Nghiên cứu vi nhân giống cây cao su bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (CAO ĐẲNG)
NIÊN KHÓA 2011 – 2014
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU VI NHÂN GIỐNG CÂY
CAO SU (Hevea brasiliensis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG
Chuyên Ngành: SƯ PHẠM SINH HỌC
VIẾT THUÊ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
LUANVANTRITHUC.COM
ZALO: 0936.885.877
TẢI TÀI LIỆU NHANH QUA ZALO
Giáo viên hướng dẫn : ThS. PHAN VĂN THUẦN
Sinh viên thực hiện
MSSV
Lớp
: HUỲNH NGỌC ANH
: 111C840002
: C11SH02
Bình Dương, Tháng 05 Năm 2014

2. LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này trước tiên em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Phan
Văn Thuần đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên em trong suốt thời gian
qua.
Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo ThS. Nguyễn Thanh Thuận và bạn
Nguyễn Thị Xuân Thùy đã đồng hành và giúp đỡ em.
Em xin cảm ơn Trường Đại học Thủ Dầu Một, khoa Khoa học Tự nhiên, bộ
môn Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi để khóa luận này được hoàn thành.
Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong khoa Khoa học Tự nhiên, gia
đình và các bạn sinh viên lớp C11SH02 đã động viên và giúp đỡ nhiệt tình trong
suốt thời gian em thực hiện khóa luận này.
Sinh viên thực hiện
Huỳnh Ngọc Anh

3. NHẬN XÉT
Của giáo viên hướng dẫn
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
Bình Dương, Ngày tháng năm 2014

4. NHẬN XÉT
Của giáo viên phản biện
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
Bình Dương, Ngày tháng năm 2014

5. MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC HÌNH..................................................................................................................v
DANH MỤC BIỂU ĐỒ.................................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.........................................................vii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài.............................................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài..................................................................................................................................2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...........................................................................................2
4. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................................................3
5. Bố cục của đề tài .............................................................................................................................3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................................5
1.1. LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ .......................................................5
1.2. NHỮNG ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG INVITRO............ 10
1.2.1. Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro ................................................................... 10
1.2.2. Hạn chế của nhân giống vô tính in vitro..................................................................... 11
1.3. ỨNG DỤNG CỦA NHÂN GIỐNG INVTRO Ở MỘT SỐ CÂY
CÔNG NGHIỆP.................................................................................................................................. 12
1.4. VÀI NÉT VỀ CÂY CAO SU ............................................................................................. 15
1.4.1. Đặc điểm chung của họ Cao su ...................................................................................... 15
1.4.2. Đặc điểm riêng của cây Cao su ...................................................................................... 17
1.4.2.1. Tên khoa học.................................................................................................................... 17
1.4.2.2. Đặc tính thực vật............................................................................................................ 17
1.4.2.3. Thành phần hóa học...................................................................................................... 19
i

6. 1.4.3. Giá trị kinh tế của cây Cao su ......................................................................................... 20
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 22
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 22
2.1.1. Trang thiết bị và dụng cụ.................................................................................................... 22
2.1.2. Vật liệu ....................................................................................................................................... 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................... 22
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu..................................................................................... 22
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.................................................. 23
2.2.2.1. Điều kiện và môi trường nuôi cấy.............................................................................. 23
2.2.2.2. Nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu................................................................ 25
2.2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro........................... 26
2.2.3. Phương pháp xử lý thống kê số liệu .............................................................................. 28
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................ 29
3.1. THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ MỘT
SỐ MẪU CÂY CAO SU................................................................................................................. 29
3.2. THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ
CÀNH CỦA CÂY CAO SU.......................................................................................................... 31
3.3. THÍ NGHIỆM 3: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT SINH CHỒI
TỪ CÁC MẪU VẬT VÔ TRÙNG CỦA CÂY CAO SU................................................ 34
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ.......................................................................................... 39
ii

7. 1. KẾT LUẬN .................................................................................................................................... 39
2. KHUYẾN NGHỊ.......................................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................... 40
iii

8. DANH MỤC CÁC BẢNG
TT TÊN CÁC BẢNG TRANG
1. Bảng 2.1. Thành phần môi trường cơ bản Murashige
và Skoog (1962).................................................................................................................24
2. Bảng 3.1. Tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng của mẫu với
các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel).................................................29
3. Bảng 3.2. Tỉ lệ (%) mẫu được vô trùng với chất khử trùng
HgCl2 0,1% ở thời gian khác nhau............................................................................32
4. Bảng 3.3. Khả năng phát sinh chồi từ các mẫu ở các môi trường
nuôi cấy..................................................................................................................................34
iv

9. DANH MỤC CÁC HÌNH
TT TÊN CÁC HÌNH TRANG
1. Hình 3.1. Mẫu in vitro từ hạt cây cao su ...................................................................31
2. Hình 3.2. Mẫu chồi đỉnh và chồi nách vô trùng khi
khử trùng bằng HgCl2 0,1% 33
3. Hình 3.3. Chồi in vitro hình thành sau 8 tuần nuôi cấy
trên môi trường MS 36
4. Hình 3.4. Sự thích ứng của mẫu với môi trường MS
bổ sung 5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA 37
5. Hình 3.5. Chồi in vitro hình thành từ chồi nách sau 8 tuần
nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BAP 5mg/L + IBA 5mg/L 38
v

10. DANH MỤC BIỂU ĐỒ
TT TÊN BIỂU ĐỒ TRANG
1. Biểu đồ 3.1. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử
trùng của mẫu với các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel) ......... 30
vi

11. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ABA : Abscisis acid
BA : N6
-Benzyl adenine
BAP : Benzyl amino purine
cs : cộng sự
DNA : Deoxyribonucleotid acid
IBA : Indole-3-butyric acid
MS : Murashige và Skoog (1962)
NAA :  - naphthaleneacetic acid
IAA :  -indolacetic acid
2,4-D : 2,4-D dichlorophenoxy acetic acid
TDZ : Thidiazuron
vii

12. MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực bao gồm nhiều kỹ thuật khác
nhau trong nuôi cấy in vitro như: Nuôi cấy phôi, cơ quan, tế bào và protoplast.
Việc ra đời của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mở ra một hướng
mới cho nghiên cứu thực vật, nó nhanh chóng dành được một vị trí quan trọng
trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất và cải thiện giống cây trồng [24].
Kỹ thuật nhân giống in vitro không chỉ ứng dụng để nhân giống và phục tráng
cây trồng mà nó còn đem lại hiệu quả kinh tế cao trong việc nhân nhanh và tạo ra
một số lượng lớn cây con đồng đều, sạch bệnh, đặc biệt là còn giữ được tính trạng
quý của bố mẹ và cho phép chủ động cung cấp nguồn giống cũng như vật liệu vô
trùng cho các thí nghiệm [16].
Cho đến nay, có nhiều đối tượng cây công nghiệp đã được nhân giống bằng
phương pháp nuôi cấy mô, tế bào và thu được nhiều kết quả đáng kể như: Cây cà
phê, cây tiêu, cây chè…
Cây Cao su (Hevea brasiliensis), là một loài cây thân gỗ thuộc về họ Đại kích
(Euphorbiaceae) và là thành viên có tầm quan trọng kinh tế lớn nhất trong chi
Hevea. Nó có tầm quan trọng kinh tế lớn là do chất lỏng chiết ra tựa như nhựa cây
của nó (gọi là nhựa mủ-latex) có thể được thu thập lại như là nguồn chủ lực trong
sản xuất cao su tự nhiên [34].
Cây Cao su là loài cây thân gỗ, có thể cao tới trên 30 m. Nhựa hay mủ màu
trắng có trong các mạch ở vỏ cây. Cây đạt độ tuổi 5-6 năm thì người ta bắt đầu thu
hoạch mủ. Cho năng suất cao nhất trong độ tuổi từ 11 đến 25, sẽ ngừng sản sinh
mủ khi đạt độ tuổi 26-32 năm. Ngoài ra, gỗ cao su còn được dùng sản xuất đồ gỗ,
được xem là loại gỗ thân thiện với môi trường vì chỉ được khai thác khi cây kết
thúc chu trình sinh mủ [36].
1

13. Cây Cao su không những mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân tỉnh Bình
Dương mà còn là một lợi thế xuất khẩu của Việt Nam. Nhưng mặc khác chất
lượng giống cây Cao su ở Việt Nam còn chưa cao và chưa phù hợp với điều kiện
khí hậu ở nước ta, bên cạnh đó sâu bệnh phá hoại, các phương pháp nhân giống
chủ yếu là truyền thống làm cho mầm bệnh cây Cao su truyền từ thế hệ này qua
thế hệ khác, chất lượng cây con không đồng đều…
Xuất phát từ tiềm năng to lớn và những hạn chế gặp phải, chúng tôi đề xuất đề
tài: “Bước đầu nghiên cứu vi nhân giống cây Cao su (Hevea brasiliensis ) bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại tỉnh Bình Dương.”
2. Mục tiêu đề tài
Thăm dò điều kiện khử trùng và môi trường thích hợp để tạo cụm chồi cây
Cao su (Hevea brasiliensis) trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực
vật.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1. Đối tượng và nguồn mẫu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây Cao su (Hevea brasiliensis) thuộc:
Họ: Euphorbiaceae
Bộ: Euphorbiales
Lớp: Dicotyledonae
Ngành: Angiospermatophyta [20].
Nguồn mẫu nghiên cứu được lấy từ các hộ nông dân trồng cây Cao su tại
huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Bước đầu nghiên cứu điều kiện khử trùng và khả năng tạo cụm chồi của cây
Cao su.
2

14. Khóa luận được tiến hành trong thời gian từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05
năm 2014 tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, trường Đại học Thủ Dầu Một.
4. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 0,1%, dung dịch javel với
các thời gian khác nhau lên chồi đỉnh, chồi nách, hạt của cây Cao su.
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh
trưởng khác nhau lên khả năng tạo cụm chồi in vitro của mẫu.
5. Bố cục của khóa luận
Bố cục của khóa luận gồm các phần sau:
- Mở đầu (4 trang)
Phần này gồm các nội dung: Lý do chọn đề tài, mục tiêu đề tài, đối tượng
phạm vi nghiên cứu, nội dung nghiên cứu và bố cục của khóa luận.
- Chương 1. Tổng quan tài liệu (17 trang)
Trong chương này, chúng tôi trình bày các cơ sở lý thuyết và tình hình nghiên
cứu liên quan đến nội dung khóa luận. Gồm các nội dung: Lược sử phát triển
của nuôi cấy mô và tế bào thực vật, những ưu điểm và hạn chế của nhân giống
in vitro, ứng dụng của nhân giống in vitro ở một số cây công nghiệp và vài nét
về cây cao su.
- Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (7 trang)
Chúng tôi trình bày về vật liệu và phương pháp nghiên cứu bao gồm: Trang
thiết bị, dụng cụ và vật liệu nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu tài liệu,
phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, phương pháp xử lý thống kê
số liệu.
- Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận (10 trang)
Trong chương này, các kết quả nghiên cứu được trình bày và thảo luận. Chúng
tôi trình bày các nội dung sau:
3

15. + Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng khử trùng từ một số mẫu cây Cao su và
thảo luận.
+ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng khử trùng từ cành của cây Cao su và
thảo luận.
+ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu khả năng phát sinh chồi từ các mẫu vật vô trùng
của cây Cao su và thảo luận.
- Kết luận và khuyến nghị (1 trang)
Ở phần này, chúng tôi rút ra những kết luận trên cơ sở của kết quả nghiên cứu.
Đồng thời, chúng tôi cũng đưa ra những khuyến nghị cho việc tiếp tục nghiên
cứu vi nhân giống cây Cao su.
- Tài liệu tham khảo (4 trang)
Phần này, chúng tôi liệt kê các tài liệu tham khảo gồm có: Tài liệu tiếng việt,
tài liệu nước ngoài và tài liệu internet.
4

16. Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO
THỰC VẬT
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro
các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
nhanh chóng đi vào thực tiễn cuộc sống. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế
bào thực vật được bao hàm trong ứng dụng của Công nghệ Sinh học. Nó bao gồm
nhân giống và nhân nhanh giống, sản xuất sinh khối các sản phẩm sinh hóa, sản
xuất và chuyển hóa sinh học các dược liệu tự nhiên, duy trì và bảo quản các nguồn
gen quý, cải thiện và tạo giống cây trồng, nghiên cứu bệnh học thực vật, làm sạch
virus…[16].
Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã chính
thức xây dựng học thuyết tế bào. Học thuyết tế bào khẳng định: Mỗi cơ thể động
thực vật đều bao gồm những thể tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế
bào [29].
Năm 1898, Haberlandt tiến hành nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào này tách từ
nhu mô lá, tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật, kết quả
thu được là không thành công [23]. Năm 1902, Haberlandt để chứng minh cho tính
toàn năng của tế bào ông đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật.
Theo ông, mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng
tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Điều đó, theo kiến thức sinh
học hiện đại có nghĩa là: Mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy
đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều
kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn
chỉnh. Tuy nhiên, Haberlandt đã không thành công trong thí nghiệm chứng minh
5

17. chứng tính toàn năng của tế bào do bởi ông đã chọn cây Một lá mầm là đối tượng
rất khó nuôi cấy, mặt khác do ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh.
Một nguyên nhân khác nữa của sự thất bại là do vào thời kỳ đó những hiểu biết
khoa học về nhu cầu dinh dưỡng của mô thực vật còn hạn chế nên ông đã không
tìm ra được môi trường dinh dưỡng tối thích hợp cho sự phân chia tế bào [1], [16],
[23].
Phải mất hàng chục năm sau mới có những thí nghiệm thành công để chứng
minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Nỗi bật là các công
trình sau:
Năm 1922, Kotte và cs. đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ của một
cây hòa thảo và đã tạo được một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhưng sau một thời gian
ngắn thì hệ rễ này sinh trưởng chậm dần và ngừng lại [23], [32].
Đến năm 1934, White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ
Cà chua (Lycopersicum esculentum) trên một môi trường lỏng chứa muối khoáng,
glucose và nước chiết nấm men. Năm 1937, ông phát hiện tầm quan trọng của các
vitamin thuộc nhóm B là B1, B6 và PP để thay thế cho dịch chiết nấm men và thấy
rằng việc thay thế này hoàn toàn phù hợp. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời
gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Cùng lúc với White,
Gautheret cũng đã thu được kết quả phân chia các tế bào của tầng sinh gỗ ở cây
liễu [16], [23].
Năm 1939, Nobécourt và Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh
trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo Cà rốt (Daucus carota) bằng cách cấy
chuyền đều đặn 6 tuần một lần. Lúc này, White đã thành công tương tự với cây
thuốc lá. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật được khai sinh từ đó [17].
Từ năm 1941 – 1954, những phát hiện về vai trò của các chất kích thích sinh
trưởng như IAA, NAA, 2,4-D, kinetin và vai trò của các vitamin, nước dừa là tiền
6

18. đề kỹ thuật cho việc làm thí nghiệm ổn định, dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của
kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào [31].
Năm 1951, Nitsch đã khắc phục được tính không giao hợp tiền giao tử khi
nghiên cứu và thành công trong nuôi cấy mô quả bầu non, cà chua, dưa chuột và
lần đầu tiên tạo được hạt trong quả cà chua in vitro có khả năng nảy mầm (hạt có
sức sống). Sau này có rất nhiều nhà khoa học thành công trong nuôi cấy hạt phấn,
các quá trình sinh trưởng của ống phấn, thụ tinh và tạo thành quả trong điều kiện
in vitro [19].
Năm 1953, Miller và Skoog tạo được rễ từ mãnh mô cắt từ thân cây Thuốc lá
(Nicotiana tabacum). Đến năm 1957, hai ông công bố kết quả nghiên cứu ảnh
hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ
quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm tỉ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hướng
phát triển rễ, ngược lại nếu tỉ lệ này tăng thì dẫn đến sự tạo chồi ở mô sẹo. Hiện
tượng này được xác nhận trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau và đóng góp rất
lớn vào việc điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào
trong nuôi cấy [16], [17], [29], [32].
Năm 1958, Reinert và Steward tạo được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế
bào đơn nuôi cấy trong dung dịch [30].
Năm 1960, Cooking ở Đại học Nottingham (Anh) lần đầu tiên đã tách được tế
bào trần (protoplast) khi dùng enzyme cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế
bào thực vật. Cũng trong năm 1960, Bergman thành công trong việc thu một số
dung dịch huyền phù không có các tế bào kết cụm mà gồm hầu hết các tế bào đơn.
Các tế bào này có thể gieo trên môi trường, trong các hộp lồng, nó sẽ tiếp tục
sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo [16], [17].
Năm 1962, Kante và cs. thông báo về khả năng thụ phấn trong điều kiện in
vitro của cây Thuốc phiện (Papaver somniferum) [2].
7

19. Năm 1964, Guha và cs. thu được phôi trưởng thành từ nuôi cấy bao phấn cây
Cà độc dược (Datura inoxia). Năm 1966, ông tạo thành công cây đơn bội từ nuôi
cấy túi phấn cây Cà độc dược. Năm 1967, nhóm Bourgin và Nitsch lại thành công
khi tạo cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Những thành công này đã khiến giới khoa
học bắt đầu chú ý đến việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt
phấn. Việc này đã đóng góp rất nhiều kiến thức cho lĩnh vực di truyền thực vật và
thực tiễn chọn giống [29].
Năm 1966, Morel hoàn thành quy trình nhân nhanh cây hoa lan thuộc chi
Cymbidium. Ý tưởng của ông được thai nghén từ năm 1960 khi ông ngẫu nhiên
quan sát sự sinh trưởng và phát triển của chồi ngọn cây hoa lan trong lúc cố tìm
cách để làm sạch bệnh cây hoa lan giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật [2].
Năm 1970, Nagata và Takebe đã sử dụng kỹ thuật tế bào của Bergman để nuôi
cấy protoplast của lá cây thuốc lá và tái sinh được cây hoàn chỉnh. Cho đến nay,
kỹ thuật protoplast đã được thực tế xác nhận sau nhiều công bố lai thành công giữa
các loài, một việc không thể thực hiện được bằng lai hữu tính cổ điển. Protoplast
giúp sự nghiên cứu hiện tượng nhiễm sắc thể hòa hợp của các tế bào khác loài sau
khi dung hợp, giúp cho việc nghiên cứu vai trò của các DNA trong các cơ quan tử
và quan hệ của chúng với DNA trong phân bào. Tính đến ngày 1/1/1985 kỹ thuật
dung hợp protoplast đã thu được 104 trường hợp lai, bao gồm con lai trong loài,
con lai giữa các loài, con lai giữa các chi và con lai giữa các chi phụ. Đến năm
1995, con số trên đã gấp hai lần. Điều đó chứng tỏ kỹ thuật dung hợp protoplast đã
trợ giúp rất hiệu quả cho công tác chọn tạo giống [16], [17].
Từ năm 1972 đến 1977, Melchers đã đưa ra những cải tiến mới về phương
pháp nuôi cấy bao phấn và túi phấn để nhận được cây con đơn bội với số lượng
lớn và đưa ra các luận điểm cần phải gắn phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực
vật với các phương pháp chọn giống khác [18].
8

20. Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh vực công nghệ gene
thực vật. Đó là kỹ thuật đưa một gene cần thiết có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực
vật và động vật hay một gene tổng hợp vào các giống cây trồng muốn cải tạo. Chỉ
trong một thời gian ngắn một loạt phương pháp đưa gene ngoại lai vào thực vật
được công bố. Sau khi đưa được gene ngoại lai vào tế bào người ta sử dụng kỹ
thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật để nuôi cấy các tế bào đã được chuyển nạp. Sau
đó cho tái sinh lại thành cây nguyên vẹn mang những đặc tính sinh học mới.
Chúng sinh trưởng, phát triển, ra hoa, kết hạt bình thường và được coi như một
giống cây trồng mới. Lĩnh vực công nghệ gene đã có những thành công to lớn
không chỉ trên đối tượng thực vật mà còn thành công trên đối tượng động vật và vi
sinh vật. Năm 1988, Toriyama thành công khi chuyển gene kháng bệnh vàng lụi
(Tungro) vào protoplast lúa nhóm Japonica và tái sinh cây hoàn toàn từ protoplast
chuyển gene. Năm 1991, Burbank đã thành công trong việc ghép gene miễn dịch
đối với loài gián cánh cứng Colorado cho khoai tây đã được trồng thử ở một vài
nơi ở Maine Oregar. Kết quả khoai tây có thể miễn dịch đặc biệt với loài gián cánh
cứng [3], [16], [23].
Ở viện nghiên cứu Nông nghiệp Pháp (INRA), các nhà khoa học đã chuyển
thành công gene Capsul vào cây thuốc lá. Các nhà khoa học của viện lúa Quốc tế
(IRRI) đã chuyển thành công các gene khác nhau vào cây lúa, cụ thể là gene Bt
(gene chống sâu đục thân ở lúa), gene Chitinase chống bệnh do nấm gây ra như
đạo ôn, khô vằn. Các giống cây trồng chuyển gene hiện đang được khảo nghiệm
và trồng trong điều kiện nhà kính tại Công ty Di truyền chọn giống và sản xuất hạt
giống tại Bruxell (Bỉ). Ở Mỹ đã sản xuất hai loại cây trồng là cà chua cứng quả và
bảo quản lâu hơn 45 ngày, loại thứ hai là giống ngô chống sâu đục thân và có năng
suất cao. Thực vật chuyển gene thực tế đã trở thành hàng hóa trên thị trường. Năm
1996, người ta đã ứng dụng cho trồng trọt khoảng 18.000 km2
từ Ả rập đến Bắc
Mỹ và sản phẩm được đem bán trên thị trường với những ưu việt như bí ngô
chống chịu được virus, khoai tây và bông không bị côn trùng phá hoại, bông và
9

21. đậu tương chống chịu được các chất diệt cỏ. Ngô chuyển gene cũng đã được trồng
đại trà và được bán rộng rãi trên thị trường Châu Âu [1], [5].
Nói tóm lại, sự phát triển như vũ bão của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực
vật cùng với sự ra đời của công nghệ gene thực vật đã mở ra một hướng mới cho
nền nông nghiệp thế giới. Với các giống cây trồng được tạo ra bằng các phương
pháp này, nền nông nghiệp thế giới đang bước vào “Cuộc cách mạng xanh lần thứ
hai”, góp phần không nhỏ vào đảm bảo an toàn lương thực và nhu cầu của con
người. Các nhà nông học sẽ có thêm một phương pháp mới trong việc cải tạo tự
nhiên [24].
1.2. NHỮNG ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG IN
VITRO
1.2.1. Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro
Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một
quần thể đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản phẩm thương mại,
dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền.
Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công
nghệ nhân giống vô tính in vitro đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong
vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
Sản phẩm cây giống đồng nhất: Nhân giống vô tính in vitro về cơ bản là công
nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có
kiểu gene dị hợp hay đồng hợp.
Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm,
không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ
cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng
ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
10

22. Nâng cao chất lượng cây trồng: Nuôi cấy mô là phương pháp hữu hiệu để loại
trừ virus, nấm, vi khuẩn khỏi các cây trồng đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh
tạo ra bằng nuôi cấy mô thường tăng năng suất 15-30 % so với nguồn gốc.
Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác
nhau có thể tạo ra từ hệ thống nhân giống vô tính in vitro như cây con in vitro
hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân
củ.
Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa
dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác
nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy định về sinh thực
vật quốc tế.
Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể được tiến hành vào bất kỳ thời
gian nào, không phụ thuộc vào mùa vụ [12].
1.2.2. Hạn chế của nhân giống in vitro
Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không
phải tất cả cây trồng điều được nhân giống thương phẩm bằng nhân giống vô tính
in vitro. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh
để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gene. Nhiều vấn đề lý thuyết
liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải
quyết.
Chi phí sản xuất cao: Nhân giống vô tính in vitro đòi hỏi nhiều lao động kỹ
thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp
truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác
với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ
được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỉ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn
11

23. đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng nhân lên khi nuôi cấy kéo dài và
tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được
lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di
truyền [12].
1.3. ỨNG DỤNG CỦA NHÂN GIỐNG IN VITRO Ở MỘT SỐ CÂY
CÔNG NGHIỆP
Kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro thật chất là một tiến bộ vượt bậc về chất
của phương thức nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành, ghép cành, chiết
cành… Ở đây, giá trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học là đã biến những phương
thức cổ điển đó thành những phương thức mới về chất cho phép giải quyết những
vấn đề khó khăn, những hạn chế mà phương thức nhân giống cổ điển không thể
giải quyết được [15].
Cây công nghiệp ở nước ta gồm cây công nghiệp ngắn ngày như: Mía, sắn, lô
hội…; cây công nghiệp dài ngày như các cây: Cà phê, tiêu, điều, ca cao, cao su…
là những loại cây chiếm tỉ trọng rất cao trong lĩnh vực nông nghiệp ở nước ta, do
mang lại giá trị cao về mặt kinh tế, nhu cầu về những mặt hàng cây công nghiệp
trong nước và xuất khẩu khá cao và đang ngày càng tăng.
Phương thức nhân giống in vitro cho phép ta có thể tận dụng hầu hết các bộ
phận của cây từ đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân, mảnh lá,… để tiến hành
nuôi cấy và hiện nay đã mang lại những thành công rất lớn [24].
Kỹ thuật nhân giống in vitro đã được áp dụng rộng rãi để nhân giống các loại
cây trồng như: Cây nông nghiệp, cây thuốc, cây hoa… và đã mang lại kết quả cao.
Đối với các cây công nghiệp, phương thức nhân giống truyền thống đã được
tiến hành phổ biến từ lâu. Ngày nay, việc ứng dụng nhân giống vô tính in vitro cây
công nghiệp cũng đã được áp dụng và phát triển mạnh.
12

24. Một số nghiên cứu ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro ở cây công
nghiệp:
- Ở cây công nghiệp ngắn ngày:
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh, Dương Huyền Trang, “Nghiên cứu
kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội (Aloe vera L.) bằng phương pháp nuôi cấy
in vitro”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2008: Tập VI, Số 6: 514-521, khoa Nông
học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã đạt kết quả rất khả quan. Kỹ thuật
tạo vật liệu khởi đầu in vitro nên sử dụng mẫu lấy ở vụ xuân và khử trùng đơn
trong dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút cho hiệu quả khử trùng tốt, tỉ
lệ mẫu sống và bật chồi cao (68,5%). Môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi
Lô hội in vitro là môi trường MS bổ sung 2,5 mg/L BAP, có hệ số nhân cao (5,3
lần), chất lượng chồi tốt. Môi trường có kinetin và hỗn hợp BAP với - IAA đều
không có tác dụng làm tăng hệ số nhân và chất lượng chồi in vitro. Bổ sung 0,5
ppm - NAA hoặc IBA vào môi trường cho tỉ lệ ra rễ cao (79,1 - 89%). Môi
trường có than hoạt tính 1,5 - 2,0 g/L cho khả năng ra rễ đạt cao nhất. Tỉ lệ ra rễ
đạt 100%, chất lượng rễ tốt. Giá thể ra cây Lô hội in vitro thích hợp là cát mịn.
Cây ra ngôi trên giá thể này tỉ lệ sống đạt 81,4%, cây sinh trưởng phát triển tốt.
Thời vụ không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả ra cây Lô hội in vitro [22].
- Ở cây công nghiệp dài ngày:
Trên thế giới: Phương pháp vi nhân giống tạo dòng cây Hồ tiêu sử dụng các
mảnh cấy như: Đầu rễ, mắt nhánh và chồi ngọn từ cả cây tiêu non và cây trưởng
thành (Mathews và Rao, 1984; Agarwal, 1988; Philip và cs. 1992; Nazeem và cs.
1993; Nirmal Babu và cs. 1993; Joseph và cs. 1996; Lissamma và cs. 1996) [7].
Phương pháp vi nhân giống cây tiêu P. chaba đã được (Nirmal Babu và cs.
1993; Rema và cs. 1995) tiêu chuẩn hóa. Sự chuyển hóa của mô phân sinh rễ và
mô phân ngọn đã giúp cây con phát triển ở cây tiêu: P. longum và P. colurinum đã
13

25. được báo cáo về vấn đề này (Nirmal Babu và cs. 1993). Các cây con in vitro của
giống cây này đã được đánh giá, thử nghiệm ở phòng nghiên cứu chủng loại
Calicus ở Ấn độ. Những phương pháp vi nhân giống cây tiêu này đã đóng góp
quan trọng cho nền kinh tế và mối quan hệ giữa các giống tiêu [7].
Trong nước: Năm 2003, Đoàn Thị Ái Thuyền, TS. Thái Xuân Du và Đỗ Xuân
Giáp, “Bước đầu nghiên cứu nhân giống một số cây hồ tiêu sạch virus (Piper
nigrum L.)” tại viện Sinh học nhiệt đới. Mẫu chồi sau khi lấy được rửa sạch và sát
trùng bằng cồn 700
rồi dùng nước tẩy javel pha loãng khoảng 1/3 khử trùng mẫu
trong khoảng 30-40 phút. Có thể dùng HgCl2 0,1% hoặc dùng dung dịch kháng
sinh Cefotaxin 1% từ 1-2 giờ. Sau khi ngâm trong dung dịch kháng sinh Cefotaxin
1% (1, 2, 24) giờ. Kết quả cho 20-70% mẫu bị nhiễm sau 7-14 ngày nuôi cấy. Khi
bổ sung Cefotaxin 1% vào môi trường nuôi cấy. Kết quả cho khoảng 20-30% mẫu
được vô trùng hoàn toàn sau 3-4 tuần nuôi cấy. Đồng thời khi cấy chuyển sang
môi trường mới không có kháng sinh, chồi mới không có khả năng tái nhiễm trở
lại. Ngoài ra, khử nghiệm thử trùng bằng cách kết hợp dung dịch Acid Benzoic
bão hòa, dung dịch tẩy javel và kháng sinh. Kết quả thu được khoảng 40-50 %
mẫu khử trùng không tái nhiễm. Khả năng tạo chồi mới của đốt gốc là tốt nhất so
với đốt giữa và đốt ngọn. Khả năng tạo mô sẹo ở mỗi loại đốt cũng tương tự như ở
tạo chồi. Khi nồng độ BA hơn 5,0 mg/L hoặc TDZ sẽ ức chế khả năng hình thành
chồi và khi bổ sung một nồng độ Cytokinin và Auxin thích hợp sẽ làm tăng số
chồi hình thành ở đốt cấy hồ tiêu. Nồng độ NAA và IBA càng cao thì khối mô sẹo
tạo ra càng nhiều. Các mô sẹo trắng, xốp khi chuyển sang môi trường tạo chồi sẽ
có ít khả năng tái tạo chồi. Môi trường MS có bổ sung BA (0,5 mg/L), Ki (0,5
mg/L), IBA (0,5 mg/L) là thích hợp cho khả năng biệt hóa chồi từ mô sẹo. Ở nồng
độ BA (0,3 mg/L), Ki (0,5 mg/L), IBA (0,5 mg/L) chồi sẽ phát triển mạnh hơn,
chồi lớn hơn và khi cắt chồi nuôi cấy trên môi trường MS thì khả năng tạo rễ và
phát triển tốt hơn những môi môi trường còn lại. Môi trường tạo rễ là ½ MS +
NAA (0,1-1,0 mg/L) hoặc IBA (0,1-1,0 mg/L). Môi trường MS ½ có bổ sung than
14

26. hoạt tính (1,0 mg/L) là thích hợp để cây ra rễ ở cây hồ tiêu. Không sử dụng Auxin
cho mục đích ra rễ [25].
Năm 2005, Nguyễn Hữu Định, ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện “Nghiên cứu nhân giống vô tính cây
Tiêu (Piper nigrum) bằng phương pháp nuôi cấy mô với chất khử trùng chồi tiêu
bằng kháng sinh Tetracylin hoặc Streptomyxin” cho hiệu quả cao nhất khi thời
gian xử lí là 6 giờ. Kháng sinh Tetracylin hiệu quả khử trùng cao hơn kháng sinh
Streptomyxin. Môi trường thích hợp nhất cho mẫu lá tiêu hình thành và phát triển
mô sẹo là môi trường bổ sung 3 mg/L BA + 1 mg/L IBA. Môi trường thích hợp
nhất cho mô sẹo tái sinh chồi là môi trường có bổ sung 3 mg/L BA + 0,3 mg/L
TDZ [7].
Năm 2011, Nguyễn Cảnh Chính, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã
“Nghiên cứu khả năng nhân giống vô tính cây Chè đắng (llex kaushue S.Y Hu)
bằng phương pháp giâm cành” [6].
Hiện nay, trên thế giới việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nhân nhanh
các loại cây trồng đã trở thành công cụ nhân giống chủ yếu. Tuy nhiên ở Việt Nam
với cây công nghiệp dài ngày như cao su, cà phê… kỹ thuật này còn chưa được
nghiên cứu ứng dụng nhiều mặt dù cũng đã có một số kết quả nhất định. Từ năm
1993 đã có công trình nghiên cứu tạo và nhân phôi vô tính từ mô lá cho cây cà phê
lai Arabusta của trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia tại thành
phố Hồ Chí Minh. Nhưng lượng cây tái sinh trực tiếp từ phôi là không cao và chưa
được ứng dụng rộng rãi cho sản xuất [37].
1.4. VÀI NÉT VỀ CÂY CAO SU
1.4.1. Đặc điểm chung của họ Đại kích hay họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
Họ Thầu dầu là một họ lớn, gần 290 chi và khoảng 7500 loài, phân bố chủ yếu
ở các xứ nhiệt đới, nhưng các đại diện thân cỏ cũng gặp ở vùng ôn đới, thậm chí
15

27. vùng hàn đới; trung tâm phân bố chủ yếu của họ là Nam Mĩ, châu Phi, Đông Á và
Đông Nam Á. Nước ta có khoảng 80 chi với gần 460 loài [8].
Đặc điểm chung của họ là cây rất đa dạng: Thân gỗ, thân bụi, thân cỏ, đôi khi
mọng nước chứa đầy nhựa mủ như sữa. Lá cũng đa dạng: Mọc cách hoặc mọc đối,
đơn hoặc kép, gân lông chim hay chân vịt,… thường có lá kèm, đôi khi lá kèm biến
thành gai. Hoa tập hợp thành cụm hoa chùm, chùy… gồm nhiều xim hai ngả. Hoa
đơn tính, cùng cây hay khác cây. Hoa đều, gốc có là bắc, thường mẫu 5, ít khi mẫu 3.
Bao hoa kép hoặc đơn (chỉ có đài), đôi khi hoàn toàn không có bao hoa. Nhị từ nhiều
đến 5 hoặc giảm chỉ còn 1 (chi Euphorbia). Trong hoa đực có các dấu vết của nhụy.
Bộ nhụy luôn luôn gồm 3 lá noãn dính lại với nhau thành bầu trên, 3 ô, mỗi ô chứa 1
hay 2 noãn đảo. Noãn thường có nút đậy lỗ noãn do vách bầu phát triển thành, về sau
để lại di tích trên hạt gọi là mồng. Quả mở thành 3 hay 6 mảnh vỏ, đôi khi là quả
mọng hoặc quả hạch. Hạt thường có nội nhủ dầu. [8].
Trong họ Đại kích hay họ Thầu dầu có đến 10 loài cây cho mủ cao su, dưới
đây là tên một số loài Hevea khác Hevea brasiliensis [14].
+ H. benthamiana: Cây cao trên 27 m, gốc cây phình to. Cây thường mọc ở vùng
đất phù sa, ngập nước định kỳ vào mựa mưa ở dọc bờ sông Amazon. Năng suất
mủ cao su kém, chất lượng mủ tốt [14].
+ H. camagoana: Cây nhỏ, cao từ 2-12 m, mọc cạnh các dòng chảy và vùng
đầm lầy. Cây cho năng suất mủ kém, mủ trắng [14].
+ H. camporum: Cây thấp, chiều cao dưới 2 m, chỉ tìm thấy ở vùng đầu nguồn,
vùng sa mạc, Cây cho năng suất mủ kém, mủ trắng [14].
+ H. guianensis: Loài này có vùng phân bố rộng nhất, cây cao 20-35 m, thân hình
trụ, thường chỉ phân cành ở chiều cao 1/2 thân trở lên. Năng suất mủ kém, mủ
màu hơi vàng, chất lượng mủ thấp [14].
+ H. microphylla : Cây cao 18-20 m, thân mảnh khảnh, gốc cây hơi to. Năng suất
mủ kém [14].
16

28. + H. nitida : Cây nhỏ đến trung bình, thân hình trụ. Mủ màu trắng đậm đặc, chứa
nhiều chất nhựa (resin), ít cao su [14].
+ H. pauciflora : Cây lớn cao trên 25 m, thân hình trụ. Mủ có màu trắng, chứa
nhiều chất nhựa, ít cao su [14].
+ H. rigidifolia : Cây cao trung bình 12-18 m, thân hơi nghiêng. Mủ trắng, nhiều
chất nhựa, không chứa đủ cao su theo chất lượng thương mại đòi hỏi [14].
+ H. Spruceaa: Cây cao đến trên 25 m, gốc cây hơi phình to ra, tán lá nặng, lá
mọc hơi chúc xuống, mặt dưới lá có lông tơ. Mủ trắng, ít cao su. Cây mọc trên đất
thấp, ngập nước định kỳ ở dọc bờ sông [14].
Ngoài Hevea brasiliensis và 9 loài kể trên còn có trên 2.000 loài thuộc các họ
khác cũng có thể cho mủ cao su và phần lớn sống trong vùng nhiệt đới. Nhưng cho
đến nay chưa có một loài nào có thể cạnh tranh được với cây Hevea brasiliensis
[14].
1.4.2. Đặc điểm riêng của cây Cao su
1.4.2.1. Tên khoa học
Cây Cao su (Hevea brasiliensis) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [20].
1.4.2.2. Đặc tính thực vật
Cây Cao su thuộc loại thân gỗ, to, cao. Sự phát triển chiều cao của thân phụ
thuộc vào đỉnh sinh trưởng (chồi ngọn). Thân cao su lúc còn non thường có màu
tím hoặc xanh tím. Hình dạng của thân ở cây thực sinh và cây ghép có khác nhau:
Thân cây có hình trụ và có chân voi là cây ghép và thân cây hình chóp cụt, không
chân voi là cây thực sinh [27].
Khi cắt ngang thân ta có thể thấy rõ ràng 3 phần là gỗ, vỏ và 1 lớp mỏng ngăn
cách giữa chúng là tượng tầng (cambium). Mủ cao su chỉ thấy xuất hiện nhiều
trong phần vỏ [27].
Lá cao su là loại lá kép lông chim mọc cách, mỗi lá gồm ba lá chét. Khi
trưởng thành lá có màu xanh đậm ở mặt trên và xanh nhạt ở mặt dưới. Lá được
17

29. hình thành do sự phân hóa của đỉnh sinh trưởng. Quá trình phát triển lá có thể chia
thành những giai đoạn sau: Đầu tiên mầm ngủ bắt đầu mọc với một đoạn thân
không lớn hơn 1cm, sau đó nó lớn dần lên và có màu tím. Lá lúc này nhỏ, mềm, có
màu tím và mọc rủ xuống. Tiếp theo thân lại vươn ra thêm một đoạn và trở nên
xanh hơn, lá phát triển rộng và dài hơn, có màu xanh. Sau cùng của quá trình này
là sự ổn định lá là giai đoạn tầng lá ổn định. Lá mọc ngang, cứng và có màu xanh
đậm. Lá cao su thường phát triển thành tầng trên thân khi chưa phân cành hoặc
trên cành. Thời gian hình thành 1 tầng lá có thể kéo dài từ 25-50 ngày tuỳ thuộc
rất nhiều vào điều kiện khí hậu [27].
Sau 3-4 năm sinh trưởng cao su thường biểu hiện đặc tính rụng lá theo mùa
(rụng lá sinh lý), thường nhất là vào dịp đầu năm, từ tháng 1-4 tùy từng nơi. Sau
khi rụng lá cao su sẽ cho lá mới và hoa gần như đồng thời [27].
Hoa cao su có màu vàng, nhỏ, không cánh hoa, đài dính thành đĩa năm răng,
tiểu nhụy 5-10. Hoa có hương thơm, thuộc loại đơn tính, có hoa đực và hoa cái
riêng [13]. Với tỉ lệ 1 hoa cái /60 hoa đực. Hoa đực thường nở trước hoa cái một
thời gian nên phần lớn hoa thụ tinh bằng giao phấn chéo thông qua trung gian côn
trùng và gió [27]. Nhìn chung khả năng thụ phấn trên cao su xảy ra với tỉ lệ tương
đối thấp. Kết quả nghiên cứu tại Lai Khê cho thấy tỉ lệ thụ quả là 8,46% khi có trợ
giúp kích thích sinh trưởng [8].
Quả cao su thuộc loại quả nang (vỏ quả khô có nhiều mảnh) có đường kính từ
3-5 cm. Quả có 3 buồng, mỗi buồng có một hạt. Khi chín quả nứt theo chiều dọc
bắn tung hạt ra ngoài. Hạt có thể văng xa đến 15 m. Bên ngoài hạt là một lớp vỏ
cứng láng. Hạt có dạng gần tròn hay bầu dục với mặt lưng láng và mặt bụng hơi
phẳng hơn. Bên trong hạt cấu tạo bởi phôi và nội nhủ. Nội nhủ chiếm phần lớn thể
tích của hạt và chứa chủ yếu là chất béo, đạm và nước. Do hạt thường chín sinh lý
trước khi rụng khá lâu nên sau khi rụng hạt rất dễ mất sức nảy mầm, do hiện tượng
oxy hóa chất béo và mất nước xảy ra nhanh chóng khi chưa gặp điều kiện thuận
lợi cho việc nảy mầm. Vì thế mà hạt thường được gieo ngay sau khi thu từ vườn
cây để khắc phục hiện tượng trên [27].
18

30. Bộ rễ cao su bao gồm các loại: Rễ cọc dài từ 3-5 m, có thể đâm sâu đến 10 m,
làm nhiệm vụ giữ cho cây đứng vững, hút nước và chất khoáng; rễ ngang hay rễ
hấp thu là loại rễ mọc ngang trên tầng đất mặt từ 0-30 cm, loại rễ này nhiều và
mập có khả năng vươn xa từ 6-10 m, có khả năng phân nhánh nhiều, khả năng tái
sinh tốt. Rễ ngang thường lan rộng theo chiều rộng của tán; rễ tơ là loại rễ đóng
vai trò chủ yếu trong việc hút nước và muối khoáng cho cây ở tầng đất mặt, do rễ
ngang chỉ xuất hiện nhiều ở lớp đất mặt nên hầu hết rễ tơ cũng xuất hiện ở lớp đất
mặt. [4].
Cao su là cây trồng nhiệt đới điển hình nên thường sinh trưởng bình thường
trong khoảng nhiệt độ từ 22-300
C, và khoảng nhiệt độ tối thích là 26-280
C. Cao su
thường được trồng trong những vùng có lượng mưa từ 1800-2500 mm/năm. Ẩm
độ không khí bình quân thích hợp cho sinh trưởng của cao su là trên 75%, ẩm độ
không khí còn thể hiện tương quan thuận với dòng chảy mủ khi khai thác [14].
Cây Cao su được người Pháp đưa vào Việt Nam lần đầu tiên năm 1878. Đặc
biệt với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều ở Việt Nam cây Cao su đã
thích nghi và phát triển tốt, diện tích cao su ngày càng được mở rộng [34].
Năm 2007 diện tích cao su ở Đông Nam Bộ (339.000 ha), Tây Nguyên
(113.000 ha), Trung tâm phía Bắc (41.500 ha) và Duyên Hải miền Trung (6.500
ha) [34].
Bình Dương là một trong những vùng đất đầu tiên trồng cây Cao su ở Việt
Nam. Gắn liền với quá trình khai hoang lập đồn điền của tư bản Pháp vào đầu thế
kỷ XX, Bình Dương là nơi tập trung nhiều đồn điền cao su ở Đông Nam bộ [36].
1.4.2.3. Thành phần hóa học
Cây Cao su có:
- Nhựa mủ chứa 70% nước và 20-30 % cao su. Cao su là một polymer của isopren
(polypren), các dãy polyisorenic có cấu trúc cao đối với các nối kép và
19

31. trọng lượng phân tử có thể vượt quá 1 triệu.
- Nhũ tương chứa các chất khoáng (0,50%), các glucid (1-2%), các protid
(aminoacid), các men (oxydaza).
- Quả chứa một tinh dầu lỏng (20-34% ở hạt, 38-53% ở nhân) màu vàng rơm,
mùi dầu lanh, dính.
- Hạt chứa một glycosid cyanogenetic độc [33].
1.4.3. Giá trị kinh tế của cây Cao su
Cây Cao su là một loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế rất cao. Đây là loại
cây mà sản phẩm của nó chủ yếu được dùng làm nguyên liệu cho các ngành công
nghiệp và tiểu thủ công nghiệp.
Kinh danh cao su xét về mặt kinh tế có thể nói cho lợi nhuận “kép” từ sản
phẩm chính là mủ và gỗ, trong khi thu hoạch sản phẩm từ mủ thì giá trị cây ngày
càng tăng trưởng cho nguồn thu từ gỗ khi thanh lý [10].
- Mủ cao su: Sản phẩm chủ yếu của cây cao su là mủ với nhiều loại sản phẩm
đa dạng như: Cao su vỏ ruột xe chiếm 70% sản lượng cao su thế giới, kế đó là
cao su để làm các ống, băng chuyền, đệm giảm xóc, vật liệu chóng mài mòn, các
trang thiết bị hàng không, dụng cụ gia đình, dụng cụ y tế, dụng cụ thể thao…[21].
Cao su tự nhiên có đặc tính khác biệt hơn hẳn cao su nhân tạo về
độ giản, độ đàn hồi cao, chống nứt, chống lạnh tốt, ít phát nhiệt khi cọ sát, dễ
sơ luyện… Sản phẩm từ mủ cao su thiên nhiên là một trong những nguyên
liệu cần thiết của nhiều ngành công nghiệp hiện đại trên thế giới, sếp thứ tư
sau dầu mỏ, than đá, sắt thép và đặc biệt là không thể chế biến được cao su
nhân tạo có đặc tính như cao su thiên nhiên. Sản phẩm từ mủ cao su thiên
nhiên có trên 50 ngàn công dụng khác nhau và rất cần thiết cho các ngành
công nghiệp ô tô, máy bay, sản xuất dụng cụ y tế và nhiều ngành công nghiệp
phục vụ tiêu dùng khác [10].
20

32. - Gỗ cao su: Cây Cao su hết niên hạn khai thác thanh lý, trên một ha trung bình
có thể khai thác được 160 m3
gỗ nguyên liệu với giá trị thanh lý khoảng 80
triệu đồng (theo thời giá hiện nay), đủ để tái canh khoảng 2 ha kiến thiết cơ
bản. Gỗ cao su đã được chế biến để sản xuất bàn, ghế, tủ, giường,… có giá trị
giao động từ 600-900 USD/m3
[10].
Kinh doanh sản xuất cao su thiên nhiên là ngành hàng chiến lược ở nước ta.
Hàng năm ngành cao su đem lại trên 1 tỷ USD kim ngạch xuất khẩu cho nền kinh
tế, góp phần quan trọng thúc đẩy nhanh tiến trình công nghiệp hóa – hiện đại hóa
nông nghiệp, nông thôn ở nước ta trong giai đoạn hiện nay. Về mặt xã hội: Doanh
nghiệp nhà nước kinh doanh cao su thiên nhiên đã tạo công ăn việc làm cho hàng
chục vạn lao động từ các vùng. Nhờ thuận lợi về giá cả, thị trường, thu nhập của
người lao động được nâng cao vào những năm gần đây làm thay đổi bộ mặt kinh
tế - văn hóa - xã hội. Nhiều địa phương đã sử dụng cây Cao su như một giải pháp
xóa đói giảm nghèo [10].
Cây Cao su được xem là loại cây đa mục đích, vừa có giá trị kinh tế cao, vừa
thực hiện nhiệm vụ của những cánh rừng phòng hộ, phòng chống thiên tai, bảo vệ
đất, chống xói mòn.
21

33. Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Trang thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Tủ vô trùng, nồi hấp khử trùng, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh,
nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình, đèn neon…
Dụng cụ: Pise, kéo, bộ đồ cấy, đĩa petri, đèn cồn,…
2.1.2. Vật liệu
Hạt và cành cao su lấy từ các hộ nông dân trồng cao su tại huyện Tân Uyên,
tỉnh Bình Dương.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu
Chúng tôi tiến hành thu thập, phân tích, tổng hợp những tài liệu có nội dung
liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu để có cơ sở lý thuyết, phương pháp nghiên cứu
phù hợp phục vụ cho việc hoàn thành khóa luận nghiên cứu của mình.
Các nguồn tài liệu khác được sử dụng tham khảo thêm như: Giáo trình nuôi
cấy mô và tế bào thực vật, Tạp chí Sinh học, Tạp chí Công nghệ Sinh học, luận
văn, luận án, bài báo khoa học...
22

34. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
2.2.2.1. Điều kiện và môi trường nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy in vitro
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày
Nhiệt độ: 25 ± 20
C
Độ ẩm: 75-80 %
Cường độ ánh sáng: 2000-3000 lux
Môi trường nuôi cấy
Các môi trường được sử dụng gồm: Môi trường MS cơ bản, môi trường MS
có bổ sung 0,5-1 mg/L BAP và môi trường MS có bổ sung 5 mg/L BAP + 5 mg/L
IBA. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng là BAP, IBA (mg/L)
Các thành phần khác: Đường saccharose, aga (gam)
Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,8 (bằng KOH 0,1N và NaOH 0,1N)
trước khi hấp khử trùng bằng nồi hấp ở 1 atm (1210
C) trong 30 phút.
23

35. Bảng 2.1. Thành phần môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962)
THÀNH PHẦN HÀM LƯỢNG (mg/L)
1. Đa lượng
KNO3 1900
KH2PO4 170
NH4NO3 1650
MgSO4.7H2O 370
CaCl2.2H2O 440
FeSO4.7H2O 27,8
Na2-EDTA 37,3
2. Vi lượng
H3BO3 6,2
MnSO4.4H2O 22,3
CoCl2.6H2O 0,025
CuSO4.5H2O 0,025
ZnSO4.4H2O 8,6
Na2MoO4.2H2O 0,25
KI 0,83
3. Vitamin
Myo-inositol 100
Thiamne.HCl 0,1
Pyridoxine.HCl 0,5
Nicotinic acid 0,5
4. Amoni acid
Glycine 2
24

36. 2.2.2.2. Nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu
Tìm ra nồng độ chất khử trùng thích hợp và thời gian tối ưu cho khử trùng
mẫu hạt và cành cây Cao su.
Hạt (chọn những hạt to, vỏ bóng, cứng) lấy từ vườn cao su được rửa qua bằng
nước máy cho hết bụi bẩn bám vào. Dùng dao tách bỏ lớp vỏ cứng. Dùng xà bông rửa
hạt nhẹ nhàng. Rửa lại bằng nước máy nhiều lần dưới vòi nước. Để hạt vào trong bình
pise vô trùng và rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng. Chuyển mẫu vào tủ cấy. Trong
tủ cấy vô trùng, hạt của cây Cao su được rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng, mẫu được
xử lí sơ bộ bằng cồn 700
trong thời gian 1 phút. Mẫu được rửa lại
5 lần nước cất vô trùng. Tiếp tục thăm dò với các chất khử trùng ở nồng độ và thời
khác nhau gồm: Nước javen theo tỉ lệ (1: 3) khử trùng trong thời gian 15 phút. HgCl2
0,1% khử trùng trong 2 khoảng thời gian là 5 phút và 10 phút để nghiên cứu tỉ lệ phần
trăm mẫu bị nhiễm, tỉ lệ phần trăm mẫu vô trùng và tỉ lệ phần trăm mẫu nảy chồi.
Tiếp tục rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần. Hạt được cắt đôi hoặc
còn nguyên được cấy lên các môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh
trưởng khác nhau.
Cành mang chồi nách và chồi đỉnh (chọn những cành có đường kính khoảng 1
cm, mang nhiều chồi nách, xanh, cứng và khỏe) của cây Cao su được rửa qua bằng
nước máy cho hết bụi bẩn bám vào. Dùng xà bông rửa các đoạn cành nhẹ nhàng. Rửa
lại bằng nước máy nhiều lần dưới vòi nước. Để các đoạn cành vào trong bình pise vô
trùng và rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng. Chuyển mẫu vào tủ cấy. Trong tủ cấy
vô trùng, cành mang chồi của cây Cao su được rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng, mẫu
được xử lí sơ bộ bằng cồn 700
trong thời gian 1 phút. Mẫu được rửa lại 5 lần nước cất
vô trùng. Tiếp tục thăm dò với chất khử trùng ở cùng nồng độ với thời gian khác nhau
là HgCl2 0,1% khử trùng trong 3 khoảng thời gian là 22 phút, 30 phút và 35 phút để
nghiên cứu tỉ lệ phần trăm mẫu bị nhiễm, tỉ lệ phần trăm mẫu vô trùng và tỉ lệ phần
trăm mẫu nảy chồi. Tiếp tục rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần. Cành được cắt để
lấy đoạn chồi nách và chồi đỉnh (khoảng
25

37. 1cm) và được cấy lên các môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh
trưởng khác nhau.
2.2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro Nghiên
cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro từ chồi đỉnh.
Nghiên cứu ảnh hưởng của MS lên khả năng tạo chồi in vitro từ đỉnh chồi.
Tìm nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho quá trình tạo
cụm chồi.
Đỉnh chồi (khoảng 1cm) tách từ các cành cao su ngoài tự nhiên, được khử
trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar.
Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm),
khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Nghiên cứu ảnh hưởng của MS kết hợp với BAP lên khả năng tạo chồi in vitro
từ đỉnh chồi.
Đỉnh chồi (khoảng 1cm) tách từ các cành cao su ngoài tự nhiên, được khử
trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar và bổ
sung BAP với các nồng độ từ 0,5-1 mg/L.
Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm),
khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
26

38. Nghiên cứu ảnh hưởng của MS kết hợp với BAP và IBA lên khả năng tạo chồi
in vitro từ đỉnh chồi.
Đỉnh chồi (khoảng 1cm) từ các chồi in vitro ở thí nghiệm được khử trùng và
được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar bổ sung (5
mg/L BAP + 5mg/L IBA).
Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm),
khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro từ chồi nách.
Nghiên cứu ảnh hưởng của MS lên khả năng tạo chồi in vitro từ chồi nách.
Tìm nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho quá trình tạo
cụm chồi.
Chồi nách (khoảng 1cm) tách từ các cành cao su ngoài tự nhiên được khử
trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar.
Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm),
khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Nghiên cứu ảnh hưởng của MS kết hợp với BAP lên khả năng tạo chồi in vitro
từ chồi nách.
Chồi nách (khoảng 1cm) tách từ các cành cao su ngoài tự nhiên được khử
trùng và được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar bổ
sung BAP với các nồng độ từ 0,5-1 mg/L.
27

39. Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm),
khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Nghiên cứu ảnh hưởng của MS kết hợp với BAP và IBA lên khả năng tạo chồi
in vitro từ chồi nách.
Chồi nách (khoảng 1cm) từ các chồi in vitro ở thí nghiệm được khử trùng và
được cấy lên môi trường MS cơ bản có 2% saccharose, 0,7% agar bổ sung (5
mg/L BAP + 5mg/L IBA).
Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm),
khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Mỗi môi trường nuôi cấy 20 mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.2.3. Phương pháp xử lý thống kê số liệu
Số liệu trong các bảng kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm
Microsof Excel.
28

40. Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ
MỘT SỐ MẪU CÂY CAO SU
Các mẫu vật khác nhau được thu nhận từ quả và hạt cao su. Chọn những hạt
khô có vỏ cứng phía ngoài còn nguyên vẹn. Một số hạt được gieo nảy mầm tạo
nguồn nguyên liệu khử trùng. Hạt được tách vỏ cứng phía ngoài, và ngâm trong
nước cất vô trùng 2 giờ đồng hồ làm nguyên liệu. Kết quả thu được sau 3 tuần
nuôi cấy như sau.
Bảng 3.1. Tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng của mẫu với các chất khử
trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel)
Hiệu quả khử trùng của mẫu
Mẫu
Hạt Phôi Đoạn thân Chồi đỉnh Lá Hạt cắt
nguyên từ hạt nảy từ hạt nảy mầm ngang
Chất khử trùng
mầm mầm
HgCl2 0,1%
10% 100% 29% 21% 100% 52%
(30 phút)
Nước javel
5% 100% 18% 14% 100% 39%
(tỉ lệ 1:3)
Khả năng khử trùng của HgCl2 0,1%, 30 phút tốt hơn so với nước javel (tỉ lệ
1:3) ở tất các nguồn mẫu nghiên cứu. Đối với các loại mẫu thì hiệu quả khử trùng
của phôi, lá mầm là tốt nhất. Đối với hạt còn nguyên thì một số loại nấm phát triển
phía trong, chất khử trùng không vào được bên trong nên hiệu quả khử trùng thấp
nhất.
29

41. %
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
hạt phôi
nguyên
HgCl2 0,1%, 30'
javel (1:3)
Tên mẫu
đoạn chồi lá hạt cắt
thân đỉnh mầm ngang
Biểu đồ 3.1. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng
của mẫu với các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel)
Kết quả trên có nhiều nét tương đồng với kết quả nghiên cứu của Đặng Thị
Thanh Thúy với đề tài (2006) “Nhân giống in vitro cây Giáng hương (Pterocarpus
macrocarpus)”, luận văn tốt nghiệp trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh [28]. Hạt cây Giáng hương mang một số loại nấm nên hiệu quả khử trùng
còn hạn chế.
Hướng nghiên cứu tiếp theo: Nghiên cứu thời gian khử trùng của các chất khử
trùng trên để tạo tỉ lệ mẫu vô trùng cao hơn đồng thời rút ngắn thời gian để giảm
tác dụng của chất khử trùng lên mô, tế bào nhằm thu được tỉ lệ mẫu tạo chồi cao
nhất.
30

42. Hình 3.1. Mẫu in vitro từ hạt cây Cao su
3.2. THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ
CÀNH CỦA CÂY CAO SU
Sau 8 tuần, tỉ lệ (%) mẫu chồi đỉnh và chồi nách được khử trùng với cùng chất
khử trùng HgCl2 0,1% ở thời gian 22 phút, 30 phút và 35 phút được trình bày ở
Bảng 3.2. Nhìn chung với cùng một chất khử trùng HgCl2 0,1% ở thời gian khác
nhau cho hiệu quả khử trùng khác nhau.
31

43. Bảng 3.2. Tỉ lệ (%) mẫu được vô trùng với chất khử trùng HgCl2 0,1% ở thời
gian khác nhau
Chồi đỉnh Chồi nách
Mẫu
% mẫu% vô% mẫu % mẫu% vô% mẫu
Chất khử trùng
nhiễm trùng chết nhiễm trùng chết
HgCl2 0,1%
87,5 12,5 0 41,18 51,47 7,35
(22 phút)
HgCl2 0,1%
12,5 62,5 25 61,54 36,92 1,54
(30 phút)
HgCl2 0,1%
0 80 20 16 77,33 6,67
(35 phút)
Dung dịch HgCl2 0,1% khử trùng ở thời gian 35 phút cho hiệu quả khử trùng
tốt nhất. Tỉ lệ phần trăm vô trùng cao hơn hẳn so với khử trùng ở 22 phút và 30
phút. Nhưng tỉ lệ phần trăm mẫu chết cao hơn so với khử trùng ở 22 phút và 30
phút.
Đối với mẫu khử trùng với HgCl2 0,1% trong thời gian 22 phút thì ngược lại,
tỉ lệ phần trăm mẫu vô trùng thấp hơn so với khử trùng ở 30 phút và 35 phút. Mặc
khác tỉ lệ phần trăm mẫu nhiễm cao hơn hẵn so với khử trùng ở 30 phút và 35
phút. Phần trăm mẫu chết thì rất thấp.
Từ việc phân tích trên cho thấy khi tăng thời gian khử trùng thì kết quả mẫu
vô trùng cao nhưng tỉ lệ mẫu chết tăng lên do chất khử trùng đã làm tổn thương
phôi, mô của mẫu. Đối với chất khử trùng HgCl2 0,1% khi khử trùng với các
khoảng thời gian khác nhau thì thời gian thích hợp nhất là 30 phút cho tỉ lệ vô
trùng cao, mẫu chết và mẫu nhiễm ít.
32

44. Theo Hoàng Thị Thế, Nguyễn Thị Phương Thảo, Ninh Thị Thảo (2013) “Quy
trình nhân giống in vitro cây Ba kích (Morinda officenalis How)”, Tạp chí Khoa
học và Phát triển, tập 11, số 3: 285-292 [26]. Cũng thấy rằng hiệu quả khử trùng
có sự khác nhau giữa chồi đỉnh và chồi nách. Tuy nhiên kết quả tốt nhất thu được
khi dùng 15 phút Ca(HClO)2 10% và 5 phút HgCl2 0,1%. Khi chúng tôi hạ nồng
độ chất khử trùng xuống thấp hơn thì tỉ lệ mẫu nhiễm quá nhiều, khả năng phát
sinh chồi không cao. Cây Cao su là loại cây lấy mũ, có nhiều loài nấm, vi khuẩn
ký sinh bên ngoài và nội sinh bên trong.
Hướng phát triển tiếp theo: Tiếp tục thăm dò một số chất khử trùng khác cho
hiệu quả khử trùng, khả năng phát sinh chồi tốt hơn.
Hình 3.2. Mẫu chồi đỉnh và chồi nách vô trùng khi khử trùng
bằng HgCl2 0,1%
33

45. 3.3. THÍ NGHIỆM 3: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT SINH CHỒI
TỪ CÁC MẪU VẬT CỦA CÂY CAO SU
Kết quả nghiên cứu khả năng phát sinh chồi từ các mẫu vô trùng của cây Cao
su sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng
BAP 0-1 mg/L và bổ sung (5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA) được trình bày ở Bảng
3.3.
Bảng 3.3. Khả năng phát sinh chồi từ các mẫu ở các môi trường nuôi cấy
Môi trường
MS
MS + BAP MS + BAP MS + BAP 5 mg/L
Mẫu 0,5 mg/L 1 mg/L + IBA 5 mg/L
Phôi - - - -
Hạt - - - -
Đoạn thân từ hạt
- - - -
nảy mầm
Chồi đỉnh từ hạt
+ - - -
nảy mầm
Lá mầm - - - -
Hạt cắt ngang - - - -
Chồi đỉnh cành
- - - -
non
Chồi nách cành
- - - +
non
Chồi đỉnh cành
- - - -
già
Chồi nách cành
- - - +
già
34

46. Ghi chú:
(-): Không có khả năng phát sinh chồi.
(+): Có khả năng phát sinh chồi.
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy khả năng phát sinh chồi ở các
mẫu đã vô trùng trong các môi trường là khác nhau tùy loại mẫu và tùy vào môi
trường.
Hầu hết ở các môi trường mẫu chỉ sống được trong thời gian 1-2 tuần đầu, sau
đó chuyển sang màu xám đen và chết. Ở phôi và lá mầm, một số mẫu vẫn như ban
đầu sau 8 tuần. Nhưng quá trình tạo chồi vẫn không diễn ra. Để mẫu tạo chồi cần
có quá trình cân bằng giữa chất điều hòa sinh trưởng bên ngoài môi trường và nội
sinh bên trong mô cây Cao su.
Ở môi trường MS, chồi nách sau 1 tuần nuôi cấu có dấu hiệu cảm ứng, mẫu
xù xì, phồng rộp và có màu trắng, chồi nách có hiện tượng nhú lên. Nhưng sau 2
tuần mẫu xạm đen và có dấu hiệu ngừng phát triển.
Đối với mẫu chồi đỉnh từ hạt nảy mầm lại có khả năng phát sinh chồi ở môi
trường MS.
35

47. Hình 3.3. Chồi in vitro hình thành sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS
Quá trình tạo chồi được nhận thấy rõ nhất là môi trường MS bổ sung BAP 5
mg/L + IBA 5 mg/L trên mẫu vật là chồi nách. Sau 1 tuần nuôi cấy bắt đầu có dấu
hiệu cảm ứng. Sau 2 tuần nuôi cấy mẫu bắt đầu bung nhiều chồi nhỏ từ mắt cành.
Ở chồi đỉnh không có hiện tượng này.
36

48. Hình 3.4. Sự thích ứng của mẫu với môi trường MS bổ sung 5 mg/L BAP
+ 5 mg/L IBA
Thêm vào đó, sau 5 tuần nuôi cấy, chồi nách từ môi trường MS tuy không
phát sinh chồi nhưng sau khi được chuyển quả môi trường MS bổ sung BAP 5
mg/L + IBA 5 mg/L thì quá trình tạo chồi bắt đầu.
37

49. Hình 3.5. Chồi in vitro hình thành từ chồi nách sau 8 tuần nuôi cấy trên
môi trường MS bổ sung BAP 5 mg/L + IBA 5 mg/L
Khả năng tái sinh chồi mới từ chồi nách và chồi đỉnh khác nhau ở các loại cây
khác nhau. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có nhiều nét tương đồng với kết quả
của Lê Văn Tường Huân và cs. khi nghiên cứu trên đối tượng cây Chanh dây với
đề tài cấp bộ “Nhân giống vô tính in vitro cây Chanh dây (Pasiflora edulis Sims)
sử dụng đoạn thân mang chồi nách” [9]. Chồi nách cho hệ số nhân chồi và khả
năng phát sinh chồi tốt hơn so với chồi đỉnh.
38

50. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
- Nồng độ chất khử trùng và thời gian tối ưu cho khử trùng mẫu từ chồi đỉnh và
chồi nách cây Cao su là HgCl2 0,1%, 30 phút. Tỉ lệ chồi đỉnh vô trùng là
62,5%, chồi nách vô trùng là 36,92%.
- Trong các môi trường bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, môi trường có bổ
sung 5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA là môi trường thích hợp cho khả năng phát
sinh chồi in vitro.
- Mẫu tốt nhất cho quá trình phát sinh chồi mới là chồi nách ở cành non và cành
già.
2. KHUYẾN NGHỊ
Cây Cao su là loài cây không những mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân
tỉnh Bình Dương mà còn là một lợi thế xuất khẩu của Việt Nam. Nghiên cứu nhân
giống in vitro sẽ đáp ứng về nguồn cây giống đảm bảo chất lượng phục vụ cho
việc trồng trọt quy mô lớn. Do thời gian có hạn chúng tôi chưa thể hoàn thiện quy
trình vi nhân giống cây Cao su, do vậy chúng tôi khuyến nghị tiếp tục có những
nghiên cứu sau:
- Tiếp tục thăm dò các chất khử trùng cho hiệu quả tốt nhất.
- Tiếp tục nghiên cứu tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau cho hệ
số nhân chồi tốt nhất.
- Nghiên cứu môi trường tạo rễ cho chồi in vitro.
- Nghiên cứu các điều kiện tự nhiên thích hợp để chuyển cây con in vitro ra
vườn ươm.
39

51. TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Bá (1997), “Thực vật chuyển gene và môi trường”, Sinh học ngày
nay, Dịch từ La Recherch.
2. Đái Duy Ban, Lê Thanh Hòa (1996), Công nghệ sinh học đối với vật nuôi và
cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1994), Những thành tựu khoa học kỹ thuật
đưa vào sản xuất, Chuyên đề: Công nghệ gene trong sản xuất vacxin thế hệ
mới, Trung tâm thông tin tư liệu, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công
nghệ Quốc gia, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
4. Nguyễn Khoa Chi (1985), Cây Cao su – Kỹ Thuật trồng – Chăm sóc – Chế
biến, Nxb Nông nghiệp.
5. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 2, Nxb Khoa học và
Kỹ thuật.
6. Nguyễn Cảnh Chính (2011), “Nghiên cứu khả năng nhân giống vô tính cây
Chè đắng (llex kaushue S.Y Hu) bằng phương pháp giâm cành”, Luận văn
thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
7. Nguyễn Hữu Định (2005), “Nghiên cứu nhân giống vô tính cây Tiêu (Piper
nigrum) bằng phương pháp nuôi cây mô”, Luận văn tốt nghiệp, Ngành
Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
8. Trần Thị Thuý Hoa, Lê Mậu Tuý, Phạm Hải Dương, Vũ Văn Trường và Lại
Văn Lâm (2001), Tuyển chọn giống cao su khuyến cáo giai đoạn 1999-
2001. Trong kết quả hoạt động khoa học năm 2000. Nxb Nông nghiệp.
9. Lê Văn Tường Huân và cs. (2013), “Nhân giống vô tính in vitro cây Chanh
dây (Pasiflora edulis Sims) sử dụng đoạn thân mang chồi nách”, Tạp chí
Công nghệ Sinh học, số 8(3) .
10. Võ Thị Thu Hồng (2011), “Phương pháp xác định giá trị vườn cao su khi
chuẩn bị đi vào tiến hành cổ phần hóa các nông trường cao su trực thuộc
40

52. tổng công ty cao su Đồng Nai”, Luận văn tốt nghiệp, Ngành quản trị kinh
doanh, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Ngọc Hải (1997), Công nghệ sinh học trong công nghiệp, Nxb
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
12. Nguyễn Hữu Hổ (2004), Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa Công
nghệ Sinh học, Trường Đại học mở bán công thành phố Hồ chí minh.
13. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Quyển II, Nxb Trẻ.
14. Nguyễn Thị Huệ (1997), Cao su - Kiến thức tổng quát và kỹ thuật nông
nghiệp, Nxb Trẻ.
15. Nguyễn Hoàng Lộc (1993), “Ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro trong
nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào việc nhân nhanh các cây trồng có giá trị
kinh tế”, Thông tin Khoa học, Sở Khoa học - Công nghệ và Môi trường
Thừa Thiên Huế.
16. Nguyễn Hoàng Lộc (1998), Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa
sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.
17. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nxb
Y học, Hà Nội.
18. Phan Cự Nhân, Trần Đình Miên (1997), Tìm hiểu công nghệ sinh học hiện
đại, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
19. Trần Duy Quý (1997), Các phương pháp mới trong chọn tạo giống cây
trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
20. Hoàng Thị Sản, Hoàng Thị Bé (2005), Phân loại học thực vật, Bộ giáo dục
và đào tạo – dự án đào tạo giáo viên THCS, Nxb Đại học Sư phạm.
21. Văn Mai Sơn (2001), Những thành tựu cơ bản của khoa học công nghệ Cao
su ứng dụng ở miền Đông Nam bộ, Nxb Nông nghiệp.
22. Nguyễn Thị Kim Thanh, Dương Huyền Trang (2008), “Nghiên cứu kỹ thuật
nhân giống vô tính cây Lô hội (Aloe vera L.) bằng phương pháp nuôi cấy in
vitro”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2008: Tập VI, Số 6: 514-521, Khoa
Nông học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
41

53. 23. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và
Ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
24. Phan Văn Thuần (2008), “Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro cây hoa
Păng-Xê (Viola tricolor L.)”, Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường
Đại học Khoa học-Đại học Huế.
25. Đoàn Thị Ái Thuyền, TS. Thái Xuân Du và Đỗ Xuân Giáp (2003), “Bước
đầu nghiên cứu nhân giống một số cây hồ tiêu sạch virus (Piper nigrum
L.)”, Viện Sinh học nhiệt đới.
26. Hoàng Thị Thế, Nguyễn Thị Phương Thảo, Ninh Thị Thảo (2013) “Quy
trình nhân giống in vitro cây Ba kích (Morinda officenalis How)”, Tạp chí
Khoa học và Phát triển, Tập 11, số 3: 285-292.
27. Đinh Xuân Thức (2008), Bài giảng cây công nghiệp dài ngày, Dự án hợp
tác Việt Nam – Hà Lan, Trường Đại học Nông Lâm Huế.
28. Đặng Thị Thanh Thúy (2006), “Nhân giống in vitro cây Giáng hương
(Pterocarpu macrocarpus)”, luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh.
29. Nguyễn Văn Uyển và các tác giả (1984), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công
tác giống cây trồng, Nxb TP. Hồ Chí Minh.
30. Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ công tác
giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
31. Atique Akbar M. and Shyamal Roy K. (2006), “Effects of liquid medium
on rooting and acclimation of regenerated microshoots of banana (Musa
sapientum L.) cs. Sagar”, Plant Tissue Culture & Biotech, 16(1), pp. 11-18.
32. Rober N. T., Dennis J. G. (2000), Plant Tissue Culture Concept and
Laboratory Exercise, CRC Press, New York.
42

54. TÀI LIỆU INTERNET
33. http://www.lrc-hueni.edu.vn/dongy/show_target.plx?url=/thuocdongy/C/
Caosu.htm&key=&char=C
34. http://vi.wikipedia.org/wiki/Cao_su_(cây)
35. http://www.cesti.gov.vn/th-gi-i-d-li-u/phat-tri-n-cay-cao-su-vi-t-nam.html
36. http://khcnbinhduong.gov.vn/?s=AV&CateID=NTlC5Xa3Q0KidJk3391DZ
Q%3D%3D&ArtID=SOmCLtSw9y%2FgwJR6nbvY1A%3D%3D
37. http://idoc.vn/tai-lieu/trien-vong-nhan-giong-vo-tinh-cho-cay-ca-phe.html
43