Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM SINH
AFLATOXIN CỦA BACILLUS (CS1b) VÀ ỨNG DỤNG
TRONG BẢO QUẢN NÔNG SẢN
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện : Trịnh Thị Cẩm Tú
MSSV: 1211100227 Lớp: 12DSH02
TP. Hồ Chí Minh, 2016
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

Đồ án tốt nghiệp
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu , kết quả nêu trong
đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đồ án này đã được cảm ơn và
các thông tin trích dẫn trong Đồ án đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện đồ án
Trịnh Thị Cẩm Tú

ii
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học
Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn
thành tốt khóa học 2012 – 2016.
Em xin cảm ơn thầy cô trong Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM –
MÔI TRƯỜNG đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng
tạo nền tảng kiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng
vào công việc thực tiễn.
Em xin cảm ơn thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Khoa
CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG, Trường Đại học Công
nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp cho em thực hiện và hoàn
thành tốt Đồ án tốt nghiệp này.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp
này.
Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ,
động viên khích lệ tinh thần , cùng trải qua những khó khăn trong suốt quá trình thực
hiện Đồ án tốt nghiệp của mình.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình đã luôn bên
cạnh, cỗ vũ động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt Đồ án
tốt nghiệp này.
TP. HCM, Ngày 19 tháng 08 năm 2016
Sinh viên thục hiện
Trịnh Thị Cẩm Tú

iii
MỤC LỤC
MỤC LỤC ..........................................................................................................................i
DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG.......................................................................................................vii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH ............................................... viii
MỞ ĐẦU ...........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................4
1.1 Các nấm gây hại trên hạt.........................................................................................4
1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc..............................................4
1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch ...........................................................5
1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch...............................................................5
1.1.4 Độc tố của nấm.................................................................................................6
1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản .........................................11
1.2.1 Kháng nấm bằng phương pháp hóa học ........................................................11
1.2.2 Kháng nấm bằng phương pháp sinh học: ......................................................12
1.3 Một số vi sinh vật điển hình có khả năng đối kháng nấm gây bệnh trong nông
sản................................................................................................................................15
1.3.1 Nấm Trichoderma spp ...................................................................................15
1.3.2 Lactobacillus spp. ..........................................................................................17
1.3.3 Bacillus subtilis spp........................................................................................19
1.4 Cơ chế kháng nấm của vi khuẩn...........................................................................21
1.4.1 Cấu tạo thành tế bào của một số nấm gây hại nông sản................................21
1.4.2 Cơ chế tác động của một số enzyme ngoại bào.............................................23
1.4.3 Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất. .......................................................25
1.4.4 Một số phương pháp thu enzyme và hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy vi
khuẩn .......................................................................................................................26
1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao trong bảo quản hạt ................................30
1.6 Một số nghiên cứu nước ngoài ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp .....31
1.7 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp......32

iv
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................33
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................33
2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất..................................................................................33
2.2.1 Vật liệu ...........................................................................................................33
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ.........................................................................................33
2.2.3 Môi trường - Hóa chất....................................................................................34
2.3 Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................35
2.3.1 Mục đích.........................................................................................................35
2.3.2 Mục tiêu..........................................................................................................35
2.3.3 Nội dung.........................................................................................................35
2.4 Bố trí thí nghiêm và phương pháp ........................................................................36
2.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng nấm.................................................................36
2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo
quản hạt....................................................................................................................47
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................50
3.1 Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm
cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b ..................................................................................50
3.2 Xác định thời gian nuôi cấy để khả năng đối kháng nấm CĐP1 cực đại.............51
3.2.1 Dịch nuôi cấy sau ly tâm................................................................................51
3.2.2 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt .............................................................53
3.2.3 So sánh khả năng đối kháng dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1 của
dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và điều kiện xử lý nhiệt................53
3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
CS1b sau ly tâm...........................................................................................................55
3.3.1 Quy trình thu hồi protein kết tủa có hoạt tính sinh học.................................55
3.3.2 Định tính enzyme protease, chitinase, 𝜷- glucanase của protein kết tủa......56
3.3.3Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1 ...........................................59
3.4 Khảo sát khả năng đối kháng cao ethyl acetate với CĐb1...................................60
3.4.1 Quá trình thu cao EA......................................................................................60

v
3.4.2 Khảo sát sự ức chế của cao EA với nấm CĐP1 ............................................61
3.5 Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn
Bacillus sp. CS1b có hoat tính kháng nấm. ................................................................64
3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản
hạt. ...............................................................................................................................66
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................76
4.1 Kết luận .................................................................................................................76
4.2 Kiến nghị ...............................................................................................................76
TÀI LIỆU KHAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC.....................................................................78
TÀI LIỆU KHAM KHẢO ..............................................................................................78
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................1

vi
DANH MỤC VIẾT TẮT
AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar
EA: ethyl acetate
NA: Nutrient agar
NB: Nutrient broth MT:
Môi trường PDA: Potato dextrose agar
HPLC: High pressure liquid chromatography
TLC: Thin layer chromatography
UV: Ultraviolet
VK: vi khuẩn

vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở
vật nuôi.. ......................................................................................................................9
Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học ..........13
Bảng 1.3: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm..............................22
Bảng 1.4: Cơ chế tác động của mộ số hợp chất thứ cấp............................................26
Bảng 2.1: Bố trí các thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng..................................47
Bảng 3.1: Tỷ lệ đối kháng (%) của dịch nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1...........53
Bảng 3.2: Đường kính phân giải của enzyme của protein kết tủa bằng ethanol.......56
Bảng 3.3: Khả năng đối kháng với CĐP1 của protein kết tủa bằng ethanol.............58
Bảng 3.4: Tỷ lệ đối kháng (%) theo từng nồng độ của cao ethyl acetate với nấm
CĐP1……………………………………………………………………………….63
Bảng 3.5: Định tính một số chất có trong dịch sau ly tâm, protein kết tủa và cao ethyl
acetate .........................................................................................................................63
Bảng 3.6: Khả năng ức chế nấm mốc và vi khuẩn phát triển trên hạt đậu phộng được
bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b .................................................66
Bảng 3.7:Kết quả ứng dụng hợp chất thứ cấp bảo quản đậu phộng………………. 71

viii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH
Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm
CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm. ................................................................36
Hình 2.2: Sơ đồ thu sinh khối nấm CĐP1. ................................................................37
Hình 2.3: Quy trình thu hồi protein kết tủa bằng ethanol 960 ...................................40
Hình 2.4: Quy trình thu hồi cao EA...........................................................................42
Hình 2.5: Sơ đồ ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao chitosan..........46
Hình 3.1: Nấm CĐP1 trong môi trường PDB............................................................49
Hình 3.2: Kết quả đối kháng của dịch sau ly tâm của VK CS1b với nấm CĐP1.....51
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở
từng thời gian nuôi cấy và từng điều kiện xử lý dịch sau ly tâm ..............................54
Hình 3.4: Khả năng phân giải chitin của protein kết tủa...........................................56
Hình 3.5: Khả năng phân giải casein của protein kết tủa..........................................57
Hình 3.6 Khả năng phân giải 𝛽 − 𝑔𝑢𝑐𝑎𝑛 của protein kết tủa……………………...57
Hình 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc CĐP1 của dung dịch protein kết tủa………..59
Hình 3.8: Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA…………………………….61
Hình 3.9: : Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA, ...................................... ..62
Hình 3.10: Định tính một số chất có trong dịch nuôi cấy ly tâm (i), protein kết tủa
(ii),……………………………………………………….........................................64
Hình 3.11: Định tính lipid..........................................................................................65
Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1…………………………………...72
Hình 3.13: Quy trình công nghệ sản xuất cao EA………………………………….73

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Lương thực, thực phẩm đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô,
khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người. Vì thế, việc
nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là vấn đề được các tổ chức quốc tế cũng
như các cơ quan khoa học về lương thực, thực phẩm của thế giới đặc biệt quan tâm.
Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kỹ thuật bảo quản gìn giữ các
giá trị dinh dưỡng, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên các nông sản đó, đồng thời
chế biến nông sản thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao là một trong
những phần cần thiết đối với ngành nông nghiệp nước ta.
Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus tạo ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc
cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…),
gây quái thai, gây đột biến,…thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trong
rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm
nhất. Mặc dù sự hiện diện của Aspergillus flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với
việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ lớn về
việc có thể nhiễm aflatoxin.
Ở nước ta với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí
thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa, trong khi các phương
tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo, thoáng mát
là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc cho thực phẩm và thức
ăn chăn nuôi. Khi phát triển trên lương thực nấm mốc đã sử dụng các chất dinh dưỡng
gây ra tổn thất về lượng cũng như về chất của hạt. Không những thế, một số loài nấm
mốc khi phát triển sinh ra các loại độc tố khác nhau và được gọi chung là mycotoxin.

