Cá hộp Hichef Thái Lan 1 thùng 100 hộp, mỗi hộp 145gram Zalo sỉ: 0968.994.923 -0778.633.384 Hotline: 070605.95.91 Giao hàng khu vực TP.HCM và đưa hàng ra chành đi các tỉnh.

1. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THIẾT LẬP QUY TRÌNH PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM
LINH CHI GANODERMA LUCIDUM KẾT HỢP VỚI
ENZYME VÀ SIÊU ÂM
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện : ĐẶNG THỊ KIM TUYỀN
MSSV: 1411100465 Lớp: 14DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

2. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này hoàn toàn trung
thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các thông tin, tài liệu
trích dẫn trong đồ án này đều được ghi rõ nguồn gốc.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Đặng Thị Kim Tuyền

3. LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án, tôi đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ và giúp đỡ
từ phía nhà trường cũng như gia đình. Chính vì lí do đó, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến họ vì đã giúp tôi đạt được thành quả như hôm nay.
Lời đầu tiên tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Thành
phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện để tôi được học tập thật tốt tại trường trong thời
gian qua và quý Thầy (Cô) của Viện Khoa học Ứng dụng lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự
hào vì đã được học tập tại đây. Bên cạnh đó, để hoàn thành được bài báo cáo này, tôi
xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương đã tận tình chỉ dạy tôi, cho tôi thêm
động lực mỗi khi gặp khó khăn, nhờ có cô tôi mới có thể hoàn thành tốt nhất đề tài của
mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệm
Công nghệ Sinh học, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và các em
Nguyễn Bảo Trân, Nguyễn Ngọc Gia Bảo và Hồ Lí Hải Vân (15DSH) đã giúp đỡ tôi
và nhóm thực hiện đề tài nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đồ án.
Ngoài ra tôi cũng xin cảm ơn quý Thầy (Cô), các anh chị phụ trách phòng thí
nghiệm khoa Dược, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tôi
về thiết bị và dụng cụ để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bè
tôi, đã luôn quan tâm, động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành báo cáo.
Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót nhất định
mà tôi chưa thể khắc phục nên tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý Thầy (Cô) để
đề tài này được hoàn chỉnh hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên thực hiện
Đặng Thị Kim Tuyền

4. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT..........................................................................................v
DANH MỤC BẢNG.................................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH........................................................................................................ ix
ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................................................4
1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi ...............................................4
1.1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi.............................................................................................4
1.1.1.1. Phân loại......................................................................................................................5
1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi........................................................................8
1.1.2. Bào tử nấm Linh chi........................................................................................................9
1.2. Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi....... 12
1.2.1. Các polysaccharide và peptidoglycan......................................................................... 15
1.2.2. Triterpenes...................................................................................................................... 17
1.2.3. Saponin ........................................................................................................................... 22
1.2.4. Acid béo........................................................................................................................... 23
1.2.5. Các thành phần khác.................................................................................................... 24
1.3. Công dụng của nấm Linh chi và bào tử Nấm Linh chi........................................ 24
1.3.1. Phòng chống ung thư ................................................................................................... 26
1.3.2. Khả năng kháng oxi hóa.............................................................................................. 27
1.3.3. Điều trị bệnh đái tháo đường ...................................................................................... 28
1.3.4. Điều trị các bệnh về tim mạch..................................................................................... 28
1.3.5. Tăng cường hệ miễn dịch ............................................................................................ 29
1.4. Phương pháp phá vỡ và trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi ................. 29
1.4.1. Enzyme chitinase........................................................................................................... 30
1.4.2. Giới thiệu về siêu âm phá tế bào................................................................................. 33
1.4.2.1. Khái niệm .................................................................................................................. 33
1.4.2.2. Bản chất của sóng âm.............................................................................................. 34
1.4.2.3. Nguyên lý tác động của sóng siêu âm.................................................................... 34

5. Đồ án tốt nghiệp
ii
1.4.2.4. Tác động của sóng siêu âm lên tế bào................................................................... 36
1.4.2.5. Ứng dụng của sóng siêu âm.................................................................................... 36
1.4.2.6. Thiết bị phát sóng siêu âm ...................................................................................... 37
1.4.3. Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi ....................................................... 38
1.4.4. Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử....................................................... 41
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................. 46
2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 46
2.1.1. Vật liệu............................................................................................................................ 46
2.1.2. Nơi thực hiện ................................................................................................................. 46
2.1.3. Thời gian thực hiện ...................................................................................................... 46
2.1.4. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất..................................................................................... 46
2.1.4.1. Thiết bị....................................................................................................................... 46
2.1.4.2. Dụng cụ...................................................................................................................... 47
2.1.4.3. Hóa chất – Môi trường nuôi cấy............................................................................ 48
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................ 52
2.2.1. Thu enzyme chitinase bằng lên men thể rắn............................................................ 54
2.2.1.1. Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 trên môi trường thạch
PDA............................................................................................................................ 55
2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa Trichoderma harzianum T2 .......................................... 55
2.2.1.3. Thu enzyme dịch trích ly bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn... 55
2.2.1.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum
T2 tối ưu hóa để thu enzyme chitinase ................................................................. 55
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi ................. 56
2.2.2.1. Phá vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng
enzyme thương mại Cellulase (EC), dịch tăng sinh nấm Trichoderma
harzianum T2 (DTL) và siêu âm............................................................................. 57
2.2.2.2. Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu................. 57
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lý bào tử .......................................................... 60

6. Đồ án tốt nghiệp
iii
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học.................................................................................................................................... 61
2.2.4.1. Quy trình trích ly hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi................................. 63
2.2.4.2. Định tính một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi .................................. 65
2.2.4.3. Định lượng một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi sau khi bị phá vỡ 67
2.2.4.4. Phương pháp kháng oxi hóa DPPH....................................................................... 69
2.2.4.5. Phương pháp thử độc tính tế bào artemia ............................................................ 71
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................ 73
3.1. Thu enzyme chitinase trên môi trường lên men thể rắn .................................... 73
3.2. Ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi ........................... 74
3.3. Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông..................................................... 78
3.4. Định tính thành phần hóa học sau khi phá vỡ bào tử nấm Linh chi................ 79
3.4.1. Định tính thành phần hóa học trong dịch phá vỡ bào tử ...................................... 80
3.4.1.1. Định tính protein ...................................................................................................... 81
3.4.1.2. Định tính saponin..................................................................................................... 82
3.4.1.3. Định tính polysaccharide ........................................................................................ 85
3.4.1.4. Định tính triterpenoid.............................................................................................. 85
3.4.2. Định tính thành phần hóa học còn lại trong vỏ bào tử phá vỡ bằng enzyme
kết hợp siêu âm .............................................................................................................. 87
3.4.2.1. Định tính protein ...................................................................................................... 87
3.4.2.2. Định tính saponin..................................................................................................... 87
3.4.2.3. Định tính polysaccharide ........................................................................................ 88
3.4.2.4. Định tính triterpenoid.............................................................................................. 88
3.5. Định lượng các hoạt chất thu được từ dịch phá vỡ và bào tử bị phá vỡ ......... 90
3.5.1. Định lượng polysaccharide trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu
âm và mẫu siêu âm bằng phương pháp Phenol – Sulfuric.................................... 90
3.5.2. Định lượng lipid trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu
siêu âm bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb .............................................. 92
3.6. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa ............................................................................ 97

7. Đồ án tốt nghiệp
iv
3.7. Thử độc tính tế bào trên Artemia nauplii..............................................................101
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................104
4.1. Kết luận ........................................................................................................................104
4.2. Kiến nghị ......................................................................................................................104
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................106
Tài liệu tiếng Việt...................................................................................................................106
Tài liệu tiếng Anh ...................................................................................................................106
PHỤ LỤC A..................................................................................................................................1
PHỤ LỤC B ............................................................................................................................... 13

8. Đồ án tốt nghiệp
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
PDA: Potato Dextro Agar
EC: Enzyme Cellulase C20032
DTL: Dịch trích ly
A.nauplii: atermia nauplii
DPPH: 1,1 - Diphenyl - 2 - picryl – hydrazyl
Trolox: 6 – Hydroxy – 2, 5, 7, 8 - tetramethychroman - 2 – carboxylic
CMC: Sodium carboxymethyl cellulose
DNS: acid - 2 - hydroxyl - 3,5 – dinitrobenzoic
DMSO: Dimethyl sulfoxit
ĐC: Đối chứng
KSA: Không siêu âm
SA: Siêu âm
SA 75%: Siêu âm độ khuếch đại 75%
SA100%: Siêu âm độ khuếch đại 100%
PHC: Pha hữu cơ
PN: Pha nước
DI: Diethyl ether
HE: Hexane
BT: Bào tử

9. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác
nhau (Lê Xuân Thám, 1996)..................................................................................................... 10
Bảng 1.2. Thành phần dược tính của nấm Linh chi............................................................... 12
Bảng 1.3. Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li
JJ và cộng sự (2014))................................................................................................................. 15
Bảng 1.4. So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác
nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL) ....................................................................................... 27
Bảng 1.5. Những nghiên cứu về phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi trên Thế giới............. 39
Bảng 1.6. Các phương pháp trích ly ........................................................................................ 41
Bảng 1.7. Các dung môi trong chiết xuất lipid của Ganoderma lucidum
(CN1099455C) ........................................................................................................................... 44
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính tế bào trên artemia nauplii.................................. 71
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của enzyme chitinase thu được từ hai môi
trường cơ chất (mm) .................................................................................................................. 73
Bảng 3.2. Bảng so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh
chi qua các ngày ủ enzyme........................................................................................................ 75
Bảng 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm
Linh chi qua các ngày ................................................................................................................ 76
Bảng 3.4. Kết quả so sánh ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông........................ 78
Bảng 3.5. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly bằng hai dung
môi................................................................................................................................................ 81
Bảng 3.6. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định
tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng diethyl ether........................ 82
Bảng 3.7. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định
tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng hexane ................................. 84
Bảng 3.8. Kết quả định tính saponin khi trích ly bằng hai dung môi .................................. 85
Bảng 3.9. Kết quả định tính polysaccharide khi trích ly bằng hai dung môi...................... 85
Bảng 3.10. Kết quả định tính triterpenoid khi trích ly bằng hai dung môi ......................... 86

10. Đồ án tốt nghiệp
vii
Bảng 3.11. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính thành phần hóa học trong dịch phá
vỡ bằng hai dung môi ................................................................................................................ 86
Bảng 3.12. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly vỏ bào tử......... 87
Bảng 3.13. Kết quả định tính saponin theo thử nghiệm tạo bọt, Fontan - Kaudel khi
trích ly vỏ bào tử......................................................................................................................... 88
Bảng 3.14. Kết quả định tính polysaccharide theo thử nghiệm Molisch khi trích ly vỏ
bào tử ........................................................................................................................................... 87
Bảng 3.15. Kết quả định tính triterpenoid theo thử nghiệm Liebermann-Burchard khi
trích ly vỏ bào tử......................................................................................................................... 88
Bảng 3.16. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính phần vỏ bào tử................................... 88
Bảng 3.17. Bảng tổng kết các thử nghiệm tất cả các pha khi trích ly dịch phá vỡ bào tử
và vỏ bào tử................................................................................................................................. 89
Bảng 3.18. Hàm lượng polysaccharide có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ
100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm ....................... 91
Bảng 3.19. Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide trong hai pha khi trích ly lỏng
lỏng dịch phá vỡ bào tử bằng diethyl ether và hexane từ 100 g bào tử không siêu âm và
siêu âm ......................................................................................................................................... 92
Bảng 3.20. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử
phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm ............................................. 92
Bảng 3.21. Giả sử hàm lượng polysaccharide tổng và lipid trong mẫu không siêu âm là
100% từ đó tính ra được% polysaccharide tổng và lipid của các mẫu còn lại nhằm so
sánh ảnh hưởng của siêu âm lên hàm lượng polysaccharide và lipid trong bào tử nấm
Linh Chi....................................................................................................................................... 93
Bảng 3.22. Tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của đối chứng dương Trolox............... 97
Bảng 3.23. Tỉ lệ phần trăm (%) quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào tử ................ 97
Bảng 3.24. Bảng giá trị IC50 (µg/ml) của các mẫu dầu bào tử............................................ 98
Bảng 3.25. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất
trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của PHC SA (mg/ml) ......................................101

11. Đồ án tốt nghiệp
viii
Bảng 3.26. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất
trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của BT SA (mg/ml) .........................................102

12. Đồ án tốt nghiệp
ix
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A), nấm mọc trong tự nhiên (B) và
nấm trồng (C).................................................................................................................................5
Hình 1.2. Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần ....................... 11
Hình 1.3. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum......................... 11
Hình 1.4. Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi............................................... 12
Hình 1.5. Cấu trúc của Ganodermasides ................................................................................. 14
Hình 1.6. Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi ............................. 17
Hình 1.7. Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự,
1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48:
2905-7;Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự,
1989). ................................................................................................................................... 19
Hình 1.8. Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi
(Bingji Ma và cộng sự, 2011)................................................................................................... 20
Hình 1.9. Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự,
2011)............................................................................................................................................ 21
Hình 1.10. Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi ........................ 26
Hình 1.11. Cấu trúc chitin ......................................................................................................... 31
Hình 1.12. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ......................................................... 32
Hình 1.13. Quá trình phân hủy chitin thành chitosan và cellulose ...................................... 33
Hình 1.14. Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí ............................................ 36
Hình 1.15. Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh................................................................. 38
Hình 1.16. Máy phá mẫu, tế bào bằng sóng siêu âm Qsonica Q500 ................................... 39
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm............................................................................................. 54
Hình 2.2 Sơ đồ thu enzyme chitinase bằng môi trường lên men thể rắn ............................ 54
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử
nấm Linh chi ............................................................................................................................... 57
Hình 2.4. Buồng đếm hồng cầu Neubauer .............................................................................. 58
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử................. 60

13. Đồ án tốt nghiệp
x
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học ....................................................................................................................... 62
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình trích ly bào tử sau khi phá vỡ ........................ 64
Hình 2.8. Phương trình phản ứng định tính polysaccharide ................................................. 66
Hình 3.1. Đường kính vòng phân giải enzyme chitinase thu được từ hai môi trường cơ
chất (mm) ................................................................................................................................... 73
Hình 3.2. Khả năng phân giải chitin của enzyme thu được từ hai môi trường................... 74
Hình 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm
Linh chi qua các ngày ................................................................................................................ 76
Hình 3.4. Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi (X400)............................................... 76
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi . 77
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phá vỡ (%) bào tử nấm Linh chi qua các chế độ tiền xử
lí ................................................................................................................................... 79
Hình 3.7. Hai pha dịch trích ly lỏng lỏng bằng diethyl ether ............................................... 81
Hình 3.8. Biểu đồ polysaccharide tổng (%) có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ
100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm ....................... 92
Hình 3.9. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá
vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm. ................................................... 93
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của siêu âm đến hàm lượng polysaccharide
tổng số và lipid có trong bào tử nấm Linh chi sau khi phá vỡ. ............................................ 94
Hình 3.11. Quy trình đề nghị phá vách bào tử nấm Linh chi kết hợp enzyme và siêu
âm ................................................................................................................................... 96
Hình 3.12. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào
tử ................................................................................................................................... 98
Hình 3.13 Đường chuẩn DPPH của mẫu pha hữu cơ không siêu âm và siêu âm .............. 99
Hình 3.14 Đường chuẩn DPPH của mẫu bào tử không siêu âm và siêu âm....................... 99
Hình 3.15. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 (g/ml) của các mẫu dầu bào tử........................100
Hình 3.16. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào
tử PHC SA (mg/ml) .................................................................................................................102

14. Đồ án tốt nghiệp
xi
Hình 3.17. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào
tử BT SA (mg/ml) ....................................................................................................................103

15. Đồ án tốt nghiệp
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tính cấp thiết của đề tài
Từ xưa đến nay, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được cho là một loại dược
liệu và đã có không ít người sử dụng làm thuốc. Theo các tài liệu nghiên cứu, nấm
Linh chi có nhiều công dụng trong việc hỗ trợ điều hòa huyết áp, tăng khả năng miễn
dịch cho cơ thể, hỗ trợ giải độc và cải thiện bệnh viêm gan mãn tính, xơ gan, thần kinh
suy nhược. Có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt
chất và xác định tác dụng dược lý của nấm Linh chi như: Germanium, acid ganoderic,
acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans, adenosin, beta – D – glucan…
(đặc biệt trong nấm Linh chi có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 -
8 lần). Các nhà khoa học Việt Nam tìm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố
vi lượng cần thiết cho sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể như: đồng, sắt, kalium,
magnesium, natrium, calcium. Trong đó, triterpenoid và polysaccharide được xem là
thành phần chủ yếu có trong nấm được chú ý nhiều nhất. Chính vì lí do đó mà hiện
nay việc trồng và sử dụng nấm Linh chi đang trở nên rất phổ biến và được nhiều người
quan tâm.
Bên cạnh đó, phần bào tử do nấm Linh chi phóng thích ra cũng có nhiều công
dụng bổ ích nhưng lại ít được quan tâm nghiên cứu trích ly hoạt chất. Bào tử nấm Linh
chi được cho là tinh chất của nấm Linh chi chứa nhiều chất dinh dưỡng và các đặc tính
dược lý, là sản phẩm rất tốt cho sức khỏe. Tuy nhiên, cấu tạo bào tử nấm Linh chi gồm
2 lớp vỏ cứng, việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi để thu triệt để hoạt chất bên trong bào
tử là điều đáng được quan tâm.
Ngày nay đã có các phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng
cơ học kết hợp enzyme… Phương pháp phá vỡ sử dụng biện pháp cơ học vẫn chưa
mang lại hiệu quả tối ưu. Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đại
học Vũ Hán, Trung Quốc (2007), vách bào tử nấm Linh chi chứa 57,64% là chitin,
việc sử dụng enzyme chitinase và cellulase trong việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi là
bước không thể thiếu. Nhóm sinh viên HUTECH đã phân lập nấm Trichoderma từ
nấm Linh chi phục vụ cho việc phá vách bào tử. Ngoài ra, việc kết hợp với enzyme

16. Đồ án tốt nghiệp
2
thương mại giúp phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi, kết quả đã đạt được từ nghiên cứu
của sinh viên Nguyễn Thanh Liên Khương (khóa 13DSH) là 53.5%. Trong khi đó để
tăng hiệu suất phá vỡ thì việc ứng dụng siêu âm giúp tăng tỉ lệ phá vỡ đến 74.3%. Vì
muốn góp phần nâng cao tỉ lệ phá vỡ và chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào
tử nấm Linh chi, nên nhóm thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu các chế độ tiền xử và
áp dụng siêu âm trước và sau khi ủ bào tử với dịch enzyme. Kết quả được trình bày
trong đồ án tốt nghiệp “Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi
Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm”.
Mục đích: Thu hồi hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi.
Mục tiêu: Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum
kết hợp enzyme và siêu âm.
Nội dung:
- Chọn môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase từ Trichoderma
harzianum T2.
- Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm và enzyme lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh
chi.
- Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý lên tỉ lệ phá vỡ bào tử.
- Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học, hoạt tính sinh học
của bào tử nấm Linh chi.
Kết quả đạt được của đề tài:
- Xác định môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase để phá vỡ bào tử
nấm Linh chi.
- Thiết lập được chế độ tiền xử lý bào tử trước khi phá vỡ.
- Thiết lập được quy trình phá vỡ bào tử kết hợp enzyme và siêu âm.
- So sánh được thành phần polysaccharide tổng và lipid tổng của bào tử phá
vỡ bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.
- So sánh được hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết từ bào tử phá vỡ bằng
enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.

17. Đồ án tốt nghiệp
3
- Xác định được độc tính tế bào trên Artemia của cao chiết từ bào tử phá vỡ
bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.
Hạn chế của đề tài:
- Chưa tối ưu hóa được thông số phản ứng enzyme như vận tốc khuấy đảo
quy mô Phòng thí nghiệm.
- Chưa tối ưu hóa được thông số siêu âm do hạn chế về thiết bị.
- Hạn chế về việc khảo sát triterpenoid và các thành phần hoá học, hoạt tính
sinh học khác của bào tử phá vỡ.
Phương pháp nghiên cứu
- Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm.
- Đề tài được xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals
Analysis Systems (SAS).

18. Đồ án tốt nghiệp
4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi
1.1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi
Nấm Linh chi (tiếng Anh: Lingzhi mushroom) có tên khoa học là Ganoderma
lucidum, thuộc họ Nấm Lim (Ganodermataceae). Nấm Linh chi còn có những tên khác
như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung... được phân bố rộng rãi ở các nước Á
Đông và thường mọc trên các thân cây khô hoặc đã chết. Ở một số nước Châu Á như
Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan… nấm Linh chi được sử dụng như một loại dược
thảo thiên nhiên giúp cải thiện sức khỏe, tăng cường khả năng kháng tế bào ung thư...
Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ ngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ.
Trong tiếng Latin thì lucidus có nghĩa là “sáng bóng” hay “rực rỡ” và điều này cũng
tương thích với hình dáng bên ngoài của nấm Linh chi. Ở mỗi nơi nấm Linh chi được
gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji
(Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan). Ngoài ra còn một số tên gọi khác như nấm vạn
niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc). Theo 2 cuốn sách rất nổi tiếng mô
tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing – Thần Nông Bản
Thảo Kinh” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán), tác phẩm chuyên
tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật từ đời Hán trở về trước và “Ben Cao
Gang Mil – Bản Thảo Cương Mục” của “Li Shi Zhen – Lí Thởi Trân” (1590 trước
Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm
lúc bấy giờ. Trong đó có hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập. Tuy nhiên, trong các
văn bản cổ chỉ đề cập nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi đỏ.

19. Đồ án tốt nghiệp
5
Hình 1.1: Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A),
nấm mọc trong tự nhiên (B) và nấm trồng (C)
1.1.1.1. Phân loại
Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010)
Giới: Nấm – Mycota hay Fungi
Ngành: Nấm thật – Eumycota
Ngành phụ: Basidiomycotina
Lớp: Hymenomycetes
Lớp phụ: Hymenomycetidae
Bộ: Ganodermatales
Họ: Ganodermataceae
Chi: Ganoderma

20. Đồ án tốt nghiệp
6
Loài: Ganoderma lucidum
Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây) đã
tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại nấm
Linh chi. Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm Linh chi thành rất
nhiều loại khác nhau dựa vào thể quả cũng như hình dáng bên ngoài của nấm.
Ở phương Tây, theo trình định danh có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này.
Kể từ lần đặt tên đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học
Phần Lan xác định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst đã mất
đến 100 năm (1881). Kể từ đó nấm Linh chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu biểu cho
chủng loại nấm này. Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh chi đã được thay đổi
bởi một số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano và Steyaert, ... sau khi họ đã
tìm ra những đặc tính khác của nấm Linh chi như các bào tử của nấm Linh chi có hình
quả trứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp
trong của thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ. Cũng từ đó, nấm
Linh chi không còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa.
Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y
Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu
sắc và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi.
- Xích Chi - Nấm Linh chi đỏ: còn được gọi là Đơn chi, Hồng chi có vị đắng,
thường được tìm thấy ở trên núi Huo. Ganoderma lucidum là đại diện chính cho loài
nấm này. Những đặc điểm của nấm Linh chi đỏ chính là nắp nấm có hình dạng giống
như quả thận hoặc hình bán nguyệt, màu nâu đỏ. Thân nấm có dạng giống như một
thân cây, cùng màu hoặc đậm hơn so với nắp nấm. Nấm Linh chi đỏ giúp ích tâm khí,
chủ vị, tăng trí tuệ. Sử dụng Linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh
các bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực.
- Tử chi - Nấm Linh chi tím: còn được biết đến với tên gọi là Linh chi gỗ, màu tím
có vị ngọt. Đặc điểm của loại nấm này là nắp nấm có màu nâu hoặc nâu tím. Thể quả
có màu nâu, bào tử của chúng lớn hơn nấm Linh chi đỏ. Ganoderma sinense là đại

21. Đồ án tốt nghiệp
7
diện của loài nấm này. Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi
đẹp.
- Hoàng chi - Linh chi vàng: còn gọi là Kim chi, loại nấm này có màu vàng tím, có
vị ngọt. Một cây nấm lớn có thể nặng khoảng 5 kg hoặc hơn, còn cây nấm non thì
nặng khoảng 1,5 đến 2 kg. Laetiporus sulphureus là đại diện của loài nấm này. Khi
tươi thì nấm này sẽ chứa rất nhiều nước, có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần.
- Bạch chi - Linh chi trắng: còn gọi là nấm Linh chi ngọc bích, có màu trắng. Theo
như Bao Puzi mô tả thì đây là loại nấm không có chất béo, Fomitopsis officinalis là đại
diện cho loài nấm này. Loại nấm này có thể quả màu trắng, hình dáng giống như một
cái móng ngựa. Một cây nấm lớn có thể nặng đến nhiều kilogram. Loại nấm này
thường mọc trên cây thông và một số loại cây lá kim khác. Bạch chi có vị cay, tính
bình, không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi.
- Hắc chi - Linh chi đen: còn gọi là nấm Linh chi xuân hay Huyền chi có màu đen
và vị mặn. Loại nấm này thường mọc ở trong những thung lũng, nắp nấm bên ngoài có
màu đen bên trong có màu đỏ, thường mọc trên các thân cây, có vị mặn và đắng.
Amauroderma rugosum và Polyporus melanopus là 2 đại diện chính của loài nấm này.
Cả cuống và nắp của 2 loại nấm này đều có màu đen. Hắc chi có tác dụng ích thận khí,
khiến cho đầu óc sản khoái và tinh tường.
- Thanh chi – Linh chi xanh: còn gọi là nấm Linh chi rồng. Theo Bao Puzi miêu tả
thì nấm Linh chi xanh có hình dáng giống như những sợi lông của chim bói cá.
Coriolus versicolar là đại diện tiêu biểu cho loài nấm này. Đặc điểm của loài này là
mũ nấm cứng và bề mặt được bao phủ bởi những sợi lông ngắn. Thanh chi giúp cho
sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng
và thoải mái.
Trong mỗi loài nấm Linh chi lại được chia ra rất nhiều loại khác nhau. Ví dụ như
nấm Linh chi đỏ thì có Ganoderma lucidum và Ganoderma tsugae được biết đến nhiều
nhất. Đối với Linh chi tím thì có Ganoderma neojaponicum và Ganoderma sinense.
Tuy nhiên, trong lĩnh vực trồng trọt, y dược và nha khoa, người ta chỉ tập trung nghiên
cứu 2 loại đó là Linh chi đỏ và Linh chi tím.

22. Đồ án tốt nghiệp
8
Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học Nhật
Bản chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khác
loại mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau. Nếu thay đổi điều kiện người ta
có thể có được sáu loại từ cùng một giống.
Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại Linh
chi theo các đặc điểm như:
 Vị trí nấm mọc trên cơ chất chủ.
 Nhóm mọc cao: tai nấm mọc từ gốc lên đến ngọn cây.
 Nhóm mọc gần đất : nấm mọc từ gốc cây chủ.
 Nhóm mọc từ đất : tai nấm mọc từ rễ cây hoặc xác mùn.
 Nhiệt độ ra nấm.
 Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 200C – 230C.
 Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 240C – 260C.
 Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 270C – 300C.
Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đa
dạng về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N. 189). Linh chi
thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là
Ganoderma Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là
Ganoderma lucidum có tới 45 loại.
Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công
trong phòng thí nghiệm năm 1978. Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ
đặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào
nuôi trồng chủ động.
1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi
Về hình thái ngoài, chúng cũng có ít nhiều sai khác:
- Cuống nấm: dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống
nấm ít phân nhánh, đôi khi uốn khúc. Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen,
bóng, không có lông phủ trên mặt tán nấm.

23. Đồ án tốt nghiệp
9
- Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt. Mũ nấm dạng thận – gần tròn,
đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có
tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu
đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có
đầu sợi dày thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 – 10 μm. Chính những tế bào
vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm. Lớp vỏ láng phủ suốt
theo cuống. Kích thước tán biến động từ 2 – 30 cm, dày 0,8 – 2,5 cm, cuống dài từ 2,5
- 3,5 cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2 cm). phần đính cuống hoặc gồ
lên hoặc lõm như lõm rốn. Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8 cm màu vàng kem – nâu nhạt –
trắng. Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ. Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận
cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ
trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh trong
cồn. Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được mưa,
nắng. Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào .
- Thụ tầng: Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ
0,2 – 1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5
ống/mm. Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không
màu, dài 16 - 22μm. Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpore) phồng căng
hay lõm thụt vào mà thành.
1.1.2. Bào tử nấm Linh chi
Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử,
tức là hạt giống hữu ích cho đời sau. Bào tử thường được mô tả có dạng trứng cụt. Đôi
khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn - nhọn. Thực ra đó là do chụp
phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành. Mỗi bào tử được
bao phủ với hai lớp vách rất khó phá vỡ gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàng
mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích
thước bào tử rất nhỏ dao động khoảng từ 6,5 x 8,0 µm đến 9,6 x 12,6 µm. Vách bào tử
gồm hai lớp liên kết giữa exosporium và endosporium, có độ dày 0,8 x 1,0 µm và 11 x
14 µm, có cấu trúc phức tạp. Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vách rất cứng, khó nảy

24. Đồ án tốt nghiệp
10
mầm (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016). Một số nghiên cứu về kích thước bào
tử nấm Linh chi được trình bày trong bảng dưới đây (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác
nhau (Lê Xuân Thám, 1996)
Nguồn Kích thước bào thử (μm) Vùng thu mẫu
1889, Patouuillard 10 – 12 x 6 – 8 Đông Dương
1939, Imazeki 9,5 – 11 x 5,5 – 7 Nhật Bản
1964, Teng 8,5 - 11,5 x 5 – 6,5 Trung Quốc
1972, Steyaert 8,5 – 10,8 – 13 x 5,5 – 8,5 Indonesia, Úc châu
1973, Pegler và cộng sự 9 – 13 x 6 – 8 Anh Quốc
1976, Ryvarden 7 – 12 x 6 – 8 Bắc Âu, Phi châu
1980, Ryvarden và cộng
sự
7 – 12 x 6 – 8 Đông Phi châu
1981, Kiet 7,5 – 10 x 5 – 6,5 Bắc Việt Nam
1982, Bazzalo và cộng sự 9 – 13 x 5 – 7 Argentine
1986,Melo 8,2 – 11,5 – 13,5 x 6,5 – 7,5 – 8,1 Bồ Đào Nha
1986, Gibertson và cộng
sự
9 – 12 x 5,5 – 8 Bắc Mỹ
1986, Adaskaveg và cộng
sự
10 – 11,8 x 6,8 – 7,8 Bắc Mỹ
1987, Peterson 7 – 8 x 6 – 7,8 Bắc Âu
1989, Zhao 9 – 11 x 6 – 7 Trung Quốc
1990, Hseu 8,5 – 11,5 x 5 – 7 Đài Loan
1994, Thu 9 – 12 x 5 – 7 Hà Bắc, Việt Nam
1994, Tham và cộng sự 8 – 10,5 x 5 x 7 Lạng Sơn, Việt Nam
1996, Tham 7,5 – 11,5 x 5,5 – 7 Đà Lạt, Việt Nam
Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử
bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất mịn.

25. Đồ án tốt nghiệp
11
Tuy vậy số lượng bào tử Linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ thu
được 1 kg bào tử.
Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu
tạo tinh vi của bào tử thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung
Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt.
a) b)
Hình 1.2. Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần
a) Bào tử nấm Linh chi chưa bị phá vỡ
b) Bào tử nấm Linh chi bị phá vỡ vách
Hình 1.3. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum

26. Đồ án tốt nghiệp
12
Hình 1.4. Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi
1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử).
2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ
múi ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma)
Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cản
quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học. Cấu trúc của lớp vỏ
trong cho đến nay còn chưa được biết rõ. Cần lưu ý rằng: khái niệm – “gai chống nhọn”
từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác.
Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành
các u lồi - và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium,
exosporium hay chính là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt - mụn cóc - u
nhú trên bề mặt vỏ bào tử. Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973),
Mims và cộng sự (1989) đã từng phân tích và thảo luận nhiều.
1.2. Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi
Trong đề tài nghiên cứu năm 2005 của Nguyễn Minh Khang, thành phần dược
tính của nấm Linh chi được phân như sau:
Bảng 1.2. Thành phần dược tính của nấm Linh chi

27. Đồ án tốt nghiệp
13
Chất Hàm lượng
Nước 12 - 13%
Cellulose 54 - 56%
Lignin 13 - 14%
Hợp chất nitơ 1,6 – 2,1%
Chất béo (kể cả dạng xà phòng hóa) 1,9 - 2%
Hợp chất phenol 0,08 – 0,1%
Hợp chất Sterol toàn phần 0,11 – 0,16%
Saponin toàn phần 0,3 – 1,23%
Theo Wachtel Galor và cộng sự (2011) trong nấm Linh chi tươi, nước là thành
phần chủ yếu chiếm 90% khối lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10- 40%,
chất béo chiếm từ 2 - 85%, carbonhydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm
lượng tro chiếm 8 - 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác như kali, can-
xi, phốt pho, ma-giê, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers và
cộng sự, 1999). Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau và cộng sự
(2001) đã xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm Linh chi gồm: tro
(1,8%), carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 -
8%). Hàm lượng của protein trong nấm Linh chi khoảng 7 - 8%, thấp hơn so với nhiều
loại nấm khác (Chang và cộng sự, 1996; Mau và cộng sự, 2001). Đặc biệt thành phần
protein của nấm Linh chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine.
Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo không bão hòa nhiều nối đôi,
đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người (Chang và cộng sự, 1996;
Borchers và cộng sự, 1999; Sanodiya và cộng sự, 2009). Ngoài ra trong nấm còn chứa
các glycoprotein và các polysaccharide.
Bên cạnh đó, nấm Linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học
như các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của
chúng. Hoạt tính sinh học của nấm Linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide,
peptidoglycan và các triterpene mang lại (Boh và cộng sự, 2007; Zhou và cộng sự,
2007).

28. Đồ án tốt nghiệp
14
Địa điểm sinh trưởng của nấm Linh chi cũng được xem là yếu tố ảnh hưởng đến
hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Trong một nghiên cứu về
hoạt tính sinh học của 11 mẫu sản phẩm nấm Linh chi được trồng ở Nhật Bản, người ta
nhận thấy sự chênh lệch về hàm lượng triterpenoid giữa các mẫu dao động trong
khoảng từ 0 – 7,8% và hàm lượng các polysaccharide dao động trong khoảng từ 1,1 -
5,8% (Lu và cộng sự, 2012). Sự khác nhau về hàm lượng của các hoạt tính sinh học
trong các sản phẩm thương mại cũng chịu ảnh hưởng bởi quá trình chế biến hoặc chiết
xuất, qua đó cho thấy chiết xuất bằng nước sẽ cho hàm lượng triterpenoid ít hơn khi
chiết xuất bằng ethanol (Lu và cộng sự, 2012). Bên cạnh đó, điều kiện sinh trưởng cũng
ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi (Lu và
cộng sự, 2012).
Trước kia, việc thu thập bào tử Ganoderma lucidum rất khó nên điều này làm cho
việc nghiên cứu chức năng cũng như các hoạt chất sinh học có trong bào tử cũng trở
nên khó khăn, do đó cũng chỉ tập trung nghiên cứu vào thể quả của nấm Linh chi. Hiện
nay, việc trồng nấm Linh chi đã trở nên phổ biến hơn, việc thu thập dễ dàng cũng tạo
nhiều điều kiện để nghiên cứu về bào tử Ganoderma lucidum. Ganodermasides A, B, C
và D là dẫn xuất ergosterol phân lập từ chiết xuất methanol của bào tử Ganoderma
lucidum (Jue Wang và cộng sự, 2017). Cấu trúc của Ganodermasides A, B, C và D
được thể hiện trong hình 1.5.

29. Đồ án tốt nghiệp
15
Hình 1.5. Cấu trúc của Ganodermasides
A, B, C và D. 1 đại diện cho A, 2 đại diện cho B, 3 đại diện cho C, 4 đại diện cho
D; 1: R 1 = H, R 2 = OH, R 3= H; 2: R 1 = H, R 2 = H, R 3 = OH; 3: R 1 = OH, R 2 ,
R 3 = O;
4: R 1 = OH, R 2 = H, R 3 = H.
Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi: Polysaccharide,
triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng,… với hàm lượng
đậm đặc hơn Linh chi từ 7 - 20 lần (Cheng CR và cộng sự, 2010). Bào tử nảy mầm có
hoạt tính sinh học cao hơn bào tử không nảy mầm, có thể thấy việc thu các hợp chất
sinh học phụ thuộc vào việc vách bào tử có bị vỡ hay không (Carlos Ricardo Soccol và
cộng sự, 2016).
Bảng 1.3. Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li
JJ và cộng sự, 2014)
Hàm lượng Polysaccharides Triterpenoids Protein
Thể quả nấm 0,25% - 1,42% 0,44% - 1,42% 1,82% - 3,67%
Bào tử còn nguyên 0,41% - 0,91% 0,09% - 0,12% 0,78% - 0,90%
Bào tử phá vỡ 1,03% - 2,25% 1,89% - 3,15% 0,96 % - 1,04%
1.2.1. Các polysaccharide và các peptidoglycan
Hàm lượng carbonhydrate và hàm lượng chất xơ có trong nấm Linh chi được xác
định lần lượt từ 26 - 28% và 59% (Mau và cộng sự, 2001). Hàm lượng carbohydrate
trong bào tử Ganoderma lucidum bị phá vỡ là 1,57% ± 0,06% cao hơn so với bào tử
còn nguyên là (0,41% ± 0,01%) (Yue và cộng sự, 2008).
Nấm Linh chi có chứa rất nhiều polysaccharide có khối lượng phân tử lớn, các
hợp chất này mang hoạt tính sinh học và được tìm thấy ở tất cả các bộ phận của nấm
Linh chi. Nhiều nhóm polysaccharide có thể được chiết xuất từ thân nấm, bào tử và
khuẩn ty. Các polysaccharide của nấm Linh chi có tác dụng sinh học như chống viêm,
hạ đường huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u và tăng cường khả năng

30. Đồ án tốt nghiệp
16
miễn dịch (Miyazaki và cộng sự, 1981; Hikino và cộng sự, 1985; Tomoda và cộng sự,
1986; Bao và cộng sự, 2002; Wachtel Galor và cộng sự, 2004). Người ta thường chiết
xuất các polysaccharide trong nấm Linh chi bằng nước nóng sau đó tiến hành kết tủa
chúng bằng dung dịch ethanol hoặc methanol. Đôi khi cũng có thể chiết xuất bằng nước
và dung dịch kiềm. Theo kết quả phân tích, thành phần chủ yếu trong polysaccharide
của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum - polysaccharides: GL - PSs) là đường glucose
(Bao và cộng sự, 2002; Wang và cộng sự, 2002). Ngoài ra, GL - PSs cũng có cấu trúc
polymer mạch thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị trí
liên kết p hoặc a khác nhau như 1 - 3, 1 - 4 và 1 - 6 với các dạng đồng phân - D hay L
(Lee và cộng sự, 1999; Bao và cộng sự, 2002). Khả năng chống lại sự hình thành khối u
của GL - PSs phụ thuộc vào cấu hình mạch nhánh cũng như tính tan của polysaccharide
này (Bao và cộng sự, 2002; Zhang và cộng sự, 2001). Ngoài ra, nấm Linh chi cũng có
chứa một mạng lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể người không tiêu hóa được và
đóng vai trò tạo nên độ cứng cho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000).
Có rất nhiều peptidoglycan có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi đã được
phân lập, bao gồm proteoglycan (GLPG) có tác dụng kháng virus (Li và cộng sự,
2005), tăng cường miễn dịch (Ji và cộng sự, 2007) và F3 là một glycoprotein trong cấu
trúc có chứa fucose (Chien và cộng sự, 2004).

31. Đồ án tốt nghiệp
17
Hình 1.6. Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi
1.2.2. Triterpenes
Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là một bội số của 5, ví dụ
như menthol (monoterpene) và β - carotene (tetraterpene). Phần lớn các terpenoid thuộc
nhóm alkene, một số có chứa những nhóm chức năng, đa phần các terpenoid có cấu
trúc mạch vòng. Những hợp chất này được tìm thấy trên rất nhiều loài thực vật.
Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm
hàm lượng chất béo. Terpenoid được tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch
quả, ví dụ như hương thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có

32. Đồ án tốt nghiệp
18
tác dụng tăng cường sức khỏe (Mahato và cộng sự, 1997; Mashour và cộng sự, 1998;
Haralampidis và cộng sự, 2002).
Triterpene là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30. Khối
lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và
có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato và cộng sự, 1997; Zhou và cộng sự, 2007). Nhiều
loài cây có khả năng tổng hợp triterpene trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Một
số có chứa nhiều triterpene trong nhựa, qua đó giúp các cây này chống lại các loại
bệnh. Mặc dù có hàng trăm loại triterpene đã được phân lập từ rất nhiều loại thực vật
khác nhau và phân nhóm này cũng đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhưng hiện nay
có rất ít những ứng dụng của triterpene được sử dụng trong thực tế.
Trong nấm Linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là
chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình
thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis và cộng sự, 2002). Trong quá trình
chiết xuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol,
ethanol, acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng. Dịch chiết sau đó sẽ
được phân tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường
hoặc HPLC pha nghịch đảo (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001). Những
triterpene đầu tiên được Kubota phân tách từ nấm Linh chi là ganoderic acid A và B
(Kubota và cộng sự, 1982). Kể từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của
chúng đã được tìm ra. Trong số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong
nấm Linh chi. Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có
một số loại khác như là ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Nishitoba và cộng
sự, 1984; Sato và cộng sự 1986; Budavari và cộng sự, 1989; Gonzalez và cộng sự
1999; Ma và cộng sự 2002; Akihisa và cộng sự 2007; Zhou và cộng sự 2007; Jiang và
cộng sự 2008; Chen và cộng sự 2010).

33. Đồ án tốt nghiệp
19
Hình 1.7. Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự,
1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48:
2905-7; Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự,
1989).
Nấm Linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần
tạo nên vị đắng của nấm Linh chi. Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức
khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể. Tuy
nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm Linh chi lại không ổn định. Chúng phụ thuộc rất
nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế biến,
điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành vào
năm 1999 và 2001 (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001).
Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được tìm thấy từ thể quả của nấm Linh chi
đại diện cho năm lớp cấu trúc chính. So với thể quả của nấm Linh chi, các nghiên cứu
về bào tử của nấm Linh chi mới bắt đầu từ năm 1988 (Hou CY và cộng sự, 1988) và có
29 loại triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này. Với những tiến bộ gần đây
trong quang phổ và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập
từ các bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và
dược sĩ. Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổng
hợp tương tự nhau, cụ thể là con đường acid movalonic (MVA) (Bingji Ma và cộng sự,
2011). Các Triterpenoids này được bắt đầu từ trans - squalene và sau đó đã được thay

34. Đồ án tốt nghiệp
20
đổi bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấu
hình triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi.
Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1
protease, chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung. Triterpenoids này là thành
phần hoạt chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khác
nhau được sử dụng trong dược liệu.
Hình 1.8. Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi
(Bingji Ma và cộng sự, 2011)

35. Đồ án tốt nghiệp
21
Hình 1.9. Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và
cộng sự, 2011)
Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi: năm triterpenoids thu được
từ phần tan trong ether của bào tử của nấm Linh chi và trên cơ sở tính chất hóa học và
dữ liệu quang phổ, acid ganopsoreric A (1), acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3),

36. Đồ án tốt nghiệp
22
acid ganoderic E (4) và ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma và
cộng sự, 2011). Thí nghiệm dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTP
thấp đối với gan chuột bị tổn thương bởi CC14 và GaNI (Chen RY và cộng sự, 1993).
Hai triterpenoids pentacyclic mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập
từ bào tử của nấm Linh chi, có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việc
hình thành liên kết C18 và C23 (Chen RY và cộng sự, 1991). Hai triterpenes lanostane
kiểu mới, lucidumol A (8) và p - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) và
bảy triterpenoids đã biết, ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A
(13), acid ganolucidic A (14), và 2, 3, 5. Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất 5,
10, 11 và 14 cho thấy khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV) - 1
protease hoạt động đáng kể với giá trị IC50 với giá trị 20 - 90 μM (Min BS và cộng sự,
1998).
6 loại lanostane - triterpenes mới có tính oxy hoá cao, được gọi là ganoderic acid
γ (15), acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acid
ganoderic η (19), acid ganoderic θ (20), cùng với ganolucidic acid D (21) và acid
ganoderic C2 (22) thu được từ các bào tử nấm. Các khả năng gây độc của các hợp chất
15 - 21 đã được thực hiện in vitro chống dòng tế bào ung thư Meth - A và LLC (Min
BS và cộng sự, 1998). Một terpenoid C27 có hoạt tính oxy hóa cao mới, lucidenic axit
SP1 (23), thu được từ một phần CHCl3 - tan của bào tử nấm Linh chi cùng với 11
triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12, 13,
14 (Bingji Ma và cộng sự, 2011).
1.2.3. Saponin
Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo - xà phòng (vì tạo bọt như xà
phòng), là một nhóm glycosid lớn, được tìm thấy rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng
phân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao.
Saponin có một số tính chất đặc biệt:
- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá
và tẩy sạch.
- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.

37. Đồ án tốt nghiệp
23
- Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất
các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán,
ốc sên.
- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao
gây nôn mửa, đi lỏng.
- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b -hydroxysteroid khác.
Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin. Ví dụ:
sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol.
Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid
trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt.
Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta
dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì acetate, bari
hydroxyde, ammoni sulfat.
Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin
trong quá trình chiết xuất. Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin
thường dễ kết tinh hơn saponin. Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid,
saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm.
Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin triterpenoid
và saponin steroid.
1.2.4. Acid béo
Người ta thu được lipid của bào tử bị phá vỡ bằng sắc kí lỏng CO2 siêu tới hạn
tìm thấy có 15 loại acid béo, các hợp chất chính là acid palmitic (6,12%), acid stearic
(4,97%), acid oleic (67,11%) và acid linoleic (9,63%) (Gao P và cộng sự, 2012). Chen
và cộng sự (2013) đã xác định và định lượng 9 acid béo, phần lớn trong số đó là acid
oleic (C18:1; 57,5%), acid linoleic (C18:2; 13,4%), acid palmitic (C16:0; 19,6% ), acid
hexadecenoic (C16:1; 2,2%), và acid linolenic (C18:3; 0,5%) và Liu và cộng sự
(2007) xác định được 18 acid béo. Hoạt tính của acid béo thu được từ bào tử gồm acid
nonadecanoic và acid cis-9-nonadecenoic có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào khối u
và gây độc cho tế bào hồng cầu (HL-60) (Gao P và cộng sự, 2012).

38. Đồ án tốt nghiệp
24
1.2.5. Các thành phần khác
Tiến hành phân tích thân nấm Linh chi, người ta còn tìm thấy thành phần chất
khoáng như phospho, silicon, sulfur, kali, calcium và magnesium chiếm một tỉ lệ khá
cao. Bên cạnh đó còn có sắt, nhôm, kẽm, đồng, mangan và strontium với hàm lượng
thấp hơn. Ngoài ra còn có một số kim loại nặng như chì, cadmium và thủy ngân (Chen
và cộng sự, 1998). Trong một nghiên cứu của Chiu được tiến hành vào năm 2000, khi
phân tích nấm Linh chi hoang thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định được trong
hàm lượng chất khoáng của loại nấm này có chứa 10,2% là kali, calcium và
magnesium. Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấy
cadmium và thủy ngân trong những mẫu nấm Linh chi, nhưng hàm lượng selenium
được xác định là 72 pg/g.
Trong thành phần của nấm Linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận
được rất nhiều sự quan tâm, đó là germanium. Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5
trong các chất khoáng (489 pg/g) có trong nấm Linh chi. Chất này tồn tại rất ít ở các
loại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội
và tỏi (Mino và cộng sự, 1980). Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu,
nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch,
kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến (Kolesnikova và cộng sự, 1997).
Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm Linh chi đó là các loại
enzyme như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đông
máu). Ngoài ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (như
adenosine và guanosine) (Wasser và cộng sự, 2005; Paterson và cộng sự, 2006; Kim và
cộng sự, 2004). cũng đã được tìm thấy trong nấm Linh chi, đây là những hợp chất có
tác dụng ức chế thuận nghịch a-glucosidase và SKG-3.
Trong lớp vách sporoderm còn phát hiện được các chất vô cơ như magie, nhôm,
silicon, phosphate, lưu huỳnh, clo, kali, canxi, sắt và niken, một số chất có hàm lượng
cao như silicon (19,01%) và canxi (24,31%) (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016).
1.3. Công dụng của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi
Một số dạng sản phẩm từ nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi đang có hiện nay:

39. Đồ án tốt nghiệp
25
- Trà túi lọc nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể,
điều hòa tim mạch, hạ cholesterol, phòng và chống viêm gan, an thần, tăng trí nhớ,
tăng tuổi thọ.
- Bột Nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe và hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh ung thư, xơ
gan, điều hòa huyết áp, tiểu đường, tăng cường hệ miễn dịch, chống lão hóa…
- Viên nang dầu bào tử: Chống oxy hóa, trung hòa các gốc tự do, giảm Cholesterol
trong máu, chống xơ vữa động mạch, ổn định huyết áp, giải độc gan. Chữa mất ngủ,
giúp da dẻ mịn màng, giảm sạm nám tàn nhang. Hỗ trợ tăng hồng cầu cho bệnh nhân
ung thư. Giúp đào thải độc tố trong gan cho bệnh nhân ung thư, bệnh mãn tính, người
hay tiếp xúc rượu bia, stress.
- Bột bào tử nấm Linh chi: Tăng cường hệ thống miễn dịch, cô lập và diệt các tế
bào ung thư, chống viêm nhiễm, bảo vệ gan, tăng cường chức năng chức năng gan,
thải độc chống dị ứng, điều hoà huyết áp, nhịp tim, tăng lượng oxy trong máu, giảm
cholesterol, dùng tốt cho bệnh nhân tiểu đường.
Hình 1.10. Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

40. Đồ án tốt nghiệp
26
Riêng đối với bào tử nấm Linh chi có thể được sử dụng dưới dạng còn nguyên
hoặc bị phá vỡ, nhưng có nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng bào tử bị phá vỡ có hoạt tính
sinh học cao hơn so với bào tử còn nguyên. Bào tử còn nguyên đã được tìm thấy trong
phân người và động vật, như vậy bào tử Ganoderma lucidum không thể được tiêu hóa
trong cơ thể, nhưng cũng có báo cáo cho rằng bào tử với lớp vách còn nguyên vẹn có
thể hoạt động khi uống vào trong cơ thể (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016).
1.3.1. Phòng chống ung thư
Nấm Linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thư
nhằm giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng những
liệu pháp chữa trị thông thường. Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã có
những tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phương
pháp hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rất
nhiều khó khăn thử thách (theo WHO 2008). Trong quá trình tìm kiếm những phương
pháp điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài
thực vật, trong đó có cả nấm Linh chi, những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn
quá trình hình thành khối u (Wasser và cộng sự, 1999; Borchers và cộng sự, 2008).
Trong nấm Linh chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất
từ thân nấm, sợi nấm và bào tử. Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm
hợp chất chính trong nấm Linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá
trình hình thành khối u, điều này đã được chứng minh trong những nghiên cứu của
Yuen và cộng sự (2005) cũng như của Zaidman và cộng sự (2005). Một trong những
tác dụng mới được tìm thấy của dịch chiết nấm Linh chi là có khả năng hỗ trợ điều trị
cho các căn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và bệnh liên quan đến gan (Bao và
cộng sự, 2005). Những thí nghiệm trên động vật đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong
việc ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung thư. Tuy nhiên, việc tiến hành
những thí nghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn chế.
Daniel Sliva và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế tế bào
ung thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn

41. Đồ án tốt nghiệp
27
nguyên, bào tử bị phá vỡ, bột thể quả, dịch chiết của thể quả và bào tử với các nguồn
cung cấp khác nhau và đã thu được kết quả như bảng 1.4.
Bảng 1.4. So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác
nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL)
Tên Nguồn gốc Thành phần Khả năng ức chế tế
bào ung thư
Zihanga Trung Quốc Bào tử còn nguyên 89,3%
Zhongkeb Trung Quốc Bào tử phá vỡ 71,9%
Jilinc Trung Quốc Bào tử còn nguyên 9,5%
Two Urnd Trung Quốc Bột thể quả 54,3%
Double Cranee Đài Loan Bột thể quả 86,5%
ReishiMaxf Mỹ Dịch chiết thể quả
và bào tử
99%
Gần đây có nghiên cứu cho thấy rằng các acid béo C-19 là nonadecanoic acid và
cis-9-nonadecenoic acid thu được từ bào tử Ganoderma lucidum bị phá vỡ có tác dụng
chống tế bào ung thư (Gao P và cộng sự, 2012).
Từ những nhận định và kết quả thí nghiệm nêu trên cho ta thấy việc tìm ra một
quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi hiệu quả để trích xuất các thành phần hoạt
tính sinh học từ bào tử Ganoderma là việc rất quan trọng. Đã có rất nhiều báo cáo
khoa học về các phương pháp phá vỡ bào tử Ganoderma lucidum.
1.3.2. Khả năng kháng oxi hóa
Những hợp chất chống oxi hoá trong thực vật có tác dụng ngăn ngừa ung thư
cũng như những căn bệnh nan y khác (Collins và cộng sự, 2005; Benzie và cộng sự,
2009). Những hợp chất này có tác dụng bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào
chống lại những tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những
nguy cơ gây ra đột biến và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch.
Những hợp chất có trong nấm Linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene
cũng có tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào (Lee và cộng sự, 2001; Lin và cộng
sự, 2002; Shi và cộng sự, 2002; Wachtel Galor và cộng sự, 2005; Yuen và cộng sự,
2008; Saharelli và cộng sự, 2009; Wu và cộng sự, 2009).

42. Đồ án tốt nghiệp
28
Các thành phần hoạt tính sinh học trong Ganoderma lucidum bao gồm
polysaccharides, triterpenes, peptide và polysaccharide peptide có tác dụng gián tiếp
hoặc trực tiếp trong việc chống lão hóa (Jue W và cộng sự, 2017).
1.3.3. Điều trị bệnh đái tháo đường
Những thành phần của nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường
huyết đối với động vật. Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách từ
thân nấm Linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100
mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác dụng hạ đường huyết vẫn
tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikiko và cộng sự, 1985). Cũng trong một thí nghiệm trên
chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng
glucose trong máu và điều chỉnh quá trình tổng hợp glucose dưới tác dụng của các
enzyme có sẵn trong gan (Hikiko và cộng sự, 1989). Trong một nghiên cứu khác cũng
được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide khác
có trong nấm Linh chi được gọi là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết
(Hikiko và cộng sự, 1989; Tomoda và cộng sự, 1986).
1.3.4. Điều trị các bệnh về tim mạch
Chống nhiễm mỡ, xơ mạch và các biến chứng (bệnh xơ vữa động mạch vành). Có
tác dụng đặc biệt trong việc loại trừ chất cholesterol trong máu và các thành mạch, trợ
tim, lọc sạch máu, làm giảm cholesterol, giảm xơ cứng thành động mạch, thúc đẩy quá
trình lưu thông máu, tăng cường tuần hoàn máu.
Làm giảm mệt mỏi, hỗ trợ thần kinh, chống đau đầu và tứ chi, điều hòa kinh
nguyệt.
Nấm Linh chi đã được cho là có đặc tính hạ huyết áp và tăng huyết áp
(homeostasis). Một peptidoglycan có tác dụng hạ huyết áp nhẹ trên chuột SHR (bẩm
sinh tăng huyết áp) đã được phân lập từ dịch chiết nước nóng của Linh chi. Theo một
báo cáo, huyết áp của khoảng một nửa số bệnh nhân tăng huyết áp được giảm khi được
tiêm chiết xuất từ Linh chi. Điều đó đã được báo cáo rằng bệnh nhân cao huyết áp liên
quan đến angiotensin-I-converting enzyme bị ức chế bởi acid ganoderic (B, D, F, H),
ganoderal A trong nấm Linh chi.

43. Đồ án tốt nghiệp
29
1.3.5. Tăng cường hệ miễn dịch
Những tác nhân giúp làm tăng khả năng hoạt động của hệ miễn dịch cũng có tác
dụng tăng cường sức khoẻ, qua đó giúp ngăn ngừa bệnh tật. Nhiều thành phần trong
nấm Linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển
của các tế bào lympho, các bạch cầu đơn nhân, các tế bào NK (natural killer cells) (Bao
và cộng sự, 2001); Cao và cộng sự, 2002); Zhu và cộng sự, 2007; Ma và cộng sự,
2008). Trong một nghiên cứu của Chang và cộng sự (2009) được tiến hành trên chuột
BALB/c cho thấy dịch chiết nấm Linh chi chứa nhiều polysaccharide có tác dụng tăng
cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào spleno và hoạt tính của các đại thực
bào và các tế bào NK.
Trong một nghiên cứu khác của Wang và cộng sự (1997), polysaccharide có trong
nấm Linh chi có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lympho T và các
đại thực bào, bằng cách làm tăng hàm lượng IL- ip, TNF-a và IL-6. Cũng trong một
nghiên cứu khác, quá trình ủ của các đại thực bào và các tế bào lympho T bằng các
polysaccharide đã cho thấy hàm lượng TNF- a và INF- Y tăng lên (Zhang và cộng sự,
1999).
1.4. Phương pháp phá vỡ và trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi
Trong các nghiên cứu gần đây, bào tử của nấm Linh chi chứa một số hoạt chất
sinh học phong phú hơn nhiều so với trong thể quả của chúng (Chaiyavat Chaiyasut và
cộng sự, 2010), thành phần hoạt tính bào gồm polysaccharides, triterpenoids, amino
acids, proteins, alkaloids và các nguyên tố vi lượng, … Tuy nhiên, với bào tử của nấm
Linh chi được cấu tạo phức tạp với 2 lớp vách rất cứng và bền vững, hai lớp vách này
có thành phần gồm silica (19,01%), canxi (19,01%) và chitin (52,08 - 57,64%) (Ma
Jingjing và cộng sự, 2007), do đó việc trích ly các chất có hoạt tính sinh học từ bào tử
Ganoderma rất khó khăn.
Trong đồ án này, nhóm thực hiện đề tài đã thực hiện phá vỡ bằng phương pháp
tiền xử lý lạnh đông bào tử nấm Linh chi kết hợp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm
Trichoderma harzianum T2 là nấm mốc kí sinh trên nấm Linh chi cùng với chế phẩm
enzyme Cellulase C20032 của Novozyme cuối cùng là sử dụng sóng siêu âm để phá

44. Đồ án tốt nghiệp
30
vách bào tử nấm Linh chi, để thu được các chất tiếp tục thực hiện trích ly bằng diethyl
ether và ethanol.
1.4.1. Enzyme chitinase
Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết
cấu trúc polymer ở nấm và côn trùng, có công thức hóa học [C8H13NO5]n
Hình 1.11. Cấu trúc chitin
Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên chitin là
chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn
bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật.
Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, cồn,
dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl
đậm đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật.
Chitinase là enzyme thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2
đơn vị β – 1,4 – N – acetyl glucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân
làm 3 lớp (Sahai và Manocha, 1993):
- Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetyl chitobiose
- Endochitinase: phân cắt liên kết bên trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng
thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacetyl chitobiose.
Endochitinase có vai trò quan trọng trong quá trình ký sinh nấm.
- β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase phân cắt chitotetraose, chitotriose,
diacetylchitobiose thành GlcNac monomer.

45. Đồ án tốt nghiệp
31
Glucosamin là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có
nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của
nhóm amino.
Hình 1.12. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase
Người ta đã tinh chế được rất nhiều chitinase, trong đó phổ biến nhất là
endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N – acetyl – β – D – glucosaminidase có
kích thước 70 – 73 kDa. Ngoài ra còn có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz và
cộng sự, 1992), chitobiosidase 40 kDa, enzyme này có thể hoạt động một mình hoặc
kết hợp với enzyme endochitinase 42 kDa (Harman và cộng sự, 1993), exochitinase 28
kDa (Deane và cộng sự, 1998) và β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase 102 kDa có vai
trò duy nhất trong việc gây biểu hiện các enzyme thủy phân chitin khác nhưng chưa
tinh chế được (Harman và cộng sự, 1995).
Chitinase ở Trichoderma spp. được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh,
hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như β –
glucanase, sự phối hợp giữa hai enzyme này làm tăng hiệu quả hoạt động thủy phân.
Mặt khác, theo báo cáo của Lorito (1994) cho biết, có sự phối hợp tác động lên màng tế
bào giữa enzyme thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như chất tổng hợp.
Cơ chế phân hủy chitin trong vách bào tử nấm Linh chi

46. Đồ án tốt nghiệp
32
Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đại học Vũ Hán, Trung
Quốc (2007) về phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng máy nghiền
ly tâm tốc độ cao đã báo cáo rằng thành phần vách bào tử nấm Linh chi có 19,01% Si;
19,01% Ca; 52,08% - 57,64% là chitin. Cấu trúc phức tạp của vách bào tử nấm Linh
chi nhờ sự liên kết của cellulose với các thành phần trên tạo ra vách bền vững giúp cho
bào tử nấm Linh chi chống chịu được tác nhân axit và kiềm. Việc phân hủy chitin đóng
vai trò rất quan trọng trong việc phá vách bào tử nấm Linh chi. Chitin có công thức hóa
học (C8H13NO5)n trong đó C chiếm 47,29%, H chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O
chiếm 39,37%. Về cấu trúc, chitin là một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D-
glucosamine [GlcNAc, còn gọi là (1 → 4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D –
glucose] gắn với nhau bằng liên kết β – 1,4 – O – glycoside.
Quá trình phân hủy chitin được gọi là chitinoclastic. Nếu quá trình phân hủy này
bao gồm cả sự thủy phân liên kết (1 → 4) – β – glycoside giống như trong quá trình xúc
tác chitinase phân hủy chitin thì quá trình này được gọi là chitinolytic. Ngoài ra, chitin
có thể được deacetyl hóa thành chitosan hoặc thậm chí các dạng cellulose nếu nó tiếp
tục được deamin hóa (ZoBell và Rittenberg, 1938; Campbell và Williams, 1951). Chính
vì vậy phải có sự kết hợp giữa enzyme chitinase và cellulose trong quá trình phá vách
bào tử nấm Linh chi.

47. Đồ án tốt nghiệp
33
Hình 1.13. Quá trình phân hủy chitin thành chitosan và cellulose.
GH: họ glycosid hydrolase;
GlcNAc: N – acetylglucosamine;
GlcN: glucosamine;
Glc: glucose.
1.4.2. Giới thiệu về siêu âm phá tế bào
1.4.2.1. Khái niệm
Siêu âm (ultrasound) là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các
phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người
(16- 20kHz). Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc (longitudinal wave) hay
sóng nén (compression wave), nghĩa là trong trường siêu âm các phần tử dao động theo
phương cùng với phương truyền của sóng. Con người có thể nghe được sóng âm có tần
số từ 16 Hz đến 18 kHz. Sóng siêu âm là tên gọi của những sóng có tần số cao hơn 18
kHz. Giới hạn trên của tần số sóng siêu âm thường là 5 MHz đối với chất khí và 500
MHz đối với chất lỏng hay chất rắn. Trong phạm vi ứng dụng, sóng siêu âm được chia
ra thành sóng siêu âm tần số thấp, năng lượng cao (20kHz-100kHz) và sóng siêu âm tần
số cao, biên độ nhỏ (2MHz-10MHz) (Kuldiloke J., 2002).

48. Đồ án tốt nghiệp
34
Các thông số của quá trình siêu âm:
- Tần số (Frequency, Hz): là số dao động phần tử thực hiện được trong 1 giây,
(Hz).
- Biên độ (Amplitude): biểu thị mức độ thay đổi áp suất (so với áp suất cân bằng
của môi trường) trong quá trình dao động.
- Cường độ (Intensity, W/m2
): là năng lượng mà sóng siêu âm truyền trong một
đơn vị thời gian qua một đơn vị diện tích đặt vuông góc với phương truyền âm. Công
thức tính I = P/S; trong đó P là công suất của nguồn âm (W), S là diện tích miền truyền
âm (m2
).
1.4.2.2. Bản chất của sóng âm
Các môi trường chất đàn hồi (khí, lỏng hay rắn) có thể coi như những môi trường
liên tục gồm những phần tử liên kết chặt chẽ với nhau. Lúc bình thường, mỗi phần tử
có một vị trí cân bằng bền. Nếu tác động một lực lên phần tử A nào đó trong môi
trường này, nó sẽ rời khỏi vị trí cân bằng bền. Do tương tác tạo nên bởi các mối liên kết
với các phần tử bên cạnh, một mặt phần tử A bị kéo về vị trí cân bằng, một mặt nó cũng
chịu tác dụng bởi các lực tác động nên phần tử A sẽ di chuyển qua – lại vị trí cân bằng,
có nghĩa là phần tử A thực hiện chuyển động dưới dạng dao động. Hiện tượng này tiếp
tục xảy ra đối với các phần tử khác của môi trường. Dạng dao động cơ, có tính chất lặp
đi lặp lại, lan truyền trong môi trường đàn hồi được gọi là sóng đàn hồi hay sóng cơ.
Nói một cách khác, sóng là một hiện tượng vật lý trong đó năng lượng được dẫn truyền
dưới dạng dao động của các phần tử vật chất của môi trường truyền sóng.
Về bản chất, sóng âm là sóng cơ học, do đó nó tuân theo mọi quy luật đối với
sóng cơ, có thể tạo ra sóng âm bằng cách tác động một lực cơ.
1.4.2.3. Nguyên lý tác động của sóng siêu âm
Hiện tượng xâm thực khí
Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và nén
liên tiếp được tạo thành. Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất gần
nhau nhờ liên kết hóa học. Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các phân tử ở gần
nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa. Áp lực âm trong chu trình kéo đủ

49. Đồ án tốt nghiệp
35
mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những bọt khí nhỏ. Bọt
khí trở thành hạt nhân của hiện tượng xâm thực khí, bao gồm bọt khí ổn định và bọt khí
tạm thời (Kuldiloke J., 2002).
Bọt khí ổn định là nguồn gốc của những bong bóng khí nhỏ, kích thước của chúng
dao động nhẹ trong các chu trình kéo và nén. Sau hàng ngàn chu trình, chúng tăng thêm
về kích thước. Trong suốt quá trình dao động, bọt khí ổn định có thể chuyển thành bọt
khí tạm thời. Sóng siêu âm làm rung động những bọt khí này, tạo nên hiện tượng “sốc
sóng“ và hình thành dòng nhiệt bên trong chất lỏng. Bọt khí ổn định có thể lôi kéo
những bọt khí khác vào trong trường sóng, kết hợp lại với nhau và tạo thành dòng nhiệt
nhỏ (Kuldiloke J., 2002).
Các bọt khí tạm thời có kích cỡ thay đổi rất nhanh chóng, chỉ qua vài chu trình
chúng bị vỡ ra. Trong suốt chu trình kéo/nén, bọt khí kéo giãn và kết hợp lại cho đến
khi đạt được cân bằng hơi nước ở bên trong và bên ngoài bọt khí. Diện tích bề mặt bọt
khí trong chu trình kéo lớn hơn trong chu trình nén, vì vậy sự khuyếch tán khí trong
chu trình kéo lớn hơn và kích cỡ bọt khí cũng tăng lên trong mỗi chu trình. Các bọt khí
lớn dần đến một kích cỡ nhất định mà tại đó năng lượng của sóng siêu âm không đủ để
duy trì pha khí khiến các bọt khí nổ tung dữ dội. Khi đó các phân tử va chạm với nhau
mãnh liệt tạo nên hiện tượng “sốc sóng“ trong lòng chất lỏng, kết quả là hình thành
những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao (50000C và 5x104kPa) với vận tốc rất nhanh
106℃/s (Kuldiloke J., 2002).