đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ
CHỦNG Trichoderma VỚI NẤM GÂY BỆNH LỞ CỔ RỄ
TRÊN CÂY RAU
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Hữu Nhượng
Sinh viên thực hiện : Lê Thị Mỹ Dung
MSSV: 1051110198 Lớp: 10DSH02
TP. Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CAM ĐOAN
Luận văn tốt nghiệp này được em thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của
TS.Phạm Hữu Nhượng và KS. Ngô Thùy Trâm phòng Công Nghệ Vi Sinh, Trung
tâm Công nghệ sinh học Tp. HCM. Em xin cam đoan nội dung và các tài liệu trích
dẫn trong đồ án tốt nghiệp là hoàn toàn trung thực. Em xin chịu trách nhiệm về lời
cam đoan của mình.
Tp.HCM, Ngày tháng năm 2014
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Mỹ Dung

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa đồ án tốt nghiệp này ngoài sự nổ lực của bản thân, em
còn được sự hỗ trợ từ rất nhiều người, em chân thành gửi lời “CẢM ƠN” tới:
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể thầy cô trường Đại học
Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học - Thực
phẩm - Môi trường đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền móng để
em thực hiện khóa thực tập tốt nghiệp và làm tốt công việc sau này.
Em xin cảm ơn thầy TS. Phạm Hữu Nhượng đã tận tình quan tâm, truyền đạt
nhiều kinh nghiệm, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hai người đã chỉ dẫn, dạy bảo, quan tâm và
giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn KS. Ngô Thùy Trâm đã hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đem tìm
hiểu tài liệu cần thiết và thao tác kỹ thuật thực hiện thí nghiệm và tạo điều kiện
thuận lợi cho em hoàn thành khóa đồ án này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc tới các anh chị, cán bộ
trong Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM đã cung cấp những hóa chất, thiết bị
cần thiết, chỉ dẫn và giúp đỡ,tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa đồ án tốt nghiệp.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình
những người đã luôn bên cạnh em, cổ vũ tinh thần và đã ủng hộ em trong suốt thời
gian qua.
Vì thời gian có hạn và còn hạn chế về mặt kiến thức và kinh nghiệm thực
tiễn, đồ án còn nhiều thiếu sót. Rất mong được sự đóng góp và phê bình của quý
thầy cô cho đồ án của em được hoàn thiện tốt hơn.
Tp.HCM, Ngày tháng năm 2014
Sinh viên thực hiện
Lê Thị Mỹ Dung

Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC ....................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...........................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................vi
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ....................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH..................................................................................... viii
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1
1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu................................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................2
4. Phạm vi nghiên cứu..................................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. Tổng quan về bệnh lở cổ rễ gây hại trên cây rau..................................................3
1.2. Tình hình bệnh lở cổ rễ trong và ngoài nước........................................................5
1.2.1. Tình hình bệnh lở cổ rễ trên cây rau ngoài nước............................................5
1.2.2. Tình hình bệnh lở cổ rễ trên cây rau ở trong nước .........................................5
1.3. Nấm bệnh gây lở cổ rễ hại cây trồng ....................................................................6
1.3.1. Nấm Rhizoctonia sp. .......................................................................................6
1.3.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Rhizoctonia sp........................................6
1.3.1.2. Sự phân bố và gây hại..........................................................................7
1.3.1.3. Ký chủ ...................................................................................................9
1.3.2. Nấm Phomopsis sp.........................................................................................9
1.3.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phomopsis sp...........................................9
1.3.2.2. Sự phân bố và gây hại.........................................................................10
1.3.2.3. Ký chủ .................................................................................................10
1.3.3. Nấm Fusarium sp. .........................................................................................11
1.3.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium sp...........................................11
1.3.3.2. Sự phân bố và gây hại........................................................................11

ii
1.3.3.4. Ký chủ của nấm Fusarium sp............................................................12
1.4. Biện pháp phòng trừ............................................................................................12
1.4.1. Biện pháp canh tác ........................................................................................13
1.4.1.1. Làm đất...............................................................................................13
1.4.1.2. Luân canh...........................................................................................13
1.4.1.3. Xen canh..............................................................................................13
1.4.1.4. Sử dụng giống kháng ..........................................................................14
1.4.2. Biện pháp hoá học.........................................................................................14
1.4.3. Biện pháp sinh học ........................................................................................14
1.4.4. Sử dụng nấm đối kháng.................................................................................15
1.5. Tổng quan về nấm Trichoderma.........................................................................15
1.5.1. Đặc điểm của nấm Trichoderma...................................................................15
1.5.2. Đặc điểm hình thái (Gary J. Samuels, 2004)................................................16
1.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học ............................................................17
1.5.4. Nguồn gốc ....................................................................................................18
1.5.5 Một số loài Trichoderma thường gặp ở vùng nhiệt đới............................18
1.5.5.1. Trichoderma pseudokoningii Rifai....................................................18
1.5.5.2. Trichoderma atroviride Bissett...........................................................18
1.5.5.3. Trichoderma hamatum Bain...............................................................18
1.5.5.4. Trichoderma inhamatum Veerkamp & W. Gams ...............................19
1.5.5.5. Trichoderma harzianum Rifai............................................................19
1.5.5.6. Trichoderma koningii Ouden..............................................................19
1.5.6. Các cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp...................................19
1.6. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma............................................24
1.6.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng................24
1.6.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường ..................................................................27
1.6.3. Trong các lĩnh vực khác................................................................................28
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................29
2.1. Điều kiện nghiên cứu ..........................................................................................29

iii
2.2. Dụng cụ, thiết bị..................................................................................................29
2.2.1. Các dụng cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm.............................................29
2.3. Môi trường hóa chất dùng để nuôi cấy và phân lập nấm ...................................29
2.3.1. Môi trường WA (Water Agar) ......................................................................29
2.3.2. Môi trường PDA ( Potato D-Glucose agar)..................................................30
2.4. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................30
2.4.1. Nấm đối kháng ..............................................................................................30
2.4.2. Nấm gây bệnh................................................................................................30
2.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu................................................................30
2.5.1. Phân lập nấm gây bệnh..................................................................................30
2.5.2. Quan sát hình thái bằng phương pháp phòng ẩm .........................................32
2.5.3. Bảo quản........................................................................................................33
2.6. Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch ...........................................33
2.7. Định danh các chủng nấm tuyển chọn được bằng sinh học phân tử dựa vào
vùng trình tự bảo tồn ITS ...........................................................................................34
2.8. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với các loài nấm bệnh
gây lở cổ rễ trên đĩa petri............................................................................................37
2.9. Phương pháp xử lí số liệu....................................................................................38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN............................................................39
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau ...................39
3.1.1. Chủng nấm 1..................................................................................................39
3.1.2. Chủng nấm 2..................................................................................................40
3.1.3. Chủng nấm 3..................................................................................................41
3.2. Lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch.................................................................42
3.3. Định danh bằng sinh học phân tử mẫu nấm gây bệnh........................................45
3.4. Các dòng nấm Trichoderma dùng nuôi cấy đối kháng.......................................48
3.5. Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với các chủng nấm bệnh
trên đĩa petri................................................................................................................51

iv
3.5.1. Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp. với chủng nấm bệnh
Rhizoctonia solani trên đĩa petri .............................................................................51
3.5.2 Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp., với chủng nấm bệnh
Phomopsis vexan trên đĩa petri................................................................................63
3.5.3. Đánh giá đối kháng của các chủng Trichoderma sp., với chủng nấm bệnh
Fusarium solani trên đĩa petri.................................................................................74
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................88
4.1. Kết luận................................................................................................................88
4.2. Kiến nghị .............................................................................................................88
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................89
PHỤ LỤC

v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ctv : Cộng tác viên
ĐC : Đối chứng
DNA : Deoxyribonucleotide Acid - bộ mã di truyền
Fu : Fusarium
ITS : Internal Trancribed Spacer - vùng dịch mã trong nhân
PCR : Polymerase chain reaction - phản ứng khuyếch đại
PDA : Potato D-Glucose Agar
Phomo :Phomopsis
Rhiz : Rhizoctonia solani
STT : Số thứ tự
T : Trichoderma
TAE : Tris Acetic EDTA
Tp. HCM : Thành phố Hồ Chí Minh
VSV : Vi sinh vật
WA : Water agar
WTO :World Trade Organization

vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Diện tích, năng suất, sản lượng rau vụ hè thu 2013 của Tp.HCM (Chi cục
bảo vệ thực vật TP.HCM) ............................................................................................4
Bảng 3.1: Phần trăm ức chế của sự phát triển của hệ sợi nấm Rhizoctonia sau 3
ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày nuôi cấy đối kháng..................................................55
Bảng 3.2. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối kháng cùng lúc ................55
Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối kháng cùng lúc ...............57
Bảng 3.6: Phần trăm ức chế của sự phát triển của hệ sợi nấm Phomopsis vexan sau
3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày nuôi cấy đối kháng...............................................67
Bảng 3.7: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày cấy đối kháng cùng lúc................67
Bảng 3.8: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 5 ngày cấy đối kháng cùng lúc................69
Bảng 3.9 : Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 7 ngày cấy đối kháng cùng lúc ...............71
Bảng 3.10: Mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 9 ngày cấy đối kháng cùng lúc..............72
Bảng 3.11: Phần trăm ức chế của sự phát triển của hệ sợi nấm bệnh Fusarium sau 3
ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày nuôi cấy đối kháng..................................................78

vii
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1: Tỷ lệ hạt nảy mầm / tổng số hạt gieo......................................................43
Đồ thị 3.2: Tỷ lệ cây con bị nhiễm bệnh ...................................................................44

viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1 : Sự tác động của Trichoderma spp. lên tác nhân gây bệnh (Pythium).....20
Hình 1.2 : Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia
.....................................................................................................................................21
Hình 2.1: Phân lập nấm bệnh từ một mẫu bệnh cây (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây
ở Việt Nam) ................................................................................................................32
Hình 2.2: Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm để làm thuần (Cẩm nang chẩn đoán bệnh
cây ở Việt Nam) .........................................................................................................32
Hình 2.3 : Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp nấm bệnh - Trichoderma spp. .....38
Hình 3.1: Hình thái đại thể chủng nấm 1 ..................................................................39
Hình 3.2: Hình thái vi thể chủng nấm 1 dưới kính hiển vi quang học 40X .............39
Hình 3.4: Hình thái vi thể chủng nấm 2 dưới kính hiển vi quang học 40X .............40
Hình 3.6:Hình thái vi thể chủng nấm 3 dưới kính hiển vi quang học 40X ..............41
Hình 3.7: Mẫu cây trồng trong đất có bổ sung F. .....................................................43
Hình 3.8: Mẫu cây trồng trong đất có bổ sung P. .....................................................44
Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu F, P, R ......................................45
Hình 3.10: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B1....................................48
Hình 3.13: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng B12..................................49
Hình 3.14: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng T3 ....................................49
Hình 3.15: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng TN1 .................................50

ix
Hình 3.16: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng CĐ02...............................50
Hình 3.17: Tản nấm và bào tử nấm Trichoderma chủng CĐ08.1............................50
Hình3.18: Khả năng đối kháng của Trichoderma với Rhizoctonia solani sau 3 ngày,
5 ngày, 7 ngày, 9 ngày................................................................................................54
Hình 3.19: Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phomopsis vexan sau 3 ngày,
5 ngày, 7 ngày, 9 ngày................................................................................................66
Hình 3.20 : Khả năng đối kháng của Trichoderma sp. với Fusarium solani sau 3
ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày......................................................................................77

1
LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Rau màu là loại cây ngắn ngày, đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp
thực phẩm thiết yếu cho cuộc sống con người. Rau màu có chứa nhiều chất dinh
dưỡng, nhưng thân lá lại non mềm, chứa nhiều nước, là môi trường thuận lợi cho
các loài nấm, sâu bệnh phá hoại. Vì vậy rau màu đang là đối tượng sử dụng nhiều
loại thuốc hóa học.
Cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp, ngành trồng rau nước ta đang
không ngừng phát triển cả về diện tích, năng suất và chất lượng. Từ đó, hình thành
nên nhiều vùng rau chuyên canh, từ sự chuyên canh đó đã hình thành nên nhiều
chứng bệnh nguy hiểm. Thực tế cho thấy, khi cây trồng bị nhiễm bệnh, năng suất và
chất lượng sản phẩm bị giảm đáng kể và khi nhiễm bệnh nặng có thể mất trắng.
Những bệnh gây ra do nấm là khá phổ biến. Trong đó, các bệnh hại trên rau thì
bệnh chết cây con, bệnh gây lở cổ rễ, thối rễ do nấm Rhizoctonia sp, Phomopsis sp.,
Fusarium sp.... là bệnh rất nghiêm trọng và khá phổ biến hay gặp ở cây trồng. Tổ
chức lương thực LHQ (FAO) đã thống kê thấy rằng các bệnh do vi nấm gây thiệt
hại cho nông nghiệp chiếm tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp trên thế giới.
Bởi vậy, chúng ta phải áp dụng hàng loạt các biện pháp nhằm hạn chế những
thiệt hại do tác nhân trên gây ra, trong đó biện pháp hóa học được sử dụng phổ biến
trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên, biện pháp hóa học gây tác động xấu ảnh
hưởng nghiêm trọng môi trường đất, nước, không khí và ảnh hưởng trực tiếp đến
sinh vật sống trong các môi trường đó. Dư lượng thuốc tồn trong các nông phẩm
còn ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người làm phát sinh nhiều bệnh nan y như ung
thư, viêm phổi, thai dị dạng... Hơn nữa, do việc quá lạm dụng thuốc còn gây hiện
tượng lờn thuốc của vi sinh vật gây bệnh.
Đứng trước thực tiễn đó, việc phòng, trị bệnh và tiến tới thay thế dần biện
pháp sử dụng chất hóa học bảo vệ thực vật bằng vi sinh vật đối kháng là yêu cầu,
đòi hỏi cấp thiết không những để làm giảm thiệt hại do nấm bệnh gây ra, góp phần

2
nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm nông nghiệp mà vì mục đích giải quyết
vấn đề môi trường và nâng cao chất lượng cuộc sống con người.
Trên cơ sở đó đề tài: “Đánh giá khả năng đối kháng của một số chủng
Trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau” được tiến hành, với mong
muốn tìm và chọn ra được chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng tốt nhất
với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau.
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn được chủng nấm Trichoderma có tác dụng đối kháng phòng trừ
nấm gây bệnh lơcổ rễ tốt nhất.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và định danh các nấm gây bệnh lở cổ rễ.
- Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm
Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ trên môi trường PDA
Phomopsis vexan gây bệnh lở cổ rễ trên môi trường PDA
Fusarium solani gây bệnh lở cổ rễ trên môi trường PDA
4. Phạm vi nghiên cứu
Phân lập các dòng nấm gây bệnh lở cổ rễ ở cây cà tím và cà chua. Đồng thời
đánh giá khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma trong điều kiện in
vitro.

3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh lở cổ rễ gây hại trên cây rau
Bệnh lở cổ rễ hay còn gọi là bệnh thối gốc, một trong những loại bệnh nguy
hiểm, gây thiệt hại nhiều nhất, nhanh nhất cho những người sản xuất rau màu nói
chung, những người chuyên gieo ươm cây rau giống nói riêng.
Triệu chứng: Bệnh chủ yếu gây hại ở phần cổ rễ, phần gốc sát mặt đất. Khi
mới xuất hiện, nếu quan sát kỹ có thể thấy những vết bệnh có màu khác với vỏ cây,
phần vỏ này bị rộp lên, sau đó lan dần bao quanh toàn bộ phần cổ rễ hoặc gốc cây.
Dần dần phần vỏ này khô teo lại, khi gặp trời mưa hoặc độ ẩm cao sẽ bị thối nhũn,
bong ra, trơ lại phần lõi gỗ của cây có màu thâm đen, cây sẽ héo dần và chết.
Lúc mới bị nhiễm bệnh, lá trên các cây này còn giữ được màu xanh tươi
trong vài ngày (nếu trời râm mát), sau đó toàn bộ cây sẽ bị héo rũ gục xuống, chết
lụi từng đám rải rác trên ruộng hoặc từng vạt lớn nếu ruộng rau bị nhiễm bệnh nặng.
Vào những ngày có nhiều sương mù hoặc lúc sáng sớm ta có thể thấy lớp tơ màu
trắng bám nơi vết bệnh. Vài ngày sau, trên thân cây và vùng đất xung quanh gốc
cây bị bệnh xuất hiện nhiều đốm hạch màu vàng nâu bám xung quanh đó. Bệnh lở
cổ rễ do nhóm nấm bệnh có nguồn gốc trong đất gây ra. Điển hình như nấm
Rhizoctonia, Pythium, Fusarium, Phomopsis... Các bào tử nấm này thường sống
tiềm ẩn trong đất và tàn dư cây trồng khá lâu, nhất là ở những vườn ươm cây giống,
những vườn sản xuất đã từng bị bệnh lở cổ rễ mà không được xử lý đất trước khi
trồng lại.
Các bào tử nấm này thường lây lan trong môi trường nước và xâm nhập qua
các vết thương cơ giới hoặc các lỗ khí khổng của lá khi có điều kiện môi trường
thuận tiện. Bệnh thường phá hại nhiều trong vườn ươm hoặc sau khi trồng khoảng 1
tháng tuổi, làm chết cây con. Nấm thường tấn công vào cổ rễ, nơi tiếp giáp với mặt
đất và cổ rễ bị khô, cây không hút được nước nên đổ rạp và chết rất nhanh. Bệnh
thường phát sinh, phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ cao hoặc

4
mưa, nắng, rét, nóng thất thường. Các nấm bệnh này phát triển và gây thiệt hại nặng
về kinh tế. Biện pháp phòng trừ chủ yếu dựa vào các lọai thuốc bảo vệ thực vật có
nguồn gốc hóa học còn biện pháp sinh học được sử dụng để phòng trừ còn rất hạn
chế.
Hiện nay, riêng vụ hè thu 2013 trên địa bàn Tp.HCM, tổng diện tích canh tác
rau chiếm 1638,9 ha, tổng diện tích gieo trồng chiếm 3189 ha và năng suất bình
quân đạt 21,03 tấn/ha. Với việc sản xuất độc canh của các vùng chuyên canh trồng
rau cũng như các biện pháp chăm sóc, phòng và trị các tác nhân gây bệnh chưa hợp
lý đã dẫn tới các dịch bệnh hoành hành, ảnh hưởng tới năng suất và tổn thất về kinh
tế. Hiện nay tình hình dịch hại trên rau do tác nhân là sâu và côn trùng gây hại có
thể được giám định tương đối rõ ràng và đầy đủ, vì chúng khá dễ dàng trong việc
xác định, định danh. Tuy nhiên, tình hình bệnh hại và những tổn thất kinh tế do các
tác nhân VSV gây ra trên rau, đặc biệt là các loại nấm gây bệnh thì vẫn chưa được
điều tra, nghiên cứu một cách đầy đủ. Một lý do gây nên hạn chế này có thể do việc
phân lập được đúng các loài nấm gây bệnh không hề dễ dàng và tốn nhiều công sức.
Từ đó dẫn đến việc sử dụng các biện pháp và trị bệnh sẽ kém hiệu quả.
Bảng1.1: Diện tích, năng suất, sản lượng rau vụ hè thu 2013 của Tp.HCM (Chi cục
bảo vệ thực vật TP.HCM)
Chỉ tiêu
Nhóm rau
Diện tích canh
tác (ha)
Diện tích gieo
trồng (ha)
Năng suất bình
quân (tấn/ha)
Sản lượng
(tấn)
Rau ăn lá ngắn
ngày
953,65 2380,63 20,97 49933,54
Rau ăn lá dài
ngày
11,7 13 14,7 216
Rau ăn củ quả
ngắn ngày
456,9 568,8 20,42 11616,65
Rau ăn củ quả
dài ngày
216,7 227,2 23.36 5308,5
Tổng cộng 1638,95 3189 21,03 67074,7

5
1.2. Tình hình bệnh lở cổ rễ trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình bệnh lở cổ rễ trên cây rau ngoài nước
Theo ước tính FAO - tổ chức lương thực, thực phẩm thế giới - hằng năm
thiệt hại do VSV, sâu bệnh và cỏ dại gây ra là rất lớn chiếm tới 34,39%. Trong đó
sâu hại chiếm12,4%, nấm gây hại chiếm 11,6%, còn cỏ dại chiếm 10,9%.
Tại trung tâm nghiên cứu và phát triển rau ở Thái Lan đã khảo nghiệm trên
tập đoàn 50 dòng giống cà chua cho thấy các dòng đều bị nhiễm bệnh này, nặng
nhất là FMTT 33 với tỉ lệ bệnh là 23,75%, còn lại là các dòng khác tỉ lệ bệnh từ 5-
12%.
Theo Rowshan Alison tỷ lệ bệnh lở cổ rễ trên giống cà chua ở Thái Lan là
13,02%. Theo Branch, W.L and Brunnemen, T.B (1993) ở vùng Georgia Mỹ thiệt
hại do bệnh này gây ra hằng năm ước tính lên tới 43 triệu USD.
Đây là một vấn đề nan giải ở một số nước trên thế giới như Thái Lan,
Myanma, Philippin… bệnh xuất hiện nhiều vào mùa mưa, và vào giai đoạn hạt đang
nảy mầm. Thiệt hại của nó rất đáng kể lên hàng triệu USD/ năm.. Bệnh lở cổ rễ một
trong những bệnh gây hại nghiêm trọng trên cây rau tại Indonesia.
Ở Malaysia (theo nguồn Agriviet.com...2008) thì bệnh lại xuất hiện vào
những vùng đất tái canh tác theo nghiên cứu vào năm 2000 - 2005 có khoảng 80000
ha được tái canh trước đó trồng bắp sau đó trồng cây cải. Hầu hết vùng tái canh
thuộc tiểu điền và rất mẫn cảm với bệnh lở cổ rễ. Sự xuất hiện và phân bố của bệnh
lở cổ rễ nói chung chưa thể hiện rõ do yếu tố địa lý hay thổ nhưỡng. Tuy nhiên mức
độ ảnh hưởng phụ thuộc nhiều vào việc vệ sinh đồng ruộng và thu gom tất cả rễ
nhiễm bệnh ra ngoài.
1.2.2. Tình hình bệnh lở cổ rễ trên cây rau ở trong nước
Trong điều kiện của Việt Nam, nấm gây bệnh lở cổ rễ cây rau phát sinh và
phát triển khá mạnh như Rhizoctonia sp., Phomopsis sp., Pythium sp., Fusarium sp.,
gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau như lúa, bắp, cà chua, cà tím, khoai

6
tây…Tùy theo loại cây và giai đoạn sinh trưởng của cây mà bệnh có nhiều triệu
chứng khác nhau như thối đen rễ, lở cổ rễ, thối gốc, thối thân, thối lá. Hại ở thời kỳ
cây con ở rễ, cổ rễ úng nước, nâu đen, cây đổ rạp gọi là bệnh lở cổ rễ (tạp chí
BVTV, 2002).
Bên cạnh đó đối với những loài cây cà tím, cà chua... bệnh cũng bị tấn công ,
cây héo rũ và ngã gục xuống. Nhổ cây con lên ta thấy ở phần cổ rễ có vết bệnh màu
nâu sẫm vòng quanh thân, dài 1 - 3 cm. Vì vậy, có thể thấy những ký chủ dễ dàng bị
tấn công vào lúc chúng mới nhú rễ mầm. Một yếu tố quan trọng khác không thể
thiếu để dẫn đến sự phát triển của bệnh là điều kiện thời tiết ẩm, sợi nấm bệnh có
thể mọc ra từ vết bệnh và lan ra hốc cây này sang hốc cây khác. Bệnh này xuất hiện
từ khi cây bắt đầu mọc đến khi cây được 20 ngày tuổi. Tuổi cây càng lớn thì khả
năng nhiễm bệnh càng giảm (Nguyễn Văn Minh, 2005- 2006).
Theo những điều tra về số liệu của bệnh gây ra gần đây thì bệnh thường xuất
hiện ở hầu hết các vùng đồng bằng, trung du, miền núi trên các loại đậu bắp, họ
cà… Bệnh phá hoại xuất hiện thời kỳ sinh trưởng của cây nhưng chủ yếu là vào thời
kỳ cây con gây thiệt hại lớn cho nguồn nông sản nước ta (Võ thị Thu Oanh, 2000).
1.3. Nấm bệnh gây lở cổ rễ hại cây trồng
1.3.1. Nấm Rhizoctonia sp.
1.3.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Rhizoctonia sp.
Nấm Rhizoctonia sp. có rất nhiều loài, nấm Rhizoctonia sp. thuộc lớp nấm
bất toàn (Deuteromyces), là loài gây hại phổ biến trên nhiều loại cây trồng. Ở giai
đoạn sinh sản hữu tính loài này có tên gọi là Thanatephorus cucumeris thuộc lớp
nấm đảm (Basidiomycetes), được phát hiện rất sớm, nấm phát triển nhanh, phân
nhánh tại điểm gần vách ngăn giữa hai tế bào và vuông góc với sợi nấm chính
(Mezies, 1970).
Nấm R. solani sinh trưởng rất dễ dàng trên các loại môi trường phổ biến, sợi
nấm khi còn non không màu, khi trưởng thành có màu nâu vàng nhạt, đường kính 8

7
– 12µm, với những vách ngăn không liên tục (Ou, 1983). Chúng có thể đồng dạng
hay khác nhau về kích thước, hình dạng, màu sắc và cách phân bố trên môi trường,
đường kính hạch nấm nhỏ hơn 1mm đến vài cm (Menzies, 1970). Khi nấm mọc trên
môi trường nuôi cấy có kích thước sợi nấm và hạch nấm lớn hơn so với sợi nấm
mọc trên ký chủ trong tự nhiên (Ou, 1983). Hạch nấm là một cấu trúc phức tạp được
tạo ra do các sợi nấm cuộn lại, chúng có khả năng duy trì sức sống trong điều kiện
môi trường không thuận lợi như: khô hạn, thiếu thành phần dinh dưỡng hay hóa
chất độc hại (Ghaffer, 1993). Nấm R. solani trong tự nhiên phần lớn sinh sản bằng
hình thức vô tính hiện diện ở dạng sợi nấm và hạch nấm.
Trên mô ký chủ hoặc vách ống nghiệm nuôi cấy, các sợi nấm đôi khi mọc ra
những tế bào ngắn, phình to và phân nhiều nhánh. Các tế bào đó, có thể có khả năng
liên quan tới quá trình gây bệnh hoặc tới giai đoạn sinh sản bào tử (Ou, 1983).
Hạch nấm bám sát vào mô cấy, bề mặt sần sùi, sợi nấm to, không màu, phân
nhánh vuông góc, đen… Hạch nấm lan truyền chủ yếu nhờ nước. Nó có khả năng
lan truyền theo hai chiều, đứng và ngang. Sự lây lan theo chiều đứng chủ yếu từ bẹ
lá lên lá bằng sợi nấm, còn theo chiều ngang từ chồi này sang chồi khác cũng bằng
sợi nấm nhưng từ ruộng này sang ruộng khác thì bằng hạch nấm (Tô Thị Thùy
Hương, 1993).
Khi hạch nấm bám vào bẹ lá sẽ nẩy mầm ra sợi nấm rất nhỏ, sợi nấm có thể
xâm nhập trực tiếp qua biểu bì hay khí khổng. Muốn xâm nhiễm qua khí khổng
khuẩn ty phải phát triển để len vào mặt trong của bẹ lá và xâm nhiễm vào. Nhiệt độ
cho sự xâm nhiễm của nấm có thể xảy ra là 23 – 25oC, nhưng tối hảo nhất là 30 –
32oC, ẩm độ phải từ 96 – 97%. Ở 32oC nấm xâm nhiễm trong vòng 18 giờ (Võ
Thanh Hoàng, 1993).
1.3.1.2. Sự phân bố và gây hại
Nấm R. solani gây bệnh đốm vằn trên lúa được tìm thấy lần đầu tiên tại Nhật
Bản vào năm 1910. Năm 1934, bệnh xuất hiện ở Trung Quốc và ở nhiều nước Châu
Á khác, sau đó là ở Brazil, Surinam, Venezuela, Madagasca và Mỹ.

8
Theo Kozada (1965), ghi nhận có 188 loài thực vật thuộc 32 họ, trong đó có
20 loài cỏ dại thuộc 11 họ có thể bị tấn công do nấm R. solani. Theo Tsai (1970),
nhận thấy rằng nấm R. solani gây hại trên lúa cũng xâm nhiễm trên 20 loài cỏ thuộc
11 họ.
Bệnh do nấm R. solani gây ra hiện diện ở Châu Âu, Châu Phi và Châu Á.
Bệnh gây hại chủ yếu ở những vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới. Bệnh khá phổ biến ở
Việt Nam. Bệnh làm giảm 40% năng suất. Bệnh phát triển mạnh khi có mưa nhiều,
ẩm độ cao (100%), nhiệt độ cao khoảng 25 – 30oC, gieo trồng với mật độ dày. Bệnh
gây hại nặng ở giai đoạn cây con. Điều kiện thích hợp cho sự phát triển của nấm R.
solani là: ẩm độ không khí cao và nhiệt độ cao, trồng cây ở mật độ dày, bón nhiều
phân hóa học nhất là phân đạm (Ou, 1985).
Xâm nhiễm: Trong đất, R. solani tồn tại ở dạng sợi nấm dinh dưỡng cũng
như hạch nấm, đó là giai đoạn sinh sản vô tính. Hạch nấm được biết đến là nguồn
gốc chính của nhiễm bệnh do Rhizoctonia (Anderson, N.A., 1982). Các cấu trúc
màu nâu, hình dạng không xác định, nhỏ (đường kính 1 - 3 mm) chứa một lượng
dày đặc các monolioid. Do cấu trúc này nhỏ và có chứa nhiều melanin trong tất cả
các thành tế bào, hạch nấm của R. solani có thể chống chịu nhiều điều kiện môi
trường không thuận lợi. Ngoài ra hạch nấm R. solanin tiết ra chất lỏng màu nâu là
hỗn hợp các chất phenol, acid carboxylic, carbohydrate, acid béo và amino acid góp
phần vào hoạt tính kháng nấm và gây độc cho cây trồng (Aliferis và ctv, 2010). Cả
hai yếu tố hạch nấm tồn tại lâu và tính đa dạng cao làm cho việc kiểm soát các bệnh
do Rhizoctonia gây ra rất khó.
Hạch nấm có khả năng nảy mầm nhiều lần, những lần sau sức nảy mầm giảm
đi, những hạch nấm bị phân cắt có khả năng gây bệnh cho cây. Hạch và sợi nấm rất
dễ hình thành trên các vết bệnh nhất là điều kiện ẩm, lúc đầu màu trắng, sau màu
nâu đỏ, đường kính biến động từ 1- 6mm (Ou, 1985).

9
Hemmi và Yokogi (1927) cho rằng nhiệt độ tốt nhất cho sợi nấm R.solani
phát triển là 30oC, nhiệt độ cao nhất là 40 – 42oC, ở nhiệt độ 10oC sợi nấm phát
triển rất ít hoặc không phát triển.
pH thích hợp cho sự phát triển của nấm R.solani là 5,4 – 6,7; pH thấp nhất là
2,5 và cao nhất là 7,8 (Endo, 1931).
1.3.1.3. Ký chủ
Những nghiên cứu về sự sinh trưởng ở phòng thí nghiệm cho thấy nấm R.
solani cũng gây hại trên những cây trồng khác, bao gồm cây bông vải, cải củ, lúa mì
và khoai tây (Carling và ctv, 1994). Nấm R. solani là nguyên nhân gây nên một số
bệnh phổ biến trên cây trồng: bệnh héo rũ cây con, thối rễ, thối thân hay loét thân ở
giai đoạn cây con hoặc trưởng thành. Ngoài ra, nấm R. solani còn là nguyên nhân
gây bệnh trên một số cơ quan khác của cây như thối trái cà chua, khô lá hoặc những
đốm đặc biệt trên lá ở gần mặt đất (Agrios, 1997). Các nhóm khác nhau thì không
hoàn toàn có ký chủ khác nhau rõ ràng, nhưng cũng giúp chúng ta biết được phạm
vi ký chủ của mỗi nhóm khác nhau, tạo điều kiện thuận lợi trong định hướng nghiên
cứu: tạo giống cây kháng, sinh thái, bố trí cây trồng thích hợp (Burgess và ctv, 1994
và Agrios, 1997).
1.3.2.NấmPhomopsis sp.
1.3.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phomopsis sp.
Phomopsis thuộc họ Valsaceae, bộ Diaporthales, lớp Sordariomycetes,
ngành Ascomycota, loài Phomopsis. Phân bố rộng rãi trên thế giới. Phomopsis gây
bệnh thối rễ, tổn thương gốc, héo lá và quả đặc biệt gây ra hiện tượng chết rạp ở giai
đoạn cây con do bào tử của nó có thể lây lan qua gió, mưa...
Phomopsis là loài có phổ kí chủ rộng, có hệ sợi nấm phát triển nhanh, có
màu trắng ban đầu và dần chuyển sang màu xám trên môi trường PDA. Bào tử có
hai loại: bào tử α và bào tử β. Bào tử α trong suốt như pha lê, hình bầu dục, đơn
bào, kích thước 5 - 8 x 2-3 µm trong khi bào tử β không màu, hình sợi hoặc hình

10
lưỡi liềm, có vách ngăn, không nảy mầm, kích thước 18 - 32 x 0,5 - 2 µm (Edgerton
and Moreland, 1921; Sherf and Mac Nab, 1986; Singh, 1987)
Quả thể thường mọc thành cụm, đường kính 130- 350 µm. Bào tử túi, trong
pha lê, hình elip, có vách ngăn 9 -12 x 3-4,5 µm (Gratz, 1942)
Ở Phomopsis bào tử α gây bệnh trên cây trồng còn bào tử β không gây bệnh
do không nảy mầm được. Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của nấm là 28o C
Bệnh bạc lá do Phomopsis vexan gây ra lần đầu được công bố ở Italy năm
1881 và sau đó đã có nhiều nghiên cứu về tác hại của loài nấm này. Bệnh này
nghiêm trọng nhất ở miền Nam và miền Đông của Châu Âu. Phomopsis chủ yếu
gây hại ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt, gây thiệt hại đáng kể cho mùa màng
(Porter, 1943; Vishunavat and Kumar, 1993).
Phomopsis phát triển tự nhiên từ đồng bằng đất thấp đến các khu vực miền
núi lên đến độ cao 1200m trên mực nước biển (Gellini, 1985). Phomopsis là một tác
nhân gây bệnh thực vật phân bố rộng rãi trong đất, gây giảm năng suất trên nhiều
loại cây trồng. Ở cây con và cây trưởng thành đều dễ bị mắc bệnh. Bào tử nảy mầm
sau 6 giờ và 12 giờ sau khi thâm nhập xảy ra (Divinagracia, 1968).
Phomopsis vexan gây bệnh trong điều kiện thời tiết nóng và đất ẩm ướt dễ
cho sự phát triển của bệnh. Bào tử nảy mầm tối ưu ở 27oC và tạo thành túi bào tử
phấn ở 30- 35oC (Pavar and Patel, 1957). Độ ẩm tối ưu cho bệnh phát triển là 55%
(Chaudhary and Hasija, 1979) và nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng nấm là 28oC (
Pawar and Patel, 1957). Bào tử phát tán trong tự nhiên nhờ gió và mưa (Edgerton
and Moreland, 1921)
1.3.2.3. Ký chủ
Nấm Phomopsis có thể gây bệnh ở rễ, thân, lá hay quả đặc biệt nấm này gây
ra hiện tượng chết rạp cây con. Nấm có thể gây hại cuống lá súp lơ, cà rốt, rễ củ

11
cải... Đặc biệt, cây cà tím là loại cây bị nấm này tấn công nhiều nhất trên hầu hết
các bộ phận của cây.
1.3.3. Nấm Fusarium sp.
1.3.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium sp.
Fusarium thuộc họ Nectriaceae, bộ Hypocreales, lớp Sordariomycetes,
ngành Ascomycota. Nấm Fusarium sp. thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes),
giai đoạn sinh sản hữu tính là Gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes).
Fusarium gồm nhiều loài khác nhau, có khả năng gây nhiều loại bệnh trên những
cây trồng khác nhau. Chúng hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái
và rau. Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ. Hệ sợi nấm lan tỏa khắp mô mạch và
lấp kín mạch gỗ. Sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá trình vận chuyển nước làm héo cây.
Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển
màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Cơ
thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn
giản ở giữa. Trong một tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân. Vách tế bào bằng
chitin, glucan.
Nấm sống hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật, gặp phổ biến trong đất, cũng
gặp trên các vật liệu cellulose (Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng,1982) .
Nấm này phân bố khắp nơi trên thế giới, một vài loài phân bố khắp nơi trong
khi những loài khác có xu hướng xuất hiện chủ yếu ở vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới
hay ôn đới…
Nhiệt độ tối ưu cho nấm Fusarium sp. phát triển là 27 – 30oC, tối đa là 36 –
40oC và tối thiểu là 7 – 8oC, nhưng nhiệt độ thích hợp cho sự xâm nhiễm là 35oC
(Ou, 1985).
Nấm Fusarium sp. gây nhiều bệnh trên cây trồng: bệnh nghẽn mạch (héo),
thối rễ, thối thân, thối hạt, thối trái. Nấm Fusarium sp. sống phổ biến trong đất, lưu

12
tồn dưới dạng bào tử áo hoặc khuẩn ty sống trên xác bã thực vật dư thừa hay những
chất hữu cơ. Một số loài tạo bào tử đính bay trong không khí, đây là nguyên nhân
gây ra những bệnh trên thân, lá và bông (Burgess và ctv, 1994)
Xâm nhiễm: Sợi nấm và bào tử vô tính nảy mầm trong tàn dư cây bệnh và
đất xâm nhiễm vào rễ con còn non và lan dần vào các mạch xylem. Nấm bệnh sau
đó sẽ phát triển trong mạch xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân. Quá
trình này gây phản ứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu.
Những hợp chất này gây hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn. Hiện tượng tắc mạch
xylem làm giảm lượng nước di chuyển lên cây, khiến cây bị héo và teo thắt ở phần
thân rễ rồi chết.
Nấm Fusarium sp. tấn công chủ yếu vào bộ rễ (Agrios, 1997). Đặc biệt, bệnh
gây hại nặng nề trong điều kiện stress nước, dùng phân bón quá nhiều hay rễ cây bị
tổn thương (Olsen và ctv, 2000).
1.3.3.4. Ký chủ của nấm Fusarium sp.
Nấm Fusarium sp. gây hại ở nhiều loại cây họ đậu, họ cam quít, khoai tây, cà
chua. Nấm Fusarium sp. gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây, nhưng
chủ yếu là thời kỳ cây con (Porter và ctv, 1984; Vũ Triệu Mẫn và Lê Lương Tề,
1998). Fusarium sp. là tác nhân gây bệnh thối rễ nguy hiểm nhất trên diện rộng trên
đậu, cà chua (Nelson và ctv, 1981).
1.4. Biện pháp phòng trừ
Không giống như những loại ký sinh khác, ký sinh gây hại vùng rễ cây trồng
thường rất khó phát hiện và phòng trị kịp thời, lý do là khi chúng ta phát hiện triệu
chứng thể hiện trên cây (héo, vàng lá, ...) thì ký sinh đã tấn công và hủy hoại một
phần mô cây ký chủ nằm phía dưới mặt đất, do đó việc phòng trị bệnh thường tốn
kém nhưng không mang lại hiệu quả cao. Vì vậy, cần phải kết hợp nhiều biện pháp
phòng trị để mang lại hiệu quả kịp thời (Phạm Văn Kim và ctv, 2000).

13
1.4.1. Biện pháp canh tác
1.4.1.1. Làm đất
Đất là nơi lưu tồn của nhiều mầm bệnh khác nhau. Do đó, đất trở thành
nguồn dự trữ, tích lũy và lây lan bệnh. Khi cày bừa đất, chúng ta đã làm thay đổi lý
tính, cấu trúc, ẩm độ và nhiệt độ của đất từ đó làm thay đổi điều kiện sống và phát
triển của mầm bệnh trong đất. Khi cày đất, chúng ta vùi mầm bệnh xuống sâu dưới
đất làm cho chúng chết hoặc khó khăn trong hoạt động gây hại cho cây. Việc cày ải
phơi đất trong một thời gian nhất định trong năm có ảnh hưởng khá quan trọng đối
với bệnh cây (Phạm Văn Kim và ctv, 2000).
Vệ sinh đồng ruộng, chú ý diệt cỏ dại. Trồng với mật độ cây thích hợp cho
từng giống và từng mùa vụ, nên trồng thưa vào đầu mùa mưa.
1.4.1.2. Luân canh
Luân canh nhằm cắt đứt nguồn thức ăn của một số ký chủ chuyên tính, nhờ
đó làm giảm bớt sự nhân một số mầm bệnh. Luân canh còn giúp những cây trồng lạ
tiết ra những chất ức chế mầm bệnh của hoa màu trồng trước đó, ngoài ra các chất
tiết từ rễ cũng có thể giúp kích thích sự phát triển của các vi sinh vật đối kháng
trong đất (Phạm Văn Kim và ctv, 2000).
1.4.1.3. Xen canh
Việc trồng cây xen canh dẫn đến giảm mật độ ký chủ trên đơn vị diện tích,
giảm bớt sự tiếp xúc của các rễ cây lẫn nhau của cây này với các cây lân cận trên
cùng một loại cây. Giảm bớt sự lây lan của mầm bệnh ở rễ và các mầm bệnh trong
đất, thường được phân bố không đồng đều và thường dưới dạng lưu tồn, khi chúng
chuyển sang dạng hoạt động sẽ gây hại cho cây trồng do sự tiếp xúc với rễ của ký
chủ, hoặc do các chất từ rễ ký chủ tiết ra kích thích. Do đó, khi xen canh sẽ làm
giảm đáng kể tình trạng kích thích này, mầm bệnh chỉ ở dưới dạng lưu tồn chứ
không gây hại (Phạm Văn Kim, 2000).

14
1.4.1.4. Sử dụng giống kháng
Nhiều công trình nghiên cứu về giống kháng đối với bệnh khô vằn ở nhiều
nước trên thế giới đã cho thấy chưa có giống lúa nào thể hiện tính kháng bệnh cao.
Phản ứng của các giống lúa đều nằm trong phạm vi từ nhiễm nặng tới tương đối
chống chịu (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Những giống thấp cây, đẻ
nhánh nhiều, lá đứng thường nhiễm bệnh nặng hơn những giống cao cây, đẻ nhánh
ít (Ou, 1985).
1.4.2. Biện pháp hoá học
Có thể phòng trị bệnh vùng rễ với một số loại thuốc hóa học như: khử đất với
thuốc Kitazin 10H (1-2 kg/công). Khi có bệnh mới xuất hiện, có thể xịt một trong
các loại sau: Copper B, Kitazin 50ND hoặc Validacin. Tuy nhiên việc xử lý đất
thường rất tốn kém và lâu dài sẽ có ảnh hưởng bất lợi đến sự cân bằng sinh thái.
1.4.3. Biện pháp sinh học
Trong tự nhiên tồn tại rất nhiều sinh vật đối kháng với nấm Rhizoctonia sp.,
Phomopsis sp., Fusarium sp.,như nhóm nấm đối kháng: Trichoderma spp.,
Gliocladium spp., Penicillium spp…, nhóm xạ khuẩn: Streptomyces spp…, và nhóm
vi khuẩn đối kháng Baccillus subtilis,Pseudomonas arguginos, Pseudomonas
flluorecens. Nhưng để phòng trừ bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia sp., Phomopsis
sp, Fusarium sp., trong đề tài này ta sử dụng nấm đối kháng Trichoderma spp.
Phòng trừ sinh học là một biện pháp thay thế biện pháp hóa học trong phòng
trừ bệnh cây. Vì biện pháp hóa học gây hậu quả lớn ảnh hưởng đến môi trường...
Tiềm năng sử dụng vi sinh vật vùng rễ để thay thế hoặc bổ sung vào hóa chất diệt
nấm đã được nhiều tác giả đề cập đến. Trong số vi khuẩn đối kháng được nghiên
cứu về khả năng áp dụng trong kiểm soát sinh học thì Pseudomonas phát huỳnh
quang là một trong những nhóm được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều
nghiên cứu ở Ấn Độ sử dụng P. fluorescenes NBRI2650 ức chế một số nấm trong
đất nhưFusarium, Rhizoctonia, Pythium gây bệnh trên nhiều loại cây trồng như đậu
xanh, dưa chuột, cà chua.

15
1.4.4. Sử dụng nấm đối kháng
➢ Ở ngoài nước
Trong nhiều loại nấm đất có tiềm năng đối kháng, Trichodermaspp., là giống
được sử dụng trong phòng trừ sinh học vì chúng là những loài nấm ký sinh hay
được gọi là siêu ký sinh tức là nấm ký sinh trên nấm.
Nghiên cứu về hiện tượng siêu ký sinh của các loài nấm đối kháng
(Manibhushanrao và ctv, 1989), đã quan sát thấy sợi nấm của Trichoderma hình
thành một cấu trúc nhỏ móc vào sợi nấm R. solani, sau đó cuộn quanh sợi nấm ký
chủ hoặc mọc ra những tơ nấm nhỏ buộc chặt ký chủ.
IRRI (1976), đã báo cáo rằng các dòng Trichoderma spp., thu thập trên
ruộng lúa thì phổ biến ở lúa rẫy hơn là lúa nước. Với khả năng cạnh tranh cao các
tàn dư thực vật trên đồng ruộng, các dòng Trichoderma có thể làm cạn kiệt nguồn
thức ăn và do đó ức chế nấm gây bệnh trong đất. Tuy nhiên, các tác dụng ức chế
cũng có thể thông qua các hợp chất do nấm đối kháng tiết ra.
➢ Ở Việt Nam:
Những nghiên cứu phòng trừ sinh học bệnh lở cổ rễ bắt đầu từ những năm
cuối của thập niên 1980. Trong thời gian đầu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào
việc đánh giá trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới tính đối kháng của tập
đoàn VSV phân lập được trong tự nhiên, trên cơ sở đó xác định được một số dòng
vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia sp., Fusarium sp., Pythium
sp., và bệnh Phomopsis sp., những đánh giá về hiệu lực phòng trị bệnh lở cổ rễ của
các dòng nấm đối kháng Trichoderma spp.
1.5. Tổng quan về nấm Trichoderma
1.5.1. Đặc điểm của nấm Trichoderma
Trichoderma là chi khá phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường
đất. Theo Gary J.Samuels(1932), Trichoderma ít tìm thấy trong thực vật sống và
chúng không sống nội ký sinh với thực vật. Ngày nay, hệ thống phân loại của nấm

16
Trichoderma vẫn chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến đưa ra khi
phân loại nấm này.
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp:Deuteromycetes
Bộ: Moniliales
Họ: Moniliaceae
Giống: Trichoderma spp.
TheoAgrios G.N (1997), Hrman G.E (2002), hầu như Trichoderma spp., có
giai đoạn sinh sản vô tính (đây là lý do Trichoderma spp. được phân loại thuộc
nhóm nấm bất toàn Deuteromycetes, bộ: Moniliales), tuy nhiên một vài loài
Trichoderma spp., cũng có khả năng sinh sản hữu tính nên được phân vào lớp nấm
Ascomycetes, bộ Hypocreales, giống Hypocrea.
1.5.2. Đặc điểm hình thái (Gary J. Samuels, 2004)
Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển rất
nhanh, trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang
xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số
chất làm thạch của môi trường PGA hóa vàng.
Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Cuống bào tử
là một nhóm sợi nấm bện vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ
những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn
lạc (T. koningii), có kích thước từ 1 - 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như
bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch
agar và chúng hoạt động như chồi mầm.
Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống
sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách

17
ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc điểm nổi bật
của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (như
T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình ellip hoặc hình oval (với tỉ lệ
dài : rộng từ 1 – 1,1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài : rộng là hơn 1,4 µm), đa số
các bào tử trơn láng. Kích thước không quá 5 µm.
Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà T.
harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng.
Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của
Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên
chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học.
1.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học
Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 đến
9,5. Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường
là 25 – 30 0C. Một vài dòng phát triển tốt ở 350C. Một số ít phát triển được ở 400C
(Gary J. Samuels, 2004). Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái sợi
nấm và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350C
chúng hình thành bào tử nhỏ, ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.
Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic
(enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2
enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối
kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy
mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được biết (Gary J. Samuels, 2004).
Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tượng
đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và
tác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa
dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loài Trichoderma. Vì thế, sẽ
tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây

18
chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế
phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật (Gary E. Harman, 2000).
1.5.4. Nguồn gốc
Trichoderma được tìm thấy khắp mọi nơi trừ ở những vĩ độ cực Nam và cực
Bắc. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu
rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã
chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác
(Gary J. Samuels, 2004). Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không
sống nội kí sinh với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu
nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E. Harman, 2000).
1.5.5 Một số loài Trichoderma thường gặp ở vùng nhiệt đới
1.5.5.1. Trichoderma pseudokoningii Rifai
Nấm T. pseudokoningii phát triển rất nhanh, đường kính tản nấm lên đến 8 –
9 cm chỉ sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC. Sợi nấm trong suốt, vách trơn láng,
rộng 1 – 2µm. Bào tử áo có vách dày, trơn láng, trong suốt hoặc có màu xanh, hình
cầu méo hoặc bầu dục, kích thước thường là (4-12µm) x (3- 9µm) (Bissett, 1984).
1.5.5.2. Trichoderma atroviride Bissett
Nấm T.atroviride phát triển rất nhanh, đạt 8 – 9cm sau 4 ngày nuôi cấy ở
20oC, sợi nấm trong suốt, vách trơn láng, rộng 2 – 14µm. Bào tử áo có vách dày và
trơn láng, màu xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục, đường kính 4 – 12µm, đôi khi
lên đến 24µm.
1.5.5.3. Trichoderma hamatum Bain
Nhiệt độ 24oC và pH 3,7 – 4,7 là những điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển
của T. hamatum và chúng phát triển chậm lại ở 0oC (Domsch và Gams, 1980). Đường
kính tản nấm ở 5 ngày sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC là 7cm. Thể bình và nhánh
rộng 3 – 4µm. Bào tử đính của nấm T. hamatum có hình trụ ngắn, màu xanh lục, vách
trơn láng và có kích thước khác nhau tùy theo chủng (Domsch và Gams, 1980).

19
1.5.5.4. Trichoderma inhamatum Veerkamp & W. Gams
Nhiệt độ tối hảo cho sự phát triển của T. inhamatum là 24 – 30oC và nhiệt độ
tối đa mà nấm có thể chịu đựng được là 36oC (Bissett, 1984). Nấm T. inhamatum
phát triển khá nhanh, đường kính tản nấm có thể đạt tới 9cm sau 3 ngày nuôi cấy ở
nhiệt độ24 – 30oC. Thể bình có hình bầu nậm, kích thước (4,0 – 5,0 µm) x (2,3 –
3,0µm). Bào tử có dạng hình cầu hoặc hình trứng, vách mỏng và trơn láng, màu
xanh lục, kích thước (2,3 – 3,0 µm) x (2,0 – 2,6µm).
1.5.5.5. Trichoderma harzianum Rifai
T. harzianum là loài nấm rất phổ biến trong đất (Cook và Baker, 1998). Môi
trường có nhiệt độ từ 15 – 35oC, pH 3,7 – 4,7 rất thích hợp cho sự phát triển của
nấm (Domsch và Gams, 1980). Nấm T. harzianum phát triển nhanh và có đường
kính khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC. Bào tử đính có hình cầu méo
đến bầu dục ngắn, màu xanh lục, vách trơn láng, kích thước (2,7 – 3,2 µm) x (2,5 –
2,8µm), nẩy mầm tốt nhất trong môi trường mùn cưa có ẩm độ khoảng 30%
(Domsch và Gams, 1980).
1.5.5.6. Trichoderma koningii Ouden
T. koningii hiện diện nhiều ở lớp đất mặt nhưng ở độ sâu 120 cm vẫn có sự
hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 26oC trở lên tùy theo
nguồn gốc của loài. pH cho sự phát triển của nấm là 3,7 – 6,0 (Domsch và Gams,
1980). Tản nấm có đường kính 3 – 5 cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC, bào
tử đính có dạng hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0 – 4,8 µm) x (1,9 –2,8
µm).
1.5.6. Các cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp.
Sự tương tác đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác được phân
loại như sau: tiết ra các chất kháng nấm bệnh (antibiosis), kí sinh lên cơ thể của nấm
bệnh (mycoparasitism), cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh (competition for
nutrient). Những cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối kháng thực tế có

20
thể là một trong những loại cơ chế này. Cả cơ chế tạo ra các chất kháng nấm và cơ
chế kí sinh có thể liên quan đến sự cạnh tranh dinh dưỡng, thật ra sự sản xuất ra các
chất độc được biết có ảnh hưởng đến tình trạng dinh dưỡng của môi trường tăng
trưởng. Chứng cớ gần đây chỉ ra rằng các chất kháng sinh và các enzyme thủy phân
không chỉ được tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ nhau trong cơ chế đối kháng kí sinh.
Cơ chế kí sinh (mycoparasitism)
Ký sinh nấm có thể được xem như là sự tấn công trực tiếp của một loài nấm
trên loài nấm khác và thông thường được định nghĩa là đối kháng trực tiếp (Dix và
Webster,1995) .
Theo Chet (1990) cơ chế đối kháng kí sinh gồm 4 giai đoạn: Bước thứ nhất
sự tăng trưởng có tính chất hướng hóa (chemotrophic growth), trong giai đoạn này
tác nhân kích thích hóa học gây ra bởi chủng nấm mục tiêu đã hấp dẫn chủng nấm
đối kháng; Bước thứ hai: sự nhận dạng đặc hiệu (specific recognition), tức chủng
nấm đối kháng nhận diện được bề mặt tế bào của nấm bệnh gây bệnh (Barak và ctv,
1985); Bước thứ ba: sự tấn công và xoắn vòng của sợi nấm Trichoderma xung
quanh vật chủ tế bào nấm bệnh; Bước thứ tư: sự bài tiết các enzyme phân giải ,
chúng sẽ phân hủy vách tế bào chất của vật chủ (Chet và ctv, 1998). Hệ enzyme
phân giải vách tế bào bao gồm chitinases, glucanase, protease
Hình1.1: Sự tác động của Trichoderma spp. lên tác nhân gây bệnh (Pythium)
Nguồn: Hubbard và ctv, 1983. Phytopathology 73:655-659

21
Hình1.2: Hệ sợi nấm Trichodermakí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia
Kháng sinh (antibiosis)
Thuật ngữ kháng sinh chỉ sự sản xuất các chất kháng sinh bởi các loài vi nấm
và đặc biệt bao gồm cả giống nấm Trichoderma. Kiểu tương tác này được định
nghĩa là sự đối kháng gián tiếp vì ở đây sự đối kháng diễn ra mà không yêu cầu sự
tiếp xúc với sợi nấm bệnh (Dix và Webster, 1995). Người ta đã chứng minh rằng
Trichoderma có khả năng sản xuất lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp khác
nhau có đặc tính ức chế nấm và vi khuẩn. Cơ chế kháng sinh thường diễn ra phối
hợp với ký sinh nấm (Schirmblock và ctv, 1994), tức những enzyme thủy phân giúp
cho các chất kháng sinh xâm nhập được vào tế bào chủ. Các chất kháng sinh có thể
ức chế sự thành lập vách tế bào, do đó làm gia tăng sự hoạt động của những enzyme
thủy phân (Lorito và ctv, 1996). Các chất kháng sinh cũng có thể tác động đến nấm
mục tiêu thông qua hàng loạt cơ chế khác nhau như kiềm hãm sự phát triển, sự sản
xuất các chất chuyển hóa sơ cấp, sự hấp thu các chất dinh dưỡng và sự hình thành
bào tử (Howell,1998). Kháng sinh có đặc trưng cho từng loài và các loài
Trichoderma khác nhau có khả năng kiểm soát sinh học không giống nhau trong
việc chống lại các mầm bệnh và tiêu diệt chúng.
Theo Howell (1987) thấy rằng những chủng T. virens đột biến mất khả năng
kí sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm
bệnh Rhizoctonia sp.tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng kí
sinh không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh

22
kháng sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó
là một trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này
có thể ức chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác. Khả năng sinh kháng
sinh của các loài, các chủng không giống nhau, chúng gồm: Gliotoxin: chất kháng
sinh này được R.Weindling và O. Emerson mô tả năm 1936 do nấm Trichoderma
lignorum sinh ra. Gần đây được xác định lại là do nấm T. virens sinh ra. Chất
gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta,
Botrytis, Phytophthora, Pythium…). Kháng sinh viridin: Đây là chất kháng sinh
thứ cấp do nấm Trichoderma tạo thành trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh
này được phát hiện năm 1945. Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và có hoạt
tính chống nấm cao.
Cơ chế enzyme
Ngoài cơ chế kí sinh và kháng sinh, một số tác giả nghiên cứu cho thấy rằng
các enzyme ngoại bào do Trichoderma sinh ra đóng vai trò quan trọng trong tính
kháng nấm bệnh của chúng.
Metcalf và Wilson nghiên cứu chủng T.koningii sinh mạnh các enzyme
exochitinase và endochitinase. Khi sử dụng chủng này để sử lí những cây hành bị
nhiễm nấm Sclerotium cepivorum thấy hiện tượng: hệ sợi T.koningii thâm nhập vào
biểu bì và mô vỏ của rễ, hệ sợi nấm bệnh bị phá hủy. Trong một nghiên cứu tương
tự, Woo và ctv đã làm rõ vai trò của enzyme tới khả năng kháng nấm bệnh của
Trichoderma bằng cách phá vỡ hoạt động của enzyme chitinase của T.haianum. Kết
quả cho thấy chủng mất hoạt tính chitinase biểu hiện giảm hoạt động kiểm soát sinh
học chống lại Botrytis cinrea gây bệnh trên lá đậu.
Trichoderma hazinum sản sinh ra loại protease có khả năng khử hoạt tính
enzyme thủy phân nấm Botrysis cinerea gây bệnh trên lá đậu (Kapat và ctv). Những
enzyme protease của T.harianum phá vỡ enzyme thủy phân của nấm bệnh do đó
làm mất khả năng xâm nhập vào cây của nấm bệnh.

23
Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự tác động hiệp trợ giữa enzyme và
kháng sinh cho hiệu quả điều khiển sinh học cao hơn. Pietro và ctv đã nghiên cứu
hiệu quả hiệp trợ của enzyme endochitinase và gliotoxin tác động lên sự nảy mầm
của nấm bệnh Botrytis cinerea thấy rằng có sự kết hợp của cả hai cơ chế enzyme và
kháng sinh sẽ cho hiệu quả phòng trừ cao hơn khi sử dụng cơ chế enzyme hay
kháng sinh đơn lẻ.
Loritp và ctv đã mở rộng hơn khái niệm hiệp trợ tác động khi kết hợp một
hỗn hợp kháng nấm với một số loại enzyme thủy phân và ứng dụng chúng để làm
giảm nguồn bệnh. Hiện tượng hiệp trợ hiệu quả thấp khi enzyme được bổ sung sau
phức hợp kháng nấm. Điều đó chỉ ra rằng sự phá hủy thành tế bào nhờ enzyme là
cần thiết để tăng hiệu quả của phức hợp kháng nấm.
Cơ chế cạnh tranh (competition)
Không chỉ có cơ chế kí sinh, sự sinh kháng sinh hay tiết enzyme là hiệu quả
trong điều khiển sinh học mà cơ chế cạnh tranh cũng được coi là cơ chế có ý nghĩa
hết sức quan trọng vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biến đối với
vi sinh vật. Cơ chế này cũng ứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm soát sinh học
điều khiển các bệnh do nấm.
Một cơ chế khá phổ biến đã được nghiên cứu nhiều trong những năm gần
đây là sự cạnh tranh của nấm đối kháng với nấm bệnh tại vùng rễ. Nấm
Trichoderma có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua cạnh tranh với nguồn gây
bệnh cây về dinh dưỡng và nơi cư trú. Nấm Trichoderma thường định cư trước so
với các nguồn bệnh cây. Do đó, chúng chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng
của nguồn gây bệnh. Trichoderma có thể ức chế hoặc làm giảm sự phát triển mầm
bệnh cây trông thông qua việc cạnh tranh không gian, cơ chất enzyme, chất dinh
dưỡng hoặc oxygen (Dix và Webster,1995)
Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đưa ra khái niệm cạnh tranh
khai thác và cạnh tranh cản trở vào tương tác giữa quần thể nấm. Sự cạnh tranh cản
trở liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi vi sinh vật này giới hạn vi sinh vật

24
khác tiếp xúc cơ chất và xảy ra do sự tương tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài
hoặc khác loài. Sự cạnh tranh khai thác xảy ra giữa 2 loài cùng khai thác một nguồn
lợi nhưng khác nhau về tốc độ và hiệu quả khai thác. Trong trường hợp nguồn lợi là
nguồn dinh dưỡng được xem như cạnh tranh dinh dưỡng.
Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của Trichoderma
Ngoài khả năng bảo vệ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn
trong đất, nhiều loài trong chi Trichoderma được bổ sung vào đất còn có khả năng
kích thích cơ chế tự bảo vệ thực vật chống lại virus, vi khuẩn, nấm. Trong trường
hợp này, các nấm Trichoderma đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích
thích hệ rễ miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật.
Cơ chế hoạt động của nấm Trichoderma là tiết ra một enzyme làm tan vách
tế bào của các loài nấm hại, sau đó tấn công vào bên trong và tiêu diệt chúng bảo vệ
cây trồng. Vì thế, khi sử dụng các chế phẩm có chứa nấm Trichoderma còn có tác
dụng tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển trong đất, kích thích sự
tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải chất xơ, chitin,
ligin… trong các phế thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho cây
trồng hấp thu dễ dàng.
1.6. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma
1.6.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng
• Bảo vệ thực vật
Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma spp. được quan tâm
nhiều nhất, đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số
nấm gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại Trichoderma
spp. khác nhau để kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác nhau. Kết quả là các loài
Trichoderma spp. kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh sau:
Rhizoctonia sp.:gây mục rễ, thân và hạt,…
Sclerotium rolfsii: xơ cứng ở cà chua và khoai tây.

25
Pythium sp.: gây úng thối ở đậu, thuốc lá, cây con,…
Armillaria mellea: mục rễ ở cây rừng, cao su, thông.
Botrytis cinerea: mốc xám gây hỏng dâu và nho.
Penicillium diditatum: hỏng trái ở chanh và chuối.
Phytophthora sp.: mục rễ, hỏng trái ở ca cao.
Chondeostereum purpureum: bạc lá ở đào và mận.
Hiện nay các chủng Trichoderma spp. đã được sử dụng rộng rãi trong các
chế phẩm sinh học thương mại như: GlioGard – một chế phẩm với thành phần chính
là Trichoderma spp. kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh sau: Rhizoctonia sp.,
Sclerotium rolfsii, Pythium sp., Armillaria mellea, Phytophthora sp, Phomopsis sp.,
Fusarium sp....
Ngoài ra, ở New Zealand, người ta còn trộn nhiều chủng Trichoderma khác
nhau để kiểm soát bệnh trên cây nho và các cây dạng quả hạch (Esposito, E. and
Silva, 1998). Ở Mỹ, người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống để
tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước khi
trồng trọt.
Trong nước, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm
Trichoderma xử lí đất trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm mốc với phân chuồng
hoại mục trước khi bón ruộng 5 - 10 ngày, rồi rải trên ruộng trước khi gieo hạt có
tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp (Trần Thị Thuần và ctv, 1995)
• Cải thiện năng suất cây trồng
Cũng như thuốc trừ sâu, phân bón hoá học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác
bị thoái hóa, chai sạn; các loại giun đất không phát triển được, làm hạn chế độ xốp
đồng thời, độ thông khí cần thiết cho rễ cây cũng thiếu hụt. Vì vậy, các nước có nền
nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng sử dụng các phân bón hữu cơ sinh
học thế hệ mới – thực chất là một sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu

26
sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học. Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này có
các tác dụng sau:
Phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, bệnh héo rũ, bệnh chết cỏ, bệnh
nấm sương mai, bệnh đốm nâu… và hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm gây
mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh, đồng thời bảo vệ cây
trồng khỏi các côn trùng đục phá thân (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Đăng Diệp,
1998)
Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo
ra hệ rễ cứng cáp hơn. Gần đây, khi khảo sát các loài Trichoderma spp. ở các lớp
đất sâu, người ta còn thấy Trichoderma spp. làm tăng số lượng các rễ sâu (các rễ
cách mặt đất khoảng 1m). Điều này góp phần giúp cho các cây lương thực như ngô
hay các loài dùng để trang trí như cỏ lát có khả năng chống chịu tốt với hạn hán.
Một nghiên cứu gần đây còn cho biết nếu ngô có Trichoderma harzianum T-22 kí
sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-22.
Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa. Đã
có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và
Trichoderma koningii kích thích sự nẩy mầm và tăng trưởng của cây. Đối với các
hoa được trồng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng
cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa.
Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh
vật nốt sần cố định nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích
trong đất; bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng
Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường
dinh dưỡng và kích thích sinh trưởng của cây.
Tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng Trichoderma harzianum còn
có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng. Như
vậy, các chủng nấm Trichoderma spp. trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh
không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế

27
các bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong
tự nhiên.
1.6.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường
Trichoderma harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong
đất rừng. Sự tồn tại của các hợp chất chloroguaiacols, hợp chất AOX (các hợp chất
halogen thấm nước) trong chất thải của các nhà máy sản xuất bột giấy ở hồ Bonney,
Đông Nam nước Úc và các sản phẩm phân giải của Trichoderma harzianum đã
được nhà khoa học Van Leeuwen cùng các cộng sự nghiên cứu. Chất tẩy trắng chlor
của các nhà máy sử dụng sulfit hóa bột giấy được tháo ra hồ một cách gián đoạn đã
làm xuất hiện các hợp chất chlorophenol trong nước và cặn bẩn. Hợp chất
chlorophenol này rất độc. Trichoderma harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập
trung của các hợp chất tự do 2,4,6-trichlorophenol; 4,5-dichloroguaiacol và cả AOX
trong môi trường có chứa muối khoáng. Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen
hóa tetrachloroguaiacol tự do trong môi trường khoáng mặn. Trichoderma
harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng trên ciliatin,
glycophosphat và amino methylphosphonic acid (3-methoxyphenyl) ( theo Esposito,
E. and Silva, 1998)
Trichoderma harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật Trường Đại học
California) có thể phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và
pentachlorophenol. Nấm này phân giải endosulfan trong nhiều điều kiện dinh dưỡng
khác nhau trong suốt quá trình sống của nó. Trichoderma harzianum CCT - 4790
phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt
để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất và trong đầm lầy. Một công trình
nghiên cứu khác sử dụng chủng nấm mốc Trichodermareesei RUT-30 để xử lý chất
thải sinh hoạt đô thị, hứa hẹn một nguồn sản xuất enzyme cellulase rẻ tiền, đồng thời
giảm lượng rác thải. Các enzyme cellulase thu được từ đây được đánh giá là tốt hơn
và kinh tế hơn so với enzyme cellulase được lấy từ các nguồn cơ chất cellulose tinh
chế (theo Sạnjoy Silva, Bill B.Emore and Houston K. Huckabay, 1995)

28
1.6.3. Trong các lĩnh vực khác
Trichoderma spp. là nguồn sản xuất hiệu quả các hệ enzyme cellulase ngoại
bào. Các enzyme này được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp dệt, do chúng có
thể làm cho vải bông mềm và trắng hơn (La Grange, 1996)
L.Grange và cộng sự đã biểu hiện gen - xylanase (XYN2) của Trichoderma
reesei ở Saccharomyces cerevisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả
năng tiêu hóa hemicellulose trong lúa mạch và các cây lương thực khác.
Tương tự, có rất nhiều gen được tạo dòng từ Trichoderma spp., mở ra một
hướng đi mới trong công tác bảo vệ mùa màng, sản xuất các cây lương thực an toàn
và gần gũi với thiên nhiên, tạo ra các cây chuyển gen có khả năng chống chịu bệnh
tốt.

29
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Điều kiện nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu : Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM
-Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 7
-Cây trồng nghiên cứu: cây cà tím và cây cà chua
-Mẫu bệnh được thu thập dựa trên đặc điểm bệnh lý của cây: rễ bị teo thắt ở
phần cổ rễ, thối rễ...
2.2. Dụng cụ, thiết bị
2.2.1. Các dụng cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm
Buồng cấy nấm
Kính hiển vi quang học
Cân kỹ thuật
Nồi hấp
Các dụng cụ nhỏ: bình tam giác, bình định mức, đũa thủy tinh, đĩa petri, que
cấy nấm, đèn cồn, khay đựng, bông, dao, kéo,…
2.3. Môi trường hóa chất dùng để nuôi cấy và phân lập nấm
2.3.1. Môi trường WA (Water Agar)
Thành phần môi trường: -Nước cất : 1000 ml
-Agar: 15g
- Chất kháng khuẩn chloramphenicol: 0,25 g/ l
Phương pháp điều chế: Thạch được hòa tan trong nước đun sôi và hấp thanh
trùng trong điều kiện 1210C trong thời gian 20 phút. Môi trường sau khi hấp xong

30
để nguội dần khoảng 600C rồi đổ vào các đĩa petri, đổ một lượng vừa phải, thích
hợp.Môi trường này dùng để phân lập nấm ban đầu, ít bị lẫn tạp nhiễm do nghèo
dinh dưỡng và để nuôi cấy đơn bào tử.
2.3.2. Môi trường PDA ( Potato D-Glucose agar)
Đây là môi trường giàu dinh dưỡng dùng để nuôi cấy làm thuần nấm.
Để quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc, đo kích thước sợi nấm, sắc tố
tản nấm sinh ra trên môi trường
Thành phần môi trường: -D-glucose: 20g
-Potato extract: 4g
-Agar: 15g
-pH= 6
2.4. Vật liệu nghiên cứu
2.4.1. Nấm đối kháng
Các chủng nấm Trichoderma đối kháng được lấy từ bộ giống của Trung tâm
Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM, bao gồm 8 chủng: B1, B5, B12, B4, TN1, T3,
CĐ02, CĐ08.1.
2.4.2. Nấm gây bệnh
Các dòng nấm Rhizoctonia sp. được phân lập từ cà chua, nấm Phomopsis
sp.và Fusarium sp. được phân lập từ cà tím có dấu hiệu lở cổ rễ, thối rễ được phân
lập từ mẫu bệnh.
2.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phân lập nấm gây bệnh
• Nguyên tắc
Trong thiên nhiên hoặc trong vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại
ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứuvề hình thái, sinh lý,

31
sinh hóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng
thuần. Tức là tìm cách phân lập, tách riêng từng tế bào vi sinh vật, nuôi cấy chúng
trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng nhằm thu được các dòng thuần khiết mục
tiêu.
• Tiến hành
Cách lấy mẫu bệnh
Mẫu bệnh được thu thập từ rễ có dấu hiệu bệnh lở cổ rễ, thối rễ có dấu hiệu
vằn vện màu nâu. Lưu ý chọn các mẫu mới bị bệnh để phân lập nhằm tránh bị các
loại nấm hoại sinh tấn công làm cho quá trình phân lập nấm bệnh gặp khó khăn do
các loại nấm hoại sinh phát triển rất nhanh trên môi trường phân lập.
Mẫu bệnh được cho vào túi giấy đã hấp khử trùng. Mỗi mẫu bệnh được cho
riêng vào một túi. Mẫu lấy về, phân lập sớm nhất trong thời gian có thể, hoặc có thể
cất vào tủ mát để tránh bị các loại nấm hoại sinh phát triển và lan nhanh.
Các bước phân lập nấm bệnh từ mẫu bệnh như sau:
Rửa rễ cây cà tím và rễ cây cà chua dưới nước máy để loại bỏ đất và bụi bẩn.
Dùng bông có tẩm cồn 700 để khử trùng bề mặt. Đưa mẫu cấy vào tủ cấy để tiến
hành phân lập. Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt nhỏ mẫu bệnh, kích thước 1-2 mm,
từ phần ranh giới giữa mô không có dấu hiệu bệnh và mô bệnh còn mới, khử trùng
bằng cồn 70o trong 30 giây, tiếp tục rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần, thấm khô bề
mặt mẫu bệnh bằng giấy thấm thanh trùng, đặt mẫu bệnh vào đĩa petri chứa môi
trường WA, ủ ở nhiệt độ khoảng 25oC. Sau 48 giờ, quan sát khuẩn ty nấm phát triển
và cấy truyền sang môi trường PDA trong đĩa petri, lưu trữ các ống nghiệm ở nhiệt
độ 40C cho các thí nghiệm tiếp theo.
Phương pháp cấy truyền từ các đĩa phân lập
Cấy truyền là bước trung gian giữa phân lập từ mẫu bệnh và làm thuần vi
sinh vật gây bệnh. Giai đoạn này giúp xác định vi sinh vật nào đã phân lập.

32
Hình 2.1: Phân lập nấm bệnh từ một mẫu bệnh cây (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây
ở Việt Nam)
Sau khi cấy truyền các mẫu nấm có trong mẫu cấy ban đầu, tiến hành làm
thuần các mẫu nấm từ các mẫu nấm cấy truyền bằng cách cấy đỉnh sợi nấm sang
môi trường dinh dưỡng như môi trường PDA. Dùng que cấy dẹp đã khử trùng, lấy
một miếng thạch nhỏ chứa phần đỉnh của sợi nấm cấy sang môi trường PDA. Cách
chọn đỉnh đầu sợi nấm để làm thuần được tiến hành như hình 2.2
Hình 2.2: Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm để làm thuần(Cẩm nang chẩn đoán bệnh
cây ở Việt Nam)
2.5.2. Quan sát hình thái bằng phương pháp phòng ẩm
- Chuẩn bị các đĩa petri có đặt bông gòn thấm, giấy lọc, lame và lamelle đã
được hấp khử trùng lên đĩa petri.

33
- Đổ nước cất vô trùng lên giấy lọc để tạo độ ẩm.
- Dùng dao mổ vô trùng cắt một miếng thạch hình vuông khoảng 6mm từ đĩa
thạch PDA cho lên lame.
- Dùng que cấy lấy một ít sinh khối nấm mốc cấy lên miếng thạch, cấy lên cả
mặt trên và mặt dưới của miếng thạch
- Dùng que gắp, gắp lame đậy lên bề mặt khối thạch.
- Đậy nắp đĩa petri lại và để ở nhiệt độ phòng
- Sau 48h, tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm lactophenol và quan sát tế
bào dưới kính hiển vi quang học.
2.5.3. Bảo quản
Các chủng nấm thuần sau khi được chọn lọc sơ bộ được tiến hành bảo quản
trong môi trường PDA ống thạch nghiêng và được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC
(Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2003). Bên cạnh đó, các chủng nấm thuần còn được
bảo quản lạnh sâu trong glycerol 20% ở - 800C.
2.6. Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch
Tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng phương pháp đưa mầm bệnh trực
tiếp vào trong đất. Sinh khối nấm được nhân trên giá thể tự nhiên như vỏ trấu hay
hạt lúa từ 2 - 3 tuần. Sau đó trộn vào đất theo tỉ lệ thích hợp 1g nấm bệnh / chậu
500g đất. Tỉ lệ gieo hạt là 10 hạt / chậu.Tiến hành quan sát, kiểm tra sự nảy mầm
của hạt so với mẫu đối chứng.
Sau 15 ngày tiến hành kiểm tra và so sánh các triệu chứng của cây được lây
bệnh với cây đối chứng. Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh những
triệu chứng này với các triệu chứng đã quan sát được trên đồng ruộng.
Phương pháp tính toán và xử lí:
TLB =
𝐴
𝐵
x 100

34
Trong đó: A là số cây bị bệnh nhiễm lở cổ rễ
B là Tổng số cây điều tra
2.7. Định danh các chủng nấm tuyển chọn được bằng sinh học phân tử dựa vào
vùng trình tự bảo tồn ITS
a. Ly trích DNA
• Thu sinh khối: Tiến hành thu sinh khối nấm sau 2 ngày nuôi cấy lắc trên môi
trường PDB lỏng. Sinh khối được nghiền mịn bằng nitơ lỏng và cho vào
eppendorf khoảng 2 ml
• Ly trích DNA tổng số:
Bước 1: Cho 600 µl dung dịch ly giải tế bào (lysis buffer) vào mỗi
eppendorf, vortex mẫu để trộn đều sinh khối nấm với dịch ly giải tế bào, làm sinh
khối nấm không bị vón cục, tạo huyền phù sinh khối nấm vào dịch ly giải, từ đó
giúp cho việc phá vỡ tế bào nấm tốt hơn. Sau đó, ủ ở 650 C trong 1 giờ, cứ cách 20
phút lắc 1 lần trong quá trình ủ.
Bước 2: Lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt, thêm tiếp 450µl phenol:chloroform:
isoamyl alcohol (25:24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ nhàng cho đều, để 5 phút ở
nhiệt độ phòng
Bước 3: Ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ 4oC, hút thu
khoảng 300 - 400 µl dịch nổi
Bước 4: Thêm 180 -240 µl isopropanol lạnh vào dịch mẫu (đảm bảo thể tích
isopropanol gấp 0,6 lần thể tích dịch nổi) và ủ ở -200C trong 20 phút, sau đó ly tâm
với tốc độ 13000 vòng trong 7 phút ở nhiệt độ 40C
Bước 5: Hút bỏ dịch nổi để thu tủa ở đáy eppendorf
Bước 6: Rửa tủa 2 đến 3 lần bằng ethanol 70%
Bước 7: Phơi khô mẫu sau đó bảo quản trong 50 µl dung dịch TE 0,5X và trữ
lạnh ở -800C

35
Sau bước tách chiết DNA tiến hành điện di để kiểm DNA tổng số, chủ yếu là để
biết được bước tách chiết có thành công hay không, chắc chắn có DNA để thực hiện
các bước tiếp theo.
b. Kiểm tra kết quả ly trích DNA và pha loãng DNA
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1% (w/v) : Cân 1g agarose cho vào bình đã có
chứa 100 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong lò viba ở
650W trong 2 phút. Để nhiệt độ trong chai giảm xuống dần (còn khoảng 600C), đổ
vào khuôn có gắn lược với số giếng mong muốn. Chờ gel đông (khoảng 30 phút),
lấy lược ra cho gel vào buồng điện di và bắt đầu tiến hành nạp mẫu.
Bước 2: Nạp mẫu, xác định các thông số điện di và đọc kết quả:
Đối với DNA tổng số: dùng micropipette hút lấy 4μl mẫu, trộn đều với 2 μl
loading dye, hút tổng lượng thể tích là 6μl bơm vào giếng tương ứng đã bố trí sẵn.
Lần lượt bơm các mẫu khác đã được trộn đều với thuốc nhuộm vào tất cả các giếng
còn lại. Tiến hành điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu
điện thế là 100V, cường độ dòng điện 250A trong khoảng 20 - 30 phút. Kết thúc
quá trình điện di, bảng gel được chuyển vào thuốc nhuộm ethidium bromide (1%)
trong khoảng 15 - 20 phút, rửa sạch gel và đọc kết quả bằng phần mềm Quality One
của máy Gel doc 2000 (Biorad).
Kết quả điện di thể hiện qua chương trình của máy đọc gel ta có thể dự đoán
được độ pha loãng cần thực hiện đối với từng mẫu DNA tổng số để xác định nồng
độ dung dịch DNA thích hợp cho phản ứng PCR .
Đối với sản phẩm PCR: kiểm tra kết quả phản ứng PCR và lượng DNA được
khuyết đại lên trong phản ứng cũng thông qua quá trình nạp mẫu lượng mẫu cần lấy
4 μl, điện di trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế là 100V khoảng 30 phút,
nhuộm gel trong ethidium bromide (1%) và đọc kết quả trên máy chụp hình gel doc
bằng chương trình Quality One. Band xuất hiện trên miếng gel cho ta kết quả dương
tính, chỉ một band duy nhất cho kết quả kiểm tra sản phẩm DNA trong phản ứng
PCR.

36
c. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA
Sử dụng hai primer ITS4 và ITS5 (White và ctv, 1990) để khuyếch đại vùng
ITS - rDNA của nấm bệnh có kích thước khoảng 700 bp.
Trình tự hai primer
ITS4: 5' TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3'
ITS5: 5' GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 3'
Thành phần một phản ứng PCR thể tích 25 µl
Thành phần Hàm lượng (µl)
10X buffer
MgCl2
dNTP
Taq polymerase
Primer ITS4
Primer ITS5
DNA mẫu
Nước cất
Tổng thể tích phản ứng
2,5
1,5
0,5
0,25
0,5
0,5
1
18,25
25
Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Các bước phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động
Chạy chu kỳ ( 35 chu kỳ)
Tách DNA khuôn ( biến
tính)
Ủ bắt cặp
Kéo dài
Giai đoạn kết thúc
940 C
940 C
560 C
720 C
720 C
40 C
5 phút
30 phút
45 giây
2 phút
10 phút
∞

37
Sau khi phản ứng PCR kết thúc, tiến hành điện di trên gel agarose 1,2 % thời
gian 30 phút. Sau đó ta nhuộm gel và chụp hình nhuộm bằng máy geldoc.
d. Giải trình tự DNA, xác định loài
Mẫu được gửi giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) để xác định loài
2.8. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với các loài nấm
bệnh gây lở cổ rễ trên đĩa petri
8 dòng nấm Trichoderma spp.: B1, B4, B5, B12,TN1, T3, CĐ02, CĐ08.1
được đánh giá tính đối kháng đối với sự phát triển của nấm bệnh gây hại trên cây cà
chua, cà tím trên môi trường dinh dưỡng PDA, trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5mm, vô trùng, khoan lấy một phần
thạch ở rìa khuẩn lạc nấm bệnh và đặt vào đĩa petri có chứa môi trường PDA sao
cho điểm thạch cách mép petri 1,5 cm. Tiếp theo, lấy khuẩn lạc Trichoderma spp.,
theo cách tương tự và đặt vào đĩa petri đã chứa nấm bệnh ở trên. Điểm đặt khoan
thạch Trichoderma cũng cách mép đĩa 1,5 cm nhưng ở phía đối diện với nấm bệnh.
Đĩa đối chứng khoan thạch nấm bệnh có cùng kích cỡ 5mm, được đặt giống
như trên trong các đĩa petri cùng loại chứa môi trường PDA đã khử trùng.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 8 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Phần trăm ức chế sự phát triển hệ sợi nấm (percent inhibition of mycelia
growth_PIMG): sau 3 ngày nuôi cấy đối kháng trực tiếp, đánh giá mức độ đối
kháng bằng cách đo đường kính của khuẩn lạc nấm bệnh trong đĩa petri theo
phương khuẩn lạc nấm bệnh (R2) và đường kính của khuẩn lạc nấm bệnh trong đĩa
đối chứng(R1) như hình 2.3.Các số liệu được tính toán theo công thức:
PIMG= (R1-R2)/R1x100, hoặc mức độ đối kháng với nấm gây bệnh được phân
thành 4 cấp và đánh giá mức độ đối kháng (Nguyễn Thị Thuần và ctv,1996; Trần
Kim Long và ctv,2009). Tóm tắt như sau:

đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau

đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau

Similar to đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây rau