Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. tên đề tài.txt
Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyển (Anoectochilus Setaceus) in Vitro phục
vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc
Giảng viên hướng dẫn: TS. Hà Thị Loan
SV: Nguyễn Thị Kim Ngân
Lớp: 13DSH01
MSSV: 1311101018
Page 1

2. Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng
dẫn khoa học của Tiến sĩ Hà Thị Loan. Các số liệu sử dụng phân tích trong đồ án có
nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các nội dung nghiên cứu, kết quả
trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây,
nếu phát hiện có bất kỳ gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017
Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM
Nguyễn Thị Kim Ngân

3. Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bài luận văn này, em luôn nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt
của các cấp Lãnh đạo, các tập thể và cá nhân.
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô trường Đại học Công
Nghệ TP. Hồ Chí Minh, quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm –
Môi trường đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn bổ ích trong
suốt bốn năm học vừa qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn và sự tri ân sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trung tâm
Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về kinh phí và trang thiết bị
để em thực hiện đề tài này. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Tiến
sĩ Hà Thị Loan cùng với những Anh (Chị) cán bộ làm việc tại phòng Thực nghiệm
cây trồng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học hỏi, tiếp cận những kiến thức
thực tế, tích lũy nhiều kinh nghiệm về thao tác trong phòng thí nghiệm. Đồng thời
các Anh (Chị) đã góp ý, bổ sung và chỉnh sửa những kiến thức thiếu sót để em có thể
hoàn thành tốt đề tài này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình
những người đã luôn bên cạnh em, cổ vũ tinh thần và đã ủng hộ em trong suốt thời
gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017
Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM
Nguyễn Thị Kim Ngân

4. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iv
DANH MỤC BẢNG..................................................................................................v
DANH MỤC BIỂU ĐỒ........................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH................................................................................................ vii
LỜI MỞ ĐẦU............................................................................................................1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................4
1.1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật...................................4
1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật.........................................................4
1.1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật..............................5
1.1.3. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật .......................................................12
1.1.4. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật ...........13
1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ...........................................14
1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng .......................................................................14
1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo.......................................................................................14
1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn.................................................................................15
1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần ................................................................................15
1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn....................................................................................16
1.2.6. Nuôi cấy protoplast..................................................................................16
1.3. Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ................16
1.3.1. Đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào
chủ......................................................................................................................16
1.3.2. Vai trò, chức năng của oncogen rol (root inducing locus) .....................19

5. Đồ án tốt nghiệp
ii
1.3.3. Tình hình nghiên cứu rễ tóc trên một số loài dược liệu và cây trồng .....21
1.4. Tổng quan về cây lan kim tuyến..................................................................22
1.4.1. Nguồn gốc và phân bố .............................................................................22
1.4.2. Phân loại..................................................................................................23
1.4.3. Đặc điểm hình thái...................................................................................23
1.4.4. Điều kiện sinh sống của lan kim tuyến ....................................................25
1.4.5. Giá trị dược liệu của lan kim tuyến .........................................................25
1.4.6. Nhân giống cây lan kim tuyến .................................................................26
1.4.7. Tình hình nghiên cứu cây lan kim tuyến..................................................27
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................29
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................29
2.2. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................29
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu..............................................................................29
2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất.........................................................29
2.2.3. Môi trường nuôi cấy ................................................................................31
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy ...................................................................................31
2.3. Phương pháp...................................................................................................31
2.3.1. Pha môi trường.....................................................................................31
2.3.2. Các thao tác trong phòng cấy.................................................................32
2.4. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................33
2.5. Bố trí thí nghiệm..........................................................................................33
2.5.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy chồi
lan kim tuyến......................................................................................................33

6. Đồ án tốt nghiệp
iii
2.5.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi
lan kim tuyến......................................................................................................34
2.5.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của
lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes .............36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............Error! Bookmark not defined.
3.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim
tuyến… ..................................................................................................................38
3.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan
kim tuyến...............................................................................................................43
3.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan
kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ......................48
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................54
4.1. Kết luận. .........................................................................................................54
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55

7. Đồ án tốt nghiệp
iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CNSH Công Nghệ Sinh Học
TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh
MS Murashige – Skoog
BA Benzyl Adenin
NAA Napthalene Acetic Acid
BAP 6-Benzyl Amino Purine
2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
IBA 3-Indole butyric acid
IAA 3-Indole acetic acid
NT Nghiệm thức
ĐC Đối chứng
Cs Cộng sự
YMB Yeast mannitol broth
B5 Gamborg’
s

8. Đồ án tốt nghiệp
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974) ............................6
Bảng 2.1. Khảo sát nồng độ BA và NAA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến ............34
Bảng 2.2. Khảo sát nồng độ BA và NAA dùng để nhân nhanh chồi lan kim tuyến.35
Bảng 2.3. Các cơ quan của lan kim tuyến được chuyển gen ....................................37
Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến
sau 8 tuần theo dõi.....................................................................................................39
Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến
sau 8 tuần theo dõi.....................................................................................................44
Bảng 3.3. Khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây
nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng 15834 và chủng TR7 sau 4 tuần
nuôi cấy. ....................................................................................................................48

9. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của
mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. ...............................................40
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến tỷ lệ tái sinh chồi của mẫu
cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. .......................................................41
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của
mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy. ...............................................46

10. Đồ án tốt nghiệp
vii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ................................................19
Hình 1.2. Lan kim tuyến ở ngoài vườn ươm.............................................................23
Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên...........................................................29
Hình 3.1. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến...............38
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự nhân nhanh chồi lan kim tuyến44
Hình 3.3. Ảnh hưởng của việc chuyển gen chứa vi khuẩn Agobacterium rhizogenes
chủng Tr7 và chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến sau 4 tuần nuôi cấy ở
các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4....................................................................51

11. Đồ án tốt nghiệp
1
LỜI MỞ ĐẦU
I. Đặt vấn đề
Từ xưa đến nay, lan được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa dành cho bậc
vương giả. Lan là một loài hoa được trồng rất phổ biến ở Việt Nam nói riêng và ở các
nước trên thế giới nói chung. Lan ở việt nam tượng trưng cho một vẻ đẹp thuần khiết,
thanh cao và mang nhiều ý nghĩa. Cùng với sự phát triển của ngành trồng lan trong
thời gian qua, loài hoa quý này không chỉ hấp dẫn mọi du khách do sự đa dạng về
hình dáng và màu sắc mà còn mang lại giá trị hiệu quả kinh tế cao.
Họ Lan Orchidaceae là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt
Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường Lan được sử dụng
làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài Lan còn được sử dụng làm thuốc (Nguyễn Tiến
Bân, 2005).
Chi Lan kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài,
trong đó có loài Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác
Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. được biết đến nhiều không những bởi giá
trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc
từ rất lâu, nên loài Lan kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt
chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay,
Lan kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA,
nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và trong Sách Đỏ Việt Nam
(2007), phân hạng EN A1a,c,d (Sách Đỏ Việt Nam, 2007).
Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào trần đã được công bố trên
nhiều loài cây dược liệu, đáng chú ý là sản xuất và thương mại hóa shikonin,
berberine and ginseng ở Nhật Bản. Tuy nhiên sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng
phương pháp nuôi cấy tế bào vẫn còn một số tồn tại như dòng tế bào không ổn định,
năng suất thấp và khi nuôi cấy quy mô lớn gặp khó khăn như dễ bị lây nhiễm, việc
điều chỉnh nguồn khí oxy, … (Rao and Ravishankar, 2002). Hướng mới để sản xuất
các hợp chất thứ cấp là nuôi cấy rễ chuyển gen (rễ tóc). Nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình

12. Đồ án tốt nghiệp
2
thành do sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật bị
tổn thương từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như
phân tích chức năng của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ
cấp hay biến đổi thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật (Lê Thu Ngọc và cs,
2013). Công nghệ chuyển gen tạo rễ tóc cho phép nhanh chóng thu được sinh khối
lớn trong thời gian ngắn đã thành công trên một số loài thực vật, điển hình là sâm
ngọc linh đem lại hiệu quả cao. Trên thế giới cũng như trong nước đã có một số đề
tài nghiên cứu về lan kim tuyến: Nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus
formosanus (Chow và cs, 1982). Nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến -
Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. (Phùng Văn Phê và cs, 2010)…
Lan kim tuyến được xem như là loài dược liệu quý cho sức khỏe con người nên
hiện nay loài thực vật này đang có nguy cơ bị người dân khai thác cạn kiệt để bán cho
các thương nhân nước ngoài bởi giá trị kinh tế cao với mức giá dao động từ 1,2 – 1,6
triệu đồng / 1 kg lá tươi. Mặt khác khả năng tái sinh của cây lan kim tuyến trong tự
nhiên thấp, đặc biệt là những nơi môi trường sinh thái bị tàn phá. Loài thực vật này
chủ yếu mọc trong rừng già trên vùng núi cao, nơi có ẩm độ cao và nhiệt độ thấp, ở
những nơi đất tốt và tơi xốp, không có ánh sáng trực tiếp của mặt trời (Dương Đức
Chiến, 2014). Chính vì môi trường sống ngoài tự nhiên khá khó khăn cũng như loài
dược liệu quý này có giá trị kinh tế cao nên việc ứng dụng công nghệ nuôi rễ tóc thu
sinh khối là cần thiết.
Xuất phát từ những cơ sở đó, người thực hiện đề tài đã tiến hành: “Nghiên
cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro phục vụ
công tác chuyển gen tạo rễ tóc”.
II. Mục đích, nhiệm vụ và phương pháp nghiên cứu
1. Mục đích
Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anotoecchilus setaceus
Blume), chi Lan kim tuyến.

13. Đồ án tốt nghiệp
3
Tạo nguồn vật liệu in vitro làm vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gen tạo rễ
tóc.
2. Nhiệm vụ
Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến.
Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến.
Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được
lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
3. Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với số liệu thu thập được xử lý bằng
phần mềm SAS và Microsoft Excel 2010.
III. Các kết quả đạt được và kết cấu của đồ án.
1. Các kết quả đạt được của đề tài
Xác định nồng độ NAA và BA tối ưu lên sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi
lan kim tuyến.
Xác định nguồn mẫu (các mô hay cơ quan của lan kim tuyến) phù hợp cho
hiệu suất chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
2. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án gồm 4 chương
- Chương 1: Tổng quan tài liệu.
- Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Chương 3: Kết quả và thảo luận.
- Chương 4: Kết luận và kiến ghị.

14. Đồ án tốt nghiệp
4
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật
Theo Dương Công Kiên (2002), những mốc chính trong lịch sử phát triển của
công nghệ tế bào thực vật:
Năm 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa
ra khái niệm tế bào.
Năm 1838: Mattias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế
bào.
Năm 1902: Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm
nhưng không thành công.
Năm 1904: Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài
họ cải Crucifers.
Năm 1922: Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro.
Năm 1924: Blumenthal và cộng sự nuôi cấy hình thành callus từ rễ cà rốt trong
môi trường có acid lactic.
Năm 1929: Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hòa
hợp khi lai ở Linum spp.
Năm 1934: White đã thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian
dài.
Năm 1934: Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1
phytohormone thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia
tế bào.
Năm 1936: LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau.
Năm 1939: Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy, mô sẹo thành
công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá.

15. Đồ án tốt nghiệp
5
Năm 1941: Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non
ở cà rốt.
Năm 1942: Gautheret lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp
trong nuôi cấy mô sẹo thực vật.
Năm 1950: Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước
dừa.
Từ năm 1950 – 1960: Hàng loạt thành công tiếp theo trong nuôi cấy mô như
nuôi cấy cây 1 lá mầm, nuôi cấy noãn, nuôi cấy phát sinh cơ quan, nuôi cấy câh sạch
virus, vi ghép, nuôi cấy đơn bội, tái sinh phôi soma, sản xuất sinh khối thực vật, nuôi
cấy tế bào trần, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng,…
Năm 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực
vật- môi trường MS.
Từ năm 1964 – 1998: hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô
như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gene để lai tạo giống mới
thương mại hóa sản phẩm nuôi cấy mô.
Giai đoạn hiện nay, ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống,
vào sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao.
1.1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.1.2.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
a. Điều kiện vô trùng
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối thiểu cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự
phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. Vì thế, nuôi cấy in vitro luôn được nuôi cấy
trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng, mô nuôi cấy
hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, chết (Dương Công Kiên, 2002).
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định.
Nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao.

16. Đồ án tốt nghiệp
6
 Các bước để xử lý khử trùng bề mặt mẫu vật
- Chọn lựa mẫu cấy tốt nhất, rửa kỹ mẫu bằng nước máy (trong dòng chảy)
cho sạch bụi bẩn.
- Ngâm rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng trong 3 phút (lắc nhẹ liên tục trong
quá trình ngâm).
- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy (trong dòng chảy). Chuyển vào tủ đã
được xử lý, vô trùng mẫu từ trước, mọi thao tác từ đây đều phải áp dụng các biện
pháp vô trùng.
- Dùng kẹp vô trùng gắp chuyển mẫu sang dung dịch khử trùng (kẹp này không
dùng lại nữa nếu không khử trùng lại), ngâm (lắc nhẹ) mẫu trong dung dịch khử trùng
trong thời gian ấn định.
- Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần. Nếu rửa không sạch, chất
khử trùng có thể làm chết mẫu.
- Nhập mẫu sau khi khử trùng chuyển mẫu ra giấy thấm đặt trên đĩa petri vô
trùng. Tiến hành cắt tỉa tách mẫu, tỉa bỏ các phần dập nát, hư hỏng và cấy chuyền
ngay vào môi trường đã chuẩn bị trước.
Bảng 1.1. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974)
Tác nhân vô trùng Nồng độ
(%)
Thời gian xử lý
(phút)
Hiệu quả
Calcium hypochorite 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Natri hypochlorite 2 5 – 30 Rất tốt
Hydro peroxide 10 – 12 5 – 15 Tốt
Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt
HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình
Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt

17. Đồ án tốt nghiệp
7
b, Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ
Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh
trưởng của mô nuôi cấy.
 Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:
cường độ chiếu sáng, thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng.
Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng phù hợp
nằm trong khoảng 2000 – 2500 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng
ở cường độ cao hơn để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng,
có khả năng quang hợp. Trong giai đoạn này, cường độ ánh sáng được Murashige
(1974) đề nghị là 3.000 – 10.000 lux và nhiều phòng thí nghiệm cho rằng con số 40
– 75 µmol/m2
/s (tương đương 3.300 – 6.200 lux) là thích hợp (Edwin, 1993).
 Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng
đến sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ
của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhiệt độ thích hợp nhất cho
sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 250
C (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
1.1.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình
thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ
phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì
thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy
(Dương Công Kiên, 2002).
Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy thực vật khác nhau. Trong đó, có một
số môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng khoáng

18. Đồ án tốt nghiệp
8
đa lượng cao. Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều
gồm một số thành phần cơ bản sau:
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
- Nguồn cacbon.
- Các vitamin.
- Các chất điều hòa sinh trưởng.
- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai
tây…
a. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác
nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải
cung cấp là N, P, K, Ca, Mg (Trần Văn Minh, 2010).
Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro
là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kĩ thuật nuôi cấy mô mới ra đời,
người ta không nghĩ tới việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các
nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, …(Trần Văn
Minh, 2010).
b. Nguồn cacbon
Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không
quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung
cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân
chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là saccharose, d-glucose,
d-fructose. Saccharose là nguồn các cacbon được sử dụng rộng rãi nhất cho các loại
cây, nồng độ saccharose thay đổi từ 2 – 3% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi
mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Dodds và Roberts, 1985).
c. Các vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thông
thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của

19. Đồ án tốt nghiệp
9
chúng. Trong nuôi cấy in vitro thì một số vitamin được bổ sung vào môi trường và
trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng như: thiamine (B1), acid nicotinic
(PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol (Trần Văn Minh, 2010).
Thiamine là một vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào.
Vitamin C đôi khi được sử dụng ở nồng độ cao như là một chất chống oxi hóa. Myo-
inositol có vai trò quan trọng cho sự phân chia tế bào vì thúc đẩy sự hình thành thành
tế bào. Thường sử dụng ở nồng độ cao 50 – 100 ppm (Trần Văn Minh,2010).
d. Chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (plant growth regulator), có tên khoa học
là phytohormon, là chất hữu cơ có mặt trong cây với hàm lượng rất nhỏ nhằm tham
gia vào điều khiển quá trình trao đổi chất và các quá trình hình thành mới các cơ quan
ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây. Cho đến nay người ta đã tìm
được rất nhiều chất tự nhiên hoặc nhân tạo ảnh hưởng rất mạnh đến sự sinh trưởng
và phát triển của thực vật. Người ta chia các phytohormon ra làm 5 nhóm chính:
Auxin, Gibberrellin, Cytokinin, Abcisic acid và Ethylene (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Trong đó, auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.
 Nhóm các auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác
của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế
bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với
các cytokinin. Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm
(IAA, NAA, 2,4-D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ
nhưng nếu sử dụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến (Hoàng Minh Tấn và
CS, 1993).
Vai trò sinh lý của Auxin
- Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào.

20. Đồ án tốt nghiệp
10
- IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylene làm ức chế sinh trưởng chồi
đỉnh.
- Kích thích hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính.
- 2,4-D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo.
- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus).
- Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp.
 Nhóm các cytokinin
Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin dùng để kích thích sự phát sinh chồi,
sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm
hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong môi trường nuôi
cấy, tỷ lệ Auxin/Cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ,
nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành
mô sẹo. Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, TDZ.
- Kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm
DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi.
- Zeatin thực chất là một dẫn xuất của adenine có tác dụng kích thích sự tạo
chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng.
- BAP có hoạt tính cao hơn kinetin và bền nhiệt với độ cao hơn zeatin.
Vai trò sinh lý của nhóm Cytokinin
- Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng chồi in vitro.
- Kìm hãm sự già hóa và kéo dài tuổi thọ của cây.
- Ức chế sự hình thành rễ.
- Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ.
- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh.
e. Các chất hữu cơ bổ sung

21. Đồ án tốt nghiệp
11
 Nước dừa
Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và
chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và
nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các
protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Nước
dừa thường sử dụng với nồng độ 5 – 20% thể tích môi trường (George, 1993; George,
1996).
 Dịch chiết nấm men
Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào. Dịch
chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động
vật với nồng độ thích hợp (Trần Văn Minh, 2010).
 Dịch chiếc khoai tây
Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin B, C và các
yếu tố khoáng như kali, sắt, magie rất tốt cho sự sinh trưởng và phát triển của mô, tế
bào. Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi trường nuôi cấy lan, bao phấn lúa và
một số cây ngũ cốc khác (Trần Văn Minh, 2010).
 Than hoạt tính
Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc.
Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng
và làm đen môi trường. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do
than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian
nuôi cấy.
 Độ pH và agar
Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng,
khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Độ pH của môi trường nuôi cấy
thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,5 - 6,0. Nếu pH thấp thì agar sẽ
không đông sau khi hấp khử trùng (Trần Văn Minh, 2010).

22. Đồ án tốt nghiệp
12
Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn môi
trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 – 1%, đây là loại tinh bột đặc chế từ rong
biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxi nếu môi
tường lỏng và tĩnh (Trần Văn Minh, 2010).
1.1.3. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật
1.1.3.1. Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu
Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt trong môi trường nuôi cấy. Để tiến hành
nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan
được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và
vị trí lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử
trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium
dichloroisocyanurate, clorua thủy ngân, …(Dương Công Kiên, 2003).
1.1.3.2. Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân
giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân
giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối
với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách
tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin,
GA3 và các chất hữu cơ khác (Dương Công Kiên, 2003).
1.1.3.3. Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật
liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo
thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân
giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra
nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài
(Dương Công Kiên, 2003).

23. Đồ án tốt nghiệp
13
1.1.3.4. Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị
chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi
trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các
chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên
ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ
thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của
mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in
vitro (Dương Công Kiên, 2003).
1.1.3.5. Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườn ươm
Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt
trong chậu, luống ươm có cơ chất dễ thoát hơi nước, tơi xốp, nơi có bóng râm, độ ẩm
cao, cường độ chiếu sáng thấp,… Trong những ngày đầu, cần phủ nilon để tránh sự
thoát hơi nước ở lá. Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới
xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các
hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ. Đây là giai đoạn
quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác
biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro (Dương Công Kiên, 2003).
1.1.4. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật
Về mặt lý luận và thực tiễn, nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô có
những ưu điểm sau:
- Hệ số nhân giống cao.
- Các cây đồng nhất về mặt di truyền.
- Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu nhân giống.
- Có thể nhân giống quanh năm.
- Khắc phục được đặc tính khó nhân giống và bất thụ ở một số cây trồng.
- Chất lượng giống cao, tạo nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất.
- Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm.

24. Đồ án tốt nghiệp
14
- Dễ dàng tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen.
Bên cạnh những ưu điểm thuận lợi cho nuôi cấy mô tế bào thực vật, phương
pháp vi nhân giống còn có nhiều nhược điểm cần khắc phục:
- Đầu tư trang thiết bị tốn kém, đòi hỏi trình độ chuyên môn kỹ thuật cao
nên dẫn đến giá thành cây con sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống khá cao.
- Cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình.
- Có thể xảy ra đột biến do các chất điều hòa tăng trưởng bổ sung vào môi
trường
- Sự nhiễm mẫu và hoại mẫu.
- Hiện tượng thủy tinh thể: là hiện tượng thân lá cây mọng nước, trong suốt,
cây rất khó sống khi ra ngoài môi trường do mất nước rất mạnh.
1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên).
Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Môi trường thích
hợp thay đổi theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cây, nhưng cơ bản môi
trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng và bổ sung chất kích thích sinh trưởng là thích
hợp nhất. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển
thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra
rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn
các phương thức nhân giống thông thường khác (Ngô Xuân Bình, 2015).
1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo
Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình
thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu
trắng. Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân
giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành

25. Đồ án tốt nghiệp
15
chồi. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô
sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy
nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo (Ngô
Xuân Bình, 2015).
1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt lên máy lắc
có tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất
hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi
cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống
như hệ thống nuôi cấy vi sinh. Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế
bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid…). Sau một
thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên
môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo khi môi
trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường có tỷ lệ
cytokinin/auxin thích hợp. Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột biến bằng tia phóng
xạ, hóa chất, có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cây trồng (Ngô Xuân Bình, 2015).
1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần
Tế bào trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống
và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Tế bào trần có thể tách trực tiếp từ các bộ
phận của thực vật (lá, rễ) bằng cơ học (nghiền mẫu + enzym) trong điều kiện nuôi
cấy thích hợp, tế bào trần có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái
sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn năng di truyền). Khi mất thành tế bào, hai tế bào
trần có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện
cây trồng. Quá trình dung hợp tế bào trần có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng
loài hoặc khác loài (khoai tây, cà chua). Ở trạng thái không có màng tế bào bao bọc,
tế bào trần dễ dàng hấp thu các AND ngoại lai mang các đặc điểm di truyền khác
nhau: cải thiện đặc tính kháng bệnh, năng suất và chất lượng cây trồng. Hiện nay kỹ

26. Đồ án tốt nghiệp
16
thuật tách và nuôi cấy tế bào trần đang được nghiên cứu và hoàn thiện (Ngô Xuân
Bình, 2015).
1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Bao phấn chứa các bào tử
hoặc hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích
tạo cây đơn bội. Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóa tạo thành cây lưỡng bội. Nuôi
cấy bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng, giống
thuần ở các cây tự thụ phấn vì đã rút ngắn được thời gian tạo ra giống mới. Nuôi cấy
bao phấn tạo giống mới được ứng dụng thành công ở một số loài cây như: lúa mì, lúa
nước, thuốc lá, ngô,… (Ngô Xuân Bình, 2015).
1.2.6. Nuôi cấy protoplast
Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách
từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong
môi trường lỏng. Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều
triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới
ở thực vật bậc cao nói chung. Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều
đối tượng khác nhau. Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị bội từ tế bào
trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây Thuốc lá đơn bội từ tế bào trần đơn bội.
Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá mầm
cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ quan trọng
trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng cũng như
trong công tác giống cây trồng (Ngô Xuân Bình, 2015).
1.3. Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium
Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium đã cho thấy
có một số ưu điểm vượt trội và đạt hiệu suất cao hơn các phương pháp khác.
1.3.1. Đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ
 Đặc điểm

27. Đồ án tốt nghiệp
17
Agrobacterium là vi khuẩn đất, nhuộm gram âm, háo khí, thuộc họ
Rhizobiacea (Kerters và De Ley, 1984). Nhiều nghiên cứu đã khẳng định
Agrobacterium có xu hướng chuyển gen vào những vùng mô đang phân sinh mạnh.
Đây là lợi thế lớn nhất của phương pháp này vì mô phân sinh là nơi mà chồi con hay
rễ (đã “bị” thay đổi thông tin di truyền) có thể dễ dàng được tạo thành.
Vi khuẩn A. tumefaciens (chứa plasmide pTi – tumor inducing) có thể gây
khối u dễ dàng cho cả cây khỏa tử và cây hai lá mầm nhưng lại khó khăn hơn trong
việc gây khối u cho cây một lá mầm (Smith và Townsend, 1907). Lý do là cây một
lá mầm thuộc nhóm thực vật tiến hóa hơn (tiến hóa nhất trong giới thực vật), nó tích
lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn các cây hai lá mầm như vách cellulose tẩm silic làm
tăng độ bền của thành tế bào, hoặc khi bị thương, phần mô tại điểm đó có xu hướng
hóa gỗ để bảo vệ, chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiết hợp chất phenol như
cây hai lá mầm. Nhưng hiện nay người ta đã tìm được nhiều chủng Agrobacterium có
khả năng chuyển gen cho một số cây một lá mầm như bắp, lúa, cỏ, mía, lan, ứng dụng
chuyển gen tạo ra gạo vàng, phong lan phát sáng,…
Còn vi khuẩn A. rhizogenes (chứa plasmide pRi – root inducing) là tác nhân
gây bệnh tạo rễ tóc (hairy root) cho thực vật. Nó cảm ứng kích thích tạo rễ khi xâm
nhiễm vào tế bào thực vật tại điểm bị thương (Riker và cs., 1930) tạo nên bộ rễ gồm
những rễ chuyển và những rễ không chuyển gen.
 Cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ
Đầu tiên vi khuẩn xâm nhiễm qua vết thương của mô, của cây. Sau khi di
chuyển đến vết thương, Agrobacterium gắn chặt vào bề mặt tế bào thực vật. Việc các
vi khuẩn gắn vào bề mặt tế bào còn được xem như phản ứng trả lời của các vi khuẩn
với các hợp chất phenolic như acetosyringon và hydroxyl acetosyringon mà tế bào
thực vật tiết ra. Các chất này được tiết ra khi cây bị thương và có tác động tạo vùng
tế bào phân chia mạnh nhằm chữa lành vết thương, các chất phenolic sẽ hàn gắn vết
thương và polymer hóa tạo lignin. Các phân tử phenolic này có tác động cảm ứng các

28. Đồ án tốt nghiệp
18
gen vir nằm trên Ti (đối với A. tumefaciens) hoặc Ri plasmide (đối với A. rhizogenes)
của vi khuẩn (Birot và cs, 1987).
Các gen vir định vị trên một vùng có kích thước 35kb nằm ngoài vùng T–
DNA. Ở đây có 25 gen virsắp xếp trong 7 operon. Các sản phẩm của gen vir có tác
dụng chuyển và gắn T–DNA vào genome của tế bào thực vật (Chilton và cs, 1982).
Quá trình chuyển T–DNA cũng tương tự như quá trình chuyển plasmide từ
tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tương tác với nhau. T–DNA được chuyển ở
dạng phân tử sợi đơn từ plasmide vào tế bào thực vật và được tổ hợp vào DNA nhiễm
sắc thể. Đầu 5’ của sợi đơn T–DNA xuất phát từ bờ phải và đầu cuối 3’ ở vị trí bờ
trái. Sự hình thành sợi đơn DNA được tiến hành nhờ sự cắt đặc hiệu hai vùng bờ phải
và bờ trái, sự tổ hợp T–DNA vào genome tế bào chủ phụ thuộc vào một trình tự đặc
hiệu định vị ở bờ phải của T–DNA, vùng bờ phải và bờ trái đều có 25 cặp base tương
tự nhau, tuy nhiên việc loại bỏ bờ trái không gây ảnh hưởng đến sự gắn T–DNA vào
nhiễm sắc thể tế bào chủ (Meyer và cs, 2000).
Trong quá trình cài T–DNA vào nhiễm sắc thể thực vật có sự loại bỏ một
đoạn giữa DNA của nhiễm sắc thể ở điểm gắn. Ngoài ra sự cài T–DNA vào DNA
thực vật xảy ra ở những vị trí ngẫu nhiên, bờ T–DNA vi khuẩn phải có được một số
điểm tương đồng với DNA thực vật ở vùng cài vào. Hầu hết các gen định vị trong
vùng T–DNA chỉ được thể hiện sau khi T–DNA được cài vào genome thực vật
(Meyer và cs, 2000).

29. Đồ án tốt nghiệp
19
Trong vùng T–DNA của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có các
gen iaaM và iaaH mã hóa cho các enzyme tổng hợp auxin (IAA). Vùng này còn chứa
gen tmr còn gọi là ipt mã hóa cho các enzyme tạo ra cytokinin. Auxin và cytokinin
sẽ điều khiển hình thành khối u (đối với vi khuẩn A. tumefaciens). Vùng T–DNA của
vi khuẩn A. rhizogenes mang các oncogen rol A, B, C hoặc D (Jouanin và cs, 1987).
Hình 1.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
(nguồn:www.slideshare.net)
1.3.2. Vai trò, chức năng của oncogen rol (root inducing locus)
Nguyên nhân của sự hình thành rễ tơ được xác định có liên quan đến vùng
T-DNA nằm trên plasmid Ri của các chủng A. rhizogenes, T–DNA của A.
rhizogenes chứa các oncogen mã hóa cho tổng hợp các phytohocmon (auxin và
cytokinin). Mặt khác, T-DNA chứa các oncogen rol A, B, C hoặc D (còn gọi là
gen rol) đã được định danh và phân lập bởi Schmulling và cộng sự. (1998), là tác
nhân làm tăng tính mẫn cảm của tế bào đối với các chất điều hòa sinh trưởng thực
vật. Những gen rol chịu trách nhiệm tạo nên rễ tóc ở tế bào thực vật (Cardarelli và

30. Đồ án tốt nghiệp
20
cs, 1987a, b): rễ phân nhánh mạnh, không hướng đất. Sự biểu hiện của gen rol (A, B
và C) tạo cho tế bào chuyển gen có tính mẫn cảm mạnh đối với auxin nội sinh (Maurel
và cs, 1991) gây ra sự tạo rễ. Sự kiện này được chứng minh bởi các cây trồng chuyển
gen bằng một gen rol độc lập hoặc nhiều gen rol liên kết đã gây ra sự biến đổi về sinh
trưởng (Nilsson và cs, 1993a, b; Martin-Tanguy và cs, 1996) cũng như nhiều biến đổi
về mặt hình thái. Tuy nhiên, hiện nay vai trò và chức năng của gen rol D vẫn còn
chưa có nhiều tài liệu công bố.
Phương thức điều hoà sự phiên mã của gen rol đã mang đến những thông tin
quan trọng cần thiết để tế bào cảm ứng tạo “hairy root”. Người ta đã nghiên cứu cơ
chế điều hoà biểu hiện gen rol bằng việc dung hợp promotor với một gen chỉ thị GUS
và phân tích hoạt động của gen GUS trong những cây đã bị chuyển gen theo hệ thống
này. Cũng tương tự, gen rol B và C biểu hiện ở những mô đặc biệt, chủ yếu ở vùng
libe và trong mô phân sinh của rễ. Gen rol B biểu hiện ở tế bào mô mềm tự do
(Altamura và cs, 1991). Hoạt động của phiên mã của gen C là những tế bào mang libe
rễ (Guiva’h và cs, 1996). Gen rol B và C biểu hiện trong tế bào trụ bì của những rễ
được hình thành đầu tiên của cây dương (Nilsson và cs, 1997). Nilsson và Olsson
(1997) cũng chứng minh sự chuyển hoá của gen rol B đóng vai trò trung tâm trong
cảm ứng tế bào rễ tóc. Gen rol B điều hoà tổng hợp auxin (Maurel và cs, 1994) và
gen rol C điều hòa tổng hợp saccharose (Yokoyama và cs, 1994). Những gen này có
thể biểu hiện độc lập và làm tăng hàm lượng hoạt chất thứ cấp cho tế bào ở vùng libe.
Nhưng để cảm ứng tạo rễ, nhờ gen rol tế bào sẽ tăng độ mẫn cảm với tỷ lệ auxin lên
nhiều lần. Điều này có thể do chức năng của tyrosine phosphate mã hóa bởi gen rol B,
là nguồn gốc của việc tạo mô phân sinh vùng rễ.
Khi lây nhiễm bởi vi khuẩn A. rhizogenes, những tế bào mục tiêu sẽ là
những tế bào ở vùng libe. Sự thể hiện ở mô đặc biệt này được điều hòa bởi 2 tác nhân
nội sinh là auxin và saccharose như đã nêu ở trên. Như Nilsson và Olsson (1997) đã
chứng minh rằng những chất này là cần thiết để cảm ứng cho rễ bất định và có mặt
với một lượng quan trọng trong tế bào vùng libe.

31. Đồ án tốt nghiệp
21
1.3.3. Tình hình nghiên cứu rễ tóc trên một số loài dược liệu và cây trồng
Chuyển gen rol tạo rễ tóc trên cây dược liệu đã được rất nhiều nhóm nghiên
cứu trên thế giới quan tâm đặc biệt là để nhân sinh khối và sản xuất hoạt chất thứ cấp
có giá trị kinh tế cao (Bulgakov, 2008). Đến năm 1990 đã có 116 loài cây trồng đã
được chuyển gen nhằm tạo rễ tóc (Tepfer, 1990). Đối với nhân sâm đã có nghiên cứu
chuyển gen tạo rễ tóc nhờ A. rhizogenes trên sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm
Mỹ (P. quinquefolium), sâm lai (P. ginseng x P. quinquefolium), sâm Ngọc linh
(Panax vietnamensis) (Washida và cs, 1998 ; Yang và Choi, 2000 ; Kochan và cs,
2012; Hà Thị Loan và cs, 2014).
Nguyễn Như Nhứt và Bùi Văn Lệ (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một
số yếu tố lên sự cảm ứng rễ tơ cây dừa cạn (catharanthus roseus) của chủng
Agrobacterium rhizogenes C26. Kết quả nghiên cứu này cho thấy sự cảm ứng tạo rễ
tơ từ giống dừa cạn VIN077 bằng chủng A. rhizogenes C26 chịu ảnh hưởng của yếu
tố mật độ tế bào trong huyền phù vi khuẩn (OD600 nm), thời gian gây nhiễm, thời
gian ủ cảm ứng, chế độ chiếu sáng và môi trường nuôi cấy. Điều kiện gây nhiễm thích
hợp để thu nhận rễ tơ từ giống dừa cạn VIN077 bằng chủng A. rhizogenes C26 là
OD600 = 0,2 với thời gian ngâm mẫu là 10 phút. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ đạt cao nhất
khi mẫu được ủ cảm ứng 6 ngày trong tối và loại nhiễm vi khuẩn ở điều kiện chiếu
sáng 1000 lux trên môi trường White bán đậm đặc.
Ninh Thị Thảo và cs (2015) đã tiến hành nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ
tơ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
ATCC 15834 và bước đầu khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối rễ
tơ. Trong ba loại vật liệu lây nhiễm với vi khuẩn (lá, cuống lá và đoạn thân), mô lá là
vật liệu thích hợp nhất để cảm ứng rễ tơ đan sâm. Mật độ vi khuẩn cho tỷ lệ mô lá
cảm ứng tạo rễ đạt cao nhất (53,85%) tương ứng với giá trị mật độ quang OD600 =
0,2.
Bùi Đình Thạch (2016) tiến hành nghiên cứu tạo rễ tơ cây bạch hoa xà
(Plumbago zeylanica L.) từ chủng vi khuẩn A.rhizogens ATCC 11325 đã tạo được 4

32. Đồ án tốt nghiệp
22
dòng rễ tơ mang gen rolB, trong đó chỉ có 1 dòng mang cả 2 gen rolB và rolC. Qua
mô hình thuật toán điều kiện acetosyringone 134,09 µM và 3,47 ngày ủ chung mẫu
với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao
nhất (0,025%).
Phan Trung Hải và cs (2015) đã tiến hành nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy
rễ tơ cây hoa móng tay (impatiens balsamina) từ mười bốn chủng Agrobacterium
rhizogenes và kết quả là ba chủng vi khuẩn (C02, C18 và C26) cho tỷ lệ cảm ứng
hình thành rễ tơ cao trên cây Hoa Móng tay và khảo sát được một số yếu tố ảnh hưởng
lên khả năng tạo rễ tơ từ các chủng chọn lọc. Trong đó mô lá là vật liệu thích hợp để
cảm ứng tạo rễ tơ trên cây Hoa Móng tay khi xâm nhiễm với mật độ khuẩn tương ứng
với giá trị OD600 = 1,0 với thời gian gây nhiễm là 5 đến 15 phút và thời gian đồng
nuôi cấy là 72 giờ. Dòng rễ tơ được cảm ứng từ chủng C02 cho khả năng sinh trưởng
nhanh nhất.
Lê Xuân Thao (2014) tiến hành thực hiện tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen mang
gen cry3 thông qua chủng Agrobacterium rhizogens ATCC15834/PTN289 và Chủng
Agrobacterium rhizogenes pIBT/cry3 đã xác định được điều kiện thích hợp cho quá
trình chuyển gen tạo rễ tơ vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A. rhizogens sử
dụng vector chuyển gen pPTN289 mang gen chỉ thị gus. Bước đầu đã thu nhận được
một dòng khoai lang KB1 mang gen cry3 kháng bọ hà.
1.4. Tổng quan về cây lan kim tuyến
1.4.1. Nguồn gốc và phân bố
Chi lan kim tuyến (Anoectochilus) được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm
1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở việt nam
hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc (Sách đỏ Việt Nam, 2007).
Các loài lan kim tuyến sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối,
dưới các tán cây to trong rừng ẩm ở độ cao 500 – 1600m. cây ưa độ ẩm cao và ưa
bóng râm, kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiều mùn, tơi xốp, thoáng khí. Trên thế giới, lan

33. Đồ án tốt nghiệp
23
kim tuyến có mặt ở Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Indonexia,…
Riêng ở Việt Nam, nó phân bố ở Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh
Phúc (Tam Đảo), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô, Đắc Uy), Gia Lai
(Kbang, Kon Hà Nừng)… (Phùng Văn Phê và cs, 2010).
1.4.2. Phân loại.
Bộ: Asparagales
Họ: Orchidaceae
Phân họ: Orchidoidea
Chi: Anoectochilus
Loài: A.setaceus
Tên khoa học: Anoectochilus setaceus
Hình 1.2. Lan kim tuyến ở ngoài vườn ươm
(nguồn: skhcn.daknong.gov.vn)
1.4.3. Đặc điểm hình thái

34. Đồ án tốt nghiệp
24
Cây lan kim tuyến hay còn gọi là cây kim cương, lan gấm, mộc sơn thạch tùng,
là cây thân thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước, mang các
lá mọc xòe sát đất.
 Rễ
Rễ được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ
thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mẫu chỉ có một
rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mẫu trên thân rễ. Số lượng và kích
thước rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 - 10. Chiều dài
của rễ thay đổi từ 0,5 - 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07 cm và ngắn nhất trung
bình là 1,22 cm.
 Thân
Thân rễ: nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân
rễ từ 5 - 12 cm. Đường kính thân rễ từ 3 - 4 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3 - 7 lóng.
Chiều dài của lóng từ 1 - 6 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu
nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông.
Thân khí sinh: thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng.
Chiều dài thân khí sinh từ 4 - 8 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3 - 5 mm. Thân khí
sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh
thay đổi từ 2 - 4 lóng. Chiều dài mỗi lóng từ 1- 4 cm. Thân khí sinh thường mọng
nước, nhẵn, không phủ lông, thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt.
 Lá
Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở
gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 5 cm và rộng từ 2 - 4 cm. Lá
có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông
chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất
rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với
5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ.

35. Đồ án tốt nghiệp
25
Cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ
lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6 lá, thông thường có 4 lá.
Kích thước của lá cũng thay đổi. Các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau
rõ rệt.
 Hoa, quả
Cụm hoa dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình
trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng. Cây ra hoa 1 lần vào tháng 10 - 12. Mùa quả chín
từ tháng 12 tới tháng 3 năm sau.
1.4.4. Điều kiện sinh sống của lan kim tuyến
Lan kim tuyến sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các
tán cây to trong rừng ẩm ở độ cao 500 – 1600 m. Cây ưa độ ẩm cao và ưa bóng râm,
kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiều mùn, tơi xốp, thoáng khí (Liu, Su, 1978 và Teuscher,
1978). Chúng thường mọc rải rác hoặc thành các đám nhỏ lẫn trong lớp thảm mục
hoặc ở hốc đá, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm. Cây sinh trưởng mạnh trong mùa
mưa ẩm, chịu được thời tiết có sương mù dài ngày.
Khí hậu nơi loài lan kim tuyến phân bố thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm. Lượng
mưa trung bình năm là 1,826 mm. Độ ẩm không khí trung bình 85%. Nhiệt độ trung
bình năm từ dưới 200
C đến 220
C - 230
C.
1.4.5. Giá trị dược liệu của lan kim tuyến
Lan kim tuyến không chỉ đơn thuần là loài hoa đẹp làm cảnh mà người ta còn
sử dụng lan kim tuyến để chế tạo thảo dược, làm thuốc chữa bệnh. Lan kim tuyến là
loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông,
có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy
nhược thần kinh. Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong
thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức
Huyền).

36. Đồ án tốt nghiệp
26
Trước đó, lan kim tuyến là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu,
dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958).
Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiên cứu cây thuốc
thực vật thành phố Gia Nghĩa tuyên bố: Kim tuyến liên là một vị thuốc hết sức quý
giá trong tiệm thuốc bắc Đài Loan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh
nhiệt, thanh huyết, giải trừ u uất, tiêu đờm, giải độc, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị
bệnh đái tháo đường, chữa viêm gan, trị mụn dùng cây tươi sắc uống. Nghiên cứu của
Đại học Y Tapei (Đài Loan) chứng minh dịch chiết từ lan kim tuyến có khả năng làm
ngưng sự phát triển của tế bào ung thư. Chính vì lan kim tuyến có nhiều công dụng
chữa các loại bệnh khác nhau như vậy nên trở thành thảo dược quý hiếm cần được
bảo tồn.
1.4.6. Nhân giống cây lan kim tuyến
 Nhân giống bằng hạt
Nhân giống bằng hạt hay còn gọi là nhân giống vô tính, trong thiên nhiên sự
thụ phấn của lan là do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự
thụ phấn đó. Hoa lan là một loài hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín
của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính
bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự
nhiên được côn trùng thực hiện trên cở sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và
những cấu tạo của hoa là nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng
cách xa (Phí Thị Cẩm Miện, 2012).
Ở vườn trồng lan, để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các
giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo, có thể cùng cây
hoặc khác cây. Phương pháp này có nhiều ưu điểm, dễ làm, giá thành hạ, thu được
nhiều cây khỏe, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm của thụ phấn chéo có thể thu
được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt lan
kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỷ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian
khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt (Phí Thị Cẩm Miện, 2012).

37. Đồ án tốt nghiệp
27
 Nhân giống bằng cây con
Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3 – 5 lá, cây cứng cáp có thể tách
để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản, dễ làm.
 Phương pháp giâm cây
Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các
đoạn này vào nơi ẩm, chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có
thể đem trồng vào các chậu mới. Phương pháp này cổ điển, dễ làm, quen với tập tính,
kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên, phương pháp này cũng
có một số trở ngại: chậm (tăng khoảng 2 – 4 cây/năm), chất lượng giống không cao,
cây hoa trồng lâu bị thoái hóa, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển,
từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Phí Thị Cẩm Miện, 2012).
 Nhân giống in vitro
Để nâng cao tỷ lệ nảy mầm của hạt lan kim tuyến, hiện nay người ta dùng
nấm Rhizoctonia cộng sinh với hạt, đã làm tăng tỷ lệ nảy mầm lên 80% trong môi
trường OMA, gồm bột yến mạch, dịch chiết nấm men và agar (Ling-Chin Chou and
Doris Chi-Ning Chang, 2003).
1.4.7. Tình hình nghiên cứu cây lan kim tuyến
 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Chi lan kim tuyến (Anoectochilus) đã nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một
cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành
phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005).
Chow và cs (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân sinh
khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng. Năm 1987, Liu và cs đã chọn
chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987, Ho và cs, năm 1992, Lee và cs đã sử dụng
phôi hạt để làm vật liệu nuôi cấy.

38. Đồ án tốt nghiệp
28
Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-
Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài lan kim tuyến
(Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2
MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được sử dụng để nhân
nhanh chồi là: 1/2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/l BAP +
0,5 mg/l NAA.
Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus
formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2
mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 2% than hoạt tính.
 Tình hình nghiên cứu trong nước
Những năm gần đây, nước ta đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình
thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan kim tuyến như:
Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành
công cho loài lan kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi
đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3
(Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1 g/l + 20N-20P-20K 1 g/l) + 2 g/l peptone. Môi trường
nhân nhanh là: H3 + 1 mg/l BAP (hoặc 1 - 2 mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính.
Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành,
đã đạt những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến –
Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.
Năm 2010, Phan Ngọc Khoa, trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu
ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan kim tuyến.

39. Đồ án tốt nghiệp
29
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Đề tài thực hiện từ tháng 2/2017 đến cuối tháng 6/2017.
- Địa điểm: Phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh
học Thành phố Hồ Chí Minh, số 2374, Quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây,
quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume).
Hình 2.1. Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên
(nguồn: www.botanyvn.com)
Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume) của Trunng tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM.
2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất
 Trang thiết bị - dụng cụ
- Tủ cấy vô trùng

40. Đồ án tốt nghiệp
30
- Tủ lạnh
- Máy đo pH
- Bếp từ
- Cân điện tử
- Dao cấy, kẹp cấy.
- Ống đong 100mL, ống đong 100mL, pipet 10mL.
- Chai thủy tinh 500mL.
- Đèn cồn, đĩa cấy, bông thấm.
- Máy đo pH, cân điện tử.
- Máy nước cất 2 lần.
- Tủ sấy.
- Nồi hấp tiệt trùng.
- Đĩa petri.
- Ống kim tiêm (18G).
- Que cấy vòng.
 Hóa chất
- Cồn 96o
, 70o
- Môi trường MS cơ bản
- Môi trường YMB
- Saccharose
- Agar
- Các chất kích thích sinh trưởng: NAA, BA.

41. Đồ án tốt nghiệp
31
2.2.3. Môi trường nuôi cấy
Các thí nghiệm sử dụng môi trường MS, bổ sung thêm đường sucrose, agar,
và chất điều hòa sinh trưởng gồm 2 nhóm auxine và cytokine tuỳ theo từng thí
nghiệm.
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy
- Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210
C.
- pH của môi trường là: 5.6 – 5.8
- Nhiệt độ phòng nuôi: 250
C ± 2
- Cường độ ánh sáng: 2000 lux.
- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày.
- Độ ẩm: 50%.
2.3. Phương pháp
2.3.1. Pha môi trường
 Chuẩn bị dung dịch mẹ
Môi trường nuôi cấy mô thực vật là loại môi trường nuôi cấy phức tạp với
nhiều thành phần khác nhau có hàm lượng rất nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc
pha các môi trường nuôi cấy người ta hạn chế việc cân nhiều loại hóa chất thay vào
đó là việc chuẩn bị trước các dung dịch mẹ (dung dịch Stock) với độ đậm đặc từ X10
– X200. Khi sử dụng chỉ cần pha với nước cất 2 lần hay nước vô khoáng theo tỉ lệ
thích hợp. Dung dịch Stock được pha và bảo quản dài ngày trong tủ lạnh.
 Pha môi trường nuôi cấy
- Cho nước cất vào ống đong, sau đó từ các chai dung dịch mẹ đã pha sẵn lần
lượt lấy ra đúng số lượng qui định, khuấy đều.
- Bổ sung NAA và BA (khảo sát sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi).
- Chỉnh pH 5,6 – 5,8 với NaOH 1N hoặc HCl 1N.
- Thêm nước cất vào ống đong đúng với thể tích cần pha và bổ sung 8 g agar.

42. Đồ án tốt nghiệp
32
- Khuấy đều và phân phối vào bình thủy tinh với thể tích cần thiết cho mỗi thí
nghiệm.
- Ghi rõ ngày tháng và tên (ký hiệu) môi trường để tránh nhầm lẫn.
- Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy ở 121o
C trong 20 phút, áp suất 1 atm.
- Sau khi hấp xong lấy môi trường ra, chuyển môi trường đã hấp khử trùng vào
phòng bảo quản môi trường.
Môi trường dùng trong nuôi cấy mô thực vật đa số ở dạng thạch để thuận tiện
cho việc nuôi cấy, tuy nhiên quá trình tạo đông môi trường thường dễ bị ảnh hưởng
bởi nhiều yếu tố như pH, nồng độ chất tạo đông, nhiệt độ,... nên trong quá trình pha
cần chú ý điều chỉnh các thông số của môi trường nuôi cấy cho phù hợp với sự sinh
trưởng và phát triển của từng loại cây, đồng thời chọn chất tạo đông phù hợp để hạn
chế việc gây hỏng môi trường nuôi cấy.
2.3.2. Các thao tác trong phòng cấy
- Rửa tay kỹ bằng xà phòng, mặc áo blouse, đeo khẩu trang trước khi vào phòng
cấy.
- Dùng khăn lau tủ cấy bằng cồn 70o
.
- Bật đèn UV để khử trùng tủ cấy trong 30phút. Sau khi bật UV xong bật quạt
khoảng 15 phút và lau tủ cấy lại bằng cồn 70o
.
- Dụng cụ, ống nghiệm, đĩa cấy, bình môi trường và bình mẫu cấy được xử lý
bằng cồn 70° rồi đưa vào trong tủ. Phân phối cồn 96° vào ống nghiệm và đèn
cồn.
- Hơ miệng chai cấy thật kỹ trên ngọn lửa đèn cồn trước và sau khi cấy.
- Dụng cụ sau mỗi lần cấy phải được đốt lại bằng cồn 96o
.
- Dùng giấy ghi tên môi trường tên mẫu cấy, ngày cấy chuyền, người cấy và
cột thêm 1 lớp ở miệng chai để tiện theo dõi kết quả và tránh sự nhầm lẫn.

43. Đồ án tốt nghiệp
33
- Đem vào nuôi trong phòng tăng trưởng với những điều kiện thích hợp giúp
mẫu cấy phát triển.
- Sau khi cấy xong, lau tủ cấy bằng cồn, dọn dẹp sạch sẽ nơi làm việc, giữ
nguyên vị trí các dụng cụ có trong tủ cấy từ trước. Tắt đèn, quạt trong tủ cấy.
2.4. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim
tuyến.
- Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan
kim tuyến.
- Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan
kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
2.5. Bố trí thí nghiệm
2.5.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan
kim tuyến
Mẫu cấy: Đốt thân cây lan kim tuyến in vitro.
Các bước tiến hành:
- Chọn những mẫu lan kim tuyến in vitro sinh trưởng khỏe mạnh.
- Sử dụng dao và kẹp đã khử trùng tiến hành cắt từng đốt thân (ở mỗi bình thí
nghiệm chứa 5 đốt thân ở các vị trí đốt ở phía dưới, đốt giữa thân, đốt gần phần ngọn
của 2 cây lan kim tuyến), đồng thời bỏ các lá, rễ và những phần dập nát. Cấy mẫu
sang môi trường nuôi cấy.
Môi trường: Môi trường MS + 30 g/l Saccharose + 8,0 g/l Agar, nồng độ BA
và NAA được bổ sung tùy theo nghiệm thức thí nghiệm, pH = 5.6 - 5.8.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, được bố trí hoàn toàn
ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, ô thí nghiệm 3 bình thủy tinh mỗi bình chứa 50 ml môi

44. Đồ án tốt nghiệp
34
trường và cấy 5 đốt thân lan kim tuyến vào. Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện nhiệt độ
phòng 22 – 240
C, cường độ ánh sáng 2200 – 2500 lux.
Bảng 2.1. Khảo sát nồng độ BA và NAA đến vị trí mẫu cấy
lan kim tuyến.
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l)
A1 (ĐC) 0,0 0,0
A2 1,0 0,5
A3 2,0 0,5
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ tái sinh chồi (%) =
Ʃ Số mẫu tạo chồi
Ʃ Số mẫu cấy ban đầu
x 100
- Số chồi
- Chiều cao chồi.
- Chất lượng chồi.
Theo dõi thí nghiệm và thu thập số liệu sau 8 tuần nuôi cấy.
2.5.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan
kim tuyến.
Mẫu cấy: Các chồi in vitro được tạo ra từ thí nghiệm 1.
Các bước tiến hành:
- Sử dụng dao đã khử trùng tách chồi đã tái sinh để tiến hành nhân nhanh sang
môi trường cụm.

45. Đồ án tốt nghiệp
35
- Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt, dùng kẹp đã được khử trùng trên
ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường nhân nhanh chồi đã
chuẩn bị trước.
- Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa
vào phòng nuôi.
Môi trường: Môi trường MS + 30 g/l Saccharose + 8,0 g/l Agar, nồng độ BA
và NAA được bổ sung tùy theo nghiệm thức thí nghiệm, pH = 5.6 – 5.8.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, được bố trí hoàn toàn ngẫu
nhiên, với 3 lần lặp lại, ô thí nghiệm 3 bình thủy tinh mỗi bình chứa 50 ml môi trường
và cấy 3 chồi lan kim tuyến vào. Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện nhiệt độ phòng 22 –
240
C, cường độ ánh sáng 2200 – 2500 lux.
Bảng 2.2. Khảo sát nồng độ BA và NAA dùng để nhân nhanh chồi
lan kim tuyến.
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l)
B1 (ĐC) 0,0 0,0
B2 0,1 0,1
B3 0,5 0,1
B4 1,0 0,1
Chỉ tiêu theo dõi:
- Số chồi
- Số lá (lá/chồi).

46. Đồ án tốt nghiệp
36
- Chất lượng chồi.
Theo dõi thí nghiệm và thu thập số liệu sau 8 tuần nuôi cấy.
2.5.3. Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan
kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Mẫu cấy: Thử nghiệm ở các cơ quan của lan kim tuyến: lá, trên thân, đoạn
thân.
Các bước tiến hành:
- Nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn lấy ra từ tủ lạnh sâu – 80
C được cấy trên môi
trường YMB thạch rắn hai lần trong 4 ngày, sau đó lấy dịch vi khuẩn Agobacterium
rhizogenes đem đi lây nhiễm. Vi khuẩn được đem đi lây nhiễm là A. rhizogenes
chủng Tr7 và A. rhizogenes chủng 15834 được Trung tâm công nghệ sinh học mua
từ đại học Mỹ mang về và 2 chủng vi khuẩn này không mang đoạn gen để chuyển
gen mà tấn công trực tiếp vào cơ quan lan kim tuyến để hình thành rễ tóc.
- Sử dụng dao và kẹp đã khử trùng cắt các cơ quan của lan kim tuyến riêng
biệt để tiến hành chuyển gen.
- Sử dụng ống kim tiêm (18G) tạo vết thương lần lượt lên các cơ quan vừa mới
cắt, và vẫn sử dụng ống kim tiêm đó dùng đầu kim chấm lấy dịch vi khuẩn
Agobacterium rhizogenes rồi chấm lên bề mặt vết thương của cơ quan.
- Cấy các cơ quan của lan kim tuyến vừa mới chuyển gen trên bề mặt môi
trường với mật độ đồng đều, nuôi trong 7 ngày điều kiện tối.
- Kết thúc giai đoạn đồng nuôi cấy, mẫu cấy được chuyển sang môi trường
diệt khuẩn và tái sinh là môi trường MS + 30 g/l sucrose + 400 mg/l cefotaxim trong
điều kiện tối.
- Mẫu đối chứng là những cơ quan của lan kim tuyến được nuôi cấy không lây
nhiễm với vi khuẩn cũng được nuôi cấy trên các môi trường tương tự.

47. Đồ án tốt nghiệp
37
Môi trường: Môi trường MS + 30 g/l Saccharose + 8,0 g/l Agar, không bổ
sung chất điều hòa sinh trưởng, pH = 5.6 – 5.8.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, được bố trí hoàn toàn
ngẫu nhiên, với 5 lần lặp lại, ô thí nghiệm 5 bình thủy tinh mỗi bình chứa 25 ml môi
trường và cấy riêng biệt các cơ quan lan kim tuyến vào. Mẫu cấy được nuôi ở điều
kiện nhiệt độ phòng 22 – 240
C.
Bảng 2.3. Các cơ quan của lan kim tuyến được chuyển gen
Nghiệm thức Cơ quan chuyển gen
NT1 (ĐC)
Lá, đoạn thân và thân cây không
lây nhiễm vi khuẩn.
NT2 Lá lây nhiễm với vi khuẩn.
NT3 Đoạn thân lây nhiễm với vi khuẩn.
NT4 Thân cây lây nhiễm với vi khuẩn.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ mẫu tạo rễ tóc (%) =
Ʃ Số mẫu tạo rễ tóc
Ʃ Số mẫu cấy ban đầu
x 100
- Chiều dài của rễ tóc.
- Số rễ tóc/cơ quan.
Theo dõi khả năng ra rễ sau 4 tuần lây nhiễm.
 Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với số liệu thu thập được xử lý bằng
phần mềm SAS và Microsoft Excel 2010.

48. Đồ án tốt nghiệp
38
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan
kim tuyến
Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của sự phối hợp BA và NAA cho sự tái sinh
chồi ở vị trí các đốt thân cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus ) được cấy trực
tiếp vào môi trường thạch MS. Sự cảm ứng của mẫu cấy là khác nhau khi được nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung nồng độ NAA và BA khác nhau. Kết quả thống kê
sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy có sự khác nhau về giá trị của các chỉ tiêu theo dõi.
Quan sát sau 1 tuần nuôi cấy, mẫu cấy không có sự khác biệt về mặt hình thái.
Sau 2 tuần nuôi cấy ở các đốt thân ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng
mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt với sự thay đổi của nồng độ NAA và BA so với
đối chứng. Theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy đã có sự khác biệt rõ ràng hơn giữa các nồng
độ, ở các đốt thân của mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo
thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nổi bật số chồi, chiều cao chồi,
tỷ lệ tái sinh chồi, hình thái chồi. Đến tuần thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có
sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Người thực hiện đề tài tiến hành thu kết quả, xử lý số
liệu và trình bày ở bảng 3.1, hình 3.1, biểu đồ 3.1 và biểu đồ 3.2.
A1 A2 A3
Hình 3.1. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến.

49. Đồ án tốt nghiệp
39
Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim
tuyến sau 8 tuần theo dõi.
NT
Tỷ lệ tái sinh
chồi (%)
Số chồi
(chồi/mẫu)
Chiều cao
chồi (cm)
Đặc điểm chồi
A1 (MS) 93,05ab
2,38c
1,41b Chồi phát triển
chậm, ít lá.
A2 (NAA =
0,5 mg/l;
BA = 1,0
mg/l)
98,79a
3,83a
2,03a
Chồi cao, thân
mập, xanh
đậm, nhiều lá.
A3 (NAA =
0,5 mg/l;
BA = 2,0
mg/l)
86,42b
2,99b
1,65ab
Chồi phát triển
bình thường,
đốt ngắn.
* Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự
sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p < 0,01

50. Đồ án tốt nghiệp
40
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi
của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
A1 A2 A3
Số chồi
Chiều cao chồi

51. Đồ án tốt nghiệp
41
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến tỷ lệ tái sinh chồi của
mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy.
 Nhận xét
Từ kết quả bảng 3.1, hình 3.1, và biểu đồ 3.1, 3.2 cho thấy bổ sung nồng độ
BA kết hợp với NAA hợp lý vào môi trường nuôi cấy là rất hiệu quả cho sự tái sinh
chồi ở vị trí các đốt thân lan kim tuyến. Tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tạo chồi, số
chồi/mẫu và chiều cao chồi thu được trên môi trường chứa BA và NAA cao hơn so
với công thức đối chứng. Tuy nhiên, ở mỗi tổ hợp nồng độ BA và NAA khác nhau
thì tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đều có sự khác biệt.
Các mẫu cấy nuôi trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA
(A2) có tỷ lệ tái sinh chồi (98,79%), số chồi/mẫu (3,83 chồi/mẫu) và chiều cao chồi
(2,03 cm) cao nhất so với nghiệm thức đối chứng (A1) và nghiệm thức 2 (A2).
Việc bổ sung tăng dần nồng độ BA (0; 1; 2 mg/l) thì hình thái chồi cũng khác
nhau, cụ thể là:
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
A1 A2 A3
Nồng độ BA
Tỷ lệ tái sinh chồi (%)

52. Đồ án tốt nghiệp
42
 Ở nghiệm thức 1 (A1): không bổ sung BA và NAA thì chồi vẫn phát
triển bình thường nhưng không đều giữa các mẫu, số lượng chồi ra ít,
ít lá.
 Ở nghiệm thức 2 (A2): môi trường bổ sung BA với nồng độ 1,0 mg/l
và NAA với nồng độ 0,5 mg/l thì số lượng chồi tăng lên sau tuần thứ 3,
chiều cao chồi cũng tăng lên tỷ lệ thuận với thời gian theo dõi, lá nhiều
và to. Chồi tăng trưởng nhanh và ổn định trong suốt 8 tuần nuôi cấy.
 Ở nghiệm thức 3 (A3): khi tăng nồng độ BA lên 2,0 mg/l và vẫn giữ
nguyên nồng độ NAA là 0,5 mg/l thì tỷ lệ tái sinh chồi thấp nhất so với
A1 và A2. Chồi phát triển chậm từ tuần thứ 5 trở đi, đốt thân ngắn, lá
nhiều và to.
Ở nghiệm thức A3 khi tăng nồng độ BA lên 2,0 mg/l thì chồi sinh trưởng chậm,
số chồi (2,99 chồi/mẫu) và chiều cao chồi (1,65 cm) thấp hơn so với nghiệm thức A2
sử dụng nồng độ BA là 1,0 mg/l. Kết quả này cũng tương tự như kết quả của Salez
và cs (1994) khi nghiên cứu cây Thymus piperella cho thấy BA có khả năng kích
thích tạo chồi ở các nồng độ BA thấp (0,0 – 0,5 mg/l) thì số lượng chồi và chiều cao
chồi tăng nhưng khi tăng BA đến 2,0 mg/l thì số lượng chồi và chiều cao chồi giảm
dần. Theo Hahn và Kiệt (2004), với nồng độ BA thấp có thể làm chồi sinh trưởng yếu
và làm giảm sự tăng sinh số chồi bên. Khi ở một nồng độ thích hợp, BA kích thích
chồi phát sinh đồng đều, hình thái phát triển bình thường, không có hiện tượng biến
dị. Tuy nhiên khi nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA vượt quá ngưỡng tối ưu
thì lại ức chế quá trình phát sinh của chồi, làm giảm số lượng cũng như chất lượng
chồi hình thành và khi nồng độ BA cao các chồi thu được thường có màu xanh nhạt
và lá tương đối khỏe. Phí Thị Cẩm Miện (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của cơ
quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) và
kết quả sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy mắt đốt ngang thân là cơ quan tái sinh và phát
triển tốt nhất với tỷ lệ tạo mẫu là 100%, hệ số nhân 4,56 lần, chồi dài 3,2 cm.
Sự kết hợp auxin và cytokinin với một tỷ lệ nhất định đôi khi không những
cải thiện được khả năng tái sinh mà còn làm tăng sự sinh trưởng của chồi. Do vậy,

53. Đồ án tốt nghiệp
43
nghiên cứu này tiến hành thử nghiệm các công thức tạo sự phát sinh hình thái với các
tổ hợp của BA và NAA ở các nồng độ khác nhau. Qua các kết quả trên cho thấy sự
quan trọng của các chất điều hòa sinh trưởng trong quá trình nuôi cấy in vitro. BA là
chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trò kích thích tạo chồi trực
tiếp hoặc gián tiếp ở thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro.
BA ngoài tác dụng hoạt hóa sự phân chia tế bào, còn kích thích sự sinh trưởng các
chồi bên. Khi nồng độ tăng cao, BA có tác dụng điều tiết quá trình sinh tổng hợp
trong tế bào, ảnh hưởng lên một số khâu trong cơ chế điều hòa sinh tổng hợp protein
trong tế bào và ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme cần thiết cho sự phân chia và sinh
trưởng của tế bào. NAA là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin làm giảm
pH, pH thấp hoạt hóa các enzyme tác động nới lỏng vách tế bào và enzyme tổng hợp
vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình dãn nở tế bào.
Tóm lại, nồng độ BA không nên quá thấp sẽ cho kết quả không cao, cũng
không nên quá cao sẽ tạo ra các biến dị làm chồi sinh trưởng không bình thường. Khi
có sự kết hợp giữa BA và NAA với nồng độ phù hợp (như ở nghiệm thức A2) thì sẽ
đạt kết quả cao như mong muốn.
3.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan
kim tuyến.
Từ những cụm chồi được tái sinh từ thí nghiệm 1 được cấy trực tiếp vào
môi trường MS. Sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi
trường thạch MS có bổ sung nồng độ NAA và BA khác nhau. Kết quả thống kê sau
8 tuần nuôi cấy cho thấy có sự khác nhau về giá trị của các chỉ tiêu theo dõi.

54. Đồ án tốt nghiệp
44
B1 B2 B3 B4
(sau 8 tuần)
B4 (sau 12 tuần)
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự nhân nhanh chồi lan kim
tuyến
Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim
tuyến sau 8 tuần theo dõi.
NT Số chồi (chồi/mẫu) Số lá (lá/mẫu) Đặc điểm chồi
B1 (MS) 4,93c
5,99c
Chồi ít và ít lá.
B2 (NAA =
0,1 mg/l; BA
= 0,1mg/l)
6,61b
8,46b
Chồi phát triển
không đều, lá bé.

55. Đồ án tốt nghiệp
45
B3 (NAA =
0,1 mg/l; BA
= 0,5 mg/l)
6,76b
8,50b
Chồi phát triển bình
thường, lá to.
B4 (NAA =
0,1 mg/l; BA
= 1,0 mg/l)
8,04a
10,78a
Nhiều chồi, chồi
khỏe, lá nhiều.
* Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự
sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p < 0,0,1
0
2
4
6
8
10
12
B1 B2 B3 B4
Số chồi
Số lá

56. Đồ án tốt nghiệp
46
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi
của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy.
 Nhận xét:
Sau 2 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy bắt đầu phát triển. Sau 3 tuần nuôi cấy, các
mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Sự
khác biệt hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 5 trở đi, các mẫu cấy
tăng trưởng tốt, nhiều chồi, lá. Đến tuần nuôi cấy thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm
thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt nhất. Người thực hiện đề tài tiến hành thu thập
số liệu.
Từ kết quả bảng 3.2, hình 3.2, và biểu đồ 3.3 cho thấy bổ sung nồng độ BA kết
hợp với NAA hợp lý vào môi trường nuôi cấy là rất hiệu quả cho sự nhân nhanh chồi
lan kim tuyến. Số lá, số chồi thu được trên môi trường chứa BA và NAA tăng dần
theo nghiệm thức và cao hơn so với công thức đối chứng. Tuy nhiên, ở mỗi tổ hợp
nồng độ BA và NAA khác nhau thì chỉ tiêu theo dõi đều có sự khác biệt.
Các mẫu cấy nuôi trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA
(B4) có số chồi và số lá cao nhất (8,04 chồi/mẫu và 10,78 lá/mẫu). Ở các mẫu nuôi
cấy trên môi trường có nồng độ NAA và BA khác thì thấp hơn, số chồi khi sử dụng
ở các nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 mg/l BA kết hợp nồng độ NAA không đổi là 0,1 mg/l lần
lượt là 6,61; 6,76; 8,04 chồi/mẫu và mẫu đối chứng là 4,93 chồi/mẫu, số lá khi sử