Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------o0o---------
ĐỖ NGỌC HÀ
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI TRẦN LIÊN
(Paphiopedilum tranlienianum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Lớp : K48 - CNSH
Khoa : CNSH – CNTP
Khoá học : 2015 – 2020
Giảng viên HD : ThS. Nguyễn Thị Tình
Thái Nguyên, năm 2020

i
LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em
đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên
(Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro”.
Lời đầu tiên trong khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám
hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình giảng viên khoa Công nghệ Sinh học
và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong
thời gian thực hiện đề tài.
Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên trên
phòng cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH-CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ và
hướng dẫn cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là
chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập.
Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời
gian có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận
được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn
thiện hơn Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận
lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

ii
Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn sinh viên có sức
khoẻ, thành công trong cuộc sống.
Thái Nguyên, ngày tháng năm
Sinh viên thực hiện
Đỗ Ngọc Hà

iii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo
tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN).................................................... 8
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của
H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy).34
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng
tái sinh phôi lan.............................................................................36
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân
nhanh phôi Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) ..................................38
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin
đến khả năng nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên...................40
Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ
đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy).............42
Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ
cây lan hài Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy)....................................45
Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính
đến khả năng ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuổi nuôi cấy).....47
Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng
và phát triển của lan Trần liên ......................................................49

iv
DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ
Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum................13
Hình 3.1. Quả lan Hài Trần Liên ....................................................................23
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên......................26
Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên.................35
Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%).........................................................37
Biểu đồ 4.3. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA .....39
Biểu đồ 4.4. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp
với Kinetin ....................................................................................41
Biểu đồ 4.5. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp
với Kinetin và TDZ.......................................................................43
Biểu đồ 4.6. Tỷ lệ mẫu ra rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA ............45
Biểu đồ 4.7. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết
hợp với than hoạt tính ...................................................................47
Biểu đồ 4.8. Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể........................................49

v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
B5 : Gamborg cs, 1976
BAP : 6-Benzyl amino purine
CS : Cộng sự
CT : Công thức
CV : Coeficient of Variation – Hệ số biến động
Đ/C : Đối chứng
LSD : Least Singnificant DifferenceTest
MS : Murashighe và Skoog, 1962
MT : Môi trường
GA3 : Gibberellic acid
NAA : α-Napthalene acetic acid
IAA : Indole-3-acetic acid
IBA : Indole-3-butyric acid
IUCN : International Union for Conservation of Nature and
Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế
P.
tranlienuanum
: Paphiopedilum tranlienuanum
P. malipoens : Paphiopedilum malipones
WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980

vi
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................i
DANH MỤC BẢNG........................................................................................iii
DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ.......................................................................iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v
MỤC LỤC........................................................................................................vi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2 Mục đích nghiên cứu................................................................................... 1
1.3 Yêu cầu của đề tài ....................................................................................... 2
1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ....................................... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
2.1. Tổng quan về Lan Hài................................................................................ 3
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ........................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 4
2.1.3. Sinh thái................................................................................................... 6
2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam............................................................ 7
2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum)..................11
2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum
tranlienianum) ở Việt Nam.............................................................................11
2.2.2 Hình Thái................................................................................................12
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài lan Hài Trần Liên..................13
2.3.4. Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng
trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên .........................14
2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài trên thế giới và trong nước
.........................................................................................................................19

vii
2.4.1. Trên thế giới..........................................................................................19
2.4.2. Trong nước............................................................................................21
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.........................................................................................................................23
3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu..................................................23
3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu..............................................................23
3.1.2. Hoá chất sử dụng...................................................................................23
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu.................................................................24
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu..............................................24
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu...............................................................................24
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................24
3.2.3. Thời gian nghiên cứu ............................................................................25
3.3. Nội dung nghiên cứu................................................................................25
3.4. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................25
3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro..................................................25
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống....................................26
3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm..............................................................31
3.5. Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá........................31
3.5.1. Thu thập số liệu.....................................................................................31
3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi..............................................................................31
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...........................34
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng
H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng.........................................................34
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái
sinh phôi lan Hài Trần Liên ............................................................................36
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả
năng nhân nhanh cây lan Hài Trần Liên .........................................................38

viii
4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh
chồi của cây lan Hài Trần Liên .......................................................................38
4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến
khả năng nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên..................................................40
4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả
năng nhân nhanh giống cây.............................................................................42
4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả
năng ra rễ cây lan ............................................................................................44
4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của
cây lan .............................................................................................................44
4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng
ra rễ của cây lan hài Trần liên.........................................................................46
4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát
triển của lan.....................................................................................................48
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................51
5.1. Kết luận ....................................................................................................51
5.2. Kiến nghị..................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................52

1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Lan Hài là loài hoa đẹp có giá trị thẩm mĩ và kinh tế cao. Được người yêu
hoa trong và ngoài nước tìm kiếm, điều này đã dẫn đến hầu hết các loài lan hài
trên thế giới cũng như của Việt Nam rơi vào mức báo động nguy cơ tuyệt chủng
ngoài tự nhiên.
Hài Trần Liên (hài Bắc Thái) là một trong số loài lan hài đặc hữu của Việt
Nam, có khu phân bố hẹp (khu vực Bắc Kạn và Thái Nguyên), hiện lan hài
Trần Liên được tìm thấy ở khu vực đệm của Hồ Ba Bể - nơi xuất hiện nhiều
loài phong lan, địa lan có giá trị thẩm mỹ.
Hài Trần Liên được nhiều nhà sưu tầm lan quan tâm bởi kiểu dáng độc
đáo với điểm nhấn cánh môi của hoa uốn cong giống hình chiếc hài và hai cánh
bên lượn sóng, màu đỏ thẫm, hấp dẫn người chơi lan.
Hài Trần Liên tái sinh bằng phôi nếu kết hợp được với loài nấm cộng sinh,
do đó khả năng tái sinh trong tự nhiên thấp, đây là nguyên nhân thứ 2 khiến
loài hoa có giá trị này được liệt kê vào phụ lục 1 của công ước CITES và danh
mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định
số 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006.
Xuất phát từ thực tiễn trên em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng
nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng
phương pháp in vitro”.
1.2 Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần liên từ
phôi bằng phương pháp in vitro.

2
1.3 Yêu cầu của đề tài
- Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến
hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.
- Xác định được ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến khả năng tái
sinh phôi của cây Hài Trần Liên
- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng
nhân nhanh Hài Trần Liên
- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả
năng ra rễ cây Hài Trần Liên.
- Xác định ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Hài Trần Liên.
1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
* Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung
vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn
- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm
thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho
công tác sau này.
* Ý nghĩa thực tiễn
Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan hài Trần Liên
(paphiopedilum tranlienianum) bằng phương phán nuôi cấy in vitro, góp phần
bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật
liệu cho nghiên cứu khoa học.

3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Lan Hài
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc
2.1.1.1. Phân loại
Lan Hài là một nhóm rất khác biệt trong họ lan. Chúng dễ dàng được nhận
ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống
một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa. Chiếc môi đặc sắc và hình dạng
khác thường của hoa tạo nên vẻ bề ngoài dễ dàng phân biệt lan Hài với các loài
lan khác. Vì vậy nó trở thành tên chung của loài lan này.
Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là:
- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân
bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc.
- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng
25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.
- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á
từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo
Solomon.
Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông
Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ lan (Orchidaceae), bộ lan
(Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae),
ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae).[1]
2.1.1.2. Nguồn gốc
Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó
có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở

4
Trung Quốc và Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất
hạn chế.
Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có
sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao
vòng trong gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba
nhị đực ở vòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực
và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất
dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự
hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ
Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực
còn tồn tại trong hoa
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên
ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái:
- Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang
nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất
cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn[1]
- Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn
và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên
nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu
xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu
xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ
ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng
nước và cứng [1]
- Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm
ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có
cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên

5
cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ
dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có
hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có
chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần
khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần
giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn.[1]
- Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba
cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường
nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài
hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của
môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá
đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài[1]
Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi
xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng
rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến
đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao
hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt
trong và nhẵn ở mặt ngoài.[1]
Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị
đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và
hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi
này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ
tía xỉn [1]
- Qủa: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp.
Qủa mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Qủa thường chín trong điều kiên tự nhiên
sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]

6
- Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn,dạng thuôn dài hay hẹp và
thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không
có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1]
- Rễ: Rễ chùm, có một lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng
xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt. Sau khi
rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có
các búi nấm xung quanh rễ [1].
2.1.3. Sinh thái
Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm
phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến
1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở
độ cao từ 700-2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc
bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit.
Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các
loài sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn
núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các
loài lan Hài mọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán,
chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh
mùn chủ yếu sống bám trên vỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao
1200-1500m.
Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ
cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng
thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng
nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định
kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh
rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ

7
ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của quần
thể lan Hài.
Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn
núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng
phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay,
thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên
bị phá huỷ bởi con người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái
lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của
lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam.[1]
2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam
Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế
giới cũng như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy việc trồng lan đã trở
thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát
triển khu vực Đông Nam Á.
Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu
chuộng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 20
loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn
lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không những phong phú về chủng loại, Việt
Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa
chuộng. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách
ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên.
Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện
nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng[2]
Lan Hài và các loài thuộc bộ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất
trước tiên khi môi trường sống tự nhiên bị suy thoái. Nền kinh tế phát triển nhanh
chóng dẫn đến ô nhiễm môi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm

8
nhanh chóng do hoạt động khai thác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan Hài gây
ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện nay [1].
Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài
lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt
chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng
2.1.
Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ
chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN)
Tình trạng
Tên loài
(tiếng Latinh)
Tên loài
(tiếng Việt)
Đã bị tuyệt chủng
ngoài thiên nhiên
P. vietnamense Hài Việt
Đang bị tuyệt chủng
trầm trọng
p. delenatii Hài Đỏ
Đang bị tuyệt chủng
P.  aspersum
P. barbigerum var. lokianum
P. callosum
P. dianthum
P. emersonii
P. gratrixianum
P. hangiannum
P. helenae
P. henryanum
P.  herrmannii
P. malipoense var. jackii
P. malipoense
P. micranthum
Chưa rõ tên gọi
Hài Lộc
Hài Vân
Hài Xoắn
Hài Hương Lan
Hài Đuôi công
Hài Hằng
Hài hê len
Hài Henry
Hài Herman
Hài Jack
Hài Giáp
Hài Mốc Hồng

9
Tình trạng
Tên loài
(tiếng Latinh)
Tên loài
(tiếng Việt)
P. purpuratum
P. tralienianum
Hìa Tía
Hài Trần liên
Sắp bị tuyệt chủng
P. appletonianum
P. concolor
P. hirsutissimum var.
chiwuawnum
P. hirsutissimum var. esquirolai
P. villosun var. annamense
Hài Cánh Sen
Hài Gia Định
Hài Tiên biến dị
Hài Tiên
Hài Lông
Thiếu dẫn liệu
P.  affine
P.  datalanse
P. villosum var. boxalli
Hài Hoà
Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài
Việt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần
đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây,
qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện
rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi
đá vôi [12],[13],[14]
Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số
lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số
lượng các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có
liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các
loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt
chủng nhiều hơn và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng
bị suy thoái.

10
Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam
trong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa
phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên
ra nước ngoài. Do không có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các
loài thực vật hoang dã với sự giàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam
đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên
toàn bộ lãnh thổ.[1]
Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp
và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng
trong tương lai gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn
các loài hiếm và đặc hữu.
Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình
quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập,
phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên
của chúng. Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống
lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan
Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1]
Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam.
Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như:
- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà
(Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.
- Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang
bảo tồn loài P. callosum.
- Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng
Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo
tồn P.dalatensis.

11
- Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà
Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum.
- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii,
P.hangianum, P. malipoense varijackii.
- Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài
P.gratrixianum.
- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae.
- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong
Nha đang bảo tồn loài P. malipoense
Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài.
Đầu tiên phải kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành
công lan hài Hồng năm 2005. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi
cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo
bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau, Khoa CNSH – CNTP trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bước đầu đã thành công nhân giống bằng
phương pháp in vitro một số loài lan Hài như: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen.
2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum)
2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum
tranlienianum) ở Việt Nam
2.2.1.1 Nguồn gôc
Lan hài Trần liên - Paphiopedilum Tranlienianum là một loài
lan hài nhỏ, là dài khoảng 8-15cm màu xanh bóng. Loài này có hoa tao nhã với
lá đài lưng trắng có sọc tía nâu, cánh hoa tía nâu lượn sóng rất mạnh ở mép,
môi nâu tía và nhị lép vàng tươi. Hài Trần Liên là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam,
cây ưa râm mát, nở hoa khoảng tháng 9-12, độ bền của hoa khá dài 25-30 ngày.
Lan Hài Trần Liên được mô tả chính thống năm 1988 dựa trên một cây sống

12
được nhập khẩu từ Việt Nam và được đặt theo tên người Việt Nam đã xuất khẩu
nó, bà Trần Ngô Liên.
2.2.1.2 Phân bố
Lan Hài Trần Liên được phân bố ở việt nam ở các tỉnh : Cao Bằng, Bắc
Kạn, Tuyên Quang (Na Hang) và Thái Nguyên (Đồng Hỷ): Mỏ Ba
2.2.2 Hình Thái
- Lan Hài Trần Liên là loài lan đất, cây mọc thành khối. Cây mọc trên
tầng đá vôi, lớp lá mục và trên rêu.
2.2.2.1. Dạng lá
- Hình dải cỡ 18*1.7 cm, mặt trên màu lục bóng với mép nhạt hơn, mặt
dưới màu lục nhạt với nhiều chấm màu tím ở gốc. Lá bắc hình trứng, cỡ 1.7-
2.5*1.6cm, lông ngắn ở gân giữa và mép tận cùng.
2.2.2.2. Dạng hoa
Cụm hoa: có cuống dài 7-15cm, thường mang 1 hoa. Hoa : Rộng 5.5-6cm
- Lá đài có lông ngắn ở mặt ngoài, lá đài gắn trục hoa màu trắng.Gân
tròn cỡ 3*3-3.5cm.Lá đài kia màu lục nhạt, hình trứng, cỡ 2.5*1.1-1.8cm.Cánh
hoa màu tía- nâu với chóp màu lục,hình khuôn,cỡ 3-3.4*0.7-0.9 cm, bóng. Mép
lượn sóng, có lông trắng,gốc có nhiều lông nâu- tía nhạt. Môi màu đỏ- nâu
thẫm,cỡ 3.7-3.9*1.6cm,
- Nhị lép, hình trứng ngược, 8-10*7-9 mm, có mủ bóng. Bầu dài 3-4 cm,
phủ đầy lông ngắn nâu nhạt. Bông 5-6cm rộng,6-7cm cao.
2.2.2.3. Dạng quả
- Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả
chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.
2.2.2.4. Dạng gốc
- Gốc chuyển thành màu lục so với màu tía - nâu với chóp màu lục
2.2.2.5. Rễ

13
Rễ chùm, màu nâu, có lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng
xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt. Sau khi
rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có
các búi nấm xung quanh rễ.
Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài lan Hài Trần Liên
2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng
- Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật
chung, những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến
trung bình, ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn
thích hợp với điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban
ngày là 21-25°C.
- Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lan Hài
ưa ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ 11.000-22.000
lux. Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu
lá màu xanh đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng.

14
- Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhất là
trong mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không
bị khô quá nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên
các khay sỏi nhẹ với 50% độ ẩm là lý tưởng.
2.2.3.2. Nhu cầu bón phân
Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung
khoáng Ca2+
40mg/l và Mg2+
20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón
phân, nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sang chậu
khi giá thể trồng có dấu hiệu mục nát.[4]
2.2.3.3. Giá thể trồng
Trần liên có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than
củi, xỉ than tổ ong,, sơ dừa, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần
trong suốt mùa sinh trưởng của cây lan
2.3.4. Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử
dụng trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên
Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ
phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích
nuôi cấy như duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây
hoàn chỉnh [5]
Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm
các thành phần chính sau:
2.3.4.1. Nguồn Cacbon
Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro khôngcón khả năng tự dưỡng do
không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi
cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho
môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với
hàm lượng từ 20-30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như

15
fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose,....những loại đường này
chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt.
2.3.4.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng
Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng
có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành
phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai
trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm
thấu và điện thế màng.
- Nguyên tố đa lượng:
Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S [11]
+ Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3 - hoặc NH4+, hầu hết các loại
thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm
hữu cơ.
+ Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có
tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường.
+ Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O
+ Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O
+ Magie : Sử dụng chủ yếu là MgSO4
+ Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4
- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni... các nguyên
tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng
đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô,
tế bào nuôi cấy.
2.3.4.3. Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau.
Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết,
nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các

16
vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin
(vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol.
Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong
nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy.
- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường
nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid.
- Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản
ứng trao đổi chất.
- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp.
- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào,
tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon.
2.3.4.4. Các chất hữu cơ tự nhiên
- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid,
đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin.
- Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid.
- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B.
- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh…
2.3.4.5. Các thành phần khác
- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu
cơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn...
Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh
dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy.
- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức
chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống
oxy hoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic.

17
2.3.4.6. pH của môi trường
Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh
dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều
chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có
thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ.
2.3.4.7. Các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi
trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực
vật. Hiệu quả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính
của chất điều hoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy.
Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2
nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong
nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường
được sử dụng.
- Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con
trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau
đó, nhiều nhà khoa họv đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất
này. Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy
mầm, trong phấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và
phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính
hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây
ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách).
Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân
chia của tế bào trụ bì – nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài ra,
auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm
chậm sự rụng lá.

18
Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân
tạo), IAA (các auxin tự nhiên). Hoạt tính bcuat các chất này được xếp theo thứu
tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt
độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong
môi trường nuôi cấy môi, NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy
nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế
bào và hình thành callus.
- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX,
chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách
từ nội nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu,
dương xỉ, cây lá kim. Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi
khuẩn. Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân
sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất.
Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô.
Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi.
Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh. Quá trình
sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra
cytokinin còn làm chậm sự già hoá.[7]
Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng
phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp
có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt),
ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea....[7]
- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các
nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp
trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin
có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài

19
lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi
nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [7].
2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài trên thế giới và trong nước
2.4.1. Trên thế giới
Thông thường Paphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt
hay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp
này cho hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thị trường.
Vì vậy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng
lớn cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để bảo vệ
lan Hài thoát khỏi nguy cơ tuyệt chủng.
Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thực hiện bởi
Bubeck năm 1973. Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan
Hài bằng nhiều phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây.
Một số nghiên cứu đã thành công:
Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo,
đôi khi có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên,
các mô sẹo rất khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ
chết. Vì lý do này, hầu hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô Paphiopedilum đều
sử dụng nguồn vật liệu ban đầu từ hạt.[29]
Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con [24]và
phương pháp này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứu năm
1983.[28]
Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài cây in vitro, sau đó cảm
ứng tạo chồi từ chồi nách của cây in vitro được nuôi cấy kéo dài.
Năm 2000, Lin và cs đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của
hạt một loài lan Hài lai và đã thu được một vài cây con trong ống nghiệm.[23]

20
Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hài lai giữa P.
philippinese và P. susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM.[20]
Năm 2002 và 2004, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm
ứng tạo chồi từ thân và lá của lan Hài P. philippinese khi nuôi cấy trên môi
trường MS có bổ sung 2,4D 4,52mM và TDZ 4,5mM.[16][17]
Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công phương pháp nhân
nhanh giống lan Hài P. delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảy mầm in
vitro. Từ cây con in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn
gốc từ hạt, được nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ
cao, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua
bước hình thành PLB. Một phần mô sẹo có thể tái sinh được 3-7 chồi trong 3
tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong 3 năm mà không
mất đi khả năng tái sinh [32]. Ngoài ra, Dương Tấn Nhựt còn nghiên cứu thành
công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống lan P. delenatii là
phương pháp gây vết thương trên phần gốc thân của cây con in vitro. Phần gốc
sau khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm TDZ, NAA, 2,4D sẽ hình
thành mô sẹo và một số ít xuất hiện protocorm.
Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống thành
công lan Hài Hồng qua các chồi tái sinh từ các đoạn thân của cây non được
nuôi cấy kéo dài in vitro khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5
mg/l, BA 2 mg/l, NAA 0,5 mg/l, than hoạt tính 1 g/l, đường 30 g/l, agar 9 g/l.
[25]Khi nuôi cấy trong bóng tối sẽ thu được chồi dài, màu vàng, yếu, còn khi
nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ có cường độ thấp sẽ thu được chồi có sự giãn cách
giữa các lá dọc trên thân cây.
Năm 2008, Hong và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây
con giống P. alma Gavaert khi nuôi cấy trên môi trường MS có Kinetin
4,65mM[18]

21
Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây
con hoàn chỉnh từ nụ hoa của P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên, cần rất nhiều
thời gian để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn
các phương pháp khác.[22]
Người ta cũng tiến hành phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những
dòng mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm và nuôi cấy mô sẹo từ những loại mô
khác của Paphiopedilum.
2.4.2. Trong nước
* Về nghiên cứu kỹ thuật trồng và nhân giống lan Hài
Lan Hài đỏ (Hài hồng - P.delenatii) của Phân Viện Sinh học Đà Lạt được
nhân giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật.
Sau nhiều lần thử nghiệm nhân giống, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân
viện sinh học Đà Lạt đã áp dụng phương pháp mới trong nhân giống hoa lan Hài
đỏ. Các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử ánh sáng trắng của đèn
huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy
trên môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác. Kết quả cho
thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ sung 2,0mg/l BA, còn trên
môi trường có bổ sung 1,5mg Zeotin hoặc 1,5mgTDZ thì cho chất lượng chồi tốt
nhất. Khi dùnhg phương pháp này, khả năng tạo chồi rất nhanh,,mặt khác cũng
tìm được điều kiện sinh thái cho lan Hài nở hoa. Qua đây, người ta cũng chứng
minh rằng lan Hài đỏ cũng có thể sản xuất vô tính.
Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007), đã nhân giống được loài lan
Hài đỏ- một loài Lan đặc hữu của Việt Nam (Paphiopedilum delenatii) bằng
kỹ thuật gây vết thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt
để tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên
môi trường Knudson C kết hợp với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi
trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường

22
MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ. Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng
cách sử dụng ánh sang trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED,
được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất
diều tiết sinh trưởng khác nhau. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%)
khi môi trường có bổ xung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg
Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất.[25]
Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2017) đã thành công trong nhân nhanh cây lan
Hài gấm (P. concolor) từ phôi trên môi trường MS cải tiến có bổ sung BA 2mg/l
và TDZ 1,0mg/l. Cho hệ số nhân chồi đạt 2,9 lần.
Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài giáp
P. malipoense trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và NAA 0,3mg/l cho hệ
số nhân chồi 3,28 lần.
Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài Xuân
Cảnh Paphiopedilum Canhii) trong môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ
2mg/l + Kinetine 1mg/l + TDZ 1mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,93 lần.

23
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Loài Hài Trần Liên (Paphiopedilum
tranlienianum) khỏe mạnh, sạch bệnh lưu giữ tại nhà lưới khoa CNSH - CNTP,
Trường Đại Học Nông Lâm.
- Vật liệu nghiên cứu:
+ Phôi lan Hài Trần Liên 8 tháng tuổi sau khi thụ phấn tại Khoa CNSH
– CNTP.
+ Một số chất kích thích sinh trưởng
Hình 3.1. Quả lan Hài Trần Liên
3.1.2. Hoá chất sử dụng
- Hoá chất khử trùng: cồn 70°, Ôxy già (H2O2).
- Môi trường MS, B5, WPM, đường sacharose, agar,...
- Một số chất kích thích sinh trưởng ở thực vật thuộc nhóm
auxin(NAA,...), nhóm cytokinin (BA,.Kinitine, TDZ)..

24
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Thiết bị Dụng cụ
Cân phân tích Pank cấy
Máy khuấy từ Dao kéo
Máy đo PH Đèn cồn
Lò vi sóng Cốc đong, ống đong
Nồi hấp vô trùng Bình tam giác
Tủ sấy Đĩa (hạt đậu, peptri)
Hệ thống giàn đèn Chun nịt
Box cấy vô trùng Giấy thấm
Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí
nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu
+ Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu quả trong dung dịch
H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.
+ Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh phôi cây
Hài Trần Liên từ quả
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả
năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ cây Hài Trần Liên
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Hài Trần Liên
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa CNSH
– CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm.

25
3.2.3. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 12/2019 – tháng 7/2020
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2
đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái
sinh phôi Hài Trần liên từ quả
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine đến khả năng nhân nhanh
của lan Hài Trần liên
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh
chồi của cây lan hài Trần liên
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetine đến khả
năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Trần liên.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA,Kinetine, TDZ đến khả năng
nhân nhanh của chồi lan Hài Trần Liên.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính (THT) đến
khả năng ra rễ của cây lan Trần Liên.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây lan hài
Trần Liên
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả
năng ra rễ của cây lan hài Trần Liên.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát
triển của lan Hài Trần Liên giai đoạn vườn ươm.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro
- Sử dụng môi trường MS, B5, WPM bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l,
nước dừa 150ml/l, Inositol 100mg/l, pH: 5,6-5,8.

26
- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi
cấy có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm.
- Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 121o
C, áp suất 1,0 atm trong 20 phút
- Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt
độ phòng từ 22o
C – 25o
C, độ ẩm: 60 – 65% quang chu kì 14h sáng 10h tối.
Tiến hành theo dõi mẫu.
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên
Quả
Khử trùng (cồn 70º,xà phòng,H2O2)
Nhân nhanh chồi
Tái sinh phôi
Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
Vườn ươm

27
3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong
dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.
Các bước tiến hành vô trùng mẫu như sau:
- Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Mẫu lấy là quả của cây lan Hài Trần liên đem
rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ hết phần đất bẩn, dùng xà phòng để rửa, sau
đó tráng lại bằng nước cất.
- Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng sơ bộ bằng
cồn 70° trong 30 giây, tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó khử
trùng tiếp bằng dung dịch H2O2 để tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Sau đó tráng lại
bằng nước. Đặt mẫu lên giấy thấm và để khô tự nhiên trong box. Sau đó dùng
pank, dao, kéo cắt bỏ phần mẫu ngấm hoá chất trên mẫu và cấy vào môi trường
nuôi cấy.Tiến hành theo dõi mẫu.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng cuả nồng độ, thời gian của chất khử
trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây lan Hài Trần liên
Các công thức được bố trí như sau:
Hóa chất Công thức Thời gian (phút)
CT1 (Đ/C) 0
H2O2 1%
CT2 10
CT3 15
CT4 20
H2O22%
CT5 10
CT6 15
CT7 20
H2O2 3 %
CT8 10
CT9 15
CT10 20

28
3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại môi trường dinh dưỡng
đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường nuôi
cấy đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên
- Mẫu sau khi khử trùng, được cấy sang các môi trường nuôi cấy khác
nhau Các môi trường nuôi cấy được bổ sung thêm Đường 30g/L + Agar 5,5g/L
+ Nước dừa 150 ml/L + Inositol 100mg/l, để nghiên cứu ảnh hưởng của một số
môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên.
Công thức thí nghiệm được bố trí như sau:
CT Môi trường Chất bổ sung
1 Muashige & Skoog (MS) Đường 30g/L + Agar 5,5g/L +
Nước dừa 150 ml/L + Inositol,
pH 5,6 – 5,8.
2 Woody Plant Medium (WPM)
3 Gamborg’s (B5)
- Mẫu có kích thước tương đồng sau khi khử trùng được đưa vào môi
trường tái sinh, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến
hành theo dõi, quan sát phôi tái sinh và chất lượng phôi tái sinh.
3.4.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokinine đến khả
năng nhân nhanh chồi lan Hài Trần Liên
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng
nhân nhanh chồi của cây lan hài Trần Liên
- Phôi tái sinh được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi
trường nền (Môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng,
vitamin là thành phần của môi trường MS bổ sung: Đường 30 g/l + Nước dừa
150 ml/l + Agar 5,5 g/l + Inositol 100mg/l, pH 5,6 – 5,8.), có bổ sung chất kích
thích sinh trưởng (BA) để theo dõi khả năng nhân phôi của mẫu.
- Theo dõi, quan sát số chồi chất lượng chồi
Thí nghiệm được bố trí như sau:

29
CT 1(Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l
CT 2: MT nền + BA 1,0 mg/l
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với kinitine đến khả
năng nhân nhanh chồi lan Hài Trần Liên từ phôi
- Các phôi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy
chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A(nồng độ BA
thích hợp nhất ở thí nghiệm 3) + kinetine ở các nồng độ khác nhau để theo dõi
khả năng nhân chồi.
CT 1 (Đ/c): MT nền +A+ 0,0 mg/l Kinetine
CT 2: MT nền + A + 0,3 mg/l Kinetine
CT 5: MT nền + A +2,0 mg/l Kinetine
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ
đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Hài Trần Liên.
Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển
sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A + B (nồng độ Kinetin thích
hợp nhất cho nhân nhanh chồi đã xác định ở thí nghiệm 4) + TDZ ở các nồng độ
khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.
CT 1 (Đ/c): MT nền + A + B + TDZ 0,0 mg/l
CT 2: MT nền + A + B + TDZ 0,5 mg/l

30
3.4.3.4.. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt
tính đến khả năng ra rễ của cây lan Hài Trần Liên
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây
lan Hài Trần Liên
- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá, cây cao 2-3 cm thì cấy chuyển sang môi
trường ra rễ gồm: MT nền có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau để theo
dõi khả năng tạo rễ của mẫu.
- Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ.
CT 1 (Đ/c): MT nền +0,0 NAA mg/l
CT 2: MT nền +0,5 NAA mg/l
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính
đến khả năng ra rễ của cây lan Hài Trần Liên
- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm:
MT nền + B (nồng độ NAAthích hợp nhất cho ra rễ đã được xác định ở thí nghiệm
7) + THT ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng ra rễ của mẫu.
CT 1 (Đ/c): MT nền + B + THT 0,0 g/l
CT 2: MT nền + B + THT 0,5 g/l
CT 4: MT nền + B + THT 1,5 g /l

31
3.4.3.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh
trưởng và phát triển của lan Hài Trần Liên
Công thức thí nghiệm được bố trí như sau:
Công Thức(CT) Giá thể
CT1 Đất
CT2 Than
CT3 Sơ dừa
CT4 Dớn
CT5 Vỏ thông
3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ
sinh học thực vật (Khoa CNSH - CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ±
2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 14h sáng, 10h tối cường độ chiếu sáng
2000 – 2500 lux.
- Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn
toàn với 3 lần lặp lại, mỗi lần cấy trong 30 bình thủy tinh thể tích 250ml, 500
ml) có chứa 70 ml môi trường, mỗi bình cấy 1 mẫu.). Điều chỉnh giá trị pH =
5,6 – 5,8 và bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng trước khi hấp khử trùng ở
121o
C, trong 15 - 20 phút.
3.5. Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá
3.5.1. Thu thập số liệu
- Đếm số mẫu không nhiễm, mẫu sống nhiễm, mẫu chết.
- Đếm số chồi: đếm tổng số phôi và nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban đầu.
- Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ.
3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi
- Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu

32
+ Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm:
Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu)
Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100%
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
+ Tỷ lệ mẫu sống nhiễm:
Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu)
Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100%
+Tỷ lệ mẫu chết:
Tổng số mẫu chết (mẫu)
Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100%
- Chỉ tiêu theo dõi phôi:
Tổng số mẫu nảy phôi (mẫu)
Tỷ lệ tái sinh phôi (%) = × 100%
Tổng chồi thu được
Hệ số nhân chồi = × 100%
Tổng chồi nuôi cấy
Chất lượng chồi:
+ Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh
+ Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt
+ Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng
- Chỉ tiêu theo dõi ra rễ:
Tổng số chồi ra rễ (chồi)
Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100%
Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu)

33
Chất lượng rễ,màu sắc
+ Rễ tốt: Rễ khỏe, dài,có màu trắng,nhiều lông hút.
+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn.có màu trắng hơi vàng
+ Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ.vàng hoặc màu đen.

34
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử
trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, vô trùng mẫu cấy là giai đoạn khởi đầu
và quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy. Để có được vật liệu khởi
đầu sạch nấm và vi khuẩn, việc lựa chọn chất khử trùng, nồng độ, thời gian rất
quan trọng. Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu khả năng tạo mô sạch trong
nuôi cấy in vitro trên đối tượng Phong lan nói chung và lan Hài nói riêng, chúng
tôi nhận thấy có nhiều nhất chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn mạnh
như Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2), hydroxid
(H2O2),....Tuy nhiên HgCl2 được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng bởi chúng có
hoạt tính khử trùng tốt, cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao,nhưng lại gây ô
nhiễm môi trường, độc hại, dễ gây bệnh hiểm nghèo cho con người nên không
sử dụng. Hydroxid (H2O2) có hiệu quả khử trùng kém hơn nhưng lại không gây
hại cho môi trường và con người nên được chọn sử dụng cho các nghiên cứu
lien quan trong thí nghiệm
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử
trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy)
Công thức
Nồng độ
(%)
Thời
gian
(phút)
Số
mẫu
đưa
vào
(mẫu)
Chỉ tiêu đánh giá
Tỷ lệ mẫu
sống
không
nhiễm
(%)
Tỷ lệ
mẫu
sống
nhiễm
(%)
Tỷ lệ
mẫu
chết
(%)
CT1(Đ/c)
Nước cất
vô trùng
15 30 0,00 100 0,00
CT2
H2O2 1%
10 30 15,33 73,44 11,23
CT3 15 30 27,67 35,55 36,78

35
Công thức
Nồng độ
(%)
Thời
gian
(phút)
Số
mẫu
đưa
vào
(mẫu)
Chỉ tiêu đánh giá
Tỷ lệ mẫu
sống
không
nhiễm
(%)
Tỷ lệ
mẫu
sống
nhiễm
(%)
Tỷ lệ
mẫu
chết
(%)
CT4 20 30 41,00 38,89 20,11
CT5
H2O2 2%
10 30 52,22 36,14 11,64
CT6 15 30 58,55 24,12 19,33
CT7 20 30 46,33 9,22 40,45
CT8
H2O2 3%
10 30 59,96 1,25 28,79
CT9 15 30 65,55 17,24 17,21
CT10 20 30 31,45 2,56 65,99
LSD05 5,8
CV (%) 7,9
Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy:
Khi khử trùng mẫu ở nồng độ H2O2 1% trong 15 phút cho thấy tỷ lệ mẫu
sông không nhiễm đạt ở mức cao nhất là 65,55%, tỷ lệ mẫu chết ở mức 17,21%.
0
15.33
27.67
41
52.22
58.55
46.33
59.96
65.55
31.45
0
10
20
30
40
50
60
70
CT1(Đ/c) CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10
tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)

36
Ở nồng độ H2O2 2% thì mẫu được khử trùng trong 20phút cho ra tỷ lệ mẫu
sống không nhiễm đạt ở mức cao nhất là 46,33%, tỷ lệ mẫu chết ở mức là
40,45%.Trong 20 phút khử trùng mẫu bằng 1% H2O2 cho ra tỷ lệ mẫu sống
không nhiễm đạt ở mức cao nhất lầ 41,00% và tỷ lệ mẫu chết ở mức 20,11%.
Kết quả thí nghiệm cho thấy dung dịch H2O2 ở nồng độ thấp nhất 1% ít ảnh
hưởng đến mẫu, tỷ lệ mẫu chết cao nhất ở mức 20,11% nhưng hiệu quả khử
trùng thấp. Khi nồng độ H2O2 tăng lên 2% thì hiệu quả của khử trùng khá cao
đạt mức 65,55% khử trùng trong 15 phút nhưng khi tăng lên theo thời gian khử
trùng lên 20 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm mạnh xuống 43,33% và
tỷ lệ mẫu chết khá cao 40,45%. Cho thấy nếu nồng độ và thời gian không phù
hợp thì sẽ không đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất. Như vậy, nồng độ H2O2 3%
và thời gian khử trùng 15 phút là phù hợp và tốt nhất trong thí nghiệm cho tỷ
lệ mẫu sống không nhiễm đạt 65,55% và tỷ lệ mẫu chết ở mức tương đối thấp
17,21%.
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh
phôi lan Hài Trần Liên
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả
năng tái sinh phôi lan
Công thức
Môi
trường
Tổng mẫu
nuôi cấy
(mẫu )
Tổng mẫu
tái sinh
phôi
(mẫu)
Tỷ lệ tái
sinh (%)
Chất
lượng
phôi
CT1 MS 30 20 66,67
Xanh đậm,
mập
CT2 WPM 30 14 46,67
Xanh nhạt,
mập
CT3 B5 30 8 26,67
Xanh nhạt,
gầy
LSD.05 6,8
CV 6,5

37
Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%)
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy :
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy: giá trị CV (%): 6, % và LSD.05 đạt 6,5%; các
công thức đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy là 95%.
Ở CT1 (MS) cho tỷ lệ phôi tái sinh cao nhất 66,67 %, thu được phôi có
màu xanh, mập. Tiếp theo CT2 (WPR) tỷ lệ tái sinh phôi là 47,67 % phôi thu
được màu xanh nhạt, mập. CT3 cho tỷ lệ tái sinh phôi thấp nhất 26,67%.. phôi
thu được màu xanh nhạt, gầy.
Kết quả thí nghiệm cho thấy phôi lan có thể tái sinh tốt trên nền môi
trường giàu dinh dưỡng.. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường MS
làm môi trường cơ bản cho quá trình nghiên cứu sau của cây lan .
66.67
46.67
26.67
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CT1 CT2 CT3
Tỷ lệ tái sinh (%)
Tỷ lệ tái sinh (%)

38
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến
khả năng nhân nhanh cây lan Hài Trần Liên
4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân
nhanh chồi của cây lan Hài Trần Liên
BA (6-Benzylaminopurine) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật
thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy
mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ
các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ.
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng
nhân nhanh phôi Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy)
CT
Nồng độ BA
(mg/l)
Tổng
mẫu cấy
(mẫu)
Tổng số
chồi tạo
thành
(chồi)
Hệ số nhân
chồi
(lần)
Chất lượng chồi
1 0 30 5 0,17
Trắng vàng,
nhỏ, yếu
2 1 30 21 0,7
Trắng vàng,
nhỏ, yếu
3 2 30 30 1,8 Xanh, mập, khỏe
4 3 30 47 1,56
Xanh nhạt,
khỏe, mập
5 5 30 20 0,68
Trắng vàng,
nhỏ, yếu
LSD05 0,12
CV(%) 8,7

39
Biểu đồ 4.3. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy:
Giá trị CV (%): 8,7% và LSD05 đạt 0,12 % thì các công thức thí nghiệm đều
có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều này cho thấy BA có sự ảnh
hưởng tích cực tới khả năng nhanh nhanh chồi lan Hài Trần liên.
Từ CT2 đến CT5 tương ứng với bổ sung BA ở các nồng độ từ 1,0-5,0 mg/l,
sau 40 ngày nuôi cấy thì tổng số chồi thu được nhiều hơn so với công thức đối chứng
(CT1). Khi sử dụng BA ở nồng độ 3,0 mg/l (CT4) cho tổng chồi thu được cao nhất
(47chồi) với hệ số nhân chồi là 1,56 lần. Ỏ CT2 (nồng độ BA 1,0 mg/l) thu được (21
chồi) cho hình thái chồi tốt (chồi xanh đậm và mập). CT2 và CT4 cho tỷ lệ tái sinh
chồi cao nhất chồi xanh đậm và mập. Khi tăng dần nồng độ BA trong môi trường (0
– 2,0 mg/l) thì tỷ lệ chồi tái sinh tăng đáng kể. Nồng độ BA 4,0 mg/l đối với cây lan
Hài P. Trần liên cho tổng chồi thu được cao nhất đạt 47 chồi. Khi tăng nồng độ BA
lên, tỷ lệ tái sinh có xu hướng giảm dần, điều này có thể giải thích là nồng độ BA
thích hợp kích thích cây sinh trưởng, tuy nhiên khi nồng độ BA tăng cao vượt quá
ngưỡng cần thiết có thể gây ức chế khả năng tạo chồi.
0.17
0.7
1.8
1.56
0.68
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
1 2 3 4 5
hệ số nhân chồi ( lần)

40
4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin
đến khả năng nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên
Cũng như BA, Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích
sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong
nuôi cấy mô- tế bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ
mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi
phụ. Do vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung kinetin
vào môi trường nuôi đến khả năng nhân nhanh cây lan Hài Trần liên. Kết quả
thí nghiệm sau 12 tuần theo dõi được trình bày trong bảng 4.4
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với
Kinetin đến khả năng nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên
(sau 6 tuần nuôi cấy).
Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích sinh trưởng thực
vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy mô- tế
bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ
các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [3].
Công
thức
Nồng
độ BA
(mg/l)
Nồng độ
Kinetin
(mg/l)
Tổng phôi
nuôi cấy
(phôi)
Tổng
chồi thu
được
Hệ số
nhân chồi
(lần)
Chất lượng
chồi
CT1
2
0,0 30 21 0,7
Nhỏ,yếu,
trắng
CT2 0,5 30 46 1,53
Mập, xanh
nhạt,
CT3 1,0 30 65 2,17
Xanh khỏe,
mập
CT4 1,5 30 57 1,9
Xanh nhạt
khỏe, mập
CT5 2 30 50 0,89
Nhỏ yếu
trắng vàng ,
LSD05 0,16
CV(%) 5,8

41
kết hợp với Kinetin
Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,16, cặp CT2 và CT4 có sự sai
khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức khác có sự sai khác có
ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.
Khi bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin từ 0-2mg/l vào môi trường nuôi cấy ta thấy
có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi lan . Khi tăng nồng độ Kinetin từ 0-1
mg/l hệ số nhân chồi có xu hướng tăng, cụ thể là hệ số nhân chồi tăng từ 0,7 (CT1)
đến 2,17(CT3). Trong thí nghiệm này nồng độ Kinetin 1,0 mg/l cho tổng số chồi thu
được là 65 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,17 lần. Nồng độ Kinetin từ 1,5 – 2,0 mg/l
thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm dần với CT4, CT5 lần lượt là 57 chồi, 50
chồi tương ứng vợi hệ số nhân là 1,9 ; 0,89 lần.
Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mức tốt. Với CT
đối chứng (Kinetin 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được kém. Khi tăng dần nồng
độ Kinetin từ 0,5- 1,0 mg/l thì chất lượng chồi cải thiện từ kém lên tốt, trong thí
nghiệm này CT bổ sung Kinetin từ 1-1,5 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất. Tăng
0.7
1.53
2.17
1.9
0.89
0
0.5
1
1.5
2
2.5
CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
hệ số nhân chồi (lần)
hệ số nhân (lần)

42
nồng độ Kinetin từ 1,5-2 mg/l thì chất lượng chồi thấp xuống, chồi thu được chất
lượng trung bình.
Vì vậy ở thí nghiệm này để nhân nhanh chồi lan cần bổ sung 2mg/l BA +
1mg/l Kinetin.
4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả năng
nhân nhanh giống cây
Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và
TDZ đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy)
Công
thức
Nồng độ
BA(mg/l)
Nồng độ
Kinetin
(mg/l)
Nồng độ
TDZ
(mg/l)
Số mẫu
nuôi cấy
(mẫu)
Tổng số
chồi thu
được
(chồi)
Hệ số
nhân
chồi
(lần)
Chât lượng
chồi
CT 1
2,0 1,0
0,0 30 56 1,87
Xanh
nhạt,mập,
khỏe
CT 2 0,5 30 62 2,06 Xanh đậm,gầy
CT 3 1,0 30 85 2,83
Xanh,khỏe,
mập
CT 4 1,5 30 74 2,46
Xanh,khỏe,
mập
CT 5 2,0 30 65 2,16
Xanh nhạt
khỏe, mập
LSD05 0,14
CV (%) 4,4

43
kết hợp với Kinetin và TDZ
Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,14, cặp CT2 và CT5 có sự sai
khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức khác có sự sai khác có
ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.
Khi bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin 1,0 mg/l và TDZ từ 0,0-2,0 mg/l vào môi
trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng nhân chồi cây lan hài Trần Liên. Các
công thức có bổ sung TDZ đều cho hệ số nhân chồi cao hơn công thức đối chứng
không bổ sung TDZ (công thức đối chứng có hệ số nhân chồi đạt 1,87 lần). Khi tăng
nồng độ TDZ từ 0,0-1,0 mg/l tổng số chồi thu được và hệ số nhân chồi có xu hướng
tăng lên, cụ thể ở công thức đối chứng TDZ nồng độ 0,0 mg/l cho tổng số chồi thu
được là 56 chồi và hệ số nhân là 1,87 lần., Nồng độ TDZ 1,0 mg/l cho tổng số chồi
thu được là 85 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,83 lần. Nồng độ TDZ từ 1,5- 2,0
mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm dần với CT4, CT5 lần lượt là 74
chồi, 65 chồi chồi tương ứng với hệ số nhân là 2,46 ; 2,16 lần.
1.87
2.06
2.83
2.46
2.16
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5
Hệ số nhân chồi(lân)

44
Với CT đối chứng (TDZ 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được xanh nhạt,
mập khỏe. Khi tăng dần nồng độ TDZ từ 0,5-1,0 mg/l thì chất lượng chồi cũng cải
thiện từ chồi xanh nhạt, mập, khỏe lên chồi xanh khỏe mập, trog khuôn khổ thí
nghiệm này, CT bổ sung TDZ từ 1-1,5 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất. Tăng
nồng độ TDZ từ 1,5-2,0 mg/l thì chất lượng chồi thấp xuống, chồi thu được
nhỏ,yếu, trắng vàng.
Như vậy TDZ là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích tế bào
phân chia hình thành chồi mới. Ở công thức đối chứng không có TDZ trong môi
trường nuôi cấy nên khả năng tạo chồi thấp hơn các công thức bổ sung TDZ. Ở
CT2 với nồng độ TDZ 0,5 mg/l có tác dụng kích thích phát triển chồi mới nhưng
do nồng độ TDZ thấp nên mẫu ít chịu tác động kích thích phân chia tế bào của
chất này. Ở CT 3 cho hệ số nhân chồi cao nhất là do TDZ 1,0 mg/l kích thích mẫu
sinh trưởng và phát triển tốt nhất, đồng thời tế bào phân chia mạnh mẽ nhất. Khi
nồng độ TDZ tăng dần từ 1,5 – 2,0 mg/l ứng với CT4, CT5 có sự hình thành của
nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc bị biến dạng, nồng
độ TDZ càng cao thì hệ số nhân chồi càng giảm dần.
4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả
năng ra rễ cây lan
4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của
cây lan
Ra rễ là khâu cuối cùng của qúa trình nuôi cấy in vitro. Chất kích thích sinh
trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này thuộc nhóm auxin. Trong đó, IBA và NAA
là những chất kích thích đượng dùng phổ biến trong nuôi cấy mô nhằm thúc đẩy quá
trình phân bào và kích thích sự hình thành rễ.

45
Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng
ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy)
Công thức
Nồng độ
NAA
(mg/l)
Số mẫu
nuôi cấy
(mẫu)
Số mẫu
ra rễ
(mẫu)
Tỷ lệ mẫu
ra rễ (%)
Chất lượng rễ
CT1(Đ/c) 0,0 30 3 10 Ngắn nhỏ
CT 2 0,5 30 22 73,33 Ngắn, mập
CT 3 1,0 30 18 60 Ngắn, nhỏ
CT 4 1,5 30 12 40 Ngắn, nhỏ
CT 5 2,0 30 7 23,33 Ngắn, nhỏ
LSD05 6,5
CV(%) 8,7
Biểu đồ 4.6. Tỷ lệ mẫu ra rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA
10
73.33
60
40
23.33
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CT1(Đ/c) CT 2 CT 3 CT 4 CT 5
Tỷ lệ mãu ra rễ (%)

46
Với giá trị LSD.05 đạt 6,5 các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức
độ tin cậy 95%. Tỷ lệ mẫu ra rễ cao nhất đạt được ở CT 2 là 73,33%, chất lượng
rễ thu được ngắn, mập. Tiếp theo là CT3 đạt 60%, CT4 đạt 40%, CT5 đạt
23,33%, rễ thu được ngắn, nhỏ. Kết quả trên được giả thích như sau: NAA có
dụng kích thích chồi tạo rễ. Ở CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung NAA nên
số mẫu tạỏ ra thấp và ít rễ. Nồng độ NAA 0,5 mg/l (CT2) cho nhiều cây ra rễ
và có số rễ lớn nhất là do NAA ở nồng độ này có tác dụng kích thích chồi lan
ra rễ mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt
nhất. Ở CT3, CT4, CT5, nồng độ NAA lần lượt là 1,0 mg/l, 1,5 mg/l, 2,0 mg/l
cho thấy tỷ lệ ra rễ và số rễ giảm dần, bởi vì NAA ở nồng độ cao gây ức chế
chồi phát triển, chồi yếu nên số lượng rễ hình thành cũng giảm, rễ sinh ra dài
và nhỏ.
4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả
năng ra rễ của cây lan hài Trần liên
Than hoạt tính là một hợp chất vô cơ thường được sử dụng trong giai
đoạn ra rễ trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. THT có vai trò là tạo điều kiện
tối cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng
thực vật. Ngoài ra, THT còn có khả năng làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thể ở
một số loài thực vật. Để số mẫu nuôi cấy có thể ra nhiều rễ với chất lượng rễ
tốt, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng nồng độ NAA 0,4 mg/l thích hợp
nhất cho quá trình ra rễ kết hợp với THT ở các hàm lượng khác nhau để thử
nghiệm khả năng ra rễ của cây lan .

47
Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt
tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuổi nuôi cấy)
Công
thức
Nồng độ
NAA
(mg/l)
Nồng độ
THT (g/l)
Số mẫu
nuôi cấy
(mẫu)
Tổng số
chồi ra rễ
(chồi)
Tỷ lệ mẫu
ra rễ (%)
Chất lượng
rễ
CT 1
0,5
0,0 30 20 73,33 Ngắn, mập
CT 2 0,5 30 24 80 Ngắn mập
CT 3 1,0 30 27 90 Dài mập
CT 4 1,5 30 26 86,67 Dài nhỏ
CT 5 2,0 30 23 78 Dài nhỏ
LSD05 5,5
CV (%) 6,2
Biểu đồ 4.7. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA
kết hợp với than hoạt tính
Ở chỉ tiêu số lượng rễ: Với giá trị LSD05 đạt 5,5% các công thức thí
nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Số lượng rễ thấp nhất
ở công thức đối chứng với 20 rễ, số lượng rễ cao nhất khi bổ sung THT 1,0 g/l
(CT3) với 27 rễ. Khi tăng dần hàm lượng THT thì đồng thời số lượng rễ giảm
73.33
80
90
86.67
78
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5
Tỷ lệ mẫu ra rễ (%)

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

Similar to Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro