SlideShare a Scribd company logo

Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

•
•
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
TÀI LIỆU NGÀNH MAY

Cá hộp Hichef Thái Lan 1 thùng 100 hộp, mỗi hộp 145gram Zalo sỉ: 0968.994.923 -0778.633.384 Hotline: 070605.95.91 Giao hàng khu vực TP.HCM và đưa hàng ra chành đi các tỉnh.

Education
1 of 121
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH LÊN MEN VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn :T.S NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện : CAO THỊ THANH THÚY MSSV: 1311101044 Lớp: 13DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hƣơng. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. TP. HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho con xin gởi tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ, là ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục, động viên... là chỗ vựa tinh thần vững chắc cho con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã để con có đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc tới tập thể quý thầy cô giáo trong trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM nói chung và các thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi Trƣờng, bộ môn Công Nghệ Sinh Học nói riêng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian qua. Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đáng kinh, cô đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hƣớng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Nguyễn Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thời gian học tập tại trƣờng. Cảm ơn chị Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Trƣơng Hoài Nguyên, bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, bạn Lê Thị Thu đã đồng hành chia sẻ buồn vui cùng em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp. Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc! TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy
Đồ án tốt nghiệp i MỤC LỤC MỤC LỤC.................................................................................................................i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................iv DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................v DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... vii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài................................................................................1 2. Mục đích của nghiên cứu..............................................................................1 3. Nhiệm vụ của nghiên cứu..............................................................................2 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài ...................................................................2 5. Kết cấu của đồ án ..........................................................................................2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................3 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ..............................................3 1.1.1. Hợp chất thứ cấp .....................................................................................3 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ........3 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin ...........................................................................5 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin .....................................................................5 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin .................................................6 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin....................................................9 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens.....................10 1.3. Giới thiệu về Serratia marcescens ..........................................................14 1.3.1. Lịch sử phát hiện................................................................................14 1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens....................................15 1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens ....................................................15 1.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens........................19 1.4.1. Sắc tố ..................................................................................................19 1.4.2. Biosurfactant......................................................................................20 1.4.3. Acid béo ..............................................................................................20 1.4.4. Enzyme................................................................................................20
Đồ án tốt nghiệp ii 1.4.5. Yếu tố động lực của Serratia marcescens..........................................21 1.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens............................................22 1.6. Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens 24 1.7. Thu nhận và tinh sạch prodigiosin .........................................................27 1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới ..............................................................30 1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ......................................30 1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin.....................................................30 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................33 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...........................................................34 2.1.1. Thời gian. ...........................................................................................34 2.1.2. Địa điểm..............................................................................................34 2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị....................................................................34 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens................................................34 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất.......................................................34 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị.................................................................................35 2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm .........................................................................36 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.........................................................................41 2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. .........................................41 2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống ..................44 2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men 44 2.4.4. Phương pháp phân tích......................................................................47 Mục đích...........................................................................................................47 Nội dung ...........................................................................................................47 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................48 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất ....................................................................48
Đồ án tốt nghiệp iii 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào ........................................................48 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin......................................................................52 3.1.3. So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013)............54 3.2. Thiết lập môi trƣờng nhân giống ............................................................56 3.3. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men...................................58 3.3.1. Thiết lập môi trường lên men ............................................................58 3.3.2. Thiết lập chế độ lên men ....................................................................64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................70 1. Kết luận........................................................................................................70 2. Kiến nghị......................................................................................................70 TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................70 PHỤ LỤC...............................................................................................................76 A. PHỤ LỤC 1. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ, PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.........................................................................76 B. PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH ........................................................................82 C. PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THỐNG KÊ ......................................................87
Đồ án tốt nghiệp iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại LMTL: lên men tiếp liệu PG: peptone glycerol PGTL: peptone glycerol tiếp liệu MT1: môi trƣờng 1 MT2: môi trƣờng 2
Đồ án tốt nghiệp v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) ..........6 Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)...........................................7 Hình 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009)............9 Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) .................................11 Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin...........13 Hình 1.6 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. .......16 Hình 1.7 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011)............................................................................................................16 Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014)..........................................23 Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009)..........27 Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) ..........................................27 Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô. .......................................................................................................37 Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật........................................................38 Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4......................................................................................................39 Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia marcescens SH4......................................................................................................40 Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn....................43 Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol.......................................................................46 Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB...........................................................................................................................49 Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB ................................................................................................................................50 Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB...........................................................................................................................51 Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ...................................................................53 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1.............................................54 Hình 3.6 Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SH4 ..........................................55 Hình 3.7 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của hai chủng SH4 và SH1 ...................55 Hình 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 theo thời gian trên các môi trƣờng nhân giống khác nhau......................................................57 Hình 3.9 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian........60
Đồ án tốt nghiệp vi Hình 3.10 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............61 Hình 3.11 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............63 Hình 3.12 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian................65 Hình 3.13 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh và OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men peptone glycerol tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian......................................................................................67 Hình 3.14 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499 nm) của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG ở các nồng độ tiếp liệu tại 48h. (số liệu thô xem ở bảng 5 - phụ lục A và hình 9 - phụ lục B).......................................68
Đồ án tốt nghiệp vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật ............4 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) .8 Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens.................................17 Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)......25 Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin .......................................................32 Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. .....................................................................................................................51 Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ................................................................................................................................53 Bảng 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 và SH1.........................56 Bảng 3.4 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng nhân giống theo thời gian. ....................................................................57 Bảng 3.5 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian.........59 Bảng 3.6 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............61 Bảng 3.7 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............62 Bảng 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian................65
Đồ án tốt nghiệp 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Prodigiosin là một sắc tố đỏ có bản chất là một alkaloid, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Prodigiosin đƣợc tìm thấy trong quá trình lên men của một số loài vi sinh vật nhƣ Alteromonas rubra Moss, 2002 ; Rugamonas rubra Gerber, 1975; Serratia rubidaea Moss, 2002; Streptoverticillium rubrireticuli Gerber, 1975 Vibrio gazogenes Moss, 2002 và một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia mar- censcens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3- amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng EPN và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng peptone glycerol, nutrient broth, môi trƣờng đậu phộng, môi trƣờng hạt mè,.... Một số nghiên cứu thu prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens thông thƣờng cần trích ly lỏng rắn bằng ethanol/methanol, sau đó trích ly lỏng lỏng bằng dung môi kém phân cực hơn để đƣợc prodigiosin tinh sạch một phần. Việc thu hồi prodigisin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém vì vậy một số nghiên cứu đã sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu.. Với mục tiêu tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện để sinh tổng hợp prodigiosin trong môi trƣờng bằng nuôi cấy lỏng ngƣời thực hiện đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu”. 2. Mục tiêu của nghiên cứu
Đồ án tốt nghiệp 2 Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 3. Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào. Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Thiết lập môi trƣờng lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài Chọn lọc đƣợc chủng S.marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại bào protease và lipase cao nhất. Khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc môi trƣờng lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc chế độ lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. 5. Kết cấu của đồ án Đồ án “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng: 1. Tổng quan tài liệu Giới thiệu về prodigiosin các tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp prodigiosin, phân loại loài cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hóa của vi khuẩn Serratia marcescens. 2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đồ án. Cách bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm. 3. Kết quả và thảo luận Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành.
Đồ án tốt nghiệp 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp. 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997. Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Willliams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula,
Đồ án tốt nghiệp 4 Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kiềm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật (fungi, acmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vât. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ cấp Ứng dụng Kiểu tác động ức chế Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum Penicilin Ức chế tụ cầu khuẩn, nhiễm trùng kỵ khí, giang mai, hen suyễn. Ức chế tạo polymer vách tế bào vi khuẩn, ức chế hấp thụ amini acid và protein, ứ chế tạo enzyme. Streptomyces griceus Streptomycin Ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng. Trị bệnh lao, bệnh viêm màng não, ho gà. Ức chế ghép nối một số amino acid vào protein, tác động lên hệ enzyme cả vi khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb, ... Streptomyces venezuelas Chloranphenicol Ức chế đối với bệnh lỵ, sốt Ức chế đặc hiệu sinh tổng hợp
Đồ án tốt nghiệp 5 cao, sốt phát ban. protein vi khuẩn liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide. Streptomyces aureomycin Tetracilin Ức chế phổ rộng vi khuẩn Gram âm, Gram dƣơng Ức chế tổng hợp protein Streptomyces erythraeus Erythromycin Chữa bệnh do tụ cầu khuẩn Streptococcal gây ra Ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng Sttreptomyces fradiae Neomycin Tác dụng vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng Hơi độc Streptomyces kanamycetius Kanamycin Điều trị lao, ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng Tác động giống nhƣ Streptomycin và Neomycin Streptomyces lavendulae Cycloserine Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hơp vách tế bào 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin
Đồ án tốt nghiệp 6 Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, meta- cycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochlo- ride (cPrG-HCl). 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Wil- liamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolypyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methane (Qadri và Wil- liams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008)
Đồ án tốt nghiệp 7 Các sắc tố màu đỏ của S.marcescens đã đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigio- sine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodi- giosin tổng hợp bởi S.marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles, nhƣ thể hiện trong hình 1.4, Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan trong nƣớc. Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform,
Đồ án tốt nghiệp 8 methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một bƣớc sóng nhất định và sự biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ. Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Loài Tên sắc tố Danh pháp prodigiosin Trọng lƣợng phân tử và công thức Serratia marcescens Prodigiosine 2-Methyl- 3- amyl-6-methoxy- prodigiosene 323,4 Da C20H25N3O Serratia marcescens Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl- 6-hydroxy- prodigiosene 309,4 Da C10H23N3O Serratia marcescens Dipyrrolyl- dipyrromelhenr prodigiosin 2-(2-pyrryl)-4-6- dimethoxypy- prodigiosene 334,4 Da C19H18N4O2 Nocardia (Actinomadura) madurae Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- methoxy- prodigiosene 363,5 Da C23H31N3O Nocardia (Actinomadura) madurae Cyclononyl- prodigiosin 2,10-Nonano-6- melhoxy- prodigiosene 265,5 Da C23H33N3O Nocadia (Actinomadura) pellctieri Methylcyclodccyl- prodigiosin 2,10-Nonano-6- Methoxy- prodigiosene 391,5 Da C25H33N3O Streptomyces longisporusruber và Nocardia Undccyl- prodigiosin 2-Undecyl-6- Rnethoxy- prodigiosene 393,6 Da C25H35N3O
Đồ án tốt nghiệp 9 (Actonomadura) pelletieri Streptomyces longisporusber Metacyclo- prodigiosin 2,4-(9- Ethylnonano)-6- methoxy- prodigiosene 391,6 Da C25H33N3O 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loại vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV,... dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Hình 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) A. Đối kháng với Staphylococcus aureus B. Đối kháng với Echerichia Ecoli Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012).
Đồ án tốt nghiệp 10 Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả chống ung thƣ (Pandey và cộng sự, 2009; Pe1rez – Tomás và Vias, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự, 2007). 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serrtia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2’-bipyrrile-5- caboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl- 6-methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một chủng Serratia marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này đƣợc báo cáo. Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong Erwinia carotovora subsp. Carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm). trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tính hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở hình 1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp.
Đồ án tốt nghiệp 11 Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thƣớc và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001). Hình 1.3 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Strep- tomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí tƣơng đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ đƣợc hiển thị trong màu đen, chịu trách nhiệm tổng hợp phân nữa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu đỏ. Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là PigO. RT-PCR với primer extension sẽ nhận thấy có sự phiên mã qua lại giữa hai gene pigN và pigO (Slater và cộng sự, 2003), điều này phù hợp với pigO là một op-
Đồ án tốt nghiệp 12 eron trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đƣợc sao chép dƣới dạng polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater er al., 2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 274 cũng đƣợc sao chép dƣới dạng polycistronic thông tin. Có một khoảng cách đáng kể giữa hai cụm sắc tố pigC và pigD. Khoảng cách 184 bp giữa pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy khả năng chứa hai đơn vị phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai bên của khoảng cách này đã chứng minh là tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu dùng lacZ hợp vời pigA và pigH (Crow, 2001). Cụm pig trong Sma 274 có khoảng cách 64 bp giữa pigC và pigD, nhỏ hơn so với Serratia ATCC 39.006, khoảng cách này không có ý nghĩa. Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14-15 gene), có thể phản ánh sự phức tạp hơn về các sản phẩm undecylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Streptomyses coelicolor (Harris và cộng sự, 2004). Mƣời hai gene đƣợc lƣu giữ giữa ba cụm, có thể mong đợi con đƣờng tổng hợp cho ra các sản phẩm tƣơng tự. Tuy nhiên, định hƣớng và điều tiết của nó có sự thay đổi rõ rệt (Slater và cộng sự, 2003). Việc bố trí không giống nhau của các gene tƣơng đồng trong cụm sản xuất các sản phẩm hóa học tƣơng tự đặt ra câu hỏi về nguồn gốc và sự tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm. Vẫn chƣa rõ liệu các loài trong cùng một họ có vai trò quan trọng ảnh hƣởng đến sự sắp xếp không giống nhau của các gene hay sự khác biệt đã phát sinh một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Sự khác biệt ở các gene hiện diện trong những operon có thể giải thích sự khác biệt trong phƣơng thức sản xuất và con đƣờng tổng hợp sinh hóa. PigD và pig E là hai pig gene không có sự tƣơng đồng trong cụm màu đỏ. Tƣơng tự nhƣ vậy, pdtorfL và pdtorf thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng hợp các chất khử clo (carbon tet- rachloride) nhƣ pyridine-2-6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri (Lewis và cộng sự, 2000). PigE tƣơng tự aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ Streptomyces coelicolor A3(2), đƣợc mã hóa bởi một gene không liên kết với cụm màu đỏ (38% giống với PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống với PigE từ Sma 274; cả hai đều là 50% tƣơng đƣơng 460 aa). Thật vậy, nó có thể là gene mã
Đồ án tốt nghiệp 13 hóa protein tham gia vào quá trình tổng hợp prodigiosin và undecylprodigiosin có thể không đƣợc liên kết với các cụm gene. RedR, RedQ và RedP không đƣợc mã hóa tƣơng đồng bởi cụm pig, nhƣng chúng đƣợc cho là chỉ đạo tổng hợp acetate từ ba nguyên tử carbon của vòng pyrrole và chuỗi bên undecylprodigiosin (Cerdeno và cộng sự, 2001). Các gene mã hóa tƣơng đồng tƣơng ứng có thể có mặt tại một vị trí trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác có thể thực hiện vai trò xúc tác cần thiết trong sinh trong sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia. Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tƣơng ứng của Escherichia coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme đƣợc mã hóa bởi các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004). Hình 1.4 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin.
Đồ án tốt nghiệp 14 Đề xuất này cũng tƣơng tự nhƣ đề xuất đối với undercylprodigiosin (Cerdeno và cộng sự, 2001). Mƣời hai Red protein với sự mã hóa trong cụm pig (“lõi” là en- zyme prodigiosin) có kích thƣớc tƣơng tự nhau trong bản sao của Pig. Một ngoại lệ là PigB (670 aa) tƣơng đồng với RedS (Sc3f7.05c), là một protein nhỏ hơn nhiều (146 aa) và tƣơng tự gắn vào cuối đầu N của PigB. Phần còn lại của PigB gắn với các amine oxidase. Các protein PigI và PigJ đều nhỏ hơn RedM và tƣơng đồng với RedX (Harris và cộng sự, 2004). PigA là trình tự tổng hợp một loạt các actyl-CoA dehydrogenase. Chuỗi liên kết với human isovaleryl-CoA dehydrogenase, cấu trúc tinh thể trong đó đã đƣợc xác định, cho thấy rằng phần lớn các acid amin xung quanh flavin và phosphopantetheinyl moiety của CoA đƣợc bảo vệ nhƣng các acid amin tham gia vào liên kết nhóm adenisyl của CoA không đƣợc bảo vệ (Tiffany và cộng sự, 1997). Điều này hỗ trợ cho rằng PigA là một PCP prolyl hơn là prolyl- CoA. 1.3. Giới thiệu về Serratia marcescens 1.3.1. Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó vào năm 332 trƣớc công nguyên những ngƣời lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcrscens, tuy nhiên điều
Đồ án tốt nghiệp 15 này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Girbbs, 2011). Bizio một dƣợc sĩ ở padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Ser- ratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Sau 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serratia, tên loài mar- cescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại Serratia marsescens là vi khuẩn. 1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:  Giới: Bacteria  Ngành: Proteobacteria  Lớp: Gramma proteobacteria  Bộ: Enterobacteria  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Serratia  Loài: Serratia marcescens 1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens
Đồ án tốt nghiệp 16 Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia macecens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40o C và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Hình 1.5 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. Hình 1.6 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 1.3.3.1. Đặc điểm sinh lý Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả là khuẩn lạc tròn lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính
Đồ án tốt nghiệp 17 là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thƣờng bị mất đi trong các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 1.3.3.2. Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatas, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trƣờng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Entero- bacteriaceae bởi ba đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinease (Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.7. (Tariq và John, 2010). Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl Red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase +
Đồ án tốt nghiệp 18 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 12 Triple sugar iron Môi trƣờng chuyển sang acid, không sinh khí và không sinh H2S 13 Hydrogen sulphide - 14 Lysine decarboxylase + 15 Omithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose + 20 Lên men xylose - 21 Lên men rhaminose - 22 Lên men lactose - 23 Lên men arabinose - 1.3.3.3. Đặc điểm phân bố Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực vật, côn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hóa của ngƣời và động vật có xƣơng sống. Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng một vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964). Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng (Grimont và công sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế.
Đồ án tốt nghiệp 19 Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiểm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài Steinerma và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia mar- cescens với Steinernema carpocapsae. 1.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens 1.4.1. Sắc tố Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marsescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố đặc biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, meta- cycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochlo- ride (cPrG-HCl) (Krishna, 2008). Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup A1 và A2/6, nó không đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8 hoặc TCT (Gri- mont, 1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thƣờng gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Gri- mont, 1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigi- osin đã đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Daunehauer và cộng sự, 1984). Các dòng đƣợc tạo thành này có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, có thể chúng sẽ không tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkner, 1977).
Đồ án tốt nghiệp 20 Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5- carbonxymethylmuconic semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự,1988). Enzyme này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006). 1.4.2. Biosurfactant Các chủng sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30o C nhƣng không đƣợc sản xuất ở 30o C trog phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1 đến W3, có các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 đƣợc xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trƣớc đó đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng sự (1961). 1.4.3. Acid béo Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic và octadecanoid acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50-80% thành phần tế bào, trong đó, n- tetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983). 1.4.4. Enzyme Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,… Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa chitin tronrg quá trình sản xuất thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc,… (Joshi và cộng sự, 1989).
Đồ án tốt nghiệp 21 Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase (ChiA, ChiB, ChiC) một chitobiase và một protein chitin-bindng (CBP21) (Fuchs và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996; Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998; Suzuli và cộng sự, 1998), chúng có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36 và 21 kDa, cùng với các hoạt động chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986). 1.4.5. Yếu tố động lực của Serratia marcescens Yếu tố động lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân chủ gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ, mà phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và Hewlett, 1986). Một số yếu tố động lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm sự bám dính, tính kỵ nƣớc, manose-resistant, mannose-sensitive, LipoPolySaccha- ride (LPS). Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính. Các yếu tố bám dính của vi sinh vật đƣợc gọi là các adhesion, chúng có thể có bản chất polypeptide thì đƣợc chia thành hai nhóm là nhóm có fimbriae và nhóm không có fimbriae. Mà các vi khuẩn Gram âm, nhƣ là Serratia marcescens, thƣờng bám dính nhờ các fimbriae này. Các fimbriae (hay còn gọi là các pili) là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng nhƣ sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các Finbriae đƣợc cấu tạo bởi nhiều pro- tein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống nhƣ trụ xoắn ốc. Thƣờng thì chỉ có một loại protein là cấu trúc chính của một phân nhóm fimbriae tuy nhiên các protein phụ trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc fimbriae. Đỉnh của các fimbriae có chức năng gắn với tế bào vật chủ. Bên cạnh đó, LSP hay còn đƣợc gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lƣỡng tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ
Đồ án tốt nghiệp 22 màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – an- tigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là các thành phần gây độc của phân tử LPS, gây nên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm. Ngoài ra, việc sản xuất các enzyme khác nhau bởi Serratia marcescens cũng đƣợc xem nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme chitinase, lipase, chlorope- roxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997). 1.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens S. marcescens đã đƣợc khảo sát cho sự tăng trƣởng và khả năng gây bệnh của nó trong các ấu trùng sâu bƣớm sáp (Galleria mellonella). Tất cả các chủng gây bệnh cho ấu trùng của G. mellonella dẫn đến tử vong trong vòng 48 giờ. Chủng đã đƣợc chứng minh có một gen mã hóa protein metalloprotease serralysin. Gen mã hóa protein metalloprotease đƣợc xác định là góp phần vào quá trình gây chết côn trùng (J.T. Tambong; Xu, R.; Sadiku, 2014) S. marcescens đƣợc biết đến với khả năng tiết nhiều enzyme ngoại bào nhƣ chitinase, lecthinase, hemolysin, lipase, protease, nuclease..Mặc dù S. marcescens có thể sản xuất nhiều protease khác nhau, trong đó có metalloprotease kẽm, serralysin. Meada và cộng sự năm 1995 báo cáo rằng serralysin đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của sinh vật này. Nghiên cứu đã chứng minh serralysin nhanh chóng làm suy giảm một loạt cấu trúc protein và huyết thanh. Theo đó, protease vi khuẩn nhƣ serralysin đóng một vai trò quan trọng nhƣ một yếu tố độc lực (Yutaka Kida và cộng sự, 2007). . Theo K Ishii et al. (J Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm (silkworm larvae).
Đồ án tốt nghiệp 23 Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014). Serratia marcescens còn đƣợc biết đến với khả năng lây nhiễm cho trứng, ấu trùng, nhộng và sâu trƣởng thành của loài Heliothis-thuộc chi bƣớm đêm gây hại cho nông nghiệp (Sikorowski và Lawrence, 2009) Ấu trùng lớn tuổi bị nhiễm vi khuẩn thƣờng bộc lộ phản ứng là giảm các kích thích bên ngoài, và cái chết xảy ra một hoặc hai ngày sau đó. Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào trong đƣờng máu của vi khuẩn và gây ra nhiễm trùng huyết và gây tử vong. Theo kết quả nghiên cứu của Estrada và cộng sự năm 2012 thì ấu trùng bị nhiễm trở thành màu đỏ sau khi chết, và tỉ lệ sống sót của những ấu trùng bị nhiễm là rất ít. Một số ấu trùng bị nhiễm trong giai đoạn cuối của ấu trùng thì sau khi hóa nhộng nó cũng sẽ bị chết do nhiễm khuẩn và khi chết nó cũng xuất huyết có màu đỏ của S. marcescens. Đến giai đoạn sâu trƣởng thành, nó có thể đƣợc lấy nhiễm bằng cách cho ăn thực phẩm bị ô nhiễm, các vi khuẩn sẽ xâm nhập vào các mô của côn trùng và gây chết. Serratia marcescens có khả năng lây nhiễm và loại bỏ cao đối với bộ H. Zea và H virescens . Serratia marcescens còn có thể kết hợp với một số loại tuyến trùng hay giun tròn để gây bệnh cho côn trùng ví dụ nhƣ: O. Carolinensis kết hợp với Serratia marcescens gây bệnh côn trùng trên lớp biểu bì bên ngoài của nó.
Đồ án tốt nghiệp 24 Ngoài ra cũng có thể tạo đƣợc mối quan hệ nhân tạo giữa vi khuẩn và các tuyến trùng, bằng cách trộn chung tuyến trùng với vi khuẩn và nuôi chúng trong một khoảng thời gian. Cũng trong nghiên cứu của Estrada và cộng sự, năm 2012 thì khi Steinernema carpocapsae kết hợp với S. marcescens mang đến hiệu quả diệt 100% ấu trùng Galleria mellonella chỉ sau 48 giờ. Mặc dù vậy sự tồn tại của S. marcescens cũng không ảnh hƣởng đến vi khuẩn cộng sinh X. Nematophila. 1.6. Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn. Bản chất màu đỏ tƣơi của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn nhƣ: nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan, ánh sáng, phos- phate vô cơ và thành phần môi trƣờng ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005). Quá trình sản xuất prodigiosin trong S. marcescens rất nhạy cảm với nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004). Hơn nữa, môi trƣờng thông thƣờng đƣợc sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các chủng S. marcescens là môi trƣờng phức tạp và rất giàu dinh dƣỡng (Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất dinh dƣỡng nhƣ thia- mine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối với sản xuất prodigi- osin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977), adenosine triphosphate và ri- bose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp prodi- giosin. Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của S. marcescens trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ: môi trƣờng hạt mè, môi trƣờng hạt đậu phộng, nutrient broth và peptone glycerol broth,... Các môi trƣờng cũng đƣợc so sánh tốc độ tăng trƣởng và khả năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng
Đồ án tốt nghiệp 25 hợp nhiều prodigiosin hơn. Trên môi trƣờng hạt đậu phộng thì prodigiosin có thể tổng hợp ở nhiệt độ 37oC trong khi trên các môi trƣờng nhƣ nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không có bổ sung đƣờng cũng không thể làm đƣợc điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bớt lƣợng glucose và các loại đƣờng lên men đƣợc khác do sự giảm pH trong canh trƣờng nuôi cấy (Khanafari và cộng sự, 2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong môi trƣờng nutrient broth, về cơ bản là môi trƣờng này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glu- cose làm tăng cƣờng việc sản xuất sắc tố, trong trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng hạt mè thì nguồn carbon ở dạng các acid béo. Maltose và glucose đƣợc thêm vào môi trƣờng nutrient broth làm tăng gấp đôi năng suất so với chỉ sử dụng môi trƣờng nu- trient broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố đƣợc tăng cƣờng trong môi trƣờng peptone glycerol broth ở 30oC và trong môi trƣờng nutrient broth ở 28oC, điều này có thể là do sự hiện diện của glycerol nhƣ là một nguồn carbon. Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trƣởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Stt Môi trƣờng sử dụng Nhiệt độ 280 C 300 C 370 C Tham khảo 1 Môi trƣờng dextrose bổ sung casein 13,0 - - Pruss và Matsumura, 1996 2 Ethanol và nguồn carbon 3,0 - - Mandarville, 2001 3 Canh dinh dƣỡng 0,52 0,354 0,111 Giri và cs,
Đồ án tốt nghiệp 26 2004 4 Canh Peptone glycerol 0,302 0,569 0,111 Giri và cs, 2004 5 Môi trƣờng hạt mè 16,68 9,3 0,319 Giri và cs., 2004 6 Canh dinh dƣỡng bổ sung 0,5% maltose 1,836 0,79 0,104 Giri và cs, 2004 7 Canh dinh dƣỡng bổ sung 0,5% glucose 1,689 0,29 0.104 Giri và cs, 2004 8 Môi trƣờng hạt mè bổ sung 0,5% maltose 9,43 8,56 1,63 Giri và cs, 2004 9 Môi trƣờng hạt mè bổ sung 0,5% glucose 1,47 1,16 0,42 Giri và cs, 2004 10 Môi trƣờng dầu mè 0,767 1,006 0,107 Giri và cs, 2004 11 Môi trƣờng hạt đậu phộng 38,75 25,98 1,49 Giri và cs, 2004 12 Môi trƣờng dầu đậu phộng 2,89 0,559 0,111 Giri và cs, 2004 13 Môi trƣờng từ dừa 1,94 1,39 0,1736 Giri và cs, 2004 14 Môi trƣờng dầu dừa 1,42 0,05 0,177 Giri và cs, 2004
Đồ án tốt nghiệp 27 Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009) Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) 1.7. Thu nhận và tinh sạch prodigiosin Các sắc tố không tan trong nƣớc mà tan trong dầu thƣờng đƣợc chiết xuất bằng dung môi hữu cơ pha nƣớc nhƣ: acetone, methanol, ethanol hoặc các hỗn hợp
Đồ án tốt nghiệp 28 của các dung môi, để giúp các dung môi này hoạt động tốt hơn. Chiết xuất thƣờng có chứa một lƣợng nƣớc đáng kể, do đó có thể đƣợc loại bỏ bằng cách phân lớp nhờ hexane, petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn hợp các dung môi. Sắc ký, quang phổ hấp thụ ở vùng khả kiến sẽ là cơ sở đầu tiên dùng để xác định các sắc tố. Quang phổ sẽ đƣợc thực hiện, lƣu giữ và sau đó tiến hành so sánh với các phổ chuẩn (Amaya, 2001). Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây đƣợc đề xuất là nên thực hiện để xác định một hợp chất chƣa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994). - Phổ hấp thụ (𝜆𝑚𝑎𝑥 ). - Sắc ký lớp mỏng (Rf). - Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lƣu mẫu). - Phƣơng pháp phổ khối (khối lƣợng phân tử). - NMR (chuyển hóa về mặt hóa học). Một số nghiên cứu về thu nhận và tinh sạch prodigiosin đã đƣợc thực hiện: - Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) đƣợc chiết xuất từ môi trƣờng nutrient broth nuôi cấy S. marcescens sau 72 giờ, với ethanol và petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung môi trong bể cách thuỷ và hòa tan phần còn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky, 1980). - Các sắc tố từ tế bào của S. marcescens phân lập từ đất đƣợc chiết xuất bằng acetone, hòa với một ít ethyl acetate và đƣợc sấy khô bằng natri sulfat. Các chất chiết xuất đƣợc hòa tan và đƣợc thực hiện quét từ bƣớc sóng 200 – 700 nm. Hỗn hợp dung môi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5:2,5:0,5 (v:v) đã đƣợc sử dụng để tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với các sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng. Cột silicagel có kích thƣớc từ 80 – 100 mesh đã đƣợc sử dụng để phân tách các tạp chất không màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết cho thấy có độ hấp thụ cao duy nhất tại 535 nm trong quang phổ UV. Nó đƣợc tiếp tục phân tích để xác định trọng lƣợng phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết đƣợc đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng có trọng lƣợng phân tử là 324 Da (Giri và cộng sự, 2004).
Đồ án tốt nghiệp 29 - Prodigiosin đƣợc chiết xuất bằng cách lắc môi trƣờng nuôi cấy tế bào Serratia marcescens 2170 với methanol có tính acid với tỷ lệ 24:1 (v:v) và dịch trong suốt đƣợc cô quay chân không. Sắc ký lỏng cao áp của các chiết xuất đƣợc thực hiện trên silicagel với dung môi chloroform và methanol. Các sắc tố thu đƣợc sẽ đƣợc rửa giải trong methanol và phân tích phổ khối (ESI-MS). Sau đó, các sắc tố chƣa tinh khiết đã thu đƣợc sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 𝜇m) đã đƣợc sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10 mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% ace- tonitrile). Việc rửa giải đƣợc theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dò UV diode- array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003). - Sau khi lên men S. marcescens phân lập từ đất, canh trƣờng đƣợc lấy từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v:v) đã acid hóa (pH 3,0) đƣợc thêm vào IAB. Các sắc tố đƣợc chiết xuất bằng cách sử dụng một vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem cô đặc và ly tâm. Sau đó, nó đƣợc thu bằng cách sử dụng nƣớc và chloroform để tách pha. Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dƣới của pha chloroform và đƣợc cô quay chân không. Prodigiosin đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silicagel (2,5 × 30 cm). Nó đƣợc rửa với một hỗn hợp hexane:ethyl acetate (2:1, v:v). Các sắc tố cô đặc đã đƣợc tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5 (v:v) trong TLC. Sau đó, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đƣợc thu nhận và hòa tan trong acetone. Các sắc tố chƣa tinh khiết sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp TLC (với tỷ lệ dung môi chloroform:methanol:diethyl ether là 6:2:2) và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm). Sau đó, nó đƣợc tách rửa với hỗn hợp methanol:nƣớc (7:3, v:v) đã đƣợc điều chỉnh pH = 3,0 bằng HCl 0,1N với tốc độ dòng chảy là 20 ml/phút. Một lƣới thép không gỉ lớn với kích thƣớc lỗ 0,5 cm đã đƣợc sử dụng nhƣ sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng độ của các prodigiosin sản xuất ra đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 535 nm trong methanol đã đƣợc acid hóa (HCl 0,001N 4 ml + 96 ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lƣợng phân tử của chất màu tinh
Đồ án tốt nghiệp 30 khiết đƣợc xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1 H- và 13 C-NMR của các mẫu màu đƣợc ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3. Các dịch chuyển hóa đã đƣợc đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố đƣợc ghi nhận (Song và cộng sự, 2006). - Các sắc tố đƣợc sản xuất bởi Serratia marcescens SM∆R đã đƣợc tinh sạch thực hiện NMR và phổ khối để xác định cấu trúc hóa học của nó (Wei và Chen, 2005). Các sắc tố đƣợc chiết xuất từ canh trƣờng lên men bằng methanol và sau đó tinh chế bằng cách sử dụng một cột silica gel hexane-balanced để thu các sản phẩm mục tiêu trong cột (Cang và cộng sự, 2000; Montaner và cộng sự, 2000). Sau đó cột đƣợc rửa với ethyl acetate 10M để giải phóng các sản phẩm hấp thụ. Màu cam sau khi rửa giải đã đƣợc thu và làm khô trong máy sấy chân không ở 45oC để có đƣợc những sản phẩm tinh khiết (bột màu đỏ). Các sắc tố thu đƣợc trong nghiên cứu đã đƣợc báo cáo là undecylprodigiosin dựa trên phân tích NMR và MS, còn đƣợc gọi là prodigiosin 25-C, là một trong những sắc tố đỏ đƣợc sản xuất bởi Serratia sp. và Streptomyces sp. Nó có hoạt động ức chế miễn dịch và quá trình apoptosis-inducing tƣơng tự nhƣ prodigiosin, nhƣng ít đƣợc nghiên cứu hơn (Tomas và cộng sự, 2003). 1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới 1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens Brigida và Itamar (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của Serra- tia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng nhƣ ảnh hƣởng của S. marces- cens lên thúc đẩy tăng trƣởng của cây thuộc chi cam chanh. Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm Ser- ratia marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt đƣợc kết quả gây chết 100% ấu trùng. 1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin Sundaramoorthy và cộng sự (2009), thực hiện nghiên cứu để sàng lọc những chủng Serratia có hiệu quả sản xuất prodigiosin và đã phân lập đƣợc chủng Serratia marcescens NY1 từ đất.
Đồ án tốt nghiệp 31 Helvia và cộng sự (2010), đã tối ƣu hóa quá trình sản xuất prodigiosin bởi Ser- ratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nƣớc thải từ công nghiệp chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l. Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất prodigio- sin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigio- sin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi trƣờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và quá trình chiết xuất prodigiosin đƣợc thực hiện bằng ethanol:hydrochloric acid (9,5:0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận đƣợc có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candi- da albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa, prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hƣởng bởi acid, kiềm, chất tẩy rửa, mà có thể ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu. Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất prodi- giosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi trƣờng dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 μg/ml. Một số bằng sáng chế về prodigiosin đƣợc liệt kê trong bảng 1.6 (Krishna, 2008).
Đồ án tốt nghiệp 32 Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin Tên Patent Tóm tắt Tác giả Ngày công bố United States Patent 6638968 A novel use of prodigiosin for treating diabetes mellitus without any side effect Kim Hwanmook, Han Sangbae, Lee Changwoo, Lee Kihoon, Park Sehyung, Kim Youngkook. 10/28/2003 United States Patent 6645962 The prodigiosin from Serratia marcescens is useful as an immunosuppressive in various fields, including the treatment of the diseases requiring immunosuppression and the basic research for the diseases, the transplantation of the organs or tissues. and the immune cells. Kim Hwanmook, Kim Youngkook, Han Sangbae, Yoo Sungak. 11/11/2003 United States Patent 4266028 The invention relates to novel use of prodigiosin for the treatment of Rheumatic m1hritis and can provide excellent treatment effect to Rheumatic arthritis by treating composition including prodigiosin isolated from Serratia marcescens as an active principle to DBA-l Kim Hwan- Mook Han Sang- Bac Lee Chang- Woo Lee Ki- Hoon Park Se- Hyung Kim Hy- oung Chin Kim Young- Kook 07/01/2004
Đồ án tốt nghiệp 33 mouse of collageninduced Rheumatic al1hritis animal model and thereby inhibiting production of internal cytokine which is a important pathogen of Rheumatic
Đồ án tốt nghiệp 34 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Thời gian. Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 30/04/2017 đến ngày 16/07/2017. 2.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens Giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4 và SH5 đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Giống vi khuẩn Serratia marcescens HB đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Lê Quốc Vũ, 2015 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất. a. Môi trƣờng ( Thành phần môi trƣờng xem phụ lục 1) - Môi trƣờng Peptone glycerone agar (PGA) - Môi trƣờng Peptone glycerone broth (PG) - Môi trƣờng Casein - Môi trƣờng Lipit - Môi trƣờng huyền phù Chitin 1% - Môi trƣờng nhân giống 1 (MT1) - Môi trƣờng nhân giống 2 (MT2) - Môi trƣờng lên men (MTLM) b. Hóa chất sử dụng - Cồn 70, cồn 96 - NaCl - HCl, NaOH
Đồ án tốt nghiệp 35 - Petroleum ether - Nƣớc muối bão hòa 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị a. Dụng cụ - Phiễu chiết - Ống nghiệm - Đĩa petri - Erlen 50ml, 100ml, 250ml - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml - Pipetman 100μl, 1000μl. - Đầu típ - Đũa thủy tinh - Bao hấp, giấy gói, thun - Đèn cồn, que cấy vòng - Bông không thấm, bông thấm - Chai syrum 100ml. b. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh - Cân phân tích - Bếp từ - Máy nƣớc cất - Autolave - Tủ hút - Máy ly tâm - Máy lắc - Máy đo quang phổ - Máy cô quay - Bể điều nhiệt
Đồ án tốt nghiệp 36 - Kính hiển vi 2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 2.3.1 Mục đích Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 2.3.2 Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại bào. Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. 2.3.3 Phương pháp luận Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thƣờng không trễ pha với quá trình tăng trƣởng tế bào. Dịch môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trƣớc đó của các tác giả trong và ngoài nƣớc để xác định môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy cho chủng phân lập của phòng thí nghiệm. 2.3.4 Bố trí thí nghiệm Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau:
Đồ án tốt nghiệp 37 Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô. Chọn lọc chủng Chủng vi sinh vật (S.marcescens SH4, SH5 và HB) Thiết lập môi trƣờng nhân giống Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men Chế phẩm prodigiosin thô
Đồ án tốt nghiệp 38 Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật. Thử nghiệm enzyme ngoại bào Chủng vi sinh vật (S.marcescens SH4, SH5 và HB). Trích ly thu prodigiosin Lipase Protease Nuôi cấy lỏng lắc, MTPG Chitinase
Đồ án tốt nghiệp 39 Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia mar- cescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng MT2 Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng MT1 Tăng sinh trên môi trƣờng PG 0h 4h 8h 16h 20h 24h Đo độ đục (mật độ tê bào) OD = 620nm
Đồ án tốt nghiệp 40 Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia mar- cescens SH4 Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng MT2 Tăng sinh trên môi trƣờng PG 0h 9h 24h 33h 48h 57h Đo prodigiosin OD = 499nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm Lên men trên môi trƣờng PG Lên men trên môi trƣờng LMTL, PGTL Lên men trên môi trƣờng LMTL, PGTL Lên men trên môi trƣờng PG Tiếp liệu Glycerol
Đồ án tốt nghiệp 41 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. 2.4.1.1. Phương pháp định tính enzyme Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 48h. Thử nghiệm hoạt tính lipase Pha môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121o C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50o C đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đo đƣờng kính vòng tủa trên bề mặt môi trƣờng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung quanh điểm cấy. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme lipase thì không xuất hiện vòng tủa xung quanh điểm cấy. Khả năng phân giải lipid đƣợc đánh giá qua đƣờng kính vòng tủa trên đĩa thạch mm. Vòng tủa càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase càng nhiều. Thử nghiệm hoạt tính protease Pha môi trƣờng geltatine agar và môi trƣờng casein agar, hấp 121o C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50o C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả:
Đồ án tốt nghiệp 42 Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme protesae thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải casein đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease càng nhiều. Thử nghiệm hoạt tính chitinase Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin, hấp 121o C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50o C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng thuốc thử lugol. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng lính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase càng nhiều. 2.4.1.2. Phương pháp trích ly thu prodigiosin Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 48h. Sau khi tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH =2 trong 4 giờ; cho 450μl HCl 1N vào trong canh trƣờng, để trên máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng sau khi sử lý acid HCl trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450μl NaOH 1N để đƣa về pH =7, đem đo OD620nm và OD499nm, song song đó tiến hành trích ly lỏng lỏng theo sơ đồ hình:
Đồ án tốt nghiệp 43 Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức lên 25ml và pha loãng mẫu bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5, v;v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo OD535 nm, xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD vào phƣơng trình Xử lý acid Canh trƣờng sau nuôi cấy Trung hòa NaOH 1N Ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Sinh khối Dịch trong Ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Dịch trong Ethanol: HCl 1N (95:5; v:v) Sắc tố thô Trích ly lỏng lỏng Đo prodigiosin sau trích ly OD = 535 nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 600 nm Đo prodigiosin OD = 499 nm
Đồ án tốt nghiệp 44 đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R 2 = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng 1 (MT1 - môi trƣờng thu sinh khối cực đại theo ĐATN Nguyễn Thị Tâm, 2010), môi trƣờng 2 (MT2 – môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Tiến hành đo mật độ tế bào OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 4h, t = 8h, t =16h, t = 20h, t = 24h. Theo dõi mật độ tế bào tổng hợp đƣợc. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng của chủng vi sinh vật. Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 620 nm. 2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men 2.4.3.1. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL – môi trƣờng lên men theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với nồng độ glycerol là 5g/l. Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h.
Đồ án tốt nghiệp 45 Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống 2 (MT2 – môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005) vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) tiếp liệu với nồng độ glycerol là 5 g/l. Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. 2.4.3.2. Phương pháp khảo sát thiết lập chế độ lên men Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với nồng độ glycerol là 2.5 g/l, 5 g/l. 7.5 g/l và 10 g/l theo sơ đồ sau:
Đồ án tốt nghiệp 46 Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng PG 0h 9h 24h 33h 48h 57h Đo prodigiosin OD = 499nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm Lên men trên môi trƣờng PG Tiếp liệu Glycerol 2.5 g/l Lên men trên môi trƣờng PGTL Tiếp liệu Glycerol 10 g/l Tiếp liệu Glycerol 7.5 g/l Tiếp liệu Glycerol 5 g/l
Đồ án tốt nghiệp 47 Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. 2.4.4. Phương pháp phân tích 2.4.4.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin Mục đích Xác định đƣợc lƣợng hợp chất prodigiosin có trong mẫu từ đó đƣa ra kết luận cho thí nghiệm. Nội dung Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá trị đo OD tại λmax của hợp chất prodigiosin. 2.4.4.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Các số liệu thô đƣợc xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu sau đó đƣợc phân tích ANOVA và đƣợc trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. Các số liệu đƣợc tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010. Các biểu đồ cũng đƣợc thể hiện bằng phần mềm này.
Đồ án tốt nghiệp 48 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất Để đạt mục tiêu trên, các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol. Dịch nuôi cấy đƣợc đƣa đi khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào protease, chitinase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch và lipase bằng phƣơng pháp cấy điểm. Đồng thời prodigiosin đƣợc trích ly từ dịch nuôi cấy bằng Ethanol:HCl 1N (95:5, vv) và xác định nồng độ nhờ phƣơng pháp đo OD535nm và xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD535nm vào phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R 2 = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào Mục tiêu của lên men S.marcescens trong đề tài là sản xuất chế phẩm prodigi- osin thô từ đó tạo chế phẩm diệt sâu. Xoang máu và ống tiêu hóa của côn trùng đƣợc cấu thành từ các thành phần chính gồm lipid, protein và bộ xƣơng ngoài là chitin. Ngoài việc thu nguồn prodigiosin thì chủng vi sinh vật chọn lọc cần đòi hỏi phải tổng hợp các enzyne ngoại bào có khả năng thủy phân protein, lipid và chitin Thử nghiệm hoạt tính protease Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng chứa casein, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử trichloroacetic acid (TCA), đo vòng phân giải ca- sein. Phần còn lại là casein chƣa bị thủy phân sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục. Kết quả khi tiến hành trên môi trƣờng casein thì tất cả các chủng đều có khả năng phân giải casein là nhƣ nhau . Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA – casein trắng đục dễ dàng nhận thấy (hình 3.1 và bảng 3.1).
Đồ án tốt nghiệp 49 Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB Thử nghiệm hoạt tính lipase Lipase xúc tác thủy phân các cầu nối ether của triacylglycerol để tạo ra glycerol acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi trƣờng đĩa thạch chứa tween 80 và CaCl2. Lipase sẽ thủy phân tween 80 trong môi trƣờng tạo ra các acid béo, các acid béo đƣợc giải phóng sẽ kết tủa với muối calcium trong môi trƣờng. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trƣờng xung quanh điểm cấy. HB SH4 SH5
Đồ án tốt nghiệp 50 Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase có thấy sự hiện diện của enzyme lipase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm. Tween 80 bị enzyme lipase thủy phân tạo ra các acid béo và các acid béo này tạo phức với Ca2+ làm môi trƣờng xung quanh vết cấy trắng đục. Kết quả hình 3.2 và bảng 3.1 thì chủng SH4 và HB là các chủng có khả năng phân giải casein mạnh nhất với đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng tween là 27,3 A ± 1,70 và 24,7 AB ± 1,25, chủng SH5 có khả năng phân giải casein kém nhất với đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng casein là 27,3 A ± 1,70. Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB Thử nghiệm hoạt tính chitinase Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử lugol, đo vòng phân giải chitin. Khi chitinase có mặt trong môi trƣờng chitin nó sẽ phân giải chitin thành N- acetyl glucosamine và cấu trúc mạch ngắn hơn không băt màu với thuốc thử lugol. Khi tác dụng với thuốc thử lugol, độ lớn của phần môi trƣờng trong suốt phản ánh hoạt tính chitinase của chủng vi sinh vật. Khi bổ sung dịch vi khuẩn vào giếng thạch trên môi trƣờng thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, kết quả hình 3.2 các chủng khảo sát đều không có hoạt tính chitinase. Kết luận các chủng vi sinh vật không có khả năng tiết enzyme chitinase phân giải chitin có trong môi trƣờng. SH5 SH4 HB
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

Recommended

Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcNghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt namNghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt namhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

Recommended

Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcNghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt namNghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt namhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêmNghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêmhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...
Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...
Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...
Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...
Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...
Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...
Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụngNghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụngTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lacticXác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactichttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồngKhảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồngTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

More Related Content

What's hot

Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêmNghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêmhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...
Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...
Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...
Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...
Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...
Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...
Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụngNghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụngTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

What's hot (20)

Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêmNghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
 
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
 
Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...
Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...
Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma k...
 
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
 
Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...
Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...
Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp ...
 
Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...
Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...
Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo ...
 
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụngNghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
 
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
 
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
 
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học nhằm loại bỏ trực tiếp dầu mỡ trong n...
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus plantarum đồng lên men với nấm men bánh mì tha...
 
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
 
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
 
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
 

Similar to Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lacticXác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactichttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồngKhảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồngTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ...
Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ...Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ...
Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuHoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêngNghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riênghttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá ảnh hưởng của các cơ sở sản xuất bún đến môi trường và đề xuất giải ...
đáNh giá ảnh hưởng của các cơ sở sản xuất bún đến môi trường và đề xuất giải ...đáNh giá ảnh hưởng của các cơ sở sản xuất bún đến môi trường và đề xuất giải ...
đáNh giá ảnh hưởng của các cơ sở sản xuất bún đến môi trường và đề xuất giải ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chômNghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chômTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...https://www.facebook.com/garmentspace
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ongNghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ongTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

Similar to Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu (20)

Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lacticXác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
 
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồngKhảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
 
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
 
Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ...
Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ...Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ...
Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ...
 
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuHoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
 
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
 
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
 
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêngNghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
 
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
 
đáNh giá ảnh hưởng của các cơ sở sản xuất bún đến môi trường và đề xuất giải ...
đáNh giá ảnh hưởng của các cơ sở sản xuất bún đến môi trường và đề xuất giải ...đáNh giá ảnh hưởng của các cơ sở sản xuất bún đến môi trường và đề xuất giải ...
đáNh giá ảnh hưởng của các cơ sở sản xuất bún đến môi trường và đề xuất giải ...
 
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
 
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chômNghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
 
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
 
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ongNghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
 
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
 

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC VẬT LIỆU DỆT MAY Bài giảng Vật liệu dệt may - ThS. Nguyễn Th...
ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC VẬT LIỆU DỆT MAY Bài giảng Vật liệu dệt may - ThS. Nguyễn Th...ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC VẬT LIỆU DỆT MAY Bài giảng Vật liệu dệt may - ThS. Nguyễn Th...
ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC VẬT LIỆU DỆT MAY Bài giảng Vật liệu dệt may - ThS. Nguyễn Th...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Một số biện pháp góp phần hoàn thiện chi phí sản xuất và tính giá thành sản p...
Một số biện pháp góp phần hoàn thiện chi phí sản xuất và tính giá thành sản p...Một số biện pháp góp phần hoàn thiện chi phí sản xuất và tính giá thành sản p...
Một số biện pháp góp phần hoàn thiện chi phí sản xuất và tính giá thành sản p...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Thực trạng áp dụng hệ thống quản lý chất lượng của các doanh nghiệp Việt Nam ...
Thực trạng áp dụng hệ thống quản lý chất lượng của các doanh nghiệp Việt Nam ...Thực trạng áp dụng hệ thống quản lý chất lượng của các doanh nghiệp Việt Nam ...
Thực trạng áp dụng hệ thống quản lý chất lượng của các doanh nghiệp Việt Nam ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tiểu luận Thương mại điện tử Nghiên cứu mô hình kinh doanh thương mại điện tử...
Tiểu luận Thương mại điện tử Nghiên cứu mô hình kinh doanh thương mại điện tử...Tiểu luận Thương mại điện tử Nghiên cứu mô hình kinh doanh thương mại điện tử...
Tiểu luận Thương mại điện tử Nghiên cứu mô hình kinh doanh thương mại điện tử...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tiểu luận Những tác động của hội nhập kinh tế quốc tế đối với kinh tế, thương...
Tiểu luận Những tác động của hội nhập kinh tế quốc tế đối với kinh tế, thương...Tiểu luận Những tác động của hội nhập kinh tế quốc tế đối với kinh tế, thương...
Tiểu luận Những tác động của hội nhập kinh tế quốc tế đối với kinh tế, thương...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tiểu luận Thanh toán quốc tế Tỷ giá hối đoái chính sách tỷ giá hối đoái ở Việ...
Tiểu luận Thanh toán quốc tế Tỷ giá hối đoái chính sách tỷ giá hối đoái ở Việ...Tiểu luận Thanh toán quốc tế Tỷ giá hối đoái chính sách tỷ giá hối đoái ở Việ...
Tiểu luận Thanh toán quốc tế Tỷ giá hối đoái chính sách tỷ giá hối đoái ở Việ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Thực trạng và giải pháp phát triển hoạt động trung tâm Đào tạo Logistics tiểu...
Thực trạng và giải pháp phát triển hoạt động trung tâm Đào tạo Logistics tiểu...Thực trạng và giải pháp phát triển hoạt động trung tâm Đào tạo Logistics tiểu...
Thực trạng và giải pháp phát triển hoạt động trung tâm Đào tạo Logistics tiểu...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu cơ chế quản lý và vận hành thị trường cước vận tải container đường...
Nghiên cứu cơ chế quản lý và vận hành thị trường cước vận tải container đường...Nghiên cứu cơ chế quản lý và vận hành thị trường cước vận tải container đường...
Nghiên cứu cơ chế quản lý và vận hành thị trường cước vận tải container đường...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Bảo vệ quyền sở hữu công nghiệp liên quan đến nhãn hiệu của doanh nghiệp tại ...
Bảo vệ quyền sở hữu công nghiệp liên quan đến nhãn hiệu của doanh nghiệp tại ...Bảo vệ quyền sở hữu công nghiệp liên quan đến nhãn hiệu của doanh nghiệp tại ...
Bảo vệ quyền sở hữu công nghiệp liên quan đến nhãn hiệu của doanh nghiệp tại ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tình hình xuất nhập khẩu hàng dệt may Việt Nam qua các năm.docx
Tình hình xuất nhập khẩu hàng dệt may Việt Nam qua các năm.docxTình hình xuất nhập khẩu hàng dệt may Việt Nam qua các năm.docx
Tình hình xuất nhập khẩu hàng dệt may Việt Nam qua các năm.docxTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Pháp luật của các quốc gia ASEAN chịu ảnh hưởng của hệ thống pháp luật Civil ...
Pháp luật của các quốc gia ASEAN chịu ảnh hưởng của hệ thống pháp luật Civil ...Pháp luật của các quốc gia ASEAN chịu ảnh hưởng của hệ thống pháp luật Civil ...
Pháp luật của các quốc gia ASEAN chịu ảnh hưởng của hệ thống pháp luật Civil ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Ô nhiễm môi trường tại các làng nghề sản xuất hương trên địa bàn xã Quốc Tuấn...
Ô nhiễm môi trường tại các làng nghề sản xuất hương trên địa bàn xã Quốc Tuấn...Ô nhiễm môi trường tại các làng nghề sản xuất hương trên địa bàn xã Quốc Tuấn...
Ô nhiễm môi trường tại các làng nghề sản xuất hương trên địa bàn xã Quốc Tuấn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Trình bày các phương pháp và công cụ Quản lý Nhà nước (QLNN) về kinh tế. Lý l...
Trình bày các phương pháp và công cụ Quản lý Nhà nước (QLNN) về kinh tế. Lý l...Trình bày các phương pháp và công cụ Quản lý Nhà nước (QLNN) về kinh tế. Lý l...
Trình bày các phương pháp và công cụ Quản lý Nhà nước (QLNN) về kinh tế. Lý l...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Xây dựng mô hình kinh doanh fast-food online an toàn và tiện lợi tại thành ph...
Xây dựng mô hình kinh doanh fast-food online an toàn và tiện lợi tại thành ph...Xây dựng mô hình kinh doanh fast-food online an toàn và tiện lợi tại thành ph...
Xây dựng mô hình kinh doanh fast-food online an toàn và tiện lợi tại thành ph...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật học Luật áp dụng cho thỏa thuận trọng tài lý luận v...
Khóa luận tốt nghiệp Luật học Luật áp dụng cho thỏa thuận trọng tài lý luận v...Khóa luận tốt nghiệp Luật học Luật áp dụng cho thỏa thuận trọng tài lý luận v...
Khóa luận tốt nghiệp Luật học Luật áp dụng cho thỏa thuận trọng tài lý luận v...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh doanh Pháp luật Việt Nam về cứu trợ xã hội.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh doanh Pháp luật Việt Nam về cứu trợ xã hội.pdfKhóa luận tốt nghiệp Luật kinh doanh Pháp luật Việt Nam về cứu trợ xã hội.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh doanh Pháp luật Việt Nam về cứu trợ xã hội.pdfTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Pháp luật về bồi thường, hỗ trợ tái định cư khi Nhà nước thu hồi đất theo Luậ...
Pháp luật về bồi thường, hỗ trợ tái định cư khi Nhà nước thu hồi đất theo Luậ...Pháp luật về bồi thường, hỗ trợ tái định cư khi Nhà nước thu hồi đất theo Luậ...
Pháp luật về bồi thường, hỗ trợ tái định cư khi Nhà nước thu hồi đất theo Luậ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Pháp luật về góp vốn bằng quyền sở hữu trí tuệ ở Việt Nam hiện nay.pdf
Pháp luật về góp vốn bằng quyền sở hữu trí tuệ ở Việt Nam hiện nay.pdfPháp luật về góp vốn bằng quyền sở hữu trí tuệ ở Việt Nam hiện nay.pdf
Pháp luật về góp vốn bằng quyền sở hữu trí tuệ ở Việt Nam hiện nay.pdfTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Hôn nhân đồng tính dưới góc độ quyền con người.pdf
Hôn nhân đồng tính dưới góc độ quyền con người.pdfHôn nhân đồng tính dưới góc độ quyền con người.pdf
Hôn nhân đồng tính dưới góc độ quyền con người.pdfTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Bảo vệ nạn nhân của tội phạm là trẻ em dưới góc độ pháp lý.pdf
Bảo vệ nạn nhân của tội phạm là trẻ em dưới góc độ pháp lý.pdfBảo vệ nạn nhân của tội phạm là trẻ em dưới góc độ pháp lý.pdf
Bảo vệ nạn nhân của tội phạm là trẻ em dưới góc độ pháp lý.pdfTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC VẬT LIỆU DỆT MAY Bài giảng Vật liệu dệt may - ThS. Nguyễn Th...
ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC VẬT LIỆU DỆT MAY Bài giảng Vật liệu dệt may - ThS. Nguyễn Th...ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC VẬT LIỆU DỆT MAY Bài giảng Vật liệu dệt may - ThS. Nguyễn Th...
ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC VẬT LIỆU DỆT MAY Bài giảng Vật liệu dệt may - ThS. Nguyễn Th...
 
Một số biện pháp góp phần hoàn thiện chi phí sản xuất và tính giá thành sản p...
Một số biện pháp góp phần hoàn thiện chi phí sản xuất và tính giá thành sản p...Một số biện pháp góp phần hoàn thiện chi phí sản xuất và tính giá thành sản p...
Một số biện pháp góp phần hoàn thiện chi phí sản xuất và tính giá thành sản p...
 
Thực trạng áp dụng hệ thống quản lý chất lượng của các doanh nghiệp Việt Nam ...
Thực trạng áp dụng hệ thống quản lý chất lượng của các doanh nghiệp Việt Nam ...Thực trạng áp dụng hệ thống quản lý chất lượng của các doanh nghiệp Việt Nam ...
Thực trạng áp dụng hệ thống quản lý chất lượng của các doanh nghiệp Việt Nam ...
 
Tiểu luận Thương mại điện tử Nghiên cứu mô hình kinh doanh thương mại điện tử...
Tiểu luận Thương mại điện tử Nghiên cứu mô hình kinh doanh thương mại điện tử...Tiểu luận Thương mại điện tử Nghiên cứu mô hình kinh doanh thương mại điện tử...
Tiểu luận Thương mại điện tử Nghiên cứu mô hình kinh doanh thương mại điện tử...
 
Tiểu luận Những tác động của hội nhập kinh tế quốc tế đối với kinh tế, thương...
Tiểu luận Những tác động của hội nhập kinh tế quốc tế đối với kinh tế, thương...Tiểu luận Những tác động của hội nhập kinh tế quốc tế đối với kinh tế, thương...
Tiểu luận Những tác động của hội nhập kinh tế quốc tế đối với kinh tế, thương...
 
Tiểu luận Thanh toán quốc tế Tỷ giá hối đoái chính sách tỷ giá hối đoái ở Việ...
Tiểu luận Thanh toán quốc tế Tỷ giá hối đoái chính sách tỷ giá hối đoái ở Việ...Tiểu luận Thanh toán quốc tế Tỷ giá hối đoái chính sách tỷ giá hối đoái ở Việ...
Tiểu luận Thanh toán quốc tế Tỷ giá hối đoái chính sách tỷ giá hối đoái ở Việ...
 
Thực trạng và giải pháp phát triển hoạt động trung tâm Đào tạo Logistics tiểu...
Thực trạng và giải pháp phát triển hoạt động trung tâm Đào tạo Logistics tiểu...Thực trạng và giải pháp phát triển hoạt động trung tâm Đào tạo Logistics tiểu...
Thực trạng và giải pháp phát triển hoạt động trung tâm Đào tạo Logistics tiểu...
 
Nghiên cứu cơ chế quản lý và vận hành thị trường cước vận tải container đường...
Nghiên cứu cơ chế quản lý và vận hành thị trường cước vận tải container đường...Nghiên cứu cơ chế quản lý và vận hành thị trường cước vận tải container đường...
Nghiên cứu cơ chế quản lý và vận hành thị trường cước vận tải container đường...
 
Bảo vệ quyền sở hữu công nghiệp liên quan đến nhãn hiệu của doanh nghiệp tại ...
Bảo vệ quyền sở hữu công nghiệp liên quan đến nhãn hiệu của doanh nghiệp tại ...Bảo vệ quyền sở hữu công nghiệp liên quan đến nhãn hiệu của doanh nghiệp tại ...
Bảo vệ quyền sở hữu công nghiệp liên quan đến nhãn hiệu của doanh nghiệp tại ...
 
Tình hình xuất nhập khẩu hàng dệt may Việt Nam qua các năm.docx
Tình hình xuất nhập khẩu hàng dệt may Việt Nam qua các năm.docxTình hình xuất nhập khẩu hàng dệt may Việt Nam qua các năm.docx
Tình hình xuất nhập khẩu hàng dệt may Việt Nam qua các năm.docx
 
Pháp luật của các quốc gia ASEAN chịu ảnh hưởng của hệ thống pháp luật Civil ...
Pháp luật của các quốc gia ASEAN chịu ảnh hưởng của hệ thống pháp luật Civil ...Pháp luật của các quốc gia ASEAN chịu ảnh hưởng của hệ thống pháp luật Civil ...
Pháp luật của các quốc gia ASEAN chịu ảnh hưởng của hệ thống pháp luật Civil ...
 
Ô nhiễm môi trường tại các làng nghề sản xuất hương trên địa bàn xã Quốc Tuấn...
Ô nhiễm môi trường tại các làng nghề sản xuất hương trên địa bàn xã Quốc Tuấn...Ô nhiễm môi trường tại các làng nghề sản xuất hương trên địa bàn xã Quốc Tuấn...
Ô nhiễm môi trường tại các làng nghề sản xuất hương trên địa bàn xã Quốc Tuấn...
 
Trình bày các phương pháp và công cụ Quản lý Nhà nước (QLNN) về kinh tế. Lý l...
Trình bày các phương pháp và công cụ Quản lý Nhà nước (QLNN) về kinh tế. Lý l...Trình bày các phương pháp và công cụ Quản lý Nhà nước (QLNN) về kinh tế. Lý l...
Trình bày các phương pháp và công cụ Quản lý Nhà nước (QLNN) về kinh tế. Lý l...
 
Xây dựng mô hình kinh doanh fast-food online an toàn và tiện lợi tại thành ph...
Xây dựng mô hình kinh doanh fast-food online an toàn và tiện lợi tại thành ph...Xây dựng mô hình kinh doanh fast-food online an toàn và tiện lợi tại thành ph...
Xây dựng mô hình kinh doanh fast-food online an toàn và tiện lợi tại thành ph...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật học Luật áp dụng cho thỏa thuận trọng tài lý luận v...
Khóa luận tốt nghiệp Luật học Luật áp dụng cho thỏa thuận trọng tài lý luận v...Khóa luận tốt nghiệp Luật học Luật áp dụng cho thỏa thuận trọng tài lý luận v...
Khóa luận tốt nghiệp Luật học Luật áp dụng cho thỏa thuận trọng tài lý luận v...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh doanh Pháp luật Việt Nam về cứu trợ xã hội.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh doanh Pháp luật Việt Nam về cứu trợ xã hội.pdfKhóa luận tốt nghiệp Luật kinh doanh Pháp luật Việt Nam về cứu trợ xã hội.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh doanh Pháp luật Việt Nam về cứu trợ xã hội.pdf
 
Pháp luật về bồi thường, hỗ trợ tái định cư khi Nhà nước thu hồi đất theo Luậ...
Pháp luật về bồi thường, hỗ trợ tái định cư khi Nhà nước thu hồi đất theo Luậ...Pháp luật về bồi thường, hỗ trợ tái định cư khi Nhà nước thu hồi đất theo Luậ...
Pháp luật về bồi thường, hỗ trợ tái định cư khi Nhà nước thu hồi đất theo Luậ...
 
Pháp luật về góp vốn bằng quyền sở hữu trí tuệ ở Việt Nam hiện nay.pdf
Pháp luật về góp vốn bằng quyền sở hữu trí tuệ ở Việt Nam hiện nay.pdfPháp luật về góp vốn bằng quyền sở hữu trí tuệ ở Việt Nam hiện nay.pdf
Pháp luật về góp vốn bằng quyền sở hữu trí tuệ ở Việt Nam hiện nay.pdf
 
Hôn nhân đồng tính dưới góc độ quyền con người.pdf
Hôn nhân đồng tính dưới góc độ quyền con người.pdfHôn nhân đồng tính dưới góc độ quyền con người.pdf
Hôn nhân đồng tính dưới góc độ quyền con người.pdf
 
Bảo vệ nạn nhân của tội phạm là trẻ em dưới góc độ pháp lý.pdf
Bảo vệ nạn nhân của tội phạm là trẻ em dưới góc độ pháp lý.pdfBảo vệ nạn nhân của tội phạm là trẻ em dưới góc độ pháp lý.pdf
Bảo vệ nạn nhân của tội phạm là trẻ em dưới góc độ pháp lý.pdf
 

Recently uploaded

Painted Grey Ware.pptx, PGW Culture of India
Painted Grey Ware.pptx, PGW Culture of IndiaPainted Grey Ware.pptx, PGW Culture of India
Painted Grey Ware.pptx, PGW Culture of IndiaVirag Sontakke
 
Alper Gobel In Media Res Media Component
Alper Gobel In Media Res Media ComponentAlper Gobel In Media Res Media Component
Alper Gobel In Media Res Media ComponentInMediaRes1
 
Biting mechanism of poisonous snakes.pdf
Biting mechanism of poisonous snakes.pdfBiting mechanism of poisonous snakes.pdf
Biting mechanism of poisonous snakes.pdfadityarao40181
 
Computed Fields and api Depends in the Odoo 17
Computed Fields and api Depends in the Odoo 17Computed Fields and api Depends in the Odoo 17
Computed Fields and api Depends in the Odoo 17Celine George
 
Science lesson Moon for 4th quarter lesson
Science lesson Moon for 4th quarter lessonScience lesson Moon for 4th quarter lesson
Science lesson Moon for 4th quarter lessonJericReyAuditor
 
Mastering the Unannounced Regulatory Inspection
Mastering the Unannounced Regulatory InspectionMastering the Unannounced Regulatory Inspection
Mastering the Unannounced Regulatory InspectionSafetyChain Software
 
Presiding Officer Training module 2024 lok sabha elections
Presiding Officer Training module 2024 lok sabha electionsPresiding Officer Training module 2024 lok sabha elections
Presiding Officer Training module 2024 lok sabha electionsanshu789521
 
How to Make a Pirate ship Primary Education.pptx
How to Make a Pirate ship Primary Education.pptxHow to Make a Pirate ship Primary Education.pptx
How to Make a Pirate ship Primary Education.pptxmanuelaromero2013
 
Final demo Grade 9 for demo Plan dessert.pptx
Final demo Grade 9 for demo Plan dessert.pptxFinal demo Grade 9 for demo Plan dessert.pptx
Final demo Grade 9 for demo Plan dessert.pptxAvyJaneVismanos
 
Call Girls in Dwarka Mor Delhi Contact Us 9654467111
Call Girls in Dwarka Mor Delhi Contact Us 9654467111Call Girls in Dwarka Mor Delhi Contact Us 9654467111
Call Girls in Dwarka Mor Delhi Contact Us 9654467111Sapana Sha
 
Organic Name Reactions for the students and aspirants of Chemistry12th.pptx
Organic Name Reactions for the students and aspirants of Chemistry12th.pptxOrganic Name Reactions for the students and aspirants of Chemistry12th.pptx
Organic Name Reactions for the students and aspirants of Chemistry12th.pptxVS Mahajan Coaching Centre
 
CARE OF CHILD IN INCUBATOR..........pptx
CARE OF CHILD IN INCUBATOR..........pptxCARE OF CHILD IN INCUBATOR..........pptx
CARE OF CHILD IN INCUBATOR..........pptxGaneshChakor2
 
Employee wellbeing at the workplace.pptx
Employee wellbeing at the workplace.pptxEmployee wellbeing at the workplace.pptx
Employee wellbeing at the workplace.pptxNirmalaLoungPoorunde1
 
18-04-UA_REPORT_MEDIALITERAСY_INDEX-DM_23-1-final-eng.pdf
18-04-UA_REPORT_MEDIALITERAСY_INDEX-DM_23-1-final-eng.pdf18-04-UA_REPORT_MEDIALITERAСY_INDEX-DM_23-1-final-eng.pdf
18-04-UA_REPORT_MEDIALITERAСY_INDEX-DM_23-1-final-eng.pdfssuser54595a
 
Solving Puzzles Benefits Everyone (English).pptx
Solving Puzzles Benefits Everyone (English).pptxSolving Puzzles Benefits Everyone (English).pptx
Solving Puzzles Benefits Everyone (English).pptxOH TEIK BIN
 
Crayon Activity Handout For the Crayon A
Crayon Activity Handout For the Crayon ACrayon Activity Handout For the Crayon A
Crayon Activity Handout For the Crayon AUnboundStockton
 
SOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptx
SOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptxSOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptx
SOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptxiammrhaywood
 

Recently uploaded (20)

Painted Grey Ware.pptx, PGW Culture of India
Painted Grey Ware.pptx, PGW Culture of IndiaPainted Grey Ware.pptx, PGW Culture of India
Painted Grey Ware.pptx, PGW Culture of India
 
Staff of Color (SOC) Retention Efforts DDSD
Staff of Color (SOC) Retention Efforts DDSDStaff of Color (SOC) Retention Efforts DDSD
Staff of Color (SOC) Retention Efforts DDSD
 
Alper Gobel In Media Res Media Component
Alper Gobel In Media Res Media ComponentAlper Gobel In Media Res Media Component
Alper Gobel In Media Res Media Component
 
Biting mechanism of poisonous snakes.pdf
Biting mechanism of poisonous snakes.pdfBiting mechanism of poisonous snakes.pdf
Biting mechanism of poisonous snakes.pdf
 
Computed Fields and api Depends in the Odoo 17
Computed Fields and api Depends in the Odoo 17Computed Fields and api Depends in the Odoo 17
Computed Fields and api Depends in the Odoo 17
 
Science lesson Moon for 4th quarter lesson
Science lesson Moon for 4th quarter lessonScience lesson Moon for 4th quarter lesson
Science lesson Moon for 4th quarter lesson
 
Mastering the Unannounced Regulatory Inspection
Mastering the Unannounced Regulatory InspectionMastering the Unannounced Regulatory Inspection
Mastering the Unannounced Regulatory Inspection
 
Presiding Officer Training module 2024 lok sabha elections
Presiding Officer Training module 2024 lok sabha electionsPresiding Officer Training module 2024 lok sabha elections
Presiding Officer Training module 2024 lok sabha elections
 
How to Make a Pirate ship Primary Education.pptx
How to Make a Pirate ship Primary Education.pptxHow to Make a Pirate ship Primary Education.pptx
How to Make a Pirate ship Primary Education.pptx
 
Final demo Grade 9 for demo Plan dessert.pptx
Final demo Grade 9 for demo Plan dessert.pptxFinal demo Grade 9 for demo Plan dessert.pptx
Final demo Grade 9 for demo Plan dessert.pptx
 
Model Call Girl in Bikash Puri Delhi reach out to us at 🔝9953056974🔝
Model Call Girl in Bikash Puri Delhi reach out to us at 🔝9953056974🔝Model Call Girl in Bikash Puri Delhi reach out to us at 🔝9953056974🔝
Model Call Girl in Bikash Puri Delhi reach out to us at 🔝9953056974🔝
 
TataKelola dan KamSiber Kecerdasan Buatan v022.pdf
TataKelola dan KamSiber Kecerdasan Buatan v022.pdfTataKelola dan KamSiber Kecerdasan Buatan v022.pdf
TataKelola dan KamSiber Kecerdasan Buatan v022.pdf
 
Call Girls in Dwarka Mor Delhi Contact Us 9654467111
Call Girls in Dwarka Mor Delhi Contact Us 9654467111Call Girls in Dwarka Mor Delhi Contact Us 9654467111
Call Girls in Dwarka Mor Delhi Contact Us 9654467111
 
Organic Name Reactions for the students and aspirants of Chemistry12th.pptx
Organic Name Reactions for the students and aspirants of Chemistry12th.pptxOrganic Name Reactions for the students and aspirants of Chemistry12th.pptx
Organic Name Reactions for the students and aspirants of Chemistry12th.pptx
 
CARE OF CHILD IN INCUBATOR..........pptx
CARE OF CHILD IN INCUBATOR..........pptxCARE OF CHILD IN INCUBATOR..........pptx
CARE OF CHILD IN INCUBATOR..........pptx
 
Employee wellbeing at the workplace.pptx
Employee wellbeing at the workplace.pptxEmployee wellbeing at the workplace.pptx
Employee wellbeing at the workplace.pptx
 
18-04-UA_REPORT_MEDIALITERAСY_INDEX-DM_23-1-final-eng.pdf
18-04-UA_REPORT_MEDIALITERAСY_INDEX-DM_23-1-final-eng.pdf18-04-UA_REPORT_MEDIALITERAСY_INDEX-DM_23-1-final-eng.pdf
18-04-UA_REPORT_MEDIALITERAСY_INDEX-DM_23-1-final-eng.pdf
 
Solving Puzzles Benefits Everyone (English).pptx
Solving Puzzles Benefits Everyone (English).pptxSolving Puzzles Benefits Everyone (English).pptx
Solving Puzzles Benefits Everyone (English).pptx
 
Crayon Activity Handout For the Crayon A
Crayon Activity Handout For the Crayon ACrayon Activity Handout For the Crayon A
Crayon Activity Handout For the Crayon A
 
SOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptx
SOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptxSOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptx
SOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptx
 

Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

  • 1. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH LÊN MEN VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn :T.S NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện : CAO THỊ THANH THÚY MSSV: 1311101044 Lớp: 13DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
  • 2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hƣơng. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. TP. HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy
  • 3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho con xin gởi tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ, là ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục, động viên... là chỗ vựa tinh thần vững chắc cho con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã để con có đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc tới tập thể quý thầy cô giáo trong trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM nói chung và các thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi Trƣờng, bộ môn Công Nghệ Sinh Học nói riêng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian qua. Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đáng kinh, cô đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hƣớng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Nguyễn Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thời gian học tập tại trƣờng. Cảm ơn chị Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Trƣơng Hoài Nguyên, bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, bạn Lê Thị Thu đã đồng hành chia sẻ buồn vui cùng em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp. Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc! TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy
  • 4. Đồ án tốt nghiệp i MỤC LỤC MỤC LỤC.................................................................................................................i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................iv DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................v DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... vii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài................................................................................1 2. Mục đích của nghiên cứu..............................................................................1 3. Nhiệm vụ của nghiên cứu..............................................................................2 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài ...................................................................2 5. Kết cấu của đồ án ..........................................................................................2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................3 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ..............................................3 1.1.1. Hợp chất thứ cấp .....................................................................................3 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ........3 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin ...........................................................................5 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin .....................................................................5 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin .................................................6 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin....................................................9 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens.....................10 1.3. Giới thiệu về Serratia marcescens ..........................................................14 1.3.1. Lịch sử phát hiện................................................................................14 1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens....................................15 1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens ....................................................15 1.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens........................19 1.4.1. Sắc tố ..................................................................................................19 1.4.2. Biosurfactant......................................................................................20 1.4.3. Acid béo ..............................................................................................20 1.4.4. Enzyme................................................................................................20
  • 5. Đồ án tốt nghiệp ii 1.4.5. Yếu tố động lực của Serratia marcescens..........................................21 1.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens............................................22 1.6. Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens 24 1.7. Thu nhận và tinh sạch prodigiosin .........................................................27 1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới ..............................................................30 1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ......................................30 1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin.....................................................30 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................33 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...........................................................34 2.1.1. Thời gian. ...........................................................................................34 2.1.2. Địa điểm..............................................................................................34 2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị....................................................................34 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens................................................34 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất.......................................................34 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị.................................................................................35 2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm .........................................................................36 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.........................................................................41 2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. .........................................41 2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống ..................44 2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men 44 2.4.4. Phương pháp phân tích......................................................................47 Mục đích...........................................................................................................47 Nội dung ...........................................................................................................47 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................48 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất ....................................................................48
  • 6. Đồ án tốt nghiệp iii 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào ........................................................48 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin......................................................................52 3.1.3. So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013)............54 3.2. Thiết lập môi trƣờng nhân giống ............................................................56 3.3. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men...................................58 3.3.1. Thiết lập môi trường lên men ............................................................58 3.3.2. Thiết lập chế độ lên men ....................................................................64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................70 1. Kết luận........................................................................................................70 2. Kiến nghị......................................................................................................70 TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................70 PHỤ LỤC...............................................................................................................76 A. PHỤ LỤC 1. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ, PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.........................................................................76 B. PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH ........................................................................82 C. PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THỐNG KÊ ......................................................87
  • 7. Đồ án tốt nghiệp iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại LMTL: lên men tiếp liệu PG: peptone glycerol PGTL: peptone glycerol tiếp liệu MT1: môi trƣờng 1 MT2: môi trƣờng 2
  • 8. Đồ án tốt nghiệp v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) ..........6 Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)...........................................7 Hình 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009)............9 Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) .................................11 Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin...........13 Hình 1.6 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. .......16 Hình 1.7 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011)............................................................................................................16 Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014)..........................................23 Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009)..........27 Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) ..........................................27 Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô. .......................................................................................................37 Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật........................................................38 Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4......................................................................................................39 Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia marcescens SH4......................................................................................................40 Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn....................43 Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol.......................................................................46 Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB...........................................................................................................................49 Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB ................................................................................................................................50 Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB...........................................................................................................................51 Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ...................................................................53 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1.............................................54 Hình 3.6 Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SH4 ..........................................55 Hình 3.7 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của hai chủng SH4 và SH1 ...................55 Hình 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 theo thời gian trên các môi trƣờng nhân giống khác nhau......................................................57 Hình 3.9 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian........60
  • 9. Đồ án tốt nghiệp vi Hình 3.10 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............61 Hình 3.11 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............63 Hình 3.12 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian................65 Hình 3.13 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh và OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men peptone glycerol tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian......................................................................................67 Hình 3.14 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499 nm) của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG ở các nồng độ tiếp liệu tại 48h. (số liệu thô xem ở bảng 5 - phụ lục A và hình 9 - phụ lục B).......................................68
  • 10. Đồ án tốt nghiệp vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật ............4 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) .8 Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens.................................17 Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)......25 Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin .......................................................32 Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. .....................................................................................................................51 Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ................................................................................................................................53 Bảng 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 và SH1.........................56 Bảng 3.4 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng nhân giống theo thời gian. ....................................................................57 Bảng 3.5 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian.........59 Bảng 3.6 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............61 Bảng 3.7 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............62 Bảng 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian................65
  • 11. Đồ án tốt nghiệp 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Prodigiosin là một sắc tố đỏ có bản chất là một alkaloid, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Prodigiosin đƣợc tìm thấy trong quá trình lên men của một số loài vi sinh vật nhƣ Alteromonas rubra Moss, 2002 ; Rugamonas rubra Gerber, 1975; Serratia rubidaea Moss, 2002; Streptoverticillium rubrireticuli Gerber, 1975 Vibrio gazogenes Moss, 2002 và một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia mar- censcens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3- amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng EPN và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng peptone glycerol, nutrient broth, môi trƣờng đậu phộng, môi trƣờng hạt mè,.... Một số nghiên cứu thu prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens thông thƣờng cần trích ly lỏng rắn bằng ethanol/methanol, sau đó trích ly lỏng lỏng bằng dung môi kém phân cực hơn để đƣợc prodigiosin tinh sạch một phần. Việc thu hồi prodigisin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém vì vậy một số nghiên cứu đã sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu.. Với mục tiêu tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện để sinh tổng hợp prodigiosin trong môi trƣờng bằng nuôi cấy lỏng ngƣời thực hiện đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu”. 2. Mục tiêu của nghiên cứu
  • 12. Đồ án tốt nghiệp 2 Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 3. Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào. Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Thiết lập môi trƣờng lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài Chọn lọc đƣợc chủng S.marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại bào protease và lipase cao nhất. Khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc môi trƣờng lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc chế độ lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. 5. Kết cấu của đồ án Đồ án “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng: 1. Tổng quan tài liệu Giới thiệu về prodigiosin các tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp prodigiosin, phân loại loài cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hóa của vi khuẩn Serratia marcescens. 2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đồ án. Cách bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm. 3. Kết quả và thảo luận Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành.
  • 13. Đồ án tốt nghiệp 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp. 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997. Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Willliams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula,
  • 14. Đồ án tốt nghiệp 4 Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kiềm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật (fungi, acmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vât. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ cấp Ứng dụng Kiểu tác động ức chế Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum Penicilin Ức chế tụ cầu khuẩn, nhiễm trùng kỵ khí, giang mai, hen suyễn. Ức chế tạo polymer vách tế bào vi khuẩn, ức chế hấp thụ amini acid và protein, ứ chế tạo enzyme. Streptomyces griceus Streptomycin Ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng. Trị bệnh lao, bệnh viêm màng não, ho gà. Ức chế ghép nối một số amino acid vào protein, tác động lên hệ enzyme cả vi khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb, ... Streptomyces venezuelas Chloranphenicol Ức chế đối với bệnh lỵ, sốt Ức chế đặc hiệu sinh tổng hợp
  • 15. Đồ án tốt nghiệp 5 cao, sốt phát ban. protein vi khuẩn liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide. Streptomyces aureomycin Tetracilin Ức chế phổ rộng vi khuẩn Gram âm, Gram dƣơng Ức chế tổng hợp protein Streptomyces erythraeus Erythromycin Chữa bệnh do tụ cầu khuẩn Streptococcal gây ra Ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng Sttreptomyces fradiae Neomycin Tác dụng vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng Hơi độc Streptomyces kanamycetius Kanamycin Điều trị lao, ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng Tác động giống nhƣ Streptomycin và Neomycin Streptomyces lavendulae Cycloserine Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hơp vách tế bào 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin
  • 16. Đồ án tốt nghiệp 6 Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, meta- cycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochlo- ride (cPrG-HCl). 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Wil- liamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolypyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methane (Qadri và Wil- liams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008)
  • 17. Đồ án tốt nghiệp 7 Các sắc tố màu đỏ của S.marcescens đã đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigio- sine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodi- giosin tổng hợp bởi S.marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles, nhƣ thể hiện trong hình 1.4, Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan trong nƣớc. Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform,
  • 18. Đồ án tốt nghiệp 8 methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một bƣớc sóng nhất định và sự biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ. Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Loài Tên sắc tố Danh pháp prodigiosin Trọng lƣợng phân tử và công thức Serratia marcescens Prodigiosine 2-Methyl- 3- amyl-6-methoxy- prodigiosene 323,4 Da C20H25N3O Serratia marcescens Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl- 6-hydroxy- prodigiosene 309,4 Da C10H23N3O Serratia marcescens Dipyrrolyl- dipyrromelhenr prodigiosin 2-(2-pyrryl)-4-6- dimethoxypy- prodigiosene 334,4 Da C19H18N4O2 Nocardia (Actinomadura) madurae Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- methoxy- prodigiosene 363,5 Da C23H31N3O Nocardia (Actinomadura) madurae Cyclononyl- prodigiosin 2,10-Nonano-6- melhoxy- prodigiosene 265,5 Da C23H33N3O Nocadia (Actinomadura) pellctieri Methylcyclodccyl- prodigiosin 2,10-Nonano-6- Methoxy- prodigiosene 391,5 Da C25H33N3O Streptomyces longisporusruber và Nocardia Undccyl- prodigiosin 2-Undecyl-6- Rnethoxy- prodigiosene 393,6 Da C25H35N3O
  • 19. Đồ án tốt nghiệp 9 (Actonomadura) pelletieri Streptomyces longisporusber Metacyclo- prodigiosin 2,4-(9- Ethylnonano)-6- methoxy- prodigiosene 391,6 Da C25H33N3O 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loại vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV,... dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Hình 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) A. Đối kháng với Staphylococcus aureus B. Đối kháng với Echerichia Ecoli Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012).
  • 20. Đồ án tốt nghiệp 10 Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả chống ung thƣ (Pandey và cộng sự, 2009; Pe1rez – Tomás và Vias, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự, 2007). 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serrtia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2’-bipyrrile-5- caboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl- 6-methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một chủng Serratia marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này đƣợc báo cáo. Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong Erwinia carotovora subsp. Carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm). trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tính hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở hình 1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp.
  • 21. Đồ án tốt nghiệp 11 Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thƣớc và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001). Hình 1.3 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Strep- tomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí tƣơng đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ đƣợc hiển thị trong màu đen, chịu trách nhiệm tổng hợp phân nữa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu đỏ. Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là PigO. RT-PCR với primer extension sẽ nhận thấy có sự phiên mã qua lại giữa hai gene pigN và pigO (Slater và cộng sự, 2003), điều này phù hợp với pigO là một op-
  • 22. Đồ án tốt nghiệp 12 eron trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đƣợc sao chép dƣới dạng polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater er al., 2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 274 cũng đƣợc sao chép dƣới dạng polycistronic thông tin. Có một khoảng cách đáng kể giữa hai cụm sắc tố pigC và pigD. Khoảng cách 184 bp giữa pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy khả năng chứa hai đơn vị phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai bên của khoảng cách này đã chứng minh là tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu dùng lacZ hợp vời pigA và pigH (Crow, 2001). Cụm pig trong Sma 274 có khoảng cách 64 bp giữa pigC và pigD, nhỏ hơn so với Serratia ATCC 39.006, khoảng cách này không có ý nghĩa. Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14-15 gene), có thể phản ánh sự phức tạp hơn về các sản phẩm undecylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Streptomyses coelicolor (Harris và cộng sự, 2004). Mƣời hai gene đƣợc lƣu giữ giữa ba cụm, có thể mong đợi con đƣờng tổng hợp cho ra các sản phẩm tƣơng tự. Tuy nhiên, định hƣớng và điều tiết của nó có sự thay đổi rõ rệt (Slater và cộng sự, 2003). Việc bố trí không giống nhau của các gene tƣơng đồng trong cụm sản xuất các sản phẩm hóa học tƣơng tự đặt ra câu hỏi về nguồn gốc và sự tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm. Vẫn chƣa rõ liệu các loài trong cùng một họ có vai trò quan trọng ảnh hƣởng đến sự sắp xếp không giống nhau của các gene hay sự khác biệt đã phát sinh một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Sự khác biệt ở các gene hiện diện trong những operon có thể giải thích sự khác biệt trong phƣơng thức sản xuất và con đƣờng tổng hợp sinh hóa. PigD và pig E là hai pig gene không có sự tƣơng đồng trong cụm màu đỏ. Tƣơng tự nhƣ vậy, pdtorfL và pdtorf thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng hợp các chất khử clo (carbon tet- rachloride) nhƣ pyridine-2-6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri (Lewis và cộng sự, 2000). PigE tƣơng tự aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ Streptomyces coelicolor A3(2), đƣợc mã hóa bởi một gene không liên kết với cụm màu đỏ (38% giống với PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống với PigE từ Sma 274; cả hai đều là 50% tƣơng đƣơng 460 aa). Thật vậy, nó có thể là gene mã
  • 23. Đồ án tốt nghiệp 13 hóa protein tham gia vào quá trình tổng hợp prodigiosin và undecylprodigiosin có thể không đƣợc liên kết với các cụm gene. RedR, RedQ và RedP không đƣợc mã hóa tƣơng đồng bởi cụm pig, nhƣng chúng đƣợc cho là chỉ đạo tổng hợp acetate từ ba nguyên tử carbon của vòng pyrrole và chuỗi bên undecylprodigiosin (Cerdeno và cộng sự, 2001). Các gene mã hóa tƣơng đồng tƣơng ứng có thể có mặt tại một vị trí trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác có thể thực hiện vai trò xúc tác cần thiết trong sinh trong sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia. Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tƣơng ứng của Escherichia coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme đƣợc mã hóa bởi các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004). Hình 1.4 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin.
  • 24. Đồ án tốt nghiệp 14 Đề xuất này cũng tƣơng tự nhƣ đề xuất đối với undercylprodigiosin (Cerdeno và cộng sự, 2001). Mƣời hai Red protein với sự mã hóa trong cụm pig (“lõi” là en- zyme prodigiosin) có kích thƣớc tƣơng tự nhau trong bản sao của Pig. Một ngoại lệ là PigB (670 aa) tƣơng đồng với RedS (Sc3f7.05c), là một protein nhỏ hơn nhiều (146 aa) và tƣơng tự gắn vào cuối đầu N của PigB. Phần còn lại của PigB gắn với các amine oxidase. Các protein PigI và PigJ đều nhỏ hơn RedM và tƣơng đồng với RedX (Harris và cộng sự, 2004). PigA là trình tự tổng hợp một loạt các actyl-CoA dehydrogenase. Chuỗi liên kết với human isovaleryl-CoA dehydrogenase, cấu trúc tinh thể trong đó đã đƣợc xác định, cho thấy rằng phần lớn các acid amin xung quanh flavin và phosphopantetheinyl moiety của CoA đƣợc bảo vệ nhƣng các acid amin tham gia vào liên kết nhóm adenisyl của CoA không đƣợc bảo vệ (Tiffany và cộng sự, 1997). Điều này hỗ trợ cho rằng PigA là một PCP prolyl hơn là prolyl- CoA. 1.3. Giới thiệu về Serratia marcescens 1.3.1. Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó vào năm 332 trƣớc công nguyên những ngƣời lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcrscens, tuy nhiên điều
  • 25. Đồ án tốt nghiệp 15 này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Girbbs, 2011). Bizio một dƣợc sĩ ở padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Ser- ratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Sau 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serratia, tên loài mar- cescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại Serratia marsescens là vi khuẩn. 1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:  Giới: Bacteria  Ngành: Proteobacteria  Lớp: Gramma proteobacteria  Bộ: Enterobacteria  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Serratia  Loài: Serratia marcescens 1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens
  • 26. Đồ án tốt nghiệp 16 Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia macecens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40o C và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Hình 1.5 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. Hình 1.6 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 1.3.3.1. Đặc điểm sinh lý Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả là khuẩn lạc tròn lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính
  • 27. Đồ án tốt nghiệp 17 là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thƣờng bị mất đi trong các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 1.3.3.2. Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatas, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trƣờng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Entero- bacteriaceae bởi ba đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinease (Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.7. (Tariq và John, 2010). Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl Red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase +
  • 28. Đồ án tốt nghiệp 18 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 12 Triple sugar iron Môi trƣờng chuyển sang acid, không sinh khí và không sinh H2S 13 Hydrogen sulphide - 14 Lysine decarboxylase + 15 Omithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose + 20 Lên men xylose - 21 Lên men rhaminose - 22 Lên men lactose - 23 Lên men arabinose - 1.3.3.3. Đặc điểm phân bố Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực vật, côn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hóa của ngƣời và động vật có xƣơng sống. Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng một vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964). Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng (Grimont và công sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế.
  • 29. Đồ án tốt nghiệp 19 Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiểm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài Steinerma và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia mar- cescens với Steinernema carpocapsae. 1.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens 1.4.1. Sắc tố Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marsescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố đặc biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, meta- cycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochlo- ride (cPrG-HCl) (Krishna, 2008). Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup A1 và A2/6, nó không đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8 hoặc TCT (Gri- mont, 1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thƣờng gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Gri- mont, 1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigi- osin đã đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Daunehauer và cộng sự, 1984). Các dòng đƣợc tạo thành này có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, có thể chúng sẽ không tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkner, 1977).
  • 30. Đồ án tốt nghiệp 20 Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5- carbonxymethylmuconic semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự,1988). Enzyme này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006). 1.4.2. Biosurfactant Các chủng sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30o C nhƣng không đƣợc sản xuất ở 30o C trog phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1 đến W3, có các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 đƣợc xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trƣớc đó đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng sự (1961). 1.4.3. Acid béo Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic và octadecanoid acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50-80% thành phần tế bào, trong đó, n- tetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983). 1.4.4. Enzyme Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,… Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa chitin tronrg quá trình sản xuất thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc,… (Joshi và cộng sự, 1989).
  • 31. Đồ án tốt nghiệp 21 Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase (ChiA, ChiB, ChiC) một chitobiase và một protein chitin-bindng (CBP21) (Fuchs và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996; Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998; Suzuli và cộng sự, 1998), chúng có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36 và 21 kDa, cùng với các hoạt động chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986). 1.4.5. Yếu tố động lực của Serratia marcescens Yếu tố động lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân chủ gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ, mà phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và Hewlett, 1986). Một số yếu tố động lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm sự bám dính, tính kỵ nƣớc, manose-resistant, mannose-sensitive, LipoPolySaccha- ride (LPS). Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính. Các yếu tố bám dính của vi sinh vật đƣợc gọi là các adhesion, chúng có thể có bản chất polypeptide thì đƣợc chia thành hai nhóm là nhóm có fimbriae và nhóm không có fimbriae. Mà các vi khuẩn Gram âm, nhƣ là Serratia marcescens, thƣờng bám dính nhờ các fimbriae này. Các fimbriae (hay còn gọi là các pili) là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng nhƣ sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các Finbriae đƣợc cấu tạo bởi nhiều pro- tein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống nhƣ trụ xoắn ốc. Thƣờng thì chỉ có một loại protein là cấu trúc chính của một phân nhóm fimbriae tuy nhiên các protein phụ trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc fimbriae. Đỉnh của các fimbriae có chức năng gắn với tế bào vật chủ. Bên cạnh đó, LSP hay còn đƣợc gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lƣỡng tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ
  • 32. Đồ án tốt nghiệp 22 màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – an- tigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là các thành phần gây độc của phân tử LPS, gây nên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm. Ngoài ra, việc sản xuất các enzyme khác nhau bởi Serratia marcescens cũng đƣợc xem nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme chitinase, lipase, chlorope- roxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997). 1.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens S. marcescens đã đƣợc khảo sát cho sự tăng trƣởng và khả năng gây bệnh của nó trong các ấu trùng sâu bƣớm sáp (Galleria mellonella). Tất cả các chủng gây bệnh cho ấu trùng của G. mellonella dẫn đến tử vong trong vòng 48 giờ. Chủng đã đƣợc chứng minh có một gen mã hóa protein metalloprotease serralysin. Gen mã hóa protein metalloprotease đƣợc xác định là góp phần vào quá trình gây chết côn trùng (J.T. Tambong; Xu, R.; Sadiku, 2014) S. marcescens đƣợc biết đến với khả năng tiết nhiều enzyme ngoại bào nhƣ chitinase, lecthinase, hemolysin, lipase, protease, nuclease..Mặc dù S. marcescens có thể sản xuất nhiều protease khác nhau, trong đó có metalloprotease kẽm, serralysin. Meada và cộng sự năm 1995 báo cáo rằng serralysin đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của sinh vật này. Nghiên cứu đã chứng minh serralysin nhanh chóng làm suy giảm một loạt cấu trúc protein và huyết thanh. Theo đó, protease vi khuẩn nhƣ serralysin đóng một vai trò quan trọng nhƣ một yếu tố độc lực (Yutaka Kida và cộng sự, 2007). . Theo K Ishii et al. (J Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm (silkworm larvae).
  • 33. Đồ án tốt nghiệp 23 Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014). Serratia marcescens còn đƣợc biết đến với khả năng lây nhiễm cho trứng, ấu trùng, nhộng và sâu trƣởng thành của loài Heliothis-thuộc chi bƣớm đêm gây hại cho nông nghiệp (Sikorowski và Lawrence, 2009) Ấu trùng lớn tuổi bị nhiễm vi khuẩn thƣờng bộc lộ phản ứng là giảm các kích thích bên ngoài, và cái chết xảy ra một hoặc hai ngày sau đó. Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào trong đƣờng máu của vi khuẩn và gây ra nhiễm trùng huyết và gây tử vong. Theo kết quả nghiên cứu của Estrada và cộng sự năm 2012 thì ấu trùng bị nhiễm trở thành màu đỏ sau khi chết, và tỉ lệ sống sót của những ấu trùng bị nhiễm là rất ít. Một số ấu trùng bị nhiễm trong giai đoạn cuối của ấu trùng thì sau khi hóa nhộng nó cũng sẽ bị chết do nhiễm khuẩn và khi chết nó cũng xuất huyết có màu đỏ của S. marcescens. Đến giai đoạn sâu trƣởng thành, nó có thể đƣợc lấy nhiễm bằng cách cho ăn thực phẩm bị ô nhiễm, các vi khuẩn sẽ xâm nhập vào các mô của côn trùng và gây chết. Serratia marcescens có khả năng lây nhiễm và loại bỏ cao đối với bộ H. Zea và H virescens . Serratia marcescens còn có thể kết hợp với một số loại tuyến trùng hay giun tròn để gây bệnh cho côn trùng ví dụ nhƣ: O. Carolinensis kết hợp với Serratia marcescens gây bệnh côn trùng trên lớp biểu bì bên ngoài của nó.
  • 34. Đồ án tốt nghiệp 24 Ngoài ra cũng có thể tạo đƣợc mối quan hệ nhân tạo giữa vi khuẩn và các tuyến trùng, bằng cách trộn chung tuyến trùng với vi khuẩn và nuôi chúng trong một khoảng thời gian. Cũng trong nghiên cứu của Estrada và cộng sự, năm 2012 thì khi Steinernema carpocapsae kết hợp với S. marcescens mang đến hiệu quả diệt 100% ấu trùng Galleria mellonella chỉ sau 48 giờ. Mặc dù vậy sự tồn tại của S. marcescens cũng không ảnh hƣởng đến vi khuẩn cộng sinh X. Nematophila. 1.6. Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn. Bản chất màu đỏ tƣơi của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn nhƣ: nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan, ánh sáng, phos- phate vô cơ và thành phần môi trƣờng ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005). Quá trình sản xuất prodigiosin trong S. marcescens rất nhạy cảm với nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004). Hơn nữa, môi trƣờng thông thƣờng đƣợc sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các chủng S. marcescens là môi trƣờng phức tạp và rất giàu dinh dƣỡng (Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất dinh dƣỡng nhƣ thia- mine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối với sản xuất prodigi- osin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977), adenosine triphosphate và ri- bose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp prodi- giosin. Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của S. marcescens trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ: môi trƣờng hạt mè, môi trƣờng hạt đậu phộng, nutrient broth và peptone glycerol broth,... Các môi trƣờng cũng đƣợc so sánh tốc độ tăng trƣởng và khả năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng
  • 35. Đồ án tốt nghiệp 25 hợp nhiều prodigiosin hơn. Trên môi trƣờng hạt đậu phộng thì prodigiosin có thể tổng hợp ở nhiệt độ 37oC trong khi trên các môi trƣờng nhƣ nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không có bổ sung đƣờng cũng không thể làm đƣợc điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bớt lƣợng glucose và các loại đƣờng lên men đƣợc khác do sự giảm pH trong canh trƣờng nuôi cấy (Khanafari và cộng sự, 2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong môi trƣờng nutrient broth, về cơ bản là môi trƣờng này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glu- cose làm tăng cƣờng việc sản xuất sắc tố, trong trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng hạt mè thì nguồn carbon ở dạng các acid béo. Maltose và glucose đƣợc thêm vào môi trƣờng nutrient broth làm tăng gấp đôi năng suất so với chỉ sử dụng môi trƣờng nu- trient broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố đƣợc tăng cƣờng trong môi trƣờng peptone glycerol broth ở 30oC và trong môi trƣờng nutrient broth ở 28oC, điều này có thể là do sự hiện diện của glycerol nhƣ là một nguồn carbon. Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trƣởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Stt Môi trƣờng sử dụng Nhiệt độ 280 C 300 C 370 C Tham khảo 1 Môi trƣờng dextrose bổ sung casein 13,0 - - Pruss và Matsumura, 1996 2 Ethanol và nguồn carbon 3,0 - - Mandarville, 2001 3 Canh dinh dƣỡng 0,52 0,354 0,111 Giri và cs,
  • 36. Đồ án tốt nghiệp 26 2004 4 Canh Peptone glycerol 0,302 0,569 0,111 Giri và cs, 2004 5 Môi trƣờng hạt mè 16,68 9,3 0,319 Giri và cs., 2004 6 Canh dinh dƣỡng bổ sung 0,5% maltose 1,836 0,79 0,104 Giri và cs, 2004 7 Canh dinh dƣỡng bổ sung 0,5% glucose 1,689 0,29 0.104 Giri và cs, 2004 8 Môi trƣờng hạt mè bổ sung 0,5% maltose 9,43 8,56 1,63 Giri và cs, 2004 9 Môi trƣờng hạt mè bổ sung 0,5% glucose 1,47 1,16 0,42 Giri và cs, 2004 10 Môi trƣờng dầu mè 0,767 1,006 0,107 Giri và cs, 2004 11 Môi trƣờng hạt đậu phộng 38,75 25,98 1,49 Giri và cs, 2004 12 Môi trƣờng dầu đậu phộng 2,89 0,559 0,111 Giri và cs, 2004 13 Môi trƣờng từ dừa 1,94 1,39 0,1736 Giri và cs, 2004 14 Môi trƣờng dầu dừa 1,42 0,05 0,177 Giri và cs, 2004
  • 37. Đồ án tốt nghiệp 27 Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009) Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) 1.7. Thu nhận và tinh sạch prodigiosin Các sắc tố không tan trong nƣớc mà tan trong dầu thƣờng đƣợc chiết xuất bằng dung môi hữu cơ pha nƣớc nhƣ: acetone, methanol, ethanol hoặc các hỗn hợp
  • 38. Đồ án tốt nghiệp 28 của các dung môi, để giúp các dung môi này hoạt động tốt hơn. Chiết xuất thƣờng có chứa một lƣợng nƣớc đáng kể, do đó có thể đƣợc loại bỏ bằng cách phân lớp nhờ hexane, petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn hợp các dung môi. Sắc ký, quang phổ hấp thụ ở vùng khả kiến sẽ là cơ sở đầu tiên dùng để xác định các sắc tố. Quang phổ sẽ đƣợc thực hiện, lƣu giữ và sau đó tiến hành so sánh với các phổ chuẩn (Amaya, 2001). Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây đƣợc đề xuất là nên thực hiện để xác định một hợp chất chƣa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994). - Phổ hấp thụ (𝜆𝑚𝑎𝑥 ). - Sắc ký lớp mỏng (Rf). - Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lƣu mẫu). - Phƣơng pháp phổ khối (khối lƣợng phân tử). - NMR (chuyển hóa về mặt hóa học). Một số nghiên cứu về thu nhận và tinh sạch prodigiosin đã đƣợc thực hiện: - Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) đƣợc chiết xuất từ môi trƣờng nutrient broth nuôi cấy S. marcescens sau 72 giờ, với ethanol và petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung môi trong bể cách thuỷ và hòa tan phần còn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky, 1980). - Các sắc tố từ tế bào của S. marcescens phân lập từ đất đƣợc chiết xuất bằng acetone, hòa với một ít ethyl acetate và đƣợc sấy khô bằng natri sulfat. Các chất chiết xuất đƣợc hòa tan và đƣợc thực hiện quét từ bƣớc sóng 200 – 700 nm. Hỗn hợp dung môi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5:2,5:0,5 (v:v) đã đƣợc sử dụng để tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với các sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng. Cột silicagel có kích thƣớc từ 80 – 100 mesh đã đƣợc sử dụng để phân tách các tạp chất không màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết cho thấy có độ hấp thụ cao duy nhất tại 535 nm trong quang phổ UV. Nó đƣợc tiếp tục phân tích để xác định trọng lƣợng phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết đƣợc đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng có trọng lƣợng phân tử là 324 Da (Giri và cộng sự, 2004).
  • 39. Đồ án tốt nghiệp 29 - Prodigiosin đƣợc chiết xuất bằng cách lắc môi trƣờng nuôi cấy tế bào Serratia marcescens 2170 với methanol có tính acid với tỷ lệ 24:1 (v:v) và dịch trong suốt đƣợc cô quay chân không. Sắc ký lỏng cao áp của các chiết xuất đƣợc thực hiện trên silicagel với dung môi chloroform và methanol. Các sắc tố thu đƣợc sẽ đƣợc rửa giải trong methanol và phân tích phổ khối (ESI-MS). Sau đó, các sắc tố chƣa tinh khiết đã thu đƣợc sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 𝜇m) đã đƣợc sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10 mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% ace- tonitrile). Việc rửa giải đƣợc theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dò UV diode- array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003). - Sau khi lên men S. marcescens phân lập từ đất, canh trƣờng đƣợc lấy từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v:v) đã acid hóa (pH 3,0) đƣợc thêm vào IAB. Các sắc tố đƣợc chiết xuất bằng cách sử dụng một vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem cô đặc và ly tâm. Sau đó, nó đƣợc thu bằng cách sử dụng nƣớc và chloroform để tách pha. Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dƣới của pha chloroform và đƣợc cô quay chân không. Prodigiosin đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silicagel (2,5 × 30 cm). Nó đƣợc rửa với một hỗn hợp hexane:ethyl acetate (2:1, v:v). Các sắc tố cô đặc đã đƣợc tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5 (v:v) trong TLC. Sau đó, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đƣợc thu nhận và hòa tan trong acetone. Các sắc tố chƣa tinh khiết sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp TLC (với tỷ lệ dung môi chloroform:methanol:diethyl ether là 6:2:2) và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm). Sau đó, nó đƣợc tách rửa với hỗn hợp methanol:nƣớc (7:3, v:v) đã đƣợc điều chỉnh pH = 3,0 bằng HCl 0,1N với tốc độ dòng chảy là 20 ml/phút. Một lƣới thép không gỉ lớn với kích thƣớc lỗ 0,5 cm đã đƣợc sử dụng nhƣ sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng độ của các prodigiosin sản xuất ra đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 535 nm trong methanol đã đƣợc acid hóa (HCl 0,001N 4 ml + 96 ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lƣợng phân tử của chất màu tinh
  • 40. Đồ án tốt nghiệp 30 khiết đƣợc xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1 H- và 13 C-NMR của các mẫu màu đƣợc ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3. Các dịch chuyển hóa đã đƣợc đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố đƣợc ghi nhận (Song và cộng sự, 2006). - Các sắc tố đƣợc sản xuất bởi Serratia marcescens SM∆R đã đƣợc tinh sạch thực hiện NMR và phổ khối để xác định cấu trúc hóa học của nó (Wei và Chen, 2005). Các sắc tố đƣợc chiết xuất từ canh trƣờng lên men bằng methanol và sau đó tinh chế bằng cách sử dụng một cột silica gel hexane-balanced để thu các sản phẩm mục tiêu trong cột (Cang và cộng sự, 2000; Montaner và cộng sự, 2000). Sau đó cột đƣợc rửa với ethyl acetate 10M để giải phóng các sản phẩm hấp thụ. Màu cam sau khi rửa giải đã đƣợc thu và làm khô trong máy sấy chân không ở 45oC để có đƣợc những sản phẩm tinh khiết (bột màu đỏ). Các sắc tố thu đƣợc trong nghiên cứu đã đƣợc báo cáo là undecylprodigiosin dựa trên phân tích NMR và MS, còn đƣợc gọi là prodigiosin 25-C, là một trong những sắc tố đỏ đƣợc sản xuất bởi Serratia sp. và Streptomyces sp. Nó có hoạt động ức chế miễn dịch và quá trình apoptosis-inducing tƣơng tự nhƣ prodigiosin, nhƣng ít đƣợc nghiên cứu hơn (Tomas và cộng sự, 2003). 1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới 1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens Brigida và Itamar (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của Serra- tia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng nhƣ ảnh hƣởng của S. marces- cens lên thúc đẩy tăng trƣởng của cây thuộc chi cam chanh. Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm Ser- ratia marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt đƣợc kết quả gây chết 100% ấu trùng. 1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin Sundaramoorthy và cộng sự (2009), thực hiện nghiên cứu để sàng lọc những chủng Serratia có hiệu quả sản xuất prodigiosin và đã phân lập đƣợc chủng Serratia marcescens NY1 từ đất.
  • 41. Đồ án tốt nghiệp 31 Helvia và cộng sự (2010), đã tối ƣu hóa quá trình sản xuất prodigiosin bởi Ser- ratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nƣớc thải từ công nghiệp chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l. Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất prodigio- sin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigio- sin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi trƣờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và quá trình chiết xuất prodigiosin đƣợc thực hiện bằng ethanol:hydrochloric acid (9,5:0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận đƣợc có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candi- da albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa, prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hƣởng bởi acid, kiềm, chất tẩy rửa, mà có thể ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu. Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất prodi- giosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi trƣờng dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 μg/ml. Một số bằng sáng chế về prodigiosin đƣợc liệt kê trong bảng 1.6 (Krishna, 2008).
  • 42. Đồ án tốt nghiệp 32 Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin Tên Patent Tóm tắt Tác giả Ngày công bố United States Patent 6638968 A novel use of prodigiosin for treating diabetes mellitus without any side effect Kim Hwanmook, Han Sangbae, Lee Changwoo, Lee Kihoon, Park Sehyung, Kim Youngkook. 10/28/2003 United States Patent 6645962 The prodigiosin from Serratia marcescens is useful as an immunosuppressive in various fields, including the treatment of the diseases requiring immunosuppression and the basic research for the diseases, the transplantation of the organs or tissues. and the immune cells. Kim Hwanmook, Kim Youngkook, Han Sangbae, Yoo Sungak. 11/11/2003 United States Patent 4266028 The invention relates to novel use of prodigiosin for the treatment of Rheumatic m1hritis and can provide excellent treatment effect to Rheumatic arthritis by treating composition including prodigiosin isolated from Serratia marcescens as an active principle to DBA-l Kim Hwan- Mook Han Sang- Bac Lee Chang- Woo Lee Ki- Hoon Park Se- Hyung Kim Hy- oung Chin Kim Young- Kook 07/01/2004
  • 43. Đồ án tốt nghiệp 33 mouse of collageninduced Rheumatic al1hritis animal model and thereby inhibiting production of internal cytokine which is a important pathogen of Rheumatic
  • 44. Đồ án tốt nghiệp 34 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Thời gian. Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 30/04/2017 đến ngày 16/07/2017. 2.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens Giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4 và SH5 đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Giống vi khuẩn Serratia marcescens HB đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Lê Quốc Vũ, 2015 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất. a. Môi trƣờng ( Thành phần môi trƣờng xem phụ lục 1) - Môi trƣờng Peptone glycerone agar (PGA) - Môi trƣờng Peptone glycerone broth (PG) - Môi trƣờng Casein - Môi trƣờng Lipit - Môi trƣờng huyền phù Chitin 1% - Môi trƣờng nhân giống 1 (MT1) - Môi trƣờng nhân giống 2 (MT2) - Môi trƣờng lên men (MTLM) b. Hóa chất sử dụng - Cồn 70, cồn 96 - NaCl - HCl, NaOH
  • 45. Đồ án tốt nghiệp 35 - Petroleum ether - Nƣớc muối bão hòa 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị a. Dụng cụ - Phiễu chiết - Ống nghiệm - Đĩa petri - Erlen 50ml, 100ml, 250ml - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml - Pipetman 100μl, 1000μl. - Đầu típ - Đũa thủy tinh - Bao hấp, giấy gói, thun - Đèn cồn, que cấy vòng - Bông không thấm, bông thấm - Chai syrum 100ml. b. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh - Cân phân tích - Bếp từ - Máy nƣớc cất - Autolave - Tủ hút - Máy ly tâm - Máy lắc - Máy đo quang phổ - Máy cô quay - Bể điều nhiệt
  • 46. Đồ án tốt nghiệp 36 - Kính hiển vi 2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 2.3.1 Mục đích Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 2.3.2 Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại bào. Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. 2.3.3 Phương pháp luận Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thƣờng không trễ pha với quá trình tăng trƣởng tế bào. Dịch môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trƣớc đó của các tác giả trong và ngoài nƣớc để xác định môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy cho chủng phân lập của phòng thí nghiệm. 2.3.4 Bố trí thí nghiệm Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau:
  • 47. Đồ án tốt nghiệp 37 Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô. Chọn lọc chủng Chủng vi sinh vật (S.marcescens SH4, SH5 và HB) Thiết lập môi trƣờng nhân giống Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men Chế phẩm prodigiosin thô
  • 48. Đồ án tốt nghiệp 38 Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật. Thử nghiệm enzyme ngoại bào Chủng vi sinh vật (S.marcescens SH4, SH5 và HB). Trích ly thu prodigiosin Lipase Protease Nuôi cấy lỏng lắc, MTPG Chitinase
  • 49. Đồ án tốt nghiệp 39 Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia mar- cescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng MT2 Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng MT1 Tăng sinh trên môi trƣờng PG 0h 4h 8h 16h 20h 24h Đo độ đục (mật độ tê bào) OD = 620nm
  • 50. Đồ án tốt nghiệp 40 Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia mar- cescens SH4 Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng MT2 Tăng sinh trên môi trƣờng PG 0h 9h 24h 33h 48h 57h Đo prodigiosin OD = 499nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm Lên men trên môi trƣờng PG Lên men trên môi trƣờng LMTL, PGTL Lên men trên môi trƣờng LMTL, PGTL Lên men trên môi trƣờng PG Tiếp liệu Glycerol
  • 51. Đồ án tốt nghiệp 41 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. 2.4.1.1. Phương pháp định tính enzyme Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 48h. Thử nghiệm hoạt tính lipase Pha môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121o C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50o C đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đo đƣờng kính vòng tủa trên bề mặt môi trƣờng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung quanh điểm cấy. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme lipase thì không xuất hiện vòng tủa xung quanh điểm cấy. Khả năng phân giải lipid đƣợc đánh giá qua đƣờng kính vòng tủa trên đĩa thạch mm. Vòng tủa càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase càng nhiều. Thử nghiệm hoạt tính protease Pha môi trƣờng geltatine agar và môi trƣờng casein agar, hấp 121o C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50o C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả:
  • 52. Đồ án tốt nghiệp 42 Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme protesae thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải casein đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease càng nhiều. Thử nghiệm hoạt tính chitinase Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin, hấp 121o C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50o C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng thuốc thử lugol. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng lính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase càng nhiều. 2.4.1.2. Phương pháp trích ly thu prodigiosin Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 48h. Sau khi tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH =2 trong 4 giờ; cho 450μl HCl 1N vào trong canh trƣờng, để trên máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng sau khi sử lý acid HCl trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450μl NaOH 1N để đƣa về pH =7, đem đo OD620nm và OD499nm, song song đó tiến hành trích ly lỏng lỏng theo sơ đồ hình:
  • 53. Đồ án tốt nghiệp 43 Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức lên 25ml và pha loãng mẫu bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5, v;v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo OD535 nm, xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD vào phƣơng trình Xử lý acid Canh trƣờng sau nuôi cấy Trung hòa NaOH 1N Ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Sinh khối Dịch trong Ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Dịch trong Ethanol: HCl 1N (95:5; v:v) Sắc tố thô Trích ly lỏng lỏng Đo prodigiosin sau trích ly OD = 535 nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 600 nm Đo prodigiosin OD = 499 nm
  • 54. Đồ án tốt nghiệp 44 đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R 2 = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng 1 (MT1 - môi trƣờng thu sinh khối cực đại theo ĐATN Nguyễn Thị Tâm, 2010), môi trƣờng 2 (MT2 – môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Tiến hành đo mật độ tế bào OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 4h, t = 8h, t =16h, t = 20h, t = 24h. Theo dõi mật độ tế bào tổng hợp đƣợc. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng của chủng vi sinh vật. Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 620 nm. 2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men 2.4.3.1. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL – môi trƣờng lên men theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với nồng độ glycerol là 5g/l. Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h.
  • 55. Đồ án tốt nghiệp 45 Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống 2 (MT2 – môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005) vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) tiếp liệu với nồng độ glycerol là 5 g/l. Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. 2.4.3.2. Phương pháp khảo sát thiết lập chế độ lên men Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với nồng độ glycerol là 2.5 g/l, 5 g/l. 7.5 g/l và 10 g/l theo sơ đồ sau:
  • 56. Đồ án tốt nghiệp 46 Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng PG 0h 9h 24h 33h 48h 57h Đo prodigiosin OD = 499nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm Lên men trên môi trƣờng PG Tiếp liệu Glycerol 2.5 g/l Lên men trên môi trƣờng PGTL Tiếp liệu Glycerol 10 g/l Tiếp liệu Glycerol 7.5 g/l Tiếp liệu Glycerol 5 g/l
  • 57. Đồ án tốt nghiệp 47 Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. 2.4.4. Phương pháp phân tích 2.4.4.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin Mục đích Xác định đƣợc lƣợng hợp chất prodigiosin có trong mẫu từ đó đƣa ra kết luận cho thí nghiệm. Nội dung Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá trị đo OD tại λmax của hợp chất prodigiosin. 2.4.4.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Các số liệu thô đƣợc xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu sau đó đƣợc phân tích ANOVA và đƣợc trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. Các số liệu đƣợc tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010. Các biểu đồ cũng đƣợc thể hiện bằng phần mềm này.
  • 58. Đồ án tốt nghiệp 48 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất Để đạt mục tiêu trên, các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol. Dịch nuôi cấy đƣợc đƣa đi khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào protease, chitinase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch và lipase bằng phƣơng pháp cấy điểm. Đồng thời prodigiosin đƣợc trích ly từ dịch nuôi cấy bằng Ethanol:HCl 1N (95:5, vv) và xác định nồng độ nhờ phƣơng pháp đo OD535nm và xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD535nm vào phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R 2 = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào Mục tiêu của lên men S.marcescens trong đề tài là sản xuất chế phẩm prodigi- osin thô từ đó tạo chế phẩm diệt sâu. Xoang máu và ống tiêu hóa của côn trùng đƣợc cấu thành từ các thành phần chính gồm lipid, protein và bộ xƣơng ngoài là chitin. Ngoài việc thu nguồn prodigiosin thì chủng vi sinh vật chọn lọc cần đòi hỏi phải tổng hợp các enzyne ngoại bào có khả năng thủy phân protein, lipid và chitin Thử nghiệm hoạt tính protease Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng chứa casein, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử trichloroacetic acid (TCA), đo vòng phân giải ca- sein. Phần còn lại là casein chƣa bị thủy phân sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục. Kết quả khi tiến hành trên môi trƣờng casein thì tất cả các chủng đều có khả năng phân giải casein là nhƣ nhau . Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA – casein trắng đục dễ dàng nhận thấy (hình 3.1 và bảng 3.1).
  • 59. Đồ án tốt nghiệp 49 Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB Thử nghiệm hoạt tính lipase Lipase xúc tác thủy phân các cầu nối ether của triacylglycerol để tạo ra glycerol acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi trƣờng đĩa thạch chứa tween 80 và CaCl2. Lipase sẽ thủy phân tween 80 trong môi trƣờng tạo ra các acid béo, các acid béo đƣợc giải phóng sẽ kết tủa với muối calcium trong môi trƣờng. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trƣờng xung quanh điểm cấy. HB SH4 SH5
  • 60. Đồ án tốt nghiệp 50 Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase có thấy sự hiện diện của enzyme lipase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm. Tween 80 bị enzyme lipase thủy phân tạo ra các acid béo và các acid béo này tạo phức với Ca2+ làm môi trƣờng xung quanh vết cấy trắng đục. Kết quả hình 3.2 và bảng 3.1 thì chủng SH4 và HB là các chủng có khả năng phân giải casein mạnh nhất với đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng tween là 27,3 A ± 1,70 và 24,7 AB ± 1,25, chủng SH5 có khả năng phân giải casein kém nhất với đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng casein là 27,3 A ± 1,70. Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB Thử nghiệm hoạt tính chitinase Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử lugol, đo vòng phân giải chitin. Khi chitinase có mặt trong môi trƣờng chitin nó sẽ phân giải chitin thành N- acetyl glucosamine và cấu trúc mạch ngắn hơn không băt màu với thuốc thử lugol. Khi tác dụng với thuốc thử lugol, độ lớn của phần môi trƣờng trong suốt phản ánh hoạt tính chitinase của chủng vi sinh vật. Khi bổ sung dịch vi khuẩn vào giếng thạch trên môi trƣờng thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, kết quả hình 3.2 các chủng khảo sát đều không có hoạt tính chitinase. Kết luận các chủng vi sinh vật không có khả năng tiết enzyme chitinase phân giải chitin có trong môi trƣờng. SH5 SH4 HB