Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT BỌ PHẤN TRẮNG
BEMISIA TABACI VÀ RỆP APHIS GOSSYPII CỦA NẤM
PAECILOMYCES LILACINUS
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI
Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ XUÂN HƯƠNG
MSSV: 1151110153 Lớp: 11DSH04
TP. Hồ Chí Minh, 2015

2. LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và
kết quả trong Đồ án là trung thực. Mọi thông tin trích dẫn trong Đồ án đều
được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan
này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Xuân Hương

3. LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học
Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn
thành tốt khóa học 2011 – 2015.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cô trong khoa Công nghệ
sinh học, Thực phẩm và Môi trường đã giảng dạy em trong bốn năm qua, những
kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học sẽ là hành trang giúp em vững
bước trong tương lai.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị Hai người đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình
thực hiện đồ án tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Huỳnh Văn Thành, cán bộ phòng thí nghiệm
Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để em có thể
hoàn thành tốt đồ án.
Em xin cảm ơn các anh chị phòng vi sinh Khu Nông Nghiệp Công Nghệ Cao
TPHCM đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án.
Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn trong phòng thí nghiệm vi sinh, đặc
biệt là bạn Huỳnh Thị Ngọc Trâm đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ cùng em trải qua
những khó khăn trong quá trình thực hiện đồ án.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đặc biệt là ba mẹ
đã luôn bên cạnh, cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn
thành tốt Đồ án tốt nghiệp này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Xuân Hương

4. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC.................................................................................................................. i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.................................................................................. iv
DANH MỤC BẢNG..................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ẢNH....................................................................................... vi
LỜI MỞ ĐẦU............................................................................................................1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN......................................................................................3
1. 1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces .................................................3
1.1.1. Phân loại khoa học ....................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh thái.....................................................................................4
1.1.3. Đặc điểm hình thái ....................................................................................4
1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp............................................................6
1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ ..7
1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập........................................9
1.3. Một số thành tựu và ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn
đời sống. ...............................................................................................................13
1.3.1. Sản xuất enzyme .....................................................................................14
1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp................................................15
1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật ...............................................................16
1.3.4. Xứ lý môi trường.....................................................................................16
1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp. ....................................................17
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp......17
1.6. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phòng trừ bọ phấn
và các côn trùng chích hút khác. .......................................................................19

5. Đồ án tốt nghiệp
ii
1.6.1. Tổng quan về bọ phấn trắng....................................................................19
1.6.2. Tổng quan về rệp.....................................................................................25
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................30
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..............................................................30
2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu ....................................................30
2.2.1. Thiết bị - hóa chất ...................................................................................30
2.2.2. Vật liệu....................................................................................................31
2.2.3. Các môi trường sử dụng..........................................................................31
2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................34
2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus .....................................................34
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của
nấm Paecilomyces lilacinus..............................................................................37
2.3.3. Định tính khả năng sinh enzyme protease của nấm Paecilomyces
lilacinus.............................................................................................................41
2.3.4. Đánh giá khả năng gây chết của bọ phấn và rệp của nấm Paecilomyces
lilacinus.............................................................................................................41
2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm
Paecilomyces lilacinus......................................................................................43
2.4 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................47
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................48
3.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus .........................................................48
3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của
nấm Paecilomyces lilacinus.................................................................................51
3.2.1. Khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus trên
môi trường thạch. ..............................................................................................51

6. Đồ án tốt nghiệp
iii
3.2.2. Hoạt tính Chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. ............................53
3.3. Khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus. ..55
3.4. Đánh giá khả năng gây chết côn trùng chích hút của nấm Paecilomyces
lilacinus.................................................................................................................58
3.4.1. Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn Bemisia tabaci của nấm
Paecilomyces lilacinus ......................................................................................58
3.4.2 Đánh giá khả năng gây chết rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces
lilacinus.............................................................................................................60
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của
nấm Paecilomyces lilacinus.................................................................................62
3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces
lilacinus.............................................................................................................62
3.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát
triển của nấm Paecilomyces lilacinus. ..............................................................65
3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm
Paecilomyces lilacinus......................................................................................68
3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sự phát triển của nấm
Paecilomyces lilacinus......................................................................................70
3.5.5. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm
Paecilomyces lilacinus......................................................................................72
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................75
4.1. Kết luận.........................................................................................................75
4.2. Đề nghị...........................................................................................................75
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................76

7. Đồ án tốt nghiệp
iv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CZ: Czapeck - Dox
ĐC: Đối chứng
MA: Malt
NT: Nghiệm thức
PDA: Potato D - Glucose Agar
SA: Sabouraud + KC

8. Đồ án tốt nghiệp
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Paecilomyces lilacinus phân lập
lại sau khi lây nhiễm trên bọ phấn. ...........................................................................49
Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. ..51
Bảng 3.3 Hoạt tính của enzyme chitinase sau 1,2,3,4,5 ngày nuôi cấy....................54
Bảng 3.4 Khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus....56
Bảng 3.5 Số bọ phấn Bemisia tabaci chết ở các ngày sau chủng.............................58
Bảng 3.6 Hiệu lực diệt bọ phấn của nấm Paecilomyces lilacinus............................59
Bảng 3.7 Số rệp Aphis gossypii chết ở các ngày sau chủng .....................................61
Bảng 3.8 Hiệu lực diệt rệp của nấm Pacilomyces lilacinus .....................................61
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces
lilacinus.....................................................................................................................64
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển đường kính nấm
Paecilomyces lilacinus qua các ngày........................................................................66
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển đường kính của
Paecilomyces lilacinus..............................................................................................68
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sự phát triển đường kính của
Paecilomyces lilacinus..............................................................................................71
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm
Paecilomyces lilacinus..............................................................................................73
Bảng 3.14 Tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces lilacinus của một số loại thuốc hóa học.
...................................................................................................................................73

9. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp......................................................5
Hình 1.2 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. ......................................................6
Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin.....................................................7
Hình 1.4 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces variotii............10
Hình 1.5 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces lilacinus..........12
Hình 1.6 Cành bào đài, bào tử của nấm Paecilomyces fumosoroseus .....................12
Hình 1.7 Cành bào đài, bào tử nấm Paecilomyces amoeneroseus...........................13
Hình 1.8 Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng.......................................20
Hình 1.9 Cấu tạo ngoài của rệp ................................................................................25
Hình 1.10 Cấu tạo ngoài của rệp ..............................................................................26
Hình 2.1 Hộp dùng để bố trí thí nghiệm…………………………………………...35
Hình 2.2 Các hộp dùng để đựng rệp bố trí thí nghiệm.............................................42
Hình 3. 1 Nấm phân lập lại từ bọ phấn Bemisia tabaci……………………………48
Hình 3.2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus
(a, b, c, d là vòng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1, 2, 3, 4
NSC)..........................................................................................................................52
Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm
Paecilomyces lilacinus qua 1,2,3,4 NSC ..................................................................52
Hình 3. 4 Hoạt độ enzyme chitinase sau các ngày nuôi cấy ....................................54
Hình 3.5 Sự phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus (a, b, c, d là vòng
phân giải protease của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1, 2, 3, 4 ngày). ................56
Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện sự phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus qua
1,2,3,4 ngày nuôi cấy ................................................................................................57
Hình 3.7 Mẫu bọ phấn không bị kí sinh (a) và mẫu bọ phấn bị kí sinh (b) được soi
bằng kính lúp soi nổi.................................................................................................59
Hình 3. 8 Mẫu bọ phấn không bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học....60
Hình 3. 9 Mẫu rệp không bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học ...........62

10. Đồ án tốt nghiệp
vii
Hình 3.10 Sự phát triển của Paecilomyces lilacinus trên môi trường có pH khác
nhau ở 14 NSC (a: pH5, b: pH6, c: pH7, d: pH8).....................................................63
Hình 3.11 Đường kính nấm Paecilomyces lilacinus ở các pH môi trường 5, 6, 7, 8
qua các ngày nuôi cấy. ..............................................................................................64
Hình 3.12 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 NSC ...................................65
Hình 3.13 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau khi cấy .........................66
Hình 3.14 Tản nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy.................68
Hình 3.15 Sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus ở các điều kiện chiếu sáng
khác nhau...................................................................................................................69
Hình 3.16 Tản nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 NSC.............................70
Hình 3.17 Sự phát triển đường kính của nấm Paecilomyces lilacinus dưới nguồn
Cacbon khác nhau .....................................................................................................71
Hình 3.18 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau khi cấy .........................72

11. Đồ án tốt nghiệp
1
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Rau là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn của người Việt Nam.
Đặc biệt là các loại rau ăn quả họ cà như: cà chua, ớt, cà tím…lại càng được ưa
chuộng vì chứa nhiều dinh dưỡng. Tại thành phố Hồ Chí Minh, diện tích trồng các
cây ăn quả dài ngày như cà chua, ớt, cà tím… chiếm 8- 17% tổng diện tích trồng
rau (Nguồn: Sở Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 2013). Theo Chi cục Bảo vệ
Thực vật thành phố, đây là các loại cây ký chủ chính của bọ phấn trắng. Nguyễn Đỗ
Hoàng Việt (2009) cho biết, bọ phấn trắng Bemisia tabaci xuất hiện rất sớm (chỉ 7
ngày sau khi trồng) và gây hại nặng cho cây cà pháo ở Tây Ninh. Tại các tỉnh ở
miền Bắc Việt Nam, bọ phấn trắng xuất hiện và gây hại cho sản xuất cà chua. Quan
trọng hơn nữa, bọ phấn trắng là vecto duy nhất truyền virus gây bệnh xoăn vàng
ngọn cà chua (Nguyễn Thơ, 1984; Ngô Bích Hào, Hà Viết Cường, 2010) với tỷ
lệ phát bệnh từ 40-100%. Ngoài cây cà chua, virus còn lây nhiễm trên cây ớt
cay, thuốc lá...Bọ phấn là loài đa thực nên số lượng phát triển quanh năm trên
đồng ruộng và việc phòng trừ bọ phấn truyền bệnh gặp nhiều khó khăn.
Tương tự như bọ phấn trắng, rệp Aphis gossypii là côn trùng chích hút nhựa cây phổ
biến nhất trên thế giới. Rệp gây hại trực tiếp và truyền bệnh virus cho nhiều loại cây
trồng.
Biện pháp phòng trừ các loài sâu chích hút này hiện nay chủ yếu là
dùng thuốc hóa học. Tuy nhiên, thuốc hóa học có độc tính rất cao, khó phân hủy
trong điều kiện bình thường, sẽ tích tụ lại trong đất, nước, không khí và các sản
phẩm nông nghiệp, làm ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của
con người, và sinh vật có ích, gây hiện tượng kháng thuốc dẫn tới nguy cơ bùng
phát dịch hại trên nhiều loại cây trồng.
Trong số các tác nhân sinh học, nấm Paecilomyces spp. đang được quan tâm
vì hiệu quả kí sinh cao đối với các loài côn trùng chích hút. Nhiều nước trên thế giới
đã sản xuất sử dụng thành công nhiều loại chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nấm
Paecilomyces spp. để phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng. Tuy nhiên, ở Việt

12. Đồ án tốt nghiệp
2
Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài nấm có ích này vẫn còn khá hạn chế.
Với những lý do trên sinh viên chọn đề tài: “Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn
trắng Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus.”
2. Mục đích nghiên cứu
Xác định khả năng gây chết bọ phấn trắng Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii
của nấm Paecilomyces lilacinus để làm cơ sở ứng dụng chúng trong phòng trừ các
đối tượng này.
3. Nội dung nghiên cứu
 Phân lập lại nấm Paecilomyces lilacinus trên bọ phấn trắng Bemisia tabaci.
 Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm Paecilomyces lilacinus.
 Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của
nấm Paecilomyces lilacinus.
 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces
lilacinus.
 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm
Paecilomyces lilacinus.

13. Đồ án tốt nghiệp
3
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1. 1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces
1.1.1. Phân loại khoa học
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Eurotiomycetes
Bộ: Eurotiales
Họ: Trichocomaceae
Chi: Paecilomyces
Chi Paecilomyces do Bainier mô tả vào 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp
nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Chuyên luận về chi nấm này của
Samson (1974) chấp nhận 16 loài đã mô tả, đồng thời tổ hợp mới 9 loài và đề nghị 6
loài mới, tất cả tập hợp trong 2 nhóm loài. Nhóm loài thứ nhất là nhóm loài
Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling,
Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa
(mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu
khác. Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn
bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng.
Nhiều loài trong nhóm hai này kí sinh gây bệnh côn trùng (Samson R.A.,1974).
Đến năm 2004, dựa trên các kỹ thuật phương tiện hiện đại các loài trong chi
Paecilomyces được Samson R.A. hệ thống lại với 26 loài. Năm 2005 nhóm tác giả
Liang Z.Q., Y.F., Chu, H.L. và Liu, A. Y. đã tiến hành đề tra và thu thập các nguồn
nấm Paecilomyces tại Trung Quốc. Kết quả điều tra thu thập đã phát hiện ra một số
loài mới như Paecilomyces cylindricosporus sp. nov, Paecilomyces gunnii Z. Q.
Liang, v.v. Các loài này được thu thập từ đất và xác côn trùng bị nấm ký sinh tại
vùng cao của tỉnh Hồ Bắc. Cùng với các loài đã được ghi nhận trước đó, nhóm tác
giả đã xây dựng khóa định loại của 28 loài trong chi Paecilomyces thu thập tại
Trung Quốc.

14. Đồ án tốt nghiệp
4
1.1.2. Đặc điểm sinh thái
Nấm Paecilomyces spp. sinh sống trong đất, trong xác bã thực vật, trong thức
ăn, giấy…Một số loài được phân lập trên côn trùng ngủ nghỉ trong đất (theo trích
dẫn Trần Ngọc Mai,2009). Trên thế giới có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng
rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp.
dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ, và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa
thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên.
Chi Paecilomyces có nhiều loài nhưng chủ yếu là hai loài Paecilomyces lilacinus và
Paecilomyce variotii. Một vài loài Paecilomyces spp. có khả năng chịu nhiệt như:
nhiệt độ tối ưu của Paecilomyces fulvus là 450
C, Paecilomyces crustaceous là dưới
550
C (Samson, 1974). Hai loài nấm chịu nhiệt trên có khả năng làm hư hỏng thực
phẩm nhưng cũng là loài quan trọng ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các
enzyme chịu nhiệt. Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài Paecilomyces
đem lại nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích (Liang et al., 2003) . Một số
loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:
 Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng.
 Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất.
 Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng.
 Paecilomyces lilacinus phân lập được từ xác bã hữu cơ, trứng tuyến trùng và
đôi khi còn ở côn trùng chết, rừng cao su. (Crop Protection Compennium,
2002).
1.1.3. Đặc điểm hình thái
1.1.3.1. Đặc điểm đại thể
Paecilomyces spp. là loại nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác côn trùng.
Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, có
dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đó khi bào tử
phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường

15. Đồ án tốt nghiệp
5
được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng sẫm. Sợi
nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Khuẩn lạc thường
mọc toả tròn, mép khuẩn lạc trơn nhẵn hoặc có răng cưa. Khuẩn lạc kết chặt tạo
thành các cột bào tử đính theo các vòng tròn đồng tâm quanh điểm cấy. Theo kết
quả nghiên cứu của một số tác giả như Barnett và Barry (1972), Lawrence (1994),
De Hoog (1972), Luangsa – Ard et al. (2006) thì ngoài đặc điểm khuẩn lạc, và kích
thước cơ quan sinh bào tử, hình dạng và kích thước của bào tử là những chỉ tiêu cơ
bản để phân biệt và định danh các loài khác nhau của Paecilomyces.
.
Hình 1. 1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp.
(Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp)
1.1.3.2. Đặc điểm vi thể
Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, nhẵn kích thước 4-7 x 30 -120 µm, mức
độ phân nhánh của nấm phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bào tử bình
thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều, ở đỉnh có nhiều thể bình mọc
thành cụm vòng, thể bình có chiều dài 2-7µm, phân gốc phình to hình elip, phần cổ
hình trụ dài. Phần đỉnh thể bình lần lượt kéo dài phân chia thành các bào tử phân
sinh một tế bào hình trứng kích thước 2.5-4 x 3.5 -5 µm . Bào tử phân sinh đơn bào,

16. Đồ án tốt nghiệp
6
không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Đỗ Thị Hồng,
2007).
Hình 1. 2 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp.
(Nguồn: http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2012_06_01_archive.html)
1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp.
Độc tố chính của nấm Paecilomyces spp. là paecilotoxin (leucinostatins), là
một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ
phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và
amine ở đầu C. Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S) - N- [(1S) - 1 - [[(1S) - 1-
[[(1S)-1-[2[2- (3 - arbamoyl - propylcarbomoyl) - propan- 2ylcarbamoyl]propan - 2-
ylcarbamoy]-3-methylbutylcarbomoy]-3-methyl-butyl] carbomoyl] propan-2-
ycarbomoyl] - 2 - hydroxy - 3 - methyl - butyl] - carbomyl] - 5 - hydroxyl -3methyl
- 7oxo-nonyl ] - 4 - methyl - 1 - [(E,4S) - 4 - methylhex – 2 - enoyl-pyrrolidin-2-
carboxamide. (Nevalainen Helena, 1977).
Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi
chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng loài
khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin,
viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hoá thứ
cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng.

17. Đồ án tốt nghiệp
7
Hình 1. 3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin.
1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ
Chu kỳ sống của Paecilomyces spp. có thể chia làm 3 giai đoạn: đầu tiên các
bào tử sẽ tiếp xúc với côn trùng qua lớp vỏ và lớp chân lông. Các bào tử bám vào
lớp vỏ của côn trùng, nảy mầm và phát triển một ống mầm trong 8 - 16 giờ. Ống
mầm phát triển dưới dạng một vòi bám xuyên qua biểu bì côn trùng và đi vào trong
xoang máu. Vòi bám là một tế bào có kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, có dịch nhầy
để bám vào vỏ côn trùng. Sự xâm nhập của nấm đạt được bằng cách tiết ra hỗn hợp
enzyme bao gồm chitinase, protease và áp lực cơ học. Sau khi tế bào đơn nảy mầm,
bào tử sẽ xâm nhập và lưu thông trong xoang máu của côn trùng, nhân lên, và sử
dụng chất dự trữ trong cơ thể côn trùng để sinh trưởng và sinh sản. Các sợi nấm
phân nhánh tạo thành một mạng lưới chằng chịt trong cơ thể côn trùng.
Paecilomyces spp. sản sinh ra các hợp chất, phá bỏ hệ thống miễn dịch của côn
trùng, cạnh tranh với các vi sinh vật tiềm tàng, giết chết vật chủ trong 7 - 14 ngày.
Cuối cùng sau khi ký chủ chết, nấm sẽ lan ra khỏi biểu bì rồi bao lấy cơ thể của côn
trùng và phát triển thành đảm bào tử. Khi gặp điều kiện phù hợp sẽ sản sinh ra bào
tử, bào tử sẽ được phát tán rồi lây nhiễm cho các vi sinh vật khác. Tuy nhiên, chu
kỳ sống được hoàn thành trong điều kiện phải thích hợp, trong khoảng 48 - 72 giờ
và không có sự có mặt của vi sinh vật hoại sinh.

18. Đồ án tốt nghiệp
8
Thông thường đối với các loại bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn hay do virus
thì chúng lây truyền thông qua đường ruột hay đường thức ăn, nhưng đối với nguồn
bệnh là vi nấm thì chủ yếu là do sự tiếp xúc trực tiếp hay qua trung gian truyền
bệnh. Trung gian đó có thể là những loài ký sinh hay côn trùng ăn thịt.
Nấm Paecilomyces spp. tấn công vào xoang máu của bọ phấn thông qua lớp
biểu bì hoặc đường miệng. Bọ phấn chết là sự kết hợp của nhiều yếu tố như tổn
thương mô cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do
nấm tiết ra khi ở trong cơ thể côn trùng.
Quá trình bám của bào tử nấm vào cơ thể của côn trùng là một quá trình thụ
động nhờ gió và nước. Đầu tiên bào tử của nấm sẽ bám lên thành biểu bì. Bào tử
của nấm có một lớp bên ngoài là bó sợi đan xen là các đuôi kị nước. Độ bám dính
của bào tử trên bề mặt biểu bì một phần là nhờ các đuôi kị nước. Lectins, một loại
cacborhydrate glycoprotein được phát hiện có trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề
mặt biểu bì côn trùng dễ hơn. Khi đạt tới điều kiện thích hợp bào tử sẽ nảy mầm và
tăng trưởng nhanh chóng với sự tác động của các điều kiện sẵn có của nước, chất
dinh dưỡng, oxy cũng như pH, nhiệt độ và bởi sự tác động của hợp chất độc tố trên
bề mặt côn trùng. Nấm nảy mầm trong phạm vi có đủ nguồn Carbon và Nitơ.
Nấm xâm nhập vào côn trùng bằng quá trình lây nhiễm, xâm nhập qua lớp
biểu bì hay tạo áp lực cơ học nhờ giác bám. Lớp biểu bì của côn trùng có hai lớp:
ngoài là epicuticle và trong là procuticle. Epicuticle có cấu trúc phức tạp là một lớp
mỏng không có chitin nhưng chứa protein, phenol ổn định và được bao phủ bởi một
lớp sáp có chứa acid béo, lipid, sterol. Các procuticle phần lớn có các sợi chitin bên
trong hỗn hợp protein, lipid, quinon. Nấm cần xuyên qua lớp biểu bì vào cơ thể côn
trùng để có thể lấy được chất dinh dưỡng cần cho sự tăng trưởng và sinh sản. Sự
xâm nhập vào cơ thể côn trùng bao gồm cả sự phân hủy của enzyme do nấm tiết ra
và nhờ áp lực cơ học.
Khởi đầu cho quá trình xâm nhiễm, nấm xâm nhập tại những vị trí dễ bị tổn
thương trên lớp biểu bì. Nấm sẽ xuyên qua lớp biểu bì ngoài nhờ áp lực cơ học. Bào
tử nảy mầm và hình thành các giác bám trên bề mặt biểu bì. Giác bám là đầu tận

19. Đồ án tốt nghiệp
9
cùng của ống mầm phát sinh từ bào tử. Giác bám gắn vào biểu bì côn trùng là nhờ
tương tác kị nước giữa các thành bào tử và các lipid nằm trong lớp biểu bì trên. Sau
đó, ống mầm xuyên qua lớp biểu bì dưới, nội bì rồi vào xoang máu. Các nghiên cứu
còn cho thấy có sự tham gia của các chất truyền tin nội bào như Ca2+
và cAMP
(cyclicadenosine monophosphate) trong sự hình thành giác bám trong trường hợp
khi lớp biểu bì cứng khó xuyên qua. Sau khi xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng,
nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn. Những sợi nấm này được phân tán khắp
cơ thể theo dịch máu, chúng tiêu diệt dần các tế bào bạch huyết.
Sau đó, sợi nấm xâm nhập mô, phá hủy tất cả các tế bào bạch huyết rồi làm
chết vật chủ. Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm
giảm tác dụng oxy hóa khử lympo trong máu. Do nấm sinh sản nhiều sẽ làm tắc hệ
tuần hoàn của côn trùng, làm côn trùng biếng ăn, đồng thời chất độc sinh ra làm
thay đổi sinh hóa của cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đó làm rối loạn và mất chức
năng sinh lý. Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục hoại sinh cơ thể côn trùng rồi phát
triển sợi nấm ra toàn bộ cơ thể côn trùng và hình thành bào tử.
Quá trình xâm nhập vào cơ thể côn trùng còn nhờ vào sự hỗ trợ mạnh mẽ của
các enzyme và hệ enzyme. Một loạt các loại enzyme ngoại bào có thể thủy phân các
thành phần chính của lớp biểu bì côn trùng như chitinase, lipase, esterase,
lipoxygenase và ít nhất bốn loại protease khác nhau đã được ghi nhận có vai trò
quan trọng trong việc xâm nhiễm. Do cấu trúc phức tạp của lớp biểu bì côn trùng
nên cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme khác nhau. Trong đó, chitanase
và endoprotease là hai enzyme giữ vai trò quan trọng nhất.
1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập
Xếp theo hệ thống phân loại nấm của Anisworth, 1966, 1970, 1971, Mccoy
và ctv (1988), Samson và ctv (1988) đã cho rằng Paecilomyces spp. thuộc ngành
phụ lớp nấm bất toàn Deueromycetes, giống Paecilomyces. Có rất nhiều loài trên
thế giới, khoảng 31 loài phân bố trê diện rộng trong đó có thể kể đến là

20. Đồ án tốt nghiệp
10
Paecilomyces farinosus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae,
Paecilomyces lilacinus,… (trích dẫn bởi Nguyễn Phước Vĩnh, 2008)
 Paecilomyces vatiotii Bainier (1907)
Khuẩn lạc phát triển rất nhanh, có màu vàng nâu hoặc vàng đất. Cuống bào
tử đính mọc rậm rạp. Thể bình có hình trụ hoặc elip. Bào tử có dạng hình cầu, elip,
hình thoi, màu sắc từ trong suốt đến vàng, bề mặt trơn láng, kích thước 3 -5 x 2 4
µm, hình thành từ chuỗi phân ly dài. Hậu bào tử thường hiện diện đơn lẻ hay trong
một chuỗi ngăn, màu nâu, có hình dạng từ hình cầu đến hình quả lê, đường kính 4 -
8 µm (theo trích dẫn của Domsch, Gam và Anderson,1980)
Hình 1. 4 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces variotii
Nguồn: (http://www.cbs.knaw.nl/publications/1006/content_files/sim6fig1.jpg)
 Paecilomyces lilacinus
Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này
được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru.
Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn
trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở
nhiệt độ phòng 270
C ± 20
C. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu
hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số
lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở
phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975).

21. Đồ án tốt nghiệp
11
Trong nghiên cứu của Eng (2001), có 82,9% trong số 41 nông trại được khảo
sát ở Sarawalk có sự hiện diện của P.lilacinus, mặc dù người ta đã sử dụng các loại
thuốc diệt nấm. Từ đó có thể nhận thấy P.lilacinus có khả năng thích ứng cao với
điều kiện sống, có phạm vi thích ứng rộng và có khả năng phát triển tốt ở 26 –
300
C.
Theo Fransen (1990) và Lacey et al. (1996) vi nấm là tác nhân sinh học duy
nhất ký sinh trên cơ thể bọ phấn trắng và một trong số đó có loài Paecilomyces
lilacinus. Khi một bào tử của Paecilomyces lilacinus nằm trong đất tìm thấy được kí
chủ nhất định, nó sẽ tiết ra hệ enzyme để xuyên qua lớp da ngoài của côn trùng.
Paecilomyces lilacinus cũng có thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua lỗ thở, hậu
môn và cả đường miệng. Sau đó phát triển thành các ống mầm và hình thành nhiều
sợi nấm, sợi nấm có thể lây lan trong lớp dịch giữa các tế bào hay các mô rồi bao
phủ cả bên trong và bên ngoài cơ thể côn trùng rồi sinh ra bào tử. Theo nhiều
nghiên cứu thì đa phần sự tử vong của côn trùng là do sự cạn kiệt chất dinh dưỡng,
phá hoại các mô và các độc tố mà vi nấm tạo ra trong cơ thể côn trùng.
Một báo cáo gần đây của Gortari et al. (2008) thì Paecilomyces lilacinus là
một loài vi nấm có khả năng ký sinh trứng của tuyến trùng trong điều kiện in vitro.
Hai chủng ngoài tự nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 được
phân lập từ đất trong tại công viên trung tâm của thành phố La Plata và trên một
cánh đồng nông nghiệp ở Argentina cho thấy có khả năng ký sinh trên trứng của T.
cannis. Theo kết quả thực nghiệm của tác giả thì tỷ lệ ký sinh trứng T. cannis của 2
chủng tuyến trùng nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 lần
lượt là 65,6% và 63,2%.

22. Đồ án tốt nghiệp
12
Hình 1. 5 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces lilacinus
Nguồn: (http://www.cbs.knaw.nl/publications/1006/content_files/content.htm)
 Paecilomyces fumosoroseus Wize
Khuẩn lạc phát triển tương đối trên môi trường Malt – Agar, có đường kính
khoảng 4cm sau 14 ngày ở 250
C, ban đầu màu trắng, sau đó chuyển sang màu hồng
đậm. Sợi nấm trong suốt, bề mặt trơn láng, rộng 1.5 – 3.5 µm. Cuốn bào tử đính
mọc thẳng đứng từ bên dưới chất nền hoặc từ sợi nấm, chiều dài tối đa khoảng
100µm, rộng 1,5 - 2µm, bên trên có từ 4 đến 6 thể bình với kích thước 5.7 – 8 x 1 -
2µm. Bào tử có dạng hình trụ hoặc hình thoi , bề mặt trơn láng, có màu biến đổi từ
trong suốt đến hồng, kích thước 3 – 4 x 1 -2 µm (theo trích dẫn của Domsch, Gam
và Anderson, 1980).
Hình 1. 6 Cành bào đài, bào tử của nấm Paecilomyces fumosoroseus
(http://www.cbs.knaw.nl/publications/1006/content_files/sim6fig13.jpg)

23. Đồ án tốt nghiệp
13
 Paecilomyces amoeneroseus P.Henn
Khuẩn lạc phát triển rất chậm trên môi trường Malt – Agar, chỉ đạt khoảng
2,5 - 3cm sau 14 ngày ở 250
C. sợi khuẩn ty từ trong suốt đến đỏ, rộng từ 1,5 – 2,5
µm bao gồm những nhánh phức tạp có nhiều vòng xoắn chứa 2 – thể bình. Bào tử
nhỏ 2,5 – 3,5 x 1,7 – 2,2 µm, có dạng hình cầu, elip, thỉnh thoảng có xuất hiện hình
trụ, trong suốt, bề mặt trơn láng (theo trích dẫn của Domsch, Gam và Anderson,
1980)
Hình 1. 7 Cành bào đài, bào tử nấm Paecilomyces amoeneroseus
Nguồn: (http://www.cbs.knaw.nl/publications/1006/content_files/sim6fig12.jpg)
1.3. Một số thành tựu và ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn
đời sống.
– Nấm Paecilomyces spp. gây bệnh cho các loài côn trùng thuộc bộ
cánh vảy thường gây dịch bệnh trên ruộng đậu. Nấm Paecilomyces spp. còn được
sử dụng để diệt sâu đo Trichoplusia ni, sâu xanh Spodoptera frugiperda, sâu ăn tạp
Spodoptera litura (Yoshinori Tanada và Harry K. Kaya,1993). Nấm Paecilomyces
spp. có hiệu quả cao đối với việc phòng trị sâu do có độc tố gọi là Mycotoxin. Ở Ấn
Độ, các nhà khoa học đã chứng minh được nếu sử dụng nấm Paecilomyces spp. với
nồng độ 108
bào tử.ml-1
chủng vào sâu non, sâu non sẽ chết sau 6-8 ngày. Khi chết
xác sâu sẽ bị khô lại, sau đó nấm sẽ phát triển và cơ thể của sâu sẽ bị bao phủ bởi
lớp nấm màu xanh (Vimala Devi, P.S. 1994). Ngoài ra, người ta còn sử dụng nấm

24. Đồ án tốt nghiệp
14
Paecilomyces spp. để phòng trừ sâu hại bông, sâu cuốn lá lúa, sâu đục thân bắp
(Trần Văn Mão, 2002)
– Đến nay Nhật Bản, Mỹ, Ấn Độ và Bỉ đã sản xuất nấm Paecilomyces
fumosoroeus có khả năng thương mại hóa trên thị trường có tên thương mại là
PreFeRal, Priority, Pae – Sin để phòng trừ Rệp Sáp và Rầy mềm. (Yasuhisa
Kunimi,2004 trích dẫn bởi Lê Thị Thanh Thảo,2006).
– Từ năm 2010 đến nay, nhóm nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng –
Viện Bảo Vệ Thực Vật đã tiến hành điều tra, thu thập và phân lập được một số loài
nấm ký sinh tự nhiên trên sâu hại tại các tỉnh phía Bắc và Tây Nguyên. Trên ve sầu
hại cà phê ở Đắk Lak đã xác định được nấm Paecilomyces cicadae (Miquel)
Samson ký sinh trên sâu non.
– Kết quả đánh giá bước đầu cho thấy nấm Paecilomyces spp. đạt hiệu
quả phòng trừ rầy nâu 75-80% trong điều kiện nhà lưới. Nấm Paecilomyces cicadae
có hiệu quả phòng trừ ve sầu hại cà phê đạt từ 50-60% trên đồng ruộng tại Đăk Lăk.
Nấm Paecilomyces sp. có mặt rất phổ biến trên đồng ruộng. Ngoài rầy nâu, chúng
còn ký sinh trên nhiều loài côn trùng khác, giữ vai trò quan trọng trong việc điều
hòa số lượng côn trùng, bảo đảm sự cân bằng của hệ sinh thái. Sử dụng các chế
phẩm sinh học từ các loài nấm ký sinh để hạn chế sử dụng các loại thuốc hóa học
BVTV nhất là các loại thuốc trừ bệnh cây, có ý nghĩa quan trọng nhằm bảo vệ sự đa
dạng sinh học và quản lý dịch hại.
1.3.1. Sản xuất enzyme
Paecilomyces spp. được biết đến như một chủng nấm sản xuất và cung cấp
nguồn enzyme tiềm năng. Paecilomyces spp. tiết ra enzyme để dễ xâm nhập vào ký
chủ hơn và giúp chúng phát triển nhờ thủy phân cơ chất hay thâm chí còn lấn át các
loài vi sinh vật khác phát triển. Đã có nhiều nghiên cứu về sự sản sinh enzyme của
Paecilomyces spp., nhiều nhất là về các enzyme hydrolase: protease, cellulase,
dextranase...

25. Đồ án tốt nghiệp
15
Paecilomyces spp. sinh ra ba loại protease: acid, trung tính và kiềm. Các
protease acid và trung tính có thể ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia và bánh
kẹo. Protease kiềm thì ứng dụng trong công nghiệp thuộc da.
Paecilomyces spp. thuộc nhóm nấm Ascomycetes có mặt trong đất, nước,
không khí, gỗ, tàn dư thực vật, đất… Paecilomyces spp. còn gọi là nấm thối mềm,
vì chúng có khả năng phân hủy cellulose.
Dextranase (α -1,6-D-glucan, 6 glucanohydrolase; EC: 3.2.1.11) có nhiều
ứng dụng trong y học và nền công nghiệp vì nó thủy phân dextran. Sự hiện diện của
dextran có nhiều tác động tiêu cực ở mức độ chế biến như mất sucrose, tăng độ nhớt
của quá trình siro và phục hồi kém của sucrose. Sử dụng dextran sẽ giải quyết được
các vấn đề này. Dextranase có thể thủy phân hay ức chế quá trình tổng hợp glucans,
có thể được sử dụng trong điều trị mảng bám răng. Nó cũng được sử dụng để tạo ra
các dextran có trọng lượng phân tử thấp và gây độc cho tế bào. Hơn nữa, dextranase
có ảnh hưởng tiêu cực đến sự tổng hợp isomaltooligosaccharides, chất ức chế hoạt
động của các cơ chất có lợi cho vi khuẩn đường ruột probiotic. Và loại enzyme này
cũng đã được tiết ra bởi nhiều loài nấm trong đó có nấm Paecilomyces spp.
1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp
Paecilomyces spp. sản xuất các hợp chất thứ cấp. Những nghiên cứu gần
đây đã chỉ ra rằng một số loài Paecilomyces spp. có thể tổng hợp các hợp chất có
hoạt tính sinh học rất hữu ích.
Fingolimod là hợp chất được tổng hợp dựa trên chất chuyển hóa thứ cấp do
nấm tổng hợp là myriocin (ISP-I), là một chất ức chế miễn dịch mạnh đã được phê
duyệt bởi FDA (U.S. Food and Drug Administration) như là một loại thuốc
điều trị mới cho chứng đa sơ cứng. Fingolimod đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên
cứu Tetsuro Fujita ở Đại học Kyoto (1992). ISP-I được thu nhận từ P. cicadae.
Fingolimod có tiềm năng được sử dụng trong liệu pháp ghép cơ quan. Các nhà khoa
học cho rằng nó có thể ngăn ngừa mạnh các phản ứng miễn dịch thông qua trung

26. Đồ án tốt nghiệp
16
gian lympo bào để đáp ứng việc cấy ghép cơ quan mới. Ngoài ra, fingolimod còn
được cho rằng làm tăng tế bào nội mô và bảo vệ chức năng của chúng.
Một chất tương tự như anarcadic acid được tách chiết từ P. variotii. Hợp chất
này lần đầu tiên được cô lập từ nguồn tự nhiên và được đánh giá hoạt tính kháng
khuẩn chống lại các tác nhân gây bệnh cho người bao gồm cả các chủng đa kháng
thuốc MDR (Multidrugresistan).
Paecilomyces farinosus B05 đã được nghiên cứu để tách chiết các thành
phần polysaccharide ngoại bào từ môi trường lên men và sản xuất để ứng dụng vào
sản xuất các chất chống oxy hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các
polysaccharide được chiết xuất từ P. farinosus có hoạt tính chống oxy hóa cao, chỉ
thấp hơn vitamin C một ít.
1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật
Việc sử dụng các vi sinh vật tự nhiên để phòng trừ các dịch hại là một công
việc quan trọng hiện nay trong ngành nông nghiệp vì sự an toàn, thân thiện với môi
trường và hiệu quả cao.
Ở Ai Cập đã sản xuất Priority - một sản phẩm từ P. fumosoroseus để diệt trừ
các loại côn trùng. Đây là thuốc trừ sâu sinh học giúp diệt trừ bướm trắng để bảo vệ
cây cà chua, dưa leo, cây cảnh. Sản phẩm chứa bào tử của chủng nấm
P.fumosoroseus, và được xem là có khả năng lây nhiễm ở tất cả giai đoạn (trứng, ấu
trùng, nhộng, bướm trưởng thành). Ngoài ra trên thị trường còn có một số sản phẩm
như Pelicide, Bio - Nematon, PL Plus chứa bào tử nấm P.lilacinus nhằm phòng trừ
tuyến trùng gây hại cho cây nằm trong đất.
1.3.4. Xứ lý môi trường
Nấm là đối tượng thường được sử dụng trong hệ thống lọc khí sinh học để xử
lý ô nhiễm không khí thông qua việc sử dụng khả năng của nấm để biến đổi các
chất ô nhiễm hữu cơ và vô cơ thành hợp chất ít độc hại hơn.
Formaldehyde là một chất phổ biến và nó là sản phẩm của các nguồn sinh
học và từ môi trường (sinh ra từ nhà máy công nghiệp). Formaldehyde có độc tính

27. Đồ án tốt nghiệp
17
cao do phản ứng không đặc hiệu với protein và nucleic acid, vì thế nó là chất gây ô
nhiễm môi trường.
P. variotii đã được thử nghiệm xử lý formaldehyde do chủng nấm này có
enzyme S - hydroxymethylglutathione dehydrogenase. Enzyme này có tính đặc hiệu
cơ chất rất cao với cơ chất là formaldehyde. Ngoài ra, enzyme alcohol oxidase từ P.
variotii có khả năng làm giảm lượng formaldehyde đáng kể và là tiềm năng cho
việc ứng dụng xử lý formaldehyde.
Ngoài ra, có một số ứng dụng quan trọng của chi Cordyceps trong việc làm
thuốc và thực phẩm có lợi cho sức khỏe của con người là chi Paecilomyces (Liang
et al., 2003).
1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp.
NoFly WP là thuốc trừ sâu sinh học chứa chủng nấm Paecilomyces
fumosoroseus nhằm kiểm soát bọ trĩ và bọ phấn trắng trên thực vật ở nhiều giai
đoạn sống của chúng như: trứng, ấu trùng và con trưởng thành.
Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của P.fumosoroseus sẽ bám vào côn
trùng, nảy mầm và xâm nhập qua lớp cutin. Khi ký sinh được ký chủ, chúng sẽ phát
triển nhanh chóng, phá vỡ tế bào dẫn đến bị mất chức năng sống. Côn trùng sẽ chết
trong vòng từ 3 - 10 ngày, phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi côn trùng chết, bào tử của
nấm sẽ nảy mầm trên bề mặt của côn trùng ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, làm cho
cơ thể côn trùng bị phủ một lớp tơ xám trắng ra bên ngoài. Trong điều kiện bất lợi,
sẽ không có sự hình thành bào tử tuy nhiên ta có thể nhận thấy sự ký sinh của nấm
qua màu sắc của cơ thể côn trùng khi chết, đó là màu nâu hay qua sự méo mó của
cơ thể côn trùng.
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp.
– Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng là yếu tố quan trọng cho sinh
trưởng và phát triển của nấm. Nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không
mọc và sẽ hạn chế khả năng gây bệnh đối với côn trùng. Trong quá trình hình thành
bào tử, nấm cần các nguồn C, N. Các nguồn Carbon đã được nghiên cứu ảnh

28. Đồ án tốt nghiệp
18
hưởng là: glucose, sucrose, arabinose, mannose và acid citric đều ảnh hưởng đến sự
phát triển của Paecilomyces spp. (Bharati et al., 2007). Kết quả cuối cùng thu được:
sucrose là cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng; tiếp theo là glucose
(5,625 cm). Mannose có khả năng thấp nhất, các cơ chất khác có tác dụng vừa
phải. Còn đối với nguồn Ni-tơ, Bharati et al. (2007) đã sử dụng các nguồn Nitơ thử
nghiệm: ammonium photphase, sodium nitrate, glycin, calcium nitrate, ammonium
nitrate để nghiên cứu khả năng sử dụng Nitơ của Paecilomyces spp. Kết quả thu
được Calcium nitrate là nguồn Nitơ tốt nhất rồi đến glycin, natri nitrate, ammonium
nitrate. Ammonium phosphate được vi nấm sử dụng ít nhất.
– Nhiệt độ và ẩm độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển
của bào tử nấm Paecilomyces spp., khi nuôi cấy nấm Paecilomyces farinosus ở các
điều kiện nhiệt độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 150
C có lợi cho sự hình thành bào tử
hơn là 24-260
C, nhưng ở nhiệt độ 180
C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18% so với nhiệt độ
250
C. Nguyên nhân này có thể là do nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình dị hóa và
làm tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn
Mão,2002)
– Gần đây Stathers, T.E., D. Moore và C. Prior (2004) đã cho công bố
những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đế sự phát triển của nấm
Paecilomyces spp. và xác định nấm Paecilomyces spp. thích hợp ở nhiệt độ 280
C và
ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80-90% (Phạm Thị Thùy,2004)
– Độ ẩm cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi
nấm, tuy nhiên ẩm độ thấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh
của nấm Paecilomyces spp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0-34%
hơn là khi ẩm độ 75%.
Nấm côn trùng nói chung rất cần ánh sáng cho sự phát triển và nấm Paecilomyces
spp. cũng không ngoại lệ. Vì vậy,ánh sáng là nhân tố không thể thiếu trong sự hình
thành bào tử của nấm Paecilomyces spp. (Trần Văn Mão,2002). Các nhà khoa học
cũng cho biết nấm Paecilomyces spp. khi tấn công vào cơ thể côn trùng nếu gặp
những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên

29. Đồ án tốt nghiệp
19
những thể chịu đựng (resistant structures) để đối phó lại với môi trường
(Penland,1982).
– Ảnh hưởng của các loại môi trường: Theo Sung Mi Shim (2003)
nghiên cứu rằng có sự chênh lệch về sự phát triển của nấm trên hai môi trường PDA
(6,73 cm sau 14 ngày nuôi cấy) và Czapeck - Dox (6,25 cm sau 14 ngày nuôi cấy).
Vì vậy, PDA là môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm.
– Ảnh hưởng của độ pH: thường nấm sống trong phạm vi pH = 3,5 - 8.
Nhưng nấm côn trùng ưa pH acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 - 6. Theo
như nghiên cứu của Sung Mi Shim et al. (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát
triển của P.fumosoroseus nằm trong khoảng 6 - 9, còn nấm P.japonica phát triển tối
ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al.,
2003).
– Ảnh hưởng của độ thoáng khí: nấm côn trùng đa số đều thuộc loại
hiếu khí, khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ
nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ
phát triển tốt.
1.6. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phòng trừ bọ phấn và
các côn trùng chích hút khác.
1.6.1. Tổng quan về bọ phấn trắng
1.6.1.1. Phân loại khoa học
Giới: Animanila
Ngành: Arthropoda
Lớp: Insecta
Bộ: Hemiptera
Họ: Sternorrhyncha
Chi: Bemisia
Loài: B.tabaci

30. Đồ án tốt nghiệp
20
Hình 1. 8 Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng
(Nguồn: organicsoiltechnology.com)
1.6.1.2. Đặc điểm sinh thái
Bọ phấn là một trong những dịch hại nguy hiểm đối với nhiều loài cây trồng.
Ký chủ của bọ phấn chủ yếu là thực vật hạt kín hai lá mầm, trong đó cây họ cam
quýt (Rutaceae) là ký chủ của hơn 60 loài, cây họ dâu tằm (Moracea) là ký chủ của
hơn 80 loài. Ở các nước ôn đới, bọ phấn Trialeurodes vaporariorum gây hại nặng
cho cây trồng trong nhà kính và ngoài đồng ruộng, bọ phấn Aleyrodes proletella gây
hại nặng cho rau họ thập tự. Ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, các loài

31. Đồ án tốt nghiệp
21
Aleurodicus dispersus, Trialeurodes vaporariorum và Bemisia tabaci gây hại thiệt
nghiêm trọng cho bông và nhiều loại cây trồng khác có giá trị kinh tế cao.
Cho đến nay trên thế giới đã ghi nhận 1556 loài, chúng thuộc 161 giống của
3 phân họ Aleurodicinae, Aleyrodinae, Udamoselinae (Evans,2008). Theo kết quả
điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (BVTV) các năm 1967 - 1968, 1977 - 1978, 1997
- 1998, ở nước ta có 7 loài bọ phấn có tên khoa học là: Aleurocanthus spiniferus,
Aleurocanthus woglumi, Aleurocanthus spp. gây hại trên cam quýt; Aleurocybotus
indicus gây hại trên lúa; Dialeurodes citri gây hại trên na; Parabemisia myricae gây
hại trên đậu tương, thuốc lá, đậu đỗ, dưa chuột, cà chua, cà tím. Theo kết quả điều
tra mới đây của các tác giả Nguyễn Thị Thu Cúc, Lê Thị Tuyết Nhung, Lê Quang
Khải, thành phần bọ phấn nước ta đã được bổ sung thêm 4 loài: Aleurodicus
dispersus gây hại trên ổi; Aleyrodes proletella gây hại trên súp lơ xanh;
Dialeurolonga rusotigmoides, Ochamoplatus citri gây hại trên cam, quýt.
1.6.1.3. Đặc điểm hình thái
Trưởng thành có kích thước nhỏ, thích bay và thường có màu trắng đục, có
lớp sáp phấn trên cánh, chiều dài cơ thể 1 -3 mm.
Trưởng thành của bọ phấn trắng cái có màu vàng nhạt hoặc trắng . Lá
non chưa hoàn chỉnh (chưa mở) là nơi con cái ưa thích đẻ trứng, giao phối ngay sau
khi vũ hóa.
Trứng có hình quả lê hoặc quả trứng, có cuống gắn chặt cố định trên các mô
lá và thời gian pha trứng từ 8-31 ngày. Phần mở rộng của cuống nhỏ móc dính này
là phương tiện để thụ tinh. Mỗi con cái có thể đẻ 80 trứng, số lượng trứng thay đổi
theo mùa.
Ấu trùng tuổi 1 - 3 có thể di chuyển và gây hại trong phạm vi ngắn; Tuổi 4
thường được gọi là nhộng. Ấu trùng mới nở có màu kem nhạt và dần dần chuyển
sang một màu đen bóng. Chúng hình thành các tua sáp và phủ một lớp sáp trên cơ
thể . Ngay sau khi nở, các ấu trùng di chuyển tìm vị trí thích hợp để định cư gây
hại. Thời gian phát dục của tuổi 1: 4 - 7 ngày, tuổi 2: 3 - 7 ngày và tuổi 3: 3 - 8

32. Đồ án tốt nghiệp
22
ngày. Mỗi lần lột xác là có sự thay đổi màu sắc từ màu nhạt chuyển sang hơi đen.
Hầu hết tuổi 2, 3 của ấu trùng có hình bầu dục hoặc thuôn dài và có những khe (nếp
gấp) thở cạn ở thành bụng và lưng. Đó là các lỗ thở và có thể hỗ trợ cho việc dẫn
truyền không khí.
Giai đoạn nhộng (ấu trùng tuổi 4) là nhộng giả vì chúng có hoạt động ăn
trong giai đoạn đầu, kéo dài 9-14 ngày sau đó vũ hóa thông qua khe hình chữ 'T'
trên lưng vào buổi sáng.
Cả ấu trùng và trưởng thành đều chích vào mô cây trồng và hút dịch nhưng
giai đoạn ấu trùng gây thiệt hại nặng nhất cho cây mía.
Khi ấu trùng phát triển, chúng phủ một lớp bọc bằng sáp trắng giúp bảo
vệ khỏi các tác động bên ngoài, nhất là thuốc trừ sâu, đây là đặc điểm riêng biệt
của bọ phấn trắng ở các pha phát dục, trừ pha trứng.
1.6.1.4. Tổng quan về tác hại do bọ phấn trắng gây ra
Bọ phấn trắng (B. tabaci) là một trong những loài loài dịch hại nông nghiệp
nguy hiểm nhất trên phạm vi toàn cầu (Philip A. Stansly et.al, 2010). Chúng gây hại
cho hầu hết các loài cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Luko Hilje et al,
2001). Các cây trồng là kí chủ của bọ phấn trắng lên đến 600 loài thuộc 5 họ cây
phổ biến bao gồm cây họ đậu (99 loài), cây họ cúc, họ bông, họ cà và họ thầu dầu.
Ngoài tác hại trực tiếp đến sinh trưởng phát triển của cây, bọ phấn trắng còn là
vecto truyền bệnh virus cho cây. Đây chính là tác hại quan trọng nhất của bọ phấn
trắng. Các tác giả cho biết, bọ phấn trắng là vecto truyền hơn 150 loại virus gây
bệnh cho cây trồng (Polston and Anderson 1997; Jones 2003). Trên cây cà chua,
các cây họ ớt, bọ phấn trắng là vecto duy nhất truyền virus gây xoăn vàng ngọn cà
chua (virus Tomato Yellow Leaf Curl Virus: TYLCV) (Ghanim M et al. 1998;
Ghanim M, Czosnek H, 2000; Liu et al, 2013; Rubinstein G, Czosnek H., 1997).
Cùng quan điểm này, Muniyappa et al (2000); Sylvia Jelinex (2010) cho biết, bệnh
xoăn lá cà chua do virus (Tomato leaf curl virus: ToLCV) và bệnh xoăn vàng ngọn
cà chua (TYLCV) gây hại nặng cho sản xuất cà chua tại Ấn Độ, Úc và nhiều nước

33. Đồ án tốt nghiệp
23
Châu Á được lan truyền bởi bọ phấn trắng. Chúng tấn công cây trồng từ khi cây
mới mọc và phát triển, gây hại cho đến khi thu hoạch. Tỷ lệ cây bị bệnh chiếm từ 50
đến 100%. Nhiều diện tích cây trồng bị đốn bỏ vì tác hại của virus. Thiệt hại do bọ
phấn trắng lên đến hàng tỷ đô la/năm (Gill, 1992; Zalom et al. 1995; Heinz 1996;
Henneberry et al. 1997; Henneberry et al. 1998; Chu and Henneberry 1998. Bọ
phấn trắng là dịch hại nguy hiểm nhất cho hầu hết các loại cây trồng trong nhà kính
(Premalatha K. và Rajangam. J, 2010). Trong điều kiện nhà kính, bọ phấn trắng tấn
công mạnh trên cây rau ăn trái như cà chua, ớt ngọt, cà tím, dưa leo… (Cock, 1986).
Tại Mỹ, bọ phấn trắng gây hại làm giảm 13% năng suất dưa lê (Jetter et al. 2001).
Bọ phấn trắng đã hình thành tính kháng đối với khoảng 35 hoạt chất thuốc trừ sâu
được báo cáo trên ít nhất 20 nước trên thế giới (Elbert và Nauen, 2000; Cahill và
ctv., 1995; Ahmad và ctv., 2002; Kranthi và ctv., 2002; Horowitz và ctv., 1998;
Prabhaker và ctv., 1992; Cahill và ctv., 1996a; Dittrich và ctv., 1990; Denholm và
ctv., 1998). Mất mát do bọ phấn trắng gây ra trên toàn cầu, ước tính trên 300 triệu
đô la Mỹ/năm (De Barro and Driver 1997; White 1998). Vì vậy, việc nghiên cứu để
xây dựng biện pháp phòng trừ bọ phấn trắng đã và đang được đặc biệt chú ý (Philip
A et.al, 2012). Một chương trình quản lý tổng hợp bọ phấn trắng mang tính quốc tế
(Tropical Whitefly IPM Project) đã được triển khai từ năm 1996 đến năm 2004 và
đã xác định được rằng việc lạm dụng thuốc hóa học nguyên nhân gây nên sự bùng
phát của loài dịch hại này ở các nước vùng nhiệt đới (Francisco J. Morales, 2006).
Tại Việt Nam, bọ phấn trắng được coi là dịch hại chính và là vecto truyền
bệnh virus trên nhiều loại cây trồng (Lê Thị Liễu, Trần Đình Chiến, 2005; Trần
Đình Phả et al. 2009). Trên cây cà chua ở miền Bắc, chúng xuất hiện và gây hại
trong suốt cả vụ. Trong số 33 loài bọ phấn trắng thu được trên các cây trồng ở Hà
Nội, Bemisia tabaci là luôn xuất hiện thường xuyên, gây hại nặng trên nhiều loại
cây trồng như đậu đỗ, cà chua, bắp cải, xu hào, súp lơ (Đàm Ngọc Hân, 2010).
Bọ phấn trắng non và bọ phấn trưởng thành thường tập trung ở mặt dưới lá
cà chua, ổi, ớt.. chích hút dịch cây. Khi mật độ bọ phấn cao làm cây suy yếu, có thể

34. Đồ án tốt nghiệp
24
bị héo, vàng lá, thậm chí có thể chết. Chất bài tiết của bọ phấn trắng có đường tạo
điều kiện cho nấm bồ hóng phát triển hại cây.
Bọ phấn thường gây hại trong mùa khô, chúng có phân tán trên phạm vi rộng
nhờ gió.
Ngoài ra, bọ phấn còn là vật trung gian truyền bệnh xoăn lá do virus gây ra
và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có nhóm cây rau thực phẩm
bị hại nghiêm trọng nhất là cà chua, ớt.. Bệnh xoăn lá có thể xuất hiện ngay từ khi
cây còn nhỏ trong vườn ươm cho đến khi trồng ra ruộng và thu hoạch, phổ biến
nhất là cây bắt đầu ra hoa. Bệnh xuất hiện càng sớm thì mức độ thiệt hại càng nặng.
Cây bị bệnh còi cọc, lá biến màu vàng nhạt, trong khi gân lá còn xanh tạo thành
những vết xanh vàng loang lổ, lá nhỏ lại, nhăn nheo và thô cứng, các lá ngọn bị
xoăn, cây sinh trưởng kém, thấp nhỏ, phân nhiều nhánh cằn không phát triển được.
Đốt thân hoặc các đốt ngắn lại và hơi uốn cong. Cây bị bệnh sớm và nặng có thể
chết. Nếu bị muộn và nhẹ thì những lá non ra sau mới bị xoăn, cây có thể ra hoa và
trái nhưng rụng nhiều. Nếu có trái thì trái nhỏ, méo mó, cứng, chất lượng kém.
Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới và chủ yếu là do bọ phấn
chích hút từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe. Bọ phấn Bemisia tabaci là côn
trùng môi giới truyền bệnh. Virus lan truyền rất nhanh, khi bọ phấn bắt đầu ăn cây
cà chua, virus được truyền đi trong vòng 15 - 30 phút. Mật độ bọ phấn càng cao thì
tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Bệnh không tồn tại lan truyền qua hạt giống và
qua đất. Hàng năm, bệnh thường phát sinh mạnh từ tháng 10 đến đầu tháng 11 và
gây hại nặng vụ cà chua xuân - hè tháng 3 - 4, đặc biệt khi trời ấm và nắng, ít mưa.
Mức độ bị bệnh ở các giống cũng khác nhau: giống cà chua lai dễ nhiễm bệnh hơn
các giống cà chua thuần; các giống mới nhập nội dễ nhiễm hơn các giống trồng qua
nhiều năm; các giống cà chua địa phương có khả năng kháng bệnh virus cao.

35. Đồ án tốt nghiệp
25
1.6.2. Tổng quan về rệp
1.6.2.1. Phân loại khoa học
Giới: Animalia
Ngành: Arthropoda
Lớp: Insecta
Bộ: Hemiptera
Họ: Aphididae
Chi: Aphis
Loài: A. gossypii
Hình 1. 9 Cấu tạo ngoài của rệp
(Vickers L. H, 2012)

36. Đồ án tốt nghiệp
26
Hình 1. 10 Cấu tạo ngoài của rệp
(Vickers L. H, 2012)
1.6.2.2 Đặc điểm sinh thái
Rệp Aphis gossypii có khoảng 4700 loài, chúng có thể kí sinh trên nhiều
loại cây trồng và cỏ dại khác nhau như các cây ngô, lúa mì, khoai tây, bông, ớt,
hoa hồng, cam, quýt,… thuộc các họ lúa, họ dưa, họ cà, họ có múi,… gây thiệt
hại hàng tỷ đô la Mỹ mỗi năm cho ngành nông nghiệp trồng trọt. Rệp là nhóm
côn trùng chích hút phổ biến nhất hiện nay, phân bố tập trung nhất ở các vùng ôn
đới, một số sống ở cả cận nhiệt đới và nhiệt đới với số lượng khoảng 3700 loài
rệp đã được biết trên thế giới (Holman J., 2009). Các loại rệp phá hoại cây trồng
mạnh như rệp bông Aphis gossypii Glover, rệp ngô Aphis maydis, rệp
đậu…chúng thường ẩn ở phần mặt dưới của lá, thân non và chích hút nhựa tại đó
(Von Dohlen C., Rowe C., Heie O.,2006) vừa làm cạn nguồn dinh dưỡng của cây
vừa tiết ra chất đường mật không chỉ làm đóng khí khổng của lá mà còn góp phần

37. Đồ án tốt nghiệp
27
tăng sự phát triển của mốc đen, làm ngăn cản ánh sáng đến các mô quang hợp,
ảnh hưởng nghiêm trọng tới trao đổi chất và năng suất cây trồng. Ngoài ra, việc
chích hút nhựa cây của các loài rệp làm lây lan virus gây bệnh từ cây bệnh sang
các cây khỏe mạnh.
Tại Việt Nam, theo nghiên cứu và thống kê của các nhà khoa học, nước ta
chịu sự ảnh hưởng của hơn 250 loài rệp khác nhau. Tại đồng bằng sông Cửu
Long, cây sầu riêng bị rệp sáp phá hoại. Một số cây ăn quả ở thành phố Hồ
Chí Minh và vùng phụ cận cũng bị ảnh hưởng bởi nhiều loài rệp làm giảm năng
suất và thiệt hại về kinh tế. Cây cà phê tại một số vùng ở Tây Nguyên cũng đang
gặp phải vấn nạn rệp sáp và rệp bông. Tại tỉnh Đắc Lắc, rệp sáp kí sinh trên
chùm hoa và quả non gây thiệt hại từ 8 –25%. Tại tỉnh Đắc Nông, rệp đã tấn
công gây hư hại trên 500 ha, trong đó gây thiệt hại nặng cho hơn 200 ha (Bá
Thăng, 2012).
1.6.2.3. Đặc điểm hình thái
Cơ thể rệp chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân
đốt, mắt kép và có một cặp râu, cơ thể được bao bọc bởi bộ xương ngoài bằng
chitin, chiều dài từ 1 – 10 mm (Hình 1.1). Rệp có một lớp biểu bì mềm, có cánh
(dạng màng) hoặc không cánh. Phần lớn thân rệp có màu xanh lá cây, đen, nâu,
hồng hoặc không màu.
Rệp có thể sinh sản theo cả hình thức đơn tính và hữu tính. Vào mùa thu,
khi có sự thay đổi về cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, sự giảm sút về nguồn thức
ăn hoặc chất lượng thức ăn, rệp cái sinh ra cả rệp đực và rệp cái con. Đặc điểm
di truyền của rệp đực giống hệt rệp mẹ ngoại trừ việc ít hơn một nhiễm sắc thể
giới tính. Rệp con hữu tính có thể thiếu cánh, thậm trí thiếu vòi chích hút
(McGavin G. C.,1999). Khi trưởng thành, rệp cái giao phối với rệp đực rồi đẻ
trứng. Trứng sống sót qua mùa đông khắc nghiệt rồi nở ra rệp cái có cánh hoặc
không cánh (Hình 1.2). Các rệp cái sẽ sinh sản vô tính ra rệp cái không cánh
hoặc rệp cái có cánh (khi khan hiếm thức ăn) để bay đến cây kí chủ khác. Tuy
nhiên, trong môi trường ấm áp như ở vùng nhiệt đới hoặc trong nhà kính, rệp

38. Đồ án tốt nghiệp
28
có thể sinh sản vô tính trong nhiều năm. Trong vòng đời, một rệp cái có thể sinh
ra 31 đến 93 rệp con theo hình thức sinh sản này (Hồ Khắc Tín,1981). Đặc biệt,
một số loài có khả năng sinh sản lồng, khi rệp cái mẹ sinh ra rệp cái con thì
rệp cái con cũng chuẩn bị sinh ra thế hệ tiếp theo đã có sẵn trong cơ thể nó.
Cách sinh sản này có thể ảnh hưởng đến kích thước của rệp và tốc độ sinh sản
tăng lên (Jahna G. C., Almazanb L. P., Paciab J. B., 2005).
Trong điều kiện thuận lợi, vòng đời trung bình của một cá thể rệp khoảng
30 ngày. Rệp con sinh ra sẽ phát triển trong khoảng 4 đến 10 ngày để trưởng
thành và bắt đầu sinh sản ra các thế hệ mới (Lloyd J. E.,3013).
1.6.2.4 Tổng quan về tác hại do rệp gây ra
Khi cây trồng vượt qua giai đoạn cây con, bắt đầu phân cành lúc này xuất
hiện các loại sâu hại như rầy xanh, rệp Aphis gossypii (Vũ Khắc Nhượng,1991).
Rệp Aphis gossypii phát sinh và gây hại mạnh trong điều kiện nhiệt độ 23 – 250
C,
ẩm độ 80 -85% (Lê Lương Tề, 2005). Mưa to, ẩm độ cao sẽ làm giảm mật độ và
hạn chế sự phát sinh của rệp. Khi mật độ cao hoặc thức ăn không còn phù hợp, rệp
Aphis gossypii hình thành loại hình có cánh để di chuyển sang cây khác và tiếp tục
gây hại (Viện Bảo Vệ Thực Vật, 2003). Rệp tập trung sinh sống ở ngọn cây và lá
non, chúng làm cành lá cong queo, hình dạng thay đổi, không phát triển…Rệp A.
gossypii là loại rệp điển hình ở Việt Nam, chúng có thể phát triển quanh năm trên
một phạm vi kí chủ rất rộng gồm các cây trong họ bầu bí, bông, cà, cúc và hàng loạt
cây thân gỗ, trong đó phổ biến nhất là các loại dưa, bầu bí, bông, cà, ớt và khoai sọ.
Ngoài ra rệp Aphis gossypii còn là tác nhân truyền bệnh virus gây bệnh khảm qua
các thế hệ sau, không có thời gian ủ virus trong cơ thể và virus chỉ tồn tại trong cơ
thể nó dưới 4 giờ sau mỗi lần chích hút, nhưng rệp có khả năng hấp thụ virus sau
khi chích hút cây bệnh dưới 1 phút có thể truyền bệnh (Nguyễn Thị Nghiêm, 1996).
Ngoài ra một số nhà khoa học đã nghiên cứu về diễn biến mật độ rệp Aphis
gossypii trên một số cây trồng cho rằng rệp thường xuất hiện trên cây khoai tây và
cây ớt tại Ấn Độ vào tháng 8,9,10 và tiếp tục phát triển cho tới tháng 4,5,6. Trong
thời kì này chúng hình thành 2 đỉnh cao về số lượng. Đỉnh cao lần 1 có mật độ thấp

39. Đồ án tốt nghiệp
29
hơn vào khoảng cuối tháng 11, lần 2 vào tháng 2 với mật độ rất cao sau đó mật độ
giảm dần (Verma và Parihar,1990). Trong quá trình nghiên cứu về rệp Aphis
gossypii đã phát hiện mức độ thích nghi của rệp với môi trường và nguồn thức ăn
có liên quan chặt chẽ đến đặc điểm sinh vật học, sinh thái học của rệp
(George,1983). Sau khi rệp gây hại trên một số cây trồng chúng thường có hiện
tượng phát tán tìm kí chủ mới bằng cách mọc cánh xuất hiện nhũng cá thể có cánh
trong quần thể bay đi hoặc nhờ gió để phát tán. Hoạt động phát tán của rệp cao nhất
vào đầu tháng 3, số lượng rệp bay vào buổi sáng thường cao hơn rất nhiều so với
buổi chiều. Theo Yayma và Ronald (2007) khi mật độ quần thể rệp cao, chúng sẽ
sản sinh nhiều rệp trưởng thành có cánh và có thể di cư để tìm nguồn thức ăn mới.
Với tốc độ sinh sản nhanh, số lượng rệp con được đẻ ra của một con cái nhiều và
vòng đời ngắn cộng với sự đa thực của chúng, có thể khẳng định rệp bông có sức
gây hại rất lớn.
Rệp có khả năng gia tăng quần thể rất nhanh trong điều kiện thuận lợi. Ấu
trùng và rệp trưởng thành tập trung mặt dưới lá, nhất là đọt non, bông, chồi hút
nhựa làm cho các bộ phận này bị khô héo hoặc để lại những vết thâm đen trên lá.
Trên cây ớt, rệp gây hại trầm trọng ở tầng giữa rồi đến tầng trên, hại ít nhất ở tầng
dưới. Rệp thường sống tập trung ở mặt dưới lá ớt nhất là lá bánh tẻ. Ở những cây đã
ra hoa, quả, thu hoạch thường cao hơn đối với giai đoạn phát triển thân lá. Khi mật
độ rệp cao thì chúng bắt đầu di chuyển nhiều lên các lá non và các chồi ngọn, khi đó
ở tầng trên các lá non, chồi ngọn, nụ, hoa mật độ rệp nhiều hơn so với hai tầng lá
giữ và dưới. Rệp thường tập trung với số lượng lớn ở đọt non làm lá bị quăn và
phân tiết ra thu hút nhiều muội đen trên lá, thân, cành kể cả nụ, hoa. Ngoài tác hại
làm giảm năng suất, chất lượng cây ớt còn truyền 1 số loại virus gây bệnh từ những
cây bệnh sang các cây khỏe mạnh.

40. Đồ án tốt nghiệp
30
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ ngày 7/8/2014 đến ngày 13/7/2015 tại phòng thí
nghiệm trường Đại Học Công Nghệ TPHCM.
2.2. Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Thiết bị - hóa chất
2.2.1.1. Thiết bị
 Nồi hấp khử trùng
 Máy đo quang phổ UV-Vis 2550
 Máy ly tâm Universal 320
 Que cấy điểm
 Đèn cồn
 Ống nghiệm
 Falcon
 Đũa thủy tinh
 Kính hiển vi quang học
 Dao cấy
 Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm
 Đĩa petri
 Micropipet
 Erlen
 Hộp nuôi côn trùng.
 Lame đếm Thoma, kính hiển vi, kính lúp sôi nổi, máy lắc Voltex.
 Pipet, cốc thủy tinh, micropipet 1000µl, 100µl và đầu tuýp.
 Bông thấm nước, bông không thấm nước
 Bao nhựa, dây thun, giấy báo

41. Đồ án tốt nghiệp
31
2.2.1.2. Hóa chất
 Dịch TCA 5%
 Lugol
 Tween 80

Cồn 960
, 700
 Methylene blue
 MgSO4.7H2O
 K2HPO4
 KNO3
 NaCl

FeSO4.7H2O
 Glucose
 Pepton
 NaNO3
 KCl
 CaCl2
2.2.2. Vật liệu
 Nấm Paecilomyces lilacinus đã được phân lập bởi Phùng Lê Kim Yến
(2014) và được tái phân lập lại bởi sinh viên thực hiện đề tài.
 Nguồn bọ phấn, rệp được thu từ vườn của nhà dân tại Củ Chi.
2.2.3. Các môi trường sử dụng
2.2.3.1. Môi trường phân lập nấm: PDA (Potato D - Glucose Agar)
D-glucose 20 g
Agar 20 g
Dịch chiết khoai tây 1000 ml
Cách chuẩn bị dịch chiết khoai tây: Cân 200 g khoai tây đã được gọt vỏ, sau
đó thái nhỏ thành hình vuông. Đong vào cốc thủy tinh 1000ml nước cất, thêm khoai
tây đã thái ở trên vào đun sôi trong 20 phút. Sau đó, để nguội, dùng bông thấm nước

42. Đồ án tốt nghiệp
32
lọc phần dịch, gạn bỏ phần xác khoai tây để thu dịch chiết khoai tây, bổ sung agar
và đường theo tỉ lệ và đem hấp khử trùng ở 1210
C, 1atm, trong 15 phút.
- Song song đó chuẩn bị các đĩa Petri đã được rửa sạch và sấy khô, đem
gói bằng giấy báo, rồi đem hấp khử trùng ở 1210
C, 1atm, trong 15 phút.
- Đổ môi trường ra đĩa petri và chờ thạch đông trong 15 phút, sau đó
đem bảo quản, sẵn sàng cho sử dụng.
2.2.3.2. Môi trường PSA (Potato Sucrose Agar)
Sucrose 20 g
Agar 20 g
Khoai tây 200 g
Phần chuẩn bị môi trường cũng được tiến hành tương tự như đã nêu ở
phần trên.
2.2.3.3. Môi trường thử nghiệm hoạt tính protase sử dụng casein làm cơ chất
(Nguyễn Thị Hồng Thương,2001)
Casein 1 %
MgSO4.7H2O 3 g
K2HPO4 3 g
KNO3 1 g
NaCl 0,5 g
FeSO4.7H2O 0,01 g
Agar 15 g
Chloramphenicol 0,1 g
Nước cất: bổ sung cho đủ 1000ml
2.2.3.4. Môi trường định tính sự sinh tổng hợp enzyme chitinase (Lê Thị Huệ, 2010)
NaNO3 3,5 g
K2HPO4 1,5 g
MgSO4.7H2O 0,5 g

43. Đồ án tốt nghiệp
33
KCl 0,5 g
FeSO4.7H2O 0,01 g
Cloramphenicol 0,005 g
Bổ sung dịch chitin huyền phù 1% đến 1000ml
Cách pha dịch chitin huyền phù 1%: Theo phương pháp của Dai et al. 2011
(dẫn theo Nguyễn Thị Hà, 2012) dung dịch chitin huyền phù 1% được chuẩn bị như
sau: 1g bột chitin được cho dần vào 20ml HCl đậm đặc, để ở 40
C và để qua đêm.
Thêm vào hỗn hợp 50ml ethanol (-200
C) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Ly
tâm hỗn hợp ở 5000 vòng/phút, trong 20 phút, thu lấy tủa và rửa bằng nước cất cho
đến khi pH trung tính. Thu dịch huyền phù và bổ sung nước cất đến 100ml.
2.2.3.5. Môi trường sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase (Xia
Guoquing Chungsheng, Zhou Ju, 2001)
Glucose 1g
NH4NO3 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,5 g
K2HPO4 0,7 g
KH2PO4 0,3 g
FeSO4.7H2O 0,01 g
ZnSO4 0,001 g
Cloramphenicol 0,005 g
Bổ sung dịch chitine huyền phù 1% đến 1000ml.
pH: 6-7
2.2.3.6. Môi trường Sauboraud + Khoáng chất
Glucose 40 g
Pepton 15 g

44. Đồ án tốt nghiệp
34
KH2PO4 1 g
MgSO4.7H2O 1 g
Agar 20 g
Bổ sung nước cất đến 1000ml
2.2.3.7. Môi trường Czapeck - Dox
Glucose 1 %
NaNO3 3,5 g
K2HPO4 1,5 g
MgSO4.7H2O 0,5 g
KCl 0,5 g
FeSO4.7H2O 0,01 g
Agar 20 g
Bổ sung nước cất đến 1000ml
2.2.3.8. Môi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006)
Chuẩn bị dịch chiết malt: Lấy 250g malt nghiền nhỏ, hòa vào 1 lít nước cất.
Dùng đũa thủy tinh khuấy đều và gia nhiệt từ từ, có khuấy, đến 45 - 500
C, giữ ở
nhiệt độ này 30 phút. Sau đó, nâng nhiệt độ lên 65 - 680
C, có khuấy, giữ ở nhiệt độ
này cho đến khi quá trình đường hóa xảy ra hoàn toàn (kết quả là không thấy màu
xanh xuất hiện khi thử dịch cháo với dung dịch lugol). Lọc tách bã qua vải thô hoặc
bông thấm nước, đem hấp phần dịch trong 1210
C, 30 phút, lấy ra để lắng. Lọc tách
hết tủa lần nữa, pha loãng để dịch có hàm lượng chất khô hòa tan khoảng 6 - 8 độ
Brix.
Thêm 2% agar vào dịch chiết malt, đun khuấy đều cho đến khi agar tan hết.
Phối môi trường vào các dụng cụ chứa, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210
C, 15 phút.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus
2.3.1.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus từ bọ phấn, tạo dòng thuần nguồn
nấm thu được.

45. Đồ án tốt nghiệp
35
a) Phân lập
Thực hiện: Thu bọ phấn trắng trên đồng và đem về nuôi trên lá, cuống lá được
quấn bằng bông hút ẩm để giữ lá tươi, không bị héo. Phun nấm Paecilomyces
lilacinus được phân lập bởi Phùng Lê Kim Yến (2014) lên bọ phấn. Hằng ngày
quan sát và thu bọ phấn bị chết. Các cá thể bọ phấn bị chết được cho vào đĩa petri
có đặt giấy hút ẩm. Tiến hành thu thập cá thể bị chết và được bao bọc bởi sợi nấm
màu trắng. Sau đó tiến hành phân lập nấm ký sinh trên môi trường PDA theo
phương pháp của Lawrence (1997).
Hình 2. 1 Hộp dùng để bố trí thí nghiệm
b) Tạo dòng thuần
Bước 1: Nấu môi trường PDA, sau đó đem hấp tiệt trùng 1210
C (áp suất 1atm),
trong thời gian 15 phút, sau đó để nguội 500
C và bổ sung kháng sinh. Đổ môi
trường ra đĩa đã được hấp vô trùng và để nguội.

46. Đồ án tốt nghiệp
36
Bước 2: Cấy phân lập nấm: Tiến hành vệ sinh mẫu nấm kí sinh, dùng que cấy
đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó làm nguội và chấm nhẹ vào điểm có bào
tử đặc trưng của các nguồn nấm ký sinh trên cơ thể bọ và không bị nhiễm tạp sau đó
cấy điểm nhẹ lên bền mặt môi trường. Để đĩa môi trường cấy phân lập trong phòng
thí nghiệm 2 – 3 ngày, thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm xuất hiện thì tiến hành cấy
tách ra các đĩa môi trường khác nhau để làm thuần chủng.
Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005)
 Quan sát đại thể nấm sợi
Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm
của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Các chủng nấm phân lập được
sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PDA và được ủ 2 tuần.
Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển;
dạng sợi nấm; màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; màu sắc của môi trường do
sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử…trong thời gian nuôi ủ.
 Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi (phương pháp phòng
ẩm)
Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp
tiêu bản phòng ẩm.
Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa:
mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai
thanh đũa tre.
Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1cm x 1cm) từ đĩa môi trường
PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử
trùng, lấy sinh khối nấm Paecilomyces cấy vào 4 mặt bên của khối thạch. Sau đó
đậy lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm
trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử
xảy ra (thường là 2 – 3 ngày).
Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên
một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở

47. Đồ án tốt nghiệp
37
độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh
và vách ngăn; hình dạng cuống bào tử; đặc điểm hình dạng, màu sắc, kích thước
bào tử…
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của
nấm Paecilomyces lilacinus.
2.3.2.1. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm
Paecilomyces lilacinus trên môi trường thạch (Nguyễn Thị Hà, 2012)
Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung chitin 1% làm
chất cảm ứng, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu
trúc mạch ngắn hơn là N-acetyl- D-glucosamine. Các dạng đơn phân này không cho
phản ứng màu với thuốc thử Lugol. Do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của
phần môi trường trong suốt bao quanh nấm phản ảnh khả năng sinh tổng hợp
chitinase.
– Thực hiện:
Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase, hấp khử trùng ở
1210
C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 1210
C trong 15 phút, cho
môi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên
bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt
độ phòng trong 4 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ
Lugol đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân
giải và đường kính nấm.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri.
2.3.2.2. Phương pháp nuôi cấy Paecilomyces lilacinus để thu nhận enzyme
chitinase.
 Bước 1 : Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và môi trường sinh enzyme
chitinase.
– Chuẩn bị nguồn nấm Paecilomyces lilacinus.

48. Đồ án tốt nghiệp
38
Sử dụng đĩa PDA nuôi cấy nấm Paecilomyces lilacinus 14 ngày. Cho vào đĩa
nấm 10ml nước muối sinh lý vô trùng và lấy đũa thủy tinh cạo sạch sinh khối nấm
trên bề mặt thạch.
– Chuẩn bị môi trường:
Cho 50ml môi trường vào erlen 100ml sau đó đem hấp khử trùng ở 1210
C, 1
atm trong vòng 15 phút. Sau đó, để nguội đến khoảng 300
C.
 Bước 2: Tiến hành nuôi cấy
Dùng micro pipette hút 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi bình erlen chứa
môi trường sao cho mật độ bào tử đạt 106
CFU/ml. Sau đó, tiến hành ủ trên máy lắc
với 150 vòng/phút trong vòng 1,2,3,4,5 ngày.
2.3.2.3. Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa enzyme chitinase (Nguyễn
Đức Lượng, 2003)
– Nguyên tắc: Trong quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong
môi trường lỏng, vi sinh vật sẽ tổng hợp ra các enzyme thủy phân. Các enzyme thủy
phân là các enzyme hòa tan trong nước. Do đó, để thu nhận enzyme trong trường
hợp nuôi cấy chìm là phải thu nhận dịch nuôi cấy (sau khi tách sinh khối và các
thành phần không hòa tan của môi trường).
– Tiến hành: Dịch nuôi cấy trong erlen sau 1,2,3,4,5 ngày được lọc qua
giấy lọc và thu dịch enzyme.
2.3.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase (Nguyễn Đức Lượng,2003)
a) Dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine:

49. Đồ án tốt nghiệp
39
Ống
nghiệm
ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N-acetyl-
Dglucosamin
e 8.3 mg/ml
(ml)
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Nước cất
(ml)
10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9
Nồng độ N -
acetyl-
Dglucosamin
e (mg/ml)
0 0,083 0,166 0,249 0,33 0,415 0,498 0,581 0,664 0,747 0,83
OD535nm
– Từ các ống nghiệm trên lấy 1 ml cho vào 6 ống nghiệm đã được rửa
và làm khô, thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử DNS và đun sôi trong 10 phút (có đậy
nắp hay nút bông không thấm nước).
– Làm lạnh đến nhiệt độ phòng rồi cho 1 ml nước cất vào ống nghiệm.
Đo mật độ quang ở bước sóng 535 nm với mẫu trắng pha tử ống đối chứng.
– Sau khi có các giá trị OD ở các nồng độ thì tiến hành vẽ đường chuẩn
glucose với trục hoành là nồng độ (mg/ml) N-acetyl-D-glucosamine, trục tung là
mật độ quang (OD). Tìm phương trình biễu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa 2 giá
trị: y=ax+b và hệ số tương quan R2
nhờ phần mềm Excel.
b) Xác định hoạt độ enzyme chitinase:
– Nguyên tắc: Hoạt độ chitinase được xác định dựa vào lượng đường
khử N-acetyl- β-D-Glucosamine sinh ra trong phản ứng thủy phân. Khi cho
chitinase tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, N-acetyl-β-D-Glucosamine sinh
ra trong phản ứng được định lượng qua phản ứng với thuốc thử DNS (3,5 -
dinitrosalisylic acid), cho sản phẩm 3-amino-5 nitrosalicylic acid hấp thụ ánh sáng
khả kiến ở bước sóng 535nm (Nguyễn Thị Hà, 2012).

50. Đồ án tốt nghiệp
40
Chuẩn bị các ống nghiệm đã được rửa sạch và làm khô
– Ống phản ứng:
 Cho vào mỗi ống nghiệm hỗn hợp phản ứng bao gồm: 3ml huyền phù
chitin 1% và 3 ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp được ủ ở 300
C trong
60 phút.
 Ngưng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút.
 Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi
 Lấy 1 ml dịch nổi và 1 ml thuốc thử DNS vào 1 ống nghiệm sạch, lắc
đều, đun sôi cách thủy trong 10 phút, rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng.
 Thêm 1 ml nước cất, lắc đều và đo OD ở bước sóng 535 nm.
– Ống không phản ứng:
 Cho 3 ml dịch enzyme chitinase vào ống nghiệm và biến tính enzyme
bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút sau đó thêm 3 ml dịch cơ chất chitin
vào rồi làm tương tự như cách bước của ống phản ứng.
c) Cách tính: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase là lượng enzyme cần thiết
để giải phóng 1 µmol N-acetyl-D-glucosamine từ chitin huyền phù trong 1
phút ở nhiệt độ phản ứng nhất định.
Đơn vị hoạt tính = (UI/ml)
Với a: hàm lượng glucosamine (µmol/ml) suy ra từ đường chuẩn.
n: hệ số pha loãng.
v: thể tích hỗn hợp phản ứng.
t: thời gian phản ứng (phút).
V: thể tích dịch enzyme cho vào phản ứng (ml)

51. Đồ án tốt nghiệp
41
2.3.3. Định tính khả năng sinh enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus.
Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung casein 1%,
nấm sợi sẽ sinh enzyme protease phân giải casein thành các amino acid. Các dạng
amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 5%, chỉ có casein
mới tạo tủa trắng đục với TCA 5%.
Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease, hấp
khử trùng ở 1210
C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng đã hấp ở 1210
C trong
15 phút, cho môi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm
ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm
ứng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho thuốc thử TCA 5% vào, để yên 10 phút
rồi sau đó đổ thuốc thử đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo
đường kính vòng phân giải và đường kính nấm.
2.3.4. Đánh giá khả năng gây chết của bọ phấn và rệp của nấm Paecilomyces
lilacinus.
2.3.3.1. Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn của nấm Paecilomyces lilacinus.
Thực hiện: Theo phương pháp của Ayhan GÖKÇE và M. Kubilay ER.
(2004), các cá thể bọ phấn trắng trưởng thành nằm trên lá thu thập được ngoài tự
nhiên được bỏ các hộp có nắp đậy được đục lỗ. Sau đó, hút 1ml phân NPK 16:16:8
nồng độ (0.66g/ml) cho vào bông thấm nước quấn trên cuống lá giúp lá tươi lâu
hơn. Tiến hành phun 10ml dịch huyền phù bào tử nấm có nồng độ 108
cfu/ml lên các
hộp đã chuẩn bị. Mẫu đối chứng được phun bằng nước cất.
Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.
Công thức 1: Phun dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces có nồng độ
108
cfu/ml.
Công thức 2: Phun nước cất.
Mỗi công thức được lặp lại 10 lần, mỗi lần 1hộp chứa 20 cá thể bọ phấn
trưởng thành.

52. Đồ án tốt nghiệp
42
2.3.3.2. Đánh giá khả năng gây chết rệp của nấm Paecilomyces lilacinus.
Thực hiện: cách thực hiện như trên bọ phấn.
Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.
Công thức 1: Phun dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces có nồng độ
108
cfu/ml.
Công thức 2: Phun nước cất.
Mỗi công thức được lặp lại 10 lần, mỗi lần 1 hộp chứa 30 cá thể rệp Aphis
gossypii
Hình 2. 2 Các hộp dùng để đựng rệp bố trí thí nghiệm
 Chỉ tiêu theo dõi:
– Số bọ phấn, rệp bị chết
– Hiệu lực gây chết của nấm Paecilomyces lilacinus (%)
Xử lý số liệu: Hiệu lực gây chết côn trùng được tính theo công thức Abbot
(1925):

53. Đồ án tốt nghiệp
43
Ca- Ta
M (%) = --------------- x 100
Ca
Trong đó: Ca là số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm
Ta là số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau thí nghiệm
2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm
Paecilomyces lilacinus.
2.3.5.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus.
 Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.
Công thức 1: pH 5
Công thức 2: pH 6
Công thức 3: pH 7
Công thức 4: pH 8
Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA. Mỗi công thức lặp lại 3
lần, mỗi lần 1 đĩa.
Thực hiện: Môi trường được khử trùng ở 1210
C
trong 15 phút, sau đó đổ môi trường vào các đĩa. Đổ được
2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh
nấm có đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy
sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250
C ± 20
C
trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối.
Chỉ tiêu theo dõi:
 Đường kính tản nấm (cm): 2
ngày/lần ngày đo sự phát triển của nấm bằng
cách lấy trung bình đường kính trên hai trục của
khuẩn lạc theo công thức:
5mm
Khoanh
khuẩn lạc