2
Nguy hiểm hơn những độc tố này có khả năng theo thức ăn vào cơ thể, gây ra độc cho
con người và động vật, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…),
gây quái thai, gây đột biến,…thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong.
Việc sử dụng các biện pháp phòng trừ độc tố nấm mốc đã được khuyến cáo sử
dụng. Tuy nhiên, sự nhiễm nấm mốc và các độc tố nấm mốc nói chung và sự nhiễm
aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn cho phép là không thể tránh được.
Chính vì vậy cần phải có những biện pháp khử nhiễm độc tố nấm mốc bởi độc tính và
nguy cơ gây ung thư của nó. Bảo quản nông sản bằng áp dụng các chất chống mốc hóa
học có giá thành cao,thường có mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý và có thể ảnh
hưởng xấu lên sức khỏe người tiêu dùng. Để áp dụng “ bảo quản sinh học” trong việc
bảo quản các hạt nông sản, các sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật thường được áp
dụng. Đó là lý do chúng tôi đã chọn nghiên cứu về: “ Khảo sát khả năng kháng nấm
sinh aflatoxin của Bacillus spp. (CS1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản”.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1 Mục tiêu
Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin của sản phẩm trao đổi chất dịch
nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp. CS1b và ứng dụng trong việc bảo quản hạt đậu phộng.
2.2 Nội dung
1. Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng
nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b
2. Xác định thời gian nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. CS1b để khả năng đối
kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b đạt khả năng kháng nấm
Aspergillus sp. CĐP1 cực đại.
3. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi
khuẩn CS1b sau ly tâm.

3
4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy
sau ly tâm.
5. Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn
Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm.
6. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn trong việc bảo vệ hạt đậu
phộng.
3. Kết cấu đồ án
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung này đề cập đến các nội dung liên quan
đến tài liệu nghiên cứu.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các
dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài
thực hiện được và đưa ra thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được.
Chương 4: Kết luận và kiến nghị - nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề
tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.

4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Các nấm gây hại trên hạt
1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc
Thế giới
Sự nhiễm nấm mốc trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu. Ví dụ: Ở Đức có
84% trên 1000 mẫu nông sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13 % số mẫu
lương thực như lúa mì, lúa mạch, yến mạch bị nhiễm ochratoxin. Ở Đan Mạch 19 trên
33 mẫu ngũ cốc kiểm tra có nhiễm ochratoxin. Ở Ấn Độ có 8 % số mẫu bánh dầu
hướng dương kiểm tra có nhiễm đồng thời cả hai loại độc tố T-2 và ochratoxin. Ở Mỹ
có rất nhiều mẫu bắp kiểm tra cho thấy sự nhiễm vomitoxin ( DON) ở mức 1000 ppb.
Ở Úc kiểm tra trên bắp thấy có cả 3 loại mycotoxin như: aflatoxin, fumonisin và
zearalenon. Theo Tiến sĩ Bangalore ( Ấn Độ) thì các loại mycotoxin khác nhau có ưu
thế ở những vùng khác nhau trên thế giới: Ở Bắc Âu có ochratoxin và vomitoxin (
DON) là vấn đề đang được quan tâm nhất. Còn ở Nam Mỹ thì mycotoxin có ưu thế lại
là aflatoxin và fumonisin.
Việt Nam
Ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phộng bằng bọng thủ công, độ ẩm còn cao, sau đó
xếp thành chồng. Giữa các lớp bánh dầu có độ ẩm cao là môi tường thích hợp cho nấm
phát triển. Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm thì trong không
khí sẽ có rất nhiều bào tử nấm tấn công nhanh các nguyên liệu này sinh ra nhiều độc tố
trong thức ăn. Nấm sinh ra trong kho dự trữ phổ biến nhất là Aspergillus và
Penicillium. Độc tố của chúng sinh ra chủ yếu là aflatoxin, sau đó là ochratoxin,
rubratoxin và citrinin. Nó gây tổn hại nặng trên động vật, làm hư gan, thận, tạo ra màng
bọc ống tiêu hóa do tế bào niêm mạc bị chết bong ra giảm hấp thu dưỡng chất, có thể
gây tử vong trên số lớn gia cầm con và heo con.

5
Riêng ở các trại gà giống độc tố nấm còn gây ra chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở
giảm rất thấp. Theo kết quả kiểm tra 29 mẫu bánh dầu đậu phộng và 25 mẫu bắp thì
mức aflatoxin trong bánh dầu phộng 1200 ppb ( tối đa 5000 ppb), trong bắp 205 ppb (
tối đa 600 ppb). Các nguyên liệu còn lại như đậu nành hạt khô và bánh đầu công
nghiệp của nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50 ppb.
1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch
Trong khi cây lương thực đang phát triển ngoài đồng hay sau khi thu hoạch nhưng
trước khi hạt được đập tuốt bị các nấm mốc này xâm nhập. Tùy từng loại ngũ cốc,
vùng địa lý, thời tiết mà các nấm mốc này phát triển nhiều hay ít. Các loại lúa mì, lúa
gạo, đại mạch, kiều mạch, và ngô thường nhiễm các loại nấm ngoài đồng như
Alternaria, Cladosporium, Helininthosporium và Furarium.
Tất cả các nấm ngoài đồng đòi hỏi độ ẩm cao ở hạt để phát triển. Độ ẩm ở trạng
thái cân bằng với độ ẩm tương đối 90% hay hơn nữa là điều kiện cho nấm phát triển.
Các nấm mốc ngoài đồng có thể sống qua nhiều năm ở hạt khô, nhưng chết tương đối
nhanh ở các hạt có độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối trên 70%, ở các
hạt ngũ cốc giàu tinh bột, điều này có nghĩa độ ẩm trên 14%.
Tóm lại, các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng đến bề ngoài và chất lượng
của hạt. Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước thu
hoạch có thể phát hiện bằng phương pháp giám định thông thường và nó không tiếp tục
tăng lên trong quá trình bảo quản.
1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch
Theo Christensen [1] các nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, trong
đó có năm loài phổ biến. Một số loài Penicillium, các loài riêng lẻ của Sporendonema
và một số loài nấm men cũng có thể có ở giai đoạn này. Những loài này có khả năng
phát triển ở các hạt lương thực có độ ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối 70% - 90%. Đa

6
số các nấm này thường ở trên các nguyên liệu giàu các chất hữu cơ và vô cơ, đặc biệt
trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm. Chúng xuất hiện ở khắp mọi nơi
trên thế giới và nhiễm trên tất cả các hạt lương thực và hạt giống.
Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 300C - 320C và tốc độ
phát triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm. Một vài chủng của nhóm A.glaucus phát
triển chậm ở nhiệt độ 100C – 150C. Một vài loài Aspergillus đề kháng với khô cạn, nó
có thể phát triển ở vài độ dưới điểm đóng băng.
1.1.4 Độc tố của nấm
Một số loại độc tố của nấm
Độc tố nấm còn gọi là mycototoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối
lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ
độc với động vật có vú, cá, gia cầm. Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất
nhiều vào điều kiện sinh thái ( Morrau 1974) [2]. Những điều kiện đó là vùng sinh
thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí, lượng nước có trong cơ chất… Sự sản sinh
độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại của kiểu gen ( genotype) và điều kiện
phát triển của chúng ( Scheoedes và Ashworth). Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra
trong quá trình chuyển hóa.
Cho đến nay, trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu. Một loại
độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loại nấm có thể đồng thời
sản sinh ra nhiều loại độc tố. Điều đáng chú ý là có 20 loại mycotoxin có trong thực
phẩm ở mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm và được tạo bởi
năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria, Claviceps.
❖ Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), sterimatocystin,
acid cyclopianzoic.

7
❖ Các độc tố của Penicillium: patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, acid
cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonisin, moniliformin.
❖ Các độc tố của Furarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin.
❖ Các độc tố của Alternaria: acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion.
❖ Các độc tố của Claviceps: các alkaloid Ergot.[1]
Những số liệu có giá trị về mycotoxin và các bệnh do mycotoxin đã thu nhận từ
lĩnh vực thú y học. Các nghiên cứu trên độc vật thực nghiệm cho thấy độc tính của
mycotoxin rất lớn. Hầu hết các sản phẩm thực vật có thể là cơ chất cho sự phát triển
của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo. Vì thế nó tạo khả năng không những cho
sự nhiễm trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào nguồn sữa, thịt.
Độc tố Aflatoxin:
Cơ chế gây độc của Aflatoxin
Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào. Sự liên kết này gây ức
chế enzym polymerase của RNA. Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và ức
chế polymerase t-RNA. Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong tế
bào.
Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng α, β -lacton không bão hòa có trong phân
tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton
này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởng
bình thường của tế bào.
Để có thể gây độc với tế bào gan cũng như tạo khối u, aflatoxin phải trải qua một
quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 –
dhd) ở trong gan, hợp chất này là nguyên nhân gây hủy hoại gan rất nhanh. Nhóm

8
dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base),
gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gây nhiễm độc cấp tính.
Độc tính của Aflatoxin
Theo Dương Thanh Liêm (2002) [1], aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ
thể con người và động vật. Những tác hại đó như sau:
 Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độc aflatoxin
đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hư hại nặng. Tùy theo
mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có khác nhau. Biểu hiện
chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật sưng. Sau đó gan sưng to lên, mật
căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có
những nốt hoại tử màu trắng. Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể.
 Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó
khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng.
 Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng
trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn.
 Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể. Do
đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thể gây tử
vong cho thú.
 Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản.
 Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất
mùi thức ăn.
 Làm thay đổi thành phần dinh dưỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dưỡng bị hạ
thấp, làm vật nuôi chậm phát triển.
 Làm giảm thấp sự sinh trưởng và giá trị kinh tế của vật nuôi. Hậu quả cuối cùng
là có thể gây chết cho vật nuôi.

