Luận văn: Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa, HOT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Võ Dương Thanh
SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO
TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN)
IN VITRO
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Võ Dương Thanh
SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO
TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN)
IN VITRO
Chuyên ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã số : 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. BÙI TRANG VIỆT
TS. LÊ THỊ TRUNG
Thành phố Hồ Chí Minh - 2013

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Thầy PGS.TS Bùi Trang Việt đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng
kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em có
thể hoàn thành luận văn.
Cô TS. Lê Thị Trung đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh
nghiệm, luôn động viên giúp đỡ em trong quá trình học tập và làm luận văn.
Cô TS. Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS. Nguyễn Thị Mong, cô TS. Trần
Thanh Hương, Thầy PGS.TS Bùi Văn Lệ, Thầy TS. Đỗ Minh Sĩ, cô TS. Trần Lê
Bảo Hà, Thầy PGS.TS Nguyễn Minh Công đã giảng dạy cho em những kiến thức
bổ ích.
Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa sinh học và bộ môn Sinh
lý Thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và làm
luận văn ở trường.
Các Thầy, Cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến
cho luận văn của em.
Em Hồ Thị Mỹ Linh đã nhiệt tình hướng dẫn và cho em mượn dụng cụ; hoá
chất để thực hiện thí nghiệm.
Các anh chị chuyên ngành sinh học thực nghiệm khóa 20, các bạn cùng khóa
21, khóa 22 và các em học viên ở phòng bộ môn Sinh lý Thực vật.
BGH và tập thể giáo viên trường THPT Phú Quốc đã tạo điều kiện, giúp đỡ
để em có thời gian hoàn thành chương trình học.
Cảm ơn tất cả những người thân, những người bạn đã luôn ở bên cạnh tôi,
dõi theo và động viên em trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ và anh chị,cả cu Bin nữa đã
luôn yêu thương, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành chương
trình học tập.
Một lần nữa, tôi xin chân thành biết ơn!
TP Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2013
Võ Dương Thanh

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục các hình
Danh mục các bảng
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................1
Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................2
1.1. Khái quát về cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain).......................................2
1.1.1. Phân loại....................................................................................................2
1.1.2. Sự phân bố.................................................................................................2
1.1.3. Đặc điểm sinh học.....................................................................................2
1.1.4. Giá trị.........................................................................................................3
1.1.5. Tình trạng ..................................................................................................3
1.1.6. Những nghiên cứu về cây Sưa...................................................................3
1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật ........................................................................4
1.2.1. Khái niệm sự phát sinh hình thái thực vật.................................................4
1.2.2. Sự phát sinh cơ quan và phát triển phôi hợp tử.........................................5
1.2.2.1. Mô phân sinh ngọn chồi và sự phát triển chồi .......................................5
1.2.2.2. Mô phân sinh ngọn rễ và sự hình thành rễ .............................................7
1.2.2.3. Sự phát triển phôi hợp tử........................................................................9
1.2.3. Cơ sở phân tử của sự phát sinh cơ quan và phát sinh phôi .....................10
1.3. Sự phát sinh hình thái thực vật in vitro..........................................................12
1.3.1. Sự tạo mô sẹo ..........................................................................................13
1.3.2. Sự tạo dịch treo tế bào.............................................................................14
1.3.3. Sự phát sinh cơ quan ...............................................................................15
1.3.4. Sự phát sinh và thu nhận phôi thể hệ ......................................................16

1.4. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật .......................................18
1.4.1. Auxin.......................................................................................................18
1.4.2. Cytokinin.................................................................................................22
1.4.3. Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong nuôi cấy in vitro....................24
1.4.4. Gibberelline.............................................................................................25
1.4.5. Abscissic acid (ABA)..............................................................................27
1.4.6. Etylene.....................................................................................................28
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP......................................................29
2.1. Vật liệu...........................................................................................................29
2.1.1. Vật liệu dùng trong nuôi cấy...................................................................29
2.1.2. Vật liệu sinh trắc nghiệm.........................................................................29
2.2. Phương pháp ..................................................................................................29
2.2.1. Nuôi cấy tạo cây Sưa in vitro ..................................................................29
2.2.2. Sự tạo mô sẹo ..........................................................................................30
2.2.2.1. Sự tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro.........................................................30
2.2.2.2. Sự tăng trưởng của mô sẹo...................................................................31
2.2.3. Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo...............................................................32
2.2.4. Quan sát hình thái giải phẫu....................................................................33
2.2.5. Đo cường độ hô hấp ................................................................................33
2.2.6. Đo cường độ quang hợp ..........................................................................33
2.2.7. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật...............................33
2.2.7.1. Ly trích .................................................................................................33
2.2.7.2. Phân đoạn và đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
nội sinh....................................................................................................35
2.2.8. Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng
thực vật trong quá trình tạo mô sẹo ........................................................36
2.2.9. Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo ............................................................37
2.2.9.1. Khảo sát khối lượng mô sẹo ảnh hưởng đến sự tạo dịch treo tế bào
của cây Sưa in vitro ................................................................................37

2.2.9.2. Khảo sát nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật ảnh hưởng
đến quá trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của cây Sưa in vitro..........38
2.2.10. Phân tích số liệu ....................................................................................38
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................39
3.1. Kết quả...........................................................................................................39
3.1.1. Nuôi cấy tạo cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) in vitro .................39
3.1.2. Sự tạo mô sẹo ..........................................................................................39
3.1.2.1. Sự tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro.........................................................39
3.1.2.2. Sự tăng trưởng của mô sẹo...................................................................55
3.1.2.3. Quan sát hình thái giải phẫu mô sẹo ....................................................57
3.1.2.4. Sự thay đổi cường độ hô hấp của các mẫu cấy trong quá trình tạo
mô sẹo.....................................................................................................64
3.1.2.5. Sự thay đổi hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội
sinh trong quá trình tạo mô sẹo ..............................................................65
3.1.2.6. Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng
3.1.3. Sự phát sinh cơ quan ...............................................................................67
3.1.3.1. Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo............................................................67
3.1.3.2. Hình thái giải phẫu khối mô sẹo trong quá trình phát sinh cơ quan ....70
3.1.3.3. Sự thay đổi cường độ quang hợp trong quá trình phát sinh cơ quan
của mô sẹo ..............................................................................................73
3.1.3.4. Sự thay đổi cường độ hô hấp trong quá trình phát sinh hình thái của
mô sẹo.....................................................................................................74
3.1.3.5. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV trong quá trình phát sinh cơ
quan.........................................................................................................75
3.1.4. Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của cây Sưa in vitro ...........................76
3.1.4.1. Ảnh hưởng của khối lượng mô sẹo đến sự tạo dịch treo tế bào cây
Sưa in vitro..............................................................................................76

3.1.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật đến
quá trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo cây Sưa in vitro.......................78
3.2. Thảo luận .......................................................................................................81
3.2.1. Sự tạo cây Sưa in vitro ............................................................................81
3.2.2. Sự tạo mô sẹo ..........................................................................................81
3.2.3. Sự tăng trưởng của mô sẹo......................................................................82
3.2.4. Những biến đổi hình thái giải phẫu trong quá trình hình thành mô sẹo..82
3.2.5. Sự thay đổi cường độ hô hấp trong quá trình tạo mô sẹo .......................83
3.2.6. Vai trò của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá
trình tạo mô sẹo ......................................................................................83
3.2.7. Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng
3.2.8. Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo...............................................................84
3.2.9. Những biến đổi hình thái giải phẫu trong quá trình phát sinh cơ quan
từ mô sẹo.................................................................................................84
3.2.10. Sự thay đổi cường độ hô hấp và quang hợp trong quá trình phát sinh
cơ quan từ mô sẹo...................................................................................85
3.2.11. Vai trò của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá
trình phát sinh cơ quan từ mô sẹo...........................................................85
3.2.12. Sự tạo dịch treo tế bào...........................................................................85
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................87
4.1. Kết luận..........................................................................................................87
4.2. Đề nghị...........................................................................................................87
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................88
PHỤ LỤC................................................................................................................95

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D : 2,4- dichlorophenoxyacetic acid
ABA : abscissic acid
BA : N6
-Benzyladenine
CĐHTTTV : chất điều hoà tăng trưởng thực vật
DNA : deoxyribonucleic acid
GA : gibberelline
GA3 : gibberellic acid
IAA : indol acetic acid
IBA : indolbutyric acid
IUCN : International Union for Conservation of Nature and
Natural Resources
MS : Murashige và Skoog
NAA : α-napthalenacetic acid
RNA : ribonucleic acid
TDZ : thidiazuron
VU : Vulnerable (bị đe doạ, sắp nguy cấp)

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình1.2. Sơ đồ tổng quát chỉ các vùng mô phân sinh ngọn .......................................5
Hình 1.3. Sự tổ chức của vùng phát sinh hình thái để tạo mô phân sinh rễ................8
Hình 1.4. Sự thành lập rễ (với AIA 10-6
M) và mô sẹo (với 2,4-D 10-6
) từ mảnh
lá Sansevieria (Bùi Trang Việt 2000)......................................................13
Hình 1.5. Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi thể hệ......................................17
Hình 1.6. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm
auxin ........................................................................................................19
cytokinin. .................................................................................................23
gibberelline. .............................................................................................26
Hình 1.9. Cấu trúc phân tử abscissic acid.................................................................27
Hình 1.10. Cấu trúc phân tử etylene .........................................................................28
Hình 2.2. Mẫu cấy cây Sưa 1 tuần tuổi để tạo mô sẹo..............................................30
Hình 2.3. Sơ đồ li trích và cô lập các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh ..34
Hình 2.4. Mẫu cấy cây Sưa 1 tuần tuổi để tạo mô sẹo..............................................36
Hình 3.1. Cây Sưa con nảy mầm in vitro sau 1 tuần trên môi trường MS...............39
Hình 3.2. Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên
môi trường MS sau 1 tuần, không hình thành mô sẹo.............................40
Hình 3.3.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của
cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 1mg/l..............................................................................................40
2,4-D 2mg/l và BA 0mg/l........................................................................41
2,4-D 3mg/l và BA 0mg/l........................................................................41

Hình 3.6.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non của cây Sưa
in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D
1mg/l và BA 0,5 mg/l. .............................................................................42
1mg/l và BA 1mg/l. ................................................................................42
2mg/l và BA 0,5mg/l. ..............................................................................43
2,4-D 2mg/l và BA 1mg/l........................................................................43
2,4-D 3mg/l và BA 0,5mg/l.....................................................................44
3mg/l và BA 1mg/l. .................................................................................44
2,4-D 1mg/l..............................................................................................45
2,4-D 2mg/l..............................................................................................46
2,4-D 3mg/l..............................................................................................46

2,4-D 1mg/l và BA 0,1mg/l.....................................................................47
2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l........................................................................47
2,4-D 2mg/l và BA0,5mg/l......................................................................48
2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l........................................................................48
2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l........................................................................49
2,4-D 3mg/l và BA 0,5mg/l.....................................................................49
Hình 3.21.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp)
của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ
sung 2,4-D 1mg/l. ....................................................................................50
sung 2,4-D 2mg/l. ....................................................................................51
sung 2,4-D 3mg/l. ....................................................................................51
sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5 mg/l. ..........................................................52

sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l. ..............................................................52
sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l. ...........................................................53
sung 2,4-D 2mg/l và BA 1mg/l. ..............................................................53
2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l........................................................................54
Hình 3.29. Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên
môi trường MS sau 3 tuần, không hình thành mô sẹo.............................54
Hình 3.30. Sự tăng trưởng của mẫu cấy tạo mô sẹo (trọng lượng tươi và trọng
lượng khô) trên môi trường khác nhau theo thời gian.............................55
Hình 3.31. Sự tăng trưởng của mô sẹo (trọng lượng tươi và trọng lượng khô) trên
môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l và BA 1mg/l theo thời gian
nuôi cấy....................................................................................................56
Hình 3.32.Lát cắt ngang thân non (trụ hạ diệp) cây Sưa in vitro 1 tuần tuổi............57
Hình 3.33. Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 3 ngày, có sự phản phân
hóa của các tế bào nhu mô và sự phân chia của tế bào tượng tầng (mủi
tên). ..........................................................................................................57
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 5 ngày, các tế bào mô
sẹo đang phân chia để hình thành khối mô sẹo. ......................................58
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 7 ngày, các tế bào mô
sẹo đang tách rời nhau. ............................................................................58

Hình 3.36. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có
bổ sung 2,4-D 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng
không ổn định và kéo dài.........................................................................59
bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có
hình dạng không ổn định và kéo dài........................................................60
bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có
hình dạng không ổn định. ........................................................................61
hình dạng không ổn định, có những tế bào kéo dài và những tế bào
hình cầu. ..................................................................................................62
dạng hình cầu ổn định nhất......................................................................63
Hình 3.45. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo từ mẫu cấy khúc cắt thân

non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l theo thời gian.................................................64
Hình 3.46. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo qua
các tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA
1mg/l........................................................................................................65
Hình 3.47. Sự tăng trưởng của mẫu cấy tạo mô sẹo (trọng lượng tươi) trên các
môi trường khác nhau theo thời gian.......................................................66
Hình 3.48. Mô sẹo hoá nâu và chết sau 2 tuần trên môi trường MS có bổ sung
NAA 0,5mg/l và BA 0,1mg/l...................................................................67
Hình 3.49. Mô sẹo phát triển mạnh và hoá nâu dần trên môi trường MS có bổ
sung NAA 0,5mg/l và BA 0,5mg/lsau 6 tuần.........................................68
Hình 3.50. Mô sẹo phát sinh cơ quan, bắt đầu xuất hiện màu xanh trên môi
trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l sau 2 tuần, ..............68
Hình 3.51. Mô sẹo phát sinh hình thái trên môi trường MS có bổ sung NAA
0,1mg/l và BA 3mg/l sau 4 tuần, đã hình thành cơ quan. .......................69
Hình 3.52. Mô sẹo phát sinh hình thái trên môi trường MS có bổ sung NAA
0,1mg/l và BA 3mg/l sau 6 tuần, cơ quan đang phát triển. .....................69
Hình 3.53. Các cấu trúc sơ khởi chồi hình thành trên môi trường MS có bổ sung
NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l......................................................................70
Hình 3.54. Sơ khởi chồi kéo dài trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l
và BA 3mg/l.............................................................................................70
Hình 3.55. Cơ quan chồi phát triển và hình thành hệ mạch dẫn trên môi trường
MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l. ...........................................71
Hình 3.56.Cơ quan chồi phát triển mạnh và hình thành látrên môi trường MS có
bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l........................................................71
Hình 3.57. Cơ quan chồi phát triển mạnh hoàn thiện trên môi trường MS có bổ
sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l.............................................................72
Hình 3.58. Sự thay đổi cường độ quang hợp của mô sẹo trên môi trường tạo cơ
quan MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. ...........73

Hình 3.59. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo trên môi trường tạo cơ quan
MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. ....................74
Hình 3.60. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo nuôi
cấy tạo cơ quan trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA
3mg/l theo thời gain nuôi.........................................................................75
Hình 3.61. Dich treo ở nghiệm thức 2,0 gam mô sẹo phát triển trên môi trường
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần..............................76
Hình 3.62. Dich treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo phát triển trên môi trường
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần..............................77
Hình 3.63. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 2,0 gam mô sẹo trên môi
trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần.................77
Hình 3.64. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi
trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5mg/l sau 1 tuần..............79
trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l sau 1 tuần..............80

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật được bổ sung vào các
môi trường tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro..............................................31
Bảng 2.2. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật được bổ sung vào môi
trường phát sinh cơ quan từ mô sẹo cây Sưa...........................................32
Bảng 2.3. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào các môi
trường tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro. ....................................................37
Bảng 2.4. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào các môi
trường tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo từ cây Sưa in vitro. ......................38
Bảng 3.1. Sự thay đổi trọng lượng tươi và khô của mô sẹo có nguồn gốc từ khúc
cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro theo thời gian nuôi cấy
trên môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ...................55
Bảng 3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi và khô của mô sẹo cây Sưa trên môi
trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l và BA 1mg/l theo thời gian nuôi
cấy............................................................................................................56
Bảng 3.3. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo từ mẫu cấy khúc cắt thân non
(trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D
3mg/l và BA 1mg/l theo thời gian...........................................................64
Bảng 3.4. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo qua các
tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ....65
Bảng 3.5. Sự tăng trưởng (trọng lượng tươi) của mẫu cấy tạo mô sẹo trên các môi
trường có bổ sung 2,4-D và BA ở các nồng khác nhau theo thời gian. ..66
Bảng 3.6. Sự thay đổi cường độ quang hợpcủa mô sẹo trên môi trường tạo cơ
quan MS có bổ sung 2,4-D 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian............73
Bảng 3.7. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo trên môi trường tạo cơ quan
MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian.....................74
Bảng 3.8. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo nuôi
cấy tạo cơ quan trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA
3mg/l theo thời gian nuôi cấy..................................................................75

1
MỞ ĐẦU
Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) là loài cây gỗ quý, hiếm, có giá trị
kinh tế cao. Gỗ thuộc loại nặng, cứng, có vân đẹp, không bị mối mọt và có mùi
thơm đặc biệt ( Đỗ Văn Bản và cs 2009).Chính vì vậy gỗ Sưa được dùng để đóng
đồ đạc gia đình cao cấp, làm đồ mỹ nghệ và chạm khắc. Cây có tán đẹp, hoa thơm
nên được trồng làm cây đường phố và vườn hoa (Bộ Khoa học và Công nghệ Việt
Nam 1996).
Trong y học cổ truyền của Việt Nam và Trung Quốc, nhiều loài trong chi
Dalbergia đã được sử dụng để chữa trị các bệnh về xương khớp, tiêu hoá, mụn
nhọt, ngoại thương xuất huyết (Võ Văn Chi 1999).Những năm gần đây, giới thương
gia Trung Quốc đổ xô săn lùng gỗ Sưa, giá gỗ Sưa rất đắt, vào thời điểm “ sốt”
nhất, giá 1kg gỗ Sưa lên đến hàng chục triệu đồng, thậm chí đến 11 tỉ đồng/m3
.
Chính vì vậy gỗ Sưa đang bị khai thác quá mức.
Cây Sưa được ghi nhận trong danh mục sách đỏ Việt Nam và được chính phủ
Việt Nam quy định trong nhóm IA của nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3
năm 2006 là loại đặc biệt quý hiếm và có nguy cơ đe dọa tuyệt chủng. Theo đánh
giá của hiệp hội bảo tồn thiên nhiên thế giới, cây Sưa hiện nay là VU A1 cd – sắp
nguy cấp (UICN 1997).
Đề tài “Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa (Dalbergia
tonkinensis Prain) in vitro”, nhằm tạo tiền đề cho sự nhân giống Sưa sau này.
Nội dung đề tài tập trung nghiên cứu sự tạo mô sẹo, sự phát sinh cơ quan từ
mô sẹo và bước đầu tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của cây Sưa in vitro.

