SlideShare a Scribd company logo

Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được

•
•
https://www.facebook.com/garmentspace
https://www.facebook.com/garmentspace

Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

Education
1 of 133
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Paecilomyces spp VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ BỌ PHẤN TRẮNG, TUYẾN TRÙNG CỦA CÁC CHỦNG THU NHẬN ĐƯỢC Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Phùng Lê Kim Yến MSSV: 1051110195 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 7/2014
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Phùng Lê Kim Yến
Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Lời cám ơn đầu tiên em xin chân thành gửi đến tập thể Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Hai người đã tận tình dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ, hướng dẫn em có những hiểu biết nhiều hơn về kiến thức chuyên ngành để em có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Em xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người đã nhiệt tình hỗ trợ về thiết bị, vật tư giúp đỡ em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Em xin cám ơn anh Ngô Văn Bình đã tạo điều kiện, giúp đỡ em có thể thực hiện các thí nghiệm để hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Em cũng cám ơn các bạn ở phòng thí nghiệm và đặc biệt là những người bạn trong nhóm ESS đã động viên, giúp đỡ tôi. Và lời cám ơn chân thành, sâu sắc nhất con xin dành cho Ba Mẹ, người đã theo dõi, ủng hộ và nuôi con khôn lớn đến ngày hôm nay. Cám ơn gia đình đã luôn chia sẻ và tạo mọi điều kiện để con hoàn thành từng chặng đường học vấn của mình.
Đồ án tốt nghiệp i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH LỜI MỞ ĐẦU..........................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................3 1. 1. Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp.........................................3 1.1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces ............................................3 1.1.1.1 Phân loại khoa học............................................................................3 1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái.............................................................................3 1.1.1.3. Đặc điểm hình thái ...........................................................................4 1.1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp....................................................6 1.1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp đối với ký chủ.................................................................................................................7 1.1.2. Các chủng nấm Paecilomyces spp. đã được phân lập ...........................11 1.1.3. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống .........................................................................................................................13 1.1.3.1. Sản xuất enzyme..............................................................................13 1.1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp........................................14 1.1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật .......................................................15 1.1.3.4. Xứ lý môi trường ............................................................................15 1.1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp................................................16 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp......17 1.3. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phòng trừ bọ phấn và tuyến trùng gây hại.......................................................................................20 1.3.1. Tổng quan về bọ phấn trắng ................................................................20 1.3.1.1. Phân loại khoa học.........................................................................20 1.3.1.2. Đặc điểm sinh thái..........................................................................21 1.3.1.3. Đặc điểm hình thái .........................................................................22 1.3.1.4. Tổng quan về bệnh vàng lá do bọ phấn trắng gây ra.......................23 1.3.2. Tổng quan về tuyến trùng ....................................................................24 1.3.2.1. Phân loại khoa học.........................................................................25 1.3.2.2. Đặc điểm sinh thái..........................................................................25
Đồ án tốt nghiệp ii 1.3.2.3. Tổng quan về bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra............................26 1.3.3. Đánh giá khả năng ký sinh của chủng Paecilomyces spp ..................28 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................34 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................34 2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu ...................................................34 2.2.1 Thiết bị - hóa chất..................................................................................34 2.2.1.1 Thiết bị.............................................................................................34 2.2.1.2 Hóa chất ..........................................................................................34 2.2.2. Vật liệu..................................................................................................35 2.2.3. Các môi trường sử dụng.......................................................................35 2.2.3.1 Môi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar) ......35 2.2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất ......................................................................................35 2.2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất............................................36 2.2.3.4 Môi trường Czapeck - Dox ..............................................................36 2.2.3.5 Môi trường Malt agar......................................................................36 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................37 2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp..........................................................37 2.3.1.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ chế phẩm ..............................37 2.3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ bọ phấn trắng.......................37 2.3.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của Peacilomyces spp.....38 2.3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme chitinase...............................................38 2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme protease ...............................................38 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của của nấm ..........................................................................................................39 2.3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces.........39 2.3.3.2. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các môi trường khác nhau ........................................................................................40 2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp ........................................................................................41 2.3.4. Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2...................................................................................................................41 2.3.5. Đánh giá khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp. .........................................................................................................................42 2.4. Phương pháp xử lý số liệu..........................................................................42
Đồ án tốt nghiệp iii CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................44 3.1. Phân lập nấm ..............................................................................................44 3.1.1. Phân lập nấm có nguồn gốc từ chế phẩm xử lý đất ............................44 3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces sp2. .........................................................45 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Paecilomyces phân lập được ...46 3.3. Định tính hệ enzyme ngoại bào có khả năng đối kháng tuyến trùng và bọ phấn...............................................................................................................50 3.3.1. Khả năng tổng hợp enzyme protease của 2 chủng nấm Paecilomyces50 3.3.2. Khả năng tổng hợp enzyme chitinase của 2 chủng nấm Paecilomyces sp1. và sp2.......................................................................................................52 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sự phát triển của nấm.54 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển nấm của chủng nấm Paecilomyces spp ............................................................................................54 3.4.1.1. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1. ..54 3.4.1.2. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2. ..56 3.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp ............................................................58 3.4.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1..........................................................................58 3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2..........................................................................61 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm .........................................................................................................................64 3.4.3.1. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp1.........................................................................................64 3.4.3.2. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp2.........................................................................................66 3.5. Khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2...........68 3.6. Khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp của 2 chủng nấm Paecilomyces ..............................................................................................70 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................72 4.1. Kết luận.......................................................................................................72 4.2. Đề nghị.........................................................................................................72 TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................73
Đồ án tốt nghiệp iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato D - Glucose Agar SB: Sabouraud + KC MA: Malt CZA: Czapeck - Dox
Đồ án tốt nghiệp v DANH MỤC CÁC BẢNG STT BẢNG NỘI DUNG TRANG 1 1.1 Hiệu quả phòng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật. 29 - 31 2 3.1 So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp1. 45 - 46 3 3.2 So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp2. 47 - 48 4 3.3 Kết quả sinh tổng hợp enzyme protease của 2 chủng nấm Paecilomyces sp1. và sp2. 49 5 3.4 Kết quả sinh tổng hợp enzyme chitinase của 2 chủng nấm Paecilomycessp1. và sp2. 51 6 3.5 Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm Paecilomyces sp1. qua các ngày 54 7 3.6 Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm Paecilomyces sp2. qua các ngày 56 8 3.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển đường kính nấm Paecilomyces sp1. qua các ngày. 58 9 3.8 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển đường kính nấm Paecilomyces sp2. qua các ngày. 61 10 3.9 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển đường kính của Paecilomyces sp1. 63 11 3.10 Số liệu sự phát triển của nấm dưới các điều kiện 66
Đồ án tốt nghiệp vi chiếu sáng qua các ngày nuôi cấy. 12 3.11 Hiệu lực diệt bọ phấn 67 13 3.12 Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng của 2 chủng Paecilomycessp1. và sp2. 69 DANH MỤC CÁC HÌNH STT HÌNH NỘI DUNG TRANG 1 1.1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. 5 2 1.2 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. 6 3 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin 7 4 1.4 Bio Nematon - Sản phẩm của công ty T.Stanes có khả năng trừ tuyến trùng 16 5 1.5 Sản phẩm trừ bọ phấn 17 6 1.6 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự phát triển của tản nấm Paecilomyces 19 7 1.7 Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng 21 8 1.8 Đặc điểm tuyến trùng hại rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học ×10 25
Đồ án tốt nghiệp vii 9 1.9 Vòng đời của tuyến trùng hại rễ 27 10 2.1 Chế phẩm xử lý đất 37 11 2.2 Các lọ thủy tinh dùng để bố trí thí nghiệm 38 12 3.1 Dịch chế phẩm được trang ra đĩa PDA ở nồng độpha loãng 10-4 vào ngày thứ 3. 43 13 3.2 Nấm nghi ngờ mọc lên từ bọ phấn trên môi trường PDA. 44 14 3.3 Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp1. 50 15 3.4 Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp2. 50 16 3.5 Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp1. 52 17 3.6 Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp2. 52 18 3.7 Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên môi trường có pH khác nhau ở 14 ngày nuôi cấy. 53 19 3.8 Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp1. ở các pH môi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuôi cấy 54 20 3.9 Nấm Paecilomyces sp2. ở pH 5,6,7,8 14 ngày sau cấy 55 21 3.10 Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp2. ở các pH môi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuôi cấy 56
Đồ án tốt nghiệp viii 22 3.11 Nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau khi cấy 57 23 3.12 Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên các môi trường khác nhau qua các ngày. 59 24 3.13 Nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau khi cấy 60 25 3.14 Sự phát triển của Paecilomyces sp2. trên các môi trường khác nhau qua các ngày. 62 26 3.15 Tản nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy 63 27 3.16 Sự phát triển của Paecilomyces sp1. ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau 64 28 3.17 Tản nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy 65 29 3.18 Sự phát triển của Paecilomyces sp2. ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau 66 30 3.19 Mẫu bọ phấn không bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học 68 31 3.20 Mẫu tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi quang học 69 32 3.21 Tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi sau khi bị gây nhiễm bởi nấm Paecilomyces sp2. 70
Đồ án tốt nghiệp 1
Đồ án tốt nghiệp 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam là đất nước của nền nông nghiệp và nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên thích hợp cho nhiều mầm bệnh sinh sôi nảy nở. Trong số đó có bệnh héo lá do bọ phấn trắng và bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra. Hai mầm bệnh ấy đang mang lại những tổn thất nặng nề về sản lượng nông nghiệp hiện nay. Vì vậy, việc tìm ra giải pháp để kiểm soát hai tác nhân gây bệnh này rất quan trọng. Đa số người nông dân hiện nay thường dùng các loại thuốc hóa học để phòng trừ các loài gây hại này. Tuy nhiên, thuốc hóa học không những để lại tồn lưu cao trong nông san3anh3 hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, đến môi trường sống mà còn tăng tính kháng thuốc của sâu hại, làm cho việc phòng trừ ngay càng khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay người ta đang tìm kiếm các tác nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần hoặc hoàn toàn thuốc hóa học trong quản lý các loài sâu bệnh và tuyến trùng gây hại. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Úc, Brasil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh côn trùng, tuyến trùng trong phòng trừ các loài gây hại đã mang lại hiệu quả cao (Burges H. D., 1998; Butt T. M and Copping L., 2000). Trong đó, Paecilomyces là một trong những loài nấm tiềm năng đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài này vẫn còn khá hạn chế. Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên quyết định chọn nghiên cứu đề tài: "Phân lập nấm Paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được". 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập được các chủng Paecilomyces spp. và bước đầu đánh giá khả năng ký sinh của các chủng Paecilomyces spp. phân lập được trên bọ phấn trắng, tuyến trùng nhằm phòng trừ bệnh hại thực vật.
Đồ án tốt nghiệp 2 3. Nội dung nghiên cứu − Phân lập các chủng Paecilomyces từ chế phẩm và bọ phấn trắng thu thập được − Định tính hệ enzyme ngoại bào có khả năng đối kháng tuyến trùng và bọ phấn trắng − Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. phân lập được − Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn và tuyến trùng của nấm Paecilomyces spp. phân lập được
Đồ án tốt nghiệp 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1. 1. Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp. 1.1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 1.1.1.1 Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Paecilomyces Chi Paecilomyces do Bainier mô tả vào 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Chuyên luận về chi nấm này của Samson (1974) chấp nhận 16 loài đã mô tả, đồng thời tổ hợp mới 9 loài và đề nghị 6 loài mới, tất cả tập hợp trong 2 nhóm loài. Nhóm loài thứ nhất là nhóm loài Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác. Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng. Nhiều loài trong nhóm hai này ký sinh gây bệnh côn trùng. 1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Ngoài ra, có thể tìm thấy loài nấm này ở các loại đất nông nghiệp (Brand et al., 2010). Chúng hiện diện ở những nơi khá ẩm ướt, trong đất, không khí, trong phòng thí nghiệm hay ngoài tự nhiên. Ký chủ của nấm bao gồm hơn 25 họ côn trùng và nhiều loại ve khác nhau. Trong đó, những loài ký chủ là côn trùng dễ bị nhiễm nấm đó là: bọ phấn trắng, rệp, bướm đêm...; còn những loài ký chủ là ve thì có: ve nâu, ve đỏ châu Âu... Còn đối với ký chủ là tuyến trùng thì thường phân lập được chủng nấm Paecilomyces lilacinus,
Đồ án tốt nghiệp 4 một loài có trong đất và thảm thực vật (Jatala, 1986). Trong nghiên cứu của Eng (2001), có 82,9% trong số 41 nông trại được khảo sát ở Sarawalk có sự hiện diện của P.lilacinus, mặc dù người ta đã sử dụng các loại thuốc diệt nấm. Từ đó có thể nhận thấy P.lilacinus có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống, có phạm vi thích ứng rộng và có khả năng phát triển tốt ở 26 – 300 C. Chi Paecilomyces có nhiều loài nhưng chủ yếu là hai loài Paecilomyces lilacinus và Paecilomyce variotii. Một vài loài Paecilomyces spp. có khả năng chịu nhiệt như: nhiệt độ tối ưu của Paecilomyces fulvus là 450 C, Paecilomyces crustaceous là dưới 550 C (Samson, 1974). Hai loài nấm chịu nhiệt trên có khả năng làm hư hỏng thực phẩm nhưng cũng là loài quan trọng ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các enzyme chịu nhiệt. Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài Paecilomyces đem lại nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích (Liang et al., 2003) . Một số loài Paecilomyces spp. phổ biến: − Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng. − Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất. − Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng. − Paecilomyces lilacinus phân lập được từ xác bã hữu cơ, trứng tuyến trùng và đôi khi còn ở côn trùng chết, rừng cao su. (Crop Protection Compennium, 2002). 1.1.1.3. Đặc điểm hình thái a. Đặc điểm đại thể Paecilomyces spp. là loại nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác côn trùng. Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đó khi bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng sẫm. Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Khuẩn lạc thường
Đồ án tốt nghiệp 5 mọc theo hình tròn đồng tâm. Có thể phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể. Hình 1.1. Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) b. Đặc điểm vi thể Cuống bào tử đính thường phân nhánh và mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces spp. thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium spp. Cuống bào tử hình thành từ phần gốc hay giữa sợi nấm, dài 400 - 600 µm. Paecilomyces spp. có thể bình trên đầu của cuống với kích thước 3 - 4 × 400 - 600 µm. Thể bình nhỏ, phồng lên ở phần gốc, thon dài, nhỏ và uốn cong ở phần đầu. Thường phần gốc chụm lại thành nhóm như cây chổi tương tự như cấu trúc ở phần đuôi của cuống bào tử đính. Bào tử phân sinh đơn bào, có dạng hình oval đến hình thoi, trong suốt đến nâu, có hình thành dạng chuỗi, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002). Giá bào tử trần, đơn độc hoặc bó thành giá, phân nhánh không đều hoặc thành vòng. Nhánh mang ở đỉnh thể bình mọc thành vòng. Thể bình đôi khi đơn độc trên các sợi nấm không phân hóa. Thể bình gồm phần gốc hình trụ hoặc hình gần trứng và phần ngọn thon nhỏ đột ngột thành một cổ dài. Bào tử trần thuộc tip phialoconidi (tip cơ bản euconidi), không ngăn vách, không màu hoặc màu nhạt,
Đồ án tốt nghiệp 6 nhẵn hoặc có gai, thành chuỗi gốc non. Các chuỗi bào tử trần tách xa nhau, ít khi tụ họp thành khối. Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2012_06_01_archive.html) 1.1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp. Độc tố chính của nấm Paecilomyces spp. là paecilotoxin (leucinostatins), là một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và amine ở đầu C. Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1- [[(1S)-1-[2[2-(3-arbamoylpropylcarbomoyl)propan-2-ylcarbamoyl] propan-2- ylcarbamoy]-3-methylbutyl] carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2- ycarbomoyl]-2-hydroxy-3-methyl-butul] carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo- nonyl]-4-methyl-1-[(E,4S)-4-methylhex-2-enoyl] pyrrolidin-2-carboxamide. (Nevalainen Helena, 1977). Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng loài khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng.
Đồ án tốt nghiệp 7 Hình 1.3. Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin. 1.1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ a. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với bọ phấn trắng Chu kỳ sống của Paecilomyces spp. có thể chia làm 3 giai đoạn: đầu tiên các bào tử sẽ tiếp xúc với côn trùng qua lớp vỏ và lớp chân lông. Các bào tử bám váo lớp vỏ của côn trùng, nảy mầm và phát triển một ống mầm trong 8 - 16 giờ. Ống mầm phát triển dưới dạng một vòi bám xuyên qua biểu bì côn trùng và đi vào trong xoang máu. Vòi bám là một tế bào có kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, có dịch nhầy để bám vào vỏ côn trùng. Sự xâm nhập của nấm đạt được bằng cách tiết ra hỗn hợp enzyme bao gồm chitinase, protease và áp lực cơ học. Sau khi tế bào đơn nảy mầm, bào tử sẽ xâm nhập và lưu thông trong xoang máu của côn trùng, nhân lên, và sử dụng chất dự trữ trong cơ thể côn trùng để sinh trưởng và sinh sản. Các sợi nấm phân nhánh tạo thành một mạng lưới chằng chịt trong cơ thể côn trùng. Paecilomyces spp. sản sinh ra các hợp chất, phá bỏ hệ thống miễn dịch của côn trùng, cạnh tranh với các vi sinh vật tiềm tàng, giết chết vật chủ trong 7 - 14 ngày. Cuối cùng sau khi ký chủ chết, nấm sẽ lan ra khỏi biểu bì rồi bao lấy cơ thể của côn trùng và phát triển thành đảm bào tử. Khi gặp điều kiện phù hợp sẽ sản sinh ra bào tử, bào tử sẽ được phát tán rồi lây nhiễm cho các vi sinh vật khác. Tuy nhiên,
Đồ án tốt nghiệp 8 chu kỳ sống được hoàn thành trong điều kiện phải thích hợp, trong khoảng 48 - 72 giờ và không có sự có mặt của vi sinh vật hoại sinh. Thông thường đối với các loại bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn hay do virus thì chúng lây truyền thông qua đường ruột hay đường thức ăn, nhưng đối với nguồn bệnh là vi nấm thì chủ yếu là do sự tiếp xúc trực tiếp hay qua trung gian truyền bệnh. Trung gian đó có thể là những loài ký sinh hay côn trùng ăn thịt. Nấm Paecilomyces spp. tấn công vào xoang máu của bọ phấn thông qua lớp biểu bì hoặc đường miệng. Bọ phấn chết là sự kết hợp của nhiều yếu tố như tổn thương mô cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do nấm tiết ra khi ở trong cơ thể côn trùng. Quá trình bám của bào tử nấm vào cơ thể của côn trùng là một quá trình thụ động nhờ gió và nước. Đầu tiên bào tử của nấm sẽ bám lên thành biểu bì. Bào tử của nấm có một lớp bên ngoài là bó sợi đan xen là các đuôi kị nước. Độ bám dính của bào tử trên bề mặt biểu bì một phần là nhờ các đuôi kị nước. Lectins, một loại cacborhydrate glycoprotein được phát hiện có trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì côn trùng dễ hơn. Khi đạt tới điều kiện thích hợp bào tử sẽ nảy mầm và tăng trưởng nhanh chóng với sự tác động của các điều kiện sẵn có của nước, chất dinh dưỡng, oxy cũng như pH, nhiệt độ và bởi sự tác động của hợp chất độc tố trên bề mặt côn trùng. Nấm nảy mầm trong phạm vi có đủ nguồn Carbon và Nitơ. Nấm xâm nhập vào côn trùng bằng quá trình lây nhiễm, xâm nhập qua lớp biểu bì hay tạo áp lực cơ học nhờ giác bám. Lớp biểu bì của côn trùng có hai lớp: ngoài là epicuticle và trong là procuticle. Epicuticle có cấu trúc phức tạp là một lớp mỏng không có chitin nhưng chứa protein, phenol ổn định và được bao phủ bởi một lớp sáp có chứa acid béo, lipid, sterol.Các procuticle phần lớn có các sợi chitin bên trong hỗn hợp protein, lipid, quinon. Nấm cần xuyên qua lớp biểu bì vào cơ thể côn trùng để có thể lấy được chất dinh dưỡng cần cho sự tăng trưởng và sinh sản. Sự xâm nhập vào cơ thể côn trùng bao gồm cả sự phân hủy của enzyme do nấm tiết ra và nhờ áp lực cơ học.
Đồ án tốt nghiệp 9 Khởi đầu cho quá trình xâm nhiễm, nấm xâm nhập tại những vị trí dễ bị tổn thương trên lớp biểu bì. Nấm sẽ xuyên qua lớp biểu bì ngoài nhờ áp lực cơ học. Bào tử nảy mầm và hình thành các giác bám trên bề mặt biểu bì. Giác bám là đầu tận cùng của ống mầm phát sinh từ bào tử. Giác bám gắn vào biểu bì côn trùng là nhờ tương tác kị nước giữa các thành bào tử và các lipid nằm trong lớp biểu bì trên. Sau đó, ống mầm xuyên qua lớp biểu bì dưới, nội bì rồi vào xoang máu. Các nghiên cứu còn cho thấy có sự tham gia của các chất truyền tin nội bào như Ca2+ và cAMP (cyclicadenosine monophosphate) trong sự hình thành giác bám trong trường hợp khi lớp biểu bì cứng khó xuyên qua. Sau khi xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng, nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn. Những sợi nấm này được phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, chúng tiêu diệt dần các tế bào bạch huyết. Sau đó, sợi nấm xâm nhập mô, phá hủy tất cả các tế bào bạch huyết rồi làm chết vật chủ. Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm giảm tác dụng oxy hóa khử lympo trong máu. Do nấm sinh sản nhiều sẽ làm tắc hệ tuần hoàn của côn trùng, làm côn trùng biếng ăn; đồng thời chất độc sinh ra làm thay đổi sinh hóa của cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đó làm rối loạn và mất chức năng sinh lý. Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục hoại sinh cơ thể côn trùng rồi phát triển sợi nấm ra toàn bộ cơ thể côn trùng và hình thành bào tử. Quá trình xâm nhập vào cơ thể côn trùng còn nhờ vào sự hỗ trợ mạnh mẽ của các enzyme và hệ enzyme. Một loạt các loại enzyme ngoại bào có thể thủy phân các thành phần chính của lớp biểu bì côn trùng như chitinase, lipase, esterase, lipoxygenase và ít nhất bốn loại protease khác nhau đã được ghi nhận có vai trò quan trọng trong việc xâm nhiễm. Do cấu trúc phức tạp của lớp biểu bì côn trùng nên cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme khác nhau. Trong đó, chitanase và endoprotease là hai enzyme giữ vai trò quan trọng nhất.
Đồ án tốt nghiệp 10 b. Chu kỳ sống và tác động của nấm Paecilomyces spp. tác động đối với tuyến trùng Thuật ngữ “nematophagous fungi – nấm kí sinh tuyến trùng” được dùng để mô tả một nhóm đa dạng các loài nấm có khả năng xâm nhiễm và ký sinh tuyến trùng. Nhiều loại vi nấm đã được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood,1996). Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Có rất nhiều loài Paecilomyces có khả năng ký sinh tuyến trùng, trong đó có Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces chlamydosporia được xem là nấm kí sinh trứng tuyến trùng hiệu quả. Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm là enzyme protease và chitinase, bởi vì vỏ trứng được cấu tạo bởi ba lớp riêng biệt: một lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin và một lớp lipoprotein bên trong. Các thí nghiệm đã cho thấy trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng (Llorca và Claugher, 1990) dẫn đến sự tan rã của lớp vitelline, phân hủy của lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004). Các loại nấm có sự khác nhau về khả năng phân hủy vỏ trứng tuyến trùng, và quá trình xâm nhiễm được tìm thấy bị ảnh hưởng bởi kí chủ tuyến trùng (Segers et al., 1998). Sự xâm nhiễm tuyến trùng và trứng của chúng bởi các nấm khác nhau thì có thể theo các phương thức khác nhau. Ban đầu, các bào tử và sợi nấm sẽ tiếp xúc với vỏ trứng. Khi bào tử nấm bám trên bề mặt kí chủ, bào tử sẽ mọc mầm xuyên qua lớp vỏ trứng. Như trong các cách xâm nhập bề mặt kí chủ của các nấm kí sinh côn trùng khác, nấm kí sinh trứng tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (enzyme) và cơ học. Nấm tiết ra các enzyme làm mềm lớp vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm
Đồ án tốt nghiệp 11 rồi thông qua lớp lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Vỏ trứng tuyến trùng có chứa chitin và protein được tổ chức thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980), do đó chitinase và protease giữ một vị trí quan trọng trong quá trình xâm nhập tuyến trùng (Tikhonov et al., 2002). Để chứng minh tầm quan trọng của enzyme trong quá trình phân hủy các polymer trong trứng tuyến trùng, một nghiên cứu về các enzyme ngoại bào phân hủy các polymer này đã được thực hiện trên một chất ngoại bào (ECM - extracellular material chứa protease P32) hoặc chất kết dính được tiết ra từ nấm P.rubescens có liên quan đến lectin Concanavalin A (Con A). Trong nghiên cứu đó, protein serine 32 kDa đã được ly trích từ P. rubescens kí sinh trứng. Sự tham gia của enzyme trong quá trình này đã được kiểm tra trên các protein vỏ trứng Globodera pallid (Llorca, 1990). Người ta cho rằng mặc dù quá trình gây bệnh phức tạp và liên quan tới nhiều yếu tố, nhưng ức chế P32 bằng hóa chất và kháng thể đa dòng làm giảm sự nhiễm trùng và xâm nhập trứng (Llorca et al., 2002). Các loài tương tự P. chlamydosporia cũng tiết ra enzyme protease ngoại bào (VcP1) liên quan với P32 và các enzyme tương tự từ nấm nội kí sinh (Segers et al., 1994). Trứng được xử lý với VcP1 bị xâm nhiễm dễ hơn trứng chưa được xử lý, điều này cho thấy vai trò của enzyme trong quá trình kí sinh vỏ trứng bởi nấm kí sinh trứng. 1.1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 83 loài phân bố trên diện rộng, trong đó có thể kế đến là Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseu, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces variotii, Paecilomyces lilacinus (Dilip K.Arora, P.D.Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004).
Đồ án tốt nghiệp 12 Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như: - Paecilomyces lilacinus Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phòng 270 C ± 20 C. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). - Paecilomyces fumosoroseus Khuẩn lạc trên môi trường MEA (Malt extract agar) có màu xám. Sau 14 ngày đường kính khuẩn lạc đạt 15 mm. Cuống bào tử trần đơn độc, kích thước 40 - 60 × 2 - 3µm. Bào tử có dạng hình trụ, kích thước 3 - 4 × 1 - 2µm và tạo thành chuỗi dài. Loài này có khả năng ký sinh trên các loài côn trùng. - Paecilomyces variotii Bainier Paecilomyces variotii Bainier là loài thường gặp nhất ở không khí, đất và trên các sản phẩm công nông nghiệp ở nước ta (D.H.Miên, 1960), có khả năng sinh ra kháng sinh variotin (kháng sinh chống nấm), ngoài ra còn tạo thành mycotoxin là acid byssochlamic và một số sản phẩm trao đổi chất khác. Thường sống hoại sinh trên các loại gỗ, đồ thuộc da, sách, đồ bằng sợi nilon hay sợi đay. Nhưng loài nấm này có khả năng gây bệnh trên người và thực vật. - Paecilomyces inflatus Khuẩn lạc trên môi trường MEA (Malt extract agar) phát triển chậm, đường kính từ 33 - 35mm ở 14 ngày và ở nhiệt độ 280 C. Khuẩn lạc mịn, mềm như bông khi mới phân lập. Phát triển thành sợi nấm trong suốt và mịn vài ngày sau đó.
Đồ án tốt nghiệp 13 Khuẩn lạc trên PDA cũng phát triển chậm, khoảng 33 - 35mm ở 14 ngày và ở nhiệt độ 250 C. Khuẩn lạc có màu trắng hơi vàng nhạt. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm là ở 250 C. Cuống bào tử có cấu trúc không đều thường gồm 1 - 3 thể bình trên nhánh ngắn của sợi nấm. Thể bình, bào tử: chủ yếu là các thể bình đơn có cấu trúc không đều trên sợi nấm hoặc ngẫu nhiên có 2 – 3 thể bình nằm trên sợi nấm. Thể bình có dạng bình, với phần gốc phình to, phần đầu nhọn. Thể bình dài khoảng 12,8 – 2,3 µm, trong suốt và mịn. Bào tử độc lập, hình chanh. 1.1.3. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống 1.1.3.1. Sản xuất enzyme Paecilomyces spp. được biết đến như một chủng nấm sản xuất và cung cấp nguồn enzyme tiềm năng. Paecilomyces spp. tiết ra enzyme để dễ xâm nhập vào ký chủ hơn và giúp chúng phát triển nhờ thủy phân cơ chất hay thâm chí còn lấn át các loài vi sinh vật khác phát triển. Đã có nhiều nghiên cứu về sự sản sinh enzyme của Paecilomyces spp., nhiều nhất là về các enzyme hydrolase: protease, cellulase, dextranase... Paecilomyces spp. sinh ra ba loại protease: acid, trung tính và kiềm. Các protease acid và trung tính có thể ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia và bánh kẹo. Protease kiềm thì ứng dụng trong công nghiệp thuộc da. Paecilomyces spp. thuộc nhóm nấm Ascomycetes có mặt trong đất, nước, không khí, gỗ, tàn dư thực vật, đất… Paecilomyces spp. còn gọi là nấm thối mềm, vì chúng có khả năng phân hủy cellulose. Dextranase (α -1,6-D-glucan, 6 glucanohydrolase; EC: 3.2.1.11) có nhiều ứng dụng trong y học và nền công nghiệp vì nó thủy phân dextran. Sự hiện diện của dextran có nhiều tác động tiêu cực ở mức độ chế biến như mất sucrose, tăng độ nhớt của quá trình siro và phục hồi kém của sucrose. Sử dụng dextran sẽ giải quyết được các vấn đề này. Dextranase có thể thủy phân hay ức chế quá trình tổng hợp glucans,
Đồ án tốt nghiệp 14 có thể được sử dụng trong điều trị mảng bám răng. Nó cũng được sử dụng để tạo ra các dextran có trọng lượng phân tử thấp và gây độc cho tế bào. Hơn nữa, dextranase có ảnh hưởng tiêu cực đến sự tổng hợp isomaltooligosaccharides, chất ức chế hoạt động của các cơ chất có lợi cho vi khuẩn đường ruột probiotic. Và loại enzyme này cũng đã được tiết ra bởi nhiều loài nấm trong đó có nấm Paecilomyces spp. 1.1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp Paecilomyces spp. là nguồn quan trọng cho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng một số loài Paecilomyces spp. có thể tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học rất hữu ích. Fingolimod làhợp chất được tổng hợp dựa trên chất chuyển hóa thứ cấp do nấm tổng hợp là myriocin (ISP-I), là một chất ức chế miễn dịch mạnh đã được phê duyệt bởi FDA (U.S. Food and Drug Administration) như là một loại thuốc điều trị mới cho chứng đa sơ cứng. Fingolimod đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Tetsuro Fujita ở Đại học Kyoto (1992). ISP-I được thu nhận từ P. cicadae. Fingolimod có tiềm năng được sử dụng trong liệu pháp ghép cơ quan. Các nhà khoa học cho rằng nó có thể ngăn ngừa mạnh các phản ứng miễn dịch thông qua trung gian lympo bào để đáp ứng việc cấy ghép cơ quan mới. Ngoài ra, fingolimod còn được cho rắng làm tăng tế bào nội mô và bảo vệ chức năng của chúng. Một chất tương tự như anarcadic acid được tách chiết từ P. variotii. Hợp chất này lần đầu tiên được cô lập từ nguồn tự nhiên và được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chống lại các tác nhân gây bệnh cho người bao gồm cả các chủng đa kháng thuốc MDR (Multidrugresistan). Paecilomyces farinosus B05 đã được nghiên cứu để tách chiết các thành phần polysaccharide ngoại bào từ môi trường lên men và sản xuất để ứng dụng vào sản xuất các chất chống oxy hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các polysaccharide được chiết xuất từ P. farinosus có hoạt tính chống oxy hóa cao, chỉ thấp hơn vitamin C một ít.
Đồ án tốt nghiệp 15 1.1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật Việc sử dụng các vi sinh vật tự nhiên để phòng trừ các dịch hại là một công việc quan trọng hiện nay trong ngành nông nghiệp vì sự an toàn, thân thiện với môi trường và hiệu quả cao. Ở Ai Cập đã sản xuất Priority - một sản phẩm từ P. fumosoroseus để diệt trừ các loại côn trùng. Đây là thuốc trừ sâu sinh học giúp diệt trừ bướm trắng để bảo vệ cây cà chua, dưa leo, cây cảnh. Sản phẩm chứa bào tử của chủng nấm P.fumosoroseus, và được xem là có khả năng lây nhiễm ở tất cả giai đoạn (trứng, ấu trùng, nhộng, bướm trưởng thành). Ngoài ra trên thị trường còn có một số sản phẩm như Pelicide, Bio - Nematon, PL Plus chứa bào tử nấm P.lilacinus nhằm phòng trừ tuyến trùng gây hại cho cây nằm trong đất. 1.1.3.4. Xứ lý môi trường Nấm là đối tượng thường được sử dụng trong hệ thống lọc khí sinh học để xử lý ô nhiễm không khí thông qua việc sử dụng khả năng của nấm để biến đổi các chất ô nhiễm hữu cơ và vô cơ thành hợp chất ít độc hại hơn. Formaldehyde là một chất phổ biến và nó là sản phẩm của các nguồn sinh học và từ môi trường (sinh ra từ nhà máy công nghiệp). Formaldehyde có độc tính cao do phản ứng không đặc hiệu với protein và nucleic acid, vì thế nó là chất gây ô nhiễm môi trường. P. variotii đã được thử nghiệm xử lý formaldehyde do chủng nấm này có enzyme S - hydroxymethylglutathione dehydrogenase. Enzyme này có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với cơ chất là formaldehyde. Ngoài ra, enzyme alcohol oxidase từ P. variotii có khả năng làm giảm lượng formaldehyde đáng kể và là tiềm năng cho việc ứng dụng xử lý formaldehyde. Ngoài ra, có một số ứng dụng quan trọng của chi Cordyceps trong việc làm thuốc và thực phẩm có lợi cho sức khỏe của con người là chi Paecilomyces (Liang et al., 2003).
Đồ án tốt nghiệp 16 1.1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp. Bio - Nematon là thuốc trừ tuyến trùng sinh học chứa chủng nấm Paecilomyces lilacinus được chọn lọc trong tự nhiên. Sản phầm bao gồm những bào tử và sợi nấm của P.lilacinus, dạng lỏng chứa 1x109 CFU/ml và dạng bột chứa 1x108 CFU's/gm. Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của nó sẽ phá hủy vỏ trứng, ấu trùng và con nhỏ của hấu hết các loại tuyến trùng gây hại ở thực vật. Khi mà bảo tử tìm thấy những giai đoạn khác nhau của tuyến trùng, chúng sẽ nảy mầm và phát triển, nảy nở trong cơ thể ký chủ, thậm chí làm tê liệt dẫn đến chết. Hình 1.4. Bio Nematon - Sản phẩm của công ty T.Stanes có khả năng trừ tuyến trùng (Nguồn: www.tstanes.com) NoFly WP là thuốc trừ sâu sinh học chứa chủng nấm Paecilomyces fumosoroseus nhằm kiểm soát bọ trĩ và bọ phấn trắng trên thực vật ở nhiều giai đoạn sống của chúng như: trứng, ấu trùng và con trưởng thành. Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của P.fumosoroseus sẽ bám vào côn trùng, nảy mầm và xâm nhập qua lớp cutin. Khi ký sinh được ký chủ, chúng sẽ phát triển nhanh chóng, phá vỡ tế bào dẫn đến bị mất chức năng sống. Côn trùng sẽ chết trong vòng từ 3 - 10 ngày, phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi côn trùng chết, bào tử của nấm sẽ nảy mầm trên bề mặt của côn trùng ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, làm cho
Đồ án tốt nghiệp 17 cơ thể côn trùng bị phủ một lớp tơ xám trắng ra bên ngoài. Trong điều kiện bất lợi, sẽ không có sự hình thành bào tử tuy nhiên ta có thể nhận thấy sự ký sinh của nấm qua màu sắc của cơ thể côn trùng khi chết, đó là màu nâu. Hay qua sự méo mó của cơ thể côn trùng. Hình 1.5. Sản phẩm trừ bọ phấn (Nguồn:www.plantprod.com) 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. Điều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng như hệ sợi nấm côn trùng là ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ pH trong môi trường, cũng như phương pháp nuôi cấy. Quá trình tác động đến đất như sử dụng phân bón hữu cơ, thuốc trừ sâu hóa học đều có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của một số chủng vi nấm sống trong đất. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát tiển của nấm: - Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của nấm. Nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không mọc và sẽ hạn chế khả năng gây bệnh đối với côn trùng. Trong quá trình hình thành bào tử, nấm cần các nguồn C, N. Các nguồn Carbon đã được nghiên cứu ảnh hưởng là: glucose, sucrose, arabinose, mannose và acid citric đều ảnh hưởng đến sự phát triển của Paecilomyces spp. (Bharati et al., 2007). Kết quả cuối cùng thu được:
Đồ án tốt nghiệp 18 sucrose là cơ chất tốt nhất (87,25 cm) cho sự tăng trưởng; tiếp theo là glucose (56,25 cm). Mannose có khả năng thấp nhất, các cơ chất khác có tác dụng vừa phải. Còn đối với nguồn Ni-tơ, Bharati et al. (2007) đã sử dụng các nguồn Nitơ thử nghiệm: ammonium photphase, sodium nitrate, glycin, calcium nitrate, ammonium nitrate để nghiên cứu khả năng sử dụng Nitơ của Paecilomyces spp. Kết quả thu được Calcium nitrate là nguồn Nitơ tốt nhất rồi đến glycin, natri nitrate, ammonium nitrate. Ammonium phosphate được vi nấm sử dụng ít nhất. - Ảnh hưởng của các loại môi trường: Theo Sung Mi Shim (2003) nghiên cứu rằng có sự chênh lệch về sự phát triển của nấm trên hai môi trường PDA (6,73 cm sau 14 ngày nuôi cấy) và Czapeck - Dox (6,25 cm sau 14 ngày nuôi cấy). - Ảnh hưởng của ẩm độ và nhiệt độ là yếu tố cần cho sự hình thành và phát triển của bào tử nấm Paecilomyces spp. Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 - 250 C, nhưng ở 250 C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999), còn nhiệt độ phù hợp cho sự hình thành bào tử lại là ở 240 C. Đối với nấm Paecilomyces papillata, khi lây nhiễm thì ở 180 C có tỷ lệ ký sinh cao hơn đến 18% so với nhiệt độ 250 C. Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình dị hóa, tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần văn Mão, 2002). Gần đây, Statbers, T.E, D.Moore và C.Prior (2004) đã cho công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. và xác định loài này thích hợp ở nhiệt độ 280 C (Phạm Thị Thùy, 2004). Nếu nhiệt độ quá cao thì bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành. Julio J.D et al. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12, 16 và 300 C. Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công vào cơ thể côn trùng nếu gặp điều kiện không thích hợp về nhiệt và ẩm độ hay ánh sáng thì sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường (Penland, 1982).
Đồ án tốt nghiệp 19 Hình 1.6. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự phát triển của tản nấm Paecilomyces Ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80 - 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Độ ẩm cao sẽ có lợi cho sự sinh trưởng của sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử. Tuy nhiên, độ ẩm thấp sẽ duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm có khả năng sống lâu trong điều kiện độ ẩm từ 0 - 34% hơn là khi ẩm độ 75% (Trần Văn Mão, 2002). - Ảnh hưởng của ánh sáng: Nấm côn trùng phát triển tốt trong điều kiện phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong thời gian 6 - 8 giờ cũng đủ cho nấm côn trùng phát triển. Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình sinh bào tử của nấm. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp. sẽ không tạo nhiều bào tử. Theo như nghiên cứu của Li Gao et al (2009) thì thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng đến sự phát triển nấm và hình thành bào tử đối với Paecilomyces lilicinus IPC - P, cụ thể như sau: nấm phát triển tốt nhất ở điều kiện tối hoàn toàn (49,96 mg/cm2 ), còn ở điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn rất nhiều (29,75 mg/cm2 ). Tương tự cho sự hình thành bào tử, ở điều kiện tối hoàn toàn thì bào tử tạo thành nhiều nhất 91,7.105 bào tử/cm2 ; trong điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn (46,79 bào tử/cm2 ). Đối với chủng P.lilacinus M-14 thì trong điều kiện tối hoàn toàn nấm phát triển tốt (56,58 mg/cm2 ); còn điều kiện 12h sáng/12h tối nấm đạt giá trị 55,05 mg/cm2 . Đối với sự hình thành bào tử thì lượng bào tử tạo
Đồ án tốt nghiệp 20 thành nhiều ở điều kiện 12h sáng/ 12 tối (121,57.105 bào tử/cm2 ); còn ở điều kiện tối hoàn toàn thì lượng bào tử tạo thành thấp hơn (55,91. 105 bào tử/cm2 ). - Ảnh hưởng của độ pH: thường nấm sống trong phạm vi pH = 3,5 - 8. Nhưng nấm côn trùng ưa pH acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 - 6. Theo như nghiên cứu của Sung Mi Shim et al. (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P.fumosoroseus nằm trong khoảng 6 - 9, còn nấm P.japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003). - Ảnh hưởng của độ thoáng khí: nấm côn trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí, khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt. 1.3. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phòng trừ bọ phấn và tuyến trùng gây hại 1.3.1. Tổng quan về bọ phấn trắng 1.3.1.1. Phân loại khoa học Giới: Animanila Ngành: Arthropoda Lớp: Insecta Bộ: Hemiptera Họ: Sternorrhyncha Chi: Aleyrodoidea Loài: Aleyrodidae
Đồ án tốt nghiệp 21 Hình 1.7. Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng. (Nguồn: organicsoiltechnology.com) 1.3.1.2. Đặc điểm sinh thái Bọ phấn là một trong những dịch hại nguy hiểm đối với nhiều loài cây trồng. Ký chủ ọ phấn chủ yếu là thực vật hạt kín hai lá mầm, trong đó cây họ cam quýt (Rutaceae) là ký chủ của hơn 60 loài, cây họ dâu tằm (Moracea) là ký chủ của hơn 80 loài. Ở các nước ôn đới, bọ phấn Trialeurodes vaporariorum gây hại nặng cho cây trồng trong nhà kính và ngoài đồng ruộ Aleyrodes proletella gây hại nặng cho rau họ thập tự. Ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, các loài
Đồ án tốt nghiệp 22 Aleurodicus dispersus, Trialeurodes vaporariorum và Bemisia tabaci gây hại thiệt nghiêm trọng cho bông và nhiều loại cây trồng khác có giá trị kinh tế cao. Cho đến nay trên thế giới đã ghi nhận 1556 loài bọ phấn. Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (BVTV) các năm 1967 - 1968, 1977 - 1978, 1997 - 1998, ở nước ta có 7 loài bọ phấn có tên khoa học là: Aleurocanthus spiniferus, Aleurocanthus woglumi, Aleurocanthus spp. gây hại trên cam quýt; Aleurocybotus indicus gây hại trên lúa; Dialeurodes citri gây hại trên na; Parabemisia myricae gây hại trên đậu tương, thuốc lá, đậu đỗ, dưa chuột, cà chua, cà tím. Theo kết quả điều tra mới đây của các tác giả Nguyễn Thị Thu Cúc, Lê Thị Tuyết Nhung, Lê Quang Khải, thành phần bọ phấn nước ta đã được bổ sung thêm 4 loài: Aleurodicus dispersus gây hại trên ổi; Aleyrodes proletella gây hại trên súp lơ xanh; Dialeurolonga rusotigmoides, Ochamoplatus citri gây hại trên cam, quýt. 1.3.1.3. Đặc điểm hình thái Trưởng thành có kích thước nhỏ, thích bay và thường có màu trắng đục, có lớp sáp phấn trên cánh, chiều dài cơ thể 1 -3 mm. Trưởng thành của bọ phấn trắng cái có màu vàng nhạt hoặc trắng . Lá non chưa hoàn chỉnh (chưa mở) là nơi con cái ưa thích đẻ trứng, giao phối ngay sau khi vũ hóa. Trứng có hình quả lê hoặc quả trứng, có cuống gắn chặt cố định trên các mô lá và thời gian pha trứng từ 8-31 ngày. Phần mở rộng của cuống óc dính này là phương tiện để thụ tinh. Mỗi con cái có thể đẻ 80 trứng, số lượng trứng thay đổi theo mùa. Ấu trùng tuổi 1 - 3 có thể di chuyển và gây hại trong phạm vi ngắn; T . Ấu trùng mới nở có màu kem nhạt và dần dần chuyển sang một màu đen bóng. Chúng hình thành các tua sáp và phủ một lớp sáp trên cơ thể . Ngay sau khi nở, các ấu trùng di chuyển tìm vị trí thích hợp để định cư gây hại. Thời gian phát dục của tuổi 1: 4 - 7 ngày, tuổi 2: 3 - 7 ngày và tuổi 3: 3 - 8 ngày. Mỗi lần lột xác là có sự thay đổi màu sắc từ màu nhạt chuyển sang hơi đen.
Đồ án tốt nghiệp 23 Hầu hết tuổi 2, 3 của ấu trùng có hình bầu dục hoặc thuôn dài và có những khe (nếp gấp) thở cạn ở thành bụng và lưng. Đó là các lỗ thở và có thể hỗ trợ cho việc dẫn truyền không khí. Giai đoạn nhộng (ấu trùng tuổi 4) trong giai đoạn đầu, kéo dài 9-14 ngày sau đó vũ hóa thông qua khe hình chữ 'T' trên lưng vào buổi sáng. Cả ấu trùng và trưởng thành đều chích vào mô cây trồng và hút dịch nhưng giai đoạn ấu trùng gây thiệt hại nặng nhất cho cây mía. Khi ấu trùng phát triển, chúng phủ một lớp bọc bằng sáp trắng giúp bảo vệ khỏi các tác động bên ngoài, nhất là thuốc trừ sâu, đây là đặc điểm riêng biệt của bọ phấn trắng ở các pha phát dục, trừ pha trứng. 1.3.1.4. Tổng quan về bệnh vàng lá do bọ phấn trắng gây ra Bọ phấn trắng non và bọ phấn trưởng thành thường tập trung ở mặt dưới lá cà chua, ổi, ớt.. chích hút dịch cây. Khi mật độ bọ phấn cao làm cây suy yếu, có thể bị héo, vàng lá, thậm chí có thể chết. Chất bài tiết của bọ phấn trắng có đường tạo điều kiện cho nấm bồ hóng phát triển hại cây. Bọ phấn thường gây hại trong mùa khô, chúng có phân tán trên phạm vi rộng nhờ gió. Ngoài ra, bọ phấn còn là vật trung gian truyền bệnh xoăn lá do virus gây ra và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có nhóm cây rau thực phẩm bị hại nghiêm trọng nhất là cà chua, ớt.. Bệnh xoăn lá có thể xuất hiện ngay từ khi cây còn nhỏ trong vườn ươm cho đến khi trồng ra ruộng và thu hoạch, phổ biến nhất là cây bắt đầu ra hoa. Bệnh xuất hiện càng sớm thì mức độ thiệt hại càng nặng. Cây bị bệnh còi cọc, lá biến màu vàng nhạt, trong khi gân lá còn xanh tạo thành những vết xanh vàng loang lổ, lá nhỏ lại, nhăn nheo và thô cứng, các lá ngọn bị xoăn, cây sinh trưởng kém, thấp nhỏ, phân nhiều nhánh cằn không phát triển được. Đốt thân hoặc các đốt ngắn lại và hơi uốn cong. Cây bị bệnh sớm và nặng có thể
Đồ án tốt nghiệp 24 chết. Nếu bị muộn và nhẹ thì những lá non ra sau mới bị xoăn, cây có thể ra hoa và trái nhưng rụng nhiều. Nếu có trái thì trái nhỏ, méo mó, cứng, chất lượng kém. Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới và chủ yếu là do bọ phấn chích hút từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe. Bọ phấn Bemisia tabaci là côn trùng môi giới truyền bệnh. Virus lan truyền rất nhanh, khi bọ phấn bắt đầu ăn cây cà chua, virus được truyền đi trong vòng 15 - 30 phút. Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Bệnh không tồn tại lan truyền qua hạt giống và qua đất. Hàng năm, bệnh thường phát sinh mạnh từ tháng 10 đến đầu tháng 11 và gây hại nặng vụ cà chua xuân - hè tháng 3 - 4, đặc biệt khi trời ấm và nắng, ít mưa. Mức độ bị bệnh ở các giống cũng khác nhau: giống cà chua lai dễ nhiễm bệnh hơn các giống cà chua thuần; các giống mới nhập nội dễ nhiễm hơn các giống trồng qua nhiều năm; các giống cà chua địa phương có khả năng kháng bệnh virus cao. 1.3.2. Tổng quan về tuyến trùng Tuyến trùng ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman và et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40%- 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều. Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính. Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972). Tuyến trùng hại rễ là một loài sống ký sinh thực vật, thuộc chi Meloidogyne. Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp. gây tổn hại 20% - 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972). Chúng tồn tại trong đất ở những vùng có khí hậu nóng bức hay có mùa đông ngắn. Có khoảng 2000 loài thực vật có thể bị nhiễm