9
Bảng 1.1: Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở
vật nuôi. (Allcroff, 1969 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003). [2]
Loại gia súc Lượng
aflatoxin trong
thức ăn hàng
ngày (mg/kg)
Thời kỳ nuôi
dưỡng (tuần)
Tổn thương
gan
Ảnh hưởng tới
phát triển và
hiệu quả thức
ăn.
Lợn
(20 – 70 kg)
0.14
0.28
0.41
12
12
12
Trung bình
Nhẹ
Nhẹ
Bình thường
Giảm sút
Giảm sút
Lợn
(40 – 100 kg)
0.28
0.41
20
20
Nhẹ
Nhẹ
Giảm sút
Giảm sút
Lợn
(70 – 100 kg)
0.69 7 Trung bình Bình thường
Lợn nái
(có chửa)
0.3
0.55
4
4
Rõ Suy giảm và
một số con
chết
Gà tây
(1 ngày tuổi)
0.25 4 Rõ Chậm phát
triển và giảm
trọng lượng
Gà tây
(1 ngày tuổi)
0.2
0.42
0.5
7
7
7
Nhẹ
Nhẹ
Nặng
Giảm trọng
lượng trong 3
tuần.
Vịt
(7 ngày tuổi)
0.03 4 Đặc điểm điển
hình nhiễm
aflatoxin
Giảm trọng
lượng, chết
50%
Bê 0.2 16 Trung bình Giảm trọng

10
(4 ngày tuổi) lượng từ 0 – 3
tháng
Bò sữa 15 4 Trung bình Giảm lượng
sữa Aflatoxin
M1 có mặt
trong sữa.
Tình hình nhiễm độc Aflatoxin:
Aflatoxin có mặt trong rất nhiều sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là các loại hạt có
dầu như lạc, đậu tương và ngô (Blaney, 1985 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị
Ngọc Diệp, 2003) [2]. Ở vùng Đông Nam Á và ở Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong sản
phẩm nông nghiệp là rất đáng kể.
Nhiễm aflatoxin là do điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập của sâu mọt trong
bảo quản cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan và phát triển nhanh chóng của
Aspergillus flavus. Trong điều kiện thuận lợi, Asp. Flavus có thể tăng nhanh chỉ sau 3 –
7 ngày bảo quản.
Nhiễm độc aflatoxin ở lợn là một vấn đề quan trọng, gây thiệt hại khá lớn cho
ngành chăn nuôi. Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu của Smith (1976) trong
số 94 trường hợp phát hiện aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi thì có đến 83 trường
hợp gây ngộ độc ở lợn, 7 trường hợp ở bò và 4 trường hợp ở gia cầm. Hàm lượng
aflatoxin trung bình có trong thức ăn chăn nuôi là 389 ppb và ở ngô nguyên liệu làm
thức ăn là 518 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2]
Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét của Ginting (1985) và Widiastut (1988),
ngô và thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên tới 200 ppb. Ở Úc, theo
Barry J. Balaney, trong 161 mẫu thức ăn cho gia cầm được phân tích thì có 13 mẫu

11
chứa aflatoxin, trong đó có 4 mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên đến 50 ppb.
(Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2].
1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản
1.2.1 Kháng nấm bằng phương pháp hóa học
Tình trạng sử dụng thuốc diệt nấm hóa học và tác hại
Hiện nay khi sử dụng thuốc Bảo vệ thực vật nói chung cũng như thuốc trừ nấm
bệnh hại cây trồng nói riêng, phần lớn bà con chúng ta vẫn làm theo cảm tính, cẩu thả,
không khoa học, việc bà con nông dân sử dụng không hợp lý thậm chí lạm dụng thuốc
bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp đã và đang gây những hậu quả nghiêm
trọng.
Thuốc diệt nấm có thể gián tiếp có hại cho sức khỏe con người do các loại lương
thực, rau quả thu được từ các loại cây trồng được con người sử dụng và nó có thể gây
ra dị ứng cũng như nhiều triệu chứng khác như đau đầu, tiêu chảy, các tổn hại cho các
cơ quan cũng như gây ra các rối loạn nghiêm trọng và các loại bệnh tật liên quan
đến hệ thần kinh. Nó cũng có thể là nguy hiểm cho các hệ sinh thái do nó có thể thoát
đi và gây ô nhiễm môi trường nước và đất cũng như tích lũy sinh học và làm gia tăng
độc tính đối với các cơ thể sống trong hệ sinh thái.
Một số loại chất diệt nấm hóa học
 Amphotericin B (fungizon).
 Nystatin (fungicidin, mycostatin, monoral, nystan).
 Candicidin.
 Ketoconazol.
 Econazol.
 Thuốc dẫn chất Imidazol.

12
1.2.2 Kháng nấm bằng phương pháp sinh học:
Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp
dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là không thể
tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng
con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa
chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào
thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất.
Màng bao chitosan có khả năng kháng nấm gây bệnh cho nông sản.
Chitosan là một polime sinh học có hoạt tính cao, đa dạng, dễ hòa hợp với cơ thể
sinh học có tính kháng nấm và dễ phân hủy khi tạo thành màng mỏng có tính bán thấm,
chống thấm … nên được ứng dụng trong kinh tế kỹ thuật khác nhau như y học, cộng
nghiệp dệt, giấy, mỹ phẩm, đặt biệt trong công nghệ bảo vệ rau quả tươi.
Ứng dụng trong xử lý hạt
Hạt giống xử lý bằng cách nhúng vào dung dịch chitosan loãng, bao phủ bề mặt hạt
bằng một màng chitin hay chitosan mỏng trước khi gieo trồng sẽ thúc đẩy và nâng cao
độ tăng trưởng. Bổ sung chitin trong bầu đất sẽ dẫn đến giảm đáng kể sâu hại rễ, vi
khuẩn gây bệnh và nấm mốc.
Ứng dụng của màng chitosan trong tồn trữ và bảo quản chất lượng rau quả
tươi
Chitosan cũng có tiềm năng là một loại màng bảo quản trái cây. NOCC ( N,O-
Carboxymethyl chitosan) một dẫn xuất được tạo ra bởi phản ứng của chitosan với acid
monochloroacetic. Lớp phim được tạo ra bằng cách phun dung dịch NOCC hòa tan lên
trái cây hoặc bằng cách nhúng trái cây vào trong dung dịch. Kết quả tạo ra màng bán

13
thấm, màng chitosan có thể làm giảm khí quyển bên trong tốt như việc làm giảm sự
mất hơi nước thoát ra và làm trì hoãn quá trình chín của trái.
Ứng dụng chống vi sinh vật của chitin, chitosan
Chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn do có khả năng lấy đi các ion
kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd+ của tế bào vi khuẩn nhờ hoạt động của các
nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với các nhóm amino của bề mặt thành tế
bào. Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến ion
quan trọng.
Ứng dụng các vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm gây bệnh cho nông sản
Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa
như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực
tiếp nhờ vi sinh vật. Một số vi sinh vật có khả năng đối kháng với các nấm gây bệnh
cho nông sản và cơ chế khử nhiễm bằng con đường sinh học được trình bày ở bảng 1.2.
Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học [3]
Tên vi khuẩn Đối tượng Cơ chế khử nhiễm Tác giả
Bacillus pumilus Aspergillus
parasiticus
Sử dụng các sản phẩm
trao đổi chất ngoại
bào, sinh ra trong quá
trình nuôi cấy B.
pumilus, ức chế sự
phát triển và quá trình
tổng hợp độc chất
aflatoxin của nấm
Asp.parasiticus.
C. Munimbazi
và
LB.Bullerman,
1997

14
Streptomyces sp. Aspergillus
parasiticus
Streptomyces sp. tổng
hợp được aflastatin A,
là hợp chất có bản
chất là protein, ức chế
1 số enzyme esterase
tham gia quá trình
tổng hợp độc chất
aflatoxin của nấm
Asp. Parasiticus
M. Ono và ctv
,1996. T.
Kondo và ctv,
2001
Achromobacter
xylosoxidans
Aspergillus
parasiticus
A. xylosoxidan tổng
hợp Cyclo (Lleucyl-
L-prolyl), là 1
cyclodipeptide, ức
chế sự phát triển và
sự tổng hợp aflatoxin
của nấm Asp.
parasiticus.
PS. Yan và ctv,
2004.
Lactobacillus
casei
Aspergillus flavus Sử dụng các sản phẩm
trao đổi chất ngoại
bào, sinh ra trong quá
trình nuôi cấy L.
casei, ức chế sự phát
triển và quá trình tổng
hợp độc chất aflatoxin
của nấm Asp. flavus.
I. Chang và
JD. Kim, 2007.
Bacillus subtilis Aspergillus flavus Hợp chất thứ cấp Ting Zhang và

15
BFS06 ctv, 2007
Bacillus subtilis Aspergillus flavus B. subtilis tổng hợp
các enzyme ngoại bào
như protease,
chitinase, β-1,3-
glucanase làm ức chế
sự phát triển của nấm
Asp. Flavus
R. Thakaew và
ctv, 2013.
Serratia
marcescens
Strain JPP1
Aspergillus
parasiticus và
Aflatoxin
Sinh khối tổng hợp
enzyme chitinase
Kai Wang và
ctv, 2013
1.3 Một số vi sinh vật điển hình có khả năng đối kháng nấm gây bệnh trong nông
sản.
1.3.1 Nấm Trichoderma spp
Cơ chế đối kháng
Theo Harman (1996), nấm Trichoderma spp. có nhiều cơ chế đối kháng, cơ chế ký
sinh lên nấm bệnh, cơ chế tiết kháng sinh (antibiosis), cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và
không gian sống.
Theo Kredics (2003), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma spp. với nấm bệnh
chủ yếu bằng 2 cơ chế:
 Thứ nhất: Nấm Trichoderma spp. bao quanh và cuộn lấy nấm bệnh.
 Thứ hai: Nấm Trichoderma spp. tiết ra các loại enzyme thủy phân.
( Trích dẫn bởi Huỳnh Văn Phục, 2006) [4].

16
Ứng dụng trong nông nghiệp
Theo Elad (2000), có nhiều cơ chế được ứng dụng trong phòng trừ sinh học của
Trichoderma spp đối với nấm gây bệnh, nhưng chỉ có 3 cơ chế quan trọng là ký sinh,
cạnh tranh và tiết ra kháng sinh.
Okigbo và Ikediugw (2000), cho biết những loài Trichoderma spp. có hệ sợi nấm
nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển vọng trong phòng trừ sinh học chống bệnh thối hạt,
thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch.
Nấm Trichoderma spp được sử dụng rộng rãi trong phòng trừ sinh học để quản lý
bệnh hại do R.solani gây ra (Hardar và ctv, 1984).
Nấm Trichoderma spp tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzyme
phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp
cây trồng kháng lại bệnh (Klein và Eveleigh, 1998).
Nấm Trichoderma spp sống ở rễ cây giúp biến đổi vật chất vô cơ, giúp tăng cường
khả năng sản xuất hormone ở cây trồng, làm tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng.
Bailey và Lumsden (1998) cho rằng khi dùng dịch huyền phù nấm Trichoderma
hazianum vào trong đất làm tăng sự nảy mầm, tăng khả năng ra hoa, tăng sinh khối và
chiều cao cây bắp, ớt, hoa cúc, cà chua, thuốc lá. Nòi T1290 của nấm Trichoderma
hazianum còn làm tăng số chồi và rễ cây bắp ngọt trong nhà lưới 66% so với đối chứng
(Harman, 2000).
Một số loại enzyme do Trichoderma tiết ra bao gồm glucan 1,3-beta-glucosidase,
endochitinase, chitobiosidase, N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (NAGase), trypsin,
chymotrypsin, cellulase, protease, lipase, khi kết hợp hai enzyme glucan 1,3-beta-
glucosidase và endochitinase sẽ ngăn cản được quá trình tăng trưởng của nhiều loại

17
Ascomycetes trong nuôi cấy, thêm vào đó sẽ có hiệu quả cao trong việc ngăn cản sự
nảy mầm của bào tử hơn là từng loại enzyme đơn lẻ (Margolless – Clark, 1995).
Trichoderma spp ký sinh lên sợi nấm R. solani và làm chết sợi nấm là do tác dụng
của enzyme ngoại bào làm phá hủy màng tế bào của nấm bệnh (Phạm Văn Kim, 2000).
Các chủng nấm Trichoderma spp. được phân lập từ những hệ thống canh tác khác trên
nền đất lúa ở 4 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long chúng đều có khả năng ký sinh trên nấm
R. solani được ly trích từ lúa, đậu nành, đậu xanh. Nấm Trichoderma spp. có chỉ số
phân hủy rơm (cellulose) cao hơn nấm R.solani (Lưu Hồng Mẫn và Noda, 1997).
Lưu Hồng Mẫn và Noda (1997), nghiên cứu sự phân bố của quần thể nấm
Trichoderma spp. trong những hệ thống canh tác trên nền đất lúa ở 4 tỉnh đồng bằng
sông Cửu Long, kết quả cho thấy quần thể nấm Trichoderma spp. trong hệ thống canh
tác lúa – đậu – lúa ở huyện Ô Môn, Cần Thơ biến động từ 1,43 – 1,62 x 103 CFU/g
trong điều kiện ẩm độ đất từ 30,3 – 30,7% và pH đất là 4,6 – 5,01 nhưng cùng hệ thống
ở huyện Thốt Nốt, Cần Thơ thì quần thể Trichoderma spp. cao hơn từ 1,25 – 2,65 x
103 CFU/g, ẩm độ đất là 14,5 – 16,8%, pH đất là 4,36 – 4,6. ( Trích dẫn bởi Huỳnh
Văn Phúc, 2006) [4].
1.3.2 Lactobacillus spp.
Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn, nấm gây
bệnh của Lactobacillus:
Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với nhiều vi
khuẩn Gram (+), Gram (-) và kể cả nấm.
Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn bao gồm: các acid hữu cơ
(acid lactic và acid acetic), hydrogen peroxit, cacbondioxit và diaxetyl cũng như

18
bacterioxin và các hợp chất giống bacterioxin ( Mishra và Lambert, 1996; Ouwehand
và cộng sự, 1999). Cả acid lactic và acid acetic đều có khả năng hạn chế sự phát triển
của các vi sinh vật khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính đều này
đã ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của các sinh vật khác (Mishra và Lambert,
1996). Hydrogen peroxit ức chế được sự phát triển của cả Gram (+) và Gram (-) (
Hollang, Knapp, Shoesmith, 1987; Mishra và Lambert, 1996). Diacetyl tác động ức chế
lên sự tăng trưởng bằng cách can thiệp sử dụng arginine ( Jay, 1986).
Ngoài ra, Lactobacillus còn có khả năng sinh ra bacterioxin, một loại protein có
khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm
của màng tế bào, nhiều loại bacterioxin còn có khả năng phân giải AND, ARN và tấn
công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacterioxin sẽ tấn công các vi
khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh
như: E.coli, Samonella, Vibrio, Clostridium, Candida albicans và một số virus khác
nữa ( O’Sullivan và Kullen, 1998). ( Trích dẫn bởi Lê Thanh Huân, 2011) [5].
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính
kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều
trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và
nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm.
Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất
hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm,
làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất
cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ

19
tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có
tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy,
2007).
Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo
quản sinh học. Ngoài ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính
kháng nấm như reuretin, acid lactic,...
1.3.3 Bacillus subtilis spp.
Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh là
cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh.
Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hướng chủ
yếu sau:
 Làm ngừng tổng hợp thành (màng) tế bào hay làm tan màng tế bào vi khuẩn và
do đó phá hủy tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg++, Na+, Ca++ thoát ra ngoài, tế
bào chết.
 Ảnh hưởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Chất kháng sinh có thể
ngăn cản quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng hợp chuỗi
polypeptid hay đưa đến tổng protein bất thường.
 Ảnh hưởng đối với acid acetic cụ thể là phá hủy sự trao đổi của ADN và ARN
bằng cách ức chế men RNA polymerase hay gắn vào các base làm đứt đoạn chuỗi xoắn
kép AND.
Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số
lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi
khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn

20
chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh
trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn
bởi Lý Kim Hữu).
Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn
kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay nghỉ
ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra bào
tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ.
Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất
sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng sinh để giết chết
những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá
vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang
hình thành bào tử tiêu thụ.
Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng
lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ
cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt.
Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những
kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải
chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004). [6]
Bacillus subtilis ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia
solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae,… ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác
bảo vệ nông sản sau thu hoạch. [6]
Công ty TNHH Sinh phẩm số 1 Khánh Hòa đặt tại QL1- KCN Suối Dầu-Khánh
Hòa đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm có chứa Bacillus Pumilus là vi khuẩn gram

21
dương hình que di động có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí; tùy tiện có
khả năng sinh ra nhiều enzyme amylase và protease, có khả năng ức chế được nhiều
loại nấm mốc trong quá trình bảo quản nông sản, đặc biệt các nấm mốc sinh độc tố.
Bacillus pumilus hoạt động ngăn ngừa sự phát triển bào tử nấm trên cây trồng, đặt biệt
tốt cho hệ rễ cây trồng.
1.4 Cơ chế kháng nấm của vi khuẩn
1.4.1 Cấu tạo thành tế bào của một số nấm gây hại nông sản
Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh có
thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thì
thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30 µm (thông thường là 5-10 µm).
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc
sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng
này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng
thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng
nguyên sinh chất có một số phần có kế cấu gấp nếp hay xoắn lại, người ta gọi là biên
thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi chúng có tác dụng
chiết xuất các chất nào đó.
Thành tế bào (cell wall) của nấm có thành phần hóa học khác nhau. Đây là một tiêu
chí quan trọng khi định loại nấm.

22
Bảng 1.3: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm
Chú thích: 1- Allomyces, 2- Phytophthora, 3- Mucor, 4- Aspergillus,
5- Saccharomyces, 6- Schizophyllum
Ngoài các thành phần trên thì trong màng nấm có ergosterol là một trong thành
phần hóa học cơ bản trong tế bào sợ nấm. Chúng là các sterol chiếm ưu thế ở hầu hết
các loại nấm (nghiên cứu tách chiết ergosterol từ sinh khối các chủng nấm cordyceps
sp. phân lập tại Việt Nam Đoàn Minh Quân 2013 luận văn tốt nghiệp trường đại học
khoa học tự nhiên).
Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nảy mầm trên một môi
trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn
thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ
xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là
một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh
dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hiện tượng kết mạng thường gặp ở nấm bậc cao nhưng

23
lại ít gặp ở các sợi nấm dinh dưỡng của nấm bậc thấp. Hình thái, kích thước màu sắc,
bề mặt của khuẩn lạc…có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm.
Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm sợi nấm mang sắc tố tạo nên
màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và làm đổi
màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh
thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên cả khuẩn lạc
thường có màu.
1.4.2 Cơ chế tác động của một số enzyme ngoại bào.
Do các nấm Aspergillus spp. có cấu tạo vách tế bào chủ yếu là chitin, beta-glucan,
protein nên khả năng tiết các enzyme ngoại bào chitinase, beta – glucanase và protease
giúp vi khuẩn đối kháng nấm mốc dễ dàng hơn. Các enzyme này tác động lên vách tế
bào của nấm làm phá vỡ hay làm thủng vách tế bào của nấm làm cho chúng mất căng
bằng nội bào, ức chế được sự phát triển của chúng.
Chitinase
Hệ enzyme thủy phân chitin (chitinolytic enzymes) hay thường được gọi là
chitinase [poly  -1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase] thuộc
nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay
chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 -  -glucosid giữa C1 và C4 của hai
monomer N-acetyl-D-glucosamine liên tiếp nhau trong mạch chitin.
Cơ chế xúc tác
Chitinase xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết 1,4 – β - glucosid trong chitin. Nó
phân cắt dọc theo mạch carbon của chitin và sản phẩm tạo thành chủ yếu là chitobiose
và chitotriose. Những chất này sau đó được tiếp tục phân cắt thành các monomer là các
N-acetyl – D - glucosamine.

24
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản
phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng
chiếm đa số là các diacetylchitotiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể
phân cắt thêm được nữa. Hầu hết chitinase thuộc loại này.
Chitin 1,4 – chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn
hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)2 với n≥3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích
diacetylchitobiose (GlcNAc)2.
β-N-acetylhexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên
tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl-glucosamine.
Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-
chitooligosaccharide làm cơ chất. Các oligosaccharide thường được thủy phân bên
trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên. Một số loại chitinase có
khả năng thủy phân trisaccharide, một số thì không. Cũng có hai dạng chitinase thủy
phân pentasaccharide: một loại phân cắt bên trong tạo disaccharide và trisaccharide,
một loại phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharide và tetrasaccharide. Tóm lại,
chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên.
Protease
Cơ chế xúc tác
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên
kết peptide (-CO – NH-) của phân tử protein và peptide thành các acid amin tự do, một
ít peptide ngắn, pepton.

25
Beta – glucanase
Beta glucanase là một enzyme giúp tiêu hóa chất xơ. Nó giúp khắc phục các vấn đề
về tiêu hóa như kém hấp thu và rối loạn dinh dưỡng. Beta – glucanase là một enzyme
rất quan trọng vì cơ thể động vật không thể tự sản xuất được.
Cơ chế xúc tác [5]
β-1,3-glucanase xúc tác sự thủy phân liên kết β-1,3-glucosidic hiện trong β-1,3-
glucan, là thành phần chính của thành tế bào của nấm men và nấm sợi.
Có rất nhiều β-1,3-glucanases đã được tịnh hóa và đặc trưng từ các loài vi khuẩn khác
nhau, bao gồm cả vi khuẩn Bacillus, Paenibacillus, Micromonospora, Streptomyces và
Cellulosimicrobium.
1.4.3 Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất.
Các VK tiết ra các kháng sinh là các hợp chất thứ cấp có khả năng ức chế sự sinh
trưởng và phát triển của nấm bệnh gây hại. Nghiên cứu của Stein (2005) cho thấy tiềm
năng chất kháng sinh từ Bacillus subtilis được ghi nhận từ 50 năm qua. Có khoảng vài
trăm dòng VK Bacillus subtilis có khả năng tiết ra khoảng 20 chất kháng sinh với cấu
trúc khác nhau. Hầu hết các chất này được tiết ra trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ
hay ra môi trường nước làm rào cản sự nhân lên của các vi sinh vật cơ hội gây ức chế
các vi sinh vật gây bệnh. Các chất diệt khuẩn này có thể có tác dụng đơn lẻ hoặc kết
hợp với nhau.
Hay một số hợp chất ức chế khả năng sinh tổng hợp nên các vách tế bào nấm chitin,
beta – glucan, protease. Cơ chế tác động ức chế sự hình thành các thành phần hình
thành nên vách trong đó có ergosterol là một thành phần cơ bản trong màng của nấm,
tạo ra các kênh ( channel) ở màng tế bào, làm tăng tính thấm màng tế bào, làm cho các

26
dòng ion dịch chuyển (kali, glucoza đi ra, natri đi vào ) gây mất căng bằng nội chất, ức
chế sự phát triển của sợ nấm và khả năng sinh độc tố của chúng.
Bảng 1.4: Cơ chế tác động của mộ số hợp chất thứ cấp [3],[4]
Hợp chất Cơ chế tác động Đối tượng
Surfactin ức chế sự vận chuyển các ion qua
màng lipid kép.
A. flavus
Fengycin Ức chế sự hình thành sợi nấm Aspergillus niger,
A. flavus
Iturins Làm thủng màng tế bào làm rò rỉ ion
K+ và một số ion quan trọng khác.
Thay đổi tính thấm của màng
Aspergillus niger
Nikkomycins Ức chế sự tổng hợp chitin C. albicans
Polyoxins Ức chế sự tổng hợp chitin C.immitis
Echinocandin Ức chế sự tổng hợp glucan Candida,
Aspergillus
1.4.4 Một số phương pháp thu enzyme và hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy vi
khuẩn
Thu nhận enzyme (E) dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực.
Hỗn hợp chứa E sẽ phải trải qua nhiều công đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên đặc
tính nhất định để thu được một E tinh sạch. Sau mỗi bước thu nhận ta đều phải tiến

27
hành xác định hoạt tính và nồng độ E để đảm bảo hiệu quả tinh sạch. Các kỹ thuật tinh
sạch thường dùng: tủa, màng bán dẫn, sắc ký.
Có nhiều phương pháp khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ
hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein/E, dùng nhiệt. Trong đó tủa bằng muối
được sử dụng nhiều nhất.
Tủa bằng muối
Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên
của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của
protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm
mạnh (salting out), mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ nhất định. Lượng muối có
thể được loại bỏ thông qua bước thẩm tách.
Khả năng tủa protein phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không
phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng
thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống.
Hiệu quả tủa protein/E của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp
theo thứ tự giảm dần như sau:
citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate.
Để tủa E từ dịch chiết thô ta có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất
là ammonium sulfatese (NH4)2SO4, do nó có độ hoà tan rất cao trong nước (720 g/l,
nhiệt độ 25 oC), ít làm mất tác dụng E thậm chí còn có tác dụng làm bền E. Ngoài ra
ammonium sulfatese có khả năng tủa chọn lọc protein, do đó giúp loại một số protein
không mong muốn ra khỏi dịch chiết. Thường dùng hai dạng bột hoặc bão hòa .
Dạng bột:

28
Người ta cho từng ít một vào dịch chiết E, cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng
kết tủa ban đầu của E. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm
bảo sự hòa tan của muối.
Dịch bão hòa:
Cho dung dịch (NH4)2SO4 vào dịch chiết E thì độ (NH4)2SO4 không tăng đột ngột.
Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2 giờ để qua đêm, mục đích là tạo
kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết
được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buckner. Khi hòa tan kết tủa lại người
ta thường thêm ion Ca+ làm bền (CaCl2 hoặc Ca(COOH)2). Ở giai đoạn loại muối,
người ta dùng phương pháp thẩm tích. Thời gian thẩm tích thường là 24 – 28 giờ, nước
thay càng nhiều càng nhanh càng tốt. Có thể loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex
G25 là dẫn suất của dextran. Ưu thế của phương pháp này là tiến hành với thời gian
ngắn (khoảng 30 '), nên không làm mất hoạt độ E. Muối có trọng lượng phân tử bé bị
giữ lại, các E có trọng lượng phân tử lớn xuống trước. Giai đoạn tiếp theo là làm đông
khô thành bột trắng. Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà không
qua trạng thái lỏng. Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2SO4
bão hòa hoàn toàn, còn amylase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hòa của dung
dịch muối này. Ðiều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối
khác.
* Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfate
 Cho muối vào dung dịch E một cách từ từ, đồng thời khuấy đều để tránh tăng
nhanh cục bộ nồng độ muối dẫn đến mất tính kết tủa chọn lọc, thậm chí làm mất hoạt
tính E.
 Sử dụng muối ammonium sulfatese mất nhiều thời gian và cần phải ly tâm tốc
độ cao và ở nhiệt độ thấp để tách protein tủa.

29
Tủa bằng các dung môi hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng
hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có
ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính
protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở
nồng độ thấp, trừ một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD),
dimethyl sulfoxide (DMSO) và ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao. Ethanol
hay aceton thường được dùng để tủa protein cho mục đích tinh sạch. Sự kết tủa có thể
có tính chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được tủa bằng các
nồng độ khác nhau của dung môi (nồng độ dung môi thường chiếm 80 % (v/v) trở lên).
Sau đó dung môi được loại bằng cách cho bay hơi trong chân không hay thậm chí trong
không khí.
Phương pháp này cũng tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5 0C trở xuống). Dùng dung
môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0o C và có thể đến – 20 oC, như vậy
nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein E. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết
tủa ra khỏi dung môi bằng tách dùng máy ly tâm. Phương pháp này có lợi thế là không
cần loại muối, nhưng có nhược điểm là hay có màu.
Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện
Khi pH của môi trường thay đổi, mức độ tủa của protein cũng thay đổi.
 pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận
proton).
 pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất
đi proton (mất H+).

