Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận văn thạc sĩ với đề tài: Tuyển chọn các chủng vi sinh vật tạo chế phẩm nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản, cho các bạn làm luận văn tham khảo

1. 1
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Bùi Thị Việt Hà –
Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội, người đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong
suốt thời gian học tâp và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa
Sinh học, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã góp ý và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành Luận văn .
Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, các bạn và cá c em Phòng Hóa
sinh và Vi sinh môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện
Luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã tạo
mọi điều kiện về vật chất và tinh thần giúp đỡ tôi hoà n thà nh tốt Luận văn nà y.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 12 năm 2011
Học viên
Nguyễn Thị Quỳnh Trang

2. 2
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................................9
Chƣơng 1: TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU ..........................................................................11
1.1. Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới :.........................................................111
1.3. Những khó khăn thách thứ c nghề ............................................................................12
1.4. Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên quá trình nuôi trồng thủy sản :14
1.4.1. Nhiê ̣t đô ̣....................................................................................................................15
1.4.2. Độ pH .......................................................................................................................15
1.4.3. Độ mặn .....................................................................................................................16
1.4.4. Oxy hòa tan (DO) ...................................................................................................16
1.4.5. COD, BOD ..............................................................................................................17
1.4.6. Mâ ̣t đô ̣vi tảo Vibrio spp. và vi khuẩn tổng số ....................................................17
1.4.7. Nitơ tổng số .............................................................................................................18
1.4.8. Photphat (PO4
3-
) .....................................................................................................20
1.4.9. Sulphuahydro ..........................................................................................................20
1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học trong xử lý môi trường
nước nuôi trồng thủy sản ..................................................................................................21
1.5.1. Vai trò của các vi sinh vật trong quá trình làm sạch nước nuôi tôm, cá..........21
1.5.2. Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó trong
việc cải tạo nước đầm nuôi trồng thủy sản .....................................................................24
1.5.3. Ưu điểm và nhược điểm của biê ̣n phấp sử dụng vi sinh vâ ̣t trong xử lý nước
nuôi trồng thủy sản …………………………………………………….………….. 31
Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 322
2.1. Đối tượng ....................................................................................................................32
2.1.1 Chủng giống .............................................................................................................32
2.1.2. Hóa chất – thiết bi ̣...................................................................................................32
2.1.3. Môi trường ...............................................................................................................32
2.2. Phương pháp nghiên c ứu .........................................................................................35
2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn............................................................................35

3. 3
2.2.2. Phương pháp bảo quản giống................................................................................35
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng khuẩn..................35
2.2.4. Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học...........................36
2.2.5. Phương pháp định lượng axit lactic......................................................................36
2.2.6. Phương pháp nghiên cứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ của tế
bào .......................................................................................................................................36
2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
trưởng của vi sinh vật........................................................................................................38
2.2.8. Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của chủng lựa chọn............39
2.3. Phương pháp ta ̣o chế phẩm .......................................................................................43
2.3.1. Nghiên cứ u các điều kiê ̣n thích hợp cho lên men xốp .......................................43
2.3.2. Trô ̣n hỗn hợp giống ................................................................................................41
2.3.3. Bảo quản chế phẩm :...............................................................................................41
2.3.4. Thử nghiê ̣m chế phẩm trong xử lý nước nuôi trồng thủy sản ...........................41
2.4. Phân loại vi sinh vật...................................................................................................42
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢ O LUẬN ......................................................................45
3.1. Tuyển cho ̣n các chủng vi sinh vâ ̣t ............................................................................45
3.1.1. Bacillus.....................................................................................................................45
3.1.1.1. Phân lâ ̣p và tuyển cho ̣n .......................................................................................45
3.1.1.2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng và
hoạt tính enzym của chủng vi Bacillus TL1...................................................................46
3.1.1.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng nghiên cứu............................................51
3.1.2. Vi khuẩn Lactic .......................................................................................................53
3.1.2.1. Phân lập và tuyển chọn.......................................................................................53
3.1.2.2. Phân loại ...............................................................................................................53
3.1.2.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp
chất kháng khuẩn của L. plantarum L5 ..........................................................................56
3.1.3. Vi khuẩn nitrat hóa ................................................................................................60
3.1.3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa .....................................................60
3.1.3.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn nitrat hóa lựa chọn......62

4. 4
3.2. Tạo chế phẩm .............................................................................................................63
3.2.1. Thử tính đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn ........................................63
3.2.2. Nghiên cứ u các điều kiê ̣n lên men xốp thích hợp ...............................................64
3.2.2.1. Lựa cho ̣n môi trường lên men xốp thích hợp ...................................................64
3.2.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên quá trình lên men xốp ..............................66
3.2.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình lên men xốp .......................................67
3.2.2.4. Ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau ............................................................68
3.2.2.5. Ảnh hưởng của độ ẩm .........................................................................................69
3.2.3. Sản xuất chế phẩm ..................................................................................................70
3.2.4. Đánh giá khả năng làm sa ̣ch nước đầm nuôi thủy sản của chế phẩm vừ a ta ̣o
được.....................................................................................................................................72
3.2.4.1. Giá trị pH ..............................................................................................................72
3.2.4.2. Nitơ tổng số ..........................................................................................................73
3.2.4.3. Amôni ...................................................................................................................74
3.2.4.4. Nitrit ......................................................................................................................75
3.2.4.5. COD và BOD .......................................................................................................76
KẾT LUẬN ........................................................................................................................79
KIẾN NGHI ̣ .......................................................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................80
PHỤ LỤC ...........................................................................................................................87

5. 5
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHƢ̃ VIẾ T TẮ T
BOD Biochemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy sinh hóa
CMC Cacboxymetyl Cenlluloze Cacboxymetyl xenlulozo
COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa hóa ho ̣c
DO Dessolved Oxygen Oxy hòa tan
OD Optical Density Mật đô ̣quang ho ̣c
QCVN Quy chuẩn Viê ̣t Nam
WHO World Heath Organization Tổ chƣ́ c Ytế thế giớ i

6. 6
DANH MỤC CÁ C BẢ NG
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của tôm , cá .........................................15
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chất lượng nước nuôi trồng thủy sản .........................................21
Bảng 3.1: Hoạt tính enzym của 5 chủng lựa chọn.........................................................45
Bảng 3.2: Hoạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 4 loại môi trường ..........46
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của
chủng TL1 ..........................................................................................................................47
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp .....48
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp
enzym của chủng TL1.......................................................................................................49
Bảng3.6:ẢnhhưởngcủanguồnnitơđếnsinhtrưởngvàhoạttínhenzymcủachủngTL1...............50
Bảng 3.7: Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng nghiên cứu......................51
Bảng 3.8: Hoạt tính ức chế các vi sinh vật kiểm định của chủng L5 ..........................53
Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng L5 ...................................53
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất kháng
khuẩn của L. plantarum L5 ..............................................................................................57
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng tổng
hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5...................................................................58
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất
kháng khuẩn của L. plantarum L5...................................................................................59
Bảng 3.13: Đặc điểm hình thái của các chủng oxy hóa amôni phân lập được ..........60
Bảng 3.14: Đặc điểm hình thái của 10 chủng oxy hóa nitrit phân lập được ..............61
Bảng 3.15: Hàm lượng nitrit tạo thành và sự sinh trưởng của 13 chủng oxy hóa
amôni phân lập được .........................................................................................................61
Bảng 3.16: Hàm lượng nitrat tạo thành và sự sinh trưởng của 10 chủng oxy hóa
nitrit.....................................................................................................................................62
Bảng 3.17: Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng NA7 và NT2 .................62
Bảng 3.18: Thử tính đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn ...............................64
Bảng 3.19: Ảnh hưởng của môi trường lên men xốp lên Bacillus..............................65
Bảng 3.20 : Ảnh hưởng của môi trường lên me n xốp lên L. plantarum L5: .............65

7. 7
Bảng 3.21: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên Bacillus TL1 .......................................66
Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên L. plantarum L5..................................67
Bảng 3.23: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên Bacillus TL1 .........................67
Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên L. plantarum L5....................67
Bảng 3.25: Ảnh hưở ng của nhiê ̣t đô ̣lên Bacillus TL1 .................................................68
Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên L. plantarum L5............................................69
Bảng 3.27: ảnh hưởng của độ ẩm lên Bacillus TL1 ......................................................69
Bảng 3.28: Ảnh hưởng của độ ẩm lên L. plantarum L5...............................................70
Bảng 3.29: Kết quả giá tri ̣pH sau các ngày thí nghiệm ...............................................72
Bảng 3.30: Kết quả giá tri ̣ Nitơ tổng số sau các ngày thí nghiệm...............................73
Bảng 3.31: Kết quả giá tri ̣NH 3 sau các ngày thí nghiệm.............................................74
Bảng 3.32: Kết quả giá tri ̣nitrit sau các ngày thí nghiệm ............................................75
Bảng 3.33: Kết quả giá tri ̣COD và BOD sau các ngày thí nghiệm............................76
Bảng 3.34: Kết quả xử lý nước đầm nu ôi thủy sản của chế phẩm ..............................77

8. 8
DANH MỤC CÁ C HÌNH
Hình 3.1: Hoạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 5 loại môi trường...........46
Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của
chủng TL1 ..........................................................................................................................48
Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp
enzym ngoại bào của chủng TL1.....................................................................................49
Hình 3.4: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp
enzym của chủng TL1.......................................................................................................50
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp
enzym của chủng TL1.......................................................................................................50
Hình 3.6: Trình tự nucleotit của rARN 16S của chủng L 5...........................................50
Hình 3.7: Vị trí phân loại của chủng L5 và các loài có quan hệ họ hàng gần…..56
Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp chất
kháng khuẩn của L. plantarum L5...................................................................................57
Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và sinh chất kháng
khuẩn của L. plantarum L5 ..............................................................................................58
Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất
kháng khuẩn của L. plantarum L5...................................................................................59
Hình 3.11: Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm da ̣ng rắn ..............................................71
Hình 3.12: Giá trị pH sau các ngày thí nghiệm .............................................................73
Hình 3.13: Giá trị nitơ tổng sau các ngày thí nghiệm ...................................................73
Hình 3.14: Giá trị amôni sau các ngày thí nghiệm........................................................75
Hình 3.15. Giá trị nitrit sau các ngày thí nghiệm ..........................................................76
Hình 3.16. Giá trị COD sau các ngày thí nghiệm..........................................................77
Hình 3.17: Giá trị BOD sau các ngày thí nghiệm..........................................................77

9. 9
MỞ ĐẦ U
Với đường bờ biển dài tới 3260 km cùng với rất nhiều hòn đảo lớn nhỏ ,
nhiều đầm phá , eo vi ̣nh , đă ̣c biê ̣t có tới 250.000 ha rừ ng ngâ ̣p mă ̣n và 290.000 ha
bãi triều, Viê ̣t Nam có tiềm năng lớn về diê ̣n tích nuôi trồng thủy sản nước lợ .
Những năm gần đây, cơ cấu chuyển di ̣ch kinh tế cùng với các chính sách của
khuyến khích của chính p hủ, phong trào nuôi trồng thủy sản ven biển ở nước ta
ngày càng phát triển mạnh .
Tuy nhiên, trong những năm gần đây ngành nuôi trồng đang phải đối mặt với
những khó khăn có thể dẫn đến nguy cơ thất bại ở nhiều cơ sở nuôi trồng. Nguyên
nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước đầm nuôi , dịch bệnh và hệ thống sinh
thái bị phá hủy. Các đầm nuôi trồng thủy sản , đă ̣c biê ̣t là các đầm quảng canh không
có hệ thống cấp , thoát nước và xử lí nước thải nên trong quá trình n uôi, phân sinh
vâ ̣t, thứ c ăn thừ a , xác động vật thủy sinh , xác rong, tảo, các loại hóa chất sử dụng
trong quá trình nuôi , các loại vi khuẩn gây bệnh… làm cho nước trong đầm bị ô
nhiễm. Các chất hữu cơ tích tụ lại ở đáy đầm bị phân hủy kị khí sinh ra các sản
phẩm như : NH3, H2S, NO3… làm cho tôm cá bi ̣sốc hoă ̣c gây ha ̣i cho tôm cá và các
sinh vâ ̣t khác sống trong đầm . Khi đầm nuôi bị ô nhiễm thì những nhóm vi sinh vật
có hại có cơ hội phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi
bị bệnh. Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi
trường ao nuôi và phòng bệnh. Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh
hưởng lớn đến môi trường và con người. Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh
còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong vật nuôi và vi phạm vấn đề vệ sinh
an toàn thực phẩm. Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề
này. Trước thực trạng đó, xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi
trường nước, phòng bệnh cho tôm cá và an toàn với người sử dụng là vấn đề cấp
thiết. Tại một số nước có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển với quy mô công
nghiệp như Mĩ, Nhật, Trung Quốc, Thái Lan,…các biện pháp sinh học được sử
dụng thay thế cho cách dùng hóa chất đã khẳng định được tính an toàn và hiệu quả
trong nuôi trồng.
Các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môi trường nước
nuôi trồng thủy sản đã đem lại nhiều lợi ích cho con người và môi trường sống mà
các phương pháp khác không có được như: an toàn với người và động vật, đặc hiệu
đối với vật chủ, thích hợp với các phương pháp phòng trừ khác, thời gian bán hủy

10. 10
ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường sống, có khả năng tự nhân
lên và ức chế các vi sinh vật gây bệnh cho tôm cá.
Với mong muốn tìm ra những chủng vi sinh vật có khả năng làm sạch môi
trường nước nuôi tôm, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Tuyển chọn các
chủng vi sinh vật tạo chế phẩm nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản”.
Mục đích của đề tài : tạo ra được chế phẩm có chứa một số chủng vi sinh vâ ̣t
hữu ích nhằm xử lý nước nuôi tôm và bước đầu đưa ra những kết quả thử nghiê ̣m
xử lý nước nuôi trồng thủy sản bi ̣ô nhiễm ở quy mô phòng thí nghiê ̣m .

11. 11
Chƣơng 1: TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU
1.1. Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới
Nuôi trồng thủy sản là mô ̣t ngành sản xuất đô ̣ng thực vâ ̣t thủy sinh trong
điều kiê ̣n kiểm soát hoă ̣c bán kiểm soát , hoă ̣c như người ta vẫn thường nói , nuôi
trồng thủy sản là sản xuất nông nghiê ̣p trong môi trường nướ c [8].
Trong thời gian qua, ngành thuỷ sản ngày càng phát triển và dần trở thành
ngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia và là nguồn cung cấp thực phẩm quan
trọng cho cộng đồng các dân cư trên toàn thế giới. Không những phát triển về số
lượng và giá trị, ngành thuỷ sản còn có những bước thay đổi cơ bản về cơ cấu sản
xuất. Từ một ngành thuỷ sản công nghiệp với khai thác thuỷ sản đóng vai trò chủ
đạo và những quốc gia có sản lượng lớn nhất là các nước phát triển có những đội
tàu khai thác xa bờ và một nền công nghiệp chế biến hiện đại trong những năm
trước thập kỷ 90, trong giai đoạn từ hơn mười năm trở lại đây, ngành thuỷ sản đã
phát triển theo hướng nông nghiệp, nghĩa là nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) đã tăng
nhanh tỷ lệ đóng góp của mình và các nước nông nghiệp chính là những nước có
sản lượng đứng đầu thế giới. Chỉ tính trong giai đoạn 10 năm từ 1993-2003, trong
khi sản lượng khai thác hầu như đứng yên, chỉ tăng 1,2%, thì sản lượng NTTS tăng
mỗi năm tới 9,4%. Năm 2003, tỷ lệ của NTTS trong tổng sản lượng thuỷ sản thế
giới đã tăng lên 31,7% [8].
Theo thống kê của FAO, năm 2003, tổng sản lượng thủy sản của thế giới đạt
gần 132 triệu tấn, lĩnh vực khai thác đạt 90 triệu tấn và nuôi đạt gần 42 triệu tấn.
Trong đó, lượng thuỷ sản (TS) dùng làm thực phẩm khoảng 101 triệu tấn, chiếm
hơn 76,5 % [8].
Nếu phân theo môi trường nuôi, sản lượng các loài thuỷ sản nước ngọt chiếm
tỷ lệ cao hơn (năm 2003, nuôi nước ngọt đạt 25,2 triệu tấn, chiếm 60,14% sản lượng
và 48,7% giá trị). Thuỷ sản nuôi nước mặn chiếm 36,5% sản lượng và 35,7% giá trị.
Mặc dù sản lượng nuôi nước lợ chỉ chiếm 5,8% (năm 2002), nhưng lại chiếm tới
15,9% giá trị vì phần lớn là những sản phẩm giá trị cao.
1.2. Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam
Với đường bờ biển dài hơn 3200km; Viê ̣t Nam có vùng đă ̣c quyền kinh tế
trên biển rô ̣ng hơn 1 triê ̣u km 2
. Viê ̣t Nam cũng có vùng mă ̣t nước nô ̣i đi ̣a lớn rô ̣ng
hơn 1,4 triê ̣u ha nhờ hê ̣thống sông ngòi , đầm phá dày đă ̣c . Vị trí địa lý và điều kiện

12. 12
tựnhiên thuâ ̣n lợi giúp Viê ̣t Nam có nhiều thế ma ̣nh nổi trô ̣i để phát triển ngành
thủy sản . Từ lâu Viê ̣t Nam đã trở thành quốc gia sản xuất và xuất khẩu thủy sản
hàng đầu khu vực cùng với Indon esia và Thái Lan . Xuất khẩu thủy sản trở thành
mô ̣t trong những lĩnh vực quan tro ̣ng của nền kinh tế [6].
Theo số liê ̣u thống kê , 11 tháng đầu năm 2009, kim nga ̣ch xuất khẩu thủy
sản đạt 3.928 triê ̣u đôla, bằng 93,8% so với cùng k ỳ năm ngoái ; chiếm 7,6% tổng
kim nga ̣ch xuất khẩu cả nước [6].
Viê ̣t Nam có hơn 1 triê ̣u km đường bờ biển và 1,4 triê ̣u hecta mă ̣t nước nô ̣i
đi ̣a vì vâ ̣y nguồn cung thủy hải sản rất dồi dào và ổn đi ̣nh . Trữ lượng hải sản ở Viê ̣ t
Nam ước tính có khoảng 4,2 triê ̣u tấn và nguồn tái ta ̣i là khoảng 1,73 triê ̣u tấn. Mở
rô ̣ng diê ̣n tích nuôi trồng thủy sản và cải thiê ̣n khả năng khai thác đánh cá xa bờ đã
giúp sản lượng thủy hải sản Việt Nam không ngừng tăng trong những năm qua .
Mứ c tăng trưởng trung bình từ năm 2006 - 2008 là khoảng 11%. Đến hết tháng 11
năm 2009, sản lượng thủy sả n đã đa ̣t hơn 4,4 triê ̣u tấn [6].
Trong những năm gần đây , các sản phẩm mặt hàng thủy sản của Việt Nam
ngày càng được đa dạng hóa . Các sản phẩm như tôm ,cá tra, cá ngừ , hàng khô , mực,
bạch tuộc chiếm tỉ trọng lớn nhất trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản . Trong đó ,
tôm đứ ng đầu về kim nga ̣ch xuất khẩu , chiếm 38,4 %.
1.3. Nhƣ̃ng khó khăn thách thƣ́ c nghề
Theo đánh giá của FAO , thủy sản và các sản phẩm là các sản phẩm được
phát triển nhanh nhất trong các mă ̣t hàng thực phẩm hiê ̣n nay nói chung . Lợi thế của
nuôi trồng thủy sản là có thể thực hiê ̣n được kế hoa ̣ch phát triển sản xuất thủy sản ,
gia tăng sản lượng nhằm đáp ứ ng nhu cầu của thi ̣trường tiêu thụ , không bi ̣phụ
thuô ̣c vào mùa vụkhai thác như nguồn lợi tựnhiên .
Tuy nhiên , ngoài những thuận lợi đó , nuôi trồng thủy sản ở Viê ̣t Nam cũng
đã và đang phải đối mă ̣t với nhiều khó khăn như điều kiê ̣n môi trường , khí hậu ,
nguồn nước , ô nhiễm nước thải , nguồn giống , thứ c ăn , dịch bệnh , thời tiết… Ha ̣n
chế trong nuôi trồng thủy sản ở Viê ̣t Nam là tính rủi ro còn cao do những nguyên
nhân chủ quan và khách quan . Về mă ̣t chủ quan , còn có nhiều vấn đề kĩ thuật và phi
kĩ thuật mà chúng ta chưa làm chủ được . Trong điều kiê ̣n nuôi trồng thủy sản hiê ̣n
nay, các đầm nuôi thường bị phú dưỡng . Nguyên nhân là do chúng ta đưa vào đầm
nuôi lượng thứ c ăn tổng hợp rất lớn mà chỉ có phần rất nhỏ (khoảng 17%) lượng
thứ c ăn được tôm sử dụng , còn lại là hòa tan trong nước hoặc bài tiết ra ng oài môi

13. 13
trường. Lượng thứ c ăn thừ a , phế thải hữu cơ và các phế thải khác là những yếu tố
làm cho đầm nuôi tôm nhiễm bẩn . Có thể nói các đầm nuôi trồng thủy sản hiện nay
bị thất bại là do đầm nuôi bị nhiễm bẩn . Do chưa có kinh nghiệm trong phòng
chống bê ̣nh cho tôm nên sử dụng thuốc chữa bê ̣nh không hợp lí đã làm tăng khả
năng hình thành di ̣ch bê ̣nh vùng nuôi . Khả năng theo dõi , cảnh báo môi trường đề
phòng dịch bệnh còn hạn chế cũng là nguy ên nhân gây tổn thất không nhỏ . Bên
cạnh đó , sựô nhiễm còn do tác đô ̣ng qua la ̣i giữa các ngành sản xuất khác nhau ,
chẳng ha ̣n sự ô nhiễm các vực nước tựnhiên từ nguồn phân bón , thuốc trừ sâu , chất
thải công nghiệp cũng là m ảnh hưởng đến cá c vùng nuôi trồng thủy sản [12], [18],
[21].
Trong nuôi trồng thủy sản thường phải sử dụng các loa ̣i hóa chất , kháng sinh ,
thuốc diê ̣t nấm để tri ̣bê ̣nh . Tuy nhiên , chúng phải được dùng với liều lượng thích
hợp và theo quy định hợp lí . Nếu không , viê ̣c sử dụng thuốc kháng sinh bừ a bãi sẽ
gây hiê ̣n tượng kháng thuốc và gây cho người sử dụng những rủi ro tiềm ẩn như
tăng mẫn cảm với dư lượng thuốc hoă ̣c xuất hiê ̣n hê ̣vi khuẩn đườ ng ruô ̣t kháng la ̣i
các chất kháng khuẩn . Rất nhiều nước trên thế giới đã có những thay đổi hoă ̣c thắt
chă ̣t các quy đi ̣nh của quốc gia về viê ̣c sử dụng thuốc tri ̣bê ̣nh trong nuôi trồng , đă ̣c
biê ̣t là kháng sinh , đây cũng là yêu cầu nghiêm ngă ̣t của nhiều nước trong đó có cả
các nước nhập khẩu [7], [26].
Mô ̣t khó khăn nữa đối với ngành nuôi trồng thủy sản đó là di ̣ch bê ̣nh , đă ̣c
biê ̣t là đối với tôm . Cùng với việc tăng sản lượng tôm thì bệnh tôm ngà y càng phát
triển nhiều và xuất hiê ̣n nhiều bê ̣nh la ̣mà chưa có giải pháp điều tri ̣ . Gần 30 bê ̣nh
và hội chứng bệnh của tôm nuôi với 2 nguyên nhân nhiễm trùng và không nhiễm
trùng đã được một số tài liệu gần đây nhắc đến nhưng sựhiểu biết về chúng còn rất
ít. Mô ̣t số tác nhân gây bê ̣nh quan tro ̣ng nhất cho tôm cá, cũng như các thủy hải sản
khác là vi sinh vật (vi khuẩn , vi rút , nấm và nguyên sinh đô ̣ng vâ ̣ t) hay do môi
trường, đô ̣c tố [30].
Các vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh gây ra các bê ̣nh nghiêm tro ̣ng cho thủy hải sản . Ví
dụ đối với tôm , chúng gây bệnh đốm trắng , bê ̣nh đầu vàng , bê ̣nh phát sáng… Nếu
môi trường tiếp tục xấu đi hay số lượng vi khuẩn gây bê ̣nh tăng ma ̣nh , tôm sẽ chết
nhiều trong mô ̣t thời gian ngắn hoă ̣c bê ̣nh sẽ chuyển thành da ̣ng nhiễm khuẩn mãn
tính và rất khó chữa . Những bê ̣nh này chỉ mang tính chất cơ hô ̣i khi nước bi ̣ô
nhiễm, đă ̣c biê ̣t là nước bi ̣ô nhiễm hữu cơ hoă ̣c tôm cá chi ̣ u tình tra ̣ng sốc do mô ̣t

14. 14
trong các điều kiê ̣n gây ra như sựthay đổi nhiê ̣t đô ̣ , pH, mâ ̣t đô ̣thả quá dày , sựthay
đổi về đô ̣mă ̣n của nước .
 Vi khuẩn Vibrio gây bê ̣nh cho tôm
Các vi sinh vật gây bệnh luôn tồn tại trong môi trường sinh sống của tôm
(đất, nước, không khí, thức ăn…) và tồn tại ngay trong cơ thể vật chủ. Một trong số
các vi khuẩn gây bệnh nguy hại phổ biến cho tôm là Vibrio spp. Đây là chủng vi
khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có hoạt tính oxidaza, hình que hoặc
hình dấu phẩy, kị khí không bắt buộc, không hình thành bào tử, có thể cư trú trong
nước với các độ mặn khác nhau. Nhóm vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước
nuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đầm nuôi nhưng
khi gặp điều kiện bất lợi cho tôm, chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh,
vì vậy chúng được xếp vào loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm) [49]. Vibrio spp.
rất phổ biến trong nước mặn, một số loài có khả năng gây bệnh cho tôm (V.
cholera, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus, V. urnissii…). Chúng
thường gây ra các bệnh nghiêm trọng cho tôm như bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng,
bệnh phát sáng…. Khi bị nhiễm vi khuẩn này, lúc đầu, một số nơi trên cơ thể tôm sẽ
bị tiêu hủy như phần đuôi hoặc phần lưng rồi dần dần làm bế tắc hệ thống lưu thông
của máu [38]. Tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn,
đổi màu đỏ hoặc xanh. Nếu môi trường tiếp tục xấu đi hay số lượng vi khuẩn gây
bệnh tăng mạnh, tôm sẽ chết nhiều trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển
thành dạng nhiễm khuẩn mãn tính. Những bệnh này chỉ mang tính chất cơ hội khi
nước bị ô nhiễm, đặc biệt là nước bị ô nhiễm hữu cơ hoặc tôm cá chịu tình trạng sốc
do một trong các điều kiện gây ra như sự thay đổi nhiệt độ, pH, mật độ thả quá dày,
sự thay đổi về độ mặn của nước.
Vi khuẩn Vibrio spp. trong các đầm nuôi tôm rất phong phú và có xu hướng
tăng dần theo thời gian nuôi, số lượng đạt cực đại vào cuối vụ. Kết quả nghiên cứu
của Nguyễn Trọng Nho và ctv (1996) [21] đầm tôm ở các tỉnh Nam Trung Bộ bị
bệnh có số lượng vi khuẩn Vibrio tổng số từ 110-1500 tế bào/ml. Theo Phan Lương
Tâm và ctv (1998) [29], Nguyễn Việt Thắng (1998) [33] khảo sát các nguyên nhân
gây chết tôm ở các tỉnh phía Nam cho rằng trong các đầm nuôi tôm bị chết, số
lượng vi khuẩn Vibrio spp. tổng số cũng rất cao. Sự xuất hiện, phân bố của các
chủng Vibrio là theo mùa và phụ thuộc vào chế độ dinh dưỡng của nước. Hiện
tượng bùng nổ Vibrio xảy ra trong các trường hợp nước bị phú dưỡng. Việc định

15. 15
lượng vi khuẩn Vibrio spp. rất quan trọng để chủ động kiểm tra chất lượng nước,
xác định khả năng bệnh lí có thể xảy ra trong đầm nuôi tôm.
1.4. Ảnh hƣởng của một số điều kiện môi trƣờng lên quá trình nuôi trồng thủy sản
Dạng thức ăn sử dụng nuôi tôm ảnh hưởng rấ t lớn đến môi trường đầm nuôi .
Trong thời gian đầu , đa số các loài nuôi đều cho năng suất cao nhưng chỉ sau mô ̣t
thời gian sử dụng thứ c ăn , đă ̣c biê ̣t là thứ c ăn tu ơi thì chất lượng nước suy giảm mô ̣t
cách nhanh chóng . Khi hàm lượ ng các chất hữu cơ và các chất chứ a ni tơ tăng lên
thì hàm lượng oxy hòa tan giảm . Sựnh iễm bẩn môi trường nước nuô i trồng thủy
sản được bắt đầu bằng sự tích tụ các sản phẩm thức ăn dư thừa và các chất thải của
tôm cá. Khi đó , quá trình sinh trưởng và phát triển của các loài thủy sản bị đình trệ ,
mô ̣t trong số trường hợp có thể dẫn đến hiê ̣n tượng tôm cá bi ̣chết hàng loa ̣t , gây
thiê ̣t ha ̣i lớn cho sản xuất .
1.4.1. Nhiê ̣t độ
Nhiê ̣t đô ̣là điều kiê ̣n xác đi ̣nh đă ̣c điểm các quá trình sinh ho ̣c , lí học, hóa
học… diễn ra trong nước . Tôm cá là các đô ̣ng vâ ̣t biến nhiê ̣t . Nhiê ̣t đô ̣là yếu tố sinh
thái quan trọng ảnh hưởng tới nhiều phương diện trong đời sống của tô m cá như : hô
hấp, tiêu thụthứ c ăn , đồng hóa thứ c ăn , tăng cường miễn di ̣ch đối với bê ̣nh tâ ̣t , sự
tăng trưởng… nhiê ̣t đô ̣thay đổi theo mùa nên ở miền Nam Viê ̣t Nam có thể nuôi
tôm cá quanh năm trong khi ở miền Bắc chỉ khai thác đ ược chủ yếu vào mùa có
nhiê ̣t đô ̣ấm áp. Ở Việt Nam , nhiê ̣t đô ̣thích hợp cho tôm cá là 28-36o
C [27].
1.4.2. Độ pH
Độ pH đặc trưng cho hoạt tính phản ứng của môi trường , giá trị pH được tính
bằng: pH = ln [H+
].
Độ pH của môi t rường đầm nuôi ảnh hưởng khá lớn đến sựsinh trưởng của
tôm cá . pH thấp có thể làm tổn thương p hần phụ, mang, quá trình lột xác và độ
cứ ng của vỏ tôm. Độ pH thấp làm tăng tính độc của khí H 2S, gây ngô ̣đô ̣c cho tôm
cá, khi pH cao la ̣i làm tăng đô ̣c tính của NH 3. Độ pH trong khoảng 7,2 – 8,8 được
coi là thích hợp [37].
Bảng 1.1. Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng của tôm , cá
(Lƣơng Đƣ́ c Phẩm , 2002) [24]
Đặc điểm môi trƣờng pH Giớ i hạn thích nghi của tôm, cá

16. 16
axit mạnh 4 điểm chết đối với tôm, cá
axit yếu 5-6 tôm cá không sinh sản hoă ̣c khó sinh sản
trung tính 7-8 môi trường thích hợp cho tôm cá
kiềm yếu 9 giới ha ̣n cuối cùng cho tôm cá
kiềm 10 tôm cá không lớn
kiềm mạnh > 10 điểm chết đối với tôm cá
1.4.3. Độ mặn
Độ mặn được tính dựa trên tổng nồng độ các ion hòa tan trong nước , có quan
hê ̣mâ ̣t thiết với đời sống của thủy sinh vâ ̣t . Nhu cầu về đô ̣mă ̣n thay đổi tùy theo
từ ng loa ̣i tôm cá và thời điểm trong chu trình sống của mỗi loại . Đối với tôm sú , đô ̣
mă ̣n thích hợp là 15-35‰ NaCl, đô ̣mă ̣n tối ưu là 29 -30‰ NaCl. Tôm sú sinh
trưởng châ ̣m và năng suất thấp khi nuôi ở đô ̣mă ̣n cao hơn 35‰ [21].
1.4.4. Oxy hòa tan (DO)
Oxy hòa tan trong nước có ý nghĩa rất lớn t rong viê ̣c đánh giá tra ̣ng thái của
nước và đô ̣giảm của nó cho thấy sựthay đổi ma ̣nh mẽ của các quá trình sinh ho ̣c ,
quá trình tự làm sạch , sựnhiễm bẩn của nguồn nước . Nồng đô ̣ oxy hòa tan phụ
thuô ̣c vào mô ̣t loa ̣t các yếu tố tựnhiên như : áp suất , nhiê ̣t đô ̣nước , nồng đô ̣các
muối hòa tan trong nước . Khi nuôi tôm , cá, giữa mâ ̣t đô ̣tôm , cá với hàm lượng oxy
hòa tan có mối quan hệ qua lại với nhau. Oxy được tôm, cá sử dụng vào quá trình
hô hấp, đồng thời oxy được tiêu thụlàm phân hủy mô ̣t lượng chất thải và thứ c ăn dư
thừ a của tôm , cá. Do đó , oxy là yếu tố quan trọng trong nước nuôi , hỗ trợcho tôm ,
cá phát tri ển. Nước nuôi đủ tiêu chuẩn để nuôi tôm cá có nồng đô ̣ oxy hòa tan là : 5-
8mg/l . Trong đầm nuôi , lượng oxy hòa tan thấp sẽ làm tôm chậm lớn , có thể chết
hàng loạt . Mứ c gây ha ̣i tùy thuô ̣c vào lượng oxy hòa tan có trong đầm và giời gian
tôm, cá phải chịu đựng . Chanratchakool P. (1995) [44] cho rằng hàm lượng oxy hòa
tan trong nước < 4mg/l làm cho tôm , cá sử dụng thức ăn kém , dễ nhiễm bê ̣nh . Chiu
Liao P. (1992) [45] nhâ ̣n thấy rằng lượng oxy hòa tan nhỏ hơ n 3,5 mg/l sẽ gây chết
tôm, cá. Lượng oxy hòa tan còn liên quan đến độ mặn và nhiệt độ nước của đầm
nuôi. Khi nhiê ̣t đô ̣ , đô ̣mă ̣n tăng thì khả năng hòa tan oxy trong nước giảm
(Gaudiosa, 1975) [50].

17. 17
1.4.5. COD, BOD
COD là nhu cầu oxy hóa học cần thiết cho quá trình oxy hóa toàn bộ c ác chất
hữu cơ trong nước thành CO 2 và H 2O. BOD là nhu cầu oxy sinh ho ̣c cần thiết cho vi
sinh vâ ̣t tiêu thụđể oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước .
Trong môi trường đầm nuôi tôm cá, hai chỉ tiêu nghiên cứ u chất lượng nước
COD và BOD được dùng để đánh giá mứ c đô ̣nhiễm bẩn , phú dưỡng hóa đồng thời
còn cho biết sự phát triển c ủa sinh vật trong thủy vực [15]. COD phản ảnh lượng
tiêu hao oxy do quá trình biến đổi các chất hữu cơ (biến đổi hóa học), do đó giá trị
COD phản ánh mứ c đô ̣gia tăng chất hữu cơ có trong đầm như thứ c ăn thừ a , sản
phẩm bài tiết của tôm và xác sinh vâ ̣t chết . Sựbiến đổi COD trong đầm nuôi tôm
tăng dần từ đầu vụtới cuối vụ , thường đầu vụhàm lượng COD thấp từ 0,5 –
1,2mg/l, cuối vụnuôi có thể lên tới 10 - 12 mg/l [23]. Trong đầm nuôi , COD thường
biến đổi từ 1,9 - 6,5 mg/l tuy giá tri ̣ở mứ c trung bình cao nhưng phù hợp cho tôm
cá phát triển [23]. BOD phản ánh lượng các chất hữu cơ dễ bi ̣phân hủy sinh ho ̣c có
trong nước . Giá trị BOD càng lớn nghĩa là mức độ ô nhiễm hữu cơ càng cao . Tiêu
chuẩn nước thủy sản của FAO quy đi ̣nh giá tỉnh BOD < 10 mg/l, giới ha ̣n thích hợp
của BOD từ 4 -8 mg/l [23].
Trong đầm nuôi trồng thủy sản , các thông số BOD , COD càng giảm càng tốt
vì điều đó chứng tỏ rằng trong đầm không phải tiêu thụ một lượng lớn oxy hòa tan
(DO) trong nước để oxy hóa các chất cặn bã ở đáy đầm . Khi COD , BOD giảm thì
DO trong nước tăng lên , làm cho nước đầm nuôi trồng thủy sản trong lành và sạch
sẽ hơn. Cả hai thông số BOD và COD đều xác định lượng chất hữu cơ có khả năng
bị oxy hóa có trong nước nhưng chúng khác nhau về ý nghĩa . BOD chỉ để thể hiê ̣n
lượng chất hữu cơ dễ bi ̣phân hủy sinh ho ̣c nghĩa là các chất hữu cơ bi ̣ oxy hóa nhờ
vi sinh vâ ̣t . COD thể hiê ̣n toàn bô ̣các chất hữu co có thể bị oxy hóa bằng các tác
nhân hóa ho ̣c . Do vâ ̣y , tỉ số BOD / COD luôn nhỏ hơn 1, chỉ số này cao chứng tỏ
môi trường đầm nuôi bi ̣ô nhiễm bởi các chất hữu cơ sinh ho ̣c dễ tan , dễ phân hủy
(thứ c ăn thừ a , chất thải của tôm , cá, xác thủy sinh vâ ̣t ch ết) [37].
1.4.6. Mật độ vi tảo, Vibrio spp. và vi khuẩn tổng số
Vi khuẩn lam và các loài vi tảo là nhóm sinh vâ ̣t đơn giản nhất có khả năng
quang hợp . Chúng sử dụng cacbonic hoặc cacbonat là nguồn cabon và sử dụng các
muối photpho và nitơ vô cơ để phát triển theo sơ đồ [37]:
CO2 + PO4 +nNH3 phát triển tế bào m ới +n O2
Năng lượng ánh sáng

18. 18
Các kết quả phân tích các mẫu thực vật nổi vùng nước cửa sông ven biển đã
xác định được 72 loài thuộc các ngành Tảo silic , vi khuẩn lam , tảo lục và tảo mắt .
Số lượng các loài kể trên còn thấp hơn nhiều so với số thực có trong mặt nước tự
nhiên. Trong số thành phần loài đã xác đi ̣nh được , tảo silic có 62 loài, chiếm ưu thế
về số lượng loài (86,1% tổng số loài ). Hầu hết các loài trong ngành tảo silic là
những loài nhiê ̣t đới trong nhóm sinh thái xa bờ , thích nghi với độ muối rộng . Ở
những thủy vực có đô ̣muối cao, tảo silic chiếm ưu thế gần như tuyệt đối . Tảo silic
là thức ăn quan trọng cho động vật phù du (zooplankton) và tôm. Ở vùng nước nằm
sâu trong sông có đô ̣mă ̣n thấp hoă ̣c ngo ̣t hoàn toàn thì ngành tảo lam chiếm ưu thế
[11]. Mâ ̣t đô ̣tảo là cơ sở cho chuỗi thứ c ăn ở nước . Giữa năng suất tôm và mâ ̣t đô ̣
tạo có sự liên hệ vô cùng quan trọng . Mă ̣t nước có mâ ̣t đô ̣tảo thấp là mă ̣t nước chết
về phương diê ̣n sản xuất . Tuy nhiên , đầm nuôi có mâ ̣t đô ̣tả o quá lớn cũng gây
nhiều bất lượng cho năng suất và môi trường [37], [38]. Mâ ̣t đô ̣tảo cũng là chỉ thị ô
nhiễm nước do phú dưỡng hóa trong đầm nuôi thủy sản .
Vi khuẩn Vibrio spp. trong các đầm nuôi rất phong phú , có xu hướng t ăng
dần theo thời gian nuôi , đa ̣t giá tri ̣cực đa ̣i vào cuối mùa vụ . Kết quả nghiên cứ u của
Nguyễn Tro ̣ng Nho và ctv (1996) [23] ở các tỉnh Nam Trung Bộ , đầm nuôi bi ̣bê ̣nh
có số lượng vi khuẩn Vibrio spp. tổng số từ 110 – 1500 tế bào/ml. Viê ̣c đi ̣nh lượng
vi khuẩn Vibrio sp. rất quan trọng để chủ động kiểm tra chất lượng nước cũng như
xác định khả năng bệnh lí có thể xảy ra trong đầm nuôi tôm .
Lượng vi khuẩn tổng số là chỉ tiêu xác đi ̣nh điều kiê ̣n v ệ sinh cũng như mức
đô ̣nhiễm bẩn do các hợp chất hữu cơ, chất thải của tôm cá, thứ c ăn thừ a , xác thủy
sinh vâ ̣t chết đồng thời dựbáo tình hình di ̣ch bê ̣nh trong đầm nuôi và nguồn nước
cung cấp cho đầm nuôi . Lượng vi khuẩn tổng số có chiều hướng tăng dần theo thời
gian nuôi , đă ̣c biê ̣t vào thời gian có lượng mưa lớn , nguồn nước bi ̣ô nhiễm từ các
con sông đổ ra. Lượng vi khuẩn tổng số ở nguồn nước cung cấp cho đầm nuôi tôm
cao hơn nhiều so với tr ong đầm nuôi . Môi trường nước có mâ ̣t đô ̣vi khuẩn cao hơn
107 tế bào/ ml có dấu hiê ̣u bi ̣ô nhiễm nhe ̣ , dịch bệnh có thể phát sinh [2].
1.4.7. Nitơ tổng số
Trong nước , ammon thường tồn ta ̣i ở da ̣ng NH 3 và NH 4
+
. Ammon là sản
phẩm khoáng hóa đầu tiên của các chất hữu cơ , có thể được thực vật phù du hấp thụ
trong quá trình quang hợp hoă ̣c bi ̣ oxy hóa tạo thành muối nitrit và nitrat dưới tác
dụng của vi sinh vật , quá trình này được gọi là quá trình n itrat hóa . Amôni ở dạng

19. 19
NH4
+
không gây đô ̣c cho các loài thủy sinh vâ ̣t trừ khi hàm lượng quá cao . NH3 là
chất gây đô ̣c cho các l oài thủy sinh vật , tuy nhiên NH3 chịu ảnh hưởng của pH ,
nhiê ̣t đô ̣và đô ̣mă ̣n . Khả năng gây độc của N H3 đối với tôm sú cũng có sựkhác
nhau theo nhiê ̣t đô ̣và đô ̣mă ̣n của đầm nuôi . Trong đầm nuôi tôm sú , nếu ở nhiê ̣t đô ̣
thấp và đô ̣mă ̣n cao thì khả năng chi ̣u đựng của tôm sú với NH 3 kém hơn và ngược
lại, khi ở nhiê ̣t đô ̣cao và độ mặn thấp thì khả năng chịu đựng đối với NH 3 tốt hơn.
Nitrit (NO2
-
) rất cần thiết cho hoa ̣t đô ̣ng của thực vâ ̣t phù du NO2
-
thường
tồn ta ̣i ở da ̣ng trung gian và hàm lượng trong nước rất thấp . Ngoài ra , NO2
-
còn là
chỉ tiêu vê ̣si nh, yếu tố chỉ thi ̣của quá trình tựlàm sa ̣ch nước trong tựnhiên [1].
Dạng nitrit thường vô hại nhưng trong môi trường nước mà hàm lượng chlorinity
(chlorinity là khối lượng của clo tính bằng gram chứ a trong 1 kg nước biển sau khi
bromua và iod được thay thế bằng cloride . Chlorinity được xác đi ̣nh bằng phương
pháp chuẩn độ , đây là mô ̣t trong những phương pháp xác đi ̣nh nồng đô ̣muối của
nước biển) thấp thì nitrit sẽ gây đô ̣c cho tôm cá . Nitrit gây đô ̣c cho tôm , cá là vì
chúng tạo thành chất methemoglobin làm giảm quá trình vận chuyển oxy tới tế bào.
Nitrit cũng có thể kết hợp với hợp chất mang gốc CN -
và giải phóng gốc này ra khỏi
phứ c chất xianua gây đô ̣c ma ̣nh ch o đầm nuôi .
Nitrat (NO3
-
) là sản phẩm của sự khoáng hóa các chất hữu cơ chứ a nitơ, cần
thiết cho sự p hát triển của thực vật phù du. Tuy nhiên , nếu hàm lượng nitrat trong
đầm tôm cá vượt quá 7 mg/l thì môi trường bi ̣phú dưỡ ng và bi ̣nhiễm bẩn [2].
Trong môi trường nước , mối quan hê ̣giữa NH 4
+
, NH3, NO2
-
, NO3
-
, có tính
liên tục và liên quan chă ̣t chẽ với nhau .
NH3 + 1,5 O2 NO2
-
+ H2O + H+
NO2 + 0,5 O2 NO3
-
Trong quá trình oxy hóa ammon thành NO 2
-
, NO3
-
, mứ c đô ̣tiêu tốn lượng
oxy trong nước khá lớn , để oxy hóa 1 mg amôni ở giai đoạn tạo NO 2
-
cần đến 3,43
mg O2, còn ở giai đoạn tạo NO 3
-
là 4,5 mg O2. Quá trình nitrat hóa quan trọng trong
nông nghiê ̣p vì nó chuyển hóa muối amô ni thành nitrat là nguồn thứ c ăn tốt cho cây
trồng. Trong nuôi trồng thủy sản , amôni, nitrit, nitrat đều là chất đô ̣c . Do đó , quá
trình nitrat hó a giải đô ̣c cho môi trường nuôi trồng thủy sản .
Nitrosomonas bacteria
Nitrobacter bacteria

20. 20
1.4.8. Photphat (PO4
3-
)
Photphat là chất dinh dưỡng cần thiết cho sựphát triển của rong , tảo, trong
nước, photphat tồn ta ̣i ở 3 dạng là : orthophotphat (PO4
3-
), orthophotphat monohydro
(HPO4
2-
) và orthophotphat dihydro (H2PO4
3-
). Trong phân tích mẫu nước thường chỉ
xác định PO 4
3-
[14]. Hàm lượng PO4
3-
thường thấp , ít khi vượt quá 1 mg/l, đa phần
hàm lượng PO4
3-
được bùn đáy hấp thu và trở lại môi trường . Trong cá c đầm nuôi
có chất đáy phèn chua nhiều ion nhỏ và sắt thì lượng PO4
3-
bị kết tủa nhiều . Vì vậy ,
các đầm nuôi có đáy chua phèn cần được bón nhiều phân lân. Hàm lượng PO4
3-
thích
hợp cho đầm nuôi là0,5 mg/l [38].
Trong nước , tảo sử dụng CO 2, nitơ vô cơ , orthophotphat và các chất dinh
dưỡng khác để phát tri ển. Tuy nhiên , khi nồng đô ̣ amônia và photphat cao , rong tảo
phát triển mạnh tạo sinh khối tới mức động vật phù du và tôm cá trong đầm không
thể tiêu thụhết sẽ dẫn đến tình tra ̣ng bùng nổ các loa ̣i rong , tảo. Tình trạng này kéo
dài sẽ làm cho đầm , hồ bi ̣phú dưỡng hóa , nước đục và có că ̣n lắng , có mùi khó chịu
do tảo bi ̣phân hủy , gây giảm oxy trong nước . Trong điều kiê ̣n đó thì tôm, cá sẽ sinh
trưởng châ ̣m và dễ mắc bê ̣nh [37].
1.4.9. Sulphuahydro
Sulphuahydro trong thủy vực được hình thành do hoa ̣t đô ̣ng phân hủy chất
hữu cơ của vi khuẩn trong điều kiê ̣n yếm khí và vi khuẩn lưu huỳnh kh ử sulphat
trong nước nơi có nhiều sulphat [31]. Trong môi trường nước các đầm nuôi trồng
thủy sản, sulphuahydro thường tồn ta ̣i ở mô ̣t số da ̣ng như : H2S, HS-
, S2-
. Tuy nhiên ,
trong các da ̣ng trên chỉ có da ̣ng H 2S là gây đô ̣c cho các thủ y sinh vâ ̣t , mứ c đô ̣gây
đô ̣c có liên quan đến nhiê ̣t đô ̣và pH của đầm nuôi . pH và nhiê ̣t đô ̣thấp (nhiê ̣t đô ̣
200
C và pH = 5) tồn ta ̣i tới 99% là H 2S gây đô ̣c [48]. Các giai đoạn biến đổi tạo ra
H2S như sau:
SO4
2-
+ 8H+
 S2-
+ 4 H2O
S2-
+ H+
 HS-
HS-
+ H+
 H2S
Phương trình tổng quá của quá trình khử sunphat :
SO4
2-
+ 2(CH2O) + 2 H+
 H2S + 2 CO2 + 2 H2O
Vì vậy , môi trường axit cung cấp nhiều ion H +
phản ứng phân hủy chất hữu
cơ trong nước luôn t ạo ra H 2S gây đô ̣c cho tôm cá và các thủy sinh vâ ̣t khác . Theo

21. 21
Nguyễn Tro ̣ng Nho (1994) [21], trong đầm nuôi tôm cá , hàm lượng H 2S không
được quá 0,1 mg/l.
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chất lƣợng nƣớ c nuôi trồng thủy sản
(Khoa thủy sản , trường đa ̣i ho ̣c Cần Thơ , 2000) [16]
chỉ tiêu giớ i hạn
nhiê ̣t đô ̣nước (0C) 23-30
màu nước xanh nõn chuối
đô ̣pH 6,5 – 8,5
O2 (mg/l) 5-8
CO2 3-10
NH4+
1,0
PO4
3-
0,5
Fe tổng số <0,3
COD (mg O2/ l) 10 – 20
H2S 0,0
Độ mặn (%0) 18 - 30
1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học trong xử lý môi
trƣờng nƣớ c nuôi trồng thủ y sản .
1.5.1. Vai trò của các vi sinh vật trong quá trình làm sạch nước nuôi tôm, cá
Đầm nuôi tôm, cá là những hệ sinh thái nước không đặc trưng do chịu nhiều
tác động của con người. Tuy vậy, cũng giống như khu hệ sinh thái nước tự nhiên
khác, hệ sinh thái đầm nuôi tôm, cá được cấu thành bởi nước, khoáng chất, các hợp
chất hữu cơ hòa tan và hệ thủy sinh vật. Vi sinh vật là một thành phần quan trọng
của hệ thủy vi sinh vật ở đây bởi chúng không những đóng vai trò chủ đạo trong các
chu trình chuyển hóa các nguyên tố cơ bản cấu tạo nên hợp chất hữu cơ mà tác
động trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản của người nuôi trồng [13], [35].
Vi sinh vật hữu ích trong nước nuôi tôm bao gồm các nhóm có khả năng phân giải

22. 22
và tái vô cơ hóa các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa các hợp chất vô cơ, đồng thời bản
thân chúng cũng không gây hại với tôm (không sinh ra sản phẩm độc hại, không
gây bệnh). Hoạt động sống của chúng sẽ giúp ích cho việc cải thiện chất lượng môi
trường nước, ổn định pH, tạo điều kiện môi trường không thuận lợi đối với các vi
sinh vật gây hại, cạnh tranh và ức chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật gây bệnh ở
tôm cá, qua đó giúp tôm, cá tăng trưởng nhanh, khỏe mạnh và môi trường sinh thái
trong đầm được cân bằng [28].
Trong môi trường nước nuôi tôm, cá luôn tồn tại các hợp chất hữu cơ từ
nhiều nguồn khác nhau như: lượng thức ăn dư thừa, phân tôm cá, chất tiết ra từ mọi
quá trình trao đổi chất của thủy sinh vật, xác động vật, thực vật phù du…[4]. Do đó,
nếu nồng độ của chúng trong nước quá cao sẽ gây ô nhiễm nguồn nước và dẫn tới
các hội chứng sốc ở tôm, cá. Hoạt động tích cực của các vi sinh vật phân giải các
hợp chất hữu cơ sẽ giúp giải phóng những tồn tại hữu cơ gây ô nhiễm nguồn nước,
đồng thời bổ sung trực tiếp hoặc gián tiếp vào nguồn dinh dưỡng cần thiết cho động
vật nuôi trồng [43]. Cơ chế các hoạt động phân giải chất hữu cơ ở vi sinh vật hữu
ích chính là cơ chế của các quá trình trao đổi chất và trao đổi năng lượng trong cơ
thể chúng. Nấm, động vật nguyên sinh và đa số vi khuẩn là vi sinh vật dị dưỡng nên
chúng cần chất hữu cơ từ bên ngoài môi trường để làm thức ăn. Chúng sử dụng
những chất này để thu nhận các tiền chất cho việc xây dựng nên tế bào của mình và
thu nhận năng lượng cho các quá trình sống. Khi đó vật chất hữu cơ được vi sinh
vật biến đổi thành các chất nghèo năng lượng và cuối cùng trong những điều kiện
phù hợp thì chuyển hóa ngược lại thành những chất vô cơ ban đầu. Trong môi
trường nước nuôi tôm, cá các loại chất hữu cơ thường chiếm tỷ lệ lớn là: protein,
cacbonhidrat, kitin,… Sự phân hủy protein trước hết là nhờ nhiều loại vi khuẩn như
Pseudomonas, Clostridium, Bacillus và họ vi khuẩn Enterobacteriaceae [34]. Đại
diện cho nhóm vi sinh vật hữu ích chuyển hóa các hợp chất cacbonhidrat bao gồm
các chi Bacillus, Lactobacillus, Streptococus, Cellulomonas, Aerobacter… Các
nghiên cứu cụ thể hơn còn cho thấy bên cạnh khả năng phân giải chất hữu cơ, nhóm
vi khuẩn này còn có khả năng cạnh tranh sinh học, ức chế sự phát triển của các vi
khuẩn gây bệnh ở tôm là Vibrio và Aeromonas [35], [39], [61].
Môi trường nước nuôi tôm, cá vốn là một môi trường giàu dinh dưỡng, thức
ăn giàu đạm luôn được con người cung cấp dư thừa, ngoài ra còn từ phân tôm, cá và
xác động vật thủy sinh. Mặt khác, một số hợp chất nitơ vô cơ như NH3 là một khí

23. 23
độc với tôm và NO3
-
là tác nhân gây ung thư đối với nhiều động vật. Do đó, vai trò
phân giải hợp chất nitơ hữu cơ của nhóm vi khuẩn amôn hóa, nhóm vi khuẩn nitrat
hóa và nhóm vi khuẩn phản nitrat hóa đặc biệt được quan tâm. Tuy nhiên, chỉ một
số ít vi sinh vật (vi khuẩn sống tự do trong đất và nước, vi khuẩn sống cộng sinh với
thực vật, vi khuẩn quang hợp,…) có khả năng cố định nitơ phân tử thành dạng nitơ
hợp chất mà các vi sinh vật khác có thể sử dụng được. Dạng amôniac (NH3) và
nitrat (NO3
-
) được tảo và nhiều vi sinh vật hấp thụ tạo nên nguồn nitơ hữu cơ, sau
đó có thể chúng lại trở thành nguồn thức ăn cho động vật thủy sinh.
- Nhóm vi khuẩn amôn hóa: Nhóm này phân giải protein và các hợp chất
hữu cơ chứa nitơ tạo thành amôniac, hoạt động của nhóm vi khuẩn amôn hóa giúp
loại bỏ các hợp chất hữu cơ gây ô nhiếm nguồn nước nuôi tôm, cá góp phần tạo nên
một môi trường trong sạch cho tôm cá phát triển.
- Nhóm vi khuẩn nitrat hóa: vi khuẩn amôn hóa là vi khuẩn hữu ích, song
sản phẩm mà chúng sinh ra là NH3, nếu trong nước nồng độ NH4
+
quá cao vượt
mức cho phép sẽ gây hại cho động vật nuôi trồng [1]. Nhóm vi khuẩn nitrat hóa đó
là các chi Nitrosomonas, Nitrococus, Nitrobacter, Nitrospira,… được xếp vào
nhóm vi khuẩn hữu ích trong môi trường nước nuôi tôm cá vì chúng có khả năng
chuyển hóa NH4
+
thành NO3
-
(dạng không độc với môi trường và các sinh vật khác
trong đầm). Mặt khác, NO3
-
do hoạt động của chúng sinh ra lại có thể được đồng
hóa trong tổng hợp protein của nhiều sinh vật và tảo. Như vậy, nhóm vi khuẩn nitrat
hóa không chỉ làm giảm độ độc của nước mà còn góp phần làm mới nguồn nước,
mang lại các chất dễ hấp thụ cho động vật thủy sinh [51], [55].
Pseudomonas, Bacillus, Paracoccus… là các vi khuẩn có khả năng khử NO3
-
thành N2 khí quyển, giúp khép kín vòng tuần hoàn nitơ trong thủy vực, đồng thời
hạn chế một tác nhân gây hại cho động vật nuôi trồng. Trong nước nuôi tôm cá
cũng như tại các nhà máy xử lý nước thải, số lượng và hoạt động sinh lý của nhóm
vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn phản nitrat hóa được xem như các thông số giới hạn
tốc độ quá trình chuyển hóa sinh học của nitơ trong nước [26].
Vi sinh vật dị dưỡng sinh trưởng và thu nhận năng lượng bằng nhiều phản
ứng xúc tác enzym. Các enzym có tính đặc hiệu cơ chất cũng như có hiệu quả xúc
tác chuyển hóa cao. Một số enzym cũng tham gia vào chuỗi các phản ứng sinh hóa
để hiệp đồng chuyển hóa một số cơ chất khó phân hủy. Có 2 loại enzym là enzym
nội bào vào enzym ngoại bào. Enzym ngoại bào phân hủy các cơ chất cao phân tử

24. 24
thành các phân tử nhỏ hơn để có thể di chuyển vào tế bào qua màng sinh chất.
Enzym nội bào xúc tác các phản ứng oxy hóa cơ chất thu năng lượng và sinh tổng
hợp trong tế bào. Trong quá trình phân hủy cơ chất hữu cơ, vai trò hàng đầu thuộc
về các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp các enzym thủy phân ngoại bào.
1.5.2. Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó
trong việc cải tạo nước đầm nuôi trồng thủy sản
 Định nghĩa về Probiotic
Theo định nghĩa của tổ chức y tế thế giới WHO, probiotic là “những vi sinh
vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của cơ
thể” [48]. Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy La ̣p , ghép từ chữ pro l à vì và biotic là
sựsống, nên tiếng Viê ̣t thường go ̣i là trợsinh . Thuâ ̣t ngữ probiotic được dùng để
mô tả những chất sinh ra từ vi sinh vâ ̣t có tác dụng tăng trưởng vi sinh vâ ̣t hoă ̣c sinh
vâ ̣t khác . Năm 1959, Rl Fuller đi ̣nh nghĩ a rõ hơn . Probiotics hay vi sinh vâ ̣t
probiotic là những vi sinh vâ ̣t sống , bổ sung vào thứ c ăn có tác dụng cân bằng hê ̣vi
khuẩn đường ruô ̣t và có tác dụng hữu ích cho đô ̣ng vâ ̣t chủ [54]. Gần đây , đi ̣nh
nghĩa này được mở rộng hơ n. Probiotic là chế phẩm bao gồm vi sinh vâ ̣t sống có tác
dụng hữu ích cho động vật và người sử dụng . Tác dụng hữu ích bao gồm tác dụng
làm cân bằng hệ vi sinh đường ruột hay sinh chất đối kháng làm giảm số lượng cá
thể hay tăng lượng kháng thể kích thích hê ̣thống miễn di ̣ch hoă ̣c là cung cấp enzym
trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn . Probiotic là giảm các vi sinh vâ ̣t có ha ̣i
(các vi sinh vật cạnh tranh th ức ăn và tiết các chất đô ̣c ản h hưởng xấu tới hoa ̣t đô ̣ng
sống của vâ ̣t chủ ), làm tăng các vi sinh v ật có lợi (đó là các sinh vâ ̣t ca ̣nh tranh th ức
ăn và vi ̣trí bám vào các mô với vi sinh vâ ̣t có ha ̣i , chúng tiết ra các chất diê ̣t khuẩn
và vitamin K cho cơ thể ).
Ngày nay, khái niệm probiotic còn được mở rộng sang lĩnh vực môi trường.
Đưa probiotic vào môi trường nước để tạo sự cân bằng giữa các vi sinh vật trong
môi trường. Ở nước ta, việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy
sản và sản xuất giống chỉ mới ứng dụng nhiều từ năm 2000 trở lại đây, qua thực tế
sử dụng đã cho thấy kết quả tốt. Hiện nay ở Việt Nam, hầu hết các cơ sở nuôi tôm
cá đều sử dụng chế phẩm vi sinh vật probiotic. Với mục tiêu tăng nhanh sản lượng,
người ta thả tôm, cá với mật độ quá dày trong khi không có biện pháp xử lý môi
trường thích hợp, dẫn đến hiện tượng thối đầm, làm giảm oxy hòa tan khiến tôm, cá
ngạt thở. Hàm lượng các NH3, NH4
+
, NO2
-
, NO3
-
, H2S… tăng cao sẽ khiến tôm cá

25. 25
giảm sự chống đỡ với môi trường bất lợi và tác nhân gây bệnh, nếu vượt quá
ngưỡng sẽ chết.
 Probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản
Probiotic là chế phẩm của công nghê ̣sinh ho ̣c ứ ng dụng vi sinh vâ ̣t trong
các vấn đề thực tiễn . Trong nuôi trồng thủy sản , probiotic hiê ̣n đang được coi là mô ̣t
liê ̣u pháp an toàn và hiê ̣u quả nhằm thay thế cho các loa ̣i thuốc kháng sinh và hóa
chất đã được sử dụng trước đây [26].
Probiotic có thành phần là mô ̣t chủng đơn hoă ̣c mô ̣t h ỗn hợp các chủng vi
sinh vâ ̣t hữu ích . Nhóm vi sinh vật hữu ích ấy tham gia tích cực vào các quá trình
phân hủy sinh ho ̣c bùn và chất thải hữu cơ , chúng có khả năng cạnh tranh ức chế
các vi sinh vật gây bệnh cho động vật hủy sinh , chúng rất an toàn với môi trườ ng và
cũng không gây độc hại đối với người và vật nuôi . Đối với các hình thức nuôi trồng
khác nhau , viê ̣c sử dụng chế phẩm sinh ho ̣c được nhìn nhâ ̣n như biê ̣n phấp tích cực
nhất bởi vì chế phẩm sinh ho ̣c có tác dụng giảm đô ̣c tố trong đầm , chủ yếu là NH 3
và H 2S, giảm mùi hôi , cải thiện màu nước , ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái
trong đầm. Chế phẩm sinh ho ̣c cũng có tác dụng phòng bê ̣nh , giảm thiểu hiện tượng
gây bê ̣nh cho tôm . Ngoài ra , việc áp dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy
sản còn giúp đối tượng nuôi hấp thụ thức ăn dễ hơn , giảm hệ số tiêu thụ thức ăn ,
tăng năng suất thu hoa ̣ch từ 20 – 30% [60]. Bên ca ̣nh đó , viê ̣c sử dụng chế phẩm
sinh ho ̣c tron g nuôi trồng thủy sản sẽ ha ̣n chế viê ̣c sử dụng hóa chất và chất kháng
sinh, yếu tốt gây ra hâ ̣u quả của viê ̣c nuôi trồng thủy sản kém bền vững . Thực tế
cho thấy, những cơ sở sử dụng chế phẩm sinh ho ̣c đã đa ̣t năng suất thủy sản khá
cao, giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh .
Sử dụng chế phẩm probiotic cho kết quả ưu viê ̣t hơn hẳn sử dụng hóa chất
cũng như thuốc kháng sinh vì hóa chất chỉ làm sạch nước tạm thời và chúng giết
chết hàng loa ̣t tảo tro ng đầm . Hơn nữa , thay vì cần phải làm sa ̣ch chất hữu cơ và
lắng că ̣n bùn thì hóa chất la ̣i góp phần hình thành nên lớp bùn dày hơn ở đáy đầm ,
tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây hại phát triển . Bên ca ̣nh đó , nhiều loài tôm, cá
và động vật thủy sinh khác cũng có thể bị giết chết bởi hóa chất . Hâ ̣u quả của viê ̣c
dùng thuốc kháng sinh cũng không kém phần nghiêm trọng . Chất kháng sinh cũng
giết chết nhiều loa ̣i vi khuẩn , kể cả vi khuẩn gây ha ̣ i lẫn vi khuẩn có ích , do đó làm
giảm tốc độ các quá trình các quá trình chuyển hóa sinh học trong nước , đồng thời ,
giảm khả năng tạo miễn dịch tự nhiên của chúng . Hơn nữa , sử dụng thuốc kháng

26. 26
sinh lâu dài sẽ dẫn đến xuất hiê ̣n các chủng vi khuẩn gây bê ̣nh kháng thuốc . Hiê ̣n
tượng kháng thuốc cũng có thể xuất hiê ̣n ở người thông qua chuỗi thứ c ăn khi con
người sử dụng các sản phẩm thủy sản nuôi trồng . Vì thế , hiê ̣n nay các loa ̣i thuốc
kháng sinh đều bi ̣cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản . Mă ̣t khác , tôm cá là
những sinh vâ ̣t rất nha ̣y cảm với bê ̣nh tâ ̣t , dễ bi ̣tổn thương và bi ̣tấn công bởi nhiều
tác động, đôi khi viê ̣c sử dụng chất kháng sinh liên tục đã là m mất đi sản lượng tôm
cá khổng lồ , ví dụ vở nhiều nơi trên thế giới đã từng bị mất đến 80% sản lượng thủy
sản. Như vâ ̣y , rõ ràng cần phải có một sự kiểm soát khác thay thế thuốc kháng sinh ,
hóa chất và probiotic đã t hể hiê ̣n được vai trò ấy .
Hiện nay các loài vi sinh vật: Bacillus, Lactobacillus, nhóm vi khuẩn quang
dưỡng, hóa dưỡng… được sử dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm sinh học.
Những nghiên cứu cho thấy rằng các loài vi khuẩn này đều không độc hại, dễ nuôi
cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước và đất nghèo dinh dưỡng. Chúng có khả năng
phân huỷ thức ăn thừa, chất thải hữu cơ và làm sạch môi trường nhờ enzym do
chúng tổng hợp được. Ngoài ra chúng còn có khả năng sinh các chất kháng khuẩn
như bacteriocin, một chất có hoạt tính kháng sinh được dùng nhiều trong chăn nuôi,
bảo quản thực phẩm để nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn
của vật nuôi, làm giảm sự phát triển của những vi sinh vật có hại. Chính nhờ những
đặc điểm này mà chúng được dùng để sản xuất các chế phẩm nhằm cải thiện môi
trường nước, nâng cao hiệu suất kinh tế, hạn chế dịch bệnh cho tôm cá.
 Mục đích của việc sử dụng chế phẩm probiotic
Trong nuôi trồng thủy sản sử dụng chế phẩm probiotic nhằm các mục đích:
- Giảm độc tố trong ao ở mức thấp nhất, giảm mùi hôi thối của nước.
- Cải thiện màu nước, ổn định pH, cân bằng hệ sinh thái trong ao.
- Phân hủy các chất hữu cơ, phòng tảo nở hoa, hấp thu nguồn tảo chết trong
ao, giảm độ nhớt của nước.
- Cạnh tranh thức ăn làm giảm lượng vi khuẩn có hại, phòng bệnh.
- Tăng sự hòa tan oxy.
- Kích thích hệ miễn dịch trong tôm để kháng bệnh, giảm sốc khi môi trường
thay đổi đột ngột.
- Giúp tôm cá hấp thu thức ăn tốt, giảm hệ số tiêu tốn thức ăn.
- Hạn chế được sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất.

27. 27
- Giảm số lần thay nước trong quá trình nuôi.
 Một số nhóm vi khuẩn thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất
probiotic cho tôm cá
 Nhóm Bacillus
Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, trong rất nhiều
môi trường (đất, nước, không khí, thực phẩm…) và gồm nhiều nhóm sinh lí sinh
thái khác nhau (ưa ấm, ưa nhiệt, ưa lạnh…), với gần khoảng gần 500 loài và dưới
loài. Do sự đa dạng sinh thái và đa dạng loài như vậy các hoạt chất sinh học của
chúng cũng vô cùng phong phú: các enzym ngoại bào, các chất kháng khuẩn và
kháng nấm, các chất kích thích sinh trưởng thực vật, các chất hoạt động bề
mặt…[32]
Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, hình que, có bào tử, sinh trưởng
trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, thuộc nhóm vi khuẩn dị dưỡng
hoại sinh. Về dinh dưỡng và sinh trưởng nhìn chung Bacillus là những vi khuẩn hóa
tự dưỡng hữu cơ tùy tiện có khả năng sử dụng nhiều các hợp chất hữu cơ đơn giản
như là các đường, axit amin, các axit hữu cơ. Trong một số trường hợp chúng lên
men cacbonhydrat thông qua chuỗi các phản ứng phức tạp tạo ra glycerol và
butanediol. Một số ít loài như Bacillus megaterium lại không cần đến các yếu tố
sinh trưởng hữu cơ, một số khác sinh trưởng lại cần có vitamin B hoặc các axit
amin. Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ưa ấm với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ
30 - 45o
C một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 65o
C. Một số loài ưa lạnh có thể
sinh trưởng và hình thành nội bào tử ở 0o
C. pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 -11.
Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 như Bacillus
alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius [32].
Trừ Bacillus anthracis gây bệnh than cho người, tất cả các Bacillus khác
được coi là không độc hại cho người. Bacillus làm sạch môi trường nước nhờ khả
năng sinh enzym phân hủy chất hữu cơ nguồn gốc từ thức ăn thừa, chất thải từ tôm
cá: proteaza phân hủy protein, amylaza phân hủy tinh bột, xenlulaza phân hủy
xenlulozơ, kitinaza phân giải kitin. Ngoài chức năng phân giải các hợp chất hữu cơ
làm sạch môi trường thì chúng còn có tác dụng kiểm soát sự phát triển quá mức vi
sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn
ở trạng thái cân bằng sinh học. Đặc điểm quan trọng nhất của chi Bacillus là có khả
năng tạo nội bào tử, nhất là trong những điều kiện bất lợi như cạn kiệt nguồn dinh

28. 28
dưỡng hay điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ hóa chất… Bào tử Bacillus
có thể tồn tại rất lâu thậm chí trong nhiều năm, khi gặp điều kiện thuận lợi có thể
nảy mầm, phát triển thành tế bào dinh dưỡng. Trong quá trình hình thành bào tử,
Bacillus thường sản sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực. Một trong những đặc tính đó là sinh enzym phân hủy hữu cơ như
proteaza, amylaza, xenlulaza. Proteaza là enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptit
(CO-NH) trong phân tử protein và các chất tương tự. Sản phẩm thủy phân là các
axit amin, sản phẩm trung gian là các peptit có mạch dài ngắn khác nhau. Enzym
amylaza có tác dụng thủy phân tinh bột. Quá trình trải qua giai đoạn dextrin hóa,
khi đó chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng
dextrin và giai đoạn đường hóa. Trong giai đoạn này các dextrin vừa được tạo thành
bị phân hủy tiếp thành các phân tử thấp hơn như maltozơ, isomaltozơ, glucozơ.
Enzym xenlulaza xúc tác sự thủy phân xenlulozơ thành sản phẩm trung gian
xenlubiozơ và sản phẩm cuối cùng là glucozơ. Các sản phẩm cuối cùng của sự phân
hủy chất hữu cơ nhờ hệ enzym proteaza, amylaza, xenlulaza là các axit amin và
glucozơ. Đó là nguồn dinh dưỡng cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng
phát triển mạnh và làm cải thiện chất lượng nước [32].
 Nhóm vi khuẩn lactic
Một trong những nhóm vi khuẩn điển hình có ích đối với môi trường đầm
nuôi tôm cá là nhóm vi khuẩn lactic. Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ
Lactobacteriacae. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái, các giống khác nhau có
hình dạng và kích thước khác nhau. Nhưng nhìn chung chúng được chia thành hai
loại hình cầu và hình que. Ngoài ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic
còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào.
Streptococcus có tế bào hình cầu hoặc hình ovan, đường kính khoảng
0,5 -1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài. Tuy nhiên, một số
chủng thuộc loài này có thể có dạng hơi giống trực khuẩn vì có kích thước chiều dài
lớn hơn chiều rộng, chẳng hạn như Streptococus lactic [9].
Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 - 0,8µm
và chiều dài khoảng 1,6µm. Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng
1 - 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám [9].
Lactobacillus có hình que. Đây là loại vi khuẩn phổ biến nhất. Hình dạng
của chúng thay đổi từ hình cầu cho đến hình que dài. Chẳng hạn L. plantatum có

29. 29
dạng hình que kích thước từ 0,7-1,1µm đến 3-8µm, sắp xếp thành chuỗi hoặc đứng
riêng lẻ, trong khi L. casei có dạng hình que ngắn hoặc hình que dài, tế bào hình
que mảnh, đôi khi hơi cong, sắp xếp thành cặp hay chuỗi [9].
Về hình thái, vi khuẩn lactic có hình dạnh không đồng nhất. Nhưng về mặt
sinh lý chúng lại có những điểm tương đối đồng nhất. Chúng đều là những vi khuẩn
Gram (+), không có khả năng tạo bào tử, không di động, sinh axit lactic trong quá
trình phát triển, catalase, oxydase và khử nitrat âm tính, không chứa các xitocrom,
hô hấp kỵ khí hoặc vi hiếu khí [10].
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về dinh dưỡng cũng khác nhau.
Chúng không những cần cung cấp đủ các chất dinh dưỡng: cacbon, nitơ, muối
khoáng… mà còn cần các chất kích thích sinh trưởng.
Nhóm vi khuẩn lactic có khả năng kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môi
trường nhờ sinh chất đối kháng như axit lactic, bacteriocin. Ngoài vai trò kiểm soát
vi sinh vật gây bệnh trong môi trường thì chúng cũng có tác dụng làm giảm mùi hôi
của đầm nuôi. Quan trọng hơn cả, sử dụng nhóm vi khuẩn này còn có tác dụng hạn
chế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho sản phẩm
thủy sản. Khi sử dụng nhóm vi khuẩn lactic để bổ sung vào thức ăn tôm cá, ngoài
mục đích làm cân bằng khu hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của vi
sinh vật có hại, tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đường ruột thì chúng còn có
tác dụng tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giúp cho tôm cá nuôi phát triển
khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh [5].
 Nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dƣỡng
Trước đây, theo phân loại truyền thống đã xếp các chủng vi khuẩn nitrat hóa
chung vào cùng một nhóm thuộc họ Nitrobacteriaceae sau đó, dựa vào khả năng
oxy hóa các cơ chất vô cơ của vi khuẩn nitrat hóa mà người ta đã chia chúng thành
2 nhóm, đó là nhóm vi khuẩn oxy hóa amôni và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit [53].
 Vi khuẩn oxy hóa amôni hay còn gọi là vi khuẩn nitroso là nhóm vi
khuẩn Gram âm, hóa tự dưỡng và hiếu khí bắt buộc. Vi khuẩn này lấy năng
lượng từ quá trình oxy hóa amôni thành nitrit. Quá trình oxy hóa amôni xảy
ra theo phương trình sau:

30. 30
Vi khuẩn oxy hóa amôni tự dưỡng lấy năng lượng và lực khử từ quá trình
oxy hóa amôni để sinh trưởng. Nguồn cacbon chính mà các tế bào vi khuẩn sử dụng
là CO2 trong khí quyển thông qua chu trình Calvin-Benson. Các tế bào vi khuẩn
sinh trưởng rất chậm, thời gian nhân đôi tế bào của vi khuẩn ít nhất là 7 - 8 giờ,
thậm chí cũng có thể kéo dài thêm vài ngày [42].
Trong hệ thống phân loại hiện nay, người ta chia nhóm vi khuẩn amôni hóa
thành 3 chi, dựa vào sự khác biệt về hình dạng tế bào, kiểu hình và tổ chức nội bào.
Đó là các chi Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira. Tế bào vi khuẩn thuộc
chi Nitrosomonas có hình que thẳng, chi này là phổ biến nhất trong nhóm vi khuẩn
amôni hóa, có vùng phân bố rộng, chúng sống trong đất, nước ngọt, bùn, nước lợ,
biển. Chi Nitrosococcus tế bào có hình cầu đặc trưng, tế bào có roi nên có khả năng
di chuyển. Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrosospira có hình xoắn ốc[62].
 Nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit tự dưỡng được biết đến như là vi khuẩn tự
dưỡng hóa năng (chemoautotroph), Gram âm và hiếu khí. Giống như vi
khuẩn oxy hóa amôni, vi khuẩn oxy hóa nitrit sử dụng nguồn cacbon là CO2
thông qua chu trình Calvin-Benson [41]. Quá trình oxy hóa nitrit xảy ra như
sau:
Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn oxy hóa nitrit phụ thuộc vào nồng độ cơ
chất, nhiệt độ, pH, ánh sáng và nồng độ oxy hòa tan. Các chủng vi khuẩn nitrit hóa
tự dưỡng sinh trưởng tốt ở nồng độ nitrit từ 2 - 30 mM, nồng độ nitrit quá cao có
thể gây ức chế sinh trưởng của tế bào. Vi khuẩn oxy hóa nitrit có thể sinh trưởng
bình thường trong môi trường tự nhiên ở dải pH = 6 - 8. Điều kiện tối ưu cho sinh
trưởng là pH = 7 - 8. Nhiệt độ lý tưởng cho sinh trưởng của chúng là 25 - 30o
C
trong môi trường không khí [62].
Tốc độ của giai đoạn (1) xảy ra nhanh gấp 3 lần so với giai đoạn (2). Bằng
thực nghiệm người ta đã chứng minh rằng lượng oxy tiêu hao để oxy hóa 1mg nitơ
của muối amôni ở giai đoạn tạo nitrit là 343 mg O2, còn ở giai đoạn tạo nitrat là 4,5
mg O2. Sự có mặt của nitrat trong nước thải phản ánh mức độ khoáng hóa hoàn
thành các chất bẩn hữu cơ. Năng lượng sinh ra từ phản ứng nitrat hóa được vi khuẩn
sử dụng trong quá trình tổng hợp tế bào [5].

31. 31
Ngày nay, vi khuẩn oxy hóa nitrit được phân loại thành 4 chi: Nitrobacter,
Nitrococcus, Nitrospina và Nitrospira. Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter có
hình que ngắn, màng trong tế bào chứa mũ phân cực. Tế bào vi khuẩn thuộc chi
Nitrococcus có hình tròn, màng trong tế bào hình ống. Tế bào vi khuẩn thuộc chi
Nitrospina có hình que, màng trong tế bào dạng túi. Tế bào vi khuẩn thuộc chi
Nitrospira có hình xoắn và không xuất hiện màng trong tế bào [62].
Các vi khuẩn oxy hóa nitrit có khả năng thích nghi cao với các điều kiện môi
trường khác nhau và chúng thường tồn tại cùng với vi khuẩn oxy hóa amôni do các
vi khuẩn này đã cung cấp nitrit cho chúng trong môi trường hiếu khí [41].
Trong các chế phẩm dùng cho ao, đầm nuôi tôm cá hiện nay người ta thường
bổ sung nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dưỡng cụ thể là chi Nitrosomonas và chi
Nitrobacter. Vi khuẩn thuộc hai chi này đóng vai trò quan trọng trong việc giảm các
độc tố trong môi trường nước, chuyển hóa các chất độc như amôni và hợp chất nitơ,
do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước, giúp tôm cá nuôi phát triển tốt [7] .
1.5.3. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của biê ̣n phấp sƣ̉ dụng vi sinh vật trong xƣ̉ lý
nƣớ c nuôi trồng thủy sản
- Ưu điểm: các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môi
trường nước nuôi trồng thủy sản và đem lại nhiều lợi ích cho con người và môi
trường sống mà các phương pháp khác không có được như : an toàn đối với người
và động vật , đă ̣c hiê ̣u đối với vâ ̣t chủ , thích hợp với các phương pháp phòng trừ
khác, thời gian bán hủy ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường
sống, có khả năng tự nhân lên (tựsinh sản ), có khả năng ức chế các vi sinh vật đã
kháng thuốc hóa học .
- Nhược điểm: thời gian phát huy tác dụng châ ̣m , tác động không triê ̣t để ,
hiê ̣u quả phương pháp chi ̣u ảnh hưởng lớn vào điều kiê ̣n ngoa ̣i cảnh , kết quả thu
được thường không ổn đi ̣nh .
Để ha ̣n chế các nhược điểm này , chúng ta cần phải tuyển chọn các chủng vi
sinh vâ ̣t có tính đối kh áng tốt nhất , nghiên cứ u sử dụng kết hợp nhiều chủng .

32. 32
Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng
2.1.1. Chủng giống
- Các chủng VSV dùng trong nghiên cứu được tuyển chọn từ các chủng vi
khuẩn phân lập từ các mẫu đất, nước tại địa bàn Hà Nội.
- Các chủng Vi sinh vật kiểm định lấy từ bảo tàng giống chuẩn VSV, Viện
VSV và Công Nghệ Sinh học- ĐH Quốc gia Hà Nội, bao gồm các chủng E. coli
ATCC 25922; Salmonella typhi ATCC 14028; Proteus mirabilis; Staphylococcus
aureus ATCC 25923; Vibrio parahaemolyticus; Shigella flexneri ATCC 29903D;
Fusarium oxysporum.
2.1.2. Hóa chất – thiết bi ̣
Hóa chất:
Các hóa chất làm môi trường: peptone, nước nắm, cao nấm men, cao thịt,
CMC, tinh bột tan, kitin, cazein, glucoza,… và nhiều hóa chất thông thường khác.
Dụng cụ:
- Buồng cấy vô trùng (Pháp)
- Máy lắc Inforsagch – 4103 (Pháp).
- Tủ sấy, tủ ấm (Trung Quốc )
- Cân phân tích (Nhâ ̣t)
- Nồi khử trùng Tomy SS 325 (Nhâ ̣t)
- Máy đo DO meter Hanna HI 8043 (Hàn Quốc ).
- Máy đo pH Hanna 8733 (Hàn Quốc ).
- Tủ cấy (Trung Quốc )
- Tủ ổn nhiệt (Nhâ ̣t )
- Tủ lạnh (Nhâ ̣t)
- Kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản)
- Máy li tâm
2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trườ ng phân lập và nuôi cấy vi sinh vật
- Môi trường tha ̣ch thường cải t iến (g/l):

33. 33
Peptone: 10g Thạch: 14 -15 g
Nước mắm : 10ml Nước cất: 1 lít
- Môi trường MRS (g/l)
Glucose
Peptone
Cao thi ̣t
Cao nấm men
Aminoxitrat
Tween 80
Nước cất
20g
10g
5g
5g
2g
1ml
1 lít
K2HPO4
CH3COONa.2H2O
MgSO4
MnSO4.4H2O
CaCO3
Thạch
2g
5g
0,58g
0,28g
5g
14-15g
- Môi trường ISP 4 (g/l) pH = 7
MgSO4.7H2O
NaCl
KH2PO4
Dịch vi lượng
(g/ml)
Nước
1g
1g
1g
1ml
1 lít
CaCO3
(NH4)SO4
Tinh bô ̣t tan
Thạch
2g
2g
10g
14 - 15 g
Dịch vi lượng : 0,1g FeSO4.7H2O + 0,1g MnCl + 0,1g ZnSO4
Môi trường giữ giống thêm 5g peptone.
- Môi trường NA (g/l): pH = 6,8-7,0
Cao thi ̣t 3g (thay bằng 20ml nước mắm )
Peptone 5g
NaCl 50g
Thạch 14-15g
Nước cất 1 lít
Đun sôi môi trường sau đó đổ vào bình tam giác và ống nghiê ̣m đã khử
trùng. Khử trùng môi trường ở 1210
C/ 30 phút, làm nghiêng mặt thạch . Để 370
C
trong 48h trước khi dụng hoă ̣c giữ ở 40
C.
- Môi trường nuôi Nitrosomonas:

34. 34
K2HPO4 1g
MgSO4 0,2g
CaCl2.2H2O 20mg
FeSO4.7H2O 50mg
MnCl2.4H2O 2,0mg
Na2MoO4.2H2O 1mg
Nước cất 1 lít
pH 8,5
- Môi trường nuôi Nitrobacter:
K2HPO4 1g
MgSO4 0,2g
CaCl2. 2H2O 20mg
FeSO4.7H2O 50mg
MnCl2.4H2O 2,0 mg
Na2MoO4.2H2O 1mg
Nước cất 1 lít
2.1.3.2. Môi trườ ng lên men di ̣ch thể (g/l):
- Môi trường 1:
Bắp cải 300g
Nước mắm 15ml
Nước cất 1 lít
- Môi trường 2:
Cà chua 300g
Nước mắm 15ml
Nước cất 1 lít
- Môi trường 3:
Giá đỗ 300g
Nước mắm 15ml
Nước cất 1 lít
- Môi trường 4:
Khoai tây 300g
Nước mắm 15ml
Nước cất 1 lít
Đun sôi môi trường sau đó đổ 40ml vào bình tam giác 100ml đã được khử
trùng, đem khử trùng ở 121o
C trong 30 phút, để nguội môi trường trong 24h giữ ở
4o
C.

35. 35
2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́ u
2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn
- Lấy 1ml mẫu đưa vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã được khử trùng để
được độ pha loãng 10-1
. Vontex đều sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-1
cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng ta được độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục
như vậy đến nồng độ 10-6
.
- Lấy 50µl dung dịch pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp trải đều lên đĩa
peptri chứa môi trường nuôi cấy.
- Tinh sạch, ria cấy 3 pha các chủng để thu nhận chủng thuần khiết, sau đó
giữ giống trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng.
2.2.2. Phân loại vi sinh vật
Phân loại theo phương pháp truyền thống
Phương pháp phân loại cổ điển là phương pháp phân loại các chủng vi khuẩn
dựa vào các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa. Dựa vào đó, người ta
phân loại chúng vào các chi.
Phân lọai theo phương pháp sinh học phân tử
 Phương pháp tách ADN vi khuẩn
- Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 l TE trong ống Eppendoff.
- Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 37o
C trong 30 phút.
- Thêm 100 l SDS 10%, ủ ở 37o
C trong 30 phút.
- Thêm 300 l PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trộn đều
trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, lấy dịch trên.
- (Bước này được lặp lại 2 lần)
- Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN.
- Rửa tủa bằng etanol 70%.
- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không.
- Thêm 30-50 l nước, bảo quản để dùng dần.
 Điện di trên gel agaroza

36. 36
- Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit
nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit nucleic là
ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung
photphodieste của các sợi axit nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về
cực dương khi đặt trong điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gel
có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước.
- Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vào
khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung
dịch 1X TAE. Trộn đều 2l dung dịch loading buffer 6x với 5l mẫu, nhỏ vào
giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng
điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20
phút vớt ra. Quan sát vạch ADN trên máy soi gel.
Thành phần Thể tích (%)
10 X buffer 10
dNTP 1,25 mM 16
Mồi xuôi 1 (10 pmol/l)
Mồi ngược 1 (10 pmol/l)
Taq polymeraza 1,2
Mẫu 2
Nước đủ 100
Mồi cho phản ứng PCR
Mồi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' tương ứng với vị trí
nucleotit 27 đến 47
Mồi ngược: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ứng với vị trí
nucleotit 1525 đến 1507
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc tiến hành Nhiệt độ (0
C) Thời gian
1 94 1 phút

37. 37
2 lặp lại 30 lần chu kỳ sau
94 30 giây
55 45 giây
72 2 phút 30 giây
3 72 7 phút
4 4 -
Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Tiến hành tương tự như đối
với điện di genome.
 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự
Terminator Ready Reaction Mix 8 l Mồi 1 l
Mẫu 1l Nước cất đủ đến 20l
Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau :
- Chu trình nhiệt
Bước tiến hành Nhiệt độ (o
C) Thời gian
1 96 1 phút
2 lặp lại 25 lần chu kỳ sau
96 10 giây
50 5 giây
60 4 phút
3 4 -
 Xác định hàm lượng axit nucleic
Do trong thực tế thường phải sử dụng những lượng axit nucleic rất nhỏ (thường
là micro-, nano- hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng. Không thể xác
định số lượng này một cách trực tiếp mà nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác
định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260) trong máy đo quang phổ kế.
Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50g/ml
của ADN sợi kép, hoặc tương đương với nồng độ 40g/ml của ADN hoặc ARN mạch