Đồ án tốt nghiệp 25 tuyến trùng hại rễ và chúng gây mất mát 5% sản lượng thực vật trên toàn cầu mỗi năm. Ấu trùng của chúng xâm nhiễm vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, đồng thời chúng làm mất khoáng chất của cây và khả năng quang hợp. Khi chúng xâm nhiễm vào cây con thì kết quả chắc rằng cây đó sẽ chết, còn nếu nhiễm vào cây đã trường thành thì chỉ làm giảm năng suất của cây đó. 1.3.2.1. Phân loại khoa học Giới: Animalia Ngành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ: Tylenchida Họ: Heteroderidae Hình 1.8. Đặc điểm tuyến trùng hại rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học vật kính × 10 1.3.2.2. Đặc điểm sinh thái Meloidogyne thuộc nhóm động vật kí sinh cây trồng, chúng phân bố khắp thế giới và gần như kí sinh ở tất cả thực vật bậc cao. Chúng sống và sinh sản trong các tế bào sống bị biến đổi của rễ thực vật. Vì tạo nên những vết sưng trên rễ nên người ta gọi chúng là tuyến trùng sần rễ. Chúng có khả năng sinh sản và phát triển rất nhanh làm cho cây trồng bị thiệt hại nặng nề. Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne spp. có các đặc điểm như sau:
Đồ án tốt nghiệp 26 Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn hay quả lê, màu trắng, ít vận động, không có giai đoạn u nang. Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12 - 15 µm. Lỗ bài tiết nằm trước tới khoảng giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích. Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chấ đặc sệt để bảo quản trứng và đẻ trứng ra ngoài. Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ. Có kim chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18 - 25µm. Tuyến hầu nằm ở phần bụng đến ruột. Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25 - 33µm, ống dẫn dài từ 7 - 11µm. Có một tinh hoàn. Ấu trùng: Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọc gelatine (gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt hay bên trong của nốt sần rễ. 1.3.2.3. Tổng quan về bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra Tuyến ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40% - 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều. Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính. Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972). Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp. gây tổn hại 20%- 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972) Trong khi ở Việt Nam thì tiêu có lượng xuất khẩu tiêu lớn nhất thế giới. Do đó, cây tiêu đóng một vai trò quan trọng trong nền kinh tế của đất nước. Nhưng hiện nay, có nhiều loại bệnh hại làm giảm năng suất của tiêu đó là bệnh sần rễ do tuyến trùng Meloidogyne gây ra. Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các loài vi nấm, vi khuẩn có hại xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn. Do đó, việc tìm hiểu và phòng trừ bệnh hại cho tiêu rất quan trọng.
Đồ án tốt nghiệp 27 Khi bị tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết. Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn cả những cây xanh tươi do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khoáng chất được. Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn: − Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu sáng. − Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinh dưỡng bị ảnh hưởng. Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn công gây nhiều bệnh khác cho cây. − Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không còn. Có 29 loài thuộc các họ khác nhau có mặt trên các vùng trồng tiêu của Việt Nam. Trong đó, chủ yếu và phổ biến nhất là chi Meloidogyne. (Trịnh Thị Thu Thủy và cộng sự, 2007). Hình 1.9. Vòng đời của tuyến trùng hại rễ (Nguồn: www.apsnet.org)
Đồ án tốt nghiệp 28 Tác động kinh tế: Meloidogyne spp. là một trong ba chi tuyến trùng ký sinh rễ gây thiệt hại nhất về cây trồng và sản lượng. Chúng có hiện diện ở tương đối nhiều nơi trên thế giới, và chúng ký sinh bắt buộc với rễ của hàng ngàn loài thực vật. Chi này gồm hơn 60 loài, trong đó một số loài lại có nhiều chủng khác nhau. Trong 60 loài thì có 4 loài gây hại chính trên thế giới đó là M. javanica, M. arenaria, M. incognita và M. hapla. Meloidogyne spp. hiện diện ở 23 trong tổng số 43 loài thực vật chính yếu, từ các cây lương thực, đồng cỏ, cây cảnh. Nếu tuyến trùng tấn công vào những cây lâu năm, có rễ ăn sâu vào đất thì việc kiểm soát sẽ rất khó khăn và bị hạn chế. Meloidogyne spp. được phát hiện đầu tiên ở cây sắn do Neal vào năm 1889. Rau màu được trồng ở những vùng có khí hậu ấm áp thường trải qua những mùa bị thiệt hại nghiêm trọng do tuyến trùng gây ra, và thường người ta dùng chất hóa học gọi là nematicide để ngăn chặn điều này. Rễ bị tuyến trùng ký sinh sẽ hấp thu nước và các khoáng chất yếu đi so với bình thường. Hậu quả bởi tuyến trùng gây ra cho thực vật là làm giảm sự tăng trưởng, chất lượng, năng suất của cây trồng, từ đó kéo theo sự suy giảm sức đề kháng của cây trồng với các yếu tố ngoại cảnh (như là: hạn hán, dịch bệnh,..) và tình huống xấu nhất là có thể sẽ mất trắng mùa màng. 1.3.3. Đánh giá khả năng ký sinh của chủng Paecilomyces spp. Kiểm soát sinh học được định nghĩa là các hoạt động kí sinh, ăn thịt hay gây bệnh trong việc duy trì mật độ sinh vật khác tại một số nơi thấp hơn trung bình (Bach, 1964). Tuy nhiên, kiểm soát sinh học là sự giảm mật độ quần thể tuyến trùng thông qua hoạt động của các sinh vật sống khác so với cây chủ có thể kháng lại tuyến trùng, xảy ra trong tự nhiên hay thông qua các thao tác môi trường (Stirling, 1991). Trước đây, việc kiểm soát tuyến trùng hại thực vật chủ yếu dựa vào các hóa chất diệt tuyến trùng, sức đề kháng của kí chủ thực vật và luân canh cây trồng. Mặc dù có nhiều thành công trong nghiên cứu kiểm soát tuyến trùng bằng phương pháp sinh học trong suốt 20 năm qua, đến nay nó vẫn ít được áp dụng. Hầu hết các sản
Đồ án tốt nghiệp 29 phẩm có chứa độc tố được ly trích từ vi sinh vật và chỉ một vài sản phẩm có chứa vi sinh vật hữu hiệu (Dong và Zhang, 2006). Dưới đây là một số nghiên cứu về hiệu quả phòng trừ tuyến trùng của nấm kí sinh trứng trong những năm 1991 - 1996: Bảng 1.1. Hiệu quả phòng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật. Nấm Tuyến trùng Hiệu quả phòng trừ của nấm đối với tuyến trùng hại thực vật Tác giả (năm) P.lilacinus M. javanica Giảm số lượng tuyến trùng gây hại dưa leo. Stephan et al. (1991) P.lilacinus M.incognita R.reniformis Giảm số lượng tuyến trùng gây hại dưa hấu. Vicente et al. (1991) P.lilacinus M.javanica Xử lý nấm có hiệu quả tốt cho sự phát triển của đậu bắp. Walia et al. (1991) P.lilacinus M.javanica Bón vào đất 2g/chậu trước khi chủng tuyến trùng cho hiệu quả tốt nhất. Zaki và Maqbool (1991) P.lilacinus M.incognita acrita Trộn vào hạt giống với liều trung bình và cao làm giảm đáng kể sự hư hại của bộ rễ. Khan et al. (1992)
Đồ án tốt nghiệp 30 P.marquandii Meloidogyne spp. Loài nấm này là một trong những sinh vật đất tự nhiên góp phần kiểm soát tuyến trùng. Marban- Mendoza và cs (1992) P.lilacinus M.incognitarace 3 Xử lý hạt đậu đũa bằng nấm cho hiệu quả diệt tuyến trùng tốt hơn so với xử lý bằng ascorbic acid. Siddiqui và Mahmood (1992a) P.lilacinus B. licheniforrnis M. incognitarace 3 P.lilacinus gây ra sự giảm mật độ tuyến trùng nhiều hơn so với B. licheniforrnis trên đậu đũa. Siddiqui và Mahmood (1992b) P.lilacinus M.incognita Có sự giảm số lượng nốt sần, khối trứng và mật độ tuyến trùng trong đất trồng nhiều loại thực vật khi xử lý với nấm. Pandey và Trivedi (1992) P. lilacinus M.incognita R.reniformis Khi phun chế phẩm lên gốc tiêu làm tăng số lượng và cân nặng chùm quả. Siddiqui và Mahmood (1993) P.lilacinus B.subtilis M.incognitarace 3 Xử lý nấm có hiệu quả hơn so với B.subtilis trong việc giảm số lượng Zaki (1994)
Đồ án tốt nghiệp 31 tuyến trùng trên đậu đũa. P.lilacinus M.javanica Liều lượng tốt nhất để kiểm soát tuyến trùng là 4 gam/kg đất. Walters và Barker (1994) P.lilacinus R.reniformis Nấm kiểm soát tuyến trùng hiệu quả cả trong điều kiện nhà lưới và đồng ruộng. Siddiqui và Mahmood (1995b) P. lilacinus P. chlamydosporia Heterodera cajani P. lilacinus kiểm soát tuyến trùng không hiệu quả bằng P. chlamydosporia trên pigeonpea. Siddiqui et al. (1996) P. chlamydosporia T. harzianum M. javanica P.lilacinus kết hợp với P. chlamydosporia và T. harzianum làm giảm mật độ tuyến trùng trên đậu đũa. Siddiqui et al. (1996) P. chlamydosporia T.harzianum Glomus mosseae H. cajani P.chlamydosporium kết hợp với T.harzianum và Glomus mosseae làm giảm tuyến trùng hiệu quả nhất nhất trên pigeonpea. Siddiqui và Mahmood (1996)
Đồ án tốt nghiệp 32 Theo R.P. Esser và N.E.El-Gol thì Paecilomyces spp. có khả năng gây ảnh hưởng và kí sinh trên con cái và trứng tuyến trùng. Nấm này cũng là tác nhân kiểm soát sinh học đáng kể theo nhiều khám phá trước đây vào năm 1979 và hiện nó đang được chú ý vì là " tác nhân kiểm soát sinh học có tiềm năng tuyệt vời trong đất nông nghiệp ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới". Loài Paecilomyces spp. ký sinh tuyến trùng sẽ tiếp cận với kí chủ thông qua một số con đường như: sợi nấm sẽ bám váo lớp vỏ keo của tuyến trùng hoặc thâm nhập thông qua phần hậu môn và cổ tử cung của tuyến trùng. Mặt khác, sợi nấm cũng có thể phân nhánh và bám vào bề mặt của trứng tuyến trùng. Theo một báo cáo gần đây của Gortari et al. (2008) thì Paecilomyces lilacinus là một loài vi nấm có khả năng ký sinh trứng của tuyến trùng trong điều kiện in vitro. Hai chủng ngoài tự nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 được phân lập từ đất trong tại công viên trung tâm của thành phố La Plata và trên một cánh đồng nông nghiệp ở Argentina cho thấy có khả năng ký sinh trên trứng của T. cannis. Theo kết quả thực nghiệm của tác giả thì tỷ lệ ký sinh trứng T. cannis của 2 chủng tuyến trùng nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 lần lượt là 65,6% và 63,2%. Đồng thời, theo Fransen (1990) và Lacey et al. (1996) vi nấm là tác nhân sinh học duy nhất ký sinh trên cơ thể bọ phấn trắng và một trong số đó có loài Paecilomyces spp. Khi một bào tử của Paecilomyces spp. nằm trong đất tìm thấy được kí chủ nhất định, nó sẽ tiết ra hệ enzyme để xuyên qua lớp da ngoài của côn trùng. Paecilomyces spp. cũng có thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua lỗ thở, hậu môn và cả đường miệng. Sau đó phát triển thành các ống mầm và hình thành nhiều sợi nấm, sợi nấm có thể lây lan trong lớp dịch giữa các tế bào hay các mô rồi bao phủ cả bên trong và bên ngoài cơ thể côn trùng rồi sinh ra bào tử. Theo nhiều nghiên cứu thì đa phần sự tử vong của côn trùng là do sự cạn kiệt chất dinh dưỡng, phá hoại các mô và các độc tố mà vi nấm tạo ra trong cơ thể côn trùng.
Đồ án tốt nghiệp 33 Theo nghiên cứu của Ayhan GOKCE và M. Kubilay ER (2004), Paecilomyces fumoroseus có khả năng ký sinh với giai đoạn nhộng của bọ phấn và tỷ lệ ký sinh lên đến hơn 70% sau 6 ngày gây nhiễm. Còn theo Claire Vidal et al. (1998), điều kiện thích hợp cho sự xâm nhiễm của Paecilomyces fumosoroseus với ký chủ tối ưu ở điều kiện nhiệt độ từ 22-330 C và độ ẩm từ 68% - 100% ( với tỷ lệ ký sinh là trên 70% sau một tuần gây nhiễm).
Đồ án tốt nghiệp 34 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ ngày 7/4 đến ngày 13/7 tại phòng thí nghiệm trường Đại Học Công Nghệ TPHCM. 2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Thiết bị - hóa chất 2.2.1.1 Thiết bị − Nồi hấp khử trùng − Que cấy điểm − Đèn cồn − Ống nghiệm − Kính hiển vi quang học − Dao cấy − Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm − Đĩa petri − Micropipet − Erlen 2.2.1.2 Hóa chất − Dịch TCA 5% − Lugol − Tween 80 − Cồn 960 , 700 − Methylene blue − Lactocotton phenol blue − MgSO4.7H2O − K2HPO4 − KNO3 − NaCl
Đồ án tốt nghiệp 35 − FeSO4.7H2O − Glucose − Pepton − NaNO3 − KCl − CaCl2 2.2.2. Vật liệu − Mẫu nấm được phân lập từ chế phẩm sinh học được người dân bón vào đất. − Mẫu bọ phấn thu được từ vườn của nhà dân quận Bình Tân. − Tuyến trùng cái từ Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM 2.2.3. Các môi trường sử dụng 2.2.3.1 Môi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar) D-glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Cách chuẩn bị dịch chiết khoai tây: Cân 200 g khoai tây đã được gọt vỏ, sau đó thái nhỏ thành hình vuông. Đong vào cốc thủy tinh 1 lít nước cất, thêm khoai tây đã thái ở trên vào đun sôi trong 20 phút. Để nguội, dùng bông thấm nước lọc phần dịch, gạn bỏ phần xác khoai tây thu được dịch chiết khoai tây. Sau đó đem bảo quản lạnh ở 40 C. 2.2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương, 2000 -2001) Cơ chất: 1 % MgSO4.7H2O 3 g/l K2HPO4 3 g/l KNO3 1 g/l NaCl 0,5 g/l FeSO4.7H2O 0,01 g/l Agar 15 g
Đồ án tốt nghiệp 36 Chloramphenicol 0,1 g/l 2.2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất Glucose 40 g/l Pepton 15 g/l KH2PO4 1 g/l MgSO4.7H2O 1 g/l Agar 20 g/l 2.2.3.4 Môi trường Czapeck - Dox Glucose 1 % NaNO3 3,5 g/l K2HPO4 1,5 g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/l KCl 0,5 g/l FeSO4.7H2O 0,01 g/l Agar 20 g/l 2.2.3.5 Môi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Chuẩn bị dịch chiết malt: Lấy 250g malt nghiền nhỏ, hòa vào 1 lít nước cất. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều và gia nhiệt từ từ, có khuấy, đến 45 - 500 C, giữ ở nhiệt độ này 30 phút. Sau đó, nâng nhiệt độ lên 65 - 680 C, có khuấy, giữ ở nhiệt độ này cho đến khi quá trình đường hóa xảy ra hoàn toàn (kết quả là không thấy màu xanh xuất hiện khi thử dịch cháo với dung dịch lugol). Lọc tách bã qua vải thô hoặc bông thấm nước, đem hấp phần dịch trong 1210 C, 30 phút, lấy ra để lắng. Lọc tách hết tủa lần nữa, pha loãng để dịch có hàm lượng chất khô hòa tan khoảng 6 - 8 độ Brix. Thêm 2% agar vào dịch chiết malt, đun khuấy đều cho đến khi agar tan hết. Phối môi trường vào các dụng cụ chứa, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210 C, 15 phút.
Đồ án tốt nghiệp 37 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. 2.3.1.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ chế phẩm Thực hiện: Cân 1 gam chế phẩm rồi đổ vào erlen có chứa 100ml nước cất vô trùng và 1% đường glucose. Tiến hành tăng sinh chế phẩm trong máy lắc, 150 vòng/phút trong 24 giờ. Sau khi lắc tăng sinh, dùng micropipet 1000µl và đầu típ đã khử trùng hút 1ml dịch chế phẩm cho vào các ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng đã được chuẩn bị để pha loãng ra thành các nồng độ khác nhau 10-1 , 10-2 , 10-3 , 10-4 , 10-5 ... Tiến hành trang đĩa bằng cách hút 0,1ml dịch pha loãng cho vào đĩa petri có chứa môi trường PDA (G. Gayathri, 2010). Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Dùng que cấy trang bằng thủy tinh để trang đến khi khô dịch chế phẩm. Hình 2.1. Chế phẩm xử lý đất 2.3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ bọ phấn trắng Thực hiện: Thu bọ phấn trắng trên đồng và đem về nuôi trên lá chuối, cuống lá được quấn bằng bông hút ẩm để giữ lá tươi, không bị héo. Hằng ngày quan sát và thu bọ phấn bị chết. Các cá thể bọ phấn bị chết được cho vào đĩa petri có đặt giấy hút ẩm. Tiến hành thu thập cá thể bị chết và được bao bọc bởi sợi nấm màu trắng. Sau đó tiến hành phân lập nấm ký sinh trên môi trường PDA theo phương pháp của Lawrence (1997).
Đồ án tốt nghiệp 38 Hình 2.2. Các lọ thủy tinh dùng để bố trí thí nghiệm 2.3.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của Peacilomyces spp. Các dòng vi nấm có khả năng ký sinh tuyến trùng và bọ phấn trắng đều nhờ hoạt động của các enzyme ngoại bào như: chitinase và protease. Do vậy, để đảm bảo chủng nấm Paecilomyces có khả năng ký sinh với tuyến trùng phải tiến hành định tính hệ enzyme chitinase, protase trên môi trường cảm ứng. 2.3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme chitinase Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung chitin 1% làm chất cảm ứng, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn là N-acetyl- D-glucosamine. Các dạng đơn phân này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol. Do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt bao quanh nấmphản ảnh khả năng sinh tổng hợp chitinase. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase, hấp khử trùng ở 1210 C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 1210 C trong 15 phút, cho môi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ Lugol đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm. 2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme protease Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung casein 1% , nấm sợi sẽ sinh enzyme protease phân giải casein thành các amino acid. Các dạng
Đồ án tốt nghiệp 39 amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 5%, chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 5%. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease, hấp khử trùng ở 1210 C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 1210 C trong 15 phút, cho môi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho thuốc thử TCA 5% vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ thuốc thử đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm. 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của của nấm 2.3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces Nguyên tắc: Tùy thuộc vào pH khác nhau mà sự tăng trưởng của nấm cũng thay đổi. Sự thay đổi của pH tức là sự thay đổi của ion H+ có trong môi trường sẽ làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, điều này làm ảnh hưởng khả năng thẩm thấu của tế bào vi sinh đối với những ion nhất định; làm thay đổi trạng thái điện ly các phân tử của chất dinh dưỡng, từ đó làm giảm khả năng sử dụng dinh dưỡng của vi sinh vật. Bên cạnh đó, pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme có mặt trên thành tế bào. Điều này, quyết định đến sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường.Paecilomyces spp. thường được phân lập từ đất hay côn trùng nên pH thường là pH hơi acid. Tiến hành khảo sát ở các pH: 5, 6, 7, 8 công thức cụ thể như sau: Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: pH 5 Công thức 2: pH 6 Công thức 3: pH 7 Công thức 4: pH 8 Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA. Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa.
Đồ án tốt nghiệp 40 Thực hiện: Môi trường được khử trùng ở 1210 C trong 15 phút, sau đó đổ môi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm có đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250 C ± 20 C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi: − Đường kính tản nấm (cm): 2 ngày/lần ngày đo sự phát triển của nấm bằng cách lấy trung bình đường kính trên hai trục của khuẩn lạc theo công thức: d = (d1+ d2)/2 Trong đó: d1, d2 là độ dài hai đường chéo phần khuẩn lạc phân bố Thời gian theo dõi: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ngày sau khi cấy. − Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): trung bình của 3 lần đo đường kính nấm từ 6 - 8; 8 - 10; 10 - 12 ngày sau nuôi cấy. Sau đó so sánh và nhận xét ở giá trị pH nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt hơn cả. 2.3.3.2. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các môi trường khác nhau Nguyên tắc: Trong quá trình phát triển nấm cần nhiều chất dinh dưỡng. Tùy vào từng môi trường nuôi cấy khác nhau mà nấm sẽ có tốc độ sinh trưởng khác nhau, do đó tiến hành khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các môi trường: PDA, Malt agar, Czapeck – dox agar, Sabouraud agar. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: môi trường PDA Công thức 2: môi trường Malt agar Công thức 3: môi trường Czapeck - Dox Công thức 4: môi trường Sabouraud agar Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA, Malt agar, Czapeck – dox agar, Sabouraud agar với 3 lần lặp lại cho mỗi môi trường. Môi trường được khử trùng ở 1210 C trong 15 phút, sau đó đổ môi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm có đường
Đồ án tốt nghiệp 41 kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250 C ± 20 C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi được thực hiện tương tự như mục 2.3.3.1. Sau đó so sánh và nhận xét ở môi trường nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt hơn cả. 2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. Nguyên tắc: Thực hiện theo phương pháp Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết (2006). Mỗi loài Paecilomyces spp. khác nhau thì sống ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau. Do vậy, tiến hành khảo sát chế độ chiếu sáng: 12 giờ sáng/12 giờ tối và tối liên tục và theo dõi, đánh giá sự phát triển của nấm. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: điều kiện 12h sáng/12h tối Công thức 2: điều kiện tối liên tục Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA với 3 lần lặp lại cho mỗi điều kiện chiếu sáng - Môi trường được khử trùng ở 1210 C trong 15 phút, sau đó đổ môi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm có đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250 C ± 20 C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi thực hiện tương tự mục 2.2.3.1. Sau đó so sánh và nhận xét ở điều kiện chiếu sáng nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt hơn cả. 2.3.4. Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2. Thực hiện: Theo phương pháp của Ayhan GÖKÇE và M. Kubilay ER. (2004), các cá thể bọ phấn trắng trưởng thành nằm trên lá thu thập được ngoài tự nhiên được bỏ vào 6 hộp thủy tinh có nắp đậy bằng lưới. Sau đó, hút 1ml phân NPK vào bông thấm nước quấn trên cuống lá giúp lá tươi lâu hơn. Tiến hành phun 10ml
Đồ án tốt nghiệp 42 dịch huyền phù bào tử nấm có nồng độ 108 vào các hộp đã chuẩn bị. Mẫu đối chứng được phun bằng nước cất. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: Mỗi lọ thủy tinh cho vào 30 cá thể bọ phấn và phun 10ml dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces có nồng độ 108 vào. Công thức 2: Mỗi lọ thủy tinh cho vào 30 cá thể bọ phấn và phun 10ml nước cất vào. Mỗi công thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 lọ thủy tinh. 2.3.5. Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. Thực hiện: Dùng micropipet hút môi trường PDA đã khử trùng vào đĩa petri. Sau đó, cấy nấm Paecilomyces spp. vào môi trường đã hút. 3 ngày sau khi cấy, cho 5 tuyến trùng vào xung quanh mép tản nấm đã cấy. Sau đó quan sát qua các ngày để theo dõi sự ký sinh của Paecilomyces spp. đến tuyến trùng. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: Mẫu đối chứng không cấy nấm sau 3 ngày cho tuyến trùng vào. Công thức 2: Mẫu thí nghiệm có cấy nấm sau sau 3 ngày cho tuyến trùng vào. Mỗi công thức lặp lại 2 lần, mỗi lần 1 đĩa. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Dùng phần mềm Statgraphic và Excel 2007 để xử lý số liệu có được. Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong Statgraphis theo trình tự: - Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu - So sánh các tham số đặc trưng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu. Phép phân tích phương sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 95%.
Đồ án tốt nghiệp 43 - Hiệu lực phòng trừ của nấm Paecilomyces được tính theo công thức Abbot (1925): Ca- Ta M (%) = --------------- x 100 Ca Trong đó: Ca là số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm Ta là số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau thí nghiệm
Đồ án tốt nghiệp 44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập nấm 3.1.1. Phân lập nấm có nguồn gốc từ chế phẩm xử lý đất Việc phân lập nấm Paecilomyces từ trong chế phẩm được tiến hành ở các nồng độ pha loãng khác nhau 10-1 , 10-2 , 10-3 , 10-4 . Kết quả cho thấy, có sự xuất hiện của chủng nấm Paecilomyces trong chế phẩm xử lý đất. Cụ thể, khi pha loãng và cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường PDA, sau 3 ngày nuôi cấy, trên đĩa xuất hiện các tản nấm ban đầu có màu trắng, xốp sau chuyển dần sang màu tím nhạt rồi tới tím đậm. Đặc điểm này trùng với mô tả của Bùi Xuân Đồng và cộng sự (2002) nên được tạm gọi là Paecilomyces sp1. Tuy nhiên, để khẳng định, cần phải có sự theo dõi về các đặc điểm đại thể, vi thể và một số chỉ tiêu sinh hóa của chủng nấm phân lâp được. Hình 3.1. Dịch chế phẩm được trang ra đĩa PDA ở nồng độ pha loãng 10-4 vào ngày thứ 3.
Đồ án tốt nghiệp 45 3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces sp2. Từ những cá thể bọ phấn trắng nghi ngờ bị chết do nhiễm nấm Paecilomyces, sinh viên đã tiến hành phân lập và cho những kết quả sau: Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA đã xuất hiện tản nấm có màu trắng xốp sang màu hồng rồi màu hồng tím. Đặc điểm đại thể này theo mô tả của Bùi Xuân Đồng và cộng sự (2002) là chi Paecilomyces. Vì thế, sinh viên tạm gọi chủng nấm này là Paecilomyces sp2. Hình 3.2. Nấm nghi ngờ mọc lên từ bọ phấn trên môi trường PDA.
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được
Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được

Recommended

Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Phân lập các chủng nấm trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở đồng nai và đánh giá...
Phân lập các chủng nấm trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở đồng nai và đánh giá...Phân lập các chủng nấm trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở đồng nai và đánh giá...
Phân lập các chủng nấm trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở đồng nai và đánh giá...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Trichoderma Hazianum Và Ứng Dụng Chế Phẩm Tron...
Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Trichoderma Hazianum Và Ứng Dụng Chế Phẩm Tron...Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Trichoderma Hazianum Và Ứng Dụng Chế Phẩm Tron...
Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Trichoderma Hazianum Và Ứng Dụng Chế Phẩm Tron...nataliej4
 
Phân lập các chủng trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đố...
Phân lập các chủng trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đố...Phân lập các chủng trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đố...
Phân lập các chủng trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đố...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát khả năng đối kháng của nấm trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ...
Khảo sát khả năng đối kháng của nấm trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ...Khảo sát khả năng đối kháng của nấm trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ...
Khảo sát khả năng đối kháng của nấm trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYĐề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 

Recommended

Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Phân lập các chủng nấm trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở đồng nai và đánh giá...
Phân lập các chủng nấm trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở đồng nai và đánh giá...Phân lập các chủng nấm trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở đồng nai và đánh giá...
Phân lập các chủng nấm trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở đồng nai và đánh giá...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Trichoderma Hazianum Và Ứng Dụng Chế Phẩm Tron...
Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Trichoderma Hazianum Và Ứng Dụng Chế Phẩm Tron...Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Trichoderma Hazianum Và Ứng Dụng Chế Phẩm Tron...
Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Trichoderma Hazianum Và Ứng Dụng Chế Phẩm Tron...nataliej4
 
Phân lập các chủng trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đố...
Phân lập các chủng trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đố...Phân lập các chủng trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đố...
Phân lập các chủng trichoderma spp. từ đất vườn cacao và đánh giá khả năng đố...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát khả năng đối kháng của nấm trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ...
Khảo sát khả năng đối kháng của nấm trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ...Khảo sát khả năng đối kháng của nấm trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ...
Khảo sát khả năng đối kháng của nấm trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYĐề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...
Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...
Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...PinkHandmade
 
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưaQuy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...
Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...
Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...nataliej4
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini, HOT
Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini, HOTĐặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini, HOT
Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini, HOTDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
BÀI MẪU Khóa luận tốt nghiệp ngành dược, HAY, 9 ĐIỂM
BÀI MẪU Khóa luận tốt nghiệp ngành dược, HAY, 9 ĐIỂMBÀI MẪU Khóa luận tốt nghiệp ngành dược, HAY, 9 ĐIỂM
BÀI MẪU Khóa luận tốt nghiệp ngành dược, HAY, 9 ĐIỂMViết Thuê Khóa Luận _ ZALO 0917.193.864 default
 
Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạc
Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạcNghiên cứu chế tạo hạt nano bạc
Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạcwww. mientayvn.com
 
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Quocphong Nguyen
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
TỔNG QUAN VỀ NẤM
TỔNG QUAN VỀ NẤMTỔNG QUAN VỀ NẤM
TỔNG QUAN VỀ NẤMTruongThanh Vu
 
tài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xám
tài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xámtài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xám
tài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xámTrang Trại Nấm CNV
 
trichoderma
trichodermatrichoderma
trichodermapjgeon1990
 
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xám
Khảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xámKhảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xám
Khảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xámTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin
Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectinĐề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin
Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectinDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 

More Related Content

What's hot

Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...
Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...
Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...PinkHandmade
 
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưaQuy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...
Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...
Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...nataliej4
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạc
Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạcNghiên cứu chế tạo hạt nano bạc
Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạcwww. mientayvn.com
 
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Quocphong Nguyen
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
TỔNG QUAN VỀ NẤM
TỔNG QUAN VỀ NẤMTỔNG QUAN VỀ NẤM
TỔNG QUAN VỀ NẤMTruongThanh Vu
 
tài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xám
tài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xámtài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xám
tài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xámTrang Trại Nấm CNV
 
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xám
Khảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xámKhảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xám
Khảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xámTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

What's hot (20)

Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
 
Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...
Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...
Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._0831571...
 
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưaQuy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
 
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệ...
 
Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...
Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...
Khảo Sát Sự Sinh Trưởng Và Phát Triển Của Nấm Bào Ngư Pleurotus Sajor - Caju ...
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩ...
 
Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini, HOT
Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini, HOTĐặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini, HOT
Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini, HOT
 
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
 
BÀI MẪU Khóa luận tốt nghiệp ngành dược, HAY, 9 ĐIỂM
BÀI MẪU Khóa luận tốt nghiệp ngành dược, HAY, 9 ĐIỂMBÀI MẪU Khóa luận tốt nghiệp ngành dược, HAY, 9 ĐIỂM
BÀI MẪU Khóa luận tốt nghiệp ngành dược, HAY, 9 ĐIỂM
 
Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạc
Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạcNghiên cứu chế tạo hạt nano bạc
Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạc
 
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
 
TỔNG QUAN VỀ NẤM
TỔNG QUAN VỀ NẤMTỔNG QUAN VỀ NẤM
TỔNG QUAN VỀ NẤM
 
tài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xám
tài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xámtài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xám
tài liệu kỹ thuật trồng nấm bào ngư xám
 
trichoderma
trichodermatrichoderma
trichoderma
 
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
 
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
 
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu titan dioxit có hoạt tính xúc tá...
 
Khảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xám
Khảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xámKhảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xám
Khảo sát tỉ lệ mạt cưa cao su và lục bình làm cơ chất trồng nấm bào ngư xám
 

Similar to Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được

Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Phân lập, định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay t...
Phân lập, định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay t...Phân lập, định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay t...
Phân lập, định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay t...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinnis)
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinnis)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinnis)
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinnis)TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong...
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong...Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong...
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)
Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)
Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen...
địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen...địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen...
địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) in vi...
Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) in vi...Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) in vi...
Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) in vi...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo câ...
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo câ...Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo câ...
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo câ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
LUẬN VĂN THẠC SĨ: PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT...
LUẬN VĂN THẠC SĨ: PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT...LUẬN VĂN THẠC SĨ: PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT...
LUẬN VĂN THẠC SĨ: PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT...ssuserc1c2711
 
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxinPhân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxinTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cá
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cáPhân lập bacillus subtilis từ ruột cá
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cáTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò (fasciolosis) ở tỉnh thá...
Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò (fasciolosis) ở tỉnh thá...Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò (fasciolosis) ở tỉnh thá...
Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò (fasciolosis) ở tỉnh thá...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Thu nhận sophorolipid tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glu...
Thu nhận sophorolipid tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glu...Thu nhận sophorolipid tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glu...
Thu nhận sophorolipid tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glu...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát tình hình nhiễm một số virus gây bệnh thường gặp tại bệnh viện trung...
Khảo sát tình hình nhiễm một số virus gây bệnh thường gặp tại bệnh viện trung...Khảo sát tình hình nhiễm một số virus gây bệnh thường gặp tại bệnh viện trung...
Khảo sát tình hình nhiễm một số virus gây bệnh thường gặp tại bệnh viện trung...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....https://www.facebook.com/garmentspace
 

Similar to Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được (20)

Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
 
Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin
Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectinĐề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin
Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin
 
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
 
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
 
Phân lập, định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay t...
Phân lập, định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay t...Phân lập, định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay t...
Phân lập, định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay t...
 
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinnis)
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinnis)Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinnis)
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinnis)
 
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...
 
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong...
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong...Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong...
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong...
 
Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)
Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)
Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)
 
địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen...
địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen...địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen...
địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen...
 
Đề tài: Định danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa ...
Đề tài: Định danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa ...Đề tài: Định danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa ...
Đề tài: Định danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa ...
 
Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) in vi...
Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) in vi...Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) in vi...
Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) in vi...
 
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo câ...
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo câ...Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo câ...
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi và tạo câ...
 
LUẬN VĂN THẠC SĨ: PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT...
LUẬN VĂN THẠC SĨ: PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT...LUẬN VĂN THẠC SĨ: PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT...
LUẬN VĂN THẠC SĨ: PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT...
 
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxinPhân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin
 
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cá
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cáPhân lập bacillus subtilis từ ruột cá
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cá
 
Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò (fasciolosis) ở tỉnh thá...
Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò (fasciolosis) ở tỉnh thá...Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò (fasciolosis) ở tỉnh thá...
Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan trâu, bò (fasciolosis) ở tỉnh thá...
 
Thu nhận sophorolipid tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glu...
Thu nhận sophorolipid tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glu...Thu nhận sophorolipid tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glu...
Thu nhận sophorolipid tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glu...
 
Khảo sát tình hình nhiễm một số virus gây bệnh thường gặp tại bệnh viện trung...
Khảo sát tình hình nhiễm một số virus gây bệnh thường gặp tại bệnh viện trung...Khảo sát tình hình nhiễm một số virus gây bệnh thường gặp tại bệnh viện trung...
Khảo sát tình hình nhiễm một số virus gây bệnh thường gặp tại bệnh viện trung...
 
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
 

More from https://www.facebook.com/garmentspace

Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfKhóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.docĐề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.dochttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...https://www.facebook.com/garmentspace
 

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
 
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfKhóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
 
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.docĐề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
 
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
 

Recently uploaded

Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Đề cương môn giải phẫu......................
Đề cương môn giải phẫu......................Đề cương môn giải phẫu......................
Đề cương môn giải phẫu......................TrnHoa46
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfChuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfhoangtuansinh1
 
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdfCampbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdfTrnHoa46
 
chuong-7-van-de-gia-dinh-trong-thoi-ky-qua-do-len-cnxh.pdf
chuong-7-van-de-gia-dinh-trong-thoi-ky-qua-do-len-cnxh.pdfchuong-7-van-de-gia-dinh-trong-thoi-ky-qua-do-len-cnxh.pdf
chuong-7-van-de-gia-dinh-trong-thoi-ky-qua-do-len-cnxh.pdfVyTng986513
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhvanhathvc
 
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
sách sinh học đại cương - Textbook.pdf
sách sinh học đại cương - Textbook.pdfsách sinh học đại cương - Textbook.pdf
sách sinh học đại cương - Textbook.pdfTrnHoa46
 
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...hoangtuansinh1
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...ThunTrn734461
 
SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...
SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...
SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...Nguyen Thanh Tu Collection
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoáCác điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoámyvh40253
 

Recently uploaded (20)

Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
 
Đề cương môn giải phẫu......................
Đề cương môn giải phẫu......................Đề cương môn giải phẫu......................
Đề cương môn giải phẫu......................
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
1 - MÃ LỖI SỬA CHỮA BOARD MẠCH BẾP TỪ.pdf
1 - MÃ LỖI SỬA CHỮA BOARD MẠCH BẾP TỪ.pdf1 - MÃ LỖI SỬA CHỮA BOARD MẠCH BẾP TỪ.pdf
1 - MÃ LỖI SỬA CHỮA BOARD MẠCH BẾP TỪ.pdf
 
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfChuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
 
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdfCampbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
Campbell _2011_ - Sinh học - Tế bào - Ref.pdf
 
chuong-7-van-de-gia-dinh-trong-thoi-ky-qua-do-len-cnxh.pdf
chuong-7-van-de-gia-dinh-trong-thoi-ky-qua-do-len-cnxh.pdfchuong-7-van-de-gia-dinh-trong-thoi-ky-qua-do-len-cnxh.pdf
chuong-7-van-de-gia-dinh-trong-thoi-ky-qua-do-len-cnxh.pdf
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
 
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
sách sinh học đại cương - Textbook.pdf
sách sinh học đại cương - Textbook.pdfsách sinh học đại cương - Textbook.pdf
sách sinh học đại cương - Textbook.pdf
 
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
 
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
 
SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...
SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...
SÁNG KIẾN ÁP DỤNG CLT (COMMUNICATIVE LANGUAGE TEACHING) VÀO QUÁ TRÌNH DẠY - H...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoáCác điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
Các điều kiện bảo hiểm trong bảo hiểm hàng hoá
 

Phân lập nấm paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được

  • 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Paecilomyces spp VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ BỌ PHẤN TRẮNG, TUYẾN TRÙNG CỦA CÁC CHỦNG THU NHẬN ĐƯỢC Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Phùng Lê Kim Yến MSSV: 1051110195 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 7/2014
  • 2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Phùng Lê Kim Yến
  • 3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Lời cám ơn đầu tiên em xin chân thành gửi đến tập thể Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Hai người đã tận tình dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ, hướng dẫn em có những hiểu biết nhiều hơn về kiến thức chuyên ngành để em có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Em xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người đã nhiệt tình hỗ trợ về thiết bị, vật tư giúp đỡ em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Em xin cám ơn anh Ngô Văn Bình đã tạo điều kiện, giúp đỡ em có thể thực hiện các thí nghiệm để hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Em cũng cám ơn các bạn ở phòng thí nghiệm và đặc biệt là những người bạn trong nhóm ESS đã động viên, giúp đỡ tôi. Và lời cám ơn chân thành, sâu sắc nhất con xin dành cho Ba Mẹ, người đã theo dõi, ủng hộ và nuôi con khôn lớn đến ngày hôm nay. Cám ơn gia đình đã luôn chia sẻ và tạo mọi điều kiện để con hoàn thành từng chặng đường học vấn của mình.
  • 4. Đồ án tốt nghiệp i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH LỜI MỞ ĐẦU..........................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................3 1. 1. Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp.........................................3 1.1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces ............................................3 1.1.1.1 Phân loại khoa học............................................................................3 1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái.............................................................................3 1.1.1.3. Đặc điểm hình thái ...........................................................................4 1.1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp....................................................6 1.1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp đối với ký chủ.................................................................................................................7 1.1.2. Các chủng nấm Paecilomyces spp. đã được phân lập ...........................11 1.1.3. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống .........................................................................................................................13 1.1.3.1. Sản xuất enzyme..............................................................................13 1.1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp........................................14 1.1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật .......................................................15 1.1.3.4. Xứ lý môi trường ............................................................................15 1.1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp................................................16 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp......17 1.3. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phòng trừ bọ phấn và tuyến trùng gây hại.......................................................................................20 1.3.1. Tổng quan về bọ phấn trắng ................................................................20 1.3.1.1. Phân loại khoa học.........................................................................20 1.3.1.2. Đặc điểm sinh thái..........................................................................21 1.3.1.3. Đặc điểm hình thái .........................................................................22 1.3.1.4. Tổng quan về bệnh vàng lá do bọ phấn trắng gây ra.......................23 1.3.2. Tổng quan về tuyến trùng ....................................................................24 1.3.2.1. Phân loại khoa học.........................................................................25 1.3.2.2. Đặc điểm sinh thái..........................................................................25
  • 5. Đồ án tốt nghiệp ii 1.3.2.3. Tổng quan về bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra............................26 1.3.3. Đánh giá khả năng ký sinh của chủng Paecilomyces spp ..................28 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................34 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................34 2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu ...................................................34 2.2.1 Thiết bị - hóa chất..................................................................................34 2.2.1.1 Thiết bị.............................................................................................34 2.2.1.2 Hóa chất ..........................................................................................34 2.2.2. Vật liệu..................................................................................................35 2.2.3. Các môi trường sử dụng.......................................................................35 2.2.3.1 Môi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar) ......35 2.2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất ......................................................................................35 2.2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất............................................36 2.2.3.4 Môi trường Czapeck - Dox ..............................................................36 2.2.3.5 Môi trường Malt agar......................................................................36 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................37 2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp..........................................................37 2.3.1.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ chế phẩm ..............................37 2.3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ bọ phấn trắng.......................37 2.3.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của Peacilomyces spp.....38 2.3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme chitinase...............................................38 2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme protease ...............................................38 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của của nấm ..........................................................................................................39 2.3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces.........39 2.3.3.2. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các môi trường khác nhau ........................................................................................40 2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp ........................................................................................41 2.3.4. Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2...................................................................................................................41 2.3.5. Đánh giá khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp. .........................................................................................................................42 2.4. Phương pháp xử lý số liệu..........................................................................42
  • 6. Đồ án tốt nghiệp iii CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................44 3.1. Phân lập nấm ..............................................................................................44 3.1.1. Phân lập nấm có nguồn gốc từ chế phẩm xử lý đất ............................44 3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces sp2. .........................................................45 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Paecilomyces phân lập được ...46 3.3. Định tính hệ enzyme ngoại bào có khả năng đối kháng tuyến trùng và bọ phấn...............................................................................................................50 3.3.1. Khả năng tổng hợp enzyme protease của 2 chủng nấm Paecilomyces50 3.3.2. Khả năng tổng hợp enzyme chitinase của 2 chủng nấm Paecilomyces sp1. và sp2.......................................................................................................52 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sự phát triển của nấm.54 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển nấm của chủng nấm Paecilomyces spp ............................................................................................54 3.4.1.1. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1. ..54 3.4.1.2. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2. ..56 3.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp ............................................................58 3.4.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1..........................................................................58 3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2..........................................................................61 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm .........................................................................................................................64 3.4.3.1. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp1.........................................................................................64 3.4.3.2. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp2.........................................................................................66 3.5. Khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2...........68 3.6. Khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp của 2 chủng nấm Paecilomyces ..............................................................................................70 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................72 4.1. Kết luận.......................................................................................................72 4.2. Đề nghị.........................................................................................................72 TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................73
  • 7. Đồ án tốt nghiệp iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato D - Glucose Agar SB: Sabouraud + KC MA: Malt CZA: Czapeck - Dox
  • 8. Đồ án tốt nghiệp v DANH MỤC CÁC BẢNG STT BẢNG NỘI DUNG TRANG 1 1.1 Hiệu quả phòng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật. 29 - 31 2 3.1 So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp1. 45 - 46 3 3.2 So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp2. 47 - 48 4 3.3 Kết quả sinh tổng hợp enzyme protease của 2 chủng nấm Paecilomyces sp1. và sp2. 49 5 3.4 Kết quả sinh tổng hợp enzyme chitinase của 2 chủng nấm Paecilomycessp1. và sp2. 51 6 3.5 Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm Paecilomyces sp1. qua các ngày 54 7 3.6 Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm Paecilomyces sp2. qua các ngày 56 8 3.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển đường kính nấm Paecilomyces sp1. qua các ngày. 58 9 3.8 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển đường kính nấm Paecilomyces sp2. qua các ngày. 61 10 3.9 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển đường kính của Paecilomyces sp1. 63 11 3.10 Số liệu sự phát triển của nấm dưới các điều kiện 66
  • 9. Đồ án tốt nghiệp vi chiếu sáng qua các ngày nuôi cấy. 12 3.11 Hiệu lực diệt bọ phấn 67 13 3.12 Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng của 2 chủng Paecilomycessp1. và sp2. 69 DANH MỤC CÁC HÌNH STT HÌNH NỘI DUNG TRANG 1 1.1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. 5 2 1.2 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. 6 3 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin 7 4 1.4 Bio Nematon - Sản phẩm của công ty T.Stanes có khả năng trừ tuyến trùng 16 5 1.5 Sản phẩm trừ bọ phấn 17 6 1.6 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự phát triển của tản nấm Paecilomyces 19 7 1.7 Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng 21 8 1.8 Đặc điểm tuyến trùng hại rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học ×10 25
  • 10. Đồ án tốt nghiệp vii 9 1.9 Vòng đời của tuyến trùng hại rễ 27 10 2.1 Chế phẩm xử lý đất 37 11 2.2 Các lọ thủy tinh dùng để bố trí thí nghiệm 38 12 3.1 Dịch chế phẩm được trang ra đĩa PDA ở nồng độpha loãng 10-4 vào ngày thứ 3. 43 13 3.2 Nấm nghi ngờ mọc lên từ bọ phấn trên môi trường PDA. 44 14 3.3 Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp1. 50 15 3.4 Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp2. 50 16 3.5 Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp1. 52 17 3.6 Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp2. 52 18 3.7 Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên môi trường có pH khác nhau ở 14 ngày nuôi cấy. 53 19 3.8 Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp1. ở các pH môi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuôi cấy 54 20 3.9 Nấm Paecilomyces sp2. ở pH 5,6,7,8 14 ngày sau cấy 55 21 3.10 Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp2. ở các pH môi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuôi cấy 56
  • 11. Đồ án tốt nghiệp viii 22 3.11 Nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau khi cấy 57 23 3.12 Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên các môi trường khác nhau qua các ngày. 59 24 3.13 Nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau khi cấy 60 25 3.14 Sự phát triển của Paecilomyces sp2. trên các môi trường khác nhau qua các ngày. 62 26 3.15 Tản nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy 63 27 3.16 Sự phát triển của Paecilomyces sp1. ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau 64 28 3.17 Tản nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy 65 29 3.18 Sự phát triển của Paecilomyces sp2. ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau 66 30 3.19 Mẫu bọ phấn không bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học 68 31 3.20 Mẫu tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi quang học 69 32 3.21 Tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi sau khi bị gây nhiễm bởi nấm Paecilomyces sp2. 70
  • 12. Đồ án tốt nghiệp 1
  • 13. Đồ án tốt nghiệp 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam là đất nước của nền nông nghiệp và nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên thích hợp cho nhiều mầm bệnh sinh sôi nảy nở. Trong số đó có bệnh héo lá do bọ phấn trắng và bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra. Hai mầm bệnh ấy đang mang lại những tổn thất nặng nề về sản lượng nông nghiệp hiện nay. Vì vậy, việc tìm ra giải pháp để kiểm soát hai tác nhân gây bệnh này rất quan trọng. Đa số người nông dân hiện nay thường dùng các loại thuốc hóa học để phòng trừ các loài gây hại này. Tuy nhiên, thuốc hóa học không những để lại tồn lưu cao trong nông san3anh3 hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, đến môi trường sống mà còn tăng tính kháng thuốc của sâu hại, làm cho việc phòng trừ ngay càng khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay người ta đang tìm kiếm các tác nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần hoặc hoàn toàn thuốc hóa học trong quản lý các loài sâu bệnh và tuyến trùng gây hại. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Úc, Brasil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh côn trùng, tuyến trùng trong phòng trừ các loài gây hại đã mang lại hiệu quả cao (Burges H. D., 1998; Butt T. M and Copping L., 2000). Trong đó, Paecilomyces là một trong những loài nấm tiềm năng đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài này vẫn còn khá hạn chế. Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên quyết định chọn nghiên cứu đề tài: "Phân lập nấm Paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được". 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập được các chủng Paecilomyces spp. và bước đầu đánh giá khả năng ký sinh của các chủng Paecilomyces spp. phân lập được trên bọ phấn trắng, tuyến trùng nhằm phòng trừ bệnh hại thực vật.
  • 14. Đồ án tốt nghiệp 2 3. Nội dung nghiên cứu − Phân lập các chủng Paecilomyces từ chế phẩm và bọ phấn trắng thu thập được − Định tính hệ enzyme ngoại bào có khả năng đối kháng tuyến trùng và bọ phấn trắng − Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. phân lập được − Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn và tuyến trùng của nấm Paecilomyces spp. phân lập được
  • 15. Đồ án tốt nghiệp 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1. 1. Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp. 1.1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 1.1.1.1 Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Paecilomyces Chi Paecilomyces do Bainier mô tả vào 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Chuyên luận về chi nấm này của Samson (1974) chấp nhận 16 loài đã mô tả, đồng thời tổ hợp mới 9 loài và đề nghị 6 loài mới, tất cả tập hợp trong 2 nhóm loài. Nhóm loài thứ nhất là nhóm loài Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác. Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng. Nhiều loài trong nhóm hai này ký sinh gây bệnh côn trùng. 1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Ngoài ra, có thể tìm thấy loài nấm này ở các loại đất nông nghiệp (Brand et al., 2010). Chúng hiện diện ở những nơi khá ẩm ướt, trong đất, không khí, trong phòng thí nghiệm hay ngoài tự nhiên. Ký chủ của nấm bao gồm hơn 25 họ côn trùng và nhiều loại ve khác nhau. Trong đó, những loài ký chủ là côn trùng dễ bị nhiễm nấm đó là: bọ phấn trắng, rệp, bướm đêm...; còn những loài ký chủ là ve thì có: ve nâu, ve đỏ châu Âu... Còn đối với ký chủ là tuyến trùng thì thường phân lập được chủng nấm Paecilomyces lilacinus,
  • 16. Đồ án tốt nghiệp 4 một loài có trong đất và thảm thực vật (Jatala, 1986). Trong nghiên cứu của Eng (2001), có 82,9% trong số 41 nông trại được khảo sát ở Sarawalk có sự hiện diện của P.lilacinus, mặc dù người ta đã sử dụng các loại thuốc diệt nấm. Từ đó có thể nhận thấy P.lilacinus có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống, có phạm vi thích ứng rộng và có khả năng phát triển tốt ở 26 – 300 C. Chi Paecilomyces có nhiều loài nhưng chủ yếu là hai loài Paecilomyces lilacinus và Paecilomyce variotii. Một vài loài Paecilomyces spp. có khả năng chịu nhiệt như: nhiệt độ tối ưu của Paecilomyces fulvus là 450 C, Paecilomyces crustaceous là dưới 550 C (Samson, 1974). Hai loài nấm chịu nhiệt trên có khả năng làm hư hỏng thực phẩm nhưng cũng là loài quan trọng ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các enzyme chịu nhiệt. Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài Paecilomyces đem lại nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích (Liang et al., 2003) . Một số loài Paecilomyces spp. phổ biến: − Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng. − Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất. − Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng. − Paecilomyces lilacinus phân lập được từ xác bã hữu cơ, trứng tuyến trùng và đôi khi còn ở côn trùng chết, rừng cao su. (Crop Protection Compennium, 2002). 1.1.1.3. Đặc điểm hình thái a. Đặc điểm đại thể Paecilomyces spp. là loại nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác côn trùng. Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đó khi bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng sẫm. Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Khuẩn lạc thường
  • 17. Đồ án tốt nghiệp 5 mọc theo hình tròn đồng tâm. Có thể phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể. Hình 1.1. Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) b. Đặc điểm vi thể Cuống bào tử đính thường phân nhánh và mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces spp. thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium spp. Cuống bào tử hình thành từ phần gốc hay giữa sợi nấm, dài 400 - 600 µm. Paecilomyces spp. có thể bình trên đầu của cuống với kích thước 3 - 4 × 400 - 600 µm. Thể bình nhỏ, phồng lên ở phần gốc, thon dài, nhỏ và uốn cong ở phần đầu. Thường phần gốc chụm lại thành nhóm như cây chổi tương tự như cấu trúc ở phần đuôi của cuống bào tử đính. Bào tử phân sinh đơn bào, có dạng hình oval đến hình thoi, trong suốt đến nâu, có hình thành dạng chuỗi, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002). Giá bào tử trần, đơn độc hoặc bó thành giá, phân nhánh không đều hoặc thành vòng. Nhánh mang ở đỉnh thể bình mọc thành vòng. Thể bình đôi khi đơn độc trên các sợi nấm không phân hóa. Thể bình gồm phần gốc hình trụ hoặc hình gần trứng và phần ngọn thon nhỏ đột ngột thành một cổ dài. Bào tử trần thuộc tip phialoconidi (tip cơ bản euconidi), không ngăn vách, không màu hoặc màu nhạt,
  • 18. Đồ án tốt nghiệp 6 nhẵn hoặc có gai, thành chuỗi gốc non. Các chuỗi bào tử trần tách xa nhau, ít khi tụ họp thành khối. Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2012_06_01_archive.html) 1.1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp. Độc tố chính của nấm Paecilomyces spp. là paecilotoxin (leucinostatins), là một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và amine ở đầu C. Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1- [[(1S)-1-[2[2-(3-arbamoylpropylcarbomoyl)propan-2-ylcarbamoyl] propan-2- ylcarbamoy]-3-methylbutyl] carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2- ycarbomoyl]-2-hydroxy-3-methyl-butul] carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo- nonyl]-4-methyl-1-[(E,4S)-4-methylhex-2-enoyl] pyrrolidin-2-carboxamide. (Nevalainen Helena, 1977). Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng loài khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng.
  • 19. Đồ án tốt nghiệp 7 Hình 1.3. Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin. 1.1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ a. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với bọ phấn trắng Chu kỳ sống của Paecilomyces spp. có thể chia làm 3 giai đoạn: đầu tiên các bào tử sẽ tiếp xúc với côn trùng qua lớp vỏ và lớp chân lông. Các bào tử bám váo lớp vỏ của côn trùng, nảy mầm và phát triển một ống mầm trong 8 - 16 giờ. Ống mầm phát triển dưới dạng một vòi bám xuyên qua biểu bì côn trùng và đi vào trong xoang máu. Vòi bám là một tế bào có kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, có dịch nhầy để bám vào vỏ côn trùng. Sự xâm nhập của nấm đạt được bằng cách tiết ra hỗn hợp enzyme bao gồm chitinase, protease và áp lực cơ học. Sau khi tế bào đơn nảy mầm, bào tử sẽ xâm nhập và lưu thông trong xoang máu của côn trùng, nhân lên, và sử dụng chất dự trữ trong cơ thể côn trùng để sinh trưởng và sinh sản. Các sợi nấm phân nhánh tạo thành một mạng lưới chằng chịt trong cơ thể côn trùng. Paecilomyces spp. sản sinh ra các hợp chất, phá bỏ hệ thống miễn dịch của côn trùng, cạnh tranh với các vi sinh vật tiềm tàng, giết chết vật chủ trong 7 - 14 ngày. Cuối cùng sau khi ký chủ chết, nấm sẽ lan ra khỏi biểu bì rồi bao lấy cơ thể của côn trùng và phát triển thành đảm bào tử. Khi gặp điều kiện phù hợp sẽ sản sinh ra bào tử, bào tử sẽ được phát tán rồi lây nhiễm cho các vi sinh vật khác. Tuy nhiên,
  • 20. Đồ án tốt nghiệp 8 chu kỳ sống được hoàn thành trong điều kiện phải thích hợp, trong khoảng 48 - 72 giờ và không có sự có mặt của vi sinh vật hoại sinh. Thông thường đối với các loại bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn hay do virus thì chúng lây truyền thông qua đường ruột hay đường thức ăn, nhưng đối với nguồn bệnh là vi nấm thì chủ yếu là do sự tiếp xúc trực tiếp hay qua trung gian truyền bệnh. Trung gian đó có thể là những loài ký sinh hay côn trùng ăn thịt. Nấm Paecilomyces spp. tấn công vào xoang máu của bọ phấn thông qua lớp biểu bì hoặc đường miệng. Bọ phấn chết là sự kết hợp của nhiều yếu tố như tổn thương mô cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do nấm tiết ra khi ở trong cơ thể côn trùng. Quá trình bám của bào tử nấm vào cơ thể của côn trùng là một quá trình thụ động nhờ gió và nước. Đầu tiên bào tử của nấm sẽ bám lên thành biểu bì. Bào tử của nấm có một lớp bên ngoài là bó sợi đan xen là các đuôi kị nước. Độ bám dính của bào tử trên bề mặt biểu bì một phần là nhờ các đuôi kị nước. Lectins, một loại cacborhydrate glycoprotein được phát hiện có trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì côn trùng dễ hơn. Khi đạt tới điều kiện thích hợp bào tử sẽ nảy mầm và tăng trưởng nhanh chóng với sự tác động của các điều kiện sẵn có của nước, chất dinh dưỡng, oxy cũng như pH, nhiệt độ và bởi sự tác động của hợp chất độc tố trên bề mặt côn trùng. Nấm nảy mầm trong phạm vi có đủ nguồn Carbon và Nitơ. Nấm xâm nhập vào côn trùng bằng quá trình lây nhiễm, xâm nhập qua lớp biểu bì hay tạo áp lực cơ học nhờ giác bám. Lớp biểu bì của côn trùng có hai lớp: ngoài là epicuticle và trong là procuticle. Epicuticle có cấu trúc phức tạp là một lớp mỏng không có chitin nhưng chứa protein, phenol ổn định và được bao phủ bởi một lớp sáp có chứa acid béo, lipid, sterol.Các procuticle phần lớn có các sợi chitin bên trong hỗn hợp protein, lipid, quinon. Nấm cần xuyên qua lớp biểu bì vào cơ thể côn trùng để có thể lấy được chất dinh dưỡng cần cho sự tăng trưởng và sinh sản. Sự xâm nhập vào cơ thể côn trùng bao gồm cả sự phân hủy của enzyme do nấm tiết ra và nhờ áp lực cơ học.
  • 21. Đồ án tốt nghiệp 9 Khởi đầu cho quá trình xâm nhiễm, nấm xâm nhập tại những vị trí dễ bị tổn thương trên lớp biểu bì. Nấm sẽ xuyên qua lớp biểu bì ngoài nhờ áp lực cơ học. Bào tử nảy mầm và hình thành các giác bám trên bề mặt biểu bì. Giác bám là đầu tận cùng của ống mầm phát sinh từ bào tử. Giác bám gắn vào biểu bì côn trùng là nhờ tương tác kị nước giữa các thành bào tử và các lipid nằm trong lớp biểu bì trên. Sau đó, ống mầm xuyên qua lớp biểu bì dưới, nội bì rồi vào xoang máu. Các nghiên cứu còn cho thấy có sự tham gia của các chất truyền tin nội bào như Ca2+ và cAMP (cyclicadenosine monophosphate) trong sự hình thành giác bám trong trường hợp khi lớp biểu bì cứng khó xuyên qua. Sau khi xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng, nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn. Những sợi nấm này được phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, chúng tiêu diệt dần các tế bào bạch huyết. Sau đó, sợi nấm xâm nhập mô, phá hủy tất cả các tế bào bạch huyết rồi làm chết vật chủ. Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm giảm tác dụng oxy hóa khử lympo trong máu. Do nấm sinh sản nhiều sẽ làm tắc hệ tuần hoàn của côn trùng, làm côn trùng biếng ăn; đồng thời chất độc sinh ra làm thay đổi sinh hóa của cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đó làm rối loạn và mất chức năng sinh lý. Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục hoại sinh cơ thể côn trùng rồi phát triển sợi nấm ra toàn bộ cơ thể côn trùng và hình thành bào tử. Quá trình xâm nhập vào cơ thể côn trùng còn nhờ vào sự hỗ trợ mạnh mẽ của các enzyme và hệ enzyme. Một loạt các loại enzyme ngoại bào có thể thủy phân các thành phần chính của lớp biểu bì côn trùng như chitinase, lipase, esterase, lipoxygenase và ít nhất bốn loại protease khác nhau đã được ghi nhận có vai trò quan trọng trong việc xâm nhiễm. Do cấu trúc phức tạp của lớp biểu bì côn trùng nên cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme khác nhau. Trong đó, chitanase và endoprotease là hai enzyme giữ vai trò quan trọng nhất.
  • 22. Đồ án tốt nghiệp 10 b. Chu kỳ sống và tác động của nấm Paecilomyces spp. tác động đối với tuyến trùng Thuật ngữ “nematophagous fungi – nấm kí sinh tuyến trùng” được dùng để mô tả một nhóm đa dạng các loài nấm có khả năng xâm nhiễm và ký sinh tuyến trùng. Nhiều loại vi nấm đã được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood,1996). Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Có rất nhiều loài Paecilomyces có khả năng ký sinh tuyến trùng, trong đó có Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces chlamydosporia được xem là nấm kí sinh trứng tuyến trùng hiệu quả. Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm là enzyme protease và chitinase, bởi vì vỏ trứng được cấu tạo bởi ba lớp riêng biệt: một lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin và một lớp lipoprotein bên trong. Các thí nghiệm đã cho thấy trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng (Llorca và Claugher, 1990) dẫn đến sự tan rã của lớp vitelline, phân hủy của lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004). Các loại nấm có sự khác nhau về khả năng phân hủy vỏ trứng tuyến trùng, và quá trình xâm nhiễm được tìm thấy bị ảnh hưởng bởi kí chủ tuyến trùng (Segers et al., 1998). Sự xâm nhiễm tuyến trùng và trứng của chúng bởi các nấm khác nhau thì có thể theo các phương thức khác nhau. Ban đầu, các bào tử và sợi nấm sẽ tiếp xúc với vỏ trứng. Khi bào tử nấm bám trên bề mặt kí chủ, bào tử sẽ mọc mầm xuyên qua lớp vỏ trứng. Như trong các cách xâm nhập bề mặt kí chủ của các nấm kí sinh côn trùng khác, nấm kí sinh trứng tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (enzyme) và cơ học. Nấm tiết ra các enzyme làm mềm lớp vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm
  • 23. Đồ án tốt nghiệp 11 rồi thông qua lớp lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Vỏ trứng tuyến trùng có chứa chitin và protein được tổ chức thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980), do đó chitinase và protease giữ một vị trí quan trọng trong quá trình xâm nhập tuyến trùng (Tikhonov et al., 2002). Để chứng minh tầm quan trọng của enzyme trong quá trình phân hủy các polymer trong trứng tuyến trùng, một nghiên cứu về các enzyme ngoại bào phân hủy các polymer này đã được thực hiện trên một chất ngoại bào (ECM - extracellular material chứa protease P32) hoặc chất kết dính được tiết ra từ nấm P.rubescens có liên quan đến lectin Concanavalin A (Con A). Trong nghiên cứu đó, protein serine 32 kDa đã được ly trích từ P. rubescens kí sinh trứng. Sự tham gia của enzyme trong quá trình này đã được kiểm tra trên các protein vỏ trứng Globodera pallid (Llorca, 1990). Người ta cho rằng mặc dù quá trình gây bệnh phức tạp và liên quan tới nhiều yếu tố, nhưng ức chế P32 bằng hóa chất và kháng thể đa dòng làm giảm sự nhiễm trùng và xâm nhập trứng (Llorca et al., 2002). Các loài tương tự P. chlamydosporia cũng tiết ra enzyme protease ngoại bào (VcP1) liên quan với P32 và các enzyme tương tự từ nấm nội kí sinh (Segers et al., 1994). Trứng được xử lý với VcP1 bị xâm nhiễm dễ hơn trứng chưa được xử lý, điều này cho thấy vai trò của enzyme trong quá trình kí sinh vỏ trứng bởi nấm kí sinh trứng. 1.1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 83 loài phân bố trên diện rộng, trong đó có thể kế đến là Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseu, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces variotii, Paecilomyces lilacinus (Dilip K.Arora, P.D.Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004).
  • 24. Đồ án tốt nghiệp 12 Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như: - Paecilomyces lilacinus Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phòng 270 C ± 20 C. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). - Paecilomyces fumosoroseus Khuẩn lạc trên môi trường MEA (Malt extract agar) có màu xám. Sau 14 ngày đường kính khuẩn lạc đạt 15 mm. Cuống bào tử trần đơn độc, kích thước 40 - 60 × 2 - 3µm. Bào tử có dạng hình trụ, kích thước 3 - 4 × 1 - 2µm và tạo thành chuỗi dài. Loài này có khả năng ký sinh trên các loài côn trùng. - Paecilomyces variotii Bainier Paecilomyces variotii Bainier là loài thường gặp nhất ở không khí, đất và trên các sản phẩm công nông nghiệp ở nước ta (D.H.Miên, 1960), có khả năng sinh ra kháng sinh variotin (kháng sinh chống nấm), ngoài ra còn tạo thành mycotoxin là acid byssochlamic và một số sản phẩm trao đổi chất khác. Thường sống hoại sinh trên các loại gỗ, đồ thuộc da, sách, đồ bằng sợi nilon hay sợi đay. Nhưng loài nấm này có khả năng gây bệnh trên người và thực vật. - Paecilomyces inflatus Khuẩn lạc trên môi trường MEA (Malt extract agar) phát triển chậm, đường kính từ 33 - 35mm ở 14 ngày và ở nhiệt độ 280 C. Khuẩn lạc mịn, mềm như bông khi mới phân lập. Phát triển thành sợi nấm trong suốt và mịn vài ngày sau đó.
  • 25. Đồ án tốt nghiệp 13 Khuẩn lạc trên PDA cũng phát triển chậm, khoảng 33 - 35mm ở 14 ngày và ở nhiệt độ 250 C. Khuẩn lạc có màu trắng hơi vàng nhạt. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm là ở 250 C. Cuống bào tử có cấu trúc không đều thường gồm 1 - 3 thể bình trên nhánh ngắn của sợi nấm. Thể bình, bào tử: chủ yếu là các thể bình đơn có cấu trúc không đều trên sợi nấm hoặc ngẫu nhiên có 2 – 3 thể bình nằm trên sợi nấm. Thể bình có dạng bình, với phần gốc phình to, phần đầu nhọn. Thể bình dài khoảng 12,8 – 2,3 µm, trong suốt và mịn. Bào tử độc lập, hình chanh. 1.1.3. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống 1.1.3.1. Sản xuất enzyme Paecilomyces spp. được biết đến như một chủng nấm sản xuất và cung cấp nguồn enzyme tiềm năng. Paecilomyces spp. tiết ra enzyme để dễ xâm nhập vào ký chủ hơn và giúp chúng phát triển nhờ thủy phân cơ chất hay thâm chí còn lấn át các loài vi sinh vật khác phát triển. Đã có nhiều nghiên cứu về sự sản sinh enzyme của Paecilomyces spp., nhiều nhất là về các enzyme hydrolase: protease, cellulase, dextranase... Paecilomyces spp. sinh ra ba loại protease: acid, trung tính và kiềm. Các protease acid và trung tính có thể ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia và bánh kẹo. Protease kiềm thì ứng dụng trong công nghiệp thuộc da. Paecilomyces spp. thuộc nhóm nấm Ascomycetes có mặt trong đất, nước, không khí, gỗ, tàn dư thực vật, đất… Paecilomyces spp. còn gọi là nấm thối mềm, vì chúng có khả năng phân hủy cellulose. Dextranase (α -1,6-D-glucan, 6 glucanohydrolase; EC: 3.2.1.11) có nhiều ứng dụng trong y học và nền công nghiệp vì nó thủy phân dextran. Sự hiện diện của dextran có nhiều tác động tiêu cực ở mức độ chế biến như mất sucrose, tăng độ nhớt của quá trình siro và phục hồi kém của sucrose. Sử dụng dextran sẽ giải quyết được các vấn đề này. Dextranase có thể thủy phân hay ức chế quá trình tổng hợp glucans,
  • 26. Đồ án tốt nghiệp 14 có thể được sử dụng trong điều trị mảng bám răng. Nó cũng được sử dụng để tạo ra các dextran có trọng lượng phân tử thấp và gây độc cho tế bào. Hơn nữa, dextranase có ảnh hưởng tiêu cực đến sự tổng hợp isomaltooligosaccharides, chất ức chế hoạt động của các cơ chất có lợi cho vi khuẩn đường ruột probiotic. Và loại enzyme này cũng đã được tiết ra bởi nhiều loài nấm trong đó có nấm Paecilomyces spp. 1.1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp Paecilomyces spp. là nguồn quan trọng cho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng một số loài Paecilomyces spp. có thể tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học rất hữu ích. Fingolimod làhợp chất được tổng hợp dựa trên chất chuyển hóa thứ cấp do nấm tổng hợp là myriocin (ISP-I), là một chất ức chế miễn dịch mạnh đã được phê duyệt bởi FDA (U.S. Food and Drug Administration) như là một loại thuốc điều trị mới cho chứng đa sơ cứng. Fingolimod đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Tetsuro Fujita ở Đại học Kyoto (1992). ISP-I được thu nhận từ P. cicadae. Fingolimod có tiềm năng được sử dụng trong liệu pháp ghép cơ quan. Các nhà khoa học cho rằng nó có thể ngăn ngừa mạnh các phản ứng miễn dịch thông qua trung gian lympo bào để đáp ứng việc cấy ghép cơ quan mới. Ngoài ra, fingolimod còn được cho rắng làm tăng tế bào nội mô và bảo vệ chức năng của chúng. Một chất tương tự như anarcadic acid được tách chiết từ P. variotii. Hợp chất này lần đầu tiên được cô lập từ nguồn tự nhiên và được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chống lại các tác nhân gây bệnh cho người bao gồm cả các chủng đa kháng thuốc MDR (Multidrugresistan). Paecilomyces farinosus B05 đã được nghiên cứu để tách chiết các thành phần polysaccharide ngoại bào từ môi trường lên men và sản xuất để ứng dụng vào sản xuất các chất chống oxy hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các polysaccharide được chiết xuất từ P. farinosus có hoạt tính chống oxy hóa cao, chỉ thấp hơn vitamin C một ít.
  • 27. Đồ án tốt nghiệp 15 1.1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật Việc sử dụng các vi sinh vật tự nhiên để phòng trừ các dịch hại là một công việc quan trọng hiện nay trong ngành nông nghiệp vì sự an toàn, thân thiện với môi trường và hiệu quả cao. Ở Ai Cập đã sản xuất Priority - một sản phẩm từ P. fumosoroseus để diệt trừ các loại côn trùng. Đây là thuốc trừ sâu sinh học giúp diệt trừ bướm trắng để bảo vệ cây cà chua, dưa leo, cây cảnh. Sản phẩm chứa bào tử của chủng nấm P.fumosoroseus, và được xem là có khả năng lây nhiễm ở tất cả giai đoạn (trứng, ấu trùng, nhộng, bướm trưởng thành). Ngoài ra trên thị trường còn có một số sản phẩm như Pelicide, Bio - Nematon, PL Plus chứa bào tử nấm P.lilacinus nhằm phòng trừ tuyến trùng gây hại cho cây nằm trong đất. 1.1.3.4. Xứ lý môi trường Nấm là đối tượng thường được sử dụng trong hệ thống lọc khí sinh học để xử lý ô nhiễm không khí thông qua việc sử dụng khả năng của nấm để biến đổi các chất ô nhiễm hữu cơ và vô cơ thành hợp chất ít độc hại hơn. Formaldehyde là một chất phổ biến và nó là sản phẩm của các nguồn sinh học và từ môi trường (sinh ra từ nhà máy công nghiệp). Formaldehyde có độc tính cao do phản ứng không đặc hiệu với protein và nucleic acid, vì thế nó là chất gây ô nhiễm môi trường. P. variotii đã được thử nghiệm xử lý formaldehyde do chủng nấm này có enzyme S - hydroxymethylglutathione dehydrogenase. Enzyme này có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với cơ chất là formaldehyde. Ngoài ra, enzyme alcohol oxidase từ P. variotii có khả năng làm giảm lượng formaldehyde đáng kể và là tiềm năng cho việc ứng dụng xử lý formaldehyde. Ngoài ra, có một số ứng dụng quan trọng của chi Cordyceps trong việc làm thuốc và thực phẩm có lợi cho sức khỏe của con người là chi Paecilomyces (Liang et al., 2003).
  • 28. Đồ án tốt nghiệp 16 1.1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp. Bio - Nematon là thuốc trừ tuyến trùng sinh học chứa chủng nấm Paecilomyces lilacinus được chọn lọc trong tự nhiên. Sản phầm bao gồm những bào tử và sợi nấm của P.lilacinus, dạng lỏng chứa 1x109 CFU/ml và dạng bột chứa 1x108 CFU's/gm. Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của nó sẽ phá hủy vỏ trứng, ấu trùng và con nhỏ của hấu hết các loại tuyến trùng gây hại ở thực vật. Khi mà bảo tử tìm thấy những giai đoạn khác nhau của tuyến trùng, chúng sẽ nảy mầm và phát triển, nảy nở trong cơ thể ký chủ, thậm chí làm tê liệt dẫn đến chết. Hình 1.4. Bio Nematon - Sản phẩm của công ty T.Stanes có khả năng trừ tuyến trùng (Nguồn: www.tstanes.com) NoFly WP là thuốc trừ sâu sinh học chứa chủng nấm Paecilomyces fumosoroseus nhằm kiểm soát bọ trĩ và bọ phấn trắng trên thực vật ở nhiều giai đoạn sống của chúng như: trứng, ấu trùng và con trưởng thành. Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của P.fumosoroseus sẽ bám vào côn trùng, nảy mầm và xâm nhập qua lớp cutin. Khi ký sinh được ký chủ, chúng sẽ phát triển nhanh chóng, phá vỡ tế bào dẫn đến bị mất chức năng sống. Côn trùng sẽ chết trong vòng từ 3 - 10 ngày, phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi côn trùng chết, bào tử của nấm sẽ nảy mầm trên bề mặt của côn trùng ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, làm cho
  • 29. Đồ án tốt nghiệp 17 cơ thể côn trùng bị phủ một lớp tơ xám trắng ra bên ngoài. Trong điều kiện bất lợi, sẽ không có sự hình thành bào tử tuy nhiên ta có thể nhận thấy sự ký sinh của nấm qua màu sắc của cơ thể côn trùng khi chết, đó là màu nâu. Hay qua sự méo mó của cơ thể côn trùng. Hình 1.5. Sản phẩm trừ bọ phấn (Nguồn:www.plantprod.com) 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. Điều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng như hệ sợi nấm côn trùng là ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ pH trong môi trường, cũng như phương pháp nuôi cấy. Quá trình tác động đến đất như sử dụng phân bón hữu cơ, thuốc trừ sâu hóa học đều có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của một số chủng vi nấm sống trong đất. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát tiển của nấm: - Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của nấm. Nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không mọc và sẽ hạn chế khả năng gây bệnh đối với côn trùng. Trong quá trình hình thành bào tử, nấm cần các nguồn C, N. Các nguồn Carbon đã được nghiên cứu ảnh hưởng là: glucose, sucrose, arabinose, mannose và acid citric đều ảnh hưởng đến sự phát triển của Paecilomyces spp. (Bharati et al., 2007). Kết quả cuối cùng thu được:
  • 30. Đồ án tốt nghiệp 18 sucrose là cơ chất tốt nhất (87,25 cm) cho sự tăng trưởng; tiếp theo là glucose (56,25 cm). Mannose có khả năng thấp nhất, các cơ chất khác có tác dụng vừa phải. Còn đối với nguồn Ni-tơ, Bharati et al. (2007) đã sử dụng các nguồn Nitơ thử nghiệm: ammonium photphase, sodium nitrate, glycin, calcium nitrate, ammonium nitrate để nghiên cứu khả năng sử dụng Nitơ của Paecilomyces spp. Kết quả thu được Calcium nitrate là nguồn Nitơ tốt nhất rồi đến glycin, natri nitrate, ammonium nitrate. Ammonium phosphate được vi nấm sử dụng ít nhất. - Ảnh hưởng của các loại môi trường: Theo Sung Mi Shim (2003) nghiên cứu rằng có sự chênh lệch về sự phát triển của nấm trên hai môi trường PDA (6,73 cm sau 14 ngày nuôi cấy) và Czapeck - Dox (6,25 cm sau 14 ngày nuôi cấy). - Ảnh hưởng của ẩm độ và nhiệt độ là yếu tố cần cho sự hình thành và phát triển của bào tử nấm Paecilomyces spp. Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 - 250 C, nhưng ở 250 C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999), còn nhiệt độ phù hợp cho sự hình thành bào tử lại là ở 240 C. Đối với nấm Paecilomyces papillata, khi lây nhiễm thì ở 180 C có tỷ lệ ký sinh cao hơn đến 18% so với nhiệt độ 250 C. Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình dị hóa, tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần văn Mão, 2002). Gần đây, Statbers, T.E, D.Moore và C.Prior (2004) đã cho công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. và xác định loài này thích hợp ở nhiệt độ 280 C (Phạm Thị Thùy, 2004). Nếu nhiệt độ quá cao thì bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành. Julio J.D et al. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12, 16 và 300 C. Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công vào cơ thể côn trùng nếu gặp điều kiện không thích hợp về nhiệt và ẩm độ hay ánh sáng thì sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường (Penland, 1982).
  • 31. Đồ án tốt nghiệp 19 Hình 1.6. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự phát triển của tản nấm Paecilomyces Ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80 - 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Độ ẩm cao sẽ có lợi cho sự sinh trưởng của sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử. Tuy nhiên, độ ẩm thấp sẽ duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm có khả năng sống lâu trong điều kiện độ ẩm từ 0 - 34% hơn là khi ẩm độ 75% (Trần Văn Mão, 2002). - Ảnh hưởng của ánh sáng: Nấm côn trùng phát triển tốt trong điều kiện phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong thời gian 6 - 8 giờ cũng đủ cho nấm côn trùng phát triển. Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình sinh bào tử của nấm. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp. sẽ không tạo nhiều bào tử. Theo như nghiên cứu của Li Gao et al (2009) thì thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng đến sự phát triển nấm và hình thành bào tử đối với Paecilomyces lilicinus IPC - P, cụ thể như sau: nấm phát triển tốt nhất ở điều kiện tối hoàn toàn (49,96 mg/cm2 ), còn ở điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn rất nhiều (29,75 mg/cm2 ). Tương tự cho sự hình thành bào tử, ở điều kiện tối hoàn toàn thì bào tử tạo thành nhiều nhất 91,7.105 bào tử/cm2 ; trong điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn (46,79 bào tử/cm2 ). Đối với chủng P.lilacinus M-14 thì trong điều kiện tối hoàn toàn nấm phát triển tốt (56,58 mg/cm2 ); còn điều kiện 12h sáng/12h tối nấm đạt giá trị 55,05 mg/cm2 . Đối với sự hình thành bào tử thì lượng bào tử tạo
  • 32. Đồ án tốt nghiệp 20 thành nhiều ở điều kiện 12h sáng/ 12 tối (121,57.105 bào tử/cm2 ); còn ở điều kiện tối hoàn toàn thì lượng bào tử tạo thành thấp hơn (55,91. 105 bào tử/cm2 ). - Ảnh hưởng của độ pH: thường nấm sống trong phạm vi pH = 3,5 - 8. Nhưng nấm côn trùng ưa pH acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 - 6. Theo như nghiên cứu của Sung Mi Shim et al. (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P.fumosoroseus nằm trong khoảng 6 - 9, còn nấm P.japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003). - Ảnh hưởng của độ thoáng khí: nấm côn trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí, khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt. 1.3. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phòng trừ bọ phấn và tuyến trùng gây hại 1.3.1. Tổng quan về bọ phấn trắng 1.3.1.1. Phân loại khoa học Giới: Animanila Ngành: Arthropoda Lớp: Insecta Bộ: Hemiptera Họ: Sternorrhyncha Chi: Aleyrodoidea Loài: Aleyrodidae
  • 33. Đồ án tốt nghiệp 21 Hình 1.7. Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng. (Nguồn: organicsoiltechnology.com) 1.3.1.2. Đặc điểm sinh thái Bọ phấn là một trong những dịch hại nguy hiểm đối với nhiều loài cây trồng. Ký chủ ọ phấn chủ yếu là thực vật hạt kín hai lá mầm, trong đó cây họ cam quýt (Rutaceae) là ký chủ của hơn 60 loài, cây họ dâu tằm (Moracea) là ký chủ của hơn 80 loài. Ở các nước ôn đới, bọ phấn Trialeurodes vaporariorum gây hại nặng cho cây trồng trong nhà kính và ngoài đồng ruộ Aleyrodes proletella gây hại nặng cho rau họ thập tự. Ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, các loài
  • 34. Đồ án tốt nghiệp 22 Aleurodicus dispersus, Trialeurodes vaporariorum và Bemisia tabaci gây hại thiệt nghiêm trọng cho bông và nhiều loại cây trồng khác có giá trị kinh tế cao. Cho đến nay trên thế giới đã ghi nhận 1556 loài bọ phấn. Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (BVTV) các năm 1967 - 1968, 1977 - 1978, 1997 - 1998, ở nước ta có 7 loài bọ phấn có tên khoa học là: Aleurocanthus spiniferus, Aleurocanthus woglumi, Aleurocanthus spp. gây hại trên cam quýt; Aleurocybotus indicus gây hại trên lúa; Dialeurodes citri gây hại trên na; Parabemisia myricae gây hại trên đậu tương, thuốc lá, đậu đỗ, dưa chuột, cà chua, cà tím. Theo kết quả điều tra mới đây của các tác giả Nguyễn Thị Thu Cúc, Lê Thị Tuyết Nhung, Lê Quang Khải, thành phần bọ phấn nước ta đã được bổ sung thêm 4 loài: Aleurodicus dispersus gây hại trên ổi; Aleyrodes proletella gây hại trên súp lơ xanh; Dialeurolonga rusotigmoides, Ochamoplatus citri gây hại trên cam, quýt. 1.3.1.3. Đặc điểm hình thái Trưởng thành có kích thước nhỏ, thích bay và thường có màu trắng đục, có lớp sáp phấn trên cánh, chiều dài cơ thể 1 -3 mm. Trưởng thành của bọ phấn trắng cái có màu vàng nhạt hoặc trắng . Lá non chưa hoàn chỉnh (chưa mở) là nơi con cái ưa thích đẻ trứng, giao phối ngay sau khi vũ hóa. Trứng có hình quả lê hoặc quả trứng, có cuống gắn chặt cố định trên các mô lá và thời gian pha trứng từ 8-31 ngày. Phần mở rộng của cuống óc dính này là phương tiện để thụ tinh. Mỗi con cái có thể đẻ 80 trứng, số lượng trứng thay đổi theo mùa. Ấu trùng tuổi 1 - 3 có thể di chuyển và gây hại trong phạm vi ngắn; T . Ấu trùng mới nở có màu kem nhạt và dần dần chuyển sang một màu đen bóng. Chúng hình thành các tua sáp và phủ một lớp sáp trên cơ thể . Ngay sau khi nở, các ấu trùng di chuyển tìm vị trí thích hợp để định cư gây hại. Thời gian phát dục của tuổi 1: 4 - 7 ngày, tuổi 2: 3 - 7 ngày và tuổi 3: 3 - 8 ngày. Mỗi lần lột xác là có sự thay đổi màu sắc từ màu nhạt chuyển sang hơi đen.
  • 35. Đồ án tốt nghiệp 23 Hầu hết tuổi 2, 3 của ấu trùng có hình bầu dục hoặc thuôn dài và có những khe (nếp gấp) thở cạn ở thành bụng và lưng. Đó là các lỗ thở và có thể hỗ trợ cho việc dẫn truyền không khí. Giai đoạn nhộng (ấu trùng tuổi 4) trong giai đoạn đầu, kéo dài 9-14 ngày sau đó vũ hóa thông qua khe hình chữ 'T' trên lưng vào buổi sáng. Cả ấu trùng và trưởng thành đều chích vào mô cây trồng và hút dịch nhưng giai đoạn ấu trùng gây thiệt hại nặng nhất cho cây mía. Khi ấu trùng phát triển, chúng phủ một lớp bọc bằng sáp trắng giúp bảo vệ khỏi các tác động bên ngoài, nhất là thuốc trừ sâu, đây là đặc điểm riêng biệt của bọ phấn trắng ở các pha phát dục, trừ pha trứng. 1.3.1.4. Tổng quan về bệnh vàng lá do bọ phấn trắng gây ra Bọ phấn trắng non và bọ phấn trưởng thành thường tập trung ở mặt dưới lá cà chua, ổi, ớt.. chích hút dịch cây. Khi mật độ bọ phấn cao làm cây suy yếu, có thể bị héo, vàng lá, thậm chí có thể chết. Chất bài tiết của bọ phấn trắng có đường tạo điều kiện cho nấm bồ hóng phát triển hại cây. Bọ phấn thường gây hại trong mùa khô, chúng có phân tán trên phạm vi rộng nhờ gió. Ngoài ra, bọ phấn còn là vật trung gian truyền bệnh xoăn lá do virus gây ra và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có nhóm cây rau thực phẩm bị hại nghiêm trọng nhất là cà chua, ớt.. Bệnh xoăn lá có thể xuất hiện ngay từ khi cây còn nhỏ trong vườn ươm cho đến khi trồng ra ruộng và thu hoạch, phổ biến nhất là cây bắt đầu ra hoa. Bệnh xuất hiện càng sớm thì mức độ thiệt hại càng nặng. Cây bị bệnh còi cọc, lá biến màu vàng nhạt, trong khi gân lá còn xanh tạo thành những vết xanh vàng loang lổ, lá nhỏ lại, nhăn nheo và thô cứng, các lá ngọn bị xoăn, cây sinh trưởng kém, thấp nhỏ, phân nhiều nhánh cằn không phát triển được. Đốt thân hoặc các đốt ngắn lại và hơi uốn cong. Cây bị bệnh sớm và nặng có thể
  • 36. Đồ án tốt nghiệp 24 chết. Nếu bị muộn và nhẹ thì những lá non ra sau mới bị xoăn, cây có thể ra hoa và trái nhưng rụng nhiều. Nếu có trái thì trái nhỏ, méo mó, cứng, chất lượng kém. Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới và chủ yếu là do bọ phấn chích hút từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe. Bọ phấn Bemisia tabaci là côn trùng môi giới truyền bệnh. Virus lan truyền rất nhanh, khi bọ phấn bắt đầu ăn cây cà chua, virus được truyền đi trong vòng 15 - 30 phút. Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Bệnh không tồn tại lan truyền qua hạt giống và qua đất. Hàng năm, bệnh thường phát sinh mạnh từ tháng 10 đến đầu tháng 11 và gây hại nặng vụ cà chua xuân - hè tháng 3 - 4, đặc biệt khi trời ấm và nắng, ít mưa. Mức độ bị bệnh ở các giống cũng khác nhau: giống cà chua lai dễ nhiễm bệnh hơn các giống cà chua thuần; các giống mới nhập nội dễ nhiễm hơn các giống trồng qua nhiều năm; các giống cà chua địa phương có khả năng kháng bệnh virus cao. 1.3.2. Tổng quan về tuyến trùng Tuyến trùng ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman và et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40%- 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều. Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính. Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972). Tuyến trùng hại rễ là một loài sống ký sinh thực vật, thuộc chi Meloidogyne. Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp. gây tổn hại 20% - 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972). Chúng tồn tại trong đất ở những vùng có khí hậu nóng bức hay có mùa đông ngắn. Có khoảng 2000 loài thực vật có thể bị nhiễm
  • 37. Đồ án tốt nghiệp 25 tuyến trùng hại rễ và chúng gây mất mát 5% sản lượng thực vật trên toàn cầu mỗi năm. Ấu trùng của chúng xâm nhiễm vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, đồng thời chúng làm mất khoáng chất của cây và khả năng quang hợp. Khi chúng xâm nhiễm vào cây con thì kết quả chắc rằng cây đó sẽ chết, còn nếu nhiễm vào cây đã trường thành thì chỉ làm giảm năng suất của cây đó. 1.3.2.1. Phân loại khoa học Giới: Animalia Ngành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ: Tylenchida Họ: Heteroderidae Hình 1.8. Đặc điểm tuyến trùng hại rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học vật kính × 10 1.3.2.2. Đặc điểm sinh thái Meloidogyne thuộc nhóm động vật kí sinh cây trồng, chúng phân bố khắp thế giới và gần như kí sinh ở tất cả thực vật bậc cao. Chúng sống và sinh sản trong các tế bào sống bị biến đổi của rễ thực vật. Vì tạo nên những vết sưng trên rễ nên người ta gọi chúng là tuyến trùng sần rễ. Chúng có khả năng sinh sản và phát triển rất nhanh làm cho cây trồng bị thiệt hại nặng nề. Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne spp. có các đặc điểm như sau:
  • 38. Đồ án tốt nghiệp 26 Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn hay quả lê, màu trắng, ít vận động, không có giai đoạn u nang. Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12 - 15 µm. Lỗ bài tiết nằm trước tới khoảng giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích. Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chấ đặc sệt để bảo quản trứng và đẻ trứng ra ngoài. Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ. Có kim chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18 - 25µm. Tuyến hầu nằm ở phần bụng đến ruột. Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25 - 33µm, ống dẫn dài từ 7 - 11µm. Có một tinh hoàn. Ấu trùng: Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọc gelatine (gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt hay bên trong của nốt sần rễ. 1.3.2.3. Tổng quan về bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra Tuyến ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40% - 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều. Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính. Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972). Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp. gây tổn hại 20%- 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972) Trong khi ở Việt Nam thì tiêu có lượng xuất khẩu tiêu lớn nhất thế giới. Do đó, cây tiêu đóng một vai trò quan trọng trong nền kinh tế của đất nước. Nhưng hiện nay, có nhiều loại bệnh hại làm giảm năng suất của tiêu đó là bệnh sần rễ do tuyến trùng Meloidogyne gây ra. Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các loài vi nấm, vi khuẩn có hại xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn. Do đó, việc tìm hiểu và phòng trừ bệnh hại cho tiêu rất quan trọng.
  • 39. Đồ án tốt nghiệp 27 Khi bị tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết. Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn cả những cây xanh tươi do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khoáng chất được. Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn: − Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu sáng. − Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinh dưỡng bị ảnh hưởng. Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn công gây nhiều bệnh khác cho cây. − Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không còn. Có 29 loài thuộc các họ khác nhau có mặt trên các vùng trồng tiêu của Việt Nam. Trong đó, chủ yếu và phổ biến nhất là chi Meloidogyne. (Trịnh Thị Thu Thủy và cộng sự, 2007). Hình 1.9. Vòng đời của tuyến trùng hại rễ (Nguồn: www.apsnet.org)
  • 40. Đồ án tốt nghiệp 28 Tác động kinh tế: Meloidogyne spp. là một trong ba chi tuyến trùng ký sinh rễ gây thiệt hại nhất về cây trồng và sản lượng. Chúng có hiện diện ở tương đối nhiều nơi trên thế giới, và chúng ký sinh bắt buộc với rễ của hàng ngàn loài thực vật. Chi này gồm hơn 60 loài, trong đó một số loài lại có nhiều chủng khác nhau. Trong 60 loài thì có 4 loài gây hại chính trên thế giới đó là M. javanica, M. arenaria, M. incognita và M. hapla. Meloidogyne spp. hiện diện ở 23 trong tổng số 43 loài thực vật chính yếu, từ các cây lương thực, đồng cỏ, cây cảnh. Nếu tuyến trùng tấn công vào những cây lâu năm, có rễ ăn sâu vào đất thì việc kiểm soát sẽ rất khó khăn và bị hạn chế. Meloidogyne spp. được phát hiện đầu tiên ở cây sắn do Neal vào năm 1889. Rau màu được trồng ở những vùng có khí hậu ấm áp thường trải qua những mùa bị thiệt hại nghiêm trọng do tuyến trùng gây ra, và thường người ta dùng chất hóa học gọi là nematicide để ngăn chặn điều này. Rễ bị tuyến trùng ký sinh sẽ hấp thu nước và các khoáng chất yếu đi so với bình thường. Hậu quả bởi tuyến trùng gây ra cho thực vật là làm giảm sự tăng trưởng, chất lượng, năng suất của cây trồng, từ đó kéo theo sự suy giảm sức đề kháng của cây trồng với các yếu tố ngoại cảnh (như là: hạn hán, dịch bệnh,..) và tình huống xấu nhất là có thể sẽ mất trắng mùa màng. 1.3.3. Đánh giá khả năng ký sinh của chủng Paecilomyces spp. Kiểm soát sinh học được định nghĩa là các hoạt động kí sinh, ăn thịt hay gây bệnh trong việc duy trì mật độ sinh vật khác tại một số nơi thấp hơn trung bình (Bach, 1964). Tuy nhiên, kiểm soát sinh học là sự giảm mật độ quần thể tuyến trùng thông qua hoạt động của các sinh vật sống khác so với cây chủ có thể kháng lại tuyến trùng, xảy ra trong tự nhiên hay thông qua các thao tác môi trường (Stirling, 1991). Trước đây, việc kiểm soát tuyến trùng hại thực vật chủ yếu dựa vào các hóa chất diệt tuyến trùng, sức đề kháng của kí chủ thực vật và luân canh cây trồng. Mặc dù có nhiều thành công trong nghiên cứu kiểm soát tuyến trùng bằng phương pháp sinh học trong suốt 20 năm qua, đến nay nó vẫn ít được áp dụng. Hầu hết các sản
  • 41. Đồ án tốt nghiệp 29 phẩm có chứa độc tố được ly trích từ vi sinh vật và chỉ một vài sản phẩm có chứa vi sinh vật hữu hiệu (Dong và Zhang, 2006). Dưới đây là một số nghiên cứu về hiệu quả phòng trừ tuyến trùng của nấm kí sinh trứng trong những năm 1991 - 1996: Bảng 1.1. Hiệu quả phòng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật. Nấm Tuyến trùng Hiệu quả phòng trừ của nấm đối với tuyến trùng hại thực vật Tác giả (năm) P.lilacinus M. javanica Giảm số lượng tuyến trùng gây hại dưa leo. Stephan et al. (1991) P.lilacinus M.incognita R.reniformis Giảm số lượng tuyến trùng gây hại dưa hấu. Vicente et al. (1991) P.lilacinus M.javanica Xử lý nấm có hiệu quả tốt cho sự phát triển của đậu bắp. Walia et al. (1991) P.lilacinus M.javanica Bón vào đất 2g/chậu trước khi chủng tuyến trùng cho hiệu quả tốt nhất. Zaki và Maqbool (1991) P.lilacinus M.incognita acrita Trộn vào hạt giống với liều trung bình và cao làm giảm đáng kể sự hư hại của bộ rễ. Khan et al. (1992)
  • 42. Đồ án tốt nghiệp 30 P.marquandii Meloidogyne spp. Loài nấm này là một trong những sinh vật đất tự nhiên góp phần kiểm soát tuyến trùng. Marban- Mendoza và cs (1992) P.lilacinus M.incognitarace 3 Xử lý hạt đậu đũa bằng nấm cho hiệu quả diệt tuyến trùng tốt hơn so với xử lý bằng ascorbic acid. Siddiqui và Mahmood (1992a) P.lilacinus B. licheniforrnis M. incognitarace 3 P.lilacinus gây ra sự giảm mật độ tuyến trùng nhiều hơn so với B. licheniforrnis trên đậu đũa. Siddiqui và Mahmood (1992b) P.lilacinus M.incognita Có sự giảm số lượng nốt sần, khối trứng và mật độ tuyến trùng trong đất trồng nhiều loại thực vật khi xử lý với nấm. Pandey và Trivedi (1992) P. lilacinus M.incognita R.reniformis Khi phun chế phẩm lên gốc tiêu làm tăng số lượng và cân nặng chùm quả. Siddiqui và Mahmood (1993) P.lilacinus B.subtilis M.incognitarace 3 Xử lý nấm có hiệu quả hơn so với B.subtilis trong việc giảm số lượng Zaki (1994)
  • 43. Đồ án tốt nghiệp 31 tuyến trùng trên đậu đũa. P.lilacinus M.javanica Liều lượng tốt nhất để kiểm soát tuyến trùng là 4 gam/kg đất. Walters và Barker (1994) P.lilacinus R.reniformis Nấm kiểm soát tuyến trùng hiệu quả cả trong điều kiện nhà lưới và đồng ruộng. Siddiqui và Mahmood (1995b) P. lilacinus P. chlamydosporia Heterodera cajani P. lilacinus kiểm soát tuyến trùng không hiệu quả bằng P. chlamydosporia trên pigeonpea. Siddiqui et al. (1996) P. chlamydosporia T. harzianum M. javanica P.lilacinus kết hợp với P. chlamydosporia và T. harzianum làm giảm mật độ tuyến trùng trên đậu đũa. Siddiqui et al. (1996) P. chlamydosporia T.harzianum Glomus mosseae H. cajani P.chlamydosporium kết hợp với T.harzianum và Glomus mosseae làm giảm tuyến trùng hiệu quả nhất nhất trên pigeonpea. Siddiqui và Mahmood (1996)
  • 44. Đồ án tốt nghiệp 32 Theo R.P. Esser và N.E.El-Gol thì Paecilomyces spp. có khả năng gây ảnh hưởng và kí sinh trên con cái và trứng tuyến trùng. Nấm này cũng là tác nhân kiểm soát sinh học đáng kể theo nhiều khám phá trước đây vào năm 1979 và hiện nó đang được chú ý vì là " tác nhân kiểm soát sinh học có tiềm năng tuyệt vời trong đất nông nghiệp ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới". Loài Paecilomyces spp. ký sinh tuyến trùng sẽ tiếp cận với kí chủ thông qua một số con đường như: sợi nấm sẽ bám váo lớp vỏ keo của tuyến trùng hoặc thâm nhập thông qua phần hậu môn và cổ tử cung của tuyến trùng. Mặt khác, sợi nấm cũng có thể phân nhánh và bám vào bề mặt của trứng tuyến trùng. Theo một báo cáo gần đây của Gortari et al. (2008) thì Paecilomyces lilacinus là một loài vi nấm có khả năng ký sinh trứng của tuyến trùng trong điều kiện in vitro. Hai chủng ngoài tự nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 được phân lập từ đất trong tại công viên trung tâm của thành phố La Plata và trên một cánh đồng nông nghiệp ở Argentina cho thấy có khả năng ký sinh trên trứng của T. cannis. Theo kết quả thực nghiệm của tác giả thì tỷ lệ ký sinh trứng T. cannis của 2 chủng tuyến trùng nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 lần lượt là 65,6% và 63,2%. Đồng thời, theo Fransen (1990) và Lacey et al. (1996) vi nấm là tác nhân sinh học duy nhất ký sinh trên cơ thể bọ phấn trắng và một trong số đó có loài Paecilomyces spp. Khi một bào tử của Paecilomyces spp. nằm trong đất tìm thấy được kí chủ nhất định, nó sẽ tiết ra hệ enzyme để xuyên qua lớp da ngoài của côn trùng. Paecilomyces spp. cũng có thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua lỗ thở, hậu môn và cả đường miệng. Sau đó phát triển thành các ống mầm và hình thành nhiều sợi nấm, sợi nấm có thể lây lan trong lớp dịch giữa các tế bào hay các mô rồi bao phủ cả bên trong và bên ngoài cơ thể côn trùng rồi sinh ra bào tử. Theo nhiều nghiên cứu thì đa phần sự tử vong của côn trùng là do sự cạn kiệt chất dinh dưỡng, phá hoại các mô và các độc tố mà vi nấm tạo ra trong cơ thể côn trùng.
  • 45. Đồ án tốt nghiệp 33 Theo nghiên cứu của Ayhan GOKCE và M. Kubilay ER (2004), Paecilomyces fumoroseus có khả năng ký sinh với giai đoạn nhộng của bọ phấn và tỷ lệ ký sinh lên đến hơn 70% sau 6 ngày gây nhiễm. Còn theo Claire Vidal et al. (1998), điều kiện thích hợp cho sự xâm nhiễm của Paecilomyces fumosoroseus với ký chủ tối ưu ở điều kiện nhiệt độ từ 22-330 C và độ ẩm từ 68% - 100% ( với tỷ lệ ký sinh là trên 70% sau một tuần gây nhiễm).
  • 46. Đồ án tốt nghiệp 34 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ ngày 7/4 đến ngày 13/7 tại phòng thí nghiệm trường Đại Học Công Nghệ TPHCM. 2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Thiết bị - hóa chất 2.2.1.1 Thiết bị − Nồi hấp khử trùng − Que cấy điểm − Đèn cồn − Ống nghiệm − Kính hiển vi quang học − Dao cấy − Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm − Đĩa petri − Micropipet − Erlen 2.2.1.2 Hóa chất − Dịch TCA 5% − Lugol − Tween 80 − Cồn 960 , 700 − Methylene blue − Lactocotton phenol blue − MgSO4.7H2O − K2HPO4 − KNO3 − NaCl
  • 47. Đồ án tốt nghiệp 35 − FeSO4.7H2O − Glucose − Pepton − NaNO3 − KCl − CaCl2 2.2.2. Vật liệu − Mẫu nấm được phân lập từ chế phẩm sinh học được người dân bón vào đất. − Mẫu bọ phấn thu được từ vườn của nhà dân quận Bình Tân. − Tuyến trùng cái từ Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM 2.2.3. Các môi trường sử dụng 2.2.3.1 Môi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar) D-glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Cách chuẩn bị dịch chiết khoai tây: Cân 200 g khoai tây đã được gọt vỏ, sau đó thái nhỏ thành hình vuông. Đong vào cốc thủy tinh 1 lít nước cất, thêm khoai tây đã thái ở trên vào đun sôi trong 20 phút. Để nguội, dùng bông thấm nước lọc phần dịch, gạn bỏ phần xác khoai tây thu được dịch chiết khoai tây. Sau đó đem bảo quản lạnh ở 40 C. 2.2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương, 2000 -2001) Cơ chất: 1 % MgSO4.7H2O 3 g/l K2HPO4 3 g/l KNO3 1 g/l NaCl 0,5 g/l FeSO4.7H2O 0,01 g/l Agar 15 g
  • 48. Đồ án tốt nghiệp 36 Chloramphenicol 0,1 g/l 2.2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất Glucose 40 g/l Pepton 15 g/l KH2PO4 1 g/l MgSO4.7H2O 1 g/l Agar 20 g/l 2.2.3.4 Môi trường Czapeck - Dox Glucose 1 % NaNO3 3,5 g/l K2HPO4 1,5 g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/l KCl 0,5 g/l FeSO4.7H2O 0,01 g/l Agar 20 g/l 2.2.3.5 Môi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Chuẩn bị dịch chiết malt: Lấy 250g malt nghiền nhỏ, hòa vào 1 lít nước cất. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều và gia nhiệt từ từ, có khuấy, đến 45 - 500 C, giữ ở nhiệt độ này 30 phút. Sau đó, nâng nhiệt độ lên 65 - 680 C, có khuấy, giữ ở nhiệt độ này cho đến khi quá trình đường hóa xảy ra hoàn toàn (kết quả là không thấy màu xanh xuất hiện khi thử dịch cháo với dung dịch lugol). Lọc tách bã qua vải thô hoặc bông thấm nước, đem hấp phần dịch trong 1210 C, 30 phút, lấy ra để lắng. Lọc tách hết tủa lần nữa, pha loãng để dịch có hàm lượng chất khô hòa tan khoảng 6 - 8 độ Brix. Thêm 2% agar vào dịch chiết malt, đun khuấy đều cho đến khi agar tan hết. Phối môi trường vào các dụng cụ chứa, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210 C, 15 phút.
  • 49. Đồ án tốt nghiệp 37 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. 2.3.1.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ chế phẩm Thực hiện: Cân 1 gam chế phẩm rồi đổ vào erlen có chứa 100ml nước cất vô trùng và 1% đường glucose. Tiến hành tăng sinh chế phẩm trong máy lắc, 150 vòng/phút trong 24 giờ. Sau khi lắc tăng sinh, dùng micropipet 1000µl và đầu típ đã khử trùng hút 1ml dịch chế phẩm cho vào các ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng đã được chuẩn bị để pha loãng ra thành các nồng độ khác nhau 10-1 , 10-2 , 10-3 , 10-4 , 10-5 ... Tiến hành trang đĩa bằng cách hút 0,1ml dịch pha loãng cho vào đĩa petri có chứa môi trường PDA (G. Gayathri, 2010). Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Dùng que cấy trang bằng thủy tinh để trang đến khi khô dịch chế phẩm. Hình 2.1. Chế phẩm xử lý đất 2.3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ bọ phấn trắng Thực hiện: Thu bọ phấn trắng trên đồng và đem về nuôi trên lá chuối, cuống lá được quấn bằng bông hút ẩm để giữ lá tươi, không bị héo. Hằng ngày quan sát và thu bọ phấn bị chết. Các cá thể bọ phấn bị chết được cho vào đĩa petri có đặt giấy hút ẩm. Tiến hành thu thập cá thể bị chết và được bao bọc bởi sợi nấm màu trắng. Sau đó tiến hành phân lập nấm ký sinh trên môi trường PDA theo phương pháp của Lawrence (1997).
  • 50. Đồ án tốt nghiệp 38 Hình 2.2. Các lọ thủy tinh dùng để bố trí thí nghiệm 2.3.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của Peacilomyces spp. Các dòng vi nấm có khả năng ký sinh tuyến trùng và bọ phấn trắng đều nhờ hoạt động của các enzyme ngoại bào như: chitinase và protease. Do vậy, để đảm bảo chủng nấm Paecilomyces có khả năng ký sinh với tuyến trùng phải tiến hành định tính hệ enzyme chitinase, protase trên môi trường cảm ứng. 2.3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme chitinase Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung chitin 1% làm chất cảm ứng, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn là N-acetyl- D-glucosamine. Các dạng đơn phân này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol. Do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt bao quanh nấmphản ảnh khả năng sinh tổng hợp chitinase. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase, hấp khử trùng ở 1210 C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 1210 C trong 15 phút, cho môi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ Lugol đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm. 2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme protease Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung casein 1% , nấm sợi sẽ sinh enzyme protease phân giải casein thành các amino acid. Các dạng
  • 51. Đồ án tốt nghiệp 39 amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 5%, chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 5%. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease, hấp khử trùng ở 1210 C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 1210 C trong 15 phút, cho môi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho thuốc thử TCA 5% vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ thuốc thử đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm. 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của của nấm 2.3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces Nguyên tắc: Tùy thuộc vào pH khác nhau mà sự tăng trưởng của nấm cũng thay đổi. Sự thay đổi của pH tức là sự thay đổi của ion H+ có trong môi trường sẽ làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, điều này làm ảnh hưởng khả năng thẩm thấu của tế bào vi sinh đối với những ion nhất định; làm thay đổi trạng thái điện ly các phân tử của chất dinh dưỡng, từ đó làm giảm khả năng sử dụng dinh dưỡng của vi sinh vật. Bên cạnh đó, pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme có mặt trên thành tế bào. Điều này, quyết định đến sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường.Paecilomyces spp. thường được phân lập từ đất hay côn trùng nên pH thường là pH hơi acid. Tiến hành khảo sát ở các pH: 5, 6, 7, 8 công thức cụ thể như sau: Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: pH 5 Công thức 2: pH 6 Công thức 3: pH 7 Công thức 4: pH 8 Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA. Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa.
  • 52. Đồ án tốt nghiệp 40 Thực hiện: Môi trường được khử trùng ở 1210 C trong 15 phút, sau đó đổ môi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm có đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250 C ± 20 C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi: − Đường kính tản nấm (cm): 2 ngày/lần ngày đo sự phát triển của nấm bằng cách lấy trung bình đường kính trên hai trục của khuẩn lạc theo công thức: d = (d1+ d2)/2 Trong đó: d1, d2 là độ dài hai đường chéo phần khuẩn lạc phân bố Thời gian theo dõi: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ngày sau khi cấy. − Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): trung bình của 3 lần đo đường kính nấm từ 6 - 8; 8 - 10; 10 - 12 ngày sau nuôi cấy. Sau đó so sánh và nhận xét ở giá trị pH nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt hơn cả. 2.3.3.2. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các môi trường khác nhau Nguyên tắc: Trong quá trình phát triển nấm cần nhiều chất dinh dưỡng. Tùy vào từng môi trường nuôi cấy khác nhau mà nấm sẽ có tốc độ sinh trưởng khác nhau, do đó tiến hành khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các môi trường: PDA, Malt agar, Czapeck – dox agar, Sabouraud agar. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: môi trường PDA Công thức 2: môi trường Malt agar Công thức 3: môi trường Czapeck - Dox Công thức 4: môi trường Sabouraud agar Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA, Malt agar, Czapeck – dox agar, Sabouraud agar với 3 lần lặp lại cho mỗi môi trường. Môi trường được khử trùng ở 1210 C trong 15 phút, sau đó đổ môi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm có đường
  • 53. Đồ án tốt nghiệp 41 kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250 C ± 20 C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi được thực hiện tương tự như mục 2.3.3.1. Sau đó so sánh và nhận xét ở môi trường nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt hơn cả. 2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. Nguyên tắc: Thực hiện theo phương pháp Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết (2006). Mỗi loài Paecilomyces spp. khác nhau thì sống ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau. Do vậy, tiến hành khảo sát chế độ chiếu sáng: 12 giờ sáng/12 giờ tối và tối liên tục và theo dõi, đánh giá sự phát triển của nấm. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: điều kiện 12h sáng/12h tối Công thức 2: điều kiện tối liên tục Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA với 3 lần lặp lại cho mỗi điều kiện chiếu sáng - Môi trường được khử trùng ở 1210 C trong 15 phút, sau đó đổ môi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm có đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250 C ± 20 C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi thực hiện tương tự mục 2.2.3.1. Sau đó so sánh và nhận xét ở điều kiện chiếu sáng nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt hơn cả. 2.3.4. Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2. Thực hiện: Theo phương pháp của Ayhan GÖKÇE và M. Kubilay ER. (2004), các cá thể bọ phấn trắng trưởng thành nằm trên lá thu thập được ngoài tự nhiên được bỏ vào 6 hộp thủy tinh có nắp đậy bằng lưới. Sau đó, hút 1ml phân NPK vào bông thấm nước quấn trên cuống lá giúp lá tươi lâu hơn. Tiến hành phun 10ml
  • 54. Đồ án tốt nghiệp 42 dịch huyền phù bào tử nấm có nồng độ 108 vào các hộp đã chuẩn bị. Mẫu đối chứng được phun bằng nước cất. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: Mỗi lọ thủy tinh cho vào 30 cá thể bọ phấn và phun 10ml dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces có nồng độ 108 vào. Công thức 2: Mỗi lọ thủy tinh cho vào 30 cá thể bọ phấn và phun 10ml nước cất vào. Mỗi công thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 lọ thủy tinh. 2.3.5. Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. Thực hiện: Dùng micropipet hút môi trường PDA đã khử trùng vào đĩa petri. Sau đó, cấy nấm Paecilomyces spp. vào môi trường đã hút. 3 ngày sau khi cấy, cho 5 tuyến trùng vào xung quanh mép tản nấm đã cấy. Sau đó quan sát qua các ngày để theo dõi sự ký sinh của Paecilomyces spp. đến tuyến trùng. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Công thức 1: Mẫu đối chứng không cấy nấm sau 3 ngày cho tuyến trùng vào. Công thức 2: Mẫu thí nghiệm có cấy nấm sau sau 3 ngày cho tuyến trùng vào. Mỗi công thức lặp lại 2 lần, mỗi lần 1 đĩa. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Dùng phần mềm Statgraphic và Excel 2007 để xử lý số liệu có được. Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong Statgraphis theo trình tự: - Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu - So sánh các tham số đặc trưng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu. Phép phân tích phương sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 95%.
  • 55. Đồ án tốt nghiệp 43 - Hiệu lực phòng trừ của nấm Paecilomyces được tính theo công thức Abbot (1925): Ca- Ta M (%) = --------------- x 100 Ca Trong đó: Ca là số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm Ta là số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau thí nghiệm
  • 56. Đồ án tốt nghiệp 44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập nấm 3.1.1. Phân lập nấm có nguồn gốc từ chế phẩm xử lý đất Việc phân lập nấm Paecilomyces từ trong chế phẩm được tiến hành ở các nồng độ pha loãng khác nhau 10-1 , 10-2 , 10-3 , 10-4 . Kết quả cho thấy, có sự xuất hiện của chủng nấm Paecilomyces trong chế phẩm xử lý đất. Cụ thể, khi pha loãng và cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường PDA, sau 3 ngày nuôi cấy, trên đĩa xuất hiện các tản nấm ban đầu có màu trắng, xốp sau chuyển dần sang màu tím nhạt rồi tới tím đậm. Đặc điểm này trùng với mô tả của Bùi Xuân Đồng và cộng sự (2002) nên được tạm gọi là Paecilomyces sp1. Tuy nhiên, để khẳng định, cần phải có sự theo dõi về các đặc điểm đại thể, vi thể và một số chỉ tiêu sinh hóa của chủng nấm phân lâp được. Hình 3.1. Dịch chế phẩm được trang ra đĩa PDA ở nồng độ pha loãng 10-4 vào ngày thứ 3.
  • 57. Đồ án tốt nghiệp 45 3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces sp2. Từ những cá thể bọ phấn trắng nghi ngờ bị chết do nhiễm nấm Paecilomyces, sinh viên đã tiến hành phân lập và cho những kết quả sau: Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA đã xuất hiện tản nấm có màu trắng xốp sang màu hồng rồi màu hồng tím. Đặc điểm đại thể này theo mô tả của Bùi Xuân Đồng và cộng sự (2002) là chi Paecilomyces. Vì thế, sinh viên tạm gọi chủng nấm này là Paecilomyces sp2. Hình 3.2. Nấm nghi ngờ mọc lên từ bọ phấn trên môi trường PDA.