30
Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều
này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi
trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Phương pháp này
thường dùng cho các protein đậu nành (có pI= 4.6).
Dùng nhiệt
Ngoài ra có thể dùng nhiệt để loại bỏ các protein E tạp ra khỏi dịch chiết E. Tuy
nhiên phương pháp này ít được dùng vì hiếm E bền với nhiệt.
1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao trong bảo quản hạt
Chitosan được sử dụng để bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công
của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng
cường khả năng nảy mầm của hạt. Một trong những hoạt tính sinh học quan trọng của
chitosan trên thực vật đó là sự kích thích nảy mầm. Trong đậu phộng hạt giống được
bao lớp màng chitosan sẽ làm tăng cường khả năng nảy mầm của hạt giống ( Zhou và
cộng sự, 2002 trích dẫn bởi Batool Mahdavi và Asghar Rahimi, 2013). Chitosan có thể
thúc đẩy sự tăng trưởng và làm tăng năng suất đậu tương ( Dũng và Thắng, 2002).
Viện Khoa học nông nghiệp Miền Nam và Trung tâm công nghệ sinh học Thủy sản
cùng tham gia nghiên cứu tác dụng của chitosan lên một số loại hạt dễ mất khả năng
nảy mầm và góp phần thúc đẩy tăng trưởng, phát triển cây trồng ngoài đồng. Kết quả là
có khả năng kéo dài thời gian sống và duy trì khả năng nảy mầm tốt của hạt giống cà
chua và hạt đậu cô ve sau thời gian bảo quản 9 – 12 tháng trong điều kiện bình thường.
Năm 1987, Bentech đã được cấp bằng sáng chế nhờ nghiên cứu dùng chitosan trong
việc bọc nang hạt giống để ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất. Trong những
vùng mà cây trồng thường bị nấm tấn công vào hệ rễ, nếu hạt giống được bọc nang
bằng chitosan sẽ nâng cao được hiệu suất thu hoạch lên 20 % so với không dùng
chitosan.

31
1.6 Một số nghiên cứu nước ngoài ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp
Ting Zhang và ctv (2007) [5] đã nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp kháng nấm từ
vi khuẩn Bacillus subtilis B-FS06 ức chế sự phát triển của Aspergillus flavus. Hợp chất
bacillomycin D là một nhóm của iturin có hoạt tính kháng nấm mạnh. Nghiên cứu này
đã ứng dụng các hợp chất này vào in vivo trên đậu phộng có bổ sung 104 bào tử
A.flavus và cho kết quả tốt ở 200 µg/g đến 250 µg/g hợp chất thứ cấp/ đậu phộng làm
ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng sợi nấm, và sự tăng trưởng của A. flavus là ở 200 và
250 lg / g của các hợp chất
Md. Rezuanul Islam và ctv (2012) [6] đã phân lập và xác định các hợp chất chống
nấm từ Bacillus subtilis C9 ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh cho cây. Nghiên cứu
này đã sử dụng ethyl acetate để tách các hợp chất kháng sinh từ dịch nuôi cấy C9 và
cao chiết này có kết quả ức chế đáng kể sự tăng trưởng cợ nấm của các nấm gây bệnh
khác nhau. Trong nghiên cứu đã xác định được hợp chất có trong cao ethyl acetate thu
được từ dịch nuôi cấy C9 là DG4 (3,4 – dihydroxy – 3 – methyl – 2 – pentanone) có
khả năng kích hoạt kháng hệ thống và bảo vệ cây Arabidopsis khỏi mầm bệnh ngoài ra
chúng còn ức chế Rhizoctonia và tăng cường sức khỏe của cây trong nhà kính. Các hợp
chất hữu cơ dễ bay hơi của vi sinh vật có vai trò thay đổi sinh hóa của quá trình chuyển
hóa hợp chất thứ cấp ở thực vật và cũng ức chế khả năng tổng hợp protein của các
mầm bệnh. Các hợp chất này có khả năng ức chế bào tử nảy mầm, hoặc tổng hợp β- (1,
3) -D-glucan, hoặc ức chế một phần không thể thiếu của thành tế bào nấm, dẫn đến sự
thay đổi của tính thấm của màng tế bào nấm. Các enzyme chitinolytic sản xuất bởi cô
lập C9 có thể tham gia trong kiểm soát sinh học của nấm gây bệnh, đặc biệt là R. solani
AG2-2 (IV).
Mohsen Farzaneh và ctv (2016) [7] đã nghiên cứu sự ức chế sự tăng trưởng
Aspergillus flavus và Aflatoxin B1 nhiễm trên hạt dẻ bằng fengycin và surfactin từ
Bacillus subtilis UTBSP1. Trong nghiên cứu này, B. subtilis UTBSP1 có khả năng sản
xuất surfactin và fengycin có thể giảm A. flavus tăng trưởng và độc tố AFB1 trong các

32
loại hạt hồ dẻ. Ngoài ra, B. subtilis UTBSP1 là tác nhân hạ AFB1 ( Farzaneh et al.,
2012 ) và có thể sử dụng để giảm AFB1-nội dung trong thực phẩm, thức ăn và các loại
cây trồng nông nghiệp.
1.7 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp
Luận văn tốt nghiệp “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng bảo
quản nông sản” [3]. của hai sinh viên Đỗ Tuyết Mai và Nguyễn Văn Hương. Nghiên
cứu đã phân lập Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm mạnh và nấm CĐP1 có khả
năng sinh aflatocxin mạnh. Tiến hành cho đối kháng in vitro CS1b với CĐP1 cho kết
quả CS1b kháng CĐP1 lên đến 59 %. Với kết quả in vitro khả quan họ tiếp tục thí
nghiệm in vivo trên hạt đậu phộng, sử dụng hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy VK
khuẩn CS1b trong môi trường có bổ sung tơ nấm CĐP1 làm chất cảm ứng kết hợp với
chitosan và trong thí nghiệm cũng bổ sung 102 bào tử CĐP1. Kết quả đậu phộng có thể
bảo quản đến 30 ngày.

33
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian
Từ tháng 16 - 05 - 2016 đến 07 - 08 - 2016.
Địa điểm
Phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường,
trường Đại học Công Nghệ TP.HCM
2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất
2.2.1 Vật liệu
Nguồn mẫu phân lập nấm: Mẫu nấm Aspergillus sp. CĐP1 do hai sinh viên Đỗ
Tuyết Mai và Nguyễn Vân Hương phân lập từ hạt đậu phộng được mua từ chợ Tân
Bình, quân Tân Bình, TP.HCM.
Nguồn mẫu phân lập VK: là các chủng VK Baccillus sp. CS1b do sinh viên Trần
Chí Phúc phân lập từ đất.
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: tủ ủ, tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), máy li tâm, cân phân tích, máy
soi UV, máy nước cất, bếp từ,…

34
Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, cốc thủy tinh (bacher), bình tam giác (erlen), ống
đong, pipet thủy tinh, micropipette, đầu típ, que cấy, đèn cồn, bông không thấm, ống li
tâm Eppendorf, …
2.2.3 Môi trường - Hóa chất
Môi trường (xem phụ lục A)
 Môi trường Potato Dextrose (PDB)
 Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
 Môi trường tăng sinh nutrient Broth (NB)
 Môi trường tăng sinh nutrient Broth 1 - NB1 (bổ sung tơ nấm)
 Môi trường β – glucan 1%
 Môi trường Casein 1 %
 Môi trường Chitin 1 %
Hóa chất
 Dịch chiết khoai tây
 Dịch tơ nấm
 D – glucose
 Peptone
 Cao thịt (meat extract)
 Cao nấm men (yeast extract)
 Casein
 Chitin, huyền phù chitin
 Chiosan thương mại của công ty Hùng Tiến, Cần Thơ (đặc điểm hóa lý trình bày
trong phụ lục A)
 NaCl

35
 Agar
 Chloramphenicol
 Nystatin
 Phenol red
 Nynhydrin
 HCl
 NaNO3
 Đệm phosphate pH = 7
 Glycerol
 Cồn 960, 700
 Nước cất
 Moslich
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Mục đích
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt .
2.3.2 Mục tiêu
Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin của sản phẩm trao đổi chất dịch
nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp. CS1b và ứng dụng trong việc bảo quản hạt đậu phộng.
2.3.3 Nội dung
1. Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng
2. Xác định thời gian nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. CS1b để khả năng đối
kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b đạt khả năng kháng nấm
Aspergillus sp. CĐP1 cực đại.

36
3. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi
khuẩn CS1b sau ly tâm.
4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy
sau ly tâm.
5. Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn
Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm.
6. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn trong việc bảo vệ hạt đậu
phộng.
2.4 Bố trí thí nghiêm và phương pháp
2.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng nấm.
Khảo sát thành phần hóa học
của các sản phẩm trao đổi chất
của vi khuẩn Bacillus sp.
Nuôi cấy vi khuẩn trong
NB1có chất cảm ứng trong
từng thời gian 24h, 48h, 72h
Hoạt hóa vi khuẩn
CSb1
Ly tâm
Xử lý nhiệt
(1000C/15p)
Kết tủa enzyme
bằng ethanol
Trích ly canh trường nuôi cấy
sau ly tâm (Ở từng thời gian
nuôi cấy) bằng ethyl acetate
Khảo sát khả năng kháng
nấm Aspergillus sp. CĐP1
của vi khuẩn Bacillus sp.
Bã

37
Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 của vi khuẩn
Bacillus sp. CS1b
2.4.1.1 Tăng sinh nấm CĐP1
Chuẩn bị môi trường
PDB
Thu sinh khối tế bào
nấm
Nuôi cấy (150 vòng/
phút,48 giờ,t0 phòng)
Làm nguội (300C)
Hấp khử trùng
(1210C, 15phút)
Sấy khô ở 850C
Giống nấm
CĐP1

38
Hình 2.2: Sơ đồ thu sinh khối nấm CĐP1.
- Chuẩn bị 500ml môi trường PDB, có bổ sung chloramphenicol (0.2%) cho vào
bình erlen 2000 ml. Sau đó, hấp khử trùng môi trường ở 1210C trong 15 phút.
- Hoạt hóa giống trên đĩa Petri PDA đến khi nấm có màu xanh đậm. Cắt thạch
chứa bào tử nấm mốc cho vào môi trường PDA lỏng đã được làm nguội (300C), lắc
tăng sinh 150 vòng / phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Sau đó, lọc dịch nuôi cấy thu sinh khối, phần sinh khối tế bào được làm khô
trong tủ sấy ở nhiệt độ 850C đến khi khối lượng không đổi (khoảng 4 giờ).
- Phân tích hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl.
2.4.1.2 Nhân giống vi khuẩn
VK giữ giống trong Eppendorf (glycerol tủ đông) cấy chuyển 0,1 ml sang chai 100
ml chứa 10 ml MT NB (đã hấp khử trùng), hoạt hóa bằng cách nuôi cấy nhiệt độ
phòng, máy lắc 150 vòng/ phút (máy lắc vòng) thời gian 24 giờ. Canh trường được pha
loãng 10-6, 10-7 rồi cấy trang trên đĩa NA, ủ to phòng 24 giờ. Cấy 1 khuẩn lạc từ đĩa
Petri vào 10 ml môi trường NB (chai 100 ml) đã được hấp khử trùng 121oC 1 atm trong
15 phút, nuôi cấy nhiệt độ phòng, máy lắc 150 vòng/ phút (máy lắc vòng) thời gian 24
giờ.
2.4.1.3 Lên men vi khuẩn thu sản phẩm trao đổi chất kháng nấm (môi trường có bổ
sung tơ nấm làm chất cảm ứng)
Chuẩn bị 3 bình môi trường mỗi bình chứa 100 ml NB1 có bổ sung tơ nấm làm chất
cảm ứng tỷ lệ 1% (1 g/ 100 ml MT) sau đó hấp tiệt trùng. Cấy 1% giống đã được tăng

39
sinh trước đó vào rồi đem lắc 150 vòng / phút trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (sử dụng
bình 500 ml).
Từ 100 ml canh trường vi khuẩn được đem ly tâm 4000 vòng / phút trong 15 phút
thu 90 ml dịch nổi sau ly tâm.
2.4.1.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm
CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm
Chuẩn bị môi trường: PDA được hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút, đổ đĩa
petri đường kính 9 cm. Nấm đã được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm
đĩa petri trên môi trường PDA, ủ từ 3 đến 5 ngày. Cắt miếng thạch có chứa bào tử nấm
đặt vào tâm đĩa chuẩn bị đối kháng. Đục 4 lỗ thạch đường kính 0.8 cm trên đĩa thạch
PDA. Mỗi đĩa cách đều tâm 1,5 cm.
Dịch nổi sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ sẽ lần lượt
được bơm và 4 giếng thạch mỗi giếng 0,1 ml dịch, đối chứng sử dụng môi trường NB1
thay thế cho dịch nổi sau ly tâm. Đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày. (Thí nghiệm
lặp lại 3 lần).
2.4.1.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm
CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm đã qua xử lý nhiệt 100 0
C
Chuẩn bị môi trường: môi trường được chuẩn bị như phần khảo sát chưa qua xử lý
nhiệt. Sau khi ly tâm thu dịch nổi ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ. Lấy
50 ml dịch ở mỗi thời gian nuôi cấy rồi đem đi đun cách thủy ở 100 0 C trong 10 phút.
Sau đó bơm lần vào giếng thạch mỗi giếng 0,1 ml dịch, đối chứng sử dụng môi trường

40
NB1 cũng đã được xử lý nhiệt thay thế cho dịch nổi sau ly tâm. Đem ủ ở nhiệt độ
phòng trong 5 ngày. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần).
Sau thời gian ủ 5 ngày, đo đường kính nấm mốc ở đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm
ở 2 thí nghiệm dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm và dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm đã qua
xử lý nhiệt 100 0 C. Tỷ lệ ức chế được tính như sau:
I% = ( DĐC – DTN)/DĐC × 100
2.4.1.6 Khảo sát khả năng đối kháng của protein kết tủa từ canh trường nuôi cấy vi
khuẩn
Hình 2.3: Quy trình thu hồi protein kết tủa bằng ethanol 960

41
Canh trường lên men 24 giờ được ly tâm 4000 vòng/phút x 20 phút. Kết tủa protein
từ 20 ml dịch nổi canh trường nuôi cấy vi khuẩn với tỉ lệ ethanol : dịch ly tâm = 1:1-
32:1 ở nhiệt độ 4 o C (làm lạnh ethanol và dịch nổi sau ly tâm trước khi kết tủa), để qua
đêm, sau đó ly tâm thu tủa ở 4000 vòng/phút x 20 phút (hấp khử trùng ống ly tâm). Kết
tủa được hòa tan vào 4 ml đệm phosphate pH = 7,0 (đã được hấp khử trùng) và cho vào
ống nghiệm có nắp đã được hấp khử trùng.
Định tính enzyme protease, chitinase, 𝛃- glucanase của protein kết tủa.
Chuẩn bị đĩa thạch chứa cơ chất khảo sát:
 Môi trường casein: 1% casein, 2% agar
 Môi trường chitin: 1% huyền phù chitin, 2% agar
 Môi trường 𝛽- glucan: 1% 𝛽- glucan, 2 % agar
Tất cả môi trường đều hòa vào dung dịch đệm photphate pH = 7.
Bơm protein kết tủa được ở từng nồng độ ethanol vào đĩa thạch như khảo sát
enzyme của dịch nuôi cấy sau ly tâm. Sử dụng đối chứng đệm phosphate pH = 7,0 thay
cho kết tủa protein. Đem ủ ở 37 o C trong 48 giờ. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần).
 Hoạt tính protease dương tính khi môi trường xung quanh đĩa tạo vùng trong
suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ Lugol trên bề mặt thạch.
 Hoạt tính chitinase dương tính khi môi trường xung quanh đĩa tạo vùng trong
suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ Lugol trên bề mặt thạch.
 Hoạt tính 𝛽- glucanase dương tính khi môi trường xung quanh đĩa tạo vùng
trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ Lugol trên bề mặt thạch.
Chuẩn bị đĩa thạch chứa cơ chất khảo sát như khảo sát enzyme của dịch nuôi
cấy sau ly tâm.

42
Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1.
Chuẩn bị môi trường: môi trường được chuẩn bị như phần khảo sát khả năng đối
kháng của dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1.
Bơm protein kết tủa được ở từng nồng độ ethanol vào đĩa thạch như khảo sát
enzyme của dịch nuôi cấy sau ly tâm. Sử dụng đối chứng đệm phosphate pH = 7,0 thay
cho kết tủa protein. Đem ủ ở 30 o C trong 5 ngày. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần).
Khảo sát khả năng đối kháng của dung dịch protein kết tủa tương tự như mô tả
trong quy trình đối kháng dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn, ngoài đối chứng
nấm mọc trên đĩa không bổ sung dịch vào giếng thạch, còn có thêm đối chứng đệm
phosphate để khảo sát ảnh hưởng của đệm phosphate lên sự phát triển nấm mốc.
2.4.1.7 Trích li canh trường nuôi cấy sau li tâm bằng ethyl acetate

43
Hình 2.4: Quy trình thu hồi cao EA
Lấy 20 ml dịch nuôi cấy sau li tâm cho vào bình trích ly, sau đó thêm 20 ml ethyl
acetate lắc đều, để yên cho đến khi phân pha. Thu lấy pha hữu cơ (phần dịch nổi phía
trên). Pha nước (phần dịch ở dưới) sẽ đem trích li với ethyl acetate lần thứ 2 và 3 với tỷ
lệ 1:1. Tiến hành trích ly đối với dịch sau ly tâm thu được sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
nuôi cấy.
Pha hữu cơ (gom 3 lần trích ly) được làm khô với Na2SO4, lọc loại bỏ Na2SO4, sau
đó cô quay để bay hơi ở nhiệt độ 50 0C. Thu hồi cặn rắn và đem cân (17 mg), sau đó
hòa tan trong DMSO 5 % với nồng độ mg/ml thu được cao EA.

44
Cao EA sau khi thu được đem thanh trùng 70 0C trong 15 phút sau đó tiến hành
khảo sát khả năng đối kháng với nấm CĐP1.
Khảo sát khả năng đối kháng cao ethyl acetate với CĐP1.
Khảo sát khả năng đồi kháng nấm của cao chiết bằng ethyl acetate từ dịch nuôi
cấy sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
Bơm vào đĩa petri đã được vô trùng 1 ml cao ethyl acetate sau đó cho 9 ml môi
trường PDA được hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút, lắc nhẹ. Đĩa đối chứng
thay cao ethyl acetate bằng DMSO 5%. Nấm đã được chuẩn bị trước bằng cách cấy
điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri trên môi trường PDA, ủ từ 3 đến 5 ngày.
Tiến hành đối kháng
Cắt miếng thạch có chứa bào tử nấm đặt vào giữa đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn.
Đem ủ ở 30 0C trong 5 ngày.
Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết bằng ethyl acetate từ dịch nuôi
cấy sau ly tâm ở từng nồng độ cao khác nhau
Từ kết quả đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm ở
từng thời gian nuôi cấy, biết được thời gian nuôi cấy nào tốt nhất.
Bơm vào đĩa petri đã được vô trùng cao ethyl acetate và môi trường PDA được hấp
khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút với nồng độ 0,5 ml cao ethyl acetate + 0,5 ml
DMSO 5 % + 9 ml PDA, 1 ml cao ethyl acetate + 9 ml PDA, 1,5 ml cao ethyl acetate +
8,5 ml PDA, 2 ml cao ethyl acetate + 8 ml PDA. Sau đó lắc nhẹ. Đĩa đối chứng thay
cao ethyl acetate bằng DMSO 5%. Nấm đã được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1
bào tử ở tâm đĩa petri trên môi trường PDA, ủ từ 3 đến 5 ngày.
Tiến hành đối kháng

45
Cắt miếng thạch có chứa bào tử nấm đặt vào giữa đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn.
Đem ủ ở 37 0C trong 5 ngày.
Khảo sát thành phần hóa học dịch nuôi cấy, dịch kết tủa bằng cồn và cao
ethyl acetate.
Để xác định tác nhân đối kháng nấm mốc, canh trường sau khi loại bỏ tế bào được
sử dụng để kết tủa protein và trích ly các hợp chất khác protein bằng dung môi kị nước
chủ yếu nhằm vào các hợp chất thứ cấp VK. Bằng các phương pháp định tính các hợp
chất hóa học truyền thống như thuốc thử molisch cho carbohydrate, thuốc thử biuret
cho liên kết peptide, thuốc thử ninhydrin cho nhóm NH2- tự do, coomasie blue cho
lipid, Dragendorff cho alkaloid.
Định tính carbohydrate
Thử nghiệm Molisch: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm, sau đó cho vài giọt
thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và đọc
kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím.
Định tính alkaloid
Thử nghiệm Dragendorff: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt
thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu
vàng cam.
Định tính amino acid
Thử nghiệm Ninhydrin: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một
vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi
thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013).
Định tính protein

46
Thử nghiệm Biuret: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài
giọt thuốc thử Biuret, lắc đều sau đó để yên. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện
màu tím hoặc màu hồng tím.
Định tính lipid
Thử nghiêm thực hiện trên bản mỏng. Chấm dịch trên bảng mỏng sau đó sử dụng
thuốc thử coomasie blue phun hiện màu. Kết quả dương tính là xuất hiện màu xanh ở
điểm chấm dịch.

47
2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong
bảo quản hạt
Hình 2.5: Sơ đồ ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao kháng nấm
Ủ ở nhiệt độ phòng
Quan sát thời gian từ
3 – 10 ngày
Cấy bào tử nấm vào
chai chứa đậu phộng
Bào tử nấm được pha
loãng tới 10-6
Để khô ở nhiệt độ
phòng
Phối 12 g đậu phộng
vào chai 100 ml
Coating trong 3 giờ
Hạt đậu phộng
Khử trùng

48
Bảng 2.1: Bố trí các thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng
Thí nghiệm Dung dịch Tỷ lệ % Đậu phộng (g)
ĐC1 Nước cất 100% 12
ĐC2 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 100% 12
ĐC3
Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1%
DMSO 5%
50%
50%
12
ĐC4
Niystatin 0.4%
50%
50%
12
TN1
NT1
Canh trường trong môi trường NB1
50%
50%
12
NT2
Canh trường trong môi trường NB
50%
50%
12
TN2
NT1
Sinh khối NB1 + nước muối sinh lý
50%
50%
12
NT2
Sinh khối NB + nước muối sinh lý
50%
50%
12
TN3
NT1
Dịch nuôi cấy sau ly tâm.
50%
50%
12
NT2
Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý 1000C
50%
50%
12
TN4
cao EA trong DMSO 5%
50%
50%
12
Điều chỉnh các dung dịch về pH 5

49
Khử trùng hạt đậu phộng
Hạt đậu phộng được khử trùng bằng cồn 700 và rửa lại bằng nước cất.
Ngâm hạt trong dung dịch màng bao trong 3 giờ.
Ngâm mẫu hạt đậu phộng đã khử trùng trong 3 giờ lần lượt trong các dung dịch
được chuẩn bị theo như bảng 2.1.
Làm khô hạt
Sau đó, đậu phộng đã ngâm được làm khô ở nhiệt độ phòng và phân phối vào chai
100ml.
Cấy bào tử nấm
Bào tử nấm chỉ thị aflatroxin được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở
tâm đĩa petri đường kính 9 cm đổ môi trường PDA, ủ từ 3-5 ngày. Tiến hành cắt 1
miếng thạch kích thước 1x1 (cm) có chứa bào tử nấm cho vào ống nước muối sinh lý
đã hấp khử trùng. Sau đó, pha loãng đến nồng độ 10-6. Hút 0.1 ml dịch pha loãng nồng
độ 10-6 vào các chai 100ml chứa 12 g đậu phộng.
Lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần.
Lắc đều chai đậu phộng và ủ ở nhiệt độ phòng.
Quan sát kết quả theo thời gian 3, 5, 7, 12 ngày.

50
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng
Theo nghiên cứu ĐATN Nguyễn Vân Hương (K2011) [3], chủng Bacillus sp.
CS1b chỉ thể hiện khả năng kháng nấm khi được đối kháng trực tiếp hoặc thu dịch nuôi
cấy trong môi trường có tơ nấm làm cảm ứng. Vì vậy để tiếp tục nghiên cứu sản xuất
hợp chất kháng nấm từ Bacilus sp. CS1b, việc đầu tiên là sản xuất sinh khối tơ nấm từ
nấm chỉ thị Aspergillus sp. CĐP1.
Sau khi tăng sinh được 48 giờ tiến hành thu sinh khối nấm, sinh khối nấm màu
vàng nhạt và lơ lửng trong môi trường nuôi cấy (hình 3.1)
a) b)
Hình 3.1: Sản xuất sinh khối tơ nấm CĐP1 trong môi trường PDB a) Dịch nuôi cấy, b)
Sinh khối tơ nấm sau khi sấy.
Tính toán hàm lượng % nitơ tổng số có trong sinh khối nấm CĐP1 sấy khô.
N% =
1.42 × (𝑉1−𝑉2) × 100
𝑚×1000
× 𝑓 =
1.42 × (20 −18) × 100
0.1×1000
× 1 = 2,84 %

51
Trong đó:
 V1: số ml H2SO4 0,1N cho vào bình hứng.
 V2: số ml NaOH 0,1N ddax chuẩn độ.
 m: số g mẫu.
 1,42: hệ số, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42
mg Nitơ.
 1000: hệ số chuyển đổi mg sang g.
 f: hệ số pha loãng ( 𝑓 =
𝑎
𝑣
với v: thể tích dung dịch đem cất đạm, a: thể tích bình
định mức chứa mẫu sau vô cơ hóa)
Hàm lượng % protein tổng số được tính theo công thức:
P(%) = N × 6.25 = 2,84 x 6,25 = 17,75 %
Trong đó:
 N: hàm lượng % Nitơ tổng số
 6.25: hệ số chuyển đổi.
3.2 Xác định thời gian nuôi cấy để khả năng đối kháng nấm CĐP1 cực đại
Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung tơ nấm làm chất cảm ứng, các hợp chất
kháng nấm có thể được sinh ra đồng thời với tăng trưởng tức là sau 24 giờ nuôi cấy
hoặc trễ hơn. Vì vậy, vi khuẩn được nuôi cấy theo từng thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
và khảo sát khả năng đối kháng nấm mốc của dịch nuôi cấy sau ly tâm loại bỏ tế bào và
dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt.
3.2.1 Dịch nuôi cấy sau ly tâm
Tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm với nấm CĐP1 bằng
phương pháp khuếch tán trong giếng thạch nhằm chọn ra thời gian nuôi cấy để vi
khuẩn tiết ra hợp chất có khả năng kháng nấm CĐP1 tốt. Sau 5 ngày đọc kết quả xác
định tỷ lệ đối kháng. So với đối chứng chỉ cấy nấm, hình thái nấm mốc trong các đĩa

52
cấy dịch nuôi cấy có tơ nấm CĐP1 làm chất cảm ứng thu ở từng thời điểm 24 giờ, 48
giờ, 72 giờ đều phát triển không bình thường, nấm bị khuyết tại các điểm bơm dịch
nuôi cấy (hình 3.2 A, B, C).
Hình 3.2: Kết quả đối kháng của dịch sau ly tâm của VK CS1b với nấm CĐP1, ĐC âm:
sử dụng môi trường NB1, ĐC dương: sử dụng Nystatin, - Thí nghiệm không xử lý
nhiệt: A: 24 giờ, B: 48 giờ, C: 72 giờ, - Thí nghiệm xử lý nhiệt 100 0 C: D: 24 giờ, E:
48 giờ, F: 72 giờ

Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản

Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản

Similar to Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản (20)

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản