Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá

tên đề tài.txt
c
Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai
SV: Huỳnh Phương Thảo
Lớp: 13DSH03
MSSV: 1311100669
Page 1

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn
của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi
trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt
nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án
tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án
của mình.
TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Huỳnh Phương Thảo

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án này em đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ của
Thầy Cô, gia đình và bạn bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gủi đến cô Nguyễn Thị Hai đã luôn tận tình
quan tâm hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập cho đến khi xây
dựng đề cương và hoàn thành đồ án này.
Em xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô khoa Công nghệ sinh học- Thực
phẩm - Môi trường đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt kiến
thức quý báu cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại đây.
Em xin gửi lời cám ơn đến gia đình đã luôn đã chăm sóc,dạy dỗ và hỗ trợ em
cũng như luôn bên cạnh và làm chỗ dựa tinh thần cho em.
Em cũng xin gửi lời cám ơn đến tất cả các anh chị và bạn bè cùng thực hiện đề
tài trong phòng thí nghiệm đã luôn quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ với em khi thực
hiện đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng em xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy Cô trong Hội đồng phản biện
đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Với điều kiện thời gian cũng như kinh
nghiệm còn hạn chế của một sinh viên, đồ án này không thể tránh được những thiếu
sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô để em
có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, nhằm phục vụ tốt hơn công tác
thực tế sau này.
Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô. Em xin chân thành cám ơn!
TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Huỳnh Phương Thảo

i
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG...............................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................................vi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu...........................................................................................................2
2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước..................................................... 2
2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước.................................................... 2
2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân bón vi
sinh. ........................................................................................................................................... 4
2.4. Tình hình chất thải thực phẩm thừa............................................................................... 6
3. Mục đích nghiên cứu ...........................................................................................................7
4. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................................8
4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu...................................................................................... 8
4.2 - Phương pháp thu thập và xử lí số liệu.......................................................................... 8
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu......................................................................................8
6. Kết quả đạt được ..................................................................................................................8
7. Ý nghĩa đề tài........................................................................................................................9
8. Kết cấu đồ án ........................................................................................................................9
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 10
1.1.Tổng quan về vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa .................................. 10
1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................................................10
1.1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus........................................................................15
1.2. Tổng quan về enzyme.................................................................................................... 20
1.2.1. Enzyme protease .........................................................................................................20
1.2.2. Enzyme amylase..........................................................................................................24
1.2.3. Enzyme cellulase.........................................................................................................28
1.3.Tổng quan về phân bón .................................................................................................. 30

ii
1.3.1.Khái niệm......................................................................................................................30
1.3.2. Phân loại......................................................................................................................31
1.3.3. Thành phần dinh dưỡng.............................................................................................33
1.3.4. Ưu điểm của phân bón hữu cơ..................................................................................33
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.............................................................334
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ........................................................................ 34
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................................34
2.1.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................................34
2.2. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................................ 34
2.2.1. Nguồn vi sinh vật ........................................................................................................34
2.2.2. Hóa chất và môi trường.............................................................................................35
2.3.Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................................... 36
2.3.1. Thiết bị .........................................................................................................................36
2.3.2. Dụng cụ........................................................................................................................36
2.4.1. Bố trí thí nghiệm chung..............................................................................................37
2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết............................................................................................38
2.5. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................... 52
2.5.1. Phương pháp tăng sinh..............................................................................................52
2.5.2. Phương pháp pha loãng mẫu....................................................................................52
2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc.............................................................53
2.5.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào...................................................................54
2.5.5. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật....................................................55
2.5.6. Phương pháp đục lỗ thạch.........................................................................................56
2.5.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein, cellulose.........57
2.5.8. Phương pháp xử lí số liệu..........................................................................................58
2.5.9. Xác định mật độ tế bào VSV......................................................................................58
2.5.10. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
được tuyển chọn.....................................................................................................................59
2.5.11. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn.......................................................................................................................60

iii
2.5.12. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh
enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn........................................................................61
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 63
3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh, cellulse và protein của các
chủng BM13 và BDH ........................................................................................................... 63
3.1.1. Kết quả khảo sát khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn BM và
BDH. ...................................................................................................................................... 65
3.1.2. Kết quả khảo sát khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn BM và
BDH. ...................................................................................................................................... 65
3.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC của các chủng vi khuẩn BM và
BDH. ...................................................................................................................................... 67
3.2. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng BDH4 ................................. 63
3.2.1. Kết quả nhuộm Gram.................................................................................................70
3.2.2. Kết quả nhuộm bào tử................................................................................................70
3.3. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng L2 ........................................ 71
3.4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của chủng Bacillus subtilis BDH4 với
Lactobacillus L2.................................................................................................................... 73
3.5. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme protease của 2 chủng Bacillus subtilis
BDH4 với Lactobacillus L2 khi trộn chung với nhau ...................................................... 74
3.6. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4. 75
3.6.1. Thời gian nuôi cấy......................................................................................................75
3.6.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng BDH4...........................................................................................................................77
3.7. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus L2........... 78
3.7.1. Thời gian nuôi cấy......................................................................................................78
3.7.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng vi khuẩn L2.................................................................................................................80
3.8. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme
của chủng BDH4.................................................................................................................... 82
3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme
của chủng L2........................................................................................................................827
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................................................. 92

iv
1. Kết luận .............................................................................................................................. 92
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 93
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ...................................................................................................... 93
TÀI LIỆU TIẾNG ANH....................................................................................................... 97

v
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt,1992) ...........13
Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn BM và BDH được chọn để khảo sát ...........34
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh amylase của các
chủng vi khuẩn BM và BDH................................................................................................63
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của
các chủng vi khuẩn BM và BDH.........................................................................................65
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC sinh enzyme cellulase của các
chủng vi khuẩn BM và BDH................................................................................................67
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
BDH4 ......................................................................................................................................75
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh
trưởng của chủng BDH4.......................................................................................................77
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng vi khuẩn L2.................................................................................................................78
Bảng 3.7. Khảo sát pH ban đầu của môi trường đến sự sinh trưởng của chủng vi
khuẩn L2 .................................................................................................................................80
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng
sinh enzyme của chủng BDH4.............................................................................................82
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự ST và khả năng sinh
enzyme của chủng L2 ...........................................................................................................87

vi
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................................. 11
Hình 1.2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus .................... 17
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quan bố trí các bước thí nghiệm ............................................... 37
Hình 2.2. Sơ đồ quy làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH 38
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình làm thuần chủng Lactobacillus L2................................... 40
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các chủng
BM và BDH ...................................................................................................................... 42
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của các chủng
BM và BDH ...................................................................................................................... 44
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi
khuẩn BM và BDH........................................................................................................... 46
Hình 2.7. Khảo sát tính đối kháng của hai chủng VSV được tuyển chọn dùng để
phối trộn vào thức ăn thừa............................................................................................... 48
Hình 2.8. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng
Bacillus subtilis được tuyển chọn................................................................................... 50
Hình 3.1. Vòng phân giải tinh bột của các chủng BM và BDH ............................... 64
Hình 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh enzyme amylase của
các chủng vi khuẩn BM và BDH.................................................................................... 64
Hình 3.3. Khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease cuả các chủng BM và
BDH ................................................................................................................................... 65
Hình 3.4. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của 65
chủng vi khuẩn BM và BDH........................................................................................... 66
Hình 3.5. Vòng phân giải CMC của các chủng BM và BDH sau 48 giờ ................. 67
Hình 3.6. Vòng phân giải CMC của 6 chủng vi khuẩn BM và BDH sau 2 ngày nuôi
cấy ................................................................................................................................... 68
Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng Bacillus subtilis BDH4
nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 .............................................................................. 70

vii
Hình 3.8 – Kết quả nhuộm bào tử chủng vi khuẩn BDH4 ......................................... 71
Hình 3.9. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng s L2 nhuộm Gram trên
kính hiển vi x100 .............................................................................................................. 72
Hình 3.10. Khả năng đối kháng chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2
................................................................................................................................... 73
Hình 3.11. Khả năng sinh enzyme protease khi trộn 2 chủng vi khuẩn BDH4 và L2 .
................................................................................................................................... 74
Hình 3.13. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng BDH4 sau 36 giờ nuôi cấy................................................................................... 77
Hình 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng vi khuẩn L2............................................................................................................ 79
Hình 3.16. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy cho sự sinh trưởng và khả năng sinh
enzyme amylase của chủng BDH4................................................................................. 83
Hình 3.17. Môi trường nuôi cấy chủng Bacillus subtilis BDH4 .............................. 83
Hình 3.18. Hình thái khuẩn lạc chủng BDH4 khi nuôi cấy trên từng loại môi trường
…............................................................................................................................... 84
Hình 3.19. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase của
chủng vi khuẩn BDH4 ..................................................................................................... 85
Hình 3.20. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme protease của
chủng vi khuẩn BHD4 ..................................................................................................... 86
Hình 3.21. Ảnh hưởng môi trưởng nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh
enzyme protease của chủng L2 ....................................................................................... 88
Hình 3.22. Môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus L2 .......................... 88
Hình 3.23. Hình thái khuẩn lạc chủng L2 khi được nuôi cấy trên 4 môi trường.... 89
Hình 3.24. Kết quả khảo sát khả năng sinh amylase của chủng L2 được nuôi cấy
trên 4 loại môi trường....................................................................................................... 90
Hình 3.25. Kết quả khảo sát khả năng sinh protease của chủng L2 được nuôi cấy
trên 4 loại môi trường....................................................................................................... 90

viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
FAO
Food and Agriculture Organization of
the United Nations
MĐVSV Mật độ vi sinh vật
NA Nutrient agar
NB Nutient broth
ĐKVPG Đường kính vòng phân giải
VSV Vi sinh vật

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Xã hội ngày càng phát triển, những tiến bộ về khoa học và kĩ thuật làm cho
cuộc sống con người có những thay đổi lớn. Ngành công nghiệp dịch vụ ăn uống
mở rộng. Hàng ngày, một lượng lớn thức ăn thừa được thải bỏ từ các nhà hàng,
khách sạn dịch vụ ăn uống. Việc gia tăng lượng thức ăn thừa đang là vấn nạn trên
phạm vi toàn cầu (Syeda Azeem Unnisa, 2015). Ở Việt Nam, chỉ một lượng nhỏ
thức ăn thừa được thu hồi để làm thức ăn chăn nuôi. Đa phần, thức ăn thừa được đổ
bỏ theo rác sinh hoạt. Thức ăn thừa là nguồn rác thải thải giàu chất hữu cơ nên việc
đổ thức ăn thừa theo rác thải thường tạo ra mùi hôi, là nơi trú ẩn của côn trùng và vi
sinh vật có hại đến sức khỏe con người (Jayathilakan et al , 2012). Ngoài ra,việc
phân hủy thức ăn thừa tại các bãi rác tạo ra một lượng không nhỏ CH4 và CO2 tác
nhân gây hiệu ứng nhà kính. Vì vậy, Syeda Azeem Unnisa, (2015) cho rằng, việc xử
lý thức ăn thừa tại các bãi rác là không tốt cho môi trường và kém bền vững. Các
tác giả cho biết, sử dụng các vi khuẩn như Bacillus subtilis và Lactobacillus spp. để
phân hủy thức ăn thừa trong điều kiện thiếu oxy, tạo phân bón dạng lỏng là một
hướng đi đầy triển vọng vừa làm giảm ô nhiễm môi trường, vừa tạo được phân bón
hữu cơ thay thế cho phân bón vô cơ trong sản xuất nông nghiệp. Trong số các
chủng vi sinh vật được dùng để phối trộn vào thức ăn thừa để chế tạo phân bón vi
sinh thì có hai chủng được biết đến nhiều là Bacillus subtilis và Lactobacillus
(Ieshita et al. 2011, Syeda Azeem Unnisa, 2015). Tuy nhiên, ở Việt Nam, chưa có
nhiều nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn để phân hủy thức ăn thừa, tạo phân bón dạng
lỏng. Xuất phát từ thực tế trên, nhóm sinh viên tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên
cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy
thức ăn thừa tạo phân bón lá”.

2
2. Tình hình nghiên cứu
2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước
Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (2005), đã tuyển chọn từ 70 chủng vi khuẩn
phân giải protein (phân lập từ ao nuôi tôm) hai chủng có hoạt tính protease mạnh là
P42 và P62. Đã khảo sát điều kiện sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp protease
của chúng. Kết quả cho thấy, trong môi trường Vinogradski dịch thể cả hai chủng vi
khuẩn đều thích nghi với pH môi trường là 8.0, thời gian nuôi cấy 42 giờ ở nhiệt độ
300
C. Chủng P42 thích hợp với nguồn carbon là rỉ đường còn chủng P62 là glucose
và cả hai chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển cũng như sinh tổng hợp protease
mạnh nhất với nguồn nitrogen là gelatine. (Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Công
Minh, 2005)
Nguyễn Văn Hiếu và ctv (2010), đã tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của
các yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp protease kiềm của chủng B. subtilis HT24
phân lập ở Việt Nam. T9.
Nguyễn Hiền Trang và ctv (2010), cũng tuyển chọn và nghiên cứu một số yếu
tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào của vi khuẩn
B.amyloliquefaciens.
Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Bacillus
phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm.
2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước
Protease chiếm khoảng 60% tổng số enzyme thương mại trên thế giới và được
sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Trong công nghiệp sản
xuất enzyme thường sử dụng vi sinh vật để sản xuất protease bởi chúng có thời gian
sinh trưởng nhanh và chi phí thấp, đem lại lợi ích kinh tế cho việc thương mại hóa
sản phẩm (Lưu Thị Nguyệt Minh, 2007).

3
Naidu K.S và ctv (2005) xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease
là 550
C ở pH 9 với tỷ lệ giống 4% (w/v) cấy trong môi trường có chứa cám gạo 1%
sau 96 giờ. (Naidu K.S.B., Devi K.L, 2005).
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về hoạt tính
enzyme protease của các chủng Bacillus, đặc biệt là Bacillus subtilis. (Đỗ Thị Bích
Thủy, 2012).
Tác giả Kumar và cộng sự (2010) đã cố định tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis
vào các chất mang khác nhau, sau đó đem nuôi cấy để thu enzyme protease có hoạt
độ cao nhất là 10,8 UI/ml trên chất mang gelatin (Kumar R. and Vats R, 2010).
Yang và ctv (2000) đã nghiên cứu khả năng tách protein trong phế thải vỏ
tôm, cua, tôm hùm của chủng vi khuẩn B. subtilis bằng cách lên men trong môi
trường lỏng với các phế thải chưa xử lí. Tác giả cho thấy rằng hiệu quả tách protein
của chủng này khá cao, nó tách protein khỏi vỏ tôm, cua, tôm hùm lần lượt là 88%,
67% và 83% trong điều kiện nuôi cấy ở 30o
C, thời gian là 96 giờ (Yang J.K., Shih
I.L., Tzeng Y.M., Wang S.L, 2000).
Ghafoor và ctv (2008) cùng nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho sản xuất
protease ngoại bào từ B. subtilis AG-1 và B. subtilis EAG-1. Kết quả pH môi trường
tối ưu lần lượt là 7 và 7,2, nhiệt độ là 35o
C và 37o
C, thể tích ủ khoảng 1% (v/v).
Thời gian nuôi cấy thích hợp từ 24 - 32 giờ cho cả hai chủng (Ghafoor A., Hasnain
S, 2008).
Das và ctv (2010) nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để B. subtilis
sản xuất protease với lượng lớn. Vi khuẩn Bacillus subtilis tăng trưởng tối ưu ở
37ºC trong 48 giờ ở pH 8,0 với nguồn carbon và nitơ thử nghiệm với tối ưu tăng
trưởng trong dextrose và peptone tương ứng sản xuất protease tốt nhất, được ứng
dụng rộng rãi trong công nghiệp.

4
Hindhumathi và ctv (2011) đã xác định điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp
protease ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus GPA4. Trong môi trường nuôi cấy
có bổ sung 0,1% casein, với nguồn carbon là glucose, nguồn nitrogen là bột đậu
nành, pH 8,0, thời gian nuôi cấy 24-36 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút ở nhiệt độ
30o
C chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme với hoạt độ protease mạnh nhất
(Hindhumathi M., Vijayalakshmi S., Thankamani V, 2011).
2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân
bón vi sinh.
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước.
Phạm Văn Toản đã nghiên cứu áp dụng công nghệ mới nhằm mở rộng việc
sản xuất, ứng dụng phân VSV cố định đạm và phân giải lân phục vụ phát triển nông
nghiệp bền vững. (Phạm Văn Toản , 2002).
Lê Thị Thanh Thủy đã chọn được chủng Bacillus velezensis (kí hiệu M),
Bacillus subtilis (kí hiệu Ba51), chủng Bacillus polymyxa (kí hiệu B14) và chủng
Lactobacillus farraginis (kí hiệu L15) được phân lập từ các vùng trồng ớt và các
cây họ cà, các chế phẩm sinh học và sản phẩm lên men truyền thống trong việc tạo
chế phẩm VSV hỗn hợp để nâng cao năng suất , chất lượng và hiệu quả trồng trọt
của ớt cay và ớt ngọt thông qua việc ứng dụng chế phẩm làm tăng hiệu quả sử dụng
dinh dưỡng và hạn chế bệnh héo rũ, thối quả cho cây trồng (Lê Thị Thanh Thủy,
2010).
Nguyễn Văn Thao và ctv,đã sử dụng hỗn hợp các chế phẩn VSV gồm:
CPVSV1 ( Penicillum sp, Aspergillus sp., Psendomonas sp., Saccharomyces sp,
Bacillus sp, Streptomyces sp); CPVSV2 (Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis;
Bacillus mycodes; Streptomyces sp. F; Saccharomyces cerevisiae);
CPVSV3(Bacillus subtilis, Streptomyces sp. F, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces
marxianus, Trichoderma spp) để sản xuất phân hữu cơ sinh học từ bã nấm và phân

5
2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Rengathavasi và ctv (2011) đã phân lập được chủng Lactobacillus delbrueckii
từ bánh dầu có khả năng phân giải dầu thô một cách tự nhiên và dùng bổ sung trong
xử lý phân giải sinh học đồng thời phối trộn vào phân bón cho hiệu quả cao.
Kengo Yamada và Hui-Lian Xu (2008) đã chứng minh được tác động có lợi
trực tiếp của phân bón vi sinh chứa các vi sinh vật như Lactobacillus spp, nấm
actinomycetes và nấm men cũng như tác động gián tiếp của các sản phẩm chuyển
hóa
2.3.3. Tình hình sử dụng phân bón VSV ở Việt Nam
Các nhóm VSV chính sử dụng làm phân bón sinh học bao gồm: VSV cố định
nitơ, VSV phân giải hợp chất photpho khó tan, VSV tổng hợp kích thích sinh
trưởng thực vật, VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng và VSV chuyển
hoá chất hữu cơ.
Theo số liệu của Hiệp hội Phân bón Việt Nam (FAV), nhu cầu phân bón ở
Việt Nam hiện nay vào khoảng trên 10 triệu tấn các loại. Trong đó, Urea khoảng 2
triệu tấn, DAP khoảng 900.000 tấn, SA 850.000 tấn, Kali 950.000 tấn, phân Lân
trên 1,8 triệu tấn, phân NPK khoảng 3,8 triệu tấn, ngoài ra còn có nhu cầu khoảng
400.000 - 500.000 tấn phân bón các loại là vi sinh, phân bón lá.Tuy nhiên, theo
thông tin thực tế thì hiệu suất sử dụng phân bón hiện nay mới chỉ đạt 40-45% với
phân đạm, 25-30% với phân lân và khoảng 55-60% với phân kali. Như vậy, nếu ước
tính hiệu suất sử dụng các loại phân bón trung bình khoảng 45-50%, có nghĩa lượng
phân bón bị thất thoát ra môi trường hoặc bị cố định trong đất, cây trồng không sử
dụng được chiếm 50-55% (tương đương trên 5 triệu tấn) thì mỗi năm ngành nông
nghiệp đã lãng phí khoảng 40-44 nghìn tỷ đồ.(Tập đoàn hoá chất Việt Nam,
http://vinachem.com.vn).
2.3.4. Một số chế phẩm sinh học được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus và Lactic
Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm VSV hữu hiệu bao
gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế

6
phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi
trường.
Chế phẩm sinh học Lactobacillus acidophilus được sử dụng nhiều nhờ lợi ích
từ sản phẩm này đối với sức khỏe con người và vật nuôi, tổng hợp vitamin, sinh
chất diệt khuẩn, acid lactic.
2.4. Tình hình chất thải từ lượng thực phẩm thừa
2.4.1. Tình hình chất thải thực phẩm thừa trong nước
Theo Tổ chức Nông-Lương Liên Hợp Quốc (FAO), mỗi năm có 1,3 tỉ tấn
lương thực bị lãng phí. Khối lượng này tương đương với giá trị sản xuất được của
khu vực Châu Phi cận Sahara. Đồng thời, cứ 7 người trên thế giới có 1 người đói và
hơn 20.000 trẻ em dưới 5 tuổi chết mỗi ngày vì đói.
Với nỗ lực duy trì sự sống cho 7 tỉ người trên toàn thế giới, FAO ước tính
khoảng 1/3 sản lượng thực phẩm toàn cầu hoặc là bị lãng phí hoặc bị mất mát.
Trong đó, chất thải thực phẩm là một nguồn thải khổng lồ đối với tài nguyên thiên
nhiên và gây ra các tác động tiêu cực về môi trường. Và theo đó, tác động ngược lại
đến chính sức khỏe của người dân như đối mặt với nguồn nước ô nhiễm, không khí
ô nhiễm và cả không gian ô nhiễm cũng không là ngoại lệ (Dương Hà - Phạm Ngọc,
2017).
2.4.2. Tình hình chất thải thực phẩm thừa trên thế giới
Các phương pháp xử lí thường tạo ra mùi hôi do các hợp chất nitơ và lưu
huỳnh thoát ra trong quá trình xử lí. Phần lớn chi phí cho việc xử lí chất thải của
thành phố dao động từ 75% đến 80% ngân sách của thành phố và thêm 30% chi phí
cho việc đổ rác (Arvanitoyannis, 2008 ).
Năm 2012 có khoảng 9.278 tấn chất thải rắn đô thị đã được xử lý tại các bãi
rác mỗi ngày, trong đó khoảng 3.337 tấn là chất thải thực phẩm. Gần 809 tấn chất
thải thực phẩm được tạo ra từ nhà hàng, khách sạn, chợ ướt, sản xuất và chế biến

7
thực phẩm. Chất thải thực phẩm có hàm lượng chất hữu cơ cao, nhưng thực tiễn cho
thấy việc xử lý rác thải thực phẩm ở bãi chôn lấp không thân thiện và bền vững, làm
giảm diện tích đất, tạo ra mùi khó chịu (Birdie và ctv, 2014).
Tại Hàn Quốc đã tăng 8% mỗi năm nhưng đạt đến đỉnh điểm vào năm 1991 và
giảm sau đó. Tuy nhiên, chất thải thực phẩm vẫn duy trì tỷ lệ cao (31,6%) và thành
phần chất thải dự kiến khoảng 41% tổng lượng chất thải rắn đô thị (Ministry of
Environment, 1996 và Environmental Newspaper, 1996).
Tại Ấn Độ, gần 700 triệu tấn chất thải hữu cơ được tạo ra hàng năm, dẫn đến
những thách thức đối với việc xử lý chất thải an toàn, với chất thải thường được
đem đi đốt hoặc đổ đầy tại các bãi chôn lấp (Bhiday 1994, Nagavallemma và cộng
sự 2006, Zeinhom và cộng sự 2010)
Tại EU, ước tính khoảng 88 triệu tấn thực phẩm bị lãng phí hàng năm, khoảng
20% lương thực,thực phẩm được sản xuất và 95-115 kilogam thực phẩm / người
mỗi năm. EU đang nỗ lực để giảm tác động đến môi trường của chất thải thông qua
chiến lược kinh tế bằng cách duy trì giá trị của nguyên vật liệu trong nền kinh tế
càng lâu càng tốt và để giảm lượng rác thải đặc biệt là chất thải thực phẩm thừa (
Stoknes và ctv, 2016).
Sự sản xuất thực phẩm ở Mỹ sử dụng khoảng 50% diện tích đất của họ, và sử
dụng 80% tổng lượng nước sạch được tiêu thụ. Tuy nhiên, khoảng 40% tổng sản
lượng lương thực là chất thải tương đương với 165 tỷ USD mỗi năm (Gunders,
2012). Ngược lại, hiện nay hơn một tỷ người bị suy dinh dưỡng mãn tính (Foley và
ctv 2011). Về lý thuyết, tổng lượng chất thải thực phẩm sản xuất ở Bắc Mỹ và Châu
Âu có thể có khả năng giảm tình trạng đói nghèo trên thế giới ba lần (Stuart, 2009).
3. Mục đích nghiên cứu
Nhân sinh khối được chủng Bacillus subtilis và Lactobacillus để tăng cường
quá trình thủy phân thức ăn thừa tạo ra được phân bón dạng lỏng.

8
4. Phương pháp nghiên cứu
4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu
Nghiên cứu thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài.
Tổng hợp lựa chọn các đề tài liên quan đến mục tiêu đề tài
4.2 - Phương pháp thu thập và xử lí số liệu
+ Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.
+ Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS).
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng:
Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH được phân lập từ ruột cá bởi
Hồng Sêch Hếnh (2016) và chủng Lactobacillus L2 đã được phân lập bởi và
Nguyễn Thị Phương Vy (2015).
Phạm vi nghiên cứu
+ Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải enzyme ngoại bào tốt nhất để phối
trộn vào thức ăn thừa trong việc tạo chế phẩm phân bón lá.
+ Khảo sát điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh
trưởng và khả năng sinh enzyme protease và amylase cho 2 chủng vi khuẩn được
tuyển chọn.
6. Kết quả đạt được
Tuyển chọn được 1 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme ngoại
bào cao nhất trong 6 chủng khảo sát. Hoạt hóa lại chủng Lactobacillus L2
Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho 2 chủng vi khuẩn đã được tuyển
chọn.

9
Xác đinh được tỷ lệ phối trộn của 2 chủng vào thức ăn thừa để tạo phân bón
dạng lỏng.
Đánh giá được chất lượng của phân bón được tạo thành thông qua các việc
đánh giá sự có mặt của vi khuẩn Coliform, Salmonella, khả năng kích thích sinh
trưởng của hạt, của cây trồng.
7. Ý nghĩa đề tài
+ Ý nghĩa khoa học: Tuyển chọn được chủng Bacillus subtilis có khả năng
phân hủy protein, tinh bột và cellulose tốt nhất và khả năng sinh acid lactic của
chủng Lactobacillus sp tốt nhất . Đồng thời khảo sát khả năng thủy phân protein khi
phối trộn 2 chủng vi khuẩn này lại với nhau. Bên cạnh đó có thể xác định được hình
thái khuẩn lạc, điều kiện nuôi cấy, yếu tố môi trường và môi trường nhân sinh khối
tối ưu cho các chủng vi khuẩn.
+ Ý nghĩa thực tiễn: Việc phân hủy thức ăn thừa để tạo chế phẩm phân bón sẽ
giảm ô nhiễm môi trường, cung cấp phân bón sạch cho nền nông nghiệp hữu cơ,
giảm tiêu tốn ngoại tệ cho việc nhập phân bón từ nước ngoài.
8. Kết cấu đồ án
Phần mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ , thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà
đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận biện chứng cho kết quả thu được.
Phần kết luận và đề nghị: nội dung tóm tắt lại những kết quả mà đề tai đạt
được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài

10
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa
1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis
1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion
Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm
sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872,
Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là
Bacillus subtilis. (Lý Kim Hữu, 2005)
Năm 1941 Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học
Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ
Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng
thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử
dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời (Lý Kim Hữu,
2005).
1.1.1.2. Đặc điểm phân loại Bacillus subtilis
- Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Bacillales
Họ (Family): Bacillaceae
Giống (Genus): Bacillus

11
Loài (Species): Bacillus subtilis
Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
http://www.bharatvyapar.in/mitushi-pharma/bacillus-subtilis
1.1.1.3. Đặc điểm phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
(Cohn, 1872). Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú
trong đất, đường tiêu hóa của động vật nhai lại và của con người (theo Nguyễn Đức
Duy Anh, 2005). Bacillus subtilis thường được tìm thấy trong đất và rơm rạ, cỏ khô
nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 10 –
100 triệu cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện
của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như
bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào
tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương và chao. Bacillus subtilis đóng
vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học
(Vũ Thị Thứ, 1996).
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong
khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu
cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus
popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát

12
triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA),
Nutrient Broth (NB)( theo Hiroshi Fujikawa và Mitsugu Matsushita ,1991).
1.1.1.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase
dương tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt.
Bacillus subtilis có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di
chuyển nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5-
0,8µm × 1,8-3 µm . Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus subtilis sẽ hình thành bào tử
để vượt qua điều kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus subtilis sẽ
nảy mầm và phát triển như một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử B.subtilis
có hình bầu dục, kích thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt
chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm theo (Hong và ctv, 2009).
1.1.1.5. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis có một số test sinh hóa đặc trưng sau: lên men nhưng không
sinh hơi các loại đường glucose, maltose, mannitol, sucrose, xylos; Indol (-); VP
(+); nitrate (+); H2S (-); NH3 (+); catalase (+); amylase (+); casein (+); citrate (+);
có khả năng di động và hiếu khí. (Lý Kim Hữu, 2005)
Phản ứng sinh hóa Kết quả
Catalase +
Indol -
MR +
VP +
Citrate +
Nitrate +
Gelatin +
Di động +
Amylase +

13
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Mannitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt, 1992)
1.1.1.6. Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử
a) Đặc điểm tế bào
Tế bào Bacillus subtilis hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng
sinh ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt
như nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn. Thành phần hóa
học chủ yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang diện tích dương đóng
vai trò là duy trì cấu trúc của vách tế bào (McKenney và ctv , 2013).
b) Cấu tạo bào tử
Bacillus subtilis sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang
của tế bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử (Ngô Tự
Thành và ctv, 2009).
Bào tử là một cấu trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong
một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi
trường không thuận lợi, tế bào phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi
khuẩn gram dương có khả năng tạo bào tử là Bacillus và Clostridium (Ngô Tự
Thành và ctv 2009).
Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005),
bào tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó
là lớp vỏ của tế bào mẹ,ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp

14
protein mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng của bào
tử (Ngô Tự Thành và ctv, 2009).
Vỏ của bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu
nối nội peptide và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách
bào tử bao bọc có cấu trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng
bất hoạt (McKenney và ctv, 2013).
c) Đặc điểm của bào tử
Bào tử ở Bacillus subtilis không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà
chúng là dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại
qua giai đoạn điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong
những điều kiện khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất
lâu (bào tử trong xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm
hoặc trong quặng mỏ 250 triệu năm đến nay vẫn còn sống (Ngô Tự Thành và ctv,
2009).
Nhiệt độ 1000
C, bào tử của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 -
20 giờ. Ngoài việc chịu được nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn
cũng như tác động của nhiều loại hóa chất cũng như các loại tia sáng. Quá trình
hình thành bào tử: các tế bào sinh bào tử trong những điều kiện thiếu thức ăn hoặc
có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình
thành bào tử.Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40% và chứa nhiều ion Ca2+
(Ngô Tự Thành và ctv, 2009)
d) Sự nảy mầm của bào tử
Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được
gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa, nảy
mầm và sinh trưởng. Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi (2007) thì một trong
những đặc điểm quan trọng nhất của Bacillus subtilis là khả năng sinh bào tử trong
những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay
khi gặp điều kiện bất lợi (Ngô Tự Thành và ctv, 2009).

15
Theo Bùi Thị Phi (2007) sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn và mất đến
8 giờ để hoàn tất.
e) Ứng dụng của Bacillus subtilis trong sản xuất và đời sống ( Nguyễn Thị Trần
Thụy, 2009)
Trong nông nghiệp, Nhật Bản có sản phẩm EM dùng sản xuất phân bón hữu
cơ.
1983 viện vaxcin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất Biosubtyl dạng bột khô rất thuận
tiện cho người sử dụng.
Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội
đã sản xuất chế phẩm subtin từ Bacillus subtilis để phòng trừ nấm bệnh Ostriniaa
furnacalis trên bắp.
1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ
Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm
Aspergillus Flavus, A. paraciticus.
1977, Nguyễn Vĩnh Phước, Bacillus subtilis tạo kháng sinh subtilin và
Bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr+ và Gr-
.
1.1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus
1.1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về Lactobacillus.
Trong suốt 15 năm qua, các nhà nghiên cứu đã tìm ra được gần hơn 25 loài
khác nhau từ các chi Lactobacillus trong đó phải kể đến các chủng tiêu biểu như
Lactobacillus acidophilus (L.acidophilus), Lactobacillus casei (L.casei),
Lactobacillus fermentum (L.fermentum), Lactobacillus plantarum (L.plantarum),
Lactobacillus brevis (L.brevis) hay Lactobacillus bulgaricus (L.bulgaricus)
(M.Champ và ctv, 1983).
Phần lớn các chủng Lactobacillus có nguồn gốc từ dạ dày – ruột người và
trong âm đạo. Hầu hết chúng đều có khả năng chuyển đường thành acid lactic,
ngoài ra nó còn có thể tiết ra Bacteriocin – một loại hợp chất có hoạt tính kháng

16
khuẩn có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng và không gây ra tính kháng kháng sinh ở
các vi khuẩn gây bệnh. Hiện nay chúng là đối tượng nghiên cứu chính về probiotic
cho con người vì có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm, kháng các
vi khuẩn gây bệnh, khử cholesterol huyết thanh, chống ung thư …mang nhiều lợi
ích đối với sức khỏe con người. Ngoài ra Lactobacillus còn điều hòa các miễn dịch
không đặc hiệu bằng cách kích thích hoạt động của lympho bào, các đại thực bào và
giảm cytokine. (Lee và Seppo, 2009)
Bên cạnh đó Lactobacillus từ lâu đã được ứng dụng trong thương mại đặc biệt
là trong lĩnh vực thực phẩm nhất là trong công nghiệp sản xuất các thực phẩm lên
men chua như sữa chua, phô mai, bắp cải muối, dưa chua, bia, rượu vang, rượu táo,
kim chi, hoặc trong lĩnh vực y học một số chủng đáng chú ý được biết đến như
Lactobacillus acidophilus sản xuất niacin, acid folic và pyridoxine, một nhóm các
hợp chất chung được gọi là vitamin B hay chủng Lactobacillus GG được phân lập
từ người trong những năm 1980 bởi tiến sĩ Sherwood Gorbach và Barry Goldin
(Kandler và ctv 1984).
Lactobacillus GG là một hứa hẹn tuyệt vời do chúng có thể sống trong đường
ruột, ở đó các vi khuẩn tạo ra một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn giúp duy trì hệ
vi sinh đường ruột khỏi vi khuẩn xâm nhập.
1.1.2.2. Phân loại vi khuẩn Lactobacillus
Theo khóa phân loại của vi khuẩn của Bergey’s (Kandler và ctv 1984).
Lactobacillus được phân loại như sau :
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Phylum): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Lactobacillales
Họ (Family): Lactobacillaceae
Chi (Genus): Lactobacillus

17
Loài (Species): Lactobacillus spp.
1.1.2.3. Đặc điểm phân bố
Phần lớn các loài Lactobacillus là nhóm vi khuẩn có nguồn gốc từ dạ dày –
ruột người, âm đạo. Chúng thường phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên, có
nhiều ở các môi trường sống chứa nhiều cacbohydrate và trong hầu hết các thực
phẩm lên men như sữa chua, kim chi, phô mai, trong đường ruột của động vật, thủy
sản và trong đường ruột, đường tiết niệu, đường sinh dục của người (Kandler và ctv,
1984).
1.1.2.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus spp.
Lactobacillus là một nhóm gồm đa dạng các loài vi sinh vật. Chúng là những
vi khuẩn Gram dương, kích thước lớn 0,5 – 1,2 μm × 1 - 10 μm, đại bộ phận các
loài không di động, không sinh bào tử, hình dạng thay đổi: dạng que thẳng dài, que
hơi cong như hình lưỡi liềm cho đến hình cầu có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng
rẽ (Cintas và ctv, 2001).
Hình 1.2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus
1.1.2.5. Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus spp.
Vi khuẩn Lactobacillus là vi khuẩn kị khí tùy nghi, chịu môi trường acid, có
nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp, phát triển trong điều kiện kị khí và sinh acid lactic
(Mair và ctv 1986). Nhiệt độ phát triển tối ưu thường là 30 – 450
C, pH tối ưu là 5,5

18
– 6,8. Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất acid lactic là một sản
phẩm của quá trình chuyển hóa glucose. Dựa trên các sản phẩm của quá trình biến
dưỡng để phân chia các loài Lactobacillus chia thành 2 nhóm: lên men đồng hình và
lên men dị hình (Nguyễn Lân Dũng, 2000; Nguyễn Đức Lương, 2006; Đồng Thị
Thanh Thu, 2003).
+ Nhóm lên men lactic đồng hình (điển hình): là quá trình lên men trong đó
các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một
lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl…
Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:
C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 21,8 x 104
J
Các vi khuẩn lên men lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường
Embden - Mayerhof, nhưng chúng không có đủ enzyme carboxylase nên acid
pyruvic không bị phân giải tiếp tục mà chỉ nhận hydro để tạo thành acid lactic, một
phần nhỏ acid lactic bị decarboxyl để tạo một lượng nhỏ sản phẩm phụ nói trên.
Lên men lactic đồng hình có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất
acid lactic và công nghệ thực phẩm, đặc biệt là trong công nghệp sữa như sản xuất
sữa chua, phomai.
Các chủng vi khuẩn tham gia trong kiểu lên men này chủ yếu là hai giống:
Lactobacillus (Lactobacillus bulgaricum, Lactobacillus plantarum,…) và
Streptococcus (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris,…)
+ Nhóm lên men lactic dị hình: là quá trình lên men tạo sản phẩm đa dạng,
ngoài acid lactic còn hàng loạt các sản phẩm khác với tỉ lệ khá cao như: acid lactic
40%, acid sucxinic và ethanol 20%, acid acetic 10% , các chất khí (CO2, H2) 20%
Phương trình chung biểu diễn cho quá trình lên men
C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH)2COOH + CH3COOH +
C2H5OH + CO2

19
Theo giả thuyết hiện nay, trong hệ vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzyme
chủ yếu của con đường Embden – Mayerhoff đó là aldolase, triosephosphate
isomerase. Vì thế giai đoạn đầu của sự phân giải glucose xảy ra theo con đường
pentosephosphate, tạo ra sản phẩm trung gian là xilulose-5-phosphate, sau đó nó bị
phân hủy thành andehit photphoglycerinic và acetyl photphat tiếp tục chuyển hóa
theo 2 hướng để tạo etanol và acid acetic. Quá trình lên men dị hình tạo nhiều sản
phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém. Tuy nhiên quá
trình này cũng có vai trò rất quan trọng trong việc chế biến một số loại thực phẩm.
vi khuẩn lactic dị hình có thể làm cho sản phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng
hơn
Khuẩn lạc của Lactobacillus thường có hình tròn, màu trắng đục hoặc trắng
sữa có bờ đều, láng và lồi, mờ đục. Chúng không tạo mùi đặc trưng trên môi trường
nuôi cấy thông thường (Sharpe và ctv, 1966).
1.1.2.6. Khả năng phân giải protein của vi khuẩn Lactobacillus.
Đa số các loài Lactobacillus có khả năng sản sinh enzyme phân giải protein.
Phổ biến trong số đó là các chủng Lactobacillus bulgaricus, L. casein, L.
paracasein, L. fermentum và L. plantarum. Hệ enzyme phân giải protein của nhiều
loài Lactobacillus mang tính đặc hiệu cao tuy nhiên ở enzyme của một số loài lại có
tính đặc hiệu ở phổ rộng dẫn đến có nhiều vùng cắt đặc hiệu cho một cơ chất.Hoạt
tính này giúp cho các chế phẩm lên men từ Lactobacillus trở thành nguồn dinh
dưỡng có giá trị cao cho con người, động vật hoặc trong phân bón.
1.1.2.7. .Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây
bệnh
Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn như các acid hữu cơ
(acid lactic, acid acetic), hydrogen peroxide, carbondioxide và diacetyl và đặc biệt
là bacteriocin. (Nguyễn Thế Trang, 2011; Ouwehand và ctv, 1999) Nhiều vi khuẩn
Gram (+), Gram (-) bị ức chế bởi hydrogen peroxide. (Nguyễn Thế Trang , 2011;
Hollang và ctv, 1987).

20
Acid lactic do vi khuẩn Lactobacillus sinh ra cùng với các cơ chất khác sẽ tạo
một môi trường bất lợi cho vi sinh vật gây thối trong đường tiêu hóa phát triển do
đó lượng urase trong ruột giảm, hơn nữa pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại
cho NH3 hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH3 từ máu vào ruột.
Những vi khuẩn gây thối rửa ở ruột kết tạo các enzyme β-glucuronidase,
azoreductase và nitroreductase thành carcinogen (chất có vai trò trong việc hình
thành và phát triển khối u), bằng các ức chế cạnh tranh và tạo môi trường acid
không thuận lợi (Ivanova và ctv 2000) Lactobacillus đã kiềm hãm sự trao đổi chất
của vi khuẩn trong ruột điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già.
(Muralihara và ctv, 1977; Gilliland và ctv, 1980).
Ngoài ra còn phải đặc biệt kể đến các bacteriocin, đây là các hợp chất không
có tính kháng sinh điển hình tức chỉ kìm hãm mà không tiêu diệt vi sinh vật. Điển
hình như plantaricin được tạo ra từ Lactobacillus plantaru (Joerger và ctv, 2000).
1.2. Tổng quan về enzyme
1.2.1. Enzyme protease
Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide [-CO-NH-], giữa
các loại acid amin trong phân tử protein để tạo thành acid amin.
1.2.1.1. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu protease
Từ trước thế kỷ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các quy trình enzyme
vào hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia rượu… , nhưng việc ứng dụng trong
giai đoạn này hoàn toàn mang tính chất kinh nghiệm.
Từ thế kỷ 18, các nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã
phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt. Năm
1936, Schawm đã quan sát được hoạt dộng phân giải protein của dịch vị. Năm 1937,
Covisar đã tách được Trypsin từ dịch tụy và cũng là protein đầu tiên nhận được
dưới dạng chế phẩm dù vẫn chưa được tinh sạch.
- 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin .

21
- 1879, Wutz tách thành công protein từ thực vật, bằng phương pháp tủa cồn
lạnh ông đã thu nhận được papain từ cây đu đủ.
- 1918-1919, Waksman đã phát hiện ra khả năng phân giải protein của xạ
khuẩn.
- Từ năm 1950 protease của vi sinh vật được chú ý nghiên cứu và có một số
công trình nghiên cứu như:
- Subtilizin A từ Bacillus subtilis của Guntelberg và Ottensen,1950
- Peptidase A từ Streptococcus của Elliot, 1950.
- Protein kiềm từ Aspergillus oryzae của Crewther và Lennox, 1950.
- Aspergillopeptidase từ Aspergillus satoi của Yoshida, 1956.
- Protease kiềm từ Pseudomonas aeruginosa củaMorihara, 1957.
- Subtilopeptidase từ Bacillus amyloliquefaciens của Hagihara cùng cộng sự,
1958.
- Keratinase từ Streptomyces fradiae của Nickerson và Durand, 1963. (Nguyễn
Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013).
1.2.1.2. Phân loại
Có thể phân loại protease thành các dạng sau (Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015)
- Endopeptidase: cắt ngẫu nhiên nội phân tử sợi polypeptide hay còn gọi là
proteinase.
- Exopeptidase cắt liên kết peptide ở đầu N (aminopeptidase) hoặc đầu C
(carboxypeptidase)
Protease là nhóm enzyme phân giải protein mà phần lớn được tế bào tiết ra bên
ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào là chủ yếu. Protease có chức năng sinh học
rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở
sinh vật sống (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013).
Protease là nhóm enzyme phân giải protein gồm các enzyme phân giải như
trypsin (là endopeptidase tác động lên liên kết nội phân tử từ protein của amino acid
có tính kiềm như Agr, His, Lys), pepsin (là endopeptidase tác động lên liên kết

22
peptide nội phân tử protein của aminoacid có vòng thơm như Phe, Tyr, Trp),
chymotrypsin là nhóm endopeptidase tác động lên liên kết peptide nội phân tử mà
nhóm carboxyl thuộc về một amino acid có vòng thơm, aminopeptidase là
exopeptidase tác động lên liên kết peptide của amino acid ở đầu N của sợi
polypeptide, carboxypeptidase là exopeptide tác động lên liên kết peptide của amino
acid ở đầu C của sợi polypeptide.
Theo phân loại quốc tế thì protease được chia làm 4 phân nhóm phụ:
Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Dipeptihydrolase, Proteinase. Nếu phân loại
theo trung tâm hoạt dộng thì protease được chia làm 4 nhóm nhỏ (Barret, 1984):
Protease serine (EC 3.4.21.) Là protease có nhóm (-OH) của serin trong trung
tâm hoạt động, các protease nay thường hoạt động trong vùng pH kiềm và tính đặc
hiệu tương đối rộng.
Protease cysteine (EC 3.4.22.) Là nhóm protease có nhóm thiol của acid amin
cysteine trong trung tâm hoạt động, nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung
tâm enzyme vì nó có khả năng tham gia phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hóa
học. Protease aspatic (EC 3.4.23.) là nhóm protease có nhóm (-COOH) trong trung
tâm hoạt động. nhóm protease này hoạt động mạnh ở vùng pH acid.
Protease kim loại (EC 3.4.24.) Là những enzyme mà trung tâm hoạt dộng của
nó có những ion kim loại, nhóm này thường hoạt động ở vùng pH trung tính.
Theo nồng độ pH thì protease được chia làm 3 nhóm: protease acid, trung tính
và kiềm (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). Cơ chế xúc tác phản ứng
thủy phân liên kết peptide theo cơ chế chung như sau:
E+S →E-S→E-S*+P1 → E+ P2.
Trong đó:
E là enzyme, S là cơ chất.
E-S là phức chất enzyme-cơ chất
E-S* là phức chất trung gian enzyme- cơ chất hóa
P1 là sản phẩm đầu tiên của phản ứng
P2 là sản phẩm thứ 2 của phản ứng

23
1.2.1.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Vi sinh vật có protease ngoại bào và nội bào, mỗi loại có một vai trò khác nhau
đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
Protease ngoại bào phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong
nhiều dung dịch thành các phân tử thấp để vi sinh vật hấp thụ.
Protease nội bào phân giải các peptide được đưa từ bên ngoài vào thành các
acid amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.
Tham gia quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme và việc này có thể
có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật, chúng còn có
thể phân hủy các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến hoặc tham gia vào quá
trình sinh trưởng của vi sinh vật. (Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009)
1.2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật
Quá trình tổng hợp enzyme protease chịu nhiều tác động của các yếu tố vật lý
môi trường khác nhau như nhiệt độ, độ pH, nồng độ oxy, thành phần môi trường…
Mỗi loài vi sinh vật có một ngưỡng nhiệt độ khác nhau tối ưu cho loài, và cho
từng chủng loài, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ và hoạt tính của enzyme được tổng
hợp, như ở loài Bacillus subtilis thì ngưỡng nhiệt độ tối ưu cho loài này phát triển
và sinh enzyme là 370
C. pH của môi trường cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình lên
men của vi sinh vật.
Thành phần môi trường cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh
tổng hợp enzyme, để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C,N
thích hợp. Đối với chủng Bacillus subtilis thì khi môi trường nuôi cấy tăng sinh có
bổ sung thêm rỉ đường nồng độ 2% thì hiệu quả sinh tổng hợp protease sẽ là tốt nhất
(Cohn, 1872), trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme protease cần phải
có chất cảm ứng và các nguồn nitơ hữu cơ (Nakano và ctv, 1998).
1.2.1.5. Ứng dụng
Protease từ vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và dược phẩm
như công nghiệp chế biến thực phẩm (chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì…hay sản

24
xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người bị bệnh tiêu hóa
do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme (Nakano và ctv,
1998)
Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong thức ăn chăn nuôi dưới dạng phối
trộn hoặc probiotic như: enzymebiosub của công ty vaxcin và sinh phẩm số 2,
Baciflora for Shrimp, VIME…..
1.2.2. Enzyme amylase
Amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và
các polysaccharide tương tự diễn ra nhanh hơn, theo tính chất và tính đặc hiệu với
liên kết glucoside, amylase được chia làm ba loại là α-amylase, β-amylase và
glucoamylase (γ- amylase), tuy nhiên các chủng Bacillus thường chỉ có khả năng
tổng hợp được α-amylase mà không tổng hợp được β-amylase và glucose amylase.
Trong số khoảng 100 enzyme công nghiệp thì có hơn một nửa là có nguồn gốc từ
nấm mốc và 1/3 từ vi khuẩn. Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật được ưa chuộng
hơn so với từ những nguồn khác vì chúng rẻ hơn, dễ kiểm soát, nguyên liệu dễ tìm
và khả năng thu hồi và tinh sạch đơn giản hơn do chúng không chứa các hợp chất
không mong muốn như phenol (ở thực vật) và chất ức chế enzyme (ở động vật)
(Nguyễn Hoài Hương, 2015).
Tuy nhiên trên thực tế thì phần lớn enzyme được sản xuất từ một số nhỏ chi
như Aspergillus, Bacillus, Trichoderma, Saccharomyces…
1.2.2.1. Lịch sử phát hiện
Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm
1811-1814. Những nghiên cứu này do nhà bác học người Nga – viện sĩ K.S Kirhof
thực hiện nhằm nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết
dại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải
tinh bột thành đường.
Amylase thường được tìm thấy trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và
động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn.

25
1.2.2.2. Cấu tạo enzyme và cơ chế hoạt động
α-amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân liên kết α-1,4
glucozid nội mạch ở trong phân tử tinh bột được diễn ra có cơ chất là amylose.
α-amylase cho ra sản phẩm thủy phân chủ yếu là maltose (khoảng 87%) và một ít
glucose với cơ chất là amylopectin, α-amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 mà không
thủy phân được liên kết 1,6 trong phân tử tinh bột. và theo Nguyễn Thị Trần Thụy
thì trong họ Bacillus thường gặp rất nhiều chủng phát triển ở nhiệt độ không cao
nhưng lại sinh ra α-amylase chịu nhiệt cao (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn,
2013).
1.2.2.3. Vi sinh vật tiết enzyme amylase
Các vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất trong việc sản xuất và thu enzyme
amylase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
Các chủng nấm mốc hay được sử dụng như: Aspergillus, Rhizopus.
Các chủng nấm men hay được sử dụng như: Candida, Saccharomyces,
Endomycospsis, Endomyces.
Các chủng vi khuẩn hay được sử dụng như: Bacillus mesentericus, Bacillus
subtilis, Bacillus lichenformis, Bacillus macecassavarum, Clostridium
acetobutylium…. Và các chủng vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh,
phát triển tốt và ít bị nhiễm các vi sinh vật khác khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ cao.
Bacillus subtilis là vi khuẩn ưa ấm sinh amylase mạnh được nghiên cứu sử
dụng rộng rãi nhất. Theo Bùi Thị Phi, riêng ở Nhật, hằng năm sản xuất tới hàng
chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài Bacillus subtilis này.(Bùi Thị
Phi, 2007).
1.2.2.4. Đặc tính của enzyme amylase
α-amylase phân giải các liên kết α-1,4 glucoside ở giữa chuỗi mạch
polysaccharide, vì vậy cũng gọi là “endo-amylase” tạo thành các phân tử dextrin
phân tử thấp.(Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015)

26
α-amylase không chỉ thủy phân được hồ tinh bột mà nó còn có khả năng thủy
phân được cả hạt tinh bột còn nguyên nhưng tốc độ lại rất chậm. Dưới tác dụng của
amylase thì độ nhớt của dung dịch giảm mạnh do tinh bột đã bị α-amylase thủy
phân thành các phân tử dextrin phân tử thấp, maltose, glucose….
α-amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. α-amylase
bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả enzyme α-amylase đều bị kìm hãm
bởi các kim loại nặng như Cu2+
, Ag+
, Hg2+
. Có một đặc điểm của enzyme từ vi
khuẩn là enzyme α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóa trội hơn hoạt lực
đường hóa so với α-amylase của nấm mốc.
Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên nhanh hơn 2-2,5
lần so với α-amylase của nấm mốc (Bùi Thị Phi, 2007)
pH tối ưu của enzyme α-amylase thu được từ vi khuẩn là 5,8 – 6,0 và vùng
hoạt động tốt là khoảng pH từ 5,8 – 7,0.
α-amylase của vi khuẩn chịu nhiệt cao hơn rất nhiều so với enzyme này thu
được từ nấm mốc ( khoảng 920
C so với 700
C ở nấm mốc) (Nguyễn Xuân Hòa và
Phạm Hồng Sơn, 2013).
β-amylase xúc tác các phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside kể từ
đầu không khử tạo thành chủ yếu là maltose và dextrin phân tử lớn. (Nguyễn Xuân
Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013).
β-amylase không thủy phân hạt tinh bột mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột, β-
amylase chỉ phổ biến ở loài thực vật (hạt đang nảy mầm) mà không có ở vi khuẩn
(Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013).
Glucose amylase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6
glucoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide và tạo ra sản phẩm
chủ yếu được tạo thành gồm glucose và dextrin (Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015).
Loại enzyme này có tính chất acid thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 – 5.

27
1.2.2.5. Sinh tổng hợp enzyme amylase và các yếu tố ảnh hưởng
Amylase ở vi khuẩn được có thể được sinh ra trong quá trình phát triển tăng
sinh khối của vi sinh vật hoặc chúng có thể được tích trữ dần trong quá trình sinh
trưởng và phát triển của mình trong tế bào hay trong môi trường.
Riêng đối với chủng Bacillus subtilis thì chỉ tìm thấy được amylase khi vi khuẩn đã
hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng vì amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế
bào đang chuyển qua thời kỳ tự phân (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn,
2013).
+ Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase.
Ảnh hưởng của nguồn carbon dinh dưỡng: các nguồn carbon và nguồn năng
lượng dễ hấp thu có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp amylase. (Nguyễn Xuân Hòa
và Phạm Hồng Sơn, 2013)
Môi trường nuôi cấy dùng để thu amylase từ vi khuẩn có thể dùng tinh bột,
maltose, saccharose…và nếu như bổ sung CaCO3 làm tác nhân điều chỉnh pH và
pepton thì α-amylase được tổng hợp gấp 2 lần vì trong thành phần môi trường có
Ca2+
có tác dụng nâng cao khả năng tổng hợp α-amylase, làm ổn định enzyme có
tác dụng bảo vệ enzyme này đối với protease (VASEP, 2015).
Để tổng hợp α-amylase thì môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme này
cần có các dạng muối magie, phosphor, Kali , Mangan, kẽm… nồng độ muối
MnSO4 thích hợp để vi sinh vật tổng hợp α-amylase là 0,05%, thiếu muối thì α-
amylase không được hình thành.
Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và sự thông khí cũng ảnh hưởng rất lớn
đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật (Nakano và ctv 1998)
1.2.2.6. Ứng dụng của enzyme amylase
Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như công nghiệp bia (thay thế một phần đại mạch), công nghiệp nước chấm, công
nghiệp sản xuất glucose, công nghiệp sản xuất bánh mỳ (nâng cao chất lượng bánh),

28
công nghiệp chế biến rau quả, công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi, công nghiệp
giấy, công nghiệp sợi…
1.2.3. Enzyme Cellulase
Enzyme Cellulase là một phức hợp enzyme có tác dụng thủy phân cellulose
thông qua phân cắt liên kết 1,4-D – glucoside trong cellulose tạo sản phẩm glucose
cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh
vật.
Hệ cellulase gồm:
+ endo -(1,4) –β-D-glucanase (EC.3.2.1.4)
+ exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC.3.2.1.91)
+ β-glucosidases (EC.3.2.1.21)
Hoạt động phối trộn thủy phân cellulose thành glucose (Nguyễn Thị Cúc,
2014).
1.2.3.1. Cơ chế tác động của enzyme cellulase
Cellulose là enzyme phức tạp xúc tác sự phân giải cellulose thành sản phẩm
cuối cùng là glucose. Gồm ba giai đoạn chủ yếu:
Giai đoạn 1: dưới tác động của cellulose và các tác nhân của môi trường làm
thay đổi tính chất lý hóa của cellulose, làm cho phân tử cellulose từ dạng tinh thể
thành dạng hoạt động. Khi phân tử cellulose ở dạng hoạt động, các endocellulose dễ
dàng tác động và phân giải chúng thành cellulose hòa tan (polysaccharide),
cellotetrose, cellobiose, glucose, mà chủ yếu của giai đoạn này là tạo thành các
cellulose hòa tan.
Giai đoạn thứ 2: Cellulose biến đổi sau giai đoạn 1 bị phân giải các cellobiose
(disaccharide) và cellotetrose dưới tác dụng của exocellulase.
Giai đoạn cuối cùng: dưới tác dụng của cellobiose (β-1,4-glucosidase), các
đoạn cellobiose bị thủy phân thành glucose, β-1,4-glucosidase là những enzyme rất
đặc hiệu thủy phân cellobiose thành D-glucose. (Trần Đông Bách, 2008).

29
1.2.3.2. Phân loại và đặc điểm của enzyme cellulase
Theo Wood và Mc.Cral (1979) enzyme cellulase được phân chia theo chức
năng thành 3 nhóm:
Exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase).
Endocellulase (endoglucanase; 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase).
β-glucosidase (cellbiase; β-D-glucoside glucohydrolase).
Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng
từ 40- 600
C, pH nằm tong khoảng 4 – 7.
Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose,
cellobiose. Hg2+
ức chế hoàn toàn cellulose, trong khi các ion như Mn2+
, Ag+
, Cu2+
và Zn2+
chỉ ức chế nhẹ. Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 –
15 phút ở 800
C (Trần Đông Bách, 2008).
Exocellulase được tổng hợp bởi Trichoderma reesei và đã được các nhà khoa
học nghiên cứu rất kỹ. Chúng bao gồm hai loại: exocellulase kiểu I và exocellulase
kiểu II.
Exocellulase kiểu I chiếm 60% lượng protein có trong dịch nuôi cấy
Trichoderma reesei. Chúng có phân tử lượng khoảng 66.000 Da, điểm đẳng điện là
4,4(PI =4,4). Loại enzyme này tác dụng cả lên cellulose vô định hình và cellulose
kết tinh. Nhưng chúng lại không tác đến cellulose biến tính như carboxylmethyl
cellulose (CMC) hay hydroxyethycellulose, cellohexaose β-nitrophenyl, β-glucoside
hay β-glucan. Exocellulase kiểu I chứa khoảng 496 amino acid (Trần Đông Bách,
2008).
Exocellulase kiểu II có phân tử lượng 53.000 Da, PI = 5,0. Chúng cũng không
tác động lên CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả
cellulose không hòa tan. Exocellulose kiểu II chưa khoảng 471 amino acid.
Exocellulase của Cellulomonas fimi có một số tính chất khác biệt so với của
Trichoderma reesei. Exocellulase của Cellomonas fimi có chứa 443 amino acid.
Enzyme này có ba cầu nối disufide. Hai cầu nối disufide nằm trong trung tâm hoạt
động còn một cầu nối nằm ngoài trung tâm hoạt động.

30
Exocellulase của Clostridium thermocellum có phân tử lượng 68.000 – 75.000
Da.
Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Các nhà
khoa học chia chúng thành hai loại endoglucaase kiểu I và endogglucanase kiểu II.
Endoglucanase kiểu I chứa 459 amino acid, phân tử lượng khoảng 48.121 Da.
Edoglucanase kiểu II chứa 418 amino acid, phân tử lượng 42.200 Da. Các
enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao . Ngoài ea endoglucanase còn được
tìm thấy ở Clostridium themocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật khác.
Các endoglucanase của các vi sinh vật khác thường không khác biệt nhiều.
β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động
trong pH rất rộng (pH từ 4,4 – 8,4), phân tử lượng 50.000 – 98.000 Da, PI
(isoeletric point) 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Β-glucosidase của
Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với phân tử lượng là 75.340 Da.
Trong dịch chiết, chúng chiếm 1% so với tổng lượng protein thu được. β-
glucosidase của Clostridium thermocellum được chia làm hai loại β-glucosidase A
và β-glucosidase B. β-glucosidase A chứa khoảng 448 amino acid và có phân tử
lượng 51.82 Da. Chúng hoạt động mạnh ở pH 6,0 – 6,5 và ở nhiệt độ 60o
C. Chúng
tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân CMC (Trần Đông Bách,
2008).
1.3. Tổng quan về phân bón
1.3.1. Khái niệm
Phân bón là những chất hoặc hợp chất có chứa một hay nhiều chất dinh dưỡng
thiết yếu đối với cây trồng, giúp cây trồng sinh trưởng, phát triển tốt cho năng suất
và chất lượng cao hoặc làm tăng độ phì nhiêu của đất. Trong phân bón có chứa
nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng. Thiếu phân cây sẽ
không thể sinh trưởng, phát triển và cho năng suất, phẩm chất cao.
Các loại phân bón hữu cơ và một số loại phân bón khai thác vô cơ đã được sử
dụng trong nhiều thế kỷ, trong khi các loại phân bón hoá học tổng hợp vô cơ chỉ

31
được phát triển mạnh từ thời cách mạng công nghiệp. Sự hiểu biết và sử dụng tốt
các loại phân bón là những thành phần quan trọng của cuộc Cách mạng Nông
nghiệp Anh (tiền công nghiệp) và cuộc cách mạng xanh (công nghiệp) ở thế kỷ 20
(Phan Phát, 2013).
1.3.2. Phân loại
1.3.2.1. Theo nguồn gốc
a) Phân hữu cơ
Là loại phân bao gồm phế phụ phẩm của cây trồng và gia súc ở các giai đoạn
khác nhau của quá trình phân giải và được bón vào đất nhằm cung cấp dinh dưỡng
cho cây trồng và cải thiện tính chất đất. Phân hữu cơ bao gồm phế phụ phẩm của
trồng trọt, lâm nghiệp, rác thải từ các ngành sản xuất như nghành sản xuất giấy,
đường, bùn cống rãnh và phế phụ phẩm từ các ngành chế biến nông sản (Phan Phát,
2013.
b) Phân vô cơ (phân khoáng, phân hóa học)
Là loại phân bón được sản xuất theo qui trình công nghiệp. Trong quá trình
sản xuất có sử dụng một số nguyên liệu tự nhiên hoặc tổng hợp. Tùy thuộc vào
nguyên tố dinh dưỡng có chứa trong phân bón, phân hóa học có thể là phân đạm,
lân, kali, canxi, lưu huỳnh… Phân hóa học có thể là phân đơn (chứa 1 nguyên tố
dinh dưỡng), phân đa nguyên tố (chứa 2 hoặc nhiều nguyên tố dinh dưỡng) (Phan
Phát, 2013)
c) Phân vi sinh
Phân có chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sống có ích, với mật độ phù hợp
với tiêu chuẩn đã ban hành. Thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các
chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe...) hay các hoạt
chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản. Phân vi sinh phải
bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động vật, thực vật, môi trường sinh
thái và chất lượng nông sản (theo TCVN 6169-1996) (Phan Phát, 2013)

32
1.3.2.2. Theo chức năng
a) Phân bón gốc
Là các loại phân bón được bón trực tiếp vào đất để cung cấp chất dinh dưỡng
cho cây trồng thông qua bộ rễ.
b) Phân bón lá
Là các hợp chất dinh dưỡng hòa tan trong nước được phun lên lá để cây hấp
thụ, thông qua hệ thống khí khổng ở bề mặt lá.
1.3.2.3. Theo thành phần dinh dưỡng
a) Phân bón đa lượng
Phân có chứa trong thành phần từ 2 hoặc nhiều hơn các nguyên tố dinh dưỡng
cần thiết cho cây trồng.
b) Phân bón trung lượng
Phân có chứa một loại chất dinh dưỡng trung lượng như: Mg, S, Ca,... Các loại
chất dinh dưỡng này cây cần với một lượng trung bình nhưng rất cần thiết cho sự
sinh trưởng, phát triển của cây trồng.
c) Phân bón vi lượng
Phân có chứa một yếu tố dinh dưỡng vi lượng như: Cu, Fe, Zn, Mo,... Các loại
chất dinh dưỡng này cây trồng cần một lượng rất nhỏ nhưng nó lại ảnh hưởng rất
lớn đến sự sinh trưởng, phát triển cũng như chất lượng của nông sản phẩm.
1.3.2.4. Theo dạng
a) Phân bón dạng rắn
Các chất dinh dưỡng và chất mang của phân được để ở dạng rắn, dùng để bón
gốc, bón lót

33
b) Phân bón dạng lỏng
Các chất dinh dưỡng dưới dạng hoà tan, sử dụng để phun vào lá, gốc
1.3.3. Thành phần dinh dưỡng
Thành phần dinh dưỡng trong phân bón thường có:
- Chất đa lượng: đạm (N), lân (P), kali (K)
- Chất trung lượng: canxi (Ca), lưu Huỳnh (S), magiê (Mg),...
- Chất vi lượng: sắt (Fe), kẽm (Zn), mangan (Mn), Bo (B), đồng (Cu), Clo
(Cl), Molypden (Mo) theo (Glass và Anthony, 2003).
1.3.4. Ưu điểm của phân bón hữu cơ
Phân hữu cơ nói chung có ưu điểm là chứa đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng
đa, trung và vi lượng mà không một loại phân khoáng nào có được. Ngoài ra, phân
hữu cơ cung cấp chất mùn làm kết cấu của đất tốt lên, tơi xốp hơn, bộ rễ phát triển
mạnh, hạn chế mất nước trong quá trình bốc hơi từ mặt đất, chống được hạn, chống
xói mòn (Bùi Huy Hiền,2014)
Bón phân hữu cơ làm tăng năng suất cây trồng. Kết quả nghiên cứu khoa học
trong rất nhiều năm của các viện, trường, cũng như kết quả điều tra kinh nghiệm
của các hộ nông dân cho thấy, năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế cao, ổn định
ở những nơi có bón tỷ lệ N hữu cơ và N vô cơ cân đối với tỷ lệ N tính từ hữu cơ
chiếm khoảng 25-30% tổng nhu cầu của cây trồng. Ước tính do bón phân hữu cơ
năng suất cây trồng đã tăng được 10-20%. Nếu tính riêng về thóc do bón phân hữu
cơ (chủ yếu là phân chuồng) đã đạt khoảng 2,5-3,0 triệu tấn thóc/năm. (Bùi Huy
Hiền, 2014).
Bón phân hữu cơ còn làm giảm bớt lượng phân khoáng cần bón do phân hữu
cơ có chứa các nguyên tố di dưỡng đa lượng, trung lượng và vi lượng. Kết quả
nghiên cứu và điều tra cho thấy nếu bón 10 tấn phân chuồng/ha có thể giảm bớt
được 40-50% lượng phân kali cần bón.heo Bùi Huy Hiền (2014).

34
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ sinh
học - Thực phẩm - Môi trường, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí
Minh.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài này được thực hiện từ tháng 2/2017 đến tháng 7/2017
2.2. Vật liệunghiêncứu
2.2.1. Nguồn vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH được phân lập bởi Hồng
Sêch Hếnh (2015).
Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn BM và BDH được chọn để khảo sát
STT Chủng VSV
1 BM13
2 BDH1
3 BDH2
4 BDH3
5 BDH4
6 BDH5
- Chủng Lactobacillus L2 được phân lập từ bởi Nguyễn Đình Phương Vy
(2015).

35
2.2.2. Hóa chất và môi trường
2.2.2.1. Hóa chất
Cao thịt Pepton
Lugol Cao nấm men
Malachite Green 5% NaCl
CuSO4 20% Casein
K2HPO4
Tinh bột tan
NaOH 1N Gelatin
HCl 1N Glycerol
TCA 10% Cồn
Nước cất Thuốc thử Kovac’s
Thuốc thử Methylred Thuốc thử Griess A, Griess B
Glucose KH2PO4
Sodium acetat Mangiesium sulfate
Manganese sulfate Amonium citrate
Rỉ đường KI
2.2.2.2. Môi trường
 Môi trường Nutrient Broth (NB)
 Môi trường Nutrient Agar (NA).
 Môi trường MRS
 Môi trường thu enzyme.
 Môi trường Casein
 Môi trường CMC
 Môi trường Starch agar.

36
 Môi trường MRT
 Môi trường HI
 Môi trường LBS
2.3.Thiết bị và dụng cụ
2.3.1. Thiết bị
- Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh
- Tủ ấm - Bếp từ
- Máy quang phổ - Nồi hấp
- Autoclave
- Bể điều nhiệt - Máy lắc
- Máy ly tâm - Kính hiển vi
- Cân phân tích - Thùng chụp hình đĩa petri
2.3.2. Dụng cụ
- Ống nghiệm. - Đèn cồn
- Đĩa petri - Dụng cụ đục lỗ thạch
- Đũa thủy tinh - Bông thấm nước
- Ống ly tâm - Bông không thấm
- Giấy đo pH - Cốc thủy tinh các loại
- Ống đong các loại
- Chai thủy tinh - Pipette thủy tinh 1ml, 5 ml, 10 ml
- Dây cấy vòng - Erlen 100 ml, 250ml
- Dây cấy thẳng - Chai đun môi trường 200 ml, 500 ml
- Que cấy trang - Micropipette 100µl, 1000µl

37
2.4. Bố trí thí nghiệm
2.4.1. Bố trí thí nghiệm chung
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quan bố trí các bước thí nghiệm
Khảo sát thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng
Nhuộm Gram Nhuộm bào tử
Khảo sát khả năng sinh enzyme của các chủng
Bacillus subtilis
Giữ giống
VSV
Hoạt hóa
Chủng thuần
khiết
Khảo sát pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự
sinh trưởng của chủng vi khuẩn BDH4 và L2
Khảo sát môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh
trưởng và khả năng sinh enzyme của hai chủng
BDH4 và L2
Khảo sát tính đối kháng và khả năng sinh enzyme
ngoại bào của hai chủng BDH4 và L2 được tuyển
chọn
Chọn chủng vi khuẩn BDH4

38
2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết
2.4.2.1. Làm thuần các chủng Bacillus subtilis BM và BDH
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
BM và BDH
Định tính khả
năng sinh enzyme
ngoại bào
Các chủng BM và BDH
Tăng sinh trong môi trường NB
Lắc 150 vòng/phút trong 24 – 48 giờ
Tiến hành pha loãng đến dãy nồng độ 10-5
, 10-6
, 10-7
và cấy
trang dịch lên môi trường NA
Ủ nhiệt độ 370
C trong 24 - 48 giờ
Chọn khuẩn lạc rời rạc
Nhuộm
gram
Giữ giống trong eppendoff
cùng glycerol 40%
Chủng thuần
khiết
Nhuộm
bào tử

39
 Thuyết minh quy trình
VSV được lấy từ các chủng được phân lập từ mẫu ruột cá, đã được định danh
sơ bộ bằng các thử nghiệm sinh hóa đặc trưng và khảo sát pH thích hợp đến khả
năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH tại
phòng thí nghiệm Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. VSV được giữ trong
eppendorf , quấn kỹ bằng paraffin và được bảo quản lạnh sâu.
Những ống eppendorf chứa vi khuẩn được tuyển chọn phải là những ống còn
nguyên vẹn, không bị nứt, được bao bọc kỹ bởi paraffin và chủng vi khuẩn không bị
chảy ra ngoài.
Tiến hành tăng sinh trong bình môi trường NB (không chọn lọc) đã được hấp
khử trùng ở 1210
C trong 20 phút. Cho 1 ml chủng VSV trong eppendorf vào bình
môi trường chứa 19 ml môi trường NB (không chọn lọc) vô trùng với tỉ lệ cấy giống
5% . Thí nghiệm thực hiện trong tủ cấy dưới ngọn lửa đèn côn trong điểu kiện vô
trùng.
Đem ủ và lắc ở 150 vòng/phút từ 24 – 48 giờ khi thấy môi trường chuyển sang
đục và có sinh khối bám trên thành bình là có thể đưa vào thí nghiệm tiếp theo.
Sau đó tiến hành đem đi pha loãng. Dùng micropipette hút 1 ml dịch tăng sinh
để pha loãng đến nồng độ 10-5
, 10-6
, 10-7
dùng cho cấy trang sau đó.
Tiến hành đỗ đĩa môi trường NA đã được hấp khử trùng, dùng micropipette
hút 100 µl dịch đồng nhất vào đĩa môi trường NA và tiến hành cấy trang đến khi
mặt thạch khô ráo hẳn. Mỗi nồng độ pha loãng được cấy ra 3 đĩa để đảm bảo kết
quả.
Ủ trong tủ ấm 37 0
C trong 24 - 48 giờ cho đến khi khuẩn lạc đặc trưng của
Bacillus subtilis bắt đầu mọc.
Tiếp theo ta chọn khuẩn lạc rời rạc và đem quan sát hình thái bằng cách
nhuộm gram và nhuộm bào tử.
Sau khi xác định đó là chủng Bacillus subtilis thì từng chủng vi khuẩn được
test định tính khả năng sinh enzyme protease trên môi trường đĩa thạch casein 1% ;
khả năng sinh enzyme amylase trên môi trường đĩa thạch tinh bột 1%; khả năng

40
sinh enzyme cellulase trên môi trường đĩa thạch CMC 1%, tiến hành giữ giống
trong eppendorf trong glycerol 40 % những chủng có khả năng sinh enzyme mạnh
để bảo quản .
2.4.2.2. Làm thuần chủng Lactobacillus L2
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình làm thuần chủng Lactobacillus L2
Khảo sát khả
năng sinh acid
lactid
Tăng sinh trong môi trường MRS broth
Lắc 150 vòng/phút trong 24 – 48 giờ
Tiến hành pha loãng đến dãy nồng độ 10-5
, 10-6
, 10-7
và
cấy trang dịch lên môi trường MRS - agar
Ủ nhiệt độ 370
C trong 24 - 48 giờ
Chọn khuẩn lạc rời rạc
Nhuộm
gram
Giữ giống trong eppendorf cùng
glycerol 40%
Chủng thuần
khiết
Chủng L2
Nhuộm
bào tử

Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá

Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá

Similar to Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá