Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH
BÀO TỬ NẤM LINH CHI
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện: TRẦN MINH HOÀNG
MSSV: 1211100082 Lớp: 12DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2016

2. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
iii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn
trung thực, chưa từng được ai sử dụng để công bố trong bất kì công trình nào khác.
Các thông tin, tài liệu trích dẫn trong luận án đều đã được ghi rõ nguồn gốc.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Trần Minh Hoàng

3. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
iv
LỜI CẢM ƠN
Trong thực tế không có sự thành công nào mà không có sự giúp đỡ từ những người
khác. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, đánh dấu kết thúc quãng thời gian học tập
ở Trường Đại học Công nghệ TP.HCM tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ gia
đình, thầy cô, bạn bè trong suốt bốn năm qua.
Trước hết xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã tạo
cơ hội cho tôi được học tập tại trường. Cám ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học
– Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức và tâm huyết trong quá
trình giảng dạy suốt những năm qua. Xin gửi lời cám ơn đến TS. Nguyễn Thị Hai đã
cung cấp chủng nấm Trichoderma harzianum T2; cô Đỗ Thị Tuyến đã cung cấp cơ
chất β-glucan và enzyme cellulase C20032; Ths. Nguyễn Thị Ngọc Yến đã cung cấp
bào tử nấm Linh chi. Cám ơn quý thầy cô phụ trách quản lý phòng thí nghiệm Công
nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tạo điều kiện làm việc cho tôi và nhóm
thực hiện đồ án. Đặc biệt xin chân thành cám ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, người đã
tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt
nghiệp này, nếu không có sự giúp đỡ của cô chắc chắn đồ án tốt nghiệp của tôi gặp
rất nhiều thiếu sót.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã có những sự giúp đỡ,
động viên trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cám ơn!
Sinh viên thực hiện
Trần Minh Hoàng

4. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
v
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................x
DANH MỤC BẢNG................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vi
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài.....................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu.........................................................................................2
3. Mục đích của đề tài............................................................................................2
4. Mục tiêu của đề tài.............................................................................................3
5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................3
6. Kết quả đạt được ban đầu ..................................................................................3
7. Hạn chế của đề tài..............................................................................................3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................4
1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi............................................................................4
1.1.1 Phân loại.......................................................................................................4
1.1.1.1 Phân loại theo khoa học......................................................................4
1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc .................................................5
1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi.........................................................9
1.1.2.1 Cuống nấm ..........................................................................................9
1.1.2.2 Mũ nấm................................................................................................9
1.1.2.3 Thụ tầng.............................................................................................10
1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi ..........................................................................10
1.1.3 Chu kì sống của nấm Linh chi..................................................................14
1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi.............................15
1.1.4.1 Dinh dưỡng........................................................................................15
1.1.4.2 Nhiệt độ .............................................................................................15
1.1.4.3 Độ ẩm ................................................................................................15
1.1.4.5 Không khí...........................................................................................15

5. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
vi
1.1.4.6 Ánh sáng ..............................................................................................16
1.1.4.7 Trị số pH ..............................................................................................16
1.1.5 Thành phần dược tính của nấm Linh chi..................................................16
1.1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát .......................................................16
1.1.5.2 Triterpenoid.......................................................................................17
1.1.5.3 Hợp chất saponin ..............................................................................21
1.1.5.4 Những thành phần khác ....................................................................22
1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi ...................................................................22
1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư ..........................................................................22
1.1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch .......................................................23
1.1.6.3 Khả năng chống oxy hóa...................................................................24
1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường ............................................................24
1.1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi.........................................................24
1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma ..................................................................27
1.2.1 Phân loại.....................................................................................................27
1.2.2 Lịch sử phát triển .......................................................................................27
1.2.3.1 Đặc điểm hình thái...............................................................................28
1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng...........................................................................29
1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma......................................31
1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp.......................................31
1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase ............................................................................31
1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase.....................................................................33
1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase ............................................................................34
1.2.4.4 Hệ enzyme protease.............................................................................35
1.3 Giới thiệu về enzyme phá vách tế bào.........................................................36
1.3.1 . Enzyme phá vách tế bào thực vật ............................................................37
1.3.2 Enzyme Cellulase C20032.........................................................................41
CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................44

6. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
vii
2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất...........................................................................44
2.1.1 Vật liệu .....................................................................................................44
2.1.2 Nơi tiến hành.............................................................................................44
2.1.3 Thời gian thực hiện ..................................................................................44
2.1.4 Thiết bị và dụng cụ...................................................................................44
2.1.4.1 Thiết bị .................................................................................................44
2.1.4.2 Dụng cụ................................................................................................45
2.1.5 Hóa chất – Môi trường sử dụng ...............................................................45
2.1.5.1 Hóa chất ..............................................................................................45
2.1.5.2 Môi trường sử dụng ............................................................................47
2.2 Phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi ............................49
2.3 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch
nuôi cấy..................................................................................................................53
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum trên môi trường thạch
PDA.....................................................................................................................54
2.3.2 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường
lỏng......................................................................................................................54
2.3.3 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường
rắn .......................................................................................................................54
2.4 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase trong
dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và enzyme chế phẩm C20032 ....56
2.4.1 Dựng đường chuẩn glucosamine .............................................................56
2.4.2 Xác định hoạt độ enzyme chitinase ở pH và nhiệt độ khác nhau ..............56
2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme celullase trong dịch nuôi cấy nấm
Trichoderma harzianum và chế phẩm enzyme C20032 ........................................57
2.5.1 Dựng đường chuẩn glucose .....................................................................57
2.5.2 Phản ứng xác định hoạt tính cellulase.....................................................58
2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease dịch nuôi cấy và chế phầm
C20032 bằng phương pháp Anson cải tiến............................................................59
2.6.1 Dựng đường chuẩn tyrosine.....................................................................59

7. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
viii
2.6.2 Phản ứng xác định hoạt tính protease .....................................................60
2.7 Phương pháp xác định hoạt tính β-glucanase trong dịch nuôi cấy và chế phầm
C20032 ...................................................................................................................60
2.7.1 Dựng đường chuẩn β-glucan ...................................................................61
2.7.2 Phản ứng xác định hoạt tính β-glucanase................................................61
2.8 Phương pháp xác định protein trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma
harzianum và chế phầm C20032 bằng phương pháp Bradford .............................62
2.8.1 Dựng đường chuẩn Albumin....................................................................62
2.8.2 Xác định hàm lượng protein trong mẫu...................................................62
2.9 Khảo sát phá vách bào tử nấm Linh chi bằng dịch nuôi cấy nấm Trichoderma
harzianum và enzyme chế phẩm C20032. .............................................................64
2.9.1 Phương pháp xác định tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy nấm
Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032...................................................64
2.9.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. ........65
2.9.3 Phương pháp xác định độ ẩm bào tử nấm Linh chi...................................67
2.9.4 Phương pháp thay đổi nồng độ của chế phẩm C20032 kết hợp với dịch nuôi
cấy nấm Trichoderma harzianum .......................................................................68
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.............................................................70
3.1 Kết quả định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease trong chế phẩm
C20032 10% và dịch nuôi cấy ...............................................................................70
3.1.1 Kết quả định tính các enzyme trong chế phẩm C20032 10%....................70
3.1.2 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum
môi trường nuôi cấy lỏng....................................................................................71
3.1.3 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum
môi trường nuôi cấy rắn .....................................................................................72
3.2 Kết quả định lượng hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma
harzianum nuôi cấy môi trường lỏng và nuôi cấy môi trường rắn và chế phẩm
C20032 10%...........................................................................................................73
3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm
Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032......................................................75
3.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm

8. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
ix
Trichoderma harzianum ở điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau. .......................75
3.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm C20032
10% .....................................................................................................................76
3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay đổi tỉ lệ enzyme phối
hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10%................................................77
3.5 Kết quả tỉ lệ bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi thay đổi nồng độ chế phẩm
C20032 kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum ...............................81
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................85
4.1 Kết luận........................................................................................................85
4.2 Kiến nghị .....................................................................................................87
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................87
PHỤ LỤC....................................................................................................................1

9. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
x
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
PDA: Potato Dextrose Agar
EC: Enzyme cellulase C20032
DNC: Dịch nuôi cấy
G. lucidum: Ganoderma lucidum
T.harzianum: Trichoderma harzianum
T. hamatum: Trichoderma hamatum
T. polysporum: Trichoderma polysporum
T. viride: Trichoderma viride
T. reesei: Trichoderma reeisei
B.cinerea: Botrytis cinerea
T. hamatum: Trichoderma hamatum
T. virens: Trichoderma virens
BSA: Bovine serum albumin
DD: Dung dịch
TCA: Trichloacetic acid
FC: Folin – Ciocalteu
CMC: Sodium carboxymethyl cellulose
DNS: acid – 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic
MT: Môi trường
ĐC: Đối chứng
TB: Trung bình
NT: nghiệm thức

10. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
iv
DANH MỤC BẢNG
STT Bảng Nội dung Trang
1 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở
các mẫu vật khác nhau
11
2 1.2 So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở
các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5mg/ml)
25
3 1.3 Một số loại enzyme thủy phân của T. harzianum 36
4 1.4 Một số enzyme thương mại và thành phần enzyme trong
chế phẩm
40
5 1.5 Thông tin chế phẩm enzyme cellulase C20032 của
Novozyme
41
6 2.1 Bảng dựng đường chuẩn glucosamine 56
7 2.2 Lập đường chuẩn glucose 58
8 2.3 Các bước xác định hoạt tính enzyme cellulase (CMCase) 58
9 2.4 Bảng bổ sung hóa chất dựng đường chuẩn tyrosine 59
10 2.5 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease 60
11 2.6 Lập đường chuẩn β-glucan để xác định hoạt tính enzyme
β-glucanase
61
12 2.7 Các bước xác định hoạt tính enzyme β-glucanase 61
13 2.8 Dựng đường chuẩn albumin (protein theo Bradford) 62
14 2.9 Bảng bố trí sự thay đổi tỉ lệ enzyme DNC và chế phẩm
C20032 10%
65
15 2.10 Bảng bố trí sự thay đổi nồng độ enzyme C20032 68
16 3.1 Vòng phân giải các enzyme có trong chế phẩm C20032
10%
70
17 3.2 Vòng phân giải các enzyme có trong DNC T. harzianum
MT nuôi cấy lỏng
72

11. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
v
18 3.3 Vòng phân giải các enzyme có trong DNC T. harzianum
MT nuôi cấy rắn
73
19 3.4 Kết quả hoạt tính enzyme của DNC nấm T. harzianum và
chế phẩm C20032 10%
74
20 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase ở điều kiện
nhiệt độ và pH thay đổi.
75
21 3.6 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong
chế phẩm C20032 10% điều kiện pH5
77
22 3.7 Bảng kết quả % bào tử linh chi bị phá vỡ khi thay đổi tỉ
lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10%
78
23 3.8 Bảng hoạt tính enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có
mặt trong hỗn hợp dịch thí nghiệm
79
24 3.9 Bảng tổng hợp tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay
đổi nồng độ chế phẩm C20032
81
25 3.10 Bảng hoạt tính enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có
mặt trong hỗn hợp dịch thí nghiệm có sự thay đổi nồng
độ enzyme chế phẩm C20032
82

12. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
vi
DANH MỤC HÌNH
STT Hình Nội dung Trang
1 1.1 Xích chi Ganoderma lucidum 5
2 1.2 Thanh chi Ganoderma genus 6
3 1.3 Bạch chi Fomitopsis officinalis 6
4 1.4 Hoàng chi Laetiporus sulphureus 7
5 1.5 Hắc chi Polyporus melanopus 7
6 1.6 Tử chi Ganoderma sinense 8
7 1.7 Phân loại linh chi theo màu sắc 8
8 1.8 Hình thái giải phẫu thể quả nấm linh chi Ganoderma
lucidum
13
9 1.9 Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi
Ganodermataceae
13
10 1.10 Chu kì sống của nấm Linh chi 14
11 1.11 Cấu trúc không gian của 29 loại Triterpenoids trong bào
tử nấm Linh chi
19
12 1.12 29 Triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi 20
13 1.13 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi
trường thạch dịch chiết khoai tây PDA
28
14 1.14 Sợi nấm và cuống bào tử của T. harzianum 29
15 1.15 Cấu trúc chitin 31
16 1.16 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 32
17 1.17 Cấu tạo cellulose 34
18 1.18 Enzyme cellulolytic xâm nhập vách tế bào qua lỗ của
vách tế bào
38
19 1.19 Nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme C20032
Novozyme
42

13. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
vii
20 1.20 pH hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme 42
21 2.1 Buồng đếm hồng cầu Neubauer 66
22 3.1 Biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy
T.harzianum MT nuôi cấy lỏng và MT nuôi cấy rắn
74
23 3.2 Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch
nuôi cấy nấm T. harzianum ở nhiệt độ và pH khác nhau
76
24 3.3 Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có trong chế
phẩm C20032 10% điều kiện pH5
77
25 3.4a Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi khi chưa bị
phá vỡ
78
26 3.4b Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ soi dưới kính hiển vi khi
thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp ở ngày thứ 4
78
27 3.5 Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm linh chi khi thay
đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm
C20032 10%
79
28 3.6 Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm linh chi khi thay
đổi nồng độ chế phẩm C20032
82
29 3.7 Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi soi dưới kính hiển vi
ngày thứ 7 (NT1: 1DNC: 1EC10%)
83
30 3.8 Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi soi dưới kính hiển vi
ngày thứ 10 (NT1: 1DNC: 1EC10%)
83

14. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
viii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
STT Sơ đồ Nội dung Trang
1 2.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm 50
2 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối
ưu của enzyme chitinase từ DNC nấm T. harzianum T2
51
3 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm
linh chi bằng enzyme DNC nấm T. harzianum T2 kết hợp
chế phẩm EC 20032
52
4 2.4 Sơ đồ nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu
enzyme dịch nuôi cấy
53
5 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp
giữa DNC và chế phẩm C20032 10%
64
6 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi nồng độ enzyme chế
phẩm C20032 kết hợp với DNC nấm T. harzianum T2
69
7 4.1 Quy trình phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương
pháp enzyme
86

15. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong y học cổ truyền phương Đông, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là một loại
dược phẩm quý, nó được sử dụng như một loại thượng dược trong các bài thuốc để
điều trị một số căn bệnh cũng như bồi bổ sức khỏe. Tuy nhiên khi sử dụng nấm Linh
chi trong việc điều trị người ta chỉ chú trọng đến việc phối hợp các vị trong bài thuốc
và nấu chúng trong nhiều giờ để tách các hoạt chất mà không chú ý đến thành phần,
các biện pháp tách chiết các hoạt chất sao cho tối ưu. Bên cạnh đó, Tây y hiện đại
cho rằng thảo dược không được xem là một loại thuốc để chữa bệnh mà chỉ có thể
được xem như một loại thực phẩm chức năng và nấm Linh chi cũng được xếp vào
loại thảo dược thực phẩm chức năng. Ngày nay, nấm Linh chi được trồng khá phổ
biển ở một số quốc gia như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam… cho nên
việc sử dụng nấm Linh chi như một loại thực phẩm chức năng giúp hỗ trợ sức khỏe,
tăng tuổi thọ, phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh ung bướu, tim mạch, huyết áp, tiểu
đường…
Trong hai thập kỉ qua, các phương pháp phân tích khoa học hiện đại đã cho phép xác
định được một số lượng lớn các hợp chất hóa học có trong quả thể, tơ và bào tử nấm
Linh chi như: triterpenoid, steroid, polysaccharide, saponin, chất khoáng, vitamin,
amino acid, phenol… Trong đó Triterpenoid, polysaccharide được xem là thành phần
chính có nhiều hoạt tính sinh học của nấm. Mặc dù có một lượng lớn các hoạt chất
sinh học được tìm ra trong nấm Linh chi nhưng việc phân tích, chiết xuất các hoạt
chất sinh học này đa số đuợc thực hiện trên quả thể và tơ nấm, có rất ít nghiên cứu
thực hiện việc trích ly các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi bởi bào tử được cấu
tạo bởi lớp vách đôi rất bền vững nên làm giảm khả năng chiết xuất các chất. Do đó,
việc nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi là giai đoạn quan trọng cho quá trình
phân tích thành phần các chất có trong bào tử.
Để góp phần nghiên cứu việc chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào tử nấm
Linh chi, tôi đã tiến hành nghiên cứu phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng
phương pháp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 kết

16. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
2
hợp với enzyme thương mại Cellulase C20032 được trình bày trong đồ án tốt nghiệp
“NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI”
2. Tình hình nghiên cứu
Các công trình nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong nấm Linh chi được thực
hiện chủ yếu trên quả thể và tơ nấm. Hội nghị nấm học thế giới 7/1994 tại Vancouver
(Canada) đã dành riêng một hội thảo về Linh chi, kết quả đã đi đến quyết định thành
lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi, đặt trụ sở tại New
York (Hoa Kỳ). Do vậy, vào tháng 10/1994 Hội nghị Quốc tế đầu tiên về nấm Linh
chi đã được tổ chức tại Bắc Kinh, Trung Quốc. Tại đây quan điểm về sự tồn tại độc
lập của họ Linh chi Ganodermataceae Donk với tầm quan trọng là các nấm làm thuốc
quý. Vào tháng 7/1996, Hội nghị Quốc tế về nấm học Châu á, lại dành một trong năm
Hội thảo cho các báo cáo về Linh chi tại đại học Chiba, Nhật Bản. Tại mỗi Hội nghị
số báo cáo rất lớn, thể hiện tầm quan trọng kinh tế và sự phong phú của nấm Linh
chi.
Vào thập niên 70 – 80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh
chi. Chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và Việt Nam. Gần đây
một số phòng thí nghiệm ở Hoa Kỳ và vùng Đông Nam á cũng bắt đầu tham gia vào
tiến trình này. Năm 1988, Nhật Bản đã điều trị thành công bệnh nhược cơ bằng Linh
chi theo nguyên tắc điều hoà miễn dịch. Bệnh viện Sơn Đông, Trung Quốc dùng
“súp” Linh chi để giải độc và bổ gan có kết quả tốt, trong 70.000 ca trên 90% khỏi
bệnh (Lui Xing Jia, 1994). Tác giả cho rằng nấm Linh chi có tác dụng tốt đối với
đường tiết niệu, điều hoà rối loạn tuần hoàn não, tránh các cơn kịch phát nghẽn mạch
và làm dịu thần kinh,…
Năm 2010, Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun đã
công bố công trình nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi bằng quá trình lên men
vi khuẩn Lactobacillus plantarum và bào tử nấm Linh chi.
3. Mục đích của đề tài
Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi thu dịch chiết bào tử

17. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
3
4. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp kết hợp
enzyme chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma
harzianum kí sinh trên nấm linh chi.
5. Phương pháp nghiên cứu
Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm
Đề tài được xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals Analysis
Systems (SAS)
6. Kết quả đạt được ban đầu
Tìm ra được phương pháp phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp kết hợp
chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum
Xác định được tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi trên một lượng nhất định.
7. Hạn chế của đề tài
Tỷ lệ bào tử phá vỡ còn thấp làm hạn chế việc định lượng hoạt chất trong dịch trích
ly sau phá vỡ cũng như hiệu suất trích ly hoạt chất.

18. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi
Nấm Linh chi hay còn gọi là Linh chi thảo, nấm trường thọ, nấm lim, thuốc thần tiên,
hạnh nhĩ... Cách đây khoảng 2000 năm, nấm Linh chi đã được ghi trong sách “Thần
nông bản thảo kinh”, tác phẩm chuyên tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật
từ đời Hán trở về trước . Xưa kia linh chi chỉ được khai thác trong thiên nhiên nên nó
là loại thuốc quý, hiếm và rất đắt tiền. Từ đầu thế kỷ 17, nấm Linh chi đã được nuôi
trồng ở Trung Quốc, chính bởi chính giá trị dược liệu cao của chúng. Ngay từ thời
Hoàng đế, trong các thư tịch cổ đã ghi chép về giá trị của Linh chi. Trong “Bản thảo
cương mục”, các ghi chép đã chuẩn mực hơn, và nấm Linh Chi ngày càng được coi
trọng. Cho nên, dễ hiểu là các nhà Đông y Việt Nam kế tục Lý Thời Trân, đã phát
hiện ra Linh Chi ở nước ta và như Lê Quý Đôn đã chỉ rõ đó là “nguồn sản vật quý
của đất rừng Đại Nam”.
1.1.1 Phân loại
1.1.1.1 Phân loại theo khoa học
Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim
(Ganodermataceae). Tên tiếng Anh là Varnished conk hay lingzhi.
Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010)
- Loài: Ganoderma lucidum
- Chi: Ganoderma
- Họ: Ganodermataceae
- Bộ: Ganodermatales
- Lớp phụ: Hymenomycetidae
- Lớp: Hymenomycetes
- Ngành phụ: Basidiomycotina
- Ngành: Nấm thật – Eumycota
- Giới: Nấm – Mycota hay Fungi
Theo trình định danh, có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này. Kể từ lần đặt tên
đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan xác

19. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
5
định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst đã mất đến 100 năm
(1881).
1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc
Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y Trung
Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu sắc
và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi.
Xích chi: Còn được gọi với những cái tên khác như Linh chi đỏ hay đơn chi, hồng
chi có vị đắng. Tên khoa học là Ganoderma lucidum. Xích chi giúp ích tâm khí, chủ
vị, tăng trí tuệ. Sử dụng linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh các
bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực.
Hình 1.1 Xích chi – Ganoderma lucidum
Thanh chi: Linh chi xanh hay long chi có màu xanh, vị chua. Tên khoa học là
Ganoderma genus. Thanh chi giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân
thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái.

20. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
6
Hình 1.2 Thanh chi Ganoderma genus
Bạch chi: Linh chi trắng hay ngọc chi có màu trắng. Tên khoa học là Fomitopsis
officinalis. Bạch chi có vị cay tính bình không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi.
Hình 1.3 Bạch chi Fomitopsis officinalis
Hoàng chi: Linh chi vàng hay kim chi, có vị ngọt, màu vàng. Tên khoa học là
Laetiporus sulphureus. Linh chi vàng có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần.

21. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
7
Hình 1.4 Hoàng chi Laetiporus sulphureus
Hắc chi: Linh chi đen hay huyền chi có màu đen và vị mặn. Tên khoa học là
Polyporus melanopus. Hắc chi có tác dụng ích thận khí, khiến cho đầu óc sản khoái
và tinh tường.
Hình 1.5 Hắc chi Polyporus melanopus
Tử chi: Linh chi tím hay Mộc chi, màu tím có vị ngọt. Tên khoa học là Ganoderma
sinense. Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi đẹp.

22. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
8
Hình 1.6 Tử chi – Ganoderma sinense
Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học Nhật Bản
chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khác loại
mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau. Nếu thay đổi điều kiện người ta
có thể có được sáu loại từ cùng một giống.
Hình 1.7 Phân loại linh chi theo màu sắc

23. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
9
Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại linh chi
theo các đặc điểm như:
 Vị trí nấm mọc trên cơ chất chủ.
- Nhóm mọc cao: tai nấm mọc từ gốc lên đến ngọn cây.
- Nhóm mọc gần đất : nấm mọc từ gốc cây chủ.
- Nhóm mọc từ đất : tai nấm mọc từ rễ cây hoặc xác mùn.
 Nhiệt độ ra nấm.
- Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 20o
C – 23o
C.
- Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 24o
C – 26o
C.
- Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 27o
C – 30o
C
Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đa dạng
về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N. 189). Linh chi thuộc
nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là Ganoderma
Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum
có tới 45 loại.
Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công
trong phòng thí nghiệm năm 1978. Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ
đặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào
nuôi trồng chủ động.
1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi
Về hình thái ngoài, chúng cũng có ít nhiều sai khác
1.1.2.1 Cuống nấm
Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống nấm ít
phân nhánh, đôi khi uốn khúc. Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng,
không có lông phủ trên mặt tán nấm.
1.1.2.2 Mũ nấm
Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt. Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi
khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia

24. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
10
rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu
đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có
đầu sợi dầy thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 - 10μm. Chính những tế bào
vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm. Lớp vỏ láng phủ suốt
theo cuống. Kích thước tán biến động từ 2 – 30cm, dày 0,8 – 2,5cm, cuống dài từ 2,5
– 3,5cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2cm). phần đính cuống hoặc gồ
lên hoặc lõm như lõm rốn. Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8cm màu vàng kem – nâu nhạt –
trắng. Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ. Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận
cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng
phủ trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh
trong cồn. Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được
mưa, nắng. Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử
1.1.2.3 Thụ tầng
Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,7 cm,
gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5 ống/mm.
Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không màu, dài
16 - 22μm. Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpose) phồng căng hay
lõm thụt vào mà thành.
1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi
Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử, tức
là hạt giống hữu ích cho đời sau. Bào tử đảm thường được mô tả có dạng trứng cụt.
Đôi khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn – nhọn. Thực ra đó là
do chụp phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành. Mỗi
bào tử được bao phủ với hai lớp tường rất khó khăn gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999),
màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt
dầu, kích thước bào tử rất nhỏ dao động ít nhiều khoảng từ 5-6 x 8,5 – 12 μm. Vỏ bào
tử khá dày, cỡ 0,7 – 1,2 μm, có cấu trúc phức tạp. Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vỏ
rất cứng, khó nảy mầm. Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi:
Polysacharide, triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng, với

25. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
11
hàm lượng đậm đặc hơn Linh chi từ 7 – 20 lần (Nguyễn Thị Sáu, 2014). Cho đến nay,
hơn 150 triterpenoids đã được phát hiện. Do những tiến bộ gần đây trong quang phổ
hiện đại và kỹ thuật quang phổ, một loạt các triterpenoids được phân lập từ bào tử
của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ. Từ
năm 1988 các nhà khoa học đã phân lập được 29 triterpenoids bao gồm cả cấu trúc
và hoạt tính sinh học của chúng.
Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác
nhau (Lê Xuân Thám, 1996)
Nguồn Kích thước bào tử (µm) Vùng thu mẫu
1889 Patouuillard
1939 Imazeki
1964 Teng
1972 Steyaert
1973Pegler et al 1976
Ryvarden
1980 Ryvarden et al
1981 Kiet
1982 Bazzalo et al
1986 Melo
1986 Gibertson et al
1986 Adaskaveg et al
1987 Petersen
1989 Zhao
1990 Hseu
1994 Thu
1994 Tham et al
1996 Tham
10 – 12 x 6 – 8
9,5 – 11 x 5,5 – 7
8,5 – 11,5 x 5 – 6,5
8,5 – 10,8 – 13 x 5,5 – 8,5
9 – 13 x 6 – 8
7 – 12 x 6 – 8
7 – 12 x 6 – 8
7,5 – 10 x 5 – 6,5
9 – 13 x 5 – 7
8,2 – 11,5 – 13,5 x 6,3 – 7,5 – 8,1
9 – 12 x 5,5 – 8
10 – 11,8 x 6,8 – 7,8
7 – 8 x 6 – 7,8
9 – 11 x 6 – 7
8,5 – 11,5 x 5 – 7
9 – 12 x 5 – 7
8 – 10,5 x 5 – 7
7,5 – 11,5 x 5,5 – 7
Đông Dương
Nhật Bản
Trung Quốc
Indonesia, Úc châu
Anh quốc
Bắc Âu, Phi châu
Đông Phi châu
Bắc Việt Nam
Argentine
Bồ Đào Nha
Bắc Mỹ
Bắc Mỹ
Bắc Âu
Trung Quốc
Đài Loan
Hà Bắc, Việt Nam
Lạng Sơn Việt Nam
Đà Lạt Việt Nam
Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử
bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất

26. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
12
mịn. Tuy vậy số lượng bào tử linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ
thu được 1 kg bào tử.
Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu tạo
tinh vi của bào tử đảm thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung
Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt. Rõ ràng kiến tạo lỗ thủng trên bề
mặt lớp vỏ ngoài là phổ biến. Lỗ nảy mầm hình tròn, khá lớn, là đặc điểm quan trọng
phổ biến ở các loài Ganoderma (đường kính 3,2 – 4,2μm). Thuật ngữ “germpore” là
tương đương định nghĩa “aperture” do Erdtman đưa ra (1952) – là chỉ vùng mà tại đó
vỏ bào tử mỏng đi rất nhiều, nơi mầm sợi nấm nguyên thủy (hay mầm ống phấn trong
trường hợp của tiểu bào tử ở thực vật) nhú ra khi nảy mầm (germination). Trên lớp
vỏ ngoài thấy rõ các trụ chống – chính là khái niệm “gai chống” theo nhiều tác giả
khác. Đỉnh các trụ nổi gồ thành các mụn cóc – gò hạt. Các trụ chống chính là tầng cột
theo phân loại của G.Erdtman (1952) (columellae), các trụ đuợc nối với nhau bởi các
vách mỏng chống từ tầng nền tới tầng phủ, chúng tạo thành các xoang rỗng của lớp
ngoài, nhờ đó tạo khả năng bảo vệ cao cho vỏ bào tử.
Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cản
quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học. Cấu trúc của lớp vỏ
trong cho đến nay còn chưa được biết rõ. Cần lưu ý rằng: khái niệm “gai chống nhọn”
từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác.
Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành
các u lồi – và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium,
exosporium hay chính là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt – mụn cóc
– u nhú trên bề mặt vỏ bào tử. Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973),
Mims et al (1989) đã từng phân tích và thảo luận nhiều.

27. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
13
Hình 1.8 Hình thái giải phẫu thể quả nấm linh chi Ganoderma lucidum
Hình 1.9 Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi Ganodermataceae
1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử).
2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ múi
ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma).
Bào tử nấm Linh chi chứa các vật liệu di truyền và các chất sinh học, nó có giá trị về
dược phẩm lớn hơn quả thể, tuy nhiên hoạt chất trong bào tử nấm khó thu nhận, cho
nên hầu hết các kết quả nghiên cứu về Linh chi được tiến hành bằng cách sử dụng
quả thể.

28. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
14
1.1.3 Chu kì sống của nấm Linh chi
Hình 1.10 Chu kì sống của nấm Linh chi
Bào tử đảm đơn bội, trong điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo nên hệ sợi sơ cấp (primary
hyphae) - trong thực nghiệm tỷ lệ nảy mầm khá thấp ở nhiệt độ 28o
C – 30o
C chỉ đạt
3 – 15%. Hệ sợi sơ cấp đơn nhân, đơn bội mau chóng phát triển phối hợp với nhau
tạo thành hệ sợi thứ cấp (tức hệ sợi song hạch), phát triển và phân nhánh rất mạnh
tràn ngập khắp giá thể.
Lúc này thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày - rất dày
(gasterospores – Chlamydospores), chúng dễ dàng rụng ra và khi gặp điều kiện phù
hợp sẽ nảy mầm cho ra hệ sợi song hạch tái sinh. Hệ sợi thứ cấp sẽ phát triển mạnh
đạt đến giai đoạn cộng bào tức là các vách ngăn được hòa tan. Tiếp đó là giai đoạn
sợi bện kết để chuẩn bị cho sự hình thành mầm móng thể quả (primordial). Đây chính
là giai đoạn phân hóa hệ sợi. Từ hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợi cứng màng
dày, ít phân nhánh, bện kết lại thành các cấu trúc bó được cố kết bởi các sợi bện phân
nhánh rất mạnh. Từ đó hình thành các mầm nấm màu trắng mịn vươn dài thành các
trụ tròn mập. Phần đỉnh trụ bắt đầu xòe thành tán, trong lúc lớp vỏ láng đỏ cam xuất
hiện. Tán lớn dần hình thành bào tầng và bắt đầu phát tán bào tử đảm liên tục cho đến
khi nấm già sẫm màu, khô tóp và lụi dần trong 3 – 4 tháng.
Nấm Linh Chi có thể mọc trên cây gỗ (thường là thuộc bộ đậu Fabales) sống hay đã
chết. Quả thể gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 – tháng 11), có thể trên thân cây (cuống
thường ngắn), quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây (khi ấy cuống thường dài và có thể

29. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
15
phân nhánh). Nấm thường mọc tốt dưới bóng rợp, ánh sáng khuếch tán nhẹ. Do có
lớp vỏ láng đỏ. Linh Chi có thể chịu nắng rọi – khi đó thường xuất hiện lớp phấn ánh
xanh tím, có thể chịu mưa liên tục. Ở những vùng thấp rõ ràng là ưu thế của các chủng
chịu nhiệt độ cao (28o
C – 35o
C) như ở vùng châu thổ sông Hồng và đồng bằng sông
Cửu Long (quanh TP. Hồ Chí Minh). Ở vùng núi đồi vĩ độ cao (>1000m) thường có
các chủng ôn hòa, thích hợp nhiệt độ thấp hơn (21o
C – 26o
C) – như vùng Đà lạt, Sapa,
Tam Đảo, Tây Nguyên…ở nước ta. Nếu theo các tư liệu cổ thì Linh Chi của vùng
rừng sâu, núi cao được coi là linh thiêng quí giá.
1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi
1.1.4.1 Dinh dưỡng
Nguồn carbon: nguồn carbon chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose, tinh
bột, pectin, lignin, cellulose, hemicelluloses, từ đó chúng tổng hợp năng lượng và tạo
thành các chất cần thiết.
Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu urê, muối
amon, sulphate amon. Nitơ không được quá nhiều làm cho sợi nấm mọc nhiều khó
hình thành quả thể. Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1. Giai đoạn
hình thành thể quả, tỉ lệ là 30/1 hoặc 40/1.
Nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg, K. nguồn vi lượng đó chỉ thêm trong quá trình nuôi
cấy giống mẹ, còn khi trồng thì chúng có trong nước và nông sản phẩm.
1.1.4.2 Nhiệt độ
Thích hợp nhất là 22 – 28o
C. Khi nuôi cấy tầng sâu nhiệt độ thích hợp là 28o
C không
thấp hơn 27o
C. Thông thường nhiệt độ thích hợp cho Linh chi phát triển là 24 – 28o
C.
Nhiệt độ không nên thay đổi lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triển thành tán
mà ở dạng sừng hươu, dạng đuôi gà.
1.1.4.3 Độ ẩm
Hàm lượng nước môi trường thường là 65% là vừa, quá nhiều hoặc quá ít sẽ ảnh
hưởng đến sự phát triển sợi nấm. Độ ẩm không khí nên giữ ở 85 – 95%, nuôi cấy
trong phòng cần giải quyết vấn đề về độ ẩm và thông thoáng gió.
1.1.4.5 Không khí

30. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
16
Nấm Linh chi là loài hiếu khí vì vậy cần thông gió, giữ độ ẩm và nhiệt độ thích hợp.
Khi nuôi cấy nấm trong tầng lỏng cần lắc 100 – 150 vòng/phút. Lắc mạnh dễ làm sợi
nấm đứt đoạn.
1.1.4.6 Ánh sáng
Nấm Linh chi cần ánh sáng tán xạ. Sợi nấm nuôi trong điều kiện ánh sáng từ 500 –
1200 lux.
1.1.4.7 Trị số pH
pH của môi trường nuôi nấm Linh chi là 3 – 7,5, thích hợp nhất là 5 - 6. Trong môi
trường lỏng là 4,5 – 5. Trong vật liệu trồng nấm điều chỉnh pH từ 5,8 – 6.
1.1.5 Thành phần dược tính của nấm Linh chi
1.1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát
Trong đề tài nghiên cứu năm 2005 của Nguyễn Minh Khang, thành phần dược tính
của nấm Linh Chi được phân như sau:
- Nước: 12 – 13%
- Cellulose 54 – 56%
- Lignin: 13 – 14%
- Hợp chất nitơ 1,6 – 2,1%
- Chất béo (kể cả dạng xà phòng hóa) : 1,9 – 2%
- Hợp chất phenol 0,08 – 0,1%
- Hợp chất Sterol toàn phần 0,11 – 0,16%
- Saponin toàn phần 0,3 – 1,23%
Theo Wachtel - Galor et al. (2011) trong nấm linh chi tươi, nước là thành phần chủ
yếu chiếm 90% khối lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo
chiếm từ 2 - 8%, carbonhydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lượng
tro chiếm 8 - 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác như kali, can-xi,
phốt pho, magne, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers et
al. (1999)). Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau et al. (2001)
đã xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm linh chi gồm: tro (1,8%),

31. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
17
carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 - 8%).
Hàm lượng của protein trong nấm linh chi khoảng 7- 8%, thấp hơn so với nhiều loại
nấm khác (Chang et al. (1996); Borchers et al. (1999)). Ngoài ra trong nấm còn chứa
các glycoprotein và các polysaccharide.
Bên cạnh đó, nấm linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học như
các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của chúng.
Hoạt tính sinh học của nấm linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide,
peptidoglycan và các triterpen mang lại (Boh et al. (2007).
1.1.5.2 Triterpenoid
Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có cấu trúc hóa học dựa trên cơ sở các phân tử
isopren liên kết lại với nhau, công thức tổng quát (C5H8)n với n ≥ 2, tuy isopren là
dẫn xuất của terpenoid nhưng pharnesyl pyrophosphate mới là chất liệu cơ bản để
sinh tổng hợp terpenoid. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2010). Terpenoid có tác dụng
chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lượng chất béo.
Triterpene là một phân lớp của terpenoid được phân bố rộng rãi trong giới động vật,
thực vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycosid. Cấu trúc hóa học của triterpen có thể
là mạch hở 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung sườn cacbon chính (Jose D. Connolly et
al. (1991)). Khối lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc
hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato et al. (1997)); Zhou et al.
(2007)).
Trong nấm linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là chất
tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình
thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis et al. (2002)). Trong quá trình chiết
xuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol,
acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng. Dịch chiết sau đó sẽ được phân
tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường hoặc
HPLC pha nghịch đảo (Chen et al. (1999); Su et al. (2001)). Những triterpene đầu
tiên được Kubota phân tách từ nấm linh chi là ganoderic acid A và B (Kubota et al.
(1982)). Kể từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của chúng đã được

32. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
18
tìm ra. Trong số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong nấm linh chi.
Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có một số loại
khác như là ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Jiang et al. (2008)).
Nấm linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần tạo
nên vị đắng của nấm linh chi. Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức
khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể. Tuy
nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm linh chi lại không ổn định. Chúng phụ thuộc
rất nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế
biến, điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành
vào năm 1999 và 2001 (Chen et al. (1999); Su et al. (2001)). Cho đến nay, hơn 150
triterpenoids đã được tìm thấy từ quả thể của nấm Linh chi đại diện cho năm lớp cấu
trúc chính. So với quả thể của nấm Linh chi, các nghiên cứu về bào tử của nấm Linh
chi mới bắt đầu từ năm 1988 (Hou CY et al. (1988)), cho đến nay đã có 29 loại
triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này. Với những tiến bộ gần đây trong
quang phổ và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập từ
các bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược
sĩ. Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổng hợp
tương tự nhau, cụ thể là con đường acid mevalonic (MVA) (Bingji Ma et al. (2011)).
Các Triterpenoids này được bắt đầu từ trans - squalene và sau đó đã được thay đổi
bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấu hình
triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi.
Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1 protease,
chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung. Triterpenoids này là thành phần hoạt
chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khác nhau được
sử dụng trong dược liệu.

33. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
19
Hình 1.11 Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi
(Bingji Ma et al. (2011))

34. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
20
Hình 1.12 – 29 Triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma et al. (2011))
 Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi
Năm triterpenoids đã được cô lập từ phần trong ether - tan của bào tử của nấm Linh
chi và trên cơ sở tính chất hóa học và dữ liệu quang phổ, acid ganopsoreric A (1),
acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3), acid ganoderic E (4) và

35. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
21
ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma et al. (2011)). Thí nghiệm
dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTP thấp đối với gan chuột bị
tổn thương bởi CCl4 và GaNI (Chen RY et al. (1993)). Hai triterpenoids pentacyclic
mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi,
có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việc hình thành liên kết C18 và
C23 (Chen RY et al. (1991)). Hai triterpenes lanostane kiểu mới, lucidumol A (8) và
β - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) và bảy triterpenoids đã biết,
ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A (13), acid ganolucidic
A (14), và 2, 3, 5. Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất 5, 10, 11 và 14 cho thấy
khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV) - 1 protease hoạt động
đáng kể với giá trị IC50 với giá trị 20 - 90 mM (Min BS et al. (1998)).
Sáu triterpenes lanostane loại oxy hóa cao mới, được gọi là ganoderic acid γ (15),
acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acid ganoderic η
(19), acid ganoderic θ (20), cùng với ganolucidic axit D (21) và axit ganoderic C2
(22) được phân lập từ các bào tử nấm. Các khả năng gây độc của các hợp chất 15-21
đã được thực hiện trong ống nghiệm chống Meth - A và LLC dòng tế bào ung thư
(Min BS et al. (1998)). Một terpenoid C27 oxy hóa cao mới, lucidenic axit SP1 (23),
được phân lập từ một phần CHCl3-tan của bào tử nấm Linh chi cùng với mười một
triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12,
13, 14
1.1.5.3 Hợp chất saponin
Saponin là một nhóm chất trao đổi thứ cấp quan trọng trong thế giới thực vật. Tên gọi
của saponin bắt nguồn từ từ sapo trong tiếng latin, có nghĩa là xà phòng. Saponin có
tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt
của dung dịch và tạo nhiều bọt. Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng.
Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao, từ 200o
C trở lên và có thể trên
300o
C. Saponin bị tủa bởi chì acetate, hydroxide barium, sulphate amonium nên lợi
dụng chất này để cô lập saponin. Về phương diện hóa học, saponin được xác định
gồm các cấu trúc khác nhau: triterpenoids, glucosylated steroids steroidal alkaloids.

36. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
22
Khả năng dược tính: trị long đờm, chữa ho, chất phụ gia cho một số vaccine, thông
tiểu, kháng viêm, chống khối u.
1.1.5.4 Những thành phần khác
Tiến hành phân tích thân nấm linh chi, người ta còn tìm thấy thành phần chất khoáng
như phospho, silicon, sulfur, kali, calcium và magnesium chiếm một tỉ lệ khá cao.
Bên cạnh đó còn có sắt, nhôm, kẽm, đồng, mangan và strontium với hàm lượng thấp
hơn. Ngoài ra còn có một số kim loại nặng như chì, cadmium và thủy ngân (Chen et
al. (1998)). Trong một nghiên cứu của Chiu được tiến hành vào năm 2000, khi phân
tích nấm linh chi hoang thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định được trong hàm
lượng chất khoáng của loại nấm này có chứa 10,2% là kali, calcium và magnesium.
Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấy cadmium và thủy
ngân trong những mẫu nấm linh chi, nhưng hàm lượng selenium được xác định là 72
µg/g.
Trong thành phần của nấm linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận được rất
nhiều sự quan tâm, đó là germanium. Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các
chất khoáng (489 µg/g) có trong nấm linh chi. Chất này tồn tại rất ít ở các loại thực
vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội và tỏi.
Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu, nhưng chỉ cần một liều lượng
thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch, kháng khối u, chống oxy
hóa và chống đột biến (Kolesnikova et al. (1997)).
Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm linh chi đó là các loại enzyme
như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đông máu).
Ngoài ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (như
adenosine và guanosine) cũng đã được tìm thấy trong nấm linh chi, đây là những hợp
chất có tác dụng ức chế thuận nghịch α-glucosidase và SKG-3.
1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi
1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư
Nấm linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thư nhằm giúp
tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng những liệu pháp

37. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
23
chữa trị thông thường. Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã có những
tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phương pháp
hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rất nhiều
khó khăn thử thách (theo WHO 2008). Trong quá trình tìm kiếm những phương pháp
điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài thực
vật, trong đó có cả nấm linh chi, những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn quá
trình hình thành khối u (Wasser et al. (1999); Borchers et al. (2008)). Trong nấm linh
chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất từ thân nấm, sợi
nấm và bào tử. Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm hợp chất chính
trong nấm linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá trình hình thành
khối u. Một trong những tác dụng mới được tìm thấy của dịch chiết nấm linh chi là
có khả năng hỗ trợ điều trị cho các căn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và
bệnh liên quan đến gan (Bao X et al. (2005)). Những thí nghiệm trên động vật đã cho
thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung
thư. Tuy nhiên, việc tiến hành những thí nghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn
chế.
1.1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch
Những tác nhân giúp làm tăng khả năng hoạt động của hệ miễn dịch cũng có tác dụng
tăng cường sức khoẻ, qua đó giúp ngăn ngừa bệnh tật. Nhiều thành phần trong nấm
linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của
các tế bào lympho, các bạch cầu đơn nhân, các tế bào NK (natural killer cells) (Bao
et al. (2001); Cao et al. (2002)). Trong một nghiên cứu của Chang et al. (2009) được
tiến hành trên chuột BALB/c cho thấy dịch chiết nấm linh chi chứa nhiều
polysaccharide có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào
spleno và hoạt tính của các đại thực bào và các tế bào NK.
Trong một nghiên cứu khác của Wang et al. (1997), polysaccharide có trong nấm linh
chi có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lympho T và các đại thực
bào, bằng cách làm tăng hàm lượng IL- 1β, TNF-α và IL-6. Cũng trong một nghiên
cứu khác, quá trình ủ của các đại thực bào và các tế bào lympho T bằng các

38. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
24
polysaccharide đã cho thấy hàm lượng TNF- α và INF- γ tăng lên (Zhang et al.
(1999)).
1.1.6.3 Khả năng chống oxy hóa
Những hợp chất chống oxi hoá trong thực vật có tác dụng ngăn ngừa ung thư cũng
như những căn bệnh nan y khác (Collins et al. (2005); Benzie et al. (2009)). Những
hợp chất này có tác dụng bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào chống lại những
tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những nguy cơ gây
ra đột biến và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch. Những hợp
chất có trong nấm linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene cũng có
tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào (Lee et al. (2001); Lin et al. (2002); Shi
et al. (2002); Wachtel-Galor et al. (2005))
1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường
Những thành phần của nấm linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường
huyết đối với động vật. Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách
từ thân nấm linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100
mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác dụng hạ đường huyết vẫn
tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikiko et al. (1985)). Cũng trong một thí nghiệm trên
chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng
glucose trong máu và điều chỉnh quá trình tổng hợp glucose dưới tác dụng của các
enzyme có sẵn trong gan (Hikiko et al. (1989)). Trong một nghiên cứu khác cũng
được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide
khác có trong nấm linh chi được gọi là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết
(Hikiko et al. (1989)).
1.1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi
Trong các nghiên cứu gần đây, bào tử của nấm Linh chi chứa một số hoạt chất sinh
học phong phú hơn nhiều so với trong quả thể của chúng (Chaiyavat Chaiyasut et al,
2010). Tuy nhiên, với bào tử của nấm Linh chi được cấu tạo phức tạp với 2 lớp vách
rất cứng và bền vững, hai lớp vách này có thành phần gồm silica (19,01%), canxi
(19,01%) và chitin (52,08 - 57,64%) (Jungjing et al, 2007.) nên đã làm hạn chế rất

39. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
25
nhiều khả năng thu nhận các hoạt chất sinh học này.
Daniel Sliva, Ph.D. et al., 2003 đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung
thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn
nguyên, bào tử bị phá vỡ, bột quả thể, dịch chiết của quả thể và bào tử với các nguồn
cung cấp khác nhau và đã thu được kết quả như bảng 1.1.2
Bảng 1.2: So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái
khác nhau của nấm Linh chi (2.5mg/mL)
Tên Nguồn gốc Thành phần Khả năng ức
chế tế bào ung
thư
Zihang
a Trung Quốc Bào tử còn nguyên 89.3%
Zhongke
b Trung Quốc Bào tử phá vỡ 71.9%
Jilin
c Trung Quốc Bào tử còn nguyên 9.5%
Two Urn
d Trung Quốc Bột quả thể 54.3%
Double Crane
e Đài Loan Bột quả thể 86.5%
ReishiMax
f Mỹ Dịch chiết quả thể
và bào tử
99%
Từ những nhận định và kết quả thí nghiệm nêu trên cho ta thấy việc phá vỡ bào tử
nấm Linh chi nhằm tăng khả năng dược liệu của nó cần được quan tâm. Trong những
năm gần đây đã có nhiều sáng chế tiết lộ phương pháp phá vỡ vách bào tử nấm Linh
chi. Ví dụ: patent JP52041208 tiết lộ quá trình chiết xuất các thành phần sinh học của
bào tử bằng phương pháp sử dụng biện pháp cơ học, JP2240026A tiết lộ việc sử dụng
các dung môi để phá vỡ, CN1165032 tiết lộ phương pháp phá vỡ bằng cách sử dụng
enzyme hòa tan như lysozyme, cellulose và hemicellulase, lạnh đông và dùng sóng

40. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
26
siêu âm. Hay theo patent CN 101596220 A của Trung Quốc, bào tử nấm Linh chi
được phá vỡ bằng một số phương pháp sinh học như: sử dụng enzyme hòa tan để thủy
phân vách bào tử hay sử dụng một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lớp vách
này nhằm tăng cường hiệu quả sử dụng các hoạt chất sinh học có trong bào tử mà chi
phí thấp và hiệu quả tương đối cao. Cũng theo patent này ngoài biện pháp sinh học
để phá hủy lớp vách của bào tử, còn có thể sử dụng một số biện pháp hóa học như
dùng dung dịch có tính acid hay kiềm để làm bào mòn lớp vách, tuy nhiên, với phương
pháp hóa học này sẽ làm ảnh hưởng đáng kể khả năng hoạt động của các hoạt chất
sinh học có trong bào tử và dư lượng của các loại hóa chất dùng cho quá trình phá
vách bào tử có thể làm ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như sức khỏe. Ngoài ra,
một số biện pháp vật lý: sóng siêu âm, vi sóng, nhiệt độ thấp, lạnh đông… cũng được
sử dụng nhưng nhìn chung khả năng làm suy yếu lớp vách của bào tử còn thấp và chi
phí đầu tư cao.
Trong một nghiên cứu khác của Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama and
Sasithorn Sirilun năm 2010 ở Thái Lan, bào tử của nấm Linh chi được phá vỡ bằng
cách lên men với Lactobacillus plantarum với kỹ thuật rất đơn giản, ít chi phí. Nó có
thể được sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm lên men với các lợi ích từ bào tử
nấm Linh chi và vi khuẩn lên men lactic. Trong đồ án này, tôi đã thực hiện phá vỡ
bằng phương pháp lạnh đông bào tử nấm Linh chi kết hợp sử dụng enzyme dịch nuôi
cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 là nấm mốc kí sinh trên nấm Linh chi cùng
với chế phẩm enzyme Cellulase C32002 của Novozyme để phá vách bào tử nấm Linh
chi.

41. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
27
1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma
Trichoderma là chi nấm khá phổ biến trong tự nhiên, tuy nhiên hệ thống phân loại
của chúng chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau đưa ra khi
phân loại giống nấm này. Trichoderma là một chi nấm hiện diện trong đất, chúng
phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác…), nhiều loài
trong chi này có khả năng sống cộng sinh với cây. Có thể nói Trichoderma là một
trong số những loài vi nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng được tìm thấy ở
khắp nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Nấm Trichoderma phổ biến ở những
khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, chúng hiện diện trên rễ cây, trong đất hay
xác sinh vật đã chết, xác bã hữu cơ hay kí sinh trên các loài nấm khác. Mỗi dòng nấm
Trichoderma khác nhau sẽ yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Harman, 2000).
1.2.1 Phân loại
- Giới (Kingdom): Nấm (Fungi)
- Ngành (Phylum): Nấm túi (Ascomycota)
- Lớp (Class): Sordariomycetes
- Phân lớp (Subclass): Hypocreomycetidae
- Bộ (Order): Hypocreales
- Họ (Family): Hypocreaceae
- Chi (Genus): Trichoderma
- Loài (Species) : Trichoderma spp.
1.2.2 Lịch sử phát triển
Chủng nấm Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794,
vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài:
1- Trichoderma caesium Pers. (1794).
2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794).
3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794).
Cho đến năm 1801, Persoon và Gray đã mô tả chi tiết được 7 loài nấm Trichoderma
đó là:

42. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
28
1- Trichoderma caesium Pers. (1794).
2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794).
3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794).
4- Trichoderma aureum Pers. (1796).
5- Trichoderma laeve Pers. (1796).
6- Trichoderma dubium Pers. (1801).
7- Trichoderma fuliginoides Pers. (1801).
Trong suốt 2 thế kỷ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế giới đã
phát hiện thêm khoảng 90 loài. Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm
khoảng 50 loài mới. Cho đến năm 2013, đã có trên 150 loài nấm Trichoderma
được mô tả.
1.2.3 Đặc điểm chung của Trichoderma
1.2.3.1 Đặc điểm hình thái
Hình 1.13 – Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường thạch dịch
chiết khoai tây (PDA)
Chủng nấm Trichoderma spp. thuộc nhóm nấm bất toàn (là những nấm sinh sản vô
tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành

43. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
29
chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử), có khuẩn lạc màu lục khi tăng trưởng
có sự hiện diện của ánh sáng mặt trời. Sợi nấm của Trichoderma phân nhánh mạnh,
thường hình thành ở dạng gần như vòng tròn đồng tâm. Các sợi nấm thường mọc tạo
góc với trục chính khoảng 90 độ.
Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh
phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu
và liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy.
Hình 1.14 – Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum
Bào tử của nấm Trichoderma mịn, trơn láng có màu xanh lá cây hoặc màu vàng. Bào
tử của hầu hết các loài có hình elip, 3-5 x 2-4 µm (L/W=1.3), bào tử hình cầu
(L/W<1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài.
1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng
Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn
carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là
monosaccharide, disaccharide, polysaccharide… NH3 là nguồn đạm mà nấm
Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên thường có mặt trong môi trường nuôi cấy loài nấm
này, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh
dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng

44. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
30
của Trichoderma. Nhưng muối NaCl sẽ làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của
một số loài Trichoderma, do đó trong môi trường nuôi cấy không nên có sự có mặt
của NaCl. Nồng độ CO2 cũng ảnh hưởng phần nào đến sự sinh trưởng của
Trichoderma. Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300
C, có một vài loài
Trichoderma tăng trưởng được ở 350
C. Một số ít phát triển tốt ở 400
C (Samuels,
2000). Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 - 7,0 nhưng không thể phát
triển trong điều kiện pH < 3,5, phát triển tốt ở pH trung tính. Các chủng Trichoderma
có tốc độ tăng trưởng nhanh, đường kính khuẩn lạc đạt trung bình 2 cm – 9 cm sau 4
ngày nuôi cấy (Bùi Xuân Đồng, 1982).
Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau.
Ví dụ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong
môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích
hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu ấm
áp.
Phần lớn các loài Trichoderma có tính cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện môi
trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn hay bào tử xuất hiện trong
điều kiện sáng. Bào tử trên môi trường thạch agar dưới ánh sáng 85 Lux trong 20 -
30 giây sẽ làm tăng hiệu quả nẩy mầm. Đối với thể bào tử phialiconidio cảm ứng với
ánh sáng nhất, chúng sẽ xuất hiện nhiều dưới ánh sáng ban ngày trong khoảng 3 phút
hoặc dưới tia cực tím ở 10 - 30 giây. Một số tác giả đã công bố Trichoderma hình
thành bào tử nhiều nhất ở bước sóng từ 380 nm - 440 nm, và không hình thành bào
tử ở bước sóng dưới 254 nm và trên 1100 nm. Các bào tử cảm quang bị hạn chế phát
triển dưới sự có mặt của các hóa chất như: azaguanine, 5-fluorouracil, actiomycin D,
Cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidum bromide,… các hóa chất này sẽ ngăn
chặn sự hình thành của các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc rất đặc biệt, có tiềm
năng trong phòng trừ sinh học. T. hamatum, T. hazianum, T. viride và T. virens ở
trong cả môi trường lỏng và rắn có acide thích hợp cho sự nảy mầm bào tử hơn là
môi trường trung tính.

45. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
31
1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma
Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma.
Weidling và Emerson đã phân lập được chất độc kết tinh từ sản phẩm trao đổi chất
của Trichoderma, đó là: gliotoxin (C13H14N2S2O4).
Chất độc thứ hai do Brian và Mc. Growan công bố là virindin (C9H16O6), được sản
xuất từ T. viride. Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp. còn sinh tổng hợp
một sản phẩm trao đổi chất khác gliotoxin và virindin, đó là kháng sinh: trichlorofore
từ T. viride và T. polysporum, kháng sinh peptide từ T. harzianum.
Bên cạnh sản phẩm trao đổi chất là chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn sinh
tổng hợp được một số các enzyme có hoạt tính sinh học mạnh như: exo và
endoglucanase, cellobiose và chitinase.
1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp
Trichoderma spp. có thể sinh tổng hợp đuộc nhiều loại enzyme ngoại bào như
chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulase, protease… để phân hủy
nguồn xác bã thực vật và vách tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký sinh
của chúng. Sau đây là một số hệ enzyme điển hình
1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase
Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết cấu
trúc polymer ở nấm và côn trùng, có công thức hóa học [C8H13NO5]n
Hình 1.15 – Cấu trúc chitin
Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên chitin là chất
hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn bộ
cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật.

46. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
32
Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, cồn, dung
môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm
đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật.
Chitinase là enzyme thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2 đơn
vị β – 1,4 – N – acetyl glucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân làm 3
lớp (Sahai và Manocha, (1993))
1. Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetyl chitobiose
2. Endochitinase: phân cắt liên kết bên trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng
thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacetyl chitobiose.
Endochitinase có vai trò quan trọng trong quá trình ký sinh nấm.
3. β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase phân cắt chitotetraose, chitotriose,
diacetylchitobiose thành GlcNac monomer
Glucosamin là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có nhóm
amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của
nhóm amino.
Hình 1.16 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase

47. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
33
Người ta đã tinh chế được rất nhiều chitinase, trong đó phổ biến nhất là endochitinase
có kích thước 42 kDa, sau đó là N – acetyl – β – D – glucosaminidase có kích thước
70 – 73 kDa. Ngoài ra còn có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz et al, (1992)),
chitobiosidase 40 kDa, enzyme này có thể hoạt động một mình hoặc kết hợp với
enzyme endochitinase 42 kDa (Harman et al, (1993)), exochitinase 28 kDa (Deane et
al,(1998)) và β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase 102 kDa có vai trò duy nhất trong
việc gây biểu hiện các enzyme thủy phân chitin khác nhưng chưa tinh chế được
(Harman et al, (1995)).
Chitinase ở Trichoderma spp. được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh, hoạt
động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như β – glucanase,
sự phối hợp giữa hai enzyme này làm tăng hiệu quả hoạt động thủy phân. Mặt khác,
theo báo cáo của Lorito (1994) cho biết, có sự phối hợp tác động lên màng tế bào
giữa enzyme thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như chất tổng hợp.
1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase
β – glucan trong vách tế bào nấm thường ở dạng β – 1,3 – glucan và nhánh là dạng
β– 1,6 – glucan. β – glucanase cũng là một enzyme quan trọng của Trichoderma spp.
trong đời sống hoại sinh và ký sinh nấm, gồm 2 lớp enzyme chính: β-1,3-glucanase
và β-1,6-glucanase
 β-1,3– glucanase: enzyme phân cắt liên kết o – glycosidic của β-1,3– glucan nhờ
2 cơ chế
1. Exo-β-1,3– glucanase phân cắt giải phóng glucose ở cuối chuỗi liên kết
polymer
2. Endo-β-1,3– glucanase cắt liên kết β ở vị trí bất kì trong chuỗi polysaccharide,
giải phóng oligosaccharide.
Trichoderma spp. phân giải β-1,3– glucan thường kết hợp giữa 2 hoạt tính exo và
endo- β-1,3– glucanase, β-1,3– glucanase có vai trò chính trong quá trình hoại sinh
và ký sinh nấm, ngoài ra β-1,3– glucanase giúp thực vật chống lại mầm bệnh.
Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo vách tế bào của các loài nấm khác nhau,
Trichoderma spp. tiết β– glucanase ở các mức độ khác nhau. Lorito năm 1994 đã tách

48. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
34
chiết in vitro được một endo - β-1,3– glucanase 78 kDa có khả năng ức chế sự nảy
mầm bào tử B.cinerea khi phối hợp với một GlcNAcase.
Ở một số chủng khác như T. harzianum T – 24, El-Katatny (2001) đã tách chiết được
một endo- β-1,3– glucanase có kích thước tương tự, có khả năng ức chế sự phát triển
của Sclerotium rolfsii khi kết hợp với một endochitinase 43 kDa. Lorito (1995) đã tạo
dòng gen của β-1,6– endoglucanase kích thước 43 kDa, có thể ức chế sự phát triển
của nhiều nấm bệnh khi phối hợp với các enzyme thủy phân khác.
 β-1,6– glucanase: trong điều kiện đặc biệt, Trichoderma spp. tiết β-1,6– glucanase,
enzyme này phân cắt liên kết β-1,6– glucan trong vách tế bào nấm.
1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase
Hình 1.17 Cấu tạo cellulose
Cellulose là chất trùng hợp với tiểu đơn vị là D – glucose nối nhau bởi liên kết β –
1,4 – glycosidic, cellulose được sử dụng như một nguồn năng lượng carbon ở rất
nhiều vi sinh vật tiết ra cellulase.
Hệ enzyme cellulase ở Trichoderma spp. được phân thành 3 lớp:
1. Exo β-1,4-D-glucanase (cellobiohydrolase) hay C1 giải phóng đơn vị
cellobiosyl từ chuỗi cellulose
2. Endo β-1,4-D-glucanase hay Cx phân cắt liên kết glucosidic bên trong cấu trúc
cellulose.
3. β-1,4-D- glucosidase phân cắt cello – oligosaccharide thành glucose khử.
Quá trình thủy phân cellulose có sự phối hợp của ít nhất là hai enzyme
cellobiohydrolase, hai enzyme endoglucanase và một enzyme β-glucosidase (Hui et

49. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
35
al, (2001)). T reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo nhiều cellulase, T.
harzianum T3 cũng là một chủng rất hiệu quả trong việc tạo ra nhiều loại cellulase.
1.2.4.4 Hệ enzyme protease
Theo Delgado và Janara (2000) khi khảo sát trên T. harzianum đã xác định nhiều loại
protease khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, trong môi trường có pH thấp
và bổ sung chitin, glucose, amon… T. harzianum tiết protease acid làm tác nhân điều
hòa, đáp ứng nhu cầu phân hủy những protein ngoại bào như chitinase, glucanase,
cellulase. Ngược lại protease có tính base hoặc trung tính được T. harzianum sinh ra
trong môi trường có nguồn carbon khó bị phân hủy như vách tế bào nấm.
Theo Haab (1990) đã tách chiết được một protease acid 42 kDa không nhạy cảm với
pepsatin có liên quan đến sự giảm sút enzyme cellulase từ T.reesei QM 9414 trong
điều kiện tạo cellulase. Một nghiên cứu khác của Dunaevesky và cộng sự (2000) đã
tách chiết được một protease 73 kDa thuộc nhóm protease serin khi nuôi cấy T.
harzianum. Protease của Trichoderma spp. có tác dụng thủy phân protein vốn là một
phần của bộ khung vách tế bào.

50. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
36
Bảng 1.3 Một số loại enzyme thủy phân của Trichoderma harzianum
Gen Hoạt tính Giống Tài liệu tham khảo
Chitinase
exc2
excl/nagl
-
-
ech42
chit42
cht42
ThEn42
-
-
chit36
chit33
-
-
-
-
73
73
64-69
28
52
42
44
42
42
40
37
36
33
31
N-
acetylglucosaminidase
N-
acetylglucosaminidase
Endochitinase
Endochitinase
Chitobiosidase
Endochitinase
Endochitinase
Endochitinase
Endochitinase
TM
T25-1
T25-1, P1a
T189
TM, TY
IMI206040a
CECT 2413
Gv2908
O1a
P1a
CECT 2413
109
TM
CECT 2413
TM, TY
Haran et al (1995)
Draborg et al
(1995)
Peterbauer et al
(1996)
Deane et al (1998)
Haran et al (1995)
Carsolio et al
(1994)
Garcia et al (1994)
Back et al (1990)
Lorito et al (1998)
Harman et al
(1993)
Cruz et al (1992)
Viterbo et al (2001)
Haran et al (1995)
Glucanase
bgn13.1
-
-
-
b16-2
lam1.3
-
78
74
36
17
43
110
75
β-1,3-endoglucanase
β-1,3-endoglucanase
β-1,3-endoglucanase
β-1,6-endoglucanase
β-1,3-exoglucanase
β-1,3-exoglucanase
P1a
, CECT
2413
T24
39.1
CECT 2413
CECT 2413
T – Y
Cruz et al (1992)
El Katatny et al
(2001)
Lorito et al (1998)
Lora et al (1995)
Cohen – Kupiec et
al (1999)
1.3 Giới thiệu về enzyme phá vách tế bào
Enzyme là protein trong tế bào, chúng được hình thành bởi các chuỗi đặc biệt của các
axit amin mà kết hợp với nhau trong hình dạng khác nhau để làm các công việc đặc
biệt như phá vỡ tạo thành đường và các phân tử chất béo, giải phóng hợp chất cao

51. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
37
phân tử bên trong tế bào hoặc làm ra nhiều enzyme hơn. Các enzyme khác nhau có
chức năng riêng, việc ứng dụng chức năng của từng loại enzyme có ý nghĩa lớn trong
nghiên cứu sinh học. Ngay trong các tế bào vi khuẩn nhỏ nhất có thể có khoảng 1000
loại enzyme làm việc. Việc nghiên cứu ứng dụng các enzyme này có ý nghĩa thực
tiễn với sự phát triển của khoa học đời sống, ứng dụng vào nhiều mặt kinh tế xã hội.
Hiện nay trên thị trường Việt Nam có nhiều loại chế phẩm enzyme thương mại ứng
dụng trên nhiều lĩnh vực. Ngành công nghiệp enzyme rất cần thiết cho các ngành
công nghệ thực phẩm, nước giải khát, trong phân tích y học và trong công nghiệp,
ngày nay chúng được thêm vào bột giặt để tăng hiệu quả giặt tẩy… Chế phẩm enzyme
thương mại thường được tổng hợp bởi thực vật, động vật, vi sinh vật hoặc nuôi cấy
mô động, thực vật nhưng hiện nay đa số các enzyme thường được tổng hợp nhờ quá
trình lên men vi sinh vật ở quy mô công nghiệp nhờ giá thành rẻ, hoạt tính cao, chu
kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể dễ dàng điều khiển sinh tổng hợp enzyme
theo chiều hướng có lợi theo nhu cầu vì vi vật có khả năng cảm ứng với môi trường
nuôi cấy rất nhanh.
1.3.1 . Enzyme phá vách tế bào thực vật
Vách tế bào thực vật được cấu tạo bởi vách cellulose bao phủ bề mặt màng nguyên
sinh chất và không bào, bảo vệ các thành phần bên trong của tế bào. Hệ thống vách
tế bào có mối tương quan sinh lý chặt chẽ tạo ra một hệ thống thẩm thấu có hiệu lực,
vách tế bào dày lên đảm bảo cho sự cứng rắn, thực hiện được chức năng năng nâng
đỡ. Ngoài ra vách tế bào còn giữ vai trò trong một số hoạt động hấp thu, thoát hơi
nước, di chuyển và tiết. Trong quá trình hình thành vách, có nhiều thành phần hóa
học khác nhau tham gia cấu tạo nên vách tế bào, những thành phần đó là cơ chất
không định hình (matrix) có nhiều trong màng sơ cấp như pectin, hemicellulose làm
chất xây dựng bộ khung sườn của vách, những chất này sắp xếp trong mạng tinh thể
có dạng sợi. Cellulose là chất cơ sở chủ yếu để cấu trúc nên bộ khung sườn nằm trong
cơ chất của vách. Vì vậy, đối với một số enzyme phá vách tế bào thực vật, cellulose
đóng vai trò là cơ chất của quá trình thủy phân phá vách.

52. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
38
Enzyme cellulolytic phân hủy cellulose, polymer cellulose chính là thành phần quan
trọng của màng tế bào thực vật. Nhiều vi khuẩn sản xuất phức hợp enzyme cellulolytic
gọi là cellulosomes, các enzyme cellulolytic được nấm tiết ra được gọi là cellulase.
Hình 1.18 Enzyme cellulolytic xâm nhập vách tế bào qua lỗ của vách tế bào
Dựa vào nghiên cứu của Ding và cộng sự (2013) sử dụng kính hiển vi nanomette vi
mô cho thấy các enzyme phá vách tế bào từ nấm và vi khuẩn xâm nhập vào vách tế
bào qua cấu trúc lỗ của vách, các enzyme này sử dụng cơ chất cellulose biến đổi thành
đường. Nhờ các enzyme ứng dụng tiềm năng này làm cơ sở cho sản xuất các sản
phẩm giá trị cao như ethanol hay axit hữu cơ từ các nguồn cellulose tái tạo rẻ tiền.
Những tiến bộ nhanh chóng trong nghiên cứu cellulosomes đang cung cấp thông tin

53. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
39
cơ bản cho sự phát triển nghiên cứu của cả in vitro và in vivo một cách hệ thống để
nghiên cứu về các phương pháp phá vách tế bào ứng dụng trong công nghiệp.
Trên thị trường Việt Nam, để phá vách tế bào chỉ có các chế phẩm enzyme cellulase
công nghiệp có nguồn gốc từ Aspergillus spp. hoặc từ Trichoderma spp. Ứng dụng
của các chế phẩm này thường được dùng để sản xuất ethanol công nghiệp hoặc axit
hữu cơ công nghiệp.
Mặc dù một số lượng lớn các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase, tuy nhiên
vi sinh vật của chủng Trichoderma và Aspergillus được sử dụng nhiều trong sản xuất
công nghiệp bởi hoạt tính mạnh chi phí sản xuất thấp, hiệu quả thu hồi cao. Một số
hãng sản xuất cũng đã ứng dụng hai chủng nấm trên để sản xuất enzyme thương mại
cung cấp cho thị trường.

54. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
40
Bảng 1.4 Một số enzyme thương mại và thành phần enzyme trong chế phẩm
Tên enzyme Chủng vi sinh vật Enzyme hoạt động Hãng sản xuất
Lysing
Enzyme
Trichoderma
harzianum
Cellulase
Protease
Chitinase
Sigma Poole UK
Cat No L2265
Lysing
Enzyme
Trichoderma
harzianum
β-glucanase
Cellulase
Protease
Chitinase
InterSpex
Foster City USA
Cat No 0412 - 1
Kitalase Rhizoctonia solani β-glucanase
Protease
Pectinase
Amylase
ICN FLOW
High Wycombe
UK
Cat No 153527
Lysing
Enzyme
Trichoderma
harzianum
Cellulase
Protease
Xylanase
Chitinase
ICN FLOW
High Wycombe
UK
Cat No 152338
Glucanex Trichoderma spp β-glucanase Novo Nordisk
Ferment Ltd
Neumatt CH
Cat No 367 - 5106
Các enzyme cellulase thương mại được áp dụng để tăng chất lượng sản phẩm thực
phẩm và thức ăn gia súc. Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu được
gia công bằng chế phẩm cellulase sẽ mềm ra, làm tăng hệ số đồng hóa và chất lượng
sản phẩm được tăng lên. Enzyme cellulase thương mại cũng làm tăng hiệu suất trích

55. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
41
ly các chất khác nhau từ nguyên liệu thực vật như trà, cà phê, đậu nành… Enzyme
cũng làm thủy phân các nguyên liệu gỗ, phế liệu gỗ cho công nghiệp sản xuất giấy,
ethanol…
1.3.2 Enzyme Cellulase C20032
Chế phẩm enzyme cellulase C20032 là sản phẩm thương mại của Novo Nordisk. Sản
phẩm ngoài enzyme cellulase là chủ yếu còn có hệ enzyme chitinase, protease, β-
glucanase. Hệ enzyme của C20032 được coi là phù hợp để nghiên cứu phá vách bào
tử nấm Linh chi bởi hệ enzyme trong chế phẩm nhìn chung có thể đáp ứng được khả
năng phá cấu trúc vách chitin đôi của bào tử đảm nấm Linh chi.
Bảng 1.5 Thông tin chế phẩm enzyme cellulase C20032 của Novozyme
Chế phẩm Nhiệt độ tối ưu pH tối ưu Tính năng, ưu điểm
C20032 45o
C – 50o
C 5 – 5,5 Cải thiện quá trình thủy
phân cellulose khi kết hợp
với CTec2.
Hỗ trợ trong trường hợp
tiền xử lý acid nhẹ hoặc
kiềm.
Chuyển đổi hemicellulose
để đường lên men
Hiệu quả ở nồng độ chất
rắn cao.
Tương thích với nhiều
nguyên liệu
Nồng độ cao và ổn định
Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk

56. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
42
Hình 1.19 Nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme
Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk
Hình 1.20. pH hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme
Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk

57. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
43
Việc sử dụng enzyme cellulase C20032 của Novozyme vào ứng dụng phá vách tế
bào bào tử nấm linh chi phụ thuộc nhiều vào hệ enzyme tìm thấy trong chế phẩm.
Ngoài cellulase, các enzyme trong chế phẩm nghiên cứu còn cho thấy có sự xuất
hiện của β-glucanase, protease, chitinase.

58. Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi
44
CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất
2.1.1 Vật liệu
 Mẫu thí nghiệm
- Bào tử nấm Linh chi được thu thập từ các trại nấm trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh
được cung cấp bởi Th.S Nguyễn Thị Ngọc Yến. Rây bào tử để loại bỏ một số tạp
chất. Sấy ở nhiệt độ 40o
C. Bảo quản trong điều kiện khô ráo.
- Giống nấm Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ nấm Linh chi trong đồ
án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu (10DSH), nhận từ phòng thí nghiệm công
nghệ sinh học trường ĐH Công Nghệ Tp. HCM, cơ sở 1, 475A Điện Biên Phủ, P. 25,
Q.Bình Thạnh, Tp.HCM.
2.1.2 Nơi tiến hành
Thí nghiệm được thực hiện tại trung tâm thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH
Công nghệ TP. HCM, cơ sở 475A, Điện Biên Phủ, P.25, Q. Bình Thạnh, TP.HCM
2.1.3 Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ 10/03/2016 đến 15/06/2016
2.1.4 Thiết bị và dụng cụ
2.1.4.1 Thiết bị
- Tủ cấy vi sinh
- Tủ lạnh
- Kính hiển vi quang học
- Autoclave
- Máy ly tâm
- Máy đo pH
- Cân phân tích
- Cân điện tử
- Bếp từ
- Máy nước cất
- Bể điều nhiệt