2
Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)
1.1.1. Phân loại
Giới : Plantae
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliopsida
Bộ : Fabales
Họ : Fabaceae
Phân Họ : Faboideae
Chi : Dalbergia
Loài : Dalbergia tonkinensis Prain
Cây Sưa còn được gọi là Trắc thối (Võ Văn Chi 2003).
1.1.2. Sự phân bố
Ở Việt Nam, cây Sưa phân bố ở các tỉnh: Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Tây,
Ninh Bình, Phú Yên, Khánh Hòa, Đồng Nai, Gia Lai. Trên thế giới, cây Sưa có mặt
ở Trung Quốc (đảo Hải Nam). Cây có tán đẹp, hoa thơm nên được trồng làm cây
đường phố và vườn hoa (Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam 1996).
1.1.3. Đặc điểm sinh học
Cây Sưa (Dalbergia tonkinesis Prain) thuộc gỗ nhỡ, rụng lá, cao 15 – 20 m,
đường kín thân 0,5 – 0,7 m. Vỏ màu xám trắng, thịt vàng, dày 3 mm (Bộ khoa học
và công nghệ Việt Nam 1996)
Gỗ Sưa có dác và lõi phân biệt. Gỗ dác có màu xám và vàng nhạt. Gỗ lõi có
nhiều màu sắc, từ đỏ vàng đến nâu hồng hơi tím, thường có sọc màu sẫm tạo thành
vân rất đẹp cả trên 3 mặt cắt. Tia gỗ nhỏ và hẹp, có cấu tạo tầng. Gỗ sưa có mùi
thơm rất đặc biệt mà gỗ trắc và cẩm lai không có. Trên mặt cắt ngang phần gỗ lõi
vừa mới cắt ngang thường thấy có chất nhựa màu nâu đỏ đùn ra. Gỗ sưa chủ yếu có
lỗ mạch đơn đến kép ngắn 2-3 (gỗ trắc, cẩm lai có mạch kép 5-7). Chất nhựa chứa
trong mạch nhiều, màu nâu đỏ đến nâu vàng. Mô mền không dính mạch thường tụ

3
hợp thành những đám, đặc biệt có chứa chất hữu cơ màu nâu đỏ đến nâu vàng (Đỗ
Văn Bản và cs 2009).
Lá kép lông chim một lần, mang 7 – 17 lá chét, mọc cách, hình bầu dục rộng,
đầu có mũi nhọn ngắn, gốc tròn, gân bậc hai khoảng 10 đôi, mặt dưới màu hơi
mốc.Hoa trắng thơm. Cụm hoa là chùy ở nách lá. Đài dạng chuông, xẻ 5 thùy.Quả
đậu hình bầu dục dài 5 – 7 cm, rộng 2 – 2,5 cm, mùa hoa tháng 2 – 3, mùa quả chín
9 – 11. Quả mang 1 – 2 hạt hình thận, dài 9 mm, rộng 5 mm. Tái sinh bằng hạt và
chồi (Bộ khoa học và công nghệ Việt Nam 1996).
1.1.4. Giá trị
Gỗ Sưa là một trong những loại gỗ quý, hiếm ở nước ta, có giá trị kinh tế cao.
Gỗ thuộc loại nặng, cứng, có vân đẹp, không bị mối mọt và có mùi thơm đặc biệt
(Đỗ Văn Bản và csv 2009).Chính vì vậy gỗ Sưa được dùng để đóng đồ đạc gia đình
cao cấp, làm đồ mỹ nghệ và chạm khắc. Cây có tán đẹp, hoa thơm nên được trồng
làm cây đường phố và vườn hoa (Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam 1996).
Trong y học cổ truyền của Việt Nam và Trung Quốc, nhiều loài trong chi
Dalbergia đã được sử dụng để chữa trị các bệnh về xương khớp, tiêu hoá, mụn
nhọt, ngoại thương xuất huyết (Võ Văn Chi 1999).
1.1.5. Tình trạng
Sưa hiện nay đang bị tận diệt khai thác. Theo IUCN thì cấp đe dọa của nó
hiện nay là VU A1cd - sắp nguy cấp (năm đánh giá 1997).
Dalbergia tonkinensis Prain được ghi nhận trong danh mục sách đỏ Việt
Nam và được chính phủ Việt Nam quy định trong nhóm IA của nghị định
32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006 là loại đặc biệt quý hiếm và có nguy cơ
đe dọa tuyệt chủng.
Giá gỗ Sưa rất đắt. Năm 2007, cơn “sốt” gỗ Sưa bùng phát ở Việt Nam. Ban
đầu chỉ vài trăm ngàn đồng 1kg, chỉ trong một thời gian ngắn, vào thời điểm “sốt”
nhất, giá 1kg sưa lên đến hàng chục triệu đồng, thậm chí đến 11 tỉ đồng/m3
.
1.1.6. Những nghiên cứu về cây Sưa
Tại một số trại cây giống, cây Sưa được nhân giống bằng hom, với điều kiện:

4
phải có giàn phun sương, hom đánh tẻ và sử dụng một số chất kích thích ra rễ như
IBA, NAA (Trần Vinh 2007).
Trên thế giới cũng như Việt Nam những nghiên cứu về cây Sưa chưa được
công bố. Tài liệu về cây Sưa không nhiều và chưa chuyên sâu.
Những nghiên cứu mớivề cây Sưa:
Xác định trình tự đoạn gen tRNA – Leu cho hai loài cây gỗ Sưa (Dalbergia
tonkinensis) và cây gỗ Trắc đỏ (Dalbergiacochinchinensis ) phục vụ việc phân loại
mẫu vật tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã xác định được
trình tụ nucleotide thuộc gen tRNA – Leu (trnL) cho loài D.tonkinensis Việt Nam
và D.cochinchinensis Việt Nam có độ dài là 476bp và 432bp (tương ứng) và mức
độ tương đồng di truyền 99,8%. Mức độ tương đồng di truyền hai loài Dalbergia
của Việt Nam với 13 loàiDalbergia khác trên thế giới dao động từ 94,6% (giữa
D.tonkinensis Việt Nam và D. foliolosa; D.cochinchinensis Việt Nam và D.
foliolosa) đến 100% (giữa D. decipularis và D. frutescens) (Vũ Thị Thu Hiền và cs
2009).
Những kết quả nghiên cứu ban đầu về thành phần hoá học isoflavon và
dihydrophenanthren của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis). Đây là lần đầu tiên khung
dihydrophenanthren được tìm thấy trong chi Dalbergia(Trần Anh Tuấn và cs 2009).
1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật
1.2.1. Khái niệm sự phát sinh hình thái thực vật
Sự phát sinh hình thái thực vật là quá trình phát triển của cơ thể thực vật, tế
bào, mô, cơ quan theo thời gian, thông qua sự phân chia, sự tăng trưởng và sự phân
hóa tế bào. Bao gồm các quá trình (Bùi Trang Việt 2000):
+ Phát sinh mô (histogenesis)
+ Phát sinh cơ quan (organogenesis)
+ Phát sinh phôi (embryogenesis)
Sự phát sinh hình thái phụ thuộc vào hai quá trình căn bản: sự điều hòa
hướng kéo dài tế bào, và sự kiểm soát vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia tế

5
bào. Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái của cơ
quan và cơ thể thực vật (Bùi Trang Việt 2000).
1.2.2. Sự phát sinh cơ quan và phát triển phôi hợp tử
1.2.2.1. Mô phân sinh ngọn chồi và sự phát triển chồi
Mô phân sinh ngọn chồi ở cây hạt kín thường có đường kính khoảng 100 -
200µm, trừ vài trường hợp cá biệt: 50 hay 900µm. Đặc điểm quan trọng của mô
phân sinh ngọn chồi là sự phân lớp và vùng. Ở bắp, mô phân sinh ngọn chồi có hai
lớp: L1 là vỏ (lớp ngoại vi), L2 là thể (bên trong lớp ngoại vi). Ở Arabidopsis, mô
phân sinh ngọn chồi có 3 lớp: L1 và L2 tạo nên võ, L3 là thể, và ở giữa là vùng đỉnh
(Hình 1.2A). Vỏ cho các lớp biểu bì và dưới biểu bì của thân và lá. Một số ít tế bào
từ các phân chia trong vỏ và thể cho sơ khởi lá, thân, nụ nách, và các bộ phận của
hoa (nếu là nụ hoa). Nhiều tác giả chia mô phân sinh ngọn thành ba vùng chính
(Hình 1.2B) (Bùi Trang Việt 2000).
Vùng đỉnh được tạo bởi các tế bào tương đối lớn với không bào to, tế bào
chất ít rARN, chu kì tế bào rất dài, hoạt tính phân chia thấp; tế bào chủ yếu ở pha
G1. Đó là vùng mô phân sinh chờ, chỉ hoạt động khi mô phân sinh ngọn chuyển
sang trạng thái sinh sản.
Vùng bên gồm các tế bào nhỏ hơn với không bào nhỏ, tế bào chất giàu
rARN, có hoạt tính phân chia cao và chu kì tế bào (pha G1 ngắn). Vùng bên thường
được gọi là vòng khởi sinh, hay vùngphát sinh cơ quan, nơi phát sinh lá và các mô
của thân (bao gồm các mô dẫn). Các chồi nách do đó có nguồn gốc ngoại sinh
(ngược với nguồn gốc nội sinh của rễ nhánh).
Hình1.2. Sơ đồ tổng quát chỉ các vùng mô phân sinh ngọn
(Bùi Trang Việt 2000).

6
Vùng lõi (mô phân sinh lõi) nằm dưới vùng đỉnh, được tạo bởi vài dải tế bào
xếp chồng lên nhau. Các tế bào có không bào lớn; hàm lượng rARN, hoạt tính phân
chia và chu kì tế bào có những đặc tính trung gian so với hai vùng đỉnh và bên. Đây
là vùng phát sinh mô, chỉ cho mô lõi.
Ở Arabidopsis, L1 cho ra biểu bì của chồi, lá và hoa, L2 sản xuất ra các mô
nền và các tế bào mầm (germ cells) và L3 cho ra các mô mạch của thân và hầu hết
các mô bên trong của lá và hoa. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của mỗi lớp rất linh động
và có thể thích ứng với sự tăng sinh tế bào xảy ra trong các lớp tế bào như được
thấy trong các nghiên cứu về gen khảm (Carles et al. 2003).
Các nghiên cứu vi phẫu thuật dùng laser để cắt chính xác một vùng/lớp tế
bào của mô phân sinh ngọn chồi hay xử lý các hóa chất lên mô phân sinh ngọn chồi
của cây cà chua kết hợp với sự quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét, các phân tích
mô học và kĩ thuật lai in-situ đã cho thấy vai trò cũng như mối liên hệ giữa các vùng
và lớp trong mô phân sinh ngọn chồi (Reinhardt et al. 2003).
Khi cắt một đường qua mô phân sinh ngọn chồi, mô phân sinh ngọn chồi tiếp
tục phát triển và hình thành các sơ khởi lá, hai mô phân sinh ngọn chồi mới được
hình thành. Sự cắt bỏ vùng trung tâm không ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan
nhưng dẫn đến sự hình thành một trung tâm mô phân sinh mới từ các tế bào ở vùng
ngoại vi. Sự hình thành trung tâm mô phân sinh mới có liên quan đến cảm ứng lệch
vị trí của gen LeWUS, một đồng dạng của gen WUSCHEL. Tuy nghiên, sự cắt bỏ
một phần vùng trung tâm không dẫn đến sự cảm ứng lệch nhanh chóng của gen này.
Sự cắt bỏ một vùng ngoại vi và các xử lý stress không ảnh hưởng đến chức năng
của vùng trung tâm. Các xử lý stress không ảnh đến tốc độ hình thành cũng như vị
trí của sơ khởi lá. Tuy nhiên, trong sự cắt qua vùng ngoại vi, tùy vào vị trí cắt có thể
ảnh hưởng đến vị trí hình thành của các sơ khởi lá. Ngược với sự hình thành một
trung tâm mô phân sinh mới khi cắt bỏ vùng trung tâm, lớp L1 không được tái sinh
khi vùng này bị cắt bỏ hoàn toàn. Sự cắt L1 tại vùng trung tâm có ảnh hưởng đến sự
phân chia và biệt hóa tế bào của L2 và L3. Sự thay thế lớp L1 từ L2 có thể được

7
thực hiện khi có sự hiện diện của lớp L1 bên cạnh. Nếu không có thông tin từ lớp
L1 bên cạnh, sự xác định L1 không thể được thực hiện được từ các tế bào lớp L2.
1.2.2.2. Mô phân sinh ngọn rễ và sự hình thành rễ
Một rễ đang tăng trưởng đầy đủ gồm ba vùng chức năng: vùng mô phân
sinh,vùng kéo dài và vùng trưởng thành. Vùng mô phân sinh bao gồm chóp rễ, vùng
trung tâm yên lặng và vùng tế bào tăng trưởng nhanh (Evert 2006). Ngoài nhiệm vụ
giữ chặt cây xuống đất, rễ đảm nhiệm một vai trò quan trọng là hấp thu nước và các
chất dinh dưỡng cần thiết cho cây nhờ các lông rễ và các tế bào biểu bì của vùng rễ
non chưa phân hóa sube (Bùi Trang Việt 2002, Taiz and Zeiger 2005).
Ở đơn tử diệp, sự biệt hóa các loại tế bào của mô phân sinh ngọn rễ có nguồn
gốc từ cùng một tế bào trong suốt quá trình phát sinh phôi, trong khi ở song tử diệp
sự biệt hóa hình thành rễ có nguồn gốc từ tế bào gốc của phôi (Waisel et al. 2002).
Ở Arabidopsis, vào giai đoạn chuyển đổi của phôi, tế bào trên cùng của dây treo sẽ
phân chia cho hai tế bào, một tế bào sẽ là nguồn gốc của vùng trung tâm yên lặng và
một tế bào sẽ là nguồn gốc của các tế bào chóp rễ (Scheres et al. 1994). Trong quá
trình phát triển, tế bào sinh rễ của phôi có sự tích lũy tinh bột và sự không bào hóa
(Gilroy and Mason 2008, Waisel et al. 2002 ).
Sự tăng trưởng của rễ tùy thuộc vào sự hoạt động của mô phân sinh ngọn rễ.
chính các tế bào mô phân sinh cung cấp nguồn tế bào mới cho sự tăng rộng và kéo
dài của rễ. Tuy nhiên, các dữ liệu về di truyền và sự dùng tia laser để loại vùng
trung tâm cho thấy chính vùng trung tâm ức chế sự biệt hóa các tế bào bên cạnh. Sự
hủy các tế bào trung tâm nhanh chóng làm mất dấu hiệu ức chế, dẫn đến sự biệt hóa
các tế bào trụ bên cạnh. Nếu sự hình thành vỏ hay trụ bì tách biệt khỏi khỏi các tế
bào trưởng thành hơn, chúng sẽ bị giữ nguyên trạng thái chưa trưởng thành. Sự
tương tác giữa các tế bào bên trong mô phân sinh rễ rất đặc biệt. sự hình thành các
cấu trúc của rễ chịu sự điều khiển theo hai kiểu truyền tín hiệu: tín hiệu ức chế từ
vùng trung tâm mô phân sinh rễ và tín hiệu cảm ứng từ rễ trưởng thành (Evert 2006,
Rebuillat et al. 2009, Waisel et al. 2002). Ở lúa, người ta nhận thấy, sự phân chia
thẳng góc đầu tiên của các tế bào vùng trung tâm yên lặng sẽ dẫn đến hình thành

8
các tế bào ở trụ giữa, sự phân chia song song đầu tiên sau nhiều lần phân chia thẳng
góc dẫn đến hình thành các tế bào vùng ngoại biên của chóp rễ. Sự phân chia thẳng
góc đầu tiên của tế bào cạnh vùng trung tâm yên lặng khởi phát sự sản sinh ra tế bào
sẽ hình thành biểu bì và nội bì. Tám lần phân chia song song không cân xứng liên
tục sau lần phân chia thẳng góc đầu tiên dẫn đến sự hình thành biểu bì, nội bì,
cương mô và năm lớp tế bào vỏ (Evert 2006, Rebuillat et al. 2009).
Trong sự tạo rễ nhánh, các rễ nhánh được thành lập từ một nhóm tế bào ở
tương đối sâu bên trong rễ chính. Một cách tổng quát, sự thành lập sơ khở rễ gồm
các giai đoạn chính sau đây (Hình 1.3) (Bùi Trang Việt 2000):
Sự phản phân hóa của một nhóm tế bào nằm tương đối sâu bên trong: các tế
bào chu bì hay các tế bào bao quanh tầng phát sinh nếu rễ già hơn.
Sự tái lập hoạt tính phân chia của các tế bào nói trên theo cách của các tế bào
mô phân ngọn, để tạo sơ khởi rễ.
Sơ khởi rễ tiêu hủy nhu mô vỏ và kéo dài ra ngoài.
Trong sự tạo rễ bất định, một cách tổng quát, thường gồm ít nhất hai giai
đoạn có thể phân biệt được dưới kính hiển vi: giai đoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào
của tầng phát sinh libe-mộc hay chu luân và giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ này (Mai
Trần Ngọc Tiếng và cs. 1980). Sự tạo sơ khởi rễ được khởi phát từ một chất trích từ
lá Mười giờ (gọi là portulal), hay auxin ở nồng độ cao; sự kéo dài sơ khởi rễ được
kích thích bởi auxin ở nồng độ thấp (Bùi Trang Việt 2000).
Hình 1.3. Sự tổ chức của vùng phát sinh hình thái để tạo mô phân sinh rễ
(sơ khởi rễ) (Bùi Trang Việt 2000).

9
1.2.2.3. Sự phát triển phôi hợp tử
Ở phôi hợp tử, sự phân chia không cân xứng đầu tiên cho ra tế bào gốc với
không bào lớn, và tế bào ngọn có không bào nhỏ hơn nhưng có nhân to và tế bào
chất đậm đặc. Sự phân chia của tế bào gốc được thực hiện theo hướng ngang để
hình thành một chuỗi tế bào nhỏ dạng sợi. Hầu hết các tế bào nhỏ này sẽ hình thành
dây treo, có nhiệm vụ dẫn truyền chất dinh dưỡng từ mô mẹ. Một tế bào nhỏ gần tế
bào ngọn nhất được gọi là hypophysis, sẽ hình thành nên các phần của phôi như
trung tâm mô phân sinh rễ và tế bào gốc của rễ (tế bào sinh rễ) (Jenik and Barton
2005, Weijers and Jürgens 2005).
Từ hợp tử, sự phát triển phôi trong hột được kiểm soát theo thời gian và
không gian, qua hai giai đoạn chính: sinh phôi và trưởng thành phôi (Bùi Trang Việt
2000).
Sự sinh phôi ở thực vật gồm hai giai đoạn chính: phân đoạn và tạo cơ quan
phôi.
 Đặc tính của giai đoạn:Phân đoạn là sự định hướng phân chia tế bào chặt
chẽ:
- Lần phân chia đầu tiên của hợp tử thường theo hướng ngang, tạo hai tế bào
không bằng nhau: tế bào ngọn nhỏ là nguồn gốc của phôi, tế bào gốc lớn hơn là
nguồn gốc của dây treo.
- Các lần phân chia tiếp theo thay đổi tùy loài, nhưng luôn luôn xác định:
thông thường, phôi ở giai đoạn bốn tế bào là một chuỗi tế bào bốn tầng hay ba tầng
(tầng trên gồm hai tế bào); mỗi tầng tế bào sẽ cho một vùng xác định trong phôi. Sự
phân đoạn xem như hoàn thành ở giai đoạn phôi hình cầu với biểu bì sơ khởi.
Tạo cơ quan phôi
Giai đoạn này ở dicot bắt đầu ngay sau giai đoạn phôi hình cầu, với sự xuất
hiện của các vùng mô phân sinh chồi và rễ; các biến đổi hình thái sau đó sẽ dẫn tới
các giai đoạn phôi hình trái tim, hình cá đuối, và sự xuất hiện rễ mầm và các tử
diệp. Phôi trưởng thành bao gồm trục hạ diệp-rễ, các mô phân sinh rễ và chồi ở hai
cực đối nhau và một hay hai tử diệp.

10
Tóm lại, sự phát triển phôi xảy ra theo một trình tự đặc sắc. Sự phân hóa cực
chồi và cực rễ cho thấy tính hữu cực của thực vât được thiết lập từ rất sớm. sự phân
biệt giữa hai cực ngày càng rõ qua các lần phân chia và kéo dài tế bào, trong các
giai đoạn sinh phôi liên tiếp nhau. Theo dõi sự sinh phôi giúp ta hiểu rõ hơn về cấu
trúc và sự liên tục giữa các cơ quan trong một cơ thể trưởng thành.
1.2.3. Cơ sở phân tử của sự phát sinh cơ quan và phát sinh phôi
Sự phát sinh hình thái là sự biểu hện của các thông tin di truyền được mã hóa
trong các trình tự ADN của genom và sự tương tác của các thông tin đó với nhau và
với môi trường (Frank 2002).
Ở tế bào chân hạch, một gen gồm hai vùng chuyên biệt: vùng điều hòa và
vùng mã hóa. Vùng điều hòa kiểm soát sự sao chép, bao gồm các promoter và yếu
tố điều hòa cis. Promoter là nơi cho phép RNA polymerase bắt đầu sự sao chép.
Yếu tố điều hòa cis là các trình tự DNA ngắn (6-8 cặp nucleotide) cho phép nhận
biết nhiều hormone (động vật, thực vật). Trên yếu tố điều hòa cis sẽ cố định yếu tố
điều hòa trans (có bản chất protein). Các enhancer là trường hợp đặc biệt của yếu tố
điều hòa cis. Sự liên kết của yếu tố điều hòa trans trên enhancer (sự điều hòa trans)
dẫn tới sự hoạt hóa của promoter (sự điều hòa cis) và sự gắn của ARN polymeraz
trên promoter qua trung gian phức hợp TFII. Từ đó có sự sao chép các gen chuyên
biệt. Vùng mã hóa của các gen tế bào chân hạch là một chuổi lần lượt các exon và
intron nằm xen kẽ nhau,intron được sao chép nhưng không được dịch, exon là trình
tự được dịch thành các protein (Karp 1999, Hughes 1996).
Để nghiên cứu sự biểu hiện của gen, người ta thường dùng kỹ thuật “ADN
footprinting”, cây chuyển gen hay theo dõi sự thay đổi hàm lượng của vài mARN
chuyên biệt … Trắc nghiệm GUS (β-glucuronidase) thường được sử dụng để chứng
minh nhanh sự biểu hiện của gen được chuyển vào tế bào thực vật. Theo đó, tế bào
có mang gen GUS sẽ có màu xanh lơ đậm do sự tạo sản phẩm màu sau khi được ủ
trong dung dịch có chứa đài chất của β-glucuronidaz là X-Gluc (5-bromo-4-cloro-
3indolyl-β-Dglucuronid acid, dạng muối cyclohexyl amonium) (Bùi Trang Việt
1994, Frank et al. 2002, Hughes 1996).

11
Có rất nhiều gen tham gia trong quá trình điều hòa sự phát sinh phôi và sự
phát sinh cơ quan. Ở mỗi giai đoạn phát triển khác nhau, các gen khác nhau sẽ được
hoạt hóa trong các nhóm tế bào khác nhau, ở những thời điểm khác nhau (sự điều
hòa theo không gian và thời gian). Mỗi nhóm tế bào theo một con đường phát triển
riêng biệt để trở thành một loại mô chứa các tế bào chuyên biệt, từ đó cho những
cấu trúc hình thái thích ứng cho những chức năng đặc biệt. Mỗi tế bào cơ thể thừa
hưởng toàn bộ thông tin di truyền của tế bào ban đầu nhưng chỉ có một phần
chương trình được biểu hiện trong các tế bào phân hóa; tiềm năng sinh phôi của các
tế bào đã phân hóa bị đàn áp bởi các tương quan trong một cơ thể nguyên vẹn (Bùi
Trang Việt 2003, Scanlon 2003).
Quá trình sinh phôi thể hệ thật sự là một chương trình biểu hiện gen. Trong
đó, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có vai trò trung tâm trong việc khởi động
dòng thông tin tế bào. Ở mỗi loài khác nhau, nhu cầu cảm ứng sự sinh phôi khác
nhau, đòi hỏi hàm lượng cũng như loại chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác
nhau (Chakrabarty et al. 2003).
Trong giai đoạn tăng trưởng và trưởng thành của phôi, có sự thay đổi trong
chương trình biểu hiện gen, một số gen được khởi động trong khi một số gen ngưng
hoạt động. Các gen biểu hiện có tính chuyên biệt, theo từng giai đoạn phát triển.
Vùng biểu hiện gen xuất hiện ở vị trí đánh dấu mô phân sinh ngọn trong phôi
chưa trưởng thành trước khi vùng này có thể thấy được dưới kính hiển vi. Sự phát
triển của mô phân sinh ngọn được khởi đầu bằng sự hình thành một trung tâm tổ
chức dưới ngọn nhằm xác định các tế bào ở gốc ngọn. Gen chỉ thị SAM đầu tiên
biểu hiện trong phôi là WUSCHEL (WUS). Sự biểu hiện gen này được định vị đầu
tiên trong 4 tế bào ngọn của phôi giai đoạn 16 tế bào. Sự phân chia tế bào sau đó
giúp hình thành một nhóm tế bào dưới ngọn lớn hơn. Có lẽ chức năng của WUS là
duy trì trạng thái đa năng của các tế bào trong trung tâm tổ chức và xác định các tế
bào gốc. Sự hình thành các tế bào gốc được đánh dấu bằng sự biểu hiện của
SHOOTMERISTEMLESS (STM) trong giai đoạn phôi hình cầu và CLAVATA 3
(CLV3) trong phôi hình tim. Trong khi STM định vị trong vùng trung tâm của ngọn

12
phôi bao gồm các tế bào gốc và trung tâm tổ chức thì sự hiện diện của CLV3 giới
hạn trong các tế bào gốc (Groβ-Hardt and Laux 2003, Tahir and Stasolla 2006).
Các kết quả nghiên cứu về việc biểu hiện gen trong những năm gần đây đã
cho thấy có rất nhiều nhóm gen liên quan trong quá trình phát sinh hình thái, hình
thành và phát triển phôi thể hệ ở thực vật. Các nhóm gen đó bao gồm: các gen đáp
ứng với hormon (DcArg-1, các đồng dạng của pJCW1, pJCW2,DcECP63, Em,
DcECF31), gen giữ nhà (Top 1, EF-la, CEM6, H3-1, CGS102, CGS103, CGS201),
gen điều khiển các con đường truyền tín hiệu (SERKs, swCDKs, CRKs, MsCPK3),
gen đồng dạng (Sbh1, CHB1-CHB6, DcDB1), gen mã hóa các protein ngoại bào
(EP3-1, EP3-2, PgChi-1, PgGlu-1, EP2, DcAGP1), gen điều khiển sự trưởng thành
của phôi (Mat1, Dc2.15, Dc3, Dc8, DcEMB1, Em, DcECP31, DcECP40, MsLEC1,
MsLeC2) … (Chugh & Khurana 2002, Hughes 1996).
Các phân tích về sự biểu hiện gen cho thấy các gen đồng dạng với
WUSCHEL (WUS) đóng vai trò trong sự hình thành các phần của phôi. Trước sự
phân chia, phôi hợp tử hiện diện RELATED HOMEOBOX (WOX). Sau sự phân
chia, WOX2 chỉ biểu hiện ở ngọn, trong khi WOX9 biểu hiện ở gốc của tế bào con.
WUS cần cho sự hình thành mô phân sinh ngọn chồi, và có khả năng những gen
WOX khác đóng vai trò trong sự điều hòa các chức năng đặc trưng của tế bào nơi
chúng biểu hiện. Sự khác biệt trong phân chia tế bào để hình thành các phần của
phôi từ các tế bào con dẫn đến các khác biệt trong sự biểu hiện của các gen mã hóa
cho các nhân tố sao mã Homeodomain (các gen đồng dạng với WUSCHEL) và
nhiều gen khác. Tuy nhiên, nguyên nhân dẫn đến các khác biệt này vẫn chưa được
biết. Có khả năng chúng cần sự truyền tín hiệu MAPK (mitogen-activated protein
kinase) (Feraru and Friml 2008, Bögre and Beemster 2008).
1.3. Sự phát sinh hình thái thực vật in vitro
Hai phương pháp thực nghiệm thường được dùng nhất để nghiên cứu sự phát
sinh hình thái thực vật là (Bùi Trang Việt 2000):
Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển
sau đó.

13
Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời
của một cơ thể thực vật.
1.3.1. Sự tạo mô sẹo
Mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường
được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ
(Hình 1.4). Do đó, cây non (nguyên vẹn hay được cắt đoạn) hay những mảnh thân
non của cây trưởng thành (đang trong quá trình tạo các loại mô và cơ quan) dễ cho
mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh (như
2,4-D) được áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với citokinin. Ngược lại những mảnh cơ
quan trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng như không có
khả năng tạo mô sẹo (Bùi Trang Việt 2000).
Sự tạo mô sẹo in vitro, nhờ auxin, thuộc về một trong ba quá trình (Bùi
Trang Việt 2000):
Sự phản phân hóa của tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan): nhu
mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
Sự phân chia của tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe-mộc). Các tế bào
tượng tầng của phần lớn dicot dễ phân chia dưới tác động của auxin, thậm chí
không cần auxin ngoại sinh như ở các cây cỏ hay dây leo.
Hình 1.4. Sự thành lập rễ (với AIA 10-6
M) và mô sẹo (với 2,4-D 10-6
) từ mảnh
lá Sansevieria(Bùi Trang Việt 2000).

14
Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). Quá trình này được
ưu tiên áp dụng ở monocot, vì các cây này không có tượng tầng điển hình như các
cây dicot, và các tế bào nhu mô khó phản phân hóa (so với dicot).
Sự tạo mô sẹo liên quan đến tình trạng sinh lý của mô cấy, liên quan tới việc
sử dụng auxin riêng lẻ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ của auxin
Sự tăng tưởng của mô sẹo có thể được theo dõi bằng phương pháp cân trọng
lượng tươi và trọng lượng khô. Sự thay đổi trọng lượng tươi và khô được biểu diển
dưới dạng đồ thị là một đường cong tăng trưởng hình chữ S gồm 3 pha (Mai Trần
Ngọc Tiếng 2001):
Pha ức chế: Nguyên sinh chất tăng nhưng số lượng tế bào không tăng. Đây là
pha chuẩn bị cho sự phân bào sắp tới. Có sự tái tổng hợp enzim và protein cần thiết
cho sự tăng trưởng tế bào. Tổng hợp hay dự trữ các tiểu đơn vị như: axit béo, axit
amin, glucid, vitamin để tạo đủ nguyên sinh chất cho 2 tế bào.
Pha lũy thừa: Là giai đoạn hoạt động tăng trưởng và phân nhân.
Pha định vị: Hoạt động tăng trưởng chậm lại, số tế bào chết gai tăng, số tế
bào còn lại phân chia rất chậm, kết quả số tế bào còn lại hầu như ổn định. Tế bào
ngừng tăng trưởng có 2 lý do chính: các yếu tố dinh dưỡng đã bị cạn dần, và môi
trường trở thành độc do sản phẩm tiết của tế bào.
1.3.2. Sự tạo dịch treo tế bào
Dịch treo tế bào là dịch chứa các tế bào cô lập và các nhóm nhỏ tế bào phân
tán và di chuyển trong một môi trường lỏng di động. Dịch treo tế bào thường được
khởi phát bằng cách đặt mô sẹo vào môi trường lỏng được lắc (30 – 150 vòng/phút).
Tuy nhiên cũng có thể từ cây con, phôi hay mô phân sinh ngọn. Giống như đối với
mô sẹo, môi trường dịch treo tế bào có một hay vài auxin (thường ở nồng độ thấp
hơn), kết hợp với citokinin hay không (BùiTrang Việt 2000).
Sự tăng trưởng của dịch treo tế bào được đo bởi số tế bào, khối lượng hay thể
tích tế bào. Đường cong tăng trưởng của dịch treo tế bào có dạng hình chữ S bình
thường; nếu dịch treo được pha loãng (bởi môi trường mới) ở giai đoạn tăng trưởng

15
nhanh hay cực đại, ta có một chu kì tăng trưởng mới của dịch treo. Sự tăng trưởng
của dịch treo tế bào phụ thuộc chủ yếu vào các quá trình (Bùi Trang Việt 2000):
Phân chia tế bào: Sự phân chia tế bào trong dịch treo tế bào tùy thuộc chủ
yếu vào sự hiện diện của auxin, ở nồng độ thích hợp, trong môi trường nuôi cấy.
Tạo nhóm tế bào: Sự phân chia tế bào tích cực thường dẫn tới sự tạo nhóm
các tế bào. Sự phân chia tế bào thường nhanh trong các nhóm, chậm hơn ở các tế
bào cô lập. Sự đổi mới môi trường thường xuyên sẽ duy trì trạng thái phân chia tế
bào hoạt động, và do đó làm gia tăng sự tạo các nhóm tế bào.
Tách rời tế bào: Ngược với sự tạo nhóm tế bào, quá trình tách rời thường gia
tăng trong pha tĩnh, khi tế bào ít phân chia, dẫn đến sự phóng thích các tế bào cô lập
hay các nhóm nhỏ tế bào. Mức độ tách rời tế bào tùy thuộc vào nguồn gốc mô sẹo,
quá trình nuôi cấy mô sẹo, hàm lượng hormone trong mô và trong môi trường. Hàm
lượng auxincao thường làm tăng sự tách rời tế bào nhất là khi có thêm cytokinin
hay nước dừa.
Dịch treo tế bào lý tưởng có sự phân chia tế bào tích cực, sự cân bằng tốt
giữa hai quá trình tạo nhóm và tách rời tế bào và có tính đồng nhất cao về hình thái
và sinh hóa. Dịch treo tế bào lý tưởng là một dịch mịn, hầu như chỉ bao gồm các tế
bào có khả năng sinh phôi, cô lập hay họp thành những nhóm nhỏ chứa từ vài tới
vài chục tế bào. Tế bào có khả năng sinh phôi, giống các tế bào của mô phân sinh,
có các đặc tính căn bản: kích thước nhỏ, đẳng kính, vách mỏng, tế bào chất đậm
đặc, nhân to, hạch nhân đậm màu và khá to (Bùi Trang Việt 2000).
1.3.3. Sự phát sinh cơ quan
Sự phát cơ quan có thể được thực hiện từ chồi hiện diện sẵn hay từ sự tạo
mới. Các chồi tận cùng và các chồi nách hiện diện sẵn, ở trạng thái hoạt động hay
nghĩ, có thể phát triển in vitro (không phải sự tạo mới cơ quan). Một mô cấy chứa
một chồi duy nhất có thể phát triển thành một chồi duy nhất hay cụm chồi, tùy
thuộc vào loài, trạng thái sinh lý của mô cấy và môi trường nuôi cấy (Bùi Trang
Việt 2000, George et al. 2008).

16
Sự nuôi cấy mô phân sinh ngọn là một phương pháp hiệu quả trong vi nhân
giống, sản xuất cây sạch bệnh bảo tồn và lưu trữ nguồn gen. Sự phát sinh cơ quan
chịu ảnh hưởng bởi tuổi, trạng thái sinh lý của mô cấy của chính những cơ quan bên
dẫn xuất từ mô phân sinh ngọn và sự thay đổi của các điều kiện môi trường, đặc biệt
là vai trò của của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. (Bùi Trang Việt 2000).
Kích thích sự phát triển của chồi hiện diện sẵn là phương pháp vi nhân giống
chậm nhất, nhưng là cách thông dụng, dễ áp dụng nhất trong hầu hết các loài thực
vật, đặc biệt là cây gỗ (vì sự sinh phôi thể hệ và tăng sinh chồi/rễ bất định khó thực
hiện hơn ở loài cây này). Trước sự phân hóa để tạo tầng phát sinh của chồi được tạo
mới, tiền mô phân sinh hay tế bào phân hóa đều phải trải qua sự tái hoạt động. Sự
tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng sự đàn áp các hiệu ứng
cản tương quan (thí dụ: cắt bỏ vùng ngọn để gỡ ưu thế ngọn) hay trên mô cấy nhờ
các môi trường thích hợp. Sự tái hoạt động gồm hai giai đoạn: khử phân hóa và tái
phân hóa (Bùi Trang Việt 2000, Taiz and Zeiger 2005).
Trong sự tạo mới chồi từ các tế bào lá đã phân hóa, người ta cho rằng có sự
hiện diện của các nhóm tế bào đặc biệt, gọi là mô đích. Các tế bào này là nơi nhận
các thông tin hóa học, đặc biệt là chất điều hòa tăng trưởng thực vật: nếu auxin có
tác dụng tạo rễ đối với các mô quanh mạch (nguồn gốc nội sinh của rễ) thì cytokinin
có tác dụng tạo chồi đối với các mô ngoại vi (nguồn gốc ngoại sinh của chồi). Tỉ lệ
auxin/cytokinin xác định một chương trình phát sinh hình thái (rễ hay chồi) (George
et al. 2008).
1.3.4. Sự phát sinh và thu nhận phôi thể hệ
Sự phát sinh phôi thể hệ là con đường trung tâm của sự vi nhân giống thực
vật và có vai trò đặc biệt quan trọng trong các nghiên cứu về phát sinh hình thái
thực vật. Sự thu nhận phôi thể hệ thường bao gồm hai gai đoạn: giai đoạn các tế bào
sinh phôi (mô sẹo, dịch treo tế bào), với sự hiện diện của auxin riêng lẻ hay kết hợp
với citokinin và giai đoạn tiến hóa phôi thể hệ từ các tế bào sinh phôi, với sự giảm
hay loại bỏ auxin (Hình1.5). Dưới các điều kiện xác định, các tế bào mô sẹo hay

17
dịch treo tế bào có thể cho các sơ khởi cơ quan (sinh cơ quan) hay phôi (sinh phôi
thể hệ) dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật (Bùi Trang Việt 2003).
Tất cả tế bào sinh dưỡng trong cây chứa toàn bộ thông tin cần thiết để tạo
một cây hoàn chỉnh và đầy đủ chức năng (Merkle et al. 1995).
Phôi thể hệ là phôi được tạo ra từ tế bào thể hệ (tế bào dinh dưỡng 2n) theo
con đường sinh phôi thể hệ, tế bào thể hệ (tế bào dinh dưỡng) đóng vai trò sinh
phôi hợp tử, và sự phát triển phôi cũng qua các giai đoạn tương tự như trong sinh
phôi hợp tử (Bùi Trang Việt 2000).
Sự tạo phôi thể hệ đầu tiên được ghi nhận ở Cà rốt (Reinert 1958, Steward et
al. 1958), và đã được chứng minh ở nhiều loài thực vật khác nhau (Brown et al.
1995, Dwartan et al. 1995).
Môi trường phổ biến nhất trong sinh phôi thể hệ là môi trường MS
(Murashige & Skoog 1962) hay các môi trường cải tiến của MS.
Đặc tính căn bản của tế bào sinh phôi rất giống với cá tế bào của mô phân
sinh. Tuy nhiên, về mặt phát sinh hình thái có sự khác nhau: tế bào sinh phôi cho ra
phôi, còn tế bào mô phân sinh chỉ cho ra mô và cơ quan (George 2008).
Phôi thể hệ được cảm ứng từ nhiều vật liệu thực vật khác nhau như: từ phôi
hợp tử, cây con từ hạt nảy mầm, đỉnh sinh trưởng chồi và chồi hoa. Quá trình tái
sinh xảy ra tuần tự từ sự khởi đầu cấu trúc lưỡng cực của tế bào, sự tạo tiền phôi, sự
Hình 1.5. Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi thể hệ

18
phát triển và trưởng thành của phôi hợp tử, sự nảy mầm thành cây con và chuyển
cây con từ môi trường nuôi cấy in vitro sang môi trường đất (Merkle et al 1995).
Bên cạnh auxin, mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy (tương tác giữa các
tế bào) có vai trò quan trọng trong sự nuôi cấy tế bào. Thí dụ, ở dịch treo tế bào cà
rốt, mật độ đạm cao (100.000 tế bào/ml) cần cho sự thành lập các nhóm tế bào sinh
phôi, trong khi mật độ thấp (20.000 tế bào/ml) kích thích sự phát triển phôi. Trong
vài trường hợp, các hormone tăng trưởng thực vật và các yếu tố vật lý hóa học khác
nhau cũng có vai trò nhất định (Bùi Trang Việt 2000).
1.4. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Thuật ngữ “chất điều hòa thực vật” (plant regulator) được dùng để chỉ một
cách tổng quát những hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực
vật và các chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng kích thích hay cản, nói cách khác,
làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở nồng độ thấp. Chúng không
phải là chất dinh dưỡng, tức là không phải là những vật liệu cung cấp năng lượng
hay những nguyên tố khoáng cần thiết cho thực vật (Bùi Trang Việt 2000).
Định nghĩa hormone thực vật: “hormone thực vật là một chất hữu cơ do tế
bào tạo ra tại một nơi nào đó trong cơ thể thực vật và được chuyển tới một nơi khác,
ở đó, với nồng độ rất thấp chất ấy gây ra một phản ứng sinh lý” (Bùi Trang Việt
2000).
Hiện nay, người ta biết được các nhóm chất điều hòa tăng trưởng thực vật có
tác động trực tiếp đến sự tăng trưởng của tế bào và được sử dụng trong nuôi cấy mô
tế bào gồm: auxin, cytokinin, gibberelline, acid abscissic và ethylen.
1.4.1. Auxin
Auxin là yếu tố quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin có
ảnh hưởng khác nhau trong các giai đoạn khac nhau của quá trình phát sinh phôi
cũng như trong sự phát sinh cơ quan. Nồng độ auxin trong tế bào mô được điều
khiển bởi tốc độ sinh tổng hợp, trạng thái hoạt động và sự vận chuyển, trong khi khả
năng đáp ứng với auxin của tế bào hay mô được xác định bởi hàm lượng và hoạt
động của con đường truyền tín hiệu (Hobbie 2007).

19
Auxin được xác định và cô lập đầu tiên vào khoảng những năm 1920 và
1930 dựa trên dựa trên thí nghiệm kéo dài khúc cắt diệp tiêu. Phần lớn auxin hiện
diện ở thực vật bậc cao là acid indole-3-acetic (IAA), với hàm lượng khoảng 10-100
mg/g trọng lượng tươi (IAA là auxin nôi sinh đầu tiên được phát hiện ở thực vật).
Một số loài thực vật tổng hợp thêm các phân tử auxin khác như 4-chloroindole-3-
acetic acid, phenylacetic acid và indole-3-butyric acid (IBA). Ngay sau khi dạng
auxin IAA được xác định, các nhà sinh hóa đã tiến hành tổng hợp nhiều hợp chất có
hoạt tính auxin. Ba auxin tổng hợp quan trọng nhất là 2,4-dichlorophenoxyacetic
acid (2,4-D), 1-naphthalene acetic acid (1-NAA) và picloram (Davies 1995,
Litwack 2005, Taiz and Zeiger 2005).
IAA được tổng hợp ở mô phân sinh, lá non, các trái và hột đang tăng trưởng.
Sự sinh tổng hợp IAA tự do ở thực vật bắt đầu từ chorismate hay anthranilate dẫn
đến sự tổng hợp indol và amino acid tryptophan. Có hai con đường tổng hợp IAA:
con đường phụ thuộc tryptophan hay con đường độc lập tryptophan. Các con đường
này xuất hiện ở nơi có sự điều hòa tăng trưởng và sự điều hòa ngược. Hầu hết auxin
được thấy ở thực vật (99% trong trường hợp Arabidopsis) có dạng liên kết với các
phân tử khác như glucid, amino acid và peptid. Auxin liên kết được xem như một
auxin.

20
nguồn auxin dự trữ chủ yếu. Tuy nhiên, trong một vài trường hợp, chúng có thể là
dạng trung gian của quá trình thoái biến. IAA liên kết với amino acid bởi họ enzym
GH3. Phản ứng ngược để phóng thích IAA từ IAA-amino acd được xúc tác bởi họ
enzym thủy giải IAA-amino acid. IBA cũng là một dạng dự trữ của auxin mặc dù
chúng có thể tác dụng trực tiếp. IBA có thể chuyển thành IAA thông qua quá trình
oxy hóa peroxisome tại vị trí β (Litwack 2005, Taiz and Zeiger 2005).
Auxin dóng vai trò trung tâm trong sự điều hòa hiện tượng ưu thế ngọn, sự
hình thành rễ thứ cấp, lão suy của lá, phân hóa mô mạch, hình thành nụ hoa và tăng
tưởng trái. Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như
không tác động trên mô phân sinh sơ cấp. Auxin tác động lên sự tăng trưởng theo
đường kính. Trong sự tăng trưởng của thân non và diệp tiêu, auxin điều khiển sự
kéo dài thân bằng cách gia tăng tính giãn vách tế bào. Auxin có khả năng cảm ứng
trực tiếp tế bào nhu mô thành các tổ chức mô dẫn. Hầu hết các auxin hiện diện trong
mô phân sinh ngọn và các sơ khởi lá nhỏ nhất. Theo Scanlon (2003), auxin được tạo
ra từ các lá già hơn di chuyển tới mô phân sinh ngọn. Mặt khác, sự di chuyển hữu
cực của auxin cần thiết cho quá trình phát triển của các sơ khởi lá (Davies 1995,
Scanlon 2003).
Auxin có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế
bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ
và kích thích sự phân hóa mô dẫn. Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ
nhưng cản sự tăng trưởng của sơ khởi rễ này (Mai Trần Ngọc Tiếng và cs 1980).
Auxin được vận chuyển hướng gốc, tích lũy ở phần gốc của khúc cắt trụ hạ diệp của
cà chua và cảm ứng sự hình thành rễ bất định (Kuroha et al. 2002). Trong sự tạo rễ,
auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid
amin (như arginin), và nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid
chlorogenic) (Bùi Trang Việt 2000).
Auxin điều khiển sự tăng trưởng của tế bào thông qua tác động trực tiếp lên
vách tế bào. Về mặt lý thuyết, auxin có thể làm gia tăng dòng proton H+
bằng hai cơ
chế sau: hoạt hóa bơm ATPase-H+
có sẵn trong màng tế bào và tổng hợp mới

21
ATPase-H+
của màng. Auxin kích thích hoạt động của bơm proton ở màng nguyên
sinh chất, làm tăng nồng độ H+
ở khoảng gian bào, khi đó pH giảm. Sự giảm pH của
vách làm cho vi nối giữa extensin, hemicellulose, cá hợp chất pectid với celluloz bị
phá vỡ; Ca2+
nối liền các chuổi hợp chất pectid bị loại đi; vài enzym thủy giải được
hoạt hóa giúp cho sự tổng hợp hoặc phân hủy polysaccharid và protein được thực
hiện, giúp duy trì tính lỏng lẻo của vách. Ngoài ra, auxin còn giúp kéo dài tế bào
nhờ kiểu điều khiển sự hấp thu các chất hòa tan trong tế bào (Taiz and Zeiger 2005).
Ở mức phân tử, auxin kích thích sự tổng hợp các mRNA liên quan trong sự
tổng hợp các enzym chuyên biệt, bao gồm bao gồm các enzym tạo tiền chất của
celluloz và các hợp chất của vách (Bùi Trang Việt 2000).
Vai trò của auxin trong nuôi cấy in vitro
Tác động của auxin trong nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài và tùy
thuộc vào nồng độ của hiện diện các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác. Thông
thường auxin khích thích kéo dài tế bào, cảm ứng tạo mô sẹo khi dùng riêng lẻ hoặc
kết hợp với các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác, kích thích sự phát sinh rễ
và kìm hãm sự kéo dài rễ (Bùi Trang Việt 2000).
Các loại auxin khác nhau thường dùng với nồng độ khác nhau như IAA
thường sử dụng với nồng độ 1 – 31mg/l, NAA và 2,4-D từ 0,1 – 3mg/l (Rogosic et
al. 2006).
Để cảm ứng tạo mô sẹo ở những cây lá rộng, 2,4-D thường được sử dụng
nồng độ từ 5 – 15µM. Để cảm ứng tạo mô sẹo ở cây hai lá mầm, người ta thường
kết hợp auxin với cytokinin trong môi trường nuôi cấy, nhưng ở cây một lá mầm thì
sự kết hợp auxin với cytokinin trong môi trường nuôi cấy là không cần thiết. Ở cây
một lá mầm thường sử dụng nồng độ auxin cao hơn để tạo mô sẹo, thường từ 5 -
10µM (Machakova et al. 2008).
Trong giai đoạn tạo tế bào sinh phôi, sự dùng auxin mạnh là điều cần thiết.
Trong giai đoạn tiến hóa phôi, việc giảm hay loại auxin trong môi trường nuôi cấy
là nguyên tắc để thu nhận phôi thể hệ. Sự di chuyển hữu cực của auxin từ trên
xuống theo một trục thẳng góc với bể mặt môi trường nuôi cấy có liên quan trong

22
sự hình thành mạch, phát sinh cơ quan phôi (Bùi Trang Việt 2004).
Auxin cần thiết để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi ở nhiều loài thực vật.
Các nghiên cứu cho thấy đối với nhiều loài thực vật, auxin ngoại sinh được đòi hỏi
tuyệt đối để kích thích tạo nên các tế bào có khả năng sinh phôi, các khối hay cụm
các tế bào có khả năng sinh phôi và các tiền phôi. Các tế bào có khả năng sinh phôi
sẽ phát triển thành phôi thể hệ khi được chuyển sang môi trường không có hoặc có
auxin với nồng độ giảm đi. Nhu cầu auxin cho sự cảm ứng các tế bào có khả năng
sinh phôi cũng được ghi nhận bởi Halperin và Wetherell (1964) ở cà rốt. Auxin
được sử dụng nhiều nhất là 2,4-D (0,5 – 27,6µM), NAA và các auxin khác được
dùng ít hơn (Evans et al. 1983).
Trong sự hình thành sơ khởi rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA thường
đạt hiệu quả cao hơn so với 2,4-D. Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh trong
sự phát sinh cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng các
chất điều hòa nội sinh trong mô cấy. Ví dụ như ở đậu nành, trụ hạ diệp được nuôi
cấy trên môi trường có auxin ngoại sinh như NAA hoặc IBA sẽ hình thành rễ bất
định. Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lượng IAA nội sinh tích lũy tăng
cao. Điều này được giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt động enzym IAA
oxidase và IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA do đó cũng làm tăng nhanh
lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất định (Lui et al. 1998).
1.4.2. Cytokinin
Cytokinin được Skoog và Miller khám phá năm 1950 trên sự phân chia tế
bào mô lõi thuốc lá. Ngày nay người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm chất thiên
nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống nước dừa hay kinetin. Zeatin tự do ở
dạng trans trong phần lớn thực vật. Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin,
chúng đều là các aminopurin được thay thế ở vị trí 6, thí dụ benzilaminopurin
(benzil adenin, viết tắt BAP hay BA) là chất được dùng trong nông nghiệp. Mô
phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho cả cơ thể thực
vật. Từ rễ, cytokinin di chuyển trong mạch mộc để tới chồi. Tuy nhiên, các chồi (cà
chua) và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin(Bùi Trang Việt 2000). Cytokinin tham

23
gia vào nhiều quá trình: tăng rộng tế bào, phân chia và phát sinh hình thái tế bào, sự
trưởng thành của chloroplast, cản sự lão hóa … (Taiz and Zeiger 2005).
Vai trò của cytokinin trong nuôi cấy in vitro
Trong nuôi cấy mô người ta thường dùng zeatin và một số hợp chất tổng hợp
như kinetin BAP, TDZ. Nước dừa (phần lỏng) được dùng với nồng độ 10 – 20%
cũng là một nguồn cung cấp cytokinin (Rogosic et al. 2006).
Đối với cảm ứng tạo mô sẹo, cytokinin giúp quá trình tạo sẹo hình thành
nhanh hơn. Sử dụng auxin kết hợp với cytokinin giúp tạo chồi.Dùng cytokinin ở
nồng độ thấp (0,01mg/l) kết hợp với auxin 1 – 5mg/l có thể kích thích tạo rễ
(Rogosic et al. 2006).
cytokinin.

24
Ở nồng độ cytokinin cao sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi. Số
lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin. Tuy nhiên cũng có những
bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi; chồi
được tạo ra trở nên nhỏ,không thể kéo dài đến một kích thước nhất định để có thể
tách ra được cho hình thành rễ, và tạo ra những lá bất thường. Cytokinin ở nồng độ
thấp kích thích sự phát triển chồi nách. Nồng độ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành
chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ (Edwin 1996).
Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi
cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang môi
trường giảm hoặc không có cytokinin. Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo
chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi. Những vấn đề này có thể khắc phục bằng
cách giảm nồng độ chất điều hòa sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được
phát triển tốt nhất (Edwin 1996).
Cytokinin riêng lẻ cũng đã được dùng như nhân tố cảm ứng cho sự hình
thành phôi ở một số loài thực vật. Ví dụ như TDZ (thidiazuron) là một chất có hoạt
tính giống cytokinin, đã được dùng để kích thích tạo phôi thể hệ ở nhiều loài thực
vật, đặc biệt ở đậu và nhiều loài 2 lá mầm (Neuman et al. 1993, Saxena et al. 1992).
Ở cà phê, sự nuôi cấy lá cần cytokinin (IP, kinetin hoặc BAP) như là chất điều hòa
cảm ứng duy nhất, trong khi auxin ở nồng độ thấp 5x10-3
µM auxin (2,4-D hoặc
NAA) làm giảm sự sinh phôi (Hatanaka et al. 1991). Tương tự, ởAbies spp.,
cytokinin được dùng như chất điều hòa duy nhất cho sự cảm ứng sinh phôi thể hệ từ
phôi hợp tử (Norgaad & Krogstrup 1991, Schuller et al. 1989).
1.4.3. Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong nuôi cấy in vitro
Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy với tỉ lệ nhất
định có vai trò trong sự biệt hóa tạo mô sẹo, hình thành cơ quan chồi, rễ … cho từng
loại thực vật nhất định. Auxin có thể ảnh hưởng lên hoạt động của cytokinin trong
tế bào bằng cách điều hòa xuôi trong quá trình tổng hợp hoặc phát huy sự thoái hóa
cytokinin (Kiss et al. 1992).

25
Skoog và Miller (1965) chứng minh khúc cắt lõi hay mô sẹo thuốc lá tạo rễ
hay chồi tùy theo tỉ lệ auxin/cytokinin (A/C) trong môi trường nuôi cấy (Bùi Trang
Việt 2000):
- A/C cao giúp sự tạo rễ (thí dụ 2/0,02);
- A/C thấp giúp tạo chồi (thí dụ 2/0,5).
(Trong các thí nghiệm này, nồng độ AIA được giữ ở 2mg/l, nhưng nồng độ
kinetin thay đổi).
Ở cỏ Creeping, sự kết hợp 2,4-D với cytokinin kích thích sự tăng sinh mô
sẹo tạo phôi nhiều hơn khi sử dụng 2,4-D riêng lẻ (Zhong et al.1991). Ở tiêu, phôi
thể hệ được tạo ra trong môi trường có 2,4-D và TDZ nhưng phôi thể hệ không
được tạo ra trên môi trường chỉ có 2.4-D (Binzel et al. 1996). Tương tự, sự tạo phôi
thể hệ ở Cayratia japonica được cảm ứng trên môi trường có 2,4-D kết hợp với
TDZ hoặc kinetin (Zhou et al. 1994).
Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đồng thời cũng
có sự đối kháng giữa auxin (giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi); sự cân
bằng giữa hai kiểu hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển
1.4.4. Gibberelline
Kurosawa (1926) chứng minh chất trích từ nấm Gibberella fujikuroi (tức
Fusarium heterosporum) cảm ứng tăng trưởng quá mức ở lúa (bệnh lúa điên).
Yabuta và Sumili (1938) cô lập từ Gibberella một hỗn hợp mà họ gọi là
gibberelline. Gibberelline là một nhóm lớn, trên 80 chất, đó là các gibberelline Ax
hay GAx theo thứ tự khám phá. Gibberelline là những terpenoid, được tạo từ 4 đơn
vị isopren (C5): CH2=C(CH3)‒CH=CH2. Các đơn vị này ít nhiều bị biến đổi trong
phân tử gibberelline. Theo lý thuyết, các gibberelline có 20C, nhưng nhiều chất chỉ
còn 19 (do một ‒CH3 bị oxid hóa thành ‒COOH, và nhóm này được khử carboxyl)

26
Gibberelline kích thích sự kéo dài tế bào bởi cơ chế kiểm soát hướng đặt của
các vi sợi. Gibberelline cũng có tác dụng kéo dài lóng do sự phối hợp hoạt tính kéo
dài và phân chia tế bào thân. Gibberelline kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu
mô vỏ và biểu bì. Gibberelline cũng có tác động kích thích sự tăng trưởng chồi và
gỡ sự ngủ của chồi (Bùi Trang Việt 2000).
Gibberelline làm tăng hàm lượng auxin trong mô mà chúng kích thích. Auxin
và gibberelline có vai trò thiết lập tính hữu cực ở mức tế bào đang tăng trưởng do
tác động đến hướng của các vi sợi bộ xương tế bào. Tuy nhiên, auxin và
gibberelline có hoạt động độc lập, gibberelline không phải là tác nhân làm tăng hoạt
động của auxin. GA3 là loại gibberelline được sử dụng nhiều nhất, GA3 kích thích
sự tăng trưởng tế bào ở nồng độ thấp. GA3 có hiệu quả trong quá trình nảy mầm của
gibberelline.

27
phôi, có tác dụng kích thích sự kéo dài chồi và nảy mầm của phôi soma.
Vai trò của gibberelline trong nuôi cấy in vitro
Gibberelline có nhũng ảnh hưởng khác nhau trên sự hình thành chồi trong
nuôi cấy in vitro ở những loài thực vật khác nhau. Ở Begonia hiemalis 30 – 60µM
GA3 làm tăng số lượng và kéo dài chồi nhưng sự hiện diện của nó ở trong chồi
khiến chúng khó ra rễ (Simmonds and Werry 1987 trong Edwin 1996). Đối với cây
hợp hoan Albizzia julirissin, GA3 làm giảm số chồi hình thành trên khúc cắt trụ hạ
diệp được nuôi cấy trên môi trường Gambrg’s B5. Ngược lại, khi thêm chất kháng
gibberelline như paclobutrazol vào môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng số chồi được
tạo ra. Như vậy gibberelline có ảnh hưởng mạnh đến số lượng chồi hình thành trong
nuôi cấy in vitro (Sankhla 1993).
Trong quá trình sinh phôi thể hệ, gibberelline thường không có tác dụng đặc
biệt. Ở cà rốt, GA3 ngoại sinh không ảnh hưởng đến số lượng phôi tạo thành trong
giai đoạn phôi hình cầu nhưng là giảm số phôi giai đoạn phôi hình tim hình cá đuối
dẫn đến giảm số lượng phôi thể hệ được tạo thành (Bhojwani & Soh 2001, Davies
1995).
1.4.5. Abscissic acid (ABA)
Abscissic acid là một sesquiterpen (3 đơn vị isopren),là một acid yếu, vượt
qua màng tế bào dễ dàng khi ở dạng trung tính (gắn proton). Abscissic acid hiện
diện ở tỉ lệ 70% trong diệp lạp, 15% trong cytosol, 10% trong không bào và 5%
trong apoplast. Dạng liên kết với glucoz chỉ gặp trong không bào. Ở mức biểu bì,
abscissic acid được thấy chủ yếu trong tế bào khí khẩu (Bùi Trang Việt 2000).
Hình 1.9. Cấu trúc phân tử abscissicacid.

28
Abscissic acid cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngũ của chồi và hột, làm chậm sự
kéo dài lóng và điều tiết trạng thái đóng mở của khí khẩu. Acid abscissic cản sự
tăng trưởng của diệp tiêu và của các mô nuôi cấy. Abscissic acid liên quan tới sự
sinh phôi và trưởng thành của hột (Bùi Trang Việt 2000).
1.4.6. Etylene
Vai trò của etylene trên sự chín của trái được biết từ rất lâu, nhưng phải cho
tới những năm 1960, chất này mới được xem là một hormon tăng trưởng thực vật
Hầu hết các phần khác nhau của cơ thể thực vật bậc cao có thể sản sinh ra
etylene, tuy nhiên tốc độ hình thành phụ thuộc vào kiểu mô, giai đoạn phát triển của
cơ thể. Các vùng mô phân sinh, mắt là nơi sản sinh ra nhiều etylene. Etylene được
tạo ra trong quá trình chín quả, thời gian rụng lá, khi hoa già, khi mô bị tổn thương
và dưới tác động của stress như ngập úng, lạnh, nhiệt độ bất lợi, bệnh, v.v. (Nguyễn
Như Khanh 2007).
Etylene làm giảm sự phân chia tế bào, gia tăng hàm lượng và tác động của
ABA, làm giảm hàm lượng và tác động của gibberelline (Abeles et al. 1992). Chính
điều này đã ngăn cản sự tăng trưởng phôi soma. Sự gia tăng tổng hợp etylene trong
quá trình sinh phôi soma làm giảm sự tổng hợp các polyamine, một trong những
yếu tố thức đẩy sự sinh phôi soma. Ngoài ra, thành phần etylene cao có thể tăng
cường hoạt tính của enzym cellulase, pectinase hoặc cả hai, làm phá vỡ các cụm tế
bào trước khi phân cực được thiết lập trong các tế bào có khả năng phát sinh phôi.
Chính điều này đã dẫn đến tác động ức chế quá trình phát sinh phôi soma của
etylene (Bajaj and Rajam 1996, Sharma and Rajam 1995).
Hình 1.10. Cấu trúc phân tử etylenee.

Luận văn: Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa, HOT

Luận văn: Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa, HOT

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Luận văn: Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa, HOT

Similar to Luận văn: Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa, HOT (20)

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Luận văn: Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa, HOT