Download luận văn thạc sĩ ngành hóa phân tích với đề tài: Cải biến phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP – HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát quá trình xà phòng hoá lutein ester Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Lê Mỹ Kim Vương
CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG
KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER
LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC
Nha Trang - 2019

3. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Lê Mỹ Kim Vương
CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG
KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER
Chuyên ngành : Hoá phân tích
Mã số : 8440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Người hướng dẫn 1 Người hướng dẫn 2
TS. Hoàng Thị Huệ An TS. Trần Thị Phương Anh
Nha Trang - 2019

4. Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Cải biến phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP – HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát
quá trình xà phòng hoá lutein ester” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi
và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới
thời điểm này.
Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019
Tác giả luận văn
Lê Mỹ Kim Vương

5. Lời cảm ơn
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa
học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè trong lớp.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hoàng Thị Huệ An
và TS. Trần Thị Phương Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công
nghệ, Khoa Hoá học và Phòng Đào tạo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ
tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.
Tôi chân thành cảm ơn các thầy cô ở Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa
học, đồng thời giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các thầy cô tại Trung tâm
Thí nghiệm Thực hành Trường Đại học Nha Trang đã hỗ trợ trang thiết bị
thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn.
Đề tài này được thực hiện trong khuôn khổ dự án “Hoàn thiện quy trình
công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn
thọ”, mã số CNHD.DASXTN.026/17-18 thuộc Chương trình nghiên cứu
KHCN trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm
2020. Xin trân trọng cảm ơn Bộ Công Thương và Phòng Thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ lọc, hóa dầu đã cấp kinh phí thực hiện dự án này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân
và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn.
Trân trọng!
Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019
Tác giả luận văn
Lê Mỹ Kim Vương

6. Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
ANOVA analysis of variance Phân tích phương sai
AOAC Assosiation of Official
Analytical Chemists
Hiệp hội các nhà hóa
phân tích chính thức.
ASTM American Society for Testing
of Materials
Hiệp hội phép thử Mỹ.
DAD Diod array detector Detector mảng diod.
DMF Dimethyle formamide
DNA Acid Deoxyribonucleic ADN
EU Europe Union Liên minh châu Âu
FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm
và dược phẩm
GC-MS Gas chromatography mass
spectrometry
Sắc ký khí Khối phổ
HPLC High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng
cao.
ICH International Conference on
Harmonization
Hội đồng hòa hợp quốc
tế.
JECFA The Joint FAO/WHO Expert
Committee on Food)
Hội đồng các chuyên gia
FAO/WHO về phụ gia
thực phẩm
LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện.

7. LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng.
MTBE Methyle tert-butyle ether
R2
Correlation coefficient Hệ số tương quan
RT Retention Time Thời gian lưu
SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn
S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu.
THF Tetrahydrofurane
UV – Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến.
v/v Volume/volume Thể tích/thể tích.
v/w Volume/weight Thể tích/khối lượng.
w/w Weight/weight Khối lượng/khối lượng.
lmax Wavelength of maximum
absorption
Bước sóng hấp thụ cực
đại.

8. Danh mục các bảng
Bảng 1.1.Dữ kiện hấp thụ UV-Vis của lutein và zeaxanthin………………. 12
Bảng 2.1.Các thành phần pha động thử nghiệm ở chế độ rửa giải isocratic...52
Bảng 3.1.Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thừa số lưu giữ lutein và
lutein ester………………………………………………………………….. 62
Bảng 3.2.Giá trị k’ của lutein và lutein ester khi thử nghiệm rửa giải theo
chương trình gradient dung môi đề nghị…………………………………….66
Bảng 3.3.Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến độ rộng chân peak và số đĩa lý
thuyết của cột tách đối với các cấu tử phân tích……………………………..67
Bảng 3.4.Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến độ rộng chân peak, số đĩa lý
thuyết và chiều cao của đĩa đối với các cấu tử phân tích……………………70
Bảng 3.5.Kết quả xác định hàm lượng carotenoid tổng số và lutein có trong
lutein đối chứng……………………………………………………………...74
Bảng 3.6.Kết quả dựng đường chuẩn lutein (lặp lại 3 lần song song)……... 75
Bảng 3.7.Khảo sát độ lặp lại khi tiêm cùng mẫu chuẩn trong ngày………... 78
Bảng 3.8.Khảo sát độ thu hồi khi thêm mẫu chuẩn ở các nồng độ 12; 15;
18ppm………………………………………………………………………..81
Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin đến hiệu suất xà phòng
hoá…………………………………………………………………………...84
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa lutein
ester……………………………………………………………………. ……86
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa……...........88
Bảng 3.12.Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein
ester………………………………………………………………………….92
Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá trên mẫu lớn.…......96
Bảng 3.14.Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá mẫu thêm chuẩn
………………………………………………………………………...97

9. Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15] ................. 10
Hình 1.2. Một số dạng đồng phân cis thường gặp của lutein [15].................. 11
Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15] .. 11
Hình 1.4. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B [16]............. 17
Hình 1.5. Sơ đồ thiết bị HPLC [16]................................................................ 18
Hình 1.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử A và B [16].................................. 22
Hình 1.7. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai chất .......... 23
Hình 3.1. Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và rửa giải của
lutein và lutein ester........................................................................................ 63
Hình 3.2. Sơ đồ sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải.... 65
Hình 3.3. Sắc ký đồ chế độ rửa giải gradient dung môi ................................. 65
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến một số đại lượng sắc ký.............. 68
Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi tốc độ dòng từ
0,8 đến 1,2 ml/phút......................................................................................... 69
Hình 3.6. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình sắc ký ................. 71
Hình 3.7. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi thể tích bơm
mẫu ................................................................................................................. 72
Hình 3.8. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 40 ppm ................. 75
Hình 3.9. Kết quả HPLC của các mẫu trắng, mẫu chứng thực, mẫu thực và
mẫu thêm ........................................................................................................ 76
Hình 3.10. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 30 ppm ............... 79
Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin không xà phòng hóa (lutein
ester) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml...................................................... 82
Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin sau khi xà phòng hóa (lutein
tự do) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml ..................................................... 82

10. Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu lutein đối chứng cho thấy trans-lutein có RT ~ 0,89
phút ................................................................................................................. 83
Hình 3.14. Phổ hấp thụ UV-Vis ứng với: a) peak trans-lutein (RT ~ 8,9 min);
b) peak cis-lutein (RT ~ 10,3 min).................................................................. 83
Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ oleoresin...................................... 85
Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin
khi thay đổi nồng độ oleoresin từ 0,1 – 0,9 g/ml............................................ 87
Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin
khi cố định nồng độ oleoresin 0,3 g/ml .......................................................... 87
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 88
Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau khi xà phòng
hóa bằng KOH 5% w/v trong EtOH trong 1 h ở các nhiệt độ khác nhau....... 91
Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester92
Hình 3.21. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu xà phòng hoá trong các khoảng thời
gian khác nhau................................................................................................ 95

11. 1
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 6
1. Lý do chọn đề tài......................................................................................... 6
2. Mục đích của đề tài..................................................................................... 8
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 8
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.................................................. 9
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................... 10
1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN.................................................................... 10
1.1.1. Cấu trúc phân tử ................................................................................ 10
1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của lutein............................................... 11
1.1.2.1. Tính chất vật lý............................................................................ 11
1.1.2.2. Tính chất hóa học........................................................................ 13
1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của lutein........................................ 13
1.1.3.1. Hoạt tính sinh học của lutein ...................................................... 13
1.1.3.2. Ứng dụng của lutein.................................................................... 14
1.1.4. Các nguồn lutein quan trọng trong tự nhiên...................................... 16
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC........................................... 16
1.2.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký .................................................... 16
1.2.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị HPLC .......................... 18
1.2.2.1. Bình đựng dung môi pha động .................................................... 18
1.2.2.2. Bộ phận khử khí........................................................................... 19
1.2.2.3. Bơm cao áp.................................................................................. 19
1.2.2.4. Bộ phận tiêm mẫu........................................................................ 19
1.2.2.5. Cột sắc ký .................................................................................... 19
1.2.2.6. Đầu dò......................................................................................... 20

12. 2
1.2.2.7. Bộ phận ghi tín hiệu .................................................................... 21
1.2.2.8. Thiết bị in dữ liệu ........................................................................ 21
1.2.3. Các đại lượng đặc trưng cơ bản trong HPLC .................................... 21
1.2.3.1. Thời gian lưu - Thời gian lưu thực.............................................. 21
1.2.3.2. Hệ số dung lượng ........................................................................ 22
1.2.3.3. Độ chọn lọc ................................................................................. 23
1.2.3.4. Số đĩa lý thuyết ............................................................................ 23
1.2.3.5. Độ phân giải................................................................................ 24
1.2.4. Cách xây dựng một quy trình phân tích HPLC ................................. 25
1.2.4.1. Chọn kiểu sắc ký.......................................................................... 26
1.2.4.2. Chọn cột sắc ký............................................................................ 26
1.2.4.3. Chọn pha động ............................................................................ 27
1.2.4.4. Chọn chế độ rửa giải................................................................... 28
1.2.5. Cách thẩm định một quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC
..................................................................................................................... 28
1.2.5.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký............................................. 29
1.2.5.2. Tính đặc hiệu (Specificity)........................................................... 29
1.2.5.3. Độ đúng (Accuracy) .................................................................... 30
1.2.5.4. Độ chính xác (Precision)............................................................. 30
1.2.5.5. Khoảng nồng độ tuyến tính (Range)............................................ 31
1.2.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD: Detection Limit)................................ 32
1.2.5.7. Độ thô (Robustness) .................................................................... 33
1.2.5.8. Khả năng áp dụng của phương pháp (Scope)............................. 33
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CARATENOID .............................................................................................. 33

13. 3
1.3.1. Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis........... 33
1.3.1.1. Định lượng sản phẩm carotenoid tinh chế.................................. 33
1.3.1.2. Định lượng carotenoid trong các mẫu sinh học.......................... 34
1.3.2. Định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC............................. 34
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI..................... 38
1.4.1. Nghiên cứu quá trình xà phòng hóa lutein ester................................ 38
1.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng lutein bằng phương pháp
HPLC........................................................................................................... 41
1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.............................................. 41
1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước................................................ 45
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 48
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU................................................................. 48
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 48
2.1.2. Hóa chất............................................................................................. 48
2.2. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ........................................................................... 49
2.2.1. Dụng cụ ............................................................................................. 49
2.2.2. Thiết bị............................................................................................... 49
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 50
2.3.1. Cải biến phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp với
lutein ester ................................................................................................... 50
2.3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch khảo sát điều kiện chạy HPLC............. 50
2.3.1.2. Chọn thành phần pha động và chế độ rửa giải........................... 51
2.3.1.3. Chọn tốc độ dòng ........................................................................ 53
2.3.1.4. Chọn thể tích bơm mẫu................................................................ 53
2.3.1.5. Dựng đường chuẩn lutein............................................................ 54

14. 4
2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng lutein.............................................. 56
2.3.2.1. Tính đặc hiệu............................................................................... 56
2.3.2.2. Độ chụm (precision).................................................................... 56
2.3.2.3. Độ tuyến tính của đường chuẩn – Khoảng nồng độ tuyến tính... 57
2.3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [41].. 57
2.3.2.5. Độ đúng....................................................................................... 57
2.3.3. Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định điều kiện thích hợp xà
phòng hóa lutein ester.................................................................................. 58
2.3.3.1. Phương pháp tổng quát xà phòng hóa lutein ester ..................... 58
2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất xà phòng hóa lutein ester....... 58
2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa lutein ester đến
đến hiệu suất xà phòng............................................................................. 59
2.3.3.4. Thử nghiệm quy trình xà phòng hóa lutein ester......................... 60
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 61
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 62
3.1. CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN TRONG
HỖN HỢP CHỨA LUTEIN ESTER ............................................................. 62
3.1.1. Chọn thành phần pha động................................................................ 62
3.1.2. Chọn tốc độ dòng............................................................................... 66
3.1.3. Chọn thể tích bơm mẫu ..................................................................... 70
3.1.4. Kết luận về điều kiện phân tích hỗn hợp lutein và lutein ester ......... 73
3.2. DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN.................. 74
3.2.1. Xác định độ tinh khiết của mẩu lutein đối chứng.............................. 74
3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn lutein ..................................................... 74
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐÃ XÂY
DỰNG ............................................................................................................ 76

15. 5
3.3.1. Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích......................................... 76
3.3.2. Độ lặp lại trong ngày (intra-day injection repeatability)................... 78
3.3.3. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn................................................. 78
3.3.4. Xác định LOD và LOQ ..................................................................... 80
3.3.5. Xác định độ thu hồi ........................................................................... 80
3.3.6. Kết luận về việc thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng.......... 81
3.4. NHẬN BIẾT PEAK LUTEIN VÀ LUTEIN ESTER ............................. 82
3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐÃ THỬ NGHIỆM ĐỂ XÁC
ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER
ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ ....................................... 84
3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ oleoresin..................................................... 84
3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa.............. 85
3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa.......... 88
3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa......... 92
3.5.5. Kết luận về khảo sát điều kiện xà phòng hoá .................................... 96
3.6. THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ.................................. 96
3.6.1. Thử nghiệm trên mẫu lớn .................................................................. 96
3.6.2. Thử nghiệm trên mẫu thêm chuẩn..................................................... 97
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................... 98
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 98
4.2. KIẾN NGHỊ............................................................................................. 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 100

16. 6
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Lutein là một sắc tố carotenoid có màu vàng cam, là dẫn xuất 3,3’-diol
của b,e-caroten. Lutein có trong nhiều loài thực vật (cải bó xôi, bông cải xanh,
rau ngót, hoa, quả, rong, tảo…) và trong mô của một số loài động vật (lòng đỏ
trứng và da của gia cầm, da cá cảnh…) [1]. Lutein - cùng với đồng phân của
nó là zeaxanthin - là các sắc tố tập trung ở hoàng điểm của mắt người với hàm
lượng cao, có vai trò quan trọng trong việc xử lý hình ảnh, phát triển của thần
kinh thị giác và não bộ [2]. Nhiều nghiên cứu dịch tể học gần đây đã chứng
minh rằng lutein có khả năng bắt giữ oxy đơn và các gốc tự do, hấp thụ mạnh
tia tử ngoại. Nhờ đó, lutein có tác dụng bảo vệ cơ thể khỏi một số bệnh ung
thư, bệnh tim mạch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa và các bệnh về mắt ở
người cao tuổi (bệnh đục thủy tinh thể, thoái hóa hoàng điểm) [3]. Do vậy,
lutein đang được quan tâm nghiên cứu khai thác từ các nguồn tự nhiên nhằm
ứng dụng trong trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm (làm
thuốc bổ mắt, vi chất dinh dưỡng, kem chống nắng, son dưỡng môi, chất màu
thực phẩm...) [4]
Hiện nay, nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu lutein nhất là hoa cúc vạn
thọ châu Mỹ (Tagetes erecta L.). Lutein tồn tại trong hoa cúc vạn thọ dưới
dạng monoester hay diester của các acid béo (acid myristic, palmitic…). Hàm
lượng carotenoid tổng số trong cánh hoa chiếm khoảng 0,1 – 0,2% (tính theo
trọng lượng khô), trong đó lutein chiếm trên 80% [5]. Theo các quy trình
truyền thống, lutein ester từ hoa cúc vạn thọ thường được chiết bằng hexan;
dịch chiết được cô đặc dưới áp suất thấp để thu được một dạng dầu sệt (gọi là
oleoresin), sau đó được xà phòng hóa bằng KOH trong alcol để chuyển thành
dạng lutein tự do – là dạng cơ thể người có thể hấp thụ. Một số quy trình xà
phòng hóa lutein ester đã được đề nghị như các quy trình của Ausich (1997)
[6], Kumar (2004) [7], Swaminathan (2009) [8], Sankar (2012) [9] … Các
quy trình trên chưa có sự nhất quán về điều kiện phản ứng (nồng độ oleoresin,
nồng độ KOH, nhiệt độ, thời gian) cũng như chưa có đầy đủ thông tin về hiệu
suất xà phòng hóa. Hơn nữa, công đoạn xà phòng hóa thường được tiến hành

17. 7
ở nhiệt độ cao (50 – 600
C hoặc 70 – 800
C) và trong thời gian khá dài (3 giờ –
10 giờ); điều này có thể gây ra sự phân hủy đáng kể lutein do lutein là một
hợp chất kém bền nhiệt. Nguyên nhân là do các tác giả trên đã sử dụng các
phương pháp khác nhau (sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao) để theo
dõi tiến trình phản ứng hoặc định lượng lutein trong hỗn hợp xà phòng hóa.
Thực tế này dẫn đến sự bối rối đối với người nghiên cứu trong việc chọn lựa
quy trình xà phòng hóa lutein ester ứng dụng cho các mục đích phân tích
lutein ở quy mô phòng thí nghiệm hoặc nhằm thu nhận lutein tự do từ cao
chiết lutein ester ở quy mô công nghiệp. Để làm sáng tỏ vấn đề trên, cần khảo
sát đầy đủ và hệ thống hơn về ảnh hưởng của các yếu tố phản ứng đến hiệu
suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do, từ đó đưa ra quy trình thích
hợp cho phép xà phòng hóa lutein ester với hiệu suất cao và sản phẩm chất
lượng cao. Muốn vậy, cần sử dụng một phương pháp phân tích đáng tin cậy
cho phép định lượng lutein tự do trong hỗn hợp xà phòng hóa lutein ester
chiết tách từ hoa cúc vạn thọ.
Cho đến nay, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn
được xem là một phương pháp hiệu quả để phân tích hỗn hợp carotenoid [10].
Nhiều quy trình phân tích sử dụng phương pháp HPLC đã được xây dựng để
phân tích hỗn hợp carotenoid trên các đối tượng khác nhau, trong đó có thể sử
dụng cột sắc ký pha thường (cột silica, cột cyanopropyl...) hay pha đảo (cột
C18, C30) với đầu dò tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), đầu dò dãy diode quang
(PDA), đầu dò khối phổ (MS), hoặc đầu dò cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
[10]. Trong số đó, phương pháp HPLC sử dụng cột silica là phương pháp đã
được JECFA sử dụng như là phương pháp tiêu chuẩn để định lượng lutein và
zeaxanthin trong các sản phẩm lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ [11][12].
Tuy nhiên, ở Việt Nam với điều kiện khí hậu có độ ẩm cao, cột silica dễ hút
ẩm và do đó rất nhạy cảm với sự thay đổi thành phần nước trong pha động
chạy sắc ký, kết quả là thời gian lưu khó lặp lại [13]. Đối với các cột pha đảo,
cột C30 có ưu điểm là cho phép phân tách rất hiệu quả nhiều hỗn hợp
carotenoid phức tạp nhưng lại khá đắt tiền. Do đó, cột pha đảo C18 thường
được ưu tiên lựa chọn khi phân tích hỗn hợp carotenoid không quá phức tạp.
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu xây dựng phương pháp

18. 8
HPLC định lượng lutein và hỗn hợp các carotenoid khác nhau sử dụng cột C18
[14] nhưng các phương pháp này không phù hợp với điều kiện sẵn có ở phòng
thí nghiệm của chúng tôi (hoặc về các thông số của cột sắc ký, hoặc về thành
phần pha động, …). Tại Việt Nam, rất ít nghiên cứu về định lượng carotenoid
bằng phương pháp HPLC. TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) đã sử dụng cột C18
(150 x 4,6 cm; 5 µm) với đầu dò PDA để xây dựng phương pháp RP-HPLC
khá hiệu quả và thuận tiện cho phép định lượng astaxanthin và hỗn hợp
carotenoid đi kèm (lutein, zeaxanthin, b-caroten, lycopen, astaxanthin ester)
trong đối tượng giáp xác thủy sản [13]. Trong nghiên cứu của Trương Ngọc
Bảo Hiếu và Ngô Văn Tứ đã xây dựng phương pháp phân tích b-carotene
trong một số loại ngũ cốc có màu bằng cách sử dụng cột C18 (150 x 4,6 cm,
5µm). Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của chúng tôi hiện chỉ có cột pha đảo C18
(250 x 4,6 cm; 5 µm) và đối tượng nghiên cứu trong luận văn hướng tới
không phù hợp với các nghiên cứu trên. Do đó, việc cải biến phương pháp
HPLC định lượng carotenoid sẵn có sao cho phù hợp với điều kiện phòng thí
nghiệm và đối tượng phân tích cụ thể là vấn đề đặt ra đối với người làm công
tác phân tích. Vì vậy, trong đề tài này chúng tôi sẽ nghiên cứu cải biến
phương pháp HPLC nói trên để định lượng lutein và theo dõi quá trình xà
phòng hóa lutein ester.
2. Mục đích của đề tài
- Cải biến phương pháp RP-HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm;
5µm) phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, cho phép định lượng lutein
trong sự có mặt của hỗn hợp lutein ester.
- Xác định điều kiện thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein ester
chiết tách từ hoa cúc vạn thọ dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC đã
cải biến thông qua việc xác định hiệu suất xà phòng hoá và độ tinh khiết của
sản phẩm lutein tự do thu được.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Hoa cúc vạn thọ Mỹ Tagetes erecta L. được
trồng trong dự án đề tài cấp tỉnh của TS. Hoàng Thị Huệ An.

19. 9
Phạm vi nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi kế thừa một số
kết quả nghiên cứu trước đây của TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) [13] và xây
dựng phương pháp HPLC phù hợp để định lượng lutein, từ đó ứng dụng kiểm
soát quá trình xà phòng hoá lutein ester.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện sắc ký đến khả
năng định lượng lutein khi có mặt hỗn hợp lutein ester bằng phương pháp
HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm; 5 µm).
- Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa
(nồng độ tác chất, nhiệt độ, thời gian) đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Cho phép định lượng lutein trong các mẫu thực tế có chứa lutein và
lutein ester bằng phương pháp HPLC với cột pha đảo C18 (250 x 4,6 cm; 5
µm).
- Góp phần hoàn thiện quy trình xà phòng hóa lutein ester ở quy mô
phòng thí nghiệm và ở quy mô công nghiệp.

20. 10
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN
1.1.1. Cấu trúc phân tử
Lutein là một sắc tố xanthophyll (tức oxycarotenoid) có nhiều ứng
dụng trong công nghiệp chất màu thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm nhờ có
màu vàng cam rất đẹp và tác dụng chống oxy hóa khá mạnh.
Lutein có công thức phân tử C40H56O2 (phân tử lượng 568,9), là dẫn
xuất 3,3’- diol của b,e-caroten và là một dạng tiền vitamin A [15]. Phân tử
lutein chứa bộ khung cấu trúc isoprenoid C40 điển hình của các carotenoid và
có 2 vòng 6 cạnh ở hai đầu mạch carbon. Chuỗi liên kết đôi liên hợp trong
lutein có thể tồn tại ở cấu hình cis hoặc trans, do đó tạo ra số lượng lớn đồng
phân mono-cis và poly-cis của lutein.
Trong tự nhiên lutein thường tồn tại ở dạng đồng phân hình học bền
nhất là dạng all-trans (hình 1.1) [15], [16].
Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15]
Tuy nhiên, dưới tác dụng của bức xạ nhiệt hay ánh sáng, dạng all-trans
có thể bị chuyển hóa thành các dạng đồng phân cis, trong đó bền hơn cả là các
dạng 9-cis, 13-cis và 15-cis hay 9’-cis, 13’-cis, 15’-cis…(Hình 1.2.).

21. 11
a) Đồng phân 9-cis- lutein b) Đồng phân 13-cis- lutein
c) Đồng phân 15-cis- lutein
Hình 1.2. Một số dạng đồng phân cis thường gặp của lutein [15]
Ngoài ra, trong tự nhiên cũng tồn tại một dạng đồng phân vị trí khác
của lutein là zeaxanthin (Hình 1.3).
Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15]
1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của lutein
1.1.2.1. Tính chất vật lý
Lutein có thể tồn tại ở dạng bột chảy vô định hình hoặc kết tinh dạng
tinh thể hình kim, khối lăng trụ, đa diện hoặc dạng lá hình thoi [17]. Nhiệt độ
nóng chảy 1900
C.
Lutein là chất ít phân cực nên không tan trong nước, kém tan trong các
dung môi hữu cơ phân cực (như methanol, ethanol…), nhưng tan tốt hơn
9
OH
OH
OH
13
OH
OH
OH
15
HO
OH

22. 12
trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình (acetone, ethyl acetate,
dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran...) [17][18].
Phân tử lutein có 10 nối đôi liên hợp nên hấp thụ mạnh tia tử ngoại và
ánh sáng xanh (400 - 490 nm), do đó lutein ở dạng bột có màu đỏ cam và ở
dạng dung dịch có màu vàng cam rất đẹp. So với zeaxanthin (có 11 nối đôi
liên hợp), các cực đại hấp thụ (λmax) của lutein thấp hơn khoảng 4 - 6 nm. Nhờ
đó, có thể phân biệt khá dễ dàng lutein và zeaxanthin dựa vào phổ hấp thụ
UV-Vis của chúng (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Dữ kiện hấp thụ UV-Vis của lutein và zeaxanthin
Carotenoid Dung môi
Cực đại hấp thụ
(λmax, nm)
Hệ số hấp thụ
( )
Lutein
Chloroform 435 458 485 -
Ethanol 422 445 474 2550
Hexane 421 445 474 2480
Zeaxanthin
Acetone 430 452 479 2340
Chloroform 433 462 493 -
Ethanol 428 450 478 2480 (2540)
Hexane 424 449 476 2348
Nguồn: “Britton (1995) and Davies (1976)” [19]
Sự chuyển hóa lutein từ dạng trans thành dạng đồng phân mono-cis dẫn
đến sự giảm cường độ hấp thụ và giảm λmax khoảng 2 - 6 nm, đồng thời làm
xuất hiện đám hấp thụ cis (gọi tắt là peak cis) ở vùng UV gần 320 - 380 nm.
Cường độ hấp thụ của peak cis càng lớn khi liên kết đôi có cấu hình cis càng
gần tâm phân tử. Do vậy, cường độ hấp thụ của peak cis- ở đồng phân 15-cis
mạnh nhất. Nhờ đó, có thể nhận biết các đồng phân cis- bằng phương pháp
HPLC với đầu dò PDA [20][21].
%1
1cmA

23. 13
1.1.2.2. Tính chất hóa học
Lutein thuộc họ carotenoid, trong phân tử có chuỗi polyen liên hợp nên
rất nhạy cảm đối với acid, các ion kim loại, chất oxy hoá, ánh sáng, nhiệt…
Nhóm hydroxyl ở hai đầu phân tử làm cho lutein dễ dàng tham gia vào các
phản ứng oxy hóa. Nhờ đó, nó có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn một số
carotenoid khác (như lycopen, b-caroten…). Vì vậy, lutein dễ bị oxi hóa bởi
oxy không khí, hấp thụ mạnh các gốc tự do hoặc bị đồng phân hóa bởi nhiệt
và ánh sáng, dẫn đến sự nhạt màu hay mất màu. Do đó, lutein cần được bảo
quản trong môi trường khí trơ hay chân không dưới nhiệt độ thấp, tránh ánh
sáng mặt trời.
Lutein khá bền trong môi trường kiềm [22]. Trong môi trường kiềm,
lutein ester bị xà phòng hóa tạo thành lutein tự do. Để tránh sự oxy hóa lutein
bởi oxy không khí nên thực hiện phản ứng xà phòng hóa lutein ester dưới khí
trơ N2.
Trong các mô động - thực vật lutein có khả năng liên kết với các acid
béo, lipid, lipoprotein tạo thành các cấu trúc bền vững hơn so với dạng lutein
tự do [23].
1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của lutein
1.1.3.1. Hoạt tính sinh học của lutein
Phần lớn chức năng sinh học của chất màu lutein đều dựa trên khả năng
hấp thụ ánh sáng, khả năng dễ bị oxy hóa và khả năng bắt giữ các gốc tự do
của phân tử lutein.
Lutein có khả năng hấp thụ tia tử ngoại và ánh sáng xanh trong dải bức
xạ khả kiến, do đó có khả năng bảo vệ da, mắt khỏi tác hại của các bức xạ
này, ngăn ngừa ung thư da, thoái hóa điểm vàng [3], [24].
Người ta cho rằng các gốc tự do sinh ra trong tế bào và mô trong hoạt
động sống của con người có thể gây tác hại đến DNA, protein, carbohydrate
và lipid . Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng lutein có tác động loại trừ sự
xâm nhập của chất oxy hóa và gốc tự do qua màng tế bào, giúp ngăn chặn sự
oxy hóa lipid, hạn chế sự suy giảm khả năng miễn dịch đối với cơ thể, ngăn

24. 14
ngừa những chứng bệnh hiểm nghèo như ung thư, tim mạch, một số bệnh về
mắt (thoái hóa võng mạc do tuổi già, đục thủy tinh thể viêm màng bồ đào…)
[19]. Tác dụng này của lutein nhờ vào khả năng bắt giữ các chất oxy hóa và
các gốc tự do sinh ra trong tế bào [26]. Khả năng chống oxy hóa của lutein có
thể được giải thích bởi cấu trúc hóa học đặc biệt của nó với chuỗi polyen rất
dễ bị oxy hóa. Ngoài ra, hai nhóm hydroxyl ở 2 vòng sáu đầu mạch trong
phân tử lutein làm cho hoạt tính chống oxy hóa của lutein trở nên mạnh hơn
so với các carotenoid khác (như lycopene, b-carotene, …) [27].
1.1.3.2. Ứng dụng của lutein
Ø Trong công nghiệp thực phẩm
Nhờ có màu vàng rất đẹp lutein được phép sử dụng làm chất màu trong
chế biến thực phẩm (mã số E161b). Lutein ở dạng chế phẩm hòa tan trong
nước được sử dụng để nhuộm vỏ ngoài cho giò chả, các bán thành phẩm từ
thịt gà, sữa chua, bánh nướng, kẹo, nước giải khát, nước ép trái cây, ngũ cốc
điểm tâm, các sản phẩm từ sữa, trứng, thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ mới
biết đi, chất béo, dầu, nước thịt, nước sốt và súp hỗn hợp [28].Theo quy định
của EU, Canada, Úc, New Zealand … lutein có thể được sử dụng với mức 0,5
- 2 mg/ngày [29].
Ø Trong công nghiệp dược phẩm
Ngoài khả năng tạo màu, lutein còn có tác dụng chống oxy hóa, hấp thụ
gốc tự do và tia tử ngoại, làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, giúp duy trì
sức khỏe tim mạch, ngăn ngừa ung thư [24]. Lutein là carotenoid chủ yếu có
ở điểm vàng, giúp cải thiện khả năng truyền tin qua khe kết nối trong võng
mạc, rất cần thiết cho quá trình xử lý hình ảnh và sự phát triển của thần kinh
thị giác [31]. Đặc biệt, những nghiên cứu gần đây của tập đoàn dinh dưỡng
hàng đầu thế giới là DSM (Thụy Sĩ) đã phát hiện lutein chiếm đến 66 - 77%
lượng carotenoid hình thành não bộ của người, có chức năng quan trọng trong
việc phát triển và kích thích khả năng học hỏi, sự hình thành cảm xúc và ghi
nhớ của trẻ em, cải thiện tình trạng suy giảm chức năng nhận thức ở người
cao tuổi [32]. Do vậy, lutein cũng đã được đưa vào trong thành phần của một

25. 15
số thuốc bổ (liều dùng 2 - 330 mg/kg), trong sữa cho bé, trong thuốc bổ cho
người cao tuổi.
- Lutein là chất ức chế khối u: Lutein cũng đã được cho là có tác dụng
làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và ngăn ngừa một số dạng ung thư
(như ung thư vú, cổ tử cung) do khả năng chống oxy hoá khá tốt. Một nghiên
cứu của Đại học Tufts (Boston, Massachusetts) và các nhà điều tra Hàn Quốc
cho thấy, phụ nữ có nồng độ lutein trong máu ở mức cao nhất thì khả năng
ung thư vú giảm 88% [8].
– Lutein là chất ức chế sự tắc nghẽn mạch máu, viêm khớp, thậm chí
có thể giúp giảm đau viêm xương khớp và tàn tật ở 16 triệu người Mỹ. Các
nhà nghiên cứu tại Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ gần đây đã phát hiện ra rằng
những người có nồng độ lutein cao trong máu (khoảng 70%) ít có khả năng bị
viêm khớp đầu gối và các mô liên kết khác [33].
– Lutein làm giảm các rối loạn mắt như thoái hóa điểm vàng, đục thủy
tinh thể. Ở người, lutein và zeaxanthin tập trung ở điểm vàng của mắt cũng
như ở da, vú và mô cổ tử cung. Lutein được coi là một vi chất dinh dưỡng cần
thiết cho thị lực bình thường [30][34]. Được sử dụng chủ yếu trong các sản
phẩm chăm sóc mắt để làm giảm mệt mỏi thị giác, giảm tỷ lệ mắc chứng thoái
hóa điểm vàng do tuổi già (AMD: Age-related macular degeneration), đục
thủy tinh thể, bệnh võng mạc…
Ø Trong công nghiệp mỹ phẩm
Lutein chủ yếu được sử dụng để chống nếp nhăn và bảo vệ da khỏi tác
hại của tia cực tím. Lutein và lutein ester có thể dễ dàng thâm nhập vào da và
cho hiệu quả chống nắng tốt [35]. Một số chế phẩm kem chống nắng công
thức thảo dược chứa lutein ester chiết suất từ Tagetes erecta L. đã được sản
xuất. [36].
Ø Trong chăn nuôi
Lutein được dùng để làm chất phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi cá
cảnh, thức ăn cho gia súc và gia cầm để tạo màu vàng cho da gà và lòng đỏ
trứng…

26. 16
1.1.4. Các nguồn lutein quan trọng trong tự nhiên
Lutein là carotenoid rất phổ biến trong nhiều loài động – thực vật. Các
loại thực phẩm chứa nhiều lutein như cải spina, súp lơ xanh, cải xoăn, bắp,
trái kiwi, lòng đỏ trứng gà, trong một số loài rong, tảo... Đặc biệt, hoa cúc vạn
thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) có khả năng tích lũy lutein với hàm lượng rất cao.
Nhiều nghiên cứu cho thấy cánh hoa cúc vạn thọ chứa khoảng 1,0 – 1,6%
carotenoid tổng số (tính theo trọng lượng khô), trong đó khoảng 90% lượng
carotenoid này là lutein ester (dưới dạng monoester và diester của các acid
béo C12 - C18 như acid lauric, myristic, oleic, linoleic, palmitic, stearic) và
chỉ có khoảng 5% là zeaxanthin ester (Kumar, 2004) [7]. Lutein dưới dạng
ester rất bền nhưng khi vào cơ thể con người chỉ bị thủy phân một phần thành
dạng tự do rồi mới được hấp thụ vào huyết thanh. Vì vậy, để tạo ra những chế
phẩm lutein bổ sung cho con người, lutein ester cần phải được thuỷ phân về
dạng lutein tự do [37].
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.2.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký
Sắc ký là kỹ thuật tách hỗn hợp phân tích thành các cấu tử riêng rẽ dựa
trên ái lực khác nhau của các cấu tử này giữa 2 pha không trộn lẫn, trong đó
một pha đứng yên (được gọi là pha tĩnh) và một pha còn lại là pha động.
Pha tĩnh có thể là các hạt rắn xốp, mịn hay cũng có thể là pha lỏng
được gắn kết trên bề mặt của các hạt giá thể rắn nào đó. Pha tĩnh có thể được
nhồi vào một cột bằng thủy tinh hay inox (sắc ký cột) hoặc tráng trên bản
mỏng (bằng nhựa hay nhôm). Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản
chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có
sắc ký hấp phụ, là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion, là chất lỏng ta
có sắc ký phân bố, là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử.
Để rửa giải chất phân tích ra khỏi pha tĩnh cần có một pha động. Pha
động ở trạng thái lỏng (gọi là sắc ký lỏng), trạng thái khí (sắc ký khí) hay
trạng thái siêu tới hạn (sắc ký siêu tới hạn).

27. 17
Trong quá trình sắc ký, mẫu phân tích được nạp lên đầu cột pha tĩnh,
sau đó cho pha động dịch chuyển liên tục qua pha tĩnh. Trong quá trình này,
cấu tử nào có ái lực với pha tĩnh càng mạnh sẽ bị lưu giữ càng chặt trên pha
tĩnh, do đó tốc độ di chuyển càng chậm. Ngược lại, cấu tử có ái lực yếu với
pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn. Nếu chiều dài pha tĩnh đủ lớn thì sau một
thời gian các cấu tử phân tích sẽ được tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột. Quá
trình tách hỗn hợp phân tích được lưu giữ trên pha tĩnh bằng cách cho một
pha động di chuyển liên tục qua pha tĩnh như trên được gọi là sự rửa giải. Nếu
đầu ra của cột sắc ký được ghép nối với một detector có khả năng ghi nhận
một tín hiệu vật lý đặc trưng nào đó của các cấu tử phân tích (ví dụ: độ hấp
thụ ánh sáng, chiết suất, độ dẫn điện, cường độ phát huỳnh quang, ...) và biểu
diễn sự thay đổi của nồng độ chất phân tích (Cx) theo thời gian rửa giải (t), ta
sẽ thu một sắc ký đồ chứa các peak sắc ký (Hình 1.4).
Hình 1.4. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B [38]
Trong sắc ký cột cổ điển sử dụng pha động là pha lỏng (sắc ký lỏng),
kích thước các hạt pha tĩnh vào khoảng 50 – 230 µm. Thực tế cho thấy với
kích thước hạt pha tĩnh như vậy hiệu quả tách không cao, thường chỉ cho
phép tách những hỗn hợp chứa ít cấu tử và có ái lực với pha tĩnh khác nhau
khá nhiều. Để tách những hỗn hợp cấu tử phức tạp (chứa nhiều cấu tử hoặc ái
lực với pha tĩnh khác nhau không nhiều) cần tăng chiều dài đường đi của các
cấu tử trên pha tĩnh bằng cách giảm kích thước các hạt pha tĩnh xuống khoảng
3 - 5 μm. Tuy nhiên, khi đó pha tĩnh được nén rất chặt nên phải hệ thống bơm

28. 18
cao áp để đẩy pha động đi qua cột pha tĩnh. Kết quả là hình thành một kỹ
thuật sắc ký mới là sắc ký lỏng cao áp (High pressure liquid chromatography)
hay chính xác hơn là sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography), viết tắt là HPLC.
1.2.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị HPLC
Thiết bị HPLC gồm những bộ phận quan trọng sau (Hình 1.5):
Hình 1.5. Sơ đồ thiết bị HPLC [38]
1- Bình chứa dung môi pha động
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4- Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler)
5- Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều
nhiệt
6- Đầu dò detector (nhận tín hiệu)
7- Hệ thống máy điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số
liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống
8- Thiết bị in dữ liệu
1.2.2.1. Bình đựng dung môi pha động
Thiết bị HPLC thường có 4 kênh dung môi đi vào đầu bơm cao áp, cho
phép tạo ra các hệ pha động có thể chứa từ 1 – 4 dung môi để rửa giải theo tỷ
lệ mong muốn.

29. 19
Tất cả dung môi, hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm phải là
hóa chất tinh khiết cho sắc ký lỏng (HPLC grade).
Mẫu trước khi bơm vào thiết bị phân tích phải được lọc qua màng lọc
0,2 – 0,45 µm nhằm tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra
các peak tạp trong quá trình phân tích [39]
1.2.2.2. Bộ phận khử khí
Bộ phận khử khí nhằm loại trừ các bọt khí nhỏ còn sót lại trong dung
môi pha động. Nếu trong quá trình phân tích pha động còn bọt khí thì bơm sẽ
hút các dung môi trong pha động không đúng tỷ lệ, do đó sẽ làm thay đổi thời
gian lưu của các peak. Nếu bọt khí còn quá nhiều và bộ khử khí không thể
loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi, áp suất sẽ
không lên và thiết bị sắc ký sẽ ngừng hoạt động [39].
1.2.2.3. Bơm cao áp
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình tách sắc ký. Tốc
độ bơm thường được cài đặt hằng định theo thông số đã lựa chọn. Bơm phải
tạo được áp suất cao khoảng 3000 – 6000 psi hoặc 250 – 500 atm và bơm
phải tạo dòng dung môi liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 – 9,999 ml/phút. Hiện
nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar. Các máy sắc ký
lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar [39].
1.2.2.4. Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột phân tích với dung tích từ 5 – 100 µl. Có 2 cách
tiêm mẫu vào cột: tiêm bằng tay (dùng syringe) và tiêm tự động (dùng
autosampler).
1.2.2.5. Cột sắc ký
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao. Cột pha tĩnh thường được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột
khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1 – 10 mm, hạt chất nhồi cột cỡ 5 – 10
µm. Với chất nhồi cột cỡ 1,8 – 5 µm có thể dùng cột ngắn 3 – 10 cm và nhỏ

30. 20
(đường kính trong 1 – 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao. Ngoài ra,
còn có một số cột dùng kích thước và kích cỡ hạt đặc biệt.
Chất nhồi cột tùy theo loại cột và kiểu sắc ký. Chất nhồi cột có thể là
silicagel (cột pha thường) hoặc silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một
lớp mỏng hợp chất hữu cơ (cột pha đảo). Ngoài ra, người ta còn dùng các loại
pha tĩnh khác như nhôm oxid, polymer xốp, chất trao đổi ion [39].
1.2.2.6. Đầu dò
Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi
chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và
định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng
loại detector thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện cường độ tín hiệu phụ
thuộc tuyến tính vào nồng độ trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân
tích.
A = k.C
trong đó:
A: là tín hiệu đo được;
C: nồng độ chất cần phân tích
k: hằng số thực nghiệm của detector đã chọn
Tín hiệu này có thể là độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ
điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất... Trên cơ sở đó, người ta đã chế
tạo ra detector tử ngoại - khả kiến UV-Vis (bước sóng từ 190 đến 900 nm)
hay detector dãy quang diod (DAD: Diod Array Detector), detector huỳnh
quang (FlD: Fluorescence Detector; để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh
quang tự nhiên hay dẫn chất có huỳnh quang), detector tán xạ ánh sáng bay
hơi (ELSD: Evaporative Light Scatterring detector), detector điện hóa (đo
dòng, độ dẫn, điện lượng...), detector chiết suất (RID: Refractive Index
Detector), detector điện hóa (đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt….). Hiện đại
hơn cả là detetor khối phổ (MSD: Mass Spectrometer), detector NMR.

31. 21
1.2.2.7. Bộ phận ghi tín hiệu
Là bộ phận ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trong các
máy HPLC thế hệ cũ thì sử dụng máy in đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời
gian lưu, diện tích peak, chiều cao peak... Các máy thế hệ mới đều dùng phần
mềm chạy trên máy tính, nó có thể lưu tất cả các thông số của mẫu, phổ đồ và
các thông số của peak (như tính đối xứng, hệ số phân giải...) trong quá trình
phân tích, đồng thời xử lý và tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử
dụng như nồng độ, % độ lệch chuẩn... [39]
1.2.2.8. Thiết bị in dữ liệu
Sau khi đã phân tích xong các mẫu, phần mềm sẽ tự động tính toán và
ta sẽ in kết quả ra giấy để hoàn thiện hồ sơ.
1.2.3. Các đại lượng đặc trưng cơ bản trong HPLC
1.2.3.1. Thời gian lưu - Thời gian lưu thực
Thời gian lưu của một chất (ký hiệu tr) là thời gian tính từ khi bơm mẫu
vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất phân tử của chất tan.
- Điều kiện chạy sắc ký: bản chất pha tĩnh; bản chất, thành phần,
pH và tốc độ của pha động; nhiệt độ cột.
Để đánh giá thời gian lưu thực của một cấu tử trong pha tĩnh cần phải
dùng thời gian lưu thực (ký hiệu: tr’):
tr’ = tr – t0
trong đó:
t0: là thời gian cần thiết để pha động (hay một cấu từ hoàn toàn không
bị lưu giữ) đi từ đầu cột đến detector
Trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn thì thời gian lưu thực của mỗi
chất là hằng định và các chất khác nhau sẽ có thời gian lưu khác nhau. Vì vậy,
dựa vào thời gian lưu để nhận biết sự có mặt của các chất.

32. 22
Trong một phép phân tích nếu t’r nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu t’r
quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích
rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hóa chất,
độ chính xác của phép phân tích kém.
Hình 1.6 là sắc ký đồ khi rửa giải của 2 chất A và chất B. Chất A được
rửa giải ra trước với thời gian lưu trA ; chất B được rửa giải ra sau với thời
gian trB.
Hình 1.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử A và B [16]
Trong đó:
t0: thời gian lưu chết
trA: thời gian lưu chất A t’rA : thời gian lưu thực chất A
trB: thời gian lưu chất B t’rB: thời gian lưu thực chất B
1.2.3.2. Hệ số dung lượng
Hệ số dung lượng (ký hiệu: k’) của một chất cho biết khả năng phân bố
của chất đó giữa pha tĩnh và pha động và được tính bằng tỷ số giữa lượng chất
tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.
0
'
0
0'
t
t
t
tt
k rri
i =
-
=

33. 23
Nếu k’ nhỏ thì tr cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu k’ lớn thì peak bị
doãng. Trong thực tế thì k’ = 1 – 5 là tối ưu.
1.2.3.3. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc (ký hiệu: α) cho biết hiệu quả tách hai chất A và B bởi hệ
thống sắc ký.
α càng khác 1 thì khả năng tách càng tốt.
Hình 1.7 mô tả ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai
chất A và B; với a = 1.02 các peak bị dính lại nên hiệu quả tách không cao,
với a = 1,2 thì các peak tách rời nhau cho thấy hiệu quả tách cao hơn.
Hình 1.7. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai chất A và B
[38]
1.2.3.4. Số đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết (ký hiệu: N) là đại lượng biểu thị hiệu năng tách của
cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Theo lý thuyết đĩa, cột sắc ký có thể
xem gồm nhiều đĩa lý thuyết có chiều cao là H, tại mỗi đĩa ứng một cân bằng
nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh
và pha động:
(L: chiều dài của pha tĩnh nhồi trong cột sắc ký)
Đối với peak có dạng phân bố chuẩn Gauss thì:
'
'
'
,
'
,
A
B
AR
BR
k
k
t
t
==a
N
L
H =

34. 24
trong đó: W1/2 là độ rộng tại ½ chiều cao của peak
Theo Van Deemter:
trong đó:
dP: kích thước hạt pha tĩnh
df: độ dày lớp phủ lỏng trên pha tĩnh
dC: đường kính cột
λ: thông số phụ thuộc kích thước hạt và độ đồng nhất của pha tĩnh
g: thông số phụ thuộc khoảng cách giữa các hạt
k: hằng số đặc trưng cho quá trình chuyển khối
DM: hệ số khuếch tán trong pha động
DS: hệ số khuếch tán của cấu tử phân tích trong pha tĩnh
: tốc độ trung bình của pha động
Như vậy, H phụ thuộc vào đường kính và khả năng hấp phụ của hạt pha
tĩnh, tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động; hệ số khuếch tán của các
chất trong cột.
1.2.3.5. Độ phân giải
Độ phân giải (ký hiệu: R) là đại lượng biểu thị độ tách của các peak A,
B ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho [39].
2
2/1
54,5 ÷÷
ø
ö
çç
è
æ
=
W
t
N r
u
D
ddf
D
d
k
u
D
dH
M
CP
S
fM
P
ú
ú
û
ù
ê
ê
ë
é
+++=
),(
.
2
2
222
g
l
u
÷
÷
ø
ö
ç
ç
è
æ
+
÷
ø
ö
ç
è
æ -
=
+
-
=
'1
'1
4
1)(2 ,,
k
k
N
WW
tt
R
AB
ArBr
a
a

35. 25
trong đó: là thừa số dung lượng trung bình của 2 cấu tử A và B cạnh
nhau cần phân tách.
Trong thực tế, nếu các peak đối xứng thì để định tính (hai peak tách
nhau) thì độ phân giải tối thiểu là R = 1,0; còn để định lượng R = 1,5 là phù
hợp.
Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ
không chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau:
• Tăng thừa số dung lượng bằng cách giảm lực rửa giải của pha
động (giảm nhiệt độ cột, thay đổi thành phần pha động, thay đổi pha tĩnh sao
cho tăng khả năng lưu giữ chất)
• Tăng số đĩa lý thuyết N của cột bằng cách dùng cột dài hơn
• Giảm chiều cao đĩa lý thuyết H bằng cách điều chỉnh tốc độ pha
động để H cực tiểu; dùng cột có kích thước hạt pha tĩnh nhỏ hơn hoặc cột có
đường kính nhỏ hơn
• Làm tăng độ chọn lọc α bằng cách dùng cột khác có pha tĩnh
tương tác chọn lọc hơn với các cấu tử cần tách.
Tuy nhiên, nếu R quá lớn thì thời gian phân tích sẽ dài, tốn nhiều pha
động, độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng
chương trình gradient dung môi. Tuy nhiên, nếu dùng gradient dung môi thì
trong quá trình chạy sắc ký sự thay đổi thành phần pha động sẽ kéo theo sự
thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích các
peak phân tích. Do vậy, nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi
[39].
1.2.4. Cách xây dựng một quy trình phân tích HPLC
Để xây dựng một quy trình phân tích HPLC cần xác lập các điều kiện
sắc ký sao cho tối ưu hóa độ phân giải đối với các chất cần phân tích trong
một thời gian ngắn nhất có thể được. Muốn vậy, cần thực hiện các bước khảo
sát sau:
'k
'k

36. 26
1.2.4.1. Chọn kiểu sắc ký
Tùy thuộc vào loại và tính chất chất phân tích (độ tan, phân tử lượng),
nền mẫu và điều kiện phòng thí nghiệm (có sẵn loại cột sắc ký gì) mà chọn
kiểu sắc ký phù hợp.
- Chất phân tích có phân tử lượng <2000:
* Chất phân tích tan tốt trong nước: nếu là hợp chất ion thì dùng sắc ký
trao đổi ion hay sắc ký cặp ion; nếu là hợp chất phân cực và không điện ly thì
dùng sắc ký pha đảo.
* Chất phân tích tan tốt trong dung môi hữu cơ kém phân cực (như
hexan) thì dùng sắc ký pha thường; nếu tan trong dung môi hữu cơ phân cực
trung bình (như methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran…) thì dùng sắc ký pha
đảo.
- Chất phân tích có phân tử lượng >2000: nếu tan tốt trong nước thì
dùng sắc ký lọc gel theo cơ chế trao đổi ion; nếu tan tốt trong dung môi hữu
cơ thì dùng sắc ký thấm qua gel [40].
1.2.4.2. Chọn cột sắc ký
a) Chọn pha tĩnh: dựa vào thành phần và tính chất của các cấu tử có
trong mẫu phân tích để lựa chọn. Pha tĩnh cần có tương tác vừa phải và chọn
lọc hỗn hợp chất cần phân tích.
- Để tách các chất không phân cực hay ít phân cực: dùng cột pha
thường (NP: normal phase) tức cột có pha tĩnh phân cực (ví dụ: cột silica
trung tính có chứa các nhóm –OH phân cực trên bề mặt; cột silica được ghép
dây nhánh chứa nhóm chức phân cực như cyanopropyl, aminopropyl, diol...)
- Để tách các chất không phân cực, ít phân cực hay các chất phân cực
có thể tạo cặp ion: dùng cột pha đảo (RP: reversed phase) tức là cột kém phân
cực, trong đó pha tĩnh là silica được ghép dây nhánh Ankyl mạch hở (C3; C8;
C18; C30) hay alkyl chứa vòng thơm (cột phenyl). Trong số đó, cột C18 được
sử dụng nhiều nhất do nó có khả năng tách hiệu quả những nhóm hợp chất có

37. 27
phân tử lượng nhỏ từ không phân cực, phân cực trung bình và cả những hợp
chất ion.
b) Chọn kích thước cột và cỡ hạt pha tĩnh:
Nếu muốn phân tích nhanh và hiệu quả tách tốt thì dùng cột ngắn và có
kích thước hạt nhỏ (<2 µm).
Nếu cần phân tích hỗn hợp phức tạp nhiều cấu tử thì dùng cột dài hơn.
1.2.4.3. Chọn pha động
Để luận chọn pha động phù hợp cần thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Hòa tan được hỗn hợp chất phân tích để có thể rửa giải được chúng.
- Trơ với pha tĩnh, tức không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa
học.
- Bền theo thời gian, ít nhất trong suốt thời gian phân tích mẫu.
- Có độ tinh khiết cao (dung môi cho HPLC, hóa chất tinh khiết phân
tích)
- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phải không cho tín hiệu với loại detector sử dụng. Ví dụ: Dùng
detector UV/Vis thì dung môi không được hấp thụ trong vùng bước sóng
phân tích; dùng detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang...
- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.
Thông thường, pha động thường có độ phân cực ngược với pha tĩnh:
- Với hệ sắc ký pha đảo (RP – HPLC) pha động thường có là tổ hợp
một số dung môi phân cực (ví dụ: nước- methanol, nước- acetonitrile...).
Ngoài ra, có thể bổ sung một số dung môi phân cực trung bình
(tetrahydrofuran, dichloromethane, isopropanol...), hoặc thêm hỗn hợp đệm
để ổn định pH, thêm chất tạo phức, tạo cặp ion... để tạo ra sự rửa giải tốt nhất
- Với hệ sắc ký pha thường (NP-HPLC) thì dùng pha động kém phân
cực (ví dụ: hexan; hỗn hợp hexan – ethyl acetate...) [39].

38. 28
1.2.4.4. Chọn chế độ rửa giải
Để chọn chế độ rửa giải phù hợp, cần thử nghiệm nhiều lần để chọn
thành phần pha động (chứa tổ hợp các dung môi nào), tốc độ dòng, nhiệt độ
cột... để đạt độ phân giải tốt và peak có độ nhạy cao.
Ngoài ra, cần chọn chế độ rửa giải sao cho hiệu quả tách tốt nhưng với
thời gian ngắn nhất.
- Nếu hỗn hợp phân tích gồm các cấu tử có độ phân cực không khác
nhau nhiều thì nên rửa giải isocratic.
- Nếu hỗn hợp phân tích chứa các cấu tử có độ phân cực khác nhau
nhiều (ví dụ: gồm hợp chất phân cực trung bình và kém phân cực) thì phải rửa
giải gradient.
Việc xây dựng quy trình phân tích HPLC là công việc hết sức cần thiết,
tuy nhiên, để có một quy trình phân tích tốt đòi hỏi mất nhiều thời gian khảo
sát [39]. Trong thực tế, chúng ta thường áp dụng một số quy trình phân tích
của một nhóm hợp chất nào đó đã được phát triển bởi các chuyên gia phân
tích. Thế nhưng, việc áp dụng những quy trình này có thể cho kết quả không
mong muốn. Do đó, để đỡ mất thời gian xây dựng một quy trình phân tích
mới, chúng ta có thể cải biến (modification) quy trình có sẵn sao cho đạt hiệu
quả mong muốn. Tuy vây, các quy trình này đều cần được thẩm định trước
khi áp dụng trên đối tượng phân tích.
1.2.5. Cách thẩm định một quy trình định lượng bằng phương
pháp HPLC
Việc thẩm định quy trình phân tích nhằm chứng minh quy trình đó có
phù hợp với mục đích ứng dụng không. Theo các hướng dẫn của ICH 1994 và
1996 [Q2A: Thẩm định phương pháp phân tích: Định nghĩa và thuật ngữ,
ngày 27 tháng 10 năm 1994”; “Q2B: Thẩm định quy trình phân tích: Phương
pháp luận, ngày 6 tháng 11 năm 1996”] để thẩm định một quy trình phân tích
định lượng bằng phương pháp HPLC cần tiến hành đánh giá những tiêu chí
tiêu sau:

39. 29
1.2.5.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Đánh giá sự phù hợp của thiết bị đối với việc thực hiện phương pháp
HPLC đã cho để đạt độ đúng và độ tin cậy tối thiểu.
Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, mẫu tự tạo hay
mẫu thử (ít nhất 6 lần tiêm).
Yêu cầu cần đạt: Độ phân giải giữa peak liền kề với peak của chất cần
phân tích phải ≥ 1,5. Số đĩa lý thuyết ≥ 2000. Giá trị RSD của thời gian lưu ≤
1,0% và của diện tích peak phải ≤ 2,0% (nếu RSD >2% phải có sự giải thích
phù hợp) [41].
1.2.5.2. Tính đặc hiệu (Specificity)
Là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các
thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Trong phân tích định lượng, tính
đặc hiệu đánh giá khả năng đưa ra kết quả chính xác về hàm lượng chất phân
tích trong mẫu thử.
- Cách khảo sát:
Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau: (1) mẫu trắng (dung môi pha
động/dung môi hòa tan mẫu); (2) mẫu nền (mẫu không có chất cần phân tích);
(3) mẫu chuẩn; (4) mẫu tự tạo (mẫu không có chất cần phân tích đã được cho
thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và (5) mẫu
thử chứa chất cần phân tích được chuẩn bị theo quy trình.
Yêu cầu cần đạt:
- Trên sắc ký đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo cho peak của chất cần phân
tích phải tách hoàn toàn khỏi các peak khác (nếu có trong nền mẫu).
- Sắc ký đồ của mẫu trắng hay dung dịch nền mẫu không xuất hiện
peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.
Nếu có đáp ứng peak phải ≤ 1,0% so với đáp ứng peak của mẫu chuẩn.
- Peak của chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh
khiết, nghĩa là hệ số chồng phổ UV-Vis của peak hoạt chất cần phân tích thu

40. 30
được trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử/mẫu tự tạo với peak tương ứng
trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn ≥ 0,99 [41].
1.2.5.3. Độ đúng (Accuracy)
Là biểu diễn sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực (hoặc giá
trị trung bình) với giá trị đúng (hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận).
Cách khảo sát:
- Cách 1 (tiến hành trên mẫu tự tạo): Chuẩn bị 03 mẫu tự tạo bằng cách
thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu
không có chất cần phân tích (Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn
thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ
phân tích). Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Tính kết
quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính.
- Cách 2 (thực hiện trên mẫu phân tích) : Chuẩn bị 06 mẫu thử độc lập
với lượng chất chuẩn thêm vào ứng với mức nồng độ 100% của chất cần phân
tích.
Tính độ thu hồi (% Recovery) theo công thức:
Độ thu hồi (%) = (Lượng chất phân tích tìm lại x 100)/Lượng chất
chuẩn thêm vào
Yêu cầu đối với phép thử định lượng: Độ thu hồi (%) = 98,0 - 102,0%
[40]
1.2.5.4. Độ chính xác (Precision)
Diễn tả sự trùng hợp (hay mức độ phân tán) của các kết quả đo được từ
nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô
tả.
Độ chính xác thường được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn (SD:
standard deviation) hoặc hệ số dao động (RSD: relative standard deviation)
của một loạt phép đo.

41. 31
trong đó:
Độ chính xác nên được thử trên một mẫu thử thực, đồng nhất (nếu
không có mẫu đồng nhất thì có thể dùng mẫu tự tạo hoặc một dung dịch mẫu
thử).
Độ chính xác có thể chia thành 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung
gian và độ tái lặp.
a) Độ lặp lại (Repeatability): diễn tả độ chính xác của một quy trình
phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn.
Cách khảo sát: Định lượng 06 mẫu thử độc lập trong cùng ngày.
b) Độ chính xác trung gian (Intermediate precision): diễn tả mức dao
động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày
khác nhau, bởi các kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau.
Cách khảo sát: Tiến hành như độ lặp lại nhưng khác ngày/khác kiểm
nghiệm viên/khác hệ thống HPLC.
Theo hướng dẫn của AOAC, giới hạn chấp nhận phù hợp cho mẫu phân
tích ở nồng độ nhỏ (<100 ppm) là giá trị RSD kết quả định lượng của mỗi
kiểm nghiệm viên/mỗi ngày (n = 6) ≤ 3,0% và của cả hai kiểm nghiệm
viên/khác ngày (n = 12) phải ≤ 5,0%.
c) Độ tái lặp (Reproducibility): diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí
nghiệm phối hợp nhau để tiêu chuẩn hoá phương pháp [40].
1.2.5.5. Khoảng nồng độ tuyến tính (Range)
Là khoảng cách giữa nồng độ trên và dưới của chất phân tích trong mẫu
thử trong đó quy trình phân tích đã được chứng minh đáp ứng độ chính xác,
độ đúng và tính tuyến tính.
1
)(
1
2
-
-
=
å=
n
XX
SD
n
i
ni
%100.%
n
n
X
S
RSD =

42. 32
Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký 5 - 8 dung dịch chuẩn. Xác định
phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn
có trong mẫu và đáp ứng peak thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp
bình phương tối thiểu.
Yêu cầu cần đạt: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2
≥ 0,995).
(Nếu r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp)
1.2.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD: Detection Limit)
Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà một quá trình phân tích có
thể phân biệt một cách đáng tin cậy với nhiễu nền.
LOD thường được xác định bằng nồng độ chất phân tích ứng với peak
có diện tích gấp 3 lần độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng.
Giới hạn định lượng (LOQ: Quantitation Limit): là nồng độ nhỏ nhất
của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và
độ chính xác thích hợp. LOQ thường được tính bằng nồng độ chất phân tích
ứng với peak có diện tích gấp 10 lần độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu
trắng [41].
LOD và LOQ có thể xác định theo 1 trong 2 cách:
- Cách 1: Pha loãng dung dịch chuẩn đến lúc diện tích peak của
chất phân tích gấp 3 lần (nếu tính LOD) hay gấp 10 lần (đối với LOQ) độ lệch
chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng.
- Cách 2: Dựa vào đường chuẩn tuyến tính và độ lệch chuẩn của
đáp ứng.
LOD = (3,3 x s)/a; LOQ = 3,3 x LOD
trong đó:
s: độ lệch chuẩn của tín hiệu ứng với mẫu nền .
a: hệ góc của đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và đáp ứng
(thường là diện tích peak) của chất cần phân tích [40].

43. 33
1.2.5.7. Độ thô (Robustness)
Đánh giá khả năng duy trì của quy trình phân tích không bị ảnh hưởng
bởi những biến đổi nhỏ nhưng có tính chủ định trong các thông số của
phương pháp và chỉ ra mức tin cậy của quy trình trong điều kiện sử dụng bình
thường.
1.2.5.8. Khả năng áp dụng của phương pháp (Scope)
Cho biết quy trình phân tích đã cho có thể áp dụng được trên các loại nền
mẫu nào.
Như vậy, việc xây dựng một quy trình HPLC đã khó khăn thì việc tiến
hành thẩm định quy trình càng phức tạp do rất tốn kém. Do vậy, trong thực tế
chỉ có thể đánh giá trên một số tiêu chí thực tiễn nào đó sao cho có sự cân đối
giữa yêu cầu về tính chính xác, tính khoa học của phương pháp với phí tổn,
thời gian và việc huấn luyện đội ngũ các nhà phân tích.
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CARATENOID
Cũng như các carotenoid khác, dung dịch lutein hấp thụ mạnh trong
vùng khả kiến trong khoảng 400 – 500 nm. Sự hấp thụ này tuân theo định luật
Lambert-Beer trong một khoảng tương đối rộng (có thể dưới 1 ppm đến vài
chục ppm). Như vậy, về nguyên tắc, có thể định lượng các carotenoid bằng
phương pháp đo quang UV-Vis. Việc định lượng này đặc biệt nhạy nếu sử
dụng phương pháp HPLC với detector UV-Vis [42].
1.3.1. Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis
1.3.1.1. Định lượng sản phẩm carotenoid tinh chế
Nguyên tắc:
Hoà tan lượng carotenoid với dung môi thích hợp. Đo độ hấp thụ của
dung dịch ở bước sóng ứng với cực đại hấp thụ của carotenoid trong dung
môi đã pha với cuvet 1cm.
Hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu (Y%) được tính theo công
thức:

44. 34
trong đó:
A: độ hấp thụ của dung dịch đo được; D: hệ số pha loãng.
: độ hấp thụ cực đại của dung dịch chứa 1% w/v carotenoid với
cuvette 1cm trong dung môi nghiên cứu.
G: số gam carotenoid đã cân (G lấy sao cho A đo được từ 0,3 – 0,7).
1.3.1.2. Định lượng carotenoid trong các mẫu sinh học
Các mẫu sinh học chứa lutein thường chứa hỗn hợp nhiều carotenoid
khác nhau, chúng có phổ hấp thụ khả kiến chồng lấn lên nhau, gây khó khăn
cho việc định lượng riêng rẽ một carotenoid nào đó. Bên cạnh đó, mẫu còn có
thể chứa một số hợp chất có màu không phải carotenoid nhưng cũng hấp thụ
bức xạ khả kiến do đó sẽ cản trở việc định lượng lutein bằng phương pháp
trắc quang - so màu. Khi đó, cần loại bỏ những hợp chất cản trở trước khi
định lượng carotenoid tổng số. Chẳng hạn, các mẫu dịch chiết thực vật (lá
cây, một số loài rong, tảo có màu lục) thường chứa chlorophyll. Ngoài khả
năng hấp thụ ở vùng 650 – 700 nm chlorophyll còn hấp thụ mạnh ở 430 nm
(chlorophyll a) và 450 – 460 nm (chlorophyll b). Do đó cần phải xà phòng
hoá mẫu carotenoid trước khi phân tích để loại bỏ các tạp chất béo khỏi dịch
chiết [43].
1.3.2. Định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC
So với phương pháp sắc ký cột cổ điển, phương pháp HPLC có những
ưu điểm sau: 1) Hiệu quả tách tốt nhờ sử dụng pha tĩnh có kích thước hạt nhỏ;
2) Giảm đáng kể nguy cơ phân hủy carotenoid do pha tĩnh được chứa trong
một cột kín bằng thép inox không tiếp xúc với ánh sáng và không khí; 3) Độ
lặp lại cao do cột sắc ký được nhồi sẵn, có thể dùng lại nhiều lần; 4) Phân tích
nhanh do hệ thống HPLC được điều khiển tự động; 5) Cho phép thu nhận các
thông tin về cấu trúc phân tử carotenoid nhờ sử dụng các detector PDA, MS
hay NMR. Vì vậy, phương pháp thông dụng nhất để định lượng carotenoid
GA
DA
Y
cm .
10..
(%) %1
1
4
=
%1
1cmA

45. 35
hiện nay chính là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tuy nhiên, do sự
phức tạp về thành phần carotenoid trong mẫu sinh học cũng như sự đa dạng
của đối tượng phân tích nên cho tới nay không có quy trình tiêu chuẩn nào
cho phép định lượng carotenoid trong tất cả loại mẫu phân tích.
Đa số trường hợp định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC đều
dùng cột pha ngược trong đó phổ biến nhất là cột C18 do có ưu điểm là tương
thích với hầu hết dung môi hòa tan carotenoid và phù hợp với độ phân cực
của các carotenoid. Trong một số trường hợp cột pha thường với pha tĩnh là
silicagel được sử dụng để tách các xanthophyll (Ví dụ: dùng cột silica (250
mm x 4,6 mm; 3 µm) để định lượng lutein và zeaxanthin trong sản phẩm
lutein tinh chiết tách từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. theo quy trình của
JECFA [11]; định lượng astaxanthin trong thức ăn nuôi cá bằng cột
Lichrosorb Si60 (5 µm) được phủ một lớp acid phosphoric 1
(Sự acid hóa pha
tĩnh bằng các acid yếu như trên có tác dụng ngăn ngừa sự lưu giữ quá mạnh
của các xanthophyll phân cực trên cột). Tuy nhiên, cột silica thường phân giải
kém đối với các carotene.
Nhiều hệ dung môi đã được đề nghị dùng làm pha động trong phân tích
carotenoid, trong đó thông dụng nhất là acetonitrile và methanol. Hầu hết các
hệ pha động đều dựa trên sự tổ hợp hai dung môi cơ bản trên nhưng có sự
thay đổi đôi chút về thành phần [44]. Acetonitrile được dùng rất phổ biến do
nó có độ nhớt thấp và độ chọn lọc tốt hơn khi tách các xanthophyll trên cột
C18 [45]. Trong khi đó pha động với thành phần cơ bản là methanol có ưu
điểm là cho độ thu hồi cao hơn, ngoài ra methanol rẻ và ít độc hơn acetonitrile
[46]. Trên cơ sở acetonitrile hay methanol, một vài dung môi khác
(dichloromethane, tetrahydrofuran, ethyl acetate, hexane, acetone, nước ...) có
thể được thêm vào pha động để đạt được sự lưu giữ mong muốn, cải thiện độ
phân giải và làm tăng độ tan của carotenoid. Ví dụ: thêm dịch loromethane
tăng tính chọn lọc của quá trình tách và tăng độ tan của carotenoid. Một số
nhà phân tích có khuynh hướng sử dụng pha động chứa 3 - 4 dung môi
1
bằng cách bơm dung dịch H3PO4 1% (1g dung dịch H3PO4 85% hòa tan trong 100 ml metanol) qua cột với
tốc độ 1 ml/min trong 1 h

46. 36
nhưng theo Craft (1992) [19], điều này có thể làm phức tạp hóa phương pháp
phân tích do tăng tính không trộn lẫn của chúng và tốc độ bay hơi khác nhau
của các dung môi sẽ làm thay đổi thành phần pha động trong quá trình phân
tích, do đó làm thay đổi thời gian lưu của carotenoid trong ngày. Neils và
Leenheer (1983) [47] cho rằng việc dùng pha động không chứa nước khi tách
hỗn hợp carotenoid phức tạp sẽ giúp làm tăng độ tan của carotenoid và giảm
khả năng kết tủa carotenoid trên cột. Tuy nhiên, một số nhà phân tích vẫn
thường thêm một lượng nước rất nhỏ vào pha động để hạn chế sự rửa giải quá
sớm của các xanthophyll tự do. Đôi khi acetat amoni (0,05 M trong methanol)
hay triethylamine (0,05 hay 0,1% v/v) có thể được thêm vào pha động để hạn
chế ảnh hưởng của tính acid gây ra bởi các nhóm silanol tự do trên pha tĩnh
silicagel, do vậy giảm hiện tượng kéo đuôi, cải thiện độ thu hồi các
carotenoid.
Nếu có thể, nên dùng chế độ rửa giải isocratic (thành phần pha động
không đổi) do nó có những ưu điểm sau: 1) đơn giản (chỉ cần dùng một bơm
cao áp); 2) nhanh; 3) cho đường nền ổn định; 4) thời gian lưu lặp lại tốt. Chế
độ rửa giải này nói chung có khả năng tách được các tiền vitamin A và
carotenoid chính trong các mẫu thực phẩm. Tuy nhiên, khi tách hỗn hợp gồm
nhiều carotenoid có độ phân cực rất khác nhau thì nên dùng chế độ rửa giải
gradient để cải thiện độ chọn lọc và tăng khả năng rửa giải các hợp chất lưu
giữ mạnh trên pha tĩnh.
Dung môi hòa tan mẫu phải tương thích với pha động HPLC. Nếu độ
tan của các carotenoid trong dung môi hòa tan mẫu tốt hơn nhiều so với trong
pha động và nhất là khi tiêm dung dịch mẫu gần như bão hòa vào cột thì sẽ
xảy ra hiện tượng kết tủa carotenoid trong buồng tiêm mẫu, dẫn đến hiện
tượng kéo đuôi, giãn peak, chẽ peak hay tạo thành các peak ma (ghost
peak)… Để tránh sự không tương thích này, nên dùng pha động làm dung môi
hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu bằng pha động trước khi tiêm vào cột sắc ký.
Theo Kimura et al. (1995) [47], acetone là dung môi hòa tan mẫu rất tốt khi
pha động chứa hỗn hợp acetonitrile – methanol – dichlorometane – hexane
do nó có độ phân cực và tính tan gần giống như pha động.

47. 37
Khi phân tích carotenoid, nếu nồng độ carotenoid trong dung dịch khá
lớn sẽ dẫn đến hiện tượng biến dạng peak. Theo Khachik et al. (1988) [47], có
thể loại trừ hiện tượng này nếu thể tích tiêm mẫu giảm xuống còn 5 hay 10 µl.
Nhiệt độ cột cũng cần được ổn định để duy trì độ lặp lại về thời gian
lưu của các carotenoid cũng như độ chọn lọc và độ thu hồi của phương pháp
phân tích. Chẳng hạn, ở 300
C khi dùng cột C18 và pha động gồm acetonitrile-
dichloromethane-methanol 70:20:10 thì không thể tách lutein với zeaxanthin,
tách trans-β-carotene với đồng phân 9-cis nhưng ở 130
C thì có thể tách tốt
chúng (Sander và Craft, 1990) [47].
Như đã biết, các carotenoid hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại - khả kiến
nên để định lượng carotenoid thường dùng detector UV-Vis. Hơn nữa, loại
detector này khá rẻ tiền và dễ vận hành nhưng có độ nhạy cao, khoảng tuyến
tính khá rộng, ít chịu ảnh hưởng của sự thay đổi nhiệt độ. Nhược điểm của
chúng là không cho phép nhận biết được các carotenoid có thời gian lưu gần
giống nhau. Để khắc phục hạn chế này có thể dùng detector DAD: loại
detector đắt tiền hơn nhưng cho phép ghi phổ hấp thụ UV-Vis của các
carotenoid ứng với các peak tách ra trên sắc ký đồ, do đó cho phép khẳng
định phần nào cấu trúc của carotenoid, đồng thời kiểm tra độ tinh khiết của
peak. Tuy nhiên, các carotenoid chứa các đồng phân hình học hay đồng phân
quang học có phổ hấp thụ UV-Vis rất gần giống nhau. Trong trường hợp này,
không thể sử dụng detector DAD để nhận biết chúng mà phải dùng detector
MS hay NMR để khẳng định chính xác hơn cấu trúc phân tử carotenoid. Nói
chung, độ nhạy của detector MS cao hơn so với detector UV-Vis.
Để định lượng một carotenoid X nào đó bằng phương pháp HPLC
thường dùng phương pháp đường chuẩn. Lưu ý rằng các carotenoid đa số kém
bền nên hàm lượng carotenoid trong “mẫu chuẩn” thường bị suy giảm trong
quá trình bảo quản. Do vậy, cần kiểm tra lại hàm lượng carotenoid tổng số có
trong mẫu chuẩn bằng phương pháp đo quang UV-Vis (xem 1.3.1), sau đó
chạy HPLC để xác định % carotenoid X có trong tổng số carotenoid còn lại.

48. 38
Hàm lượng carotenoid X trong mẫu chuẩn được tính theo công thức:
% CARX = % CAR TS* (SX/STS)*100%
trong đó:
%CARX: hàm lượng carotenoid X trong mẫu chuẩn.
%CARTS: hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu chuẩn xác định
bằng phương pháp đo quang UV-Vis.
SX: diện tích peak ứng với carotenoid X trên sắc ký đồ.
STS: tổng diện tích các peak xuất hiện trên sắc ký đồ.
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
1.4.1. Nghiên cứu quá trình xà phòng hóa lutein ester
Hiện nay, hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) được xem là nguồn
nguyên liệu tự nhiên tốt nhất dùng cho sản xuất lutein thương mại do nó có
khả năng tích lũy lutein với hàm lượng khá cao và gần như nguyên chất. Thật
vậy, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng xanthophyll tổng số trong cánh
hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. vào khoảng 1,0 – 1,6% (tính theo trọng
lượng khô), trong đó khoảng 90% lượng carotenoid này là lutein ester (dưới
dạng monoester và diester của các acid béo C12 - C18 như acid lauric,
myristic, oleic, linoleic, palmitic, stearic) và chỉ có khoảng 5% là zeaxanthin
ester (Kumar, 2004). Lutein dưới dạng ester rất bền nhưng khi vào cơ thể con
người chỉ bị thủy phân một phần thành dạng tự do rồi mới được hấp thụ vào
huyết thanh. Vì vậy, để tạo ra những chế phẩm lutein bổ sung cho con người,
sau khi thu được oleoresin cần thủy phân lutein ester về dạng tự do [9].
Quá trình thủy phân lutein ester từ hoa cúc vạn thọ có thể thực hiện
bằng phương pháp hóa học hay sinh học. Phương pháp hóa học (còn gọi là
phương pháp xà phòng hóa) sử dụng tác nhân kiềm mạnh (thường là KOH)
trong alcohol hữu cơ (propylen glycol, ethanol) để cắt đứt liên kết ester giữa
các nhóm –OH trong phân tử lutein với các acid béo. Phương pháp xà phòng
hóa tuy ít tốn kém nhưng thường phải tiến hành ở nhiệt độ cao nên có thể gây
ra sự phân hủy lutein tự do. Do đó, một số tác giả khác nghiên cứu sử dụng

49. 39
phương pháp sinh học trong đó sử dụng enzyme lipase để thủy phân lutein
ester ở nhiệt độ phòng nhằm hạn chế sự phân hủy hoạt chất. Tuy nhiên,
phương pháp này hiện nay ít được áp dụng rộng rãi do enzyme đắt tiền, hiệu
quả kinh tế không cao khi ứng dụng trong công nghiệp [48].
Trên thế giới đã có khá nhiều sáng chế về quá trình tách chiết và tinh
chế lutein từ hoa cúc vạn thọ, trong đó có đề cập đến phương pháp xà phòng
hóa lutein ester.
Sau đây là một số phương pháp xà phòng hóa lutein ester tiêu biểu:
Ausich và cs. (1997) [43] đã xà phòng hóa lutein ester bằng cách hòa
tan oleoresin trong propylen glycol theo tỷ lệ 41:41 (w/w) rồi đun ở 50 - 600
C
cho tan ra, sau đó thêm từ từ 18 phần khối lượng dung dịch nước của KOH
45% w/w rồi đun nóng đến 65-800
C (tốt nhất là ở 700
C) trong 10 giờ. Như
vậy, tỷ lệ oleoresin: propylen glycol: KOH: H2O trong hỗn hợp xà phòng hóa
ban đầu xấp xỉ 4:4:1:1 (w/w/w/w). Nhược điểm của quy trình này là oleoresin
khó tan trong propylen glycol (có độ nhớt cao) nên quá trình xà phòng hóa
cần tiến hành ở nhiệt độ khá cao trong thời gian dài, dẫn đến khả năng phân
hủy lutein, zeaxanthin thành các sản phẩm không mong muốn
Khachik, F. (2001) [49] đề nghị quá trình chiết lutein ester từ bột hoa
cúc vạn thọ khô (thu được bằng cách ủ xi-lô rồi sấy khô) bằng tetrahydrofuran
(THF) và đồng thời xà phòng hóa bằng cách phối trộn với dung dịch KOH
10% trong ethanol (EtOH) để đưa hỗn hợp về pH 12. Tỷ lệ các thành phần
trong hỗn hợp phản ứng như sau: 100 g bột hoa cúc: 1000 ml THF: 250 ml
KOH 10% w/v trong EtOH. Tiến hành chiết và xà phòng hóa lutein ester bằng
cách khuấy trộn hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng trong 2 h Tiến trình thủy phân
được giám sát bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC). Quy trình này mặc
dù cho hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm lutein cao nhưng có nhược
điềm là không có giai đoạn cô đặc lutein ester trước khi xà phòng hóa nên tiêu
tốn nhiều dung môi và KOH. Ngoài ra, THF dễ tạo thành các peroxid do đó
có thể phân hủy xanthophyll.
Madhavi (2002) [50] đưa ra quy trình xà phòng hóa oleoresin trong
dung dịch isopropanol-nước như sau: Hòa tan 1 kg oleoresin trong 3 L

50. 40
isopropanol rồi khuấy và đun nóng đến 600
C đến khi chảy lỏng thành dung
dịch. Sau đó, thêm 0,44 L dung dịch nước chứa 50% KOH (tức nồng độ
oleoresin và KOH trong hỗn hợp xà phòng hóa là 0,3 g/ml và nồng độ KOH
là 6,4% w/v). Xà phòng hóa bằng cách khuấy và duy trì hỗn hợp ở 60-650
C
trong 90 phút. Sản phẩm thu được chứa 95% carotenoid tổng số (với 90% all-
trans lutein, 4% all-trans zeaxanthin, còn lại là các vết carotenoid khác).
Nhược điểm của quy trình này sinh ra nhiều nước thải do sử dụng lượng nước
lớn gấp 30 lần lượng oleoresin.
Kumar, S.T.K và cs. (2004) [7] đã xà phòng hóa lutein ester bằng cách
thêm dung dịch KOH 8 – 13% w/v trong isopropanol vào oleoresin sao cho
oleoresin với nồng độ oleoresin trong hỗn hợp là 0,33 g/ml. Hỗn hợp được
đun nóng 65-800
C trong 3 giờ. Tiến trình xà phòng hóa được giám sát bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nhược điểm của quy trình
này phản ứng phải thực hiện ở nhiệt độ khá cao (70 - 800
C) nên có khả năng
dẫn đến sự chuyển hóa trans-lutein thành đồng phân cis- làm giảm hoạt tính
sinh học của sản phẩm.
Swaminathan (2009) [8] xà phòng hóa oleoresin bằng cách đun
oleoresin đến dưới 450
C, khuấy đều cho chảy lỏng ra, thêm 1,2 - 2,0 phần thể
tích dung dịch KOH 13 - 15% trong EtOH tuyệt đối rồi đun ở 70 - 800
C trong
40 phút. Hiệu suất xà phòng hóa thay đổi từ 55% - 80% tùy điều kiện phản
ứng cụ thể. Ưu điểm của quy trình này là ít sử dụng dung môi độc hại, rút
ngắn thời gian xà phòng hóa.
Gần đây, Joseph và cs. (2013) [51] đã cải tiến quy trình xà phòng hóa
lutein oleoresin bằng dung dịch KOH trong nước với sự có mặt của hỗn hợp
alcohol béo (lauryl alcohol) và acid béo (caprylic capric acid) để bảo vệ lutein
khỏi bị oxy hóa ở nhiệt độ cao như sau: 10 kg oleoresin được đun nóng và
khuấy ở 450
C trong 5-10 phút cho đồng nhất. Thêm từ từ 1,95 kg KOH 95%
trong 3 kg nước rồi 0,86 kg caprylic capric acid và 4,3 kg of lauryl alcohol,
khuấy đều và gia nhiệt ở 800
C trong 3h (theo dõi quá trình xà phòng hóa bằng
sắc ký bản mỏng). Hiệu suất phản ứng khoảng 80,15%. Phương pháp này tuy
không dùng dung môi EtOH và sản phẩm carotenoid thu được có độ tinh

51. 41
khiết cao (khoảng 91,75% carotenoid tổng số) nhưng phải dùng hỗn hợp
caprylic capric acid-lauryl alcohol và lượng nước khá lớn khó có khả năng thu
hồi, yêu cầu thiết bị phức tạp (ly tâm tốc độ cao).
Từ việc tổng quan tài liệu có thể thấy rằng đa số phương pháp xà phòng
hóa đều sử dụng dung dịch KOH trong alcohol (methanol, ethanol,
isopropanol, propylen glycol…). Tuy nhiên, không có sự tương đồng về điều
kiện xà phòng hóa lutein ester. Nguyên nhân có lẽ là do các tác giả đã sử dụng
các dung môi khác nhau (hexane, ether dầu mỏ, ethyl acetate…) để chiết
lutein tự do từ hỗn hợp xà phòng hóa cũng như dùng các phương pháp và kỹ
thuật khác nhau (TLC, đo quang UV-Vis, HPLC) để đánh giá hiệu suất xà
phòng hóa. Thực tế trên dẫn đến sự băn khoăn trong việc lựa chọn phương
pháp xà phòng hóa để ứng dụng trong nghiên cứu và sản xuất.
Nhằm góp phần hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, tinh chế các
hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn thọ, việc đánh giá lại ảnh hưởng
của điều kiện xà phòng hóa đến hiệu suất chuyển hóa lutein ester thành lutein
tự do, từ đó chọn lựa phương pháp thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein
ester là vấn đề cần quan tâm.
1.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng lutein bằng
phương pháp HPLC
1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Lutein là carotenoid có trong nhiều loài động - thực vật, có vai trò quan
trọng trong việc ngăn ngừa bệnh mù lòa ở người cao tuổi (thoái hóa hoàng
điểm, đục thủy tinh thể,...). Do đó, có nhiều công trình nghiên cứu định lượng
lutein và các carotenoid đi kèm trong các nguồn nguyên liệu tự nhiên, các
mẫu sinh học, thực phẩm, dược phẩm.
Một trong những công trình nghiên cứu lâu đời nhất định lượng
carotenoid trong thực vật bằng phương pháp HPLC sử dụng cột pha ngược
được thực hiện bởi Tee E. Siong và Lim Chin Lam (1992) [47]. Dịch chiết
carotenoid thu nhận từ 8 loài thực vật trước hết được tách sơ bộ bằng sắc ký
cột hở chứa hỗn hợp MgO2-diatomite (phương pháp AOAC, Deutsch, M.J,