Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT NÂNG CAO HIỆU QUẢ QUÁ TRÌNH
LÊN MEN BIOETHANOL TỪ VỎ CACAO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SSF
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Th.S Trần Thị Tưởng An
Sinh viên thực hiện : Hồ Thùy Bảo Trân
MSSV: 1151110531 Lớp: 11DSH05
TP. Hồ Chí Minh, 2015

2. Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp “Khảo sát nâng cao hiệu quả quá
trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phương pháp SSF” là công trình nghiên
cứu thực sự của cá nhân tôi, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức
và dựa trên sự hướng dẫn của Th.S Trần Thị Tưởng An.
Các số liệu sử dụng trong đồ án là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng.
Nội dung đồ án có tham khảo và sử dụng một số nhận xét, đánh giá từ các tài liệu
thông tin được đăng tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh
mục tài liệu tham khảo của đồ án.

3. Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Đồ án tốt nghiệp là một cột mốc quan trọng trong cuộc đời sinh viên, nó đánh
dấu toàn bộ quá trình học tập và nghiên cứu ở giảng đường đại học. Để có được điều
kiện thực hiện đồ án tốt nghiệp cũng như hoàn thành chương trình học 4 năm tại
trường Đại học Công Nghệ TP.HCM em đã nhận được những sự chỉ dạy tận tình với
những kinh nghiệm quý báu từ quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm-
Môi trường của trường Đại học Công Nghệ TP.HCM.
Lời đầu tiên em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công Nghệ
TP.HCM, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cũng
như tập thể các thầy cô đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em được thực hiện đồ án này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Trần Thị Tưởng An,
trường Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh. Cô là người đã giúp em đến với hướng
nghiên cứu này, đồng thời cũng là người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình,
truyền đạt các kiến thức, kinh nghiệm chuyên môn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em
hoàn thành tốt đồ án và động viên em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài tại
phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí
Minh
Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh, các chị và các bạn làm việc trong phòng
thí nghiệm đã nhiệt tình hỗ trợ em trong suốt thời gian làm việc ở đây.
Cuối cùng, xin cảm ơn sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của toàn thể gia đình trong suốt
quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp, cũng như trong suốt quá trình học tập vừa qua.
Mặc dù đã cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Song do buổi
đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực nghiệm và
máy móc hiện đại cũng như hạn chế về kiến thức, kinh nghiệm nên không tránh khỏi
những thiếu xót. Em rất mong được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn để kiến thức
của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn.
Sinh viên thực hiện
Hồ Thùy Bảo Trân

4. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.............................................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................ v
DANH MỤC HÌNH ẢNH............................................................................vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1. Đặt vấn đề.............................................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ trái cacao..................................2
3. Mục tiêu đề tài ......................................................................................................3
4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................3
5. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................3
6. Các kết quả đạt được của đề tài............................................................................4
7. Kết cấu của đồ án..................................................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 5
1.1.Giới thiệu về Bioethanol ....................................................................................5
1.1.1. Khái niệm.....................................................................................................5
1.1.2. Các thế hệ bioethanol...................................................................................5
1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bioethanol trên thế giới và Việt Nam..........6
1.1.4. Lợi ích, hạn chế và ứng dụng của bioethanol............................................11
1.1.5. Nguồn nguyên liệu lignocellulose .............................................................12
1.2.Quá trình biến đổi bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose. ..........................13
1.2.1. Quá trình tiền xử lý....................................................................................14
1.2.2. Quá trình thủy phân. ..................................................................................17
1.2.3. Quá trình lên men ......................................................................................17
1.3.Giới thiệu về cây Cacao ...................................................................................22
1.3.1. Tên khoa học của cây cacao ......................................................................22
1.3.2. Thành phần và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái cacao..................................22
1.3.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cacao ở nước ta. ........................................23
1.4.Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới.................................................24

5. Đồ án tốt nghiệp
ii
1.5.Giới thiệu về nấm men Saccharomyces cerevisiae..........................................26
1.5.1. Phân loại khoa học.....................................................................................26
1.5.2. Đặc điểm hình thái.....................................................................................26
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........... 27
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................27
2.2. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................27
2.3. Vật liệu nghiên cứu..........................................................................................27
2.3.1. Vật liệu........................................................................................................27
2.3.2. Dụng cụ và thiết bị......................................................................................28
2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................28
2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ...............................................................................29
2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ..................................................................29
2.5.Các phương pháp phân tích..............................................................................34
2.5.1. Phương pháp vi sinh. .................................................................................34
2.5.2. Phương pháp hóa lý ...................................................................................36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................. 42
3.1. Khảo sát giống nấm men..................................................................................42
3.1.1. Quan sát hình thái nấm men .......................................................................42
3.1.2. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae. ..........42
3.2. Khảo sát thành phần hóa học của vỏ cacao khô. .............................................43
3.3. Khảo sát tiền xử lý với acid oxalic. .................................................................44
3.4. Thủy phân vỏ cacao bằng enzyme Viscozym..................................................45
3.5. Khảo sát thời gian lên men sau khi thủy phân (SHF)......................................47
3.6. Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời (SSF). ............................................49
3.6.1. Khảo sát thời gian SSF. ..............................................................................50
3.6.2. Khảo sát nhiệt độ lên men SSF...................................................................54
3.6.3. Khảo sát tỉ lệ giống bổ sung .......................................................................56
3.6.4. Khảo sát tỉ lệ enzyme bổ sung....................................................................59
3.6.5. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy lắc ..................................................61

6. Đồ án tốt nghiệp
iii
3.7. Khảo sát thành phần dinh dưỡng bổ sung trong lên men SSF.........................63
3.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ peptone đến quá trình lên men SSF ......63
3.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose đến quá trình SSF ....................65
3.7.3. Khảo sát ảnh hưởng của K2HPO4 đến quá trình lên men SSF ...................67
3.7.4. Khảo sát ảnh hưởng của MnSO4 đến quá trình lên men SSF .....................68
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................ 71
4.1. Kết luận............................................................................................................71
4.2. Kiến nghị .........................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 73

7. Đồ án tốt nghiệp
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Cfu Colony forming unit
Cty Công ty
DNS Acid 3,5- dinitrosalicylic
đv Đơn vị
EtOH Ethanol
EU European Union
h Giờ
HPLC High-performance liquid chromatography
KH và CN Khoa học và Công nghệ
MeOH Methanol
PL Phụ lục.
PNV Petro Vietnam.
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
SDA Sabouraud’s Dextrose Agar
SDB Sabouraud’s Dextrose Broth
SHF Separate hydrolysis and fermentation
SSCF Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation
SSF Simultaneous Saccharification and Fermention
TXL Tiền xử lý

8. Đồ án tốt nghiệp
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các thế hệ bioethanol.................................................................................6
Bảng 1.2. Tổng sản lượng bioethanol hàng năm trên thế giới ...................................7
Bảng 1.3. Danh sách nhà máy bioethanol sinh học đang sản xuất...........................10
Bảng 1.4. Các phương pháp tiền xử lý hóa học........................................................16
Bảng 1.5. Những thuận lợi và bất lợi của phướng pháp tiền xử lý bằng acid .........16
Bảng 1.6. Các phương pháp tiền xử lý sinh học.......................................................17
Bảng 1.7. Các quá trình lên men...............................................................................20
Bảng 1.8. Thành phần vỏ cacao khô.........................................................................22
Bảng 1.9. Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới.........................................25
Bảng 2.1. Bảng thực hiện thí nghiệm lên men SSF..................................................33
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của vỏ cacao khô.....................................................44
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của vỏ cacao khô sau khi tiền xử lí ........................45
Bảng 3.3. Kết quả thủy phân theo thời gian. ............................................................46

9. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Thị phần sản xuất bioethanol sinh học trên thế giới...................................8
Hình 1.2. Thành phần của lignocelluloses. ..............................................................13
Hình 1.3. Sơ đồ chuyển đổi sinh khối lignocelluolose thành bioethanol.................14
Hình 1.4. Nấm men Saccharomyces cerevisiae .......................................................26
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình thực hiện thí nghiệm…………………………………....29
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của Saccharomyces cerevisiae..................................42
Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae................................................42
Hình 3.3. Vỏ cacao khô ............................................................................................43
Hình 3.4. Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên lên men SHF. ..................48
Hình 3.5. Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên men SSF..........................51
Hình 3.6. Sự thay đổi các thành phần theo nhiệt độ trong quá trình lên men SSF ..55
Hình 3.7. Sự thay đổi các thành phần theo tỉ lệ cấy giống trong lên men SSF........57
Hình 3.8. Sự thay đổi các thành phần theo tỉ lệ enzyme bổ sung trong quá trình lên
men SSF ....................................................................................................................60
Hình 3.9. Sự thay đổi các thành phần theo tốc độ khuấy trong quá trình lên men SSF
...................................................................................................................................62
Hình 3.10. Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ pepton bổ sung trong quá trình
lên men SSF ..............................................................................................................64
Hình 3.11. Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ glucose bổ sung trong quá trình
lên men SSF. .............................................................................................................66
Hình 3.12. Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ K2HPO4 trong quá trình lên men
SSF. ...........................................................................................................................68
Hình 3.13. Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ MnSO4 bổ sung trong quá trình
lên men SSF ..............................................................................................................70

10. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề.
Bioethanol (Ethanol sinh học) là một loại nhiên liệu sinh học mới đầy hứa hẹn
sẽ thay thế cho nguồn năng lượng từ các sản phẩm hoá thạch dầu mỏ mà mọi người
đang hướng tới nhằm khắc phục cơn khát năng lượng toàn cầu. Nó có thể được sản
xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu và chất thải sinh học khác nhau. Nguyên liệu được
sử dụng trong sản xuất bioethanol sinh học như đậu tương, cọ, hạt cải, hạt cải dầu,
mỡ động vật, dầu thực vật, tinh bột và đường được coi là nguyên liệu thế hệ đầu tiên.
Những bất lợi của các nguyên liệu thế hệ đầu tiên là chúng có thể được sử dụng theo
cách khác để làm thức ăn cho con người do đó sẽ gây ra sự lo lắng về vấn đề an ninh
lương thực - sự cạnh tranh giữa cây trồng làm nhiên liệu và cây lương thực.
Chính vì vậy, thế giới đang đi theo hướng sản xuất bioethanol từ các nguyên
liệu phi thực phẩm có chứa hợp chất cellulose - sinh khối lignocellulose. Sử dụng
nguyên liệu giàu cellulose hoặc nguyên liệu rẻ tiền chứa nhiều carbohydrate là một
giải pháp đang được hướng đến để tránh việc cạnh tranh với nguồn lương thực của
con người.
Việt Nam là một quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, điều kiện
thuận lợi cho sự phát triển của các loài cây trồng, đặc biệt là các loại cây nông nghiệp
có giá trị như cacao. Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng
dụng vỏ cacao để làm thức ăn chăn nuôi mang lại hiệu quả cao. Bên cạnh đó, vỏ cacao
đã được nghiên cứu trong lĩnh vực sản xuất bioethanol sinh học. Dựa vào thành phần
hóa học của vỏ cacao chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin… qua quá trình
thủy phân và lên men nhờ vi sinh vật chuyển hoá cellulose trong vỏ cacao thành
Bioethanol sinh học.
Vỏ trái cacao là nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose nên có thể
sử dụng để lên men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng được nguồn vỏ phế phẩm
với lượng thải bỏ hằng năm rất lớn. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu để tìm ra phương
pháp lên men tốt nhất cho nguồn nguyên liệu này là vấn đề quan trọng hàng đầu để
có thể ứng dụng vào sản xuất bioethanol đại trà. Với những ưu điểm như rẻ tiền, phổ

11. Đồ án tốt nghiệp
2
biến, vỏ cacao sẽ là một nguồn nguyên liệu tiềm năng trong quá trình nghiên cứu sản
xuất bioethanol sinh học.
Do những vấn đề nêu trên, nên đây là một loại nguyên liệu có tiềm năng rất lớn
trong việc sản xuất bioethanol ở Việt Nam. Nghiên cứu “Khảo sát nâng cao hiệu
quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phương pháp SSF” được đặt ra
nhằm mục đích sử dụng phương pháp SSF để lên men nguồn phế phẩm vỏ cacao để
thu bioethanol có hiệu quả cao.
2. Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ trái cacao.
Hiện nay đã có khá nhiều nghiên cứu lên men bioethanol được tiến hành trên
các nguồn nguyên liệu giàu cellulose như rơm rạ, bã mía, vỏ trấu,… tiêu biểu là
nghiên cứu “Sản xuất bioethanol nhiên liệu từ rơm rạ” (Trần Diệu Lý, 2008), nghiên
cứu dựa trên cơ sở sử dụng các phương pháp vật lý và hóa học để xử lý nguyên liệu
thô giàu cellulose.
Việc định hướng nguyên liệu là cellulose gặp khó khăn về vấn đề kinh tế và
kỹ thuật. Nguồn nguyên liệu là rơm rạ hay bã mía hiện đang được tận dụng khá triệt
để trong nông nghiệp và trong các nhà máy sản xuất điện nên việc sản xuất bioethanol
từ các loại nguyên liệu kể trên có vẻ như chưa khả thi lắm. Vấn đề tìm nguồn nguyên
liệu thay thế khác lại được đặt ra và vỏ trái cacao (chứa đến 43,9 – 45,2%
carbohydrate) (Samah et al., 2011) đã được xem sét. Vỏ cacao đã được sử dụng trước
đó nhưng chủ yếu là làm phân bón hữu cơ và thức ăn cho gia xúc. Theo báo cáo của
Bùi Thanh Bình (2009) thì vỏ cacao có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho việc
sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, việc phối hợp vỏ cacao với phân hữu cơ mang lại
hiệu quả vượt bậc. Và gần đây nhất là đề tài “Nghiên cứu khả năng thủy phân vỏ trái
cacao ứng dụng trong sản xuất bioethanol sinh học” của Phạm Thiếu Quân, Huỳnh
Xuân Phong và Ngô Thị Phương Dung (2013) trường ĐH Cần Thơ đã tìm thấy tiềm
năng sản xuất bioethanol sinh học từ nguồn phế phẩm nông nghiệp là vỏ trái cacao.

12. Đồ án tốt nghiệp
3
3. Mục tiêu đề tài
Khảo sát một số điều kiện trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời để
tìm ra các thông số cho quá trình lên men bioethanol đạt hiệu quả cao.
4. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát giống nấm men.
Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ cacao.
Khảo sát điều kiện tiền xử lý cho vỏ cacao bằng acid oxalic.
Khảo sát thời gian cho quá trình lên men SHF (làm đối chứng cho quá trình SSF).
Khảo sát một số điều kiện cho quá trình lên men SSF, sử dụng Saccharomyces
cerevisiae
5. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp bố trí thí nghiệm.
Phương pháp phân tích
 Phương pháp phân tích sinh hóa.
Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.
Xác định hàm lượng tro tổng bằng phương pháp nung ở nhiệt độ cao.
Định lượng đường khử bằng phương pháp Miller.
Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher-Hofft.
Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm.
Trích ly pectin bằng nước nóng.
Xác định nồng độ cồn bằng sắc ký cột lỏng cao áp - HPLC.
 Phương pháp xác định mật độ vi sinh.
Phương pháp đếm khuẩn lạc và sử dụng đường tương quan tuyến tính giữa
giá trị đo OD với mật độ tế bào vi sinh.
 Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nhận được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và vẽ biểu đồ bằng
phần mềm Microsoft Excel.
Các số liệu được xử lý bằng chương trình Statgraphics Centurion XV.

13. Đồ án tốt nghiệp
4
6. Các kết quả đạt được của đề tài
Trong suốt quá trình thí nghiệm đã thu thập được kết quả sau:
Việc sử dụng acid oxalic 5 % khi tiến hành tiền xử lý vỏ cacao trong thời gian
2 ngày thu được hàm lượng đường trong dịch đạt 14,67 mg/g
Tiến hành thủy phân bằng cellulase 0,5 % và lên men riêng lẻ SHF thu được
nồn độ cồn cao 4,64 % sau 30 giờ lên men ở điều kiện nhiệt độ phòng.
Tiếp tục lên men theo phương pháp thủy phân và lên men đồng thời SSF thu
được hàm lượng cồn là 5,47 % sau 45 giờ lên men.
Khi bổ sung các chất dinh dưỡng như peptone, glucose, K2HPO4 và MnSO4
trong quá trình lên men nồng độ cồn có sự thay đổi.
7. Kết cấu của đồ án
Đồ án gồm 4 chương.
 Chương 1: Tổng quan tài liệu
Giới thiệu về bioethanol cũng như ưu và nhược điểm của các thế hệ hệ
bioethanol hiện nay, các quá trình biến đổi nguồn nguyên liệu lignocellulose để lên
men bioethanol từ nguồn vỏ cacao. Một số công trình nghiên cứu liên quan về quá
trình lên men SHF và SSF.
 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Trình bày nội dung, sơ đồ hóa các bước thí nghiệm, cách bố trí thí nghiệm và
các phương pháp tiến hành liên quan đến từng nội dung thí nghiệm.
 Chương 3: Kết quả và bàn luận.
Trình bày các kết quả đạt được trong suốt quá trình nghiên cứu.
 Chương 4: Kết luận và kiến nghị

14. Đồ án tốt nghiệp
5
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Giới thiệu về Bioethanol
1.1.1. Khái niệm
 Ethanol
Ethanol, hay còn gọi được gọi bằng các tên khác như rượu Etylic, cồn, Ethyl
alcohol, Ethyl hydrate, Hydroxyethanol, là một chất hữu cơ thuộc dãy đồng đẳng của
rượu no đơn chức, có công thức phân tử: C2H5OH hay C2H6O và có công thức cấu
tạo:
Ethanol có thể được sản xuất bằng các phương pháp tổng hợp hóa học và
phương pháp sinh học. Ethanol được sản xuất theo phương pháp sinh học, được gọi
là bioethanol.
 Bioethanol
Bioethanol hoặc đơn giản là “Ethanol sinh học” là một nguồn năng lượng tái
tạo được tạo ra bằng cách lên men các thành phần đường có trong các phụ phẩm nông
nghiệp thông qua hoạt động của nấm men hay các vật liệu có thể chuyển đổi thành
đường như tinh bột hoặc cellulose từ thực vật nhờ tác dụng của enzyme, mà không
tổng hợp bằng con đường hóa học.
Quá trình lên men đường tạo thành bioethanol và carbon dioxide
C6H12O6  2C2H5OH + 2CO2
Trong quá trình sản xuất bioethanol sinh học có thể phân thành 2 công đoạn
là công đoạn lên men nhằm sản xuất bioethanol có nồng độ thấp và công đoạn làm
khan để sản xuất bioethanol có nồng độ cao để phối trộn vào xăng.
1.1.2. Các thế hệ bioethanol
Hiện nay dựa trên nguồn nguyên liệu sản xuất mà người ta chia bioethanol thành
các thế hệ khác nhau và được trình bày trong bảng 1.1.

15. Đồ án tốt nghiệp
6
Bảng 1.1. Các thế hệ bioethanol
Đặc điểm Ưu điểm Nhược điểm
Tài liệu
tham
khảo
Bioethanol
thế hệ thứ
nhất
Được sản xuất
từ cây trồng có
hàm lượng
đường và tinh
bột cao.
Quá trình sản
xuất đơn giản.
Khủng hoảng
lương thực và
mất cẩn bằng
lương thực
[1]
Bioethanol
thế hệ thứ
hai
Sản xuất từ
sinh khối
lignocellulose
của thực vật
Nhiên liệu bền
vững, chi phí
thấp.
Thân thiện với
môi trường.
Chứa lignin là
một chất khó
phân hủy gây cản
trở quá trình sản
xuất bioethanol
[1], [30]
Bioethanol
thế hệ thứ
ba
Sản xuất từ
các loài tảo
Không chứa
lignin
Hàm lượng
carbohydrate cao
( 50% so với tổng
khối lượng chất
khô)
Khí thải CO2 [1]
1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bioethanol trên thế giới và Việt Nam
1.1.3.1. Thế giới
Bioethanol nhiên liệu được sản xuất tại 34 quốc gia trên 5 châu lục. Sản xuất
chính được tập trung ở Mỹ (54 %) và Brazil (34 %). Mỹ sản xuất chủ yếu là từ ngô,
Mỹ cũng đang đầu tư nhiều cho việc tăng sản lượng bioethanol, hiện chiếm 5 % khối
lượng nhiên liệu bán ra ở Mỹ. Đồng thời dự kiến trong năm 2020 nước này sẽ cung
cấp trên 28 tỷ lít bioethanol và biodesel, chiếm 3,5 % lượng xăng dầu sử dụng [25].
Brazil sản xuất bioethanol từ mía đường, nước này có diện tích đất canh tác
trồng mía cho sản xuất bioethanol lên đến gần 8 triệu ha, 450 nhà máy đường ở Brazil
hầu hết đều sản xuất bioethanol. Ngành công nghiệp bioethanol ở Brazil nhận được
nguồn lực tài chính khổng lồ và những chính sách công phù hợp, ưu đãi khiến cho
sản phẩm xăng sinh học ở đây có sức cạnh tranh lớn nhất thế giới [25]. Phần còn lại
được sản xuất tại các nước châu Âu, Australia, New Zealand và Đông Nam Á, đặc
biệt là Trung Quốc, Thái Lan và Ấn Độ.

16. Đồ án tốt nghiệp
7
EU xếp vị trí thứ 3 về sản lượng bioethanol nhiên liệu sau Hoa Kỳ và Brazil.
Nổi lên trong khu vực châu Á, Trung Quốc đang dần khẳng định và trở thành
nước sản xuất bioethanol lớn trên thế giới với khoảng 2,1 tỷ lít đã được sản xuất vào
năm 2012 (90 % từ ngô), có mục tiêu tăng trưởng đầy tham vọng trong tương lai cho
bioethanol từ thế hệ thứ hai.
Theo báo cáo từ Lux Research thì Chính phủ Trung Quốc đang hỗ trợ rất nhiều
cho ngành công nghiệp nhiên liệu sinh học. Với bioethanol cao cấp (hay còn gọi là
bioethanol cellulosic) hiện đang nhận mức trợ cấp lớn nhất là 1,400 RMB/tấn. Dự
kiến năm 2020, Trung Quốc sẽ sản xuất thêm nhiên liệu sinh học tổng hợp (E10).
Từ năm 2010 đã có 3 nhà máy ở Nhật Bản sản xuất bioethanol (từ thân mía và
rơm rạ lúa mì) và cả nước có trên 2,000 trạm bán xăng sinh học. Trộn 43 % cồn sinh
học với 57 % khí thiên nhiên để tạo thành ethyl tert-butyl ether (ETBE), lại trộn với
90 % xăng để tạo thành xăng sinh học. Nhờ đó mà CO2 thải ra rất ít, có lợi lớn cho
môi trường.
Tại Ấn Độ một chương trình bioethanol dã kêu gọi người dân sử dụng xăng
E5 trên cả nước, tiến tới sử dụng xăng E10 và E20.
Trong khu vực Đông Nam Á, Thái Lan là quốc gia phát triển rất nhanh về sản
xuất và sử dụng xăng pha cồn sản xuất từ phế phẩm của sắn, hạt ngô, cây ngô, đường,
bã mía. Xăng E10 đã bán tại các trạm xăng ở Thái Lan từ năm 2003. Năm 2004, Thái
Lan đã sản xuất trên 280.000 m3
cồn, đầu tư thêm 20 nhà máy để năm 2015 có trên
2,5 tỷ lít cồn dùng làm nhiên liệu.
Bảng 1.2. Tổng sản lượng bioethanol hàng năm trên thế giới (đv triệu Gallon Mỹ)
Quốc gia 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
USA 6,521 9,309 10,938 13,298 13,948 13,300 13,300 14,300
Brazil 5,019 6,472 6,578 6,922 5,573 5,577 6,267 6,190
Europe 570 734 1,040 1,209 1,168 1,179 1,371 1,445
China 486 502 542 542 555 555 696 635
Canada 211 238 291 357 462 449 523 510
Các nước
khác
315 389 914 985 698 752 1,272 1,490
Thế giới 13,123 17,644 20,303 23,311 22,404 21,812 23,429 24,570
“Nguồn: F.O. Licht, cited in Renewable Fuels Association, Bioethanol Industry Outlook 2008-2014”

17. Đồ án tốt nghiệp
8
Theo tổ chức FAO cho biết đến năm 2022, sản lượng bioethanol thế giới dự
báo tăng khoảng 70 % so với mức trung bình của giai đoạn 2010 - 2012 và tăng
khoảng 4 % /năm đạt mức 168 tỷ lít. Ba quốc gia sản xuất bioethanol chính vẫn là
Hoa Kỳ, Brazil và Châu Âu. Tính đến năm 2022, nguyên liệu đầu vào để sản xuất
nhiên liệu sinh học dự kiến tăng như sau: mía đường – 29 %, dầu thực vật – 15 % và
ngũ cốc thô – 12 %.
Tại Hoa Kỳ, tổng sản lượng nhiên liệu sinh học theo yêu cầu của chính phủ sẽ
được duy trì lên tục trong suốt kỳ dự báo, theo đó 40 % tổng sản lượng ngô sẽ được
sử dụng để sản xuất bioethanol. Lượng xe hơi lưu hành tại Brazil gia tăng đồng nghĩa
với nhu cầu sử dụng nhiên liệu tăng, trong đó có bioethanol.
Dự báo đến năm 2022, sản lượng bioethanol sinh học của các nước đang phát
triển tăng khoảng 2/3, tróng đó Brazil chiếm 80 % và 20 % còn lại thuộc về Ấn Độ
và Trung Quốc. Gần 50 % lượng bioethanol do Ấn Độ và Trung Quốc sản xuất sẽ
được tiêu thụ tại thị trường trong nước. Sản lượng bioethanol của Ấn Độ đến năm
2022 dự kiến sẽ tăng gấp đôi, với nguyên liệu chính từ mật đường. Bioethanol tại
Trung Quốc chủ yếu được sản xuất từ sắn và lúa miến trong khi ngô bị hạn chế sử
dụng cho mục đích công nghiệp vì vấn đề an ninh lương thực (xem hình 1.1).
Hình 1.1. Thị phần sản xuất bioethanol sinh học trên thế giới.
Sản lượng tính theo giá trị % của các nước trong năm 2022 [31].

18. Đồ án tốt nghiệp
9
1.1.3.2. Việt Nam
Nhiên liệu sinh học đã được các nhà khoa học chú ý đến từ những năm cuối
của thế kỷ 20 và cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu điều chế
bioethanol sinh học, một số ít được ứng dụng trong thực tiễn còn lại vẫn chưa được
áp dụng nhiều. Một số nghiên cứu còn bỏ ngỏ, chỉ là việc làm tự phát và kết quả chỉ
mang tinh định hướng hoặc học thuật.
Từ sau năm 2000 đã có một số xí nghiệp, công ty, đơn vị nghiên cứu tổ chức
sản xuất nhiên liệu sinh học dưới dạng pilot như công ty Minh Tú (Cần Thơ), ĐH
Bách khoa TP Hồ Chí Minh, Viện Hóa Công Nghiệp Hà Nội, Viện khoa học Vật liệu
Ứng dụng TPHCM… được dư luận quan tâm. Từ đó các khái niệm sản xuất nhiên
liệu sinh học, bioethanol cũng dần rõ ràng và cụ thể hơn.
Ngày 20/11/2007, "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm
nhìn đến năm 2025" đã được Thủ tướng Chính phủ ký quyết định số177/2007/QĐ-
TTG với mục tiêu phát triển năng lượng, một dạng năng lượng mới, tái tạo được thay
thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần bảo đảm an ninh năng
lượng và bảo vệ môi trường. Đến năm 2015, sản lượng bioethanol sinh học và dầu
thực vật đạt 250 nghìn tấn, đáp ứng 1 % nhu cầu xăng dầu của cả nước. Và tầm nhìn
đến năm 2025, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học ở nước ta đạt trình độ tiên tiến
trên thế giới. Sản lượng bioethanol và dầu thực vật đạt 1,8 triệu tấn, đáp ứng khoảng
5 % nhu cầu xăng dầu của cả nước [28].
Để thực hiện chiến lược này, PetroVietNam dự kiến từ 2011 đến 2015 sẽ đưa
3 nhà máy bioethanol sinh học ở Quảng Ngãi, Phú Thọ, Bình Phước vào hoạt động
với tổng công suất 230,000 tấn/năm và từ sản phẩm này sẽ pha thành nhiên liệu E5 -
E10, đáp ứng khoảng 20 % tổng nhu cầu tiêu thụ xăng sinh học cả nước.
Theo TS. Nguyễn Phú Cường, Phó Vụ trưởng Vụ KH&CN Bộ Công Thương
cho biết tính đến tháng 3/2012, cả nước có 5 nhà máy sản xuất bioethanol nhiên liệu
đi vào hoạt động ổn định với công suất thiết kế đạt khoảng 435,000 triệu lít
bioethanol/năm (bảng 1.3). Trong số 4 nhà máy đang hoạt động mới chỉ có 03 nhà
máy của Công ty CP Đồng Xanh, Cty TNHH Tùng Lâm và Công ty CP Nhiên liệu

19. Đồ án tốt nghiệp
10
sinh học miền Trung là sản xuất được bioethanol nồng độ 99,5 % đạt tiêu chuẩn để
pha xăng sinh học.
Sản phẩm được tiêu thụ trong nước khoảng 20 % để phối trộn xăng E5 và bán
theo hệ thống phân phối của Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam (PVN). Phần còn
lại khoảng 80 % sản lượng sản xuất trong năm 2011 được xuất khẩu cho các nước
như Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippine ở dạng 99,5 % và 96 % bioethanol.
Sản xuất nhiên liệu sinh học bioethanol ở Việt Nam cũng được nhiều đối tác
nước ngoài rất quan tâm. Đáng chú ý trong số này là các Dự án JICA - Nhật Bản hỗ
trợ Việt Nam nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học sử dụng các loại phế phẩm bã
mía, rơm rạ, dự án do Chính phủ Hà Lan tài trợ sử dụng trấu, vỏ cà phê, trái điều, vỏ
điều, rong biển; chương trình tổng thể về nghiên cứu và phát triển nhiên liệu sinh học
ở Việt Nam của Hàn Quốc sản xuất diesel sinh học và các hóa chất tinh khiết thân
thiện với môi trường từ dầu thực vật.
Bảng 1.3. Danh sách nhà máy bioethanol sinh học đang sản xuất
TT Tên nhà máy
Công suất
thiết kế
Địa điểm
Tình trạng
hoạt động
1
Nhà máy sản xuất
Bioethanol nhiên liệu –
Cty CP Đồng Xanh
130 triệu
lít/năm
Đại lộc,
Quãng Nam
Đang sản xuất
2
Nhà máy sản xuất
Bioethanol nhiên liệu –
Cty TNHH Tùng Lâm
70 triệu
lít/ năm
Đồng Nai
Đang sản xuất
3
Nhà máy sản xuất
Bioethanol – Cty TNHH
Đại Việt
70 triệu
lít/ năm
Lô CN5 khu
CN Tâm
Thắng, Đăk
Nông.
Đang sản xuất
4
Nhà máy sản xuất
Bioethanol Đăk Tô – Kon
Tum
65 triệu
lít/ năm
Kon Tum Đang sản xuất
5
Nhà máy sản xuất
bioethanol sinh học Dung
Quất ( Cty CP Nhiên liệu
sinh học miền Trung)
100 triệu
lít/năm
Khu kinh tế
Dung Quốc,
Bình Sơn,
Quãng Ngãi.
Bắt đầu sản
xuất vào tháng
2/2012
“Nguồn: Khoa học và công nghệ, số 9 – 08/2012”

20. Đồ án tốt nghiệp
11
1.1.4. Lợi ích, hạn chế và ứng dụng của Bioethanol
Bioethanol có một vài lợi ích và hạn chế như:
1.1.4.1. Lợi ích
 Về môi trường
Bioethanol có nguồn gốc từ thực vật không đóng góp vào quá trình phát thải
CO2 - khí nhà kính. Hàm lượng các khí thải độc hại khác như CO, SOx,
hydrocarbon…đều giảm đi đáng kể khi sử dụng năng lượng sinh học.
 Nguồn nhiên liệu tái sinh
Các nhiên liệu này lấy từ hoạt động sản xuất nông nghiệp và có thể tái sinh.
Tránh sự lệ thuộc vào nguồn tài nguyên nhiên liệu không tái sinh truyền thống.
 Tăng hiệu suất cho xăng và chống cháy nổ.
Bioethanol có chỉ số octan là 113, cao hơn so với xăng khoảng 83 -95 lần.
Chỉ số này cao đồng nghĩa việc hạn chế được hiện tượng tự phát nổ, xảy ra trước
khi đánh lửa, sẽ làm hại động cơ. Mặt khác, nó không chứa các chất khác độc hại
như chì.
 Phát triển kinh tế nông nghiệp.
Việc tận dụng các nguồn phế phẩm, phụ phẩm trong nông nghiệp làm tăng giá trị của
nông sản.
 Bảo đảm an ninh năng lượng
Sử dụng bioethanol làm nhiên liệu thay thế nhiên liệu truyền thống giúp các quốc gia
chủ động về nguồn năng lượng hơn so với nguồn nhiên liệu hoá thạch đang dần cạn
kiệt.
1.1.4.2. Hạn chế của Bioethanol
Hạn chế chủ yếu của bioethanol khi làm nhiên liệu là tính hút ẩm. Bioethanol
có khả năng hút ẩm và hòa tan vô hạn trong nước cao nên cần phải được tồn trữ và
bảo quản đặc biệt.
 Về mặt kỹ thuật
Do nhiệt trị của bioethanol (PCIbioethanol = 26,8 MJ/kg) và các loại ancol khác
đều thấp hơn so với xăng (PCIxăng = 42,5 MJ/kg) nên khi dùng bioethanol để pha trộn

21. Đồ án tốt nghiệp
12
vào xăng sẽ làm giảm công suất động cơ so với khi dùng xăng. Tuy nhiên sự giảm
công suất này là không đáng kể nếu ta pha với số lượng ít.
Mặt khác, để sử dụng được xăng có nồng độ ethanol cao, một số xe cần phải cải biến.
 Khả năng phát triển
Tại thời điểm hiện tại, công nghệ sản xuất cồn sinh học từ các nguồn biomass như
lignocellulose chưa đạt được hiệu suất tốt và giá thành còn cao.
1.1.4.3. Ứng dụng
Bioethanol chủ yếu được ứng dụng trong pha chế xăng sinh học, có thể được
sử dụng dưới dạng nguyên chất (E100) hoặc pha với xăng có nguồn gốc dầu mỏ ở bất
kì tỷ lệ nào để chạy động cơ xăng. Nếu tỷ lệ pha trộn dưới 10 % bioethanol thì không
cần thay đổi các động cơ xe thông thường. Bioethanol là nhiên liệu có chỉ số octan
cao và đã thay thế chì như một chất tăng chỉ số octan trong xăng dầu. Bằng cách pha
trộn bioethanol với xăng, đốt cháy hoàn toàn hơn và giảm lượng khí thải gây ô nhiễm.
1.1.5. Nguồn nguyên liệu lignocellulose
Sinh khối lignocellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, bao
gồm các polysaccharide chủ yếu là cellulose, hemicellulose (xylan) và lignin, trong
đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng
từ 35 % đến 50 % khối lượng khô thực vật, còn hai hợp chất, hemicellulose và lignin
lần lượt chiếm khoảng 20 – 30 % và 5 - 20 % khối lượng khô của cơ thể thực vật (xem
hình 1.2).
Trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi
những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như lignin.
Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với nhau.
Cellulose là một chuỗi polysaccharide dài gồm các đơn vị D-glucose, liên kết
bằng β-1,4 glycoside, cấu trúc của nó có phần tinh thể và những phần vô định hình.
Hemicellulose là một mạng lưới polyme phức tạp, phân nhánh và không đồng
nhất, có chứa đường 5 carbon như xylose và arabinose, 6 carbon như glucose,
mannose và galactose. Nó có trọng lượng phân tử thấp hơn cellulose và vai trò của
nó là để kết nối các sợi lignin và cellulose.

22. Đồ án tốt nghiệp
13
Lignin là một polymer vô định hình do các hợp chất phenolic khác nhau tạo
thành và là thành phần chính của thành tế bào thực vật. Nó giữ cho sợi cellulose và
hemicellulose liên kết với nhau, tăng độ cứng vững và chống thấm cho tế bào.
Hình 1.2. Thành phần của lignocelluloses.
1.2. Quá trình biến đổi bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose.
Quá trình biến đổi bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose được trình bày tóm lược
trong hình 1.3.
Về nguyên tắc, quá trình lên men bioethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa
cellulose cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm bốn bước cơ bản:
 Tiền xử lý nguyên liệu.
 Thủy phân nguyên liệu.
 Lên men bioethanol.
Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy vào nồng
độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau. Chủ yếu dựa vào kỹ thuật công nghệ
hóa học nên trong giới hạn của đề tài xin được không trình bày phần này.

23. Đồ án tốt nghiệp
14
Hình 1.3. Sơ đồ chuyển đổi sinh khối lignocelluolose thành bioethanol.
1.2.1. Quá trình tiền xử lý
Thành phần của nguyên liệu lignocellulose chứa chủ yếu là cellulose, lignin
và hemicellulose. Để chuyển hóa các chất carbohydrate (cellulose và hemicellulose)
trong lignocellulose thành bioethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân
tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa nên bước
tiền xử lý là bắt buộc. Tiền xử lý sẽ thay đổi cấu trúc và kích thước của sinh khối,
cũng như thành phần hóa học của nó, sao cho quá trình thủy phân các hydrocarbon
thành các loại đường đơn diễn ra nhanh chóng và đạt hiệu quả cao.
Mục đích:
- Loại bỏ lignin và hemicellulose, giảm kích thước vi sợi cellulose
- Tăng vùng vô định hình của cellulose
Thủy phân
Lignin
Cellulos
e
Hemicellulos
e
Cellulases Hemicellulases
Đường 5C và 6C
Tiền xử lý
Chưng cất
Lên men
Bioethanol
SSF
Lignin

24. Đồ án tốt nghiệp
15
- Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass
- Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose.
Các phương pháp tiền xử lý :
 Các phương pháp tiền xử lý cơ học.
Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử
lý. Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao,
xử lý thủy nhiệt và nổ hơi…. Trong đó phương pháp nổ hơi là phương pháp đã được
phát triển, áp dụng trên quy mô pilot.
 Các phương pháp tiền xử lý hóa học.
Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình tiền xử lý.
Một số phương pháp tiền xử lý bằng hóa chất được trình bày trong bảng 1.4.
Có khá nhiều phương pháp tiền xử lý, thường dùng nhất là phương pháp
hóa học sử dụng base, acid vô cơ, đôi khi kết hợp phương pháp hóa học với phương
pháp vật lý: Sử dụng acid kết hợp với nhiệt độ,… Phương pháp hiệu quả trên một
lượng cơ chất lớn, đáp ứng khá đầy đủ các yêu cầu như tăng độ xốp, giảm kết tinh,
giảm độ trùng hợp, hòa tan lignin và đường hóa hemicelluloses. Tuy nhiên, phương
pháp này cũng để lộ khá nhiều nhược điểm (bảng 1.5) cần được trung hòa và loại
độc dịch trước khi lên men.

25. Đồ án tốt nghiệp
16
Bảng 1.4. Các phương pháp tiền xử lý hóa học
Phương pháp
tiền xử lý
Đặc điểm Ưu điểm Nhược điểm
Bằng hơi (có
H2SO4, SO2,
CO2)
Hơi nước bão hòa
áp suất cao và giảm
áp 160-2600
C
(0,7- 4,8Mpa).
- Thời gian < 10
phút
Hiệu quả đối với
nguyên liệu thân
gỗ cứng
Phân hủy Xylan
Ức chế vi sinh vật
Với Acid
H2SO4, HCl, …Sử
dụng acid loãng
hoặc nồng độ thấp
Điều kiện trung
bình.
Năng suất cao đối
với xylan thành
xylose.
Hòa tan tốt lignin.
Không tạo ra các
chất ức chế.
Ăn mòn thiết bị.
Độc tố
Khó thu hồi acid
Khá đắt
Với Kiềm
NaOH, Ca(OH)2,
NH3,…
Thủy phân tốt liên
kết giữa lignin và
hemicellulose/cellu
lose
Khó thu hồi kiềm
Độc hại
Dung môi hữu
cơ
Etylen glycol,
MeOH, EtOH,
aceton với HCl
hoặc H2SO4,…
Năng suất xylose
cao.
Khó thu hồi dung
môi.
Khá đắt
Chất lỏng ion
Chất lỏng họ
Imidazolium,..
Hòa tan cellulose
Tái sử dụng
Khá đắt
“Nguồn: Alessandra Verardi, 2012”
Bảng 1.5. Những thuận lợi và bất lợi của phướng pháp tiền xử lý bằng acid vô cơ
Thuận lợi Bất lợi
Tài liệu tham
khảo
Acid
đặc
Hoạt động ở
nhiệt độ thấp.
Năng suất đường
cao
Sử dụng nhiều acid
Ăn mòn thiết bị
Tốn kém cho việc thu hồi acid.
Thời gian phản ứng dài
Taherzadeh và
Karimi ( 2007)
Acid
loãng
Sử dụng ít acid
Thời gian phản
ứng ngắn
Hoạt động ở nhiệt độ cao.
Hiệu suất đường thấp
Ăn mòn thiết bị
Hình thành các sản phẩm không
mong muốn.

26. Đồ án tốt nghiệp
17
 Pháp tiền xử lý sinh học
Bảng 1.6. Các phương pháp tiền xử lý sinh học
Phương pháp
tiền xử lý
Đặc điểm Ưu điểm Nhược điểm
Sinh học
Nấm nâu, nấm
mục trắng,…
Phân hủy lignin
hiệu quả
Yêu cầu năng
lượng thấp
Ức chế vi sinh
vật
Mất cellulose và
năng suất thấp
1.2.2. Quá trình thủy phân.
Ở quá trình thủy phân, đường đơn sẽ được tạo ra bằng việc phân cắt các mắc xích
của cellulose, trước khi chúng được lên men sản xuất rượu.
Các phương pháp thủy phân:
 Thủy phân bằng acid ( acid đặc hoặc acid loãng)
Quá trình thủy phân theo các bước sau:
Bước 1: Acid xâm nhập vào mạng lưới các vi sợi biomass.
Bước 2: Xúc tác quá trình thủy phân.
Bước 3: Giới hạn quá trình thủy phân.
 Thủy phân bằng enzyme
Các giai đoạn enzyme tác dụng lên cellulose:
Bước 1: Hấp phụ enzyme lên bề mặt cellulose.
Bước 2: Enzyme thủy phân cellulose giải phóng glucose.
1.2.3. Quá trình lên men
1.2.3.1. Các phương pháp lên men
Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm đường
hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ được lên
men thành bioethanol nhờ nấm men S. cerevisiae , tổ hợp nhiều loại nấm men hoặc
vi khuẩn (Zymomonas mobilis). Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa
khử diễn ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme. Cho nên, người
ta gọi quá trình lên men là quá trình oxy hóa sinh học.

27. Đồ án tốt nghiệp
18
Bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose thành bioethanol có thể được
thực hiện một cách độc lập (SHF) hoặc đồng thời (SSF) (Xem bảng 1.7)
 Phương pháp thủy phân và lên men riêng lẻ (SHF).
Các sản phẩm thủy phân sẽ được lên men để sản xuất bioethanol trong một quá
trình riêng.
Ưu điểm:
- Hai quá trình thủy phân và lên men tách biệt nhau nên có thể được tối ưu hóa
riêng, không phụ thuộc vào nhau.
Nhược điểm:
- Sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt động của enzyme thủy phân cellulose và
glucose. Điều này làm cho quá trình biến đổi kém hiệu quả, và gây tốn kém
(phải bổ sung thêm một lượng lớn enzyme).
- Dễ nhiễm các vi sinh vật khác do thời gian ủ dài ở quá trình thủy phân.
 Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF)
Các sản phẩm cuối của quá trình thủy phân sẽ được trực tiếp chuyển đổi thành
bioethanol ngay nhờ vi sinh vật.
Ưu điểm:
- Tăng tỉ lệ thủy phân và giảm sự ức chế ngược khi sản phẩm tạo thành.
- Giảm lượng enzyme dùng cho quá trình.
- Cho hiệu suất bioethanol cao.
- Đòi hỏi điều kiện vô trùng thấp.
- Thời gian ngắn.
Nhược điểm:
- Cần phải chọn được điều kiện nhiệt độ và pH gần với điều kiện tối ưu của mỗi
quá trình riêng.
- Bioethanol tạo thành sẽ quay lại ức chế cellulase làm cho lượng bioethanol thu
được không cao.
- Cơ chất thủy phân không hoàn toàn nên lượng đường do cellulase tạo ra chỉ
đủ để cho nấm men tăng trưởng hơn là việc lên men đường sinh bioethanol.

28. Đồ án tốt nghiệp
19
 Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời sử dụng kết hợp nhiều chủng vi
sinh vât (SSCF)
Nói chung, việc sản xuất bioethanol từ nguồn cellulose bao gồm ba bước như
đường hóa các thành phần của cellulose, lên men hexose, và lên men pentose. Các
quá trình này được kết hợp với nhau để đơn giản hóa các bước và tăng cường sản
lượng bioethanol.
SSF là quá trình đồng thời đường hóa các thành phần của cellulose và lên men
hexose nhưng không diễn ra quá trình lên men pentose.
CF là đồng lên men của hexose và pentose.
Như vậy SSCF là quá trình cùng lúc đường hóa các thành phần của cellulose
và lên men đường 5 carbon và 6 carbon nhờ nhiều chủng vi sinh vật.
Các vi sinh vật thường được áp dụng để sản xuất bioethanol sinh học không thể sử
dụng tất cả các nguồn đường có nguồn gốc từ quá trình thủy phân. Ví dụ S. cerevisiae
không thể sử dụng pentose, và điều này sẽ làm lãng phí sinh khối và làm giảm sản
lượng bioethanol sinh học. Do đó trong SSCF sẽ sử dụng kết hợp các chủng vi sinh
có khả năng sử dụng đường 5 carbon và chủng có khả năng sử dụng đường 6 carbon.
Ưu điểm:
- Cải tiến của phương pháp SSF.
- Chi phí thấp, thời gian xử lý ngắn, giảm nguy cơ ô nhiễm và tác dụng ức chế ít
- Hiệu suất lên men bioethanol cao và lên men được cả đường 5 carbon và 6 carbon.
Nhược điểm:
- Nhiệt độ cho quá trình thủy phân enzyme và lên men bioethanol khác nhau đáng
kể, làm cho việc tối ưu hóa đồng thời hai hoạt động rất khó.
- Quá trình SSCF phải được vận hành ở nhiệt độ thấp hơn để phù hợp tăng trưởng
của vi khuẩn và lên men bioethanol.

29. Đồ án tốt nghiệp
20
Bảng 1.7. Các quá trình lên men
Quá trình Đặc điểm Ưu điểm Nhược điểm
SHF
Thủy phân và lên
men riêng lẻ
Thủy phân và lên men
diễn ra ở điều kiện tối
ưu
Tác dụng ức chế
Dễ nhiễm vi sinh vật
khác
SSF
Thủy phân và lên
men đồng thời
Sử dụng ít enzyme.
Sản lượng bioethanol
cao.
Ít tác dụng ức chế.
Chi phí thấp hơn.
Hoặc là thủy phân
hoặc lên men có thể
được thực hiện trong
điều kiện tối ưu.
Khó khăn trong việc
kiểm soát quá trình.
SHCF
Kết hợp những ưu
điểm của SHF và
SSCF
Thủy phân riêng lẻ
và lên men kết hợp
nhiều chủng nấm
men.
Sản lượng bioethanol
sinh học cao.
Thủy phân và lên men
diễn ra ở điều kiện tối
ưu
Sử dụng enzyme
nhiều
Gia tăng nguy cơ ô
nhiễm.
Tác dụng ức chế.
SSCF
Thủy phân và lên
men đồng thời kết
hợp nhiều chủng
nấm men
Thời gian quá trình
ngắn hơn
Sản lượng bioethanol
sinh học cao
Nguy cơ ô nhiễm ít
hơn
Sử dụng enzyme
nhiều
Hoặc là thủy phân
hoặc lên men có thể
được thực hiện trong
điều kiện tối ưu
1.2.3.2. Các giống vi sinh vật trong lên men bioethanol.
Nấm men là đối tượng chủ yếu trong lên men rượu nói chung. Tế bào nấm
men có dạng hình ovan, sinh sản bằng cách nảy chồi hay tạo bào tử, sống kị khí không
bắt buộc, có khả năng lên men các loại đường khác nhau. Trong điều kiện hiếu khí,
nấm men oxy hóa hoàn toàn đường thành CO2 và H2O, gia tăng sinh khối, ngược lại
trong điều kiện kị khí, nấm men sẽ không tăng sinh khối vì không tổng hợp được
sterol cần cho cấu trúc tế bào, nấm men tiến hành lên men đường để thu năng lượng.
Không giống như đường và nguyên liệu tinh bột thông thường, khi thủy phân
sinh khối lignocellulose sẽ cho số lượng đáng kể các loại đường pentose như xylose
và arabinose, ngoài ra còn có đường hexose như glucose, mannose và galactose.

30. Đồ án tốt nghiệp
21
Tuy nhiên, nhiều loại nấm men như Saccharomyces cerevisiae không thể lên
men các loại đường pentose thành bioethanol hiệu quả. Nếu chỉ đường hexose từ sinh
khối lignocellulose được lên men, với các loại đường pentose bỏ lại phía sau, thì việc
tiêu thụ nguyên liệu cho sản xuất bioethanol sinh học sẽ bị hạn chế, cho hiệu suất
thấp và gây lãng phí nguồn nguyên liệu.
 Nấm men và vi khuẩn sừ dụng đường 6 carbon để lên men.
Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có
trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì. Đây là một loại vi sinh vật thuộc chi
Saccharomyces, lớp nấm nang (Ascomycetes), ngành nấm. Loài này có thể xem là
loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay.
Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu và bia.
Trong quá trình thủy phân cellulose có tạo ra đường 5 carbon - xylose thì chủng men
Saccharomyces cerevisiae không thể sử dụng để lên men tạo bioethanol nên hiệu suất
tạo bioethanol không cao.
Vi khuẩn Zymomonas mobilis là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi có thể lên
men glucose thành bioethanol và CO2. Ngoài ra, Z. mobilis có thể chịu được nồng độ
cao như 120 g/L bioethanol, cao hơn nhiều so với các vi khuẩn khác, và sinh khối của
nó thường được công nhận là an toàn (GRAS) cho thức ăn gia súc, làm cho loài này
thích hợp cho kỹ thuật chuyển hóa với khả năng lên men pentose.
 Nấm men và vi khuẩn sừ dụng đường 5 carbon để lên men.
Nấm men Pichia amomala thuộc họ nấm men và có khả năng sử dụng glucose
và xylose để chuyển hóa thành bioethanol tăng hiệu suất cho quá trình lên men.

31. Đồ án tốt nghiệp
22
1.3.Giới thiệu về cây Cacao
1.3.1. Tên khoa học của cây cacao
Theo phân loại của hệ thống APG II thì cây cacao thuộc phân họ Byttnerioideae
của họ Cẩm quỳ (Malvaceae).
Giới (regnum): Plantae
Bộ (ordo): Malvales
Họ (familia): Malvaceae
Phân họ (subfamilia): Byttnerioideae
Chi (genus): Theobroma
Loài (species): T. cacao
Danh pháp hai phần: Theobroma cacao L.
1.3.2. Thành phần và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái cacao
Những nghiên cứu khoa học đã và đang được thực hiện đều hướng đến sự phát
triển bền vững của xã hội. Một trong những sự phát triển bền vững đó là sử dụng
nguồn cung cấp đường từ vỏ cacao chuyển hóa vi sinh để tạo ra bioethanol sinh học.
Điều đó sẽ giải quyết các vấn đề về ô nhiễm môi trường và chất thải nông nghiệp.
Bảng 1.8. Thành phần vỏ cacao khô
Thành phần Trung bình (% trọng lượng khô)
Celluloses 35,4 ± 0,33
Hemicelluloses 37,0 ± 0,50
Lignin 14,7 ± 0,35
Tro 12,3 ± 0,23
“Nguồn: Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2013”.

32. Đồ án tốt nghiệp
23
1.3.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cacao ở nước ta.
Cây cacao đã du nhập vào Việt Nam từ lâu và được trồng rải rác ở
nhiều vùng địa lý khác nhau từ đồng bằng sông Cửu Long đến cao nguyên
Nam Trung bộ. Vì nhiều lý do khác nhau, trước đây cacao ở Việt Nam chưa
bao giờ được trồng đến quy mô lớn. Vào thập niên 80, với sự khuyến khích
của Nhà Nước, cacao được trồng rộng rãi ở các tỉnh miền Trung và miền Nam.
Tuy nhiên vào thời điểm đó, các doanh nghiệp Nhà Nước hỗ trợ cho chương
trình này không xây dựng được một kênh thu mua và thị trường cho sản phẩm
nên toàn bộ ngành sản xuất cacao đã sụp đổ.
Năm 2005, Ban Điều phối Phát triển Cacao Quốc gia được Bộ Nông Nghiệp
và Phát Triển Nông Thôn thành lập nhằm giúp Bộ định hướng phát triển cho ngành
cacaoViệt Nam. Cũng trong năm 2005, Bộ KH và CN cũng đã ban hành Tiêu chuẩn
hạt cacao Việt Nam nhằm giúp người sản xuất có cơ sở để sản xuất hạt cacao chất
lượng cao. Năm 2006, lần đầu tiên 8 dòng cacao thương mại trong bộ giống do
Trường Đại học Nông lâm TP.HCM khảo nghiệm được Bộ NN và PTNT công
nhận và cho phép trồng rộng rãi trên toàn quốc. Đây là 2 sự kiện có ý nghĩa về
mặt pháp lý để cacao trở thành cây trồng chính trong hệ thống canh tác ở Việt
Nam.
Việt Nam có hơn 20500 ha cacao, trong đó gần 7000 ha thu hoạch, sản lượng
trên 4800 tấn/năm. Có 15 tỉnh trồng Cacao, chủ yếu là vùng đồng bằng sông Cửu
Long (Bến Tre, Tiền Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Cần Thơ),
Đông Nam Bộ (Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình phước, Bình Thuận), Tây
Nguyên ( Đắc Lắc, Đắc Nông, Lâm Đồng, Gia Lai) và một số tỉnh duyên hải Nam
Trung Bộ. Trong đó, Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích cây Cacao lớn nhất
(khoảng 12,100 ha), Tây Nguyên (4,500ha), Đông Nam bộ (3,400 ha). Cacao Việt
Nam cho năng suất hơn 7 tạ hạt/ha, mỗi vụ cho sản lượng khoảng 4,900 tấn/ha. Gần
đây, đầu ra của hạt cacao Việt Nam rất thuận lợi, có hàng chục doanh nghiệp trong
và ngoài nước chuyên thu mua với giá trên 50 nghìn đồng/kg. Đặc biệt, cả nước có
hơn 600 hộ dân trồng 541 ha cây cacao đạt tiêu chuẩn UTZ (tiêu chuẩn Quốc tế chứng

33. Đồ án tốt nghiệp
24
nhận sản xuất tốt). Trong năm 2011, cả nước đã xuất khẩu được 240 tấn hạt cacao,
đạt kim ngạch xuất khẩu 520 nghìn USD. So với nhiều loại cây ăn quả khác, cacao
dễ trồng, thích nghi với nhiều loại đất khác nhau, thường thì sau 18 tháng trồng cây
cacao bắt đầu cho trái.
Tiền Giang có 5 huyện là: Chợ Gạo, Gò Công Tây, Tân Phú Đông, Châu Thành
và thành phố Mỹ Tho đã trồng loại cây này và đang phát huy hiệu quả. Giữa tháng
11/2011, 147 ha cây cacao của các nhà vườn tại huyện Chợ Gạo được tổ chức
HELVETAS (Thụy sĩ) cấp giấy chứng nhận UTZ.
Theo kế hoạch phát triển cacao thì đến năm 2015 diện tích cacao của
cả nước sẽ là 60,000 ha với sản lượng hạt khô khoảng 52,000 tấn và đến năm
2020 diện tích sẽ đạt 80,000 ha, sản lượng 108,000 tấn. Tuy nhiên, tính đến
tháng 11/2009, cả nước mới chỉ trồng được 12,207.6 ha cacao tại 17 tỉnh ở
Miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên với sản lượng hàng năm khoảng 1,000
tấn. Các tỉnh trồng nhiều cacao hiện nay là Bến Tre 4,900 ha, Đăk Lăk 1,483
ha, Bình Phước 1,360 ha, Tiền Giang 1,335.7 ha…
Hiện nay, lượng vỏ trái cacao sau khi thu hoạch hạt một phần được nông
dân làm thức ăn cho gia súc, phơi khô để đốt, một phần được bón lại trực tiếp
cho cây cacao còn phần lớn được thải bỏ ra ngoài sông, là nguồn gây ô nhiễm
môi trường rất lớn.
Với khối lượng vỏ chiếm khoảng 60 % khối lượng trái cacao, thì đây là
một lượng nguyên liệu rất lớn nếu ta biết tận dụng để sản xuất các sản phẩm
như thức ăn gia súc, phân bón hữu cơ hay sử dụng vỏ cacao để chuyển hóa thành
rượu bioethanol sử dụng làm nhiên liệu sinh học là tiềm năng tương lai cho ngành
năng lượng xanh ở nước ta khi bước tới trở thành một nước phát triển.
1.4. Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới
Tình hình nghiên cứu về biothenol từ các nguồn nguyên liệu khác nhau trên thế giới
được trình bày trong bảng 1.9

34. Đồ án tốt nghiệp
25
Bảng 1.9. Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới
Năm Tác giả Đối tượng
PP
lên
men
Kết quả
Tài
liệu
tham
khảo
2011
Pilanee
Vaithanomsat
và cộng sự
Vỏ dừa
SHF
và
SSF
Bioethanol theo SHF:
21,21 % trọng lượng
khô.
Bioethanol theo SSF:
20,67 %.
[18]
2011
G.Lalitha,
Rajeshwari
Sivaraj
Vỏ trái cây
hỗn hợp
SHF 330 mg/L [10]
2012
Jayant
Mishra và
cộng sự
Vỏ cam,
chanh, dứa
SSF
Bioethanol đạt Dứa 1,87
% (v/v)
Cam 1,32 % (v/v)
Chanh 1,46 % (v/v)
[13]
2013
Rakesh
Koppram và
cộng sự
Lõi ngô SSCF 4% (w/v) bioethanol [19]
2013
J. Itelima và
cộng sự
Vỏ chuối SSF
Bioethanol đạt 7,45 %
(v/v)
[12]
2013
Ibrahim
Nasser
Ahmed và
cộng sự
Vỏ cây
Melaleuca
leucadendr
on
SSF
Nồng độ bioethanol từ
43,7 – 63,2 g/l
[11]
2013
Manas
Ranjan
Swain, Jyoti
Mishra and
Hrudayanath
Thatoi
Bột khoai
tây
SSF
Bioethanol thu được 172
g / kg chất khô.
[15]
2014
Alessia
Tropea và
cộng sự
Vỏ dứa SSF
Bioethanol đạt 3,9 %
(v/v)
[ 8 ]
2014
Shubhra
Tiwari và
cộng sự
Quả hồng
xiêm
SSF
Bioethanol đạt 9,4%
(v/v)
[21]
2014
Masahide
Yasuda và
cộng sự
Cỏ Napie SSCF
Hiệu suất bioethanol là
74%
[16]

35. Đồ án tốt nghiệp
26
1.5. Giới thiệu về nấm men Saccharomyces cerevisiae
1.5.1. Phân loại khoa học
Giới: Fungi.
Ngành: Ascomycota
Phân ngành: Saccharomycotina
Lớp: Saccharomycetes
Bộ: Saccharomycetales
Họ: Saccharomycetaceae
Giống: Saccharomyces
Loài: S.cerevisiae
Danh pháp hai phần: Saccharomyces cerevisiae
1.5.2. Đặc điểm hình thái
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng,
có kích thuớc từ 5 - 6 µm đến 10-14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử.
Nguồn dinh dưỡng carbon chủ yếu của chúng là đường glucose, galactose,
saccharose, maltose. Chúng sử dụng acid amin và muối amon như nguồn nitơ chính.
Saccharomyces cerevisiae có đặc điểm:
Nấm men chỉ phát triển trong môi trường lên men, cường lực lên men rất nhanh
và mãnh liệt. Đặc điểm nổi bậc của nấm men này là sinh ra nhiều khí CO2, một số
giống Saccharomyces có chứa enzyme α - galactosidase nên lên men hoàn toàn
đường rafinose, còn đối với một số khác thì một số ít chủng có khả năng chuyển hóa
đường rafinose thành CO2 và H2O và chỉ chuyển hóa được 1/3 đường rafinose.
Hình 1.4. Nấm men Saccharomyces cerevisiae

36. Đồ án tốt nghiệp
27
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài: từ 25/5/2015 đến ngày 15/8/2015.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm nhiên liệu sinh học và Biomass, trường ĐH Bách Khoa
TP.HCM.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Các nghiên cứu được thực hiện trên nguyên liệu vỏ cacao, được cung cấp bởi
Hợp tác xã cacao Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang.
Cacao được chọn là trái đã chín, vỏ cacao tươi được sấy khô rồi nghiền nhỏ,
sàng thu dạng bột để tiến hành lên men tạo bioethanol.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu
 Vi sinh: Saccharomyces cerevisiae trong bộ sưu tập ATCC của Hoa Kỳ.
 Enzyme: Viscozym cassava của công ty BrennTag cung cấp.
 Hóa chất:
- H2SO4
- Sodium Hydroxide NaOH
- Thuốc thử DNS
- Thuốc thử Anthrone
- Cồn
- Acid oxalic
- D-glucose
- Peptone
- Agar
 Môi trường hoạt hóa và nhân giống nấm men Sabouraud’s Dextrose Broth
(SDB):
- D-glucose: 40g
- Peptone: 10g
- Nước cất: 1000 mL
 Môi trường nuôi cấy nấm men Sabouraud’s Dextrose Agar (SDA)
- D-glucose: 40g
- Peptone: 10g
- Argar: 22g
- Nước cất: 1000 mL.

37. Đồ án tốt nghiệp
28
2.3.2. Dụng cụ và thiết bị
Thiết bị dùng trong nghiên cứu:
- Nồi hấp tiệt trùng Autoclave
- Tủ sấy
- Tủ lạnh
- Máy đo quang phổ UV-vis
- Cân kỹ thuật
- Máy khuấy
- Nồi đun
- Máy xay cầm tay
- Brix kế
- Cồn kế
- Máy sắc kí cột lỏng HPLC
- Bếp khuấy từ.
Dụng cụ dùng trong nghiên cứu:
- Bình định mức 50 mL.
- Bình định mức 100 mL.
- Bình định mức 500 mL.
- Bình định mức 1000mL.
- Erlen 100 mL.
- Erlen 250 mL.
- Becher 100 mL.
- Becher 250 mL.
- Becher 500 mL.
- Ống đong 250 mL.
- Ống đong 25 mL.
- Pipet 20 mL.
- Pipet 10 mL.
- Pipet 1 mL.
- Pipet bầu 3mL.
- Micropipet 1000µL, 100µL.
- Cuvet.
- Chai thủy tinh.
- Đũa thủy tinh.
- Phễu nhựa.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Đề tài được bố trí thực hiện các thí nghiệm theo sơ đồ hình 2.1.

38. Đồ án tốt nghiệp
29
2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Sơ đồ quá trình lên men thu nhận bioethanol từ vỏ cacao gồm các bước được trình
bày ở hình 2.1.
Hình 2.1.Sơ đồ quá trình thực hiện thí nghiệm.
2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Dựa vào sơ đồ bố trí thí nghiệm hình 2.1 tiến hành các thí nghiệm sau.
2.4.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát giống nấm men.
Nội dung 1: Quan sát đại thể giống nấm men.
Giống nấm men sau khi được hoạt hóa được pha loãng đến nồng độ thích hợp
và cấy trãi vào các đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy SDA, ủ ở nhiệt độ phòng trong
2-3 ngày. Quan sát hình dạng khuẩn lạc của nấm men.
Nội dung 2: Quan sát vi thể giống nấm men.
Tế bào nấm men được nhuộm với thuốc thử xanh Methylen và cố định trên lame, sau
đó quan sát hình dạng, đặc điểm vi thể nấm men bằng kính hiển vi.
Hàm lượng pectin thô
Chất dinh
dưỡng
NGUYÊN LIỆU
TIỀN XỬ LÝ
THỦY PHÂN
Đường khử
Độ ẩm (%) + Tro tổng
Hàm lượng cellulose
Hàm lượng lignin
Acid oxalic
5%
THỦY PHÂN VÀ
LÊN MEN
Enzym
e
Enzym
e
Giống
VSV
LÊN MEN
BIOETHANOL
Giống
VSV
− Vi thể
− Đại thể
− Đường cong tăng
trưởng

39. Đồ án tốt nghiệp
30
Nội dung 3: Xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và độ hấp thu OD.
Nguyên tắc: Dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử không tan lơ lững trong
pha lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiện diện của các phần tử
lơ lững làm phân tán chùm ánh sáng tới.
Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cản ánh
sáng làm phân tán chùm sáng tới đồng thời làm môi trường đục. Độ đục của huyền
phù tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy, có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián
tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sóng 610nm.
Cách tiến hành:
Pha loãng môi trường SDB đã nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae cần kiểm
nghiệm có mật độ tế bào bất kì thành các dịch huyền phù có độ đục đo OD ở bước
sóng 610nm đạt các giá trị lân cận 0,1 – 0,2 – 0,3 – 0,4 và ghi nhận các thông số vừa
đo.
Dùng phương pháp cấy trãi trên đĩa petri đã có môi trường SDA, đếm số khuẩn
lạc phát triển trong đĩa từ đó ta có được số tế bào nấm men sống. Tính giá trị
log(cfu/mL) cho mỗi giá trị mật độ cfu/mL tương ứng với độ đục trên. Vẽ được đường
tương quan tuyến tính của log(cfu/mL) tương ứng các giá trị độ đục đo được theo OD
ở 610nm với trục tung là log(cfu/mL) và trục hoành là các giá trị độ đục của dịch môi
trường đo ở OD ở 610nm.
Xác định mật độ tế bào theo trị số OD 610nm của các mẫu có tế bào vi sinh vật
tương ứng cần đo được, kết hợp đồ thị vừa lập cho phép xác định nồng độ tế bào
trong dịch huyền phù nuôi.
Nội dung 4: Xây dựng đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae.
Sau khi xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD của S.cervisiae
xong ta suy ra được phương trình đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD của
S.cerevisiae. Chuẩn bị khảo sát tại 25 mốc thời gian từ 0 giờ đến 72 giờ, mỗi mốc
thời gian tiến hành lặp lại 3 lần với 3 bình nuôi cấy, mỗi bình chứa 20ml môi trường
SDB đã được hấp tiệt trùng. Cứ mỗi 3 giờ lấy 3 bình khảo sát độ hấp thụ OD.

40. Đồ án tốt nghiệp
31
Từ giá trị OD đo được và phương trình đường tương quan giữa mật độ tế bào
và OD của S.cervisiae tính được mật độ tế bào trung bình tại mỗi mốc thời gian từ
đó vẽ được đường cong sinh trưởng của S.cervisiae.
2.4.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ cacao khô.
Nội dung 1: Độ ẩm xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.
Nội dung 2: Độ tro tổng xác định bằng phương pháp nung ở nhiệt độ cao.
Nội dung 3: Đường khử được xác định bằng phương pháp Miller.
Nội dung 4: Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher - Hofft.
Nội dung 5: Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm.
Nội dung 6: Pectin thô được xác định theo phương pháp trích ly bằng nước nóng.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo.
2.4.2.3. Thí nghiệm 3: Tiền xử lý nguyên liệu với acid oxalic.
Tiền xử lý giúp loại bỏ lignin, đường hóa một phần hemicellulose, giải phóng
cellulose. Trên cơ sở những nghiên cứu trước của Lê Thị Kim Anh (2014), tiến hành
tiền xử lý nguyên liệu với acid hữu cơ đem lại hiệu quả cho quá trình lên men. Nên
chọn acid oxalic 5% là một acid yếu để làm tác nhân tiền xử lý trong đề tài này.
Bên cạnh đó tỉ lệ nguyên liệu hợp lí bao giờ cũng là điều kiện thích hợp cho tất
cả các quá trình, theo các nghiên cứu trước khi tiến hành tiền xử lý bằng NaOH với
tỉ lệ 1:10 [6] thu được hàm lượng đường khử cao tuy nhiên ở vỏ cacao khi tiền xử lý
bằng acid oxalic, dung dịch rất đặc và nhớt do trong vỏ cacao có chứa nhiều pectin
không thể khuấy trộn đều được, ảnh hưởng đến các quá trình lên men tiếp theo. Do
đó phải tăng thể tích dung môi lên là 1:20.
Nội dung: Tiền xử lý bằng acid oxalic 5 %, tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:20
Tác chất
Điều kiện
Nồng độ sử dụng Thời gian (ngày) Nhiệt độ
Acid oxalic 5% (v/v) 2
Phòng + khuấy
150 vòng/phút
Nguyên liệu sau khi tiền xử lý thì tiến hành xác định hàm lượng đường khử (mg/g
hoặc mg/mL), cellulose (mg/g hoặc mg/mL), hàm lượng lignin (%).

41. Đồ án tốt nghiệp
32
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo.
2.4.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình thủy phân nguyên liệu.
Nguyên liệu sau khi tiền xử lý sẽ được đem đi chỉnh pH và tiến hành thủy phân.
Nội dung: Đề tài này chỉ tập trung vào quá trình lên men SSF nên không khảo sát lại
các thông số trong quá trình thủy phân, mà chỉ kiểm tra lại khả năng thủy phân của
cellulase trên cơ chất là vỏ cacao. Vì vậy chọn điều kiện thủy phân tiến hành ở nhiệt
độ phòng, tỉ lệ enzyme cellulase : dịch thủy phân 0,5 % (v/v), pH= 5 – 5,5, trong 48
giờ, tỉ lệ cơ chất 5% (w/v).
2.4.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian lên men ảnh hưởng đến quá trình SHF
Nguyên liệu sau khi thủy phân bằng enzyme được mang đi hấp khử trùng (1210
C, 1
atm, 10 phút) để bức hoạt enzyme cũng như tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm
trong quá trình lên men.
Nội dung: Khảo sát thời gian lên men thích hợp, tiến hành lên men trong 48 giờ
giờ, mỗi nghiệm thức cách nhau 5 giờ.
Cố định ban đầu các yếu tố khác như sau:
 Nhiệt độ phòng
 Cellulase 0,5% (v/v)
 pH~ 5
 Dịch nấm men 5% (v/v).
 Khuấy 150 vòng/phút.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo.
2.4.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình SSF.
Lên men sau thủy phân hay còn gọi là quá trình lên men và thủy phân riêng rẻ
được khảo sát lại các yếu tố cơ bản dựa theo các nghiên cứu trước nhằm so sánh, đánh
giá hiệu quả lên men so với quá trình lên men và thủy phân đồng thời.
Theo đó, mẫu sau tiền xử lý được khử trùng trong autoclave ở 1210
C trong 20
phút, sau đó bổ sung nấm men có mật độ 108
cfu/mL và enzyme cellulase 0,5 % cho
lên men ở nhiệt độ phòng, pH ~ 5,0 và kiểm tra nồng độ cồn ở những khoảng thời
gian khác nhau. Thí nghiệm được tiến hành theo bảng 2.1.

42. Đồ án tốt nghiệp
33
Bảng 2.1. Bảng thực hiện thí nghiệm lên men SSF
Nghiệm
thức
Thời gian
(giờ)
Nhiệt
độ (0
C)
Tỉ lệ
giống
nấm
men
(%)
Tỉ lệ
enzyme
(%)
Tốc độ
lắc
(vòng/
phút
Thành phần
chất dinh
dưỡng bổ
sung (%)
116 0, 5,10,…72
Nhiệt độ
phòng
5 0,5 150
–
17 20
Thời gian
tối ưu (topt)
 Phòng
 300
C
 350
C
 400
C
5 0,5 150 –
2124
Thời gian
tối ưu
(Topt)
Nhiệt độ
tối ưu
(t0
opt)
 3 %
 5 %
 7 %
 9 %
0,5 150 –
25 28
Thời gian
tối ưu
(Topt)
Nhiệt độ
tối ưu
(t0
opt)
Tỉ lệ
nấm
men tối
ưu
 0,3 %
 0,5 %
 0,7 %
 0,9 %
150 –
29  32
Thời gian
tối ưu
(Topt)
Nhiệt độ
tối ưu
(t0
opt)
Tỉ lệ
nấm
men tối
ưu
Tỉ lệ
enzyme
tối ưu
 50
 100
 150
 200
–
33  36
Thời gian
tối ưu
(Topt)
Nhiệt độ
tối ưu
(t0
opt)
Tỉ lệ
nấm
men tối
ưu
Tỉ lệ
enzyme
tối ưu
Tốc độ
vòng
thích
hợp
 Pepton 1
 Pepton 2
 Pepton 3
 Pepton 4
37  40
Thời gian
tối ưu
(Topt)
Nhiệt độ
tối ưu
(t0
opt)
Tỉ lệ
nấm
men tối
ưu
Tỉ lệ
enzyme
tối ưu
Tốc độ
vòng
thích
hợp
 Glucose 1
 Glucose 2
 Glucose 3
 Glucose 4
41  44
Thời gian
tối ưu
(Topt)
Nhiệt độ
tối ưu
(t0
opt)
Tỉ lệ
nấm
men tối
ưu
Tỉ lệ
enzyme
tối ưu
Tốc độ
vòng
thích
hợp
 K2HPO4 0,1
 K2HPO4 0,2
 K2HPO4 0,3
 K2HPO4 0,4
45  48
Thời gian
tối ưu
(Topt)
Nhiệt độ
tối ưu
(t0
opt)
Tỉ lệ
nấm
men tối
ưu
Tỉ lệ
enzyme
tối ưu
Tốc độ
vòng
thích
hợp
 MnSO4 0,01
 MnSO4 0,02
 MnSO4 0,03
 MnSO4 0,04

43. Đồ án tốt nghiệp
34
2.5. Các phương pháp phân tích.
2.5.1. Phương pháp vi sinh.
2.5.1.1. Phương pháp giữ giống.
Chuẩn bị môi trường SDA có chứa agar. Rót dung dịch vào ống nghiệm và hấp khử
trùng ở 1210
C, 1 atm, 20 phút. Sau đó để nghiêng ống nghiệm cho đến khi agar đông
lại.
Tiến hành cấy giống nấm men từ ống giống gốc sang môi trường thạch nghiêng đã
được chuẩn bị sẵn từ trước. Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vi sinh tránh
bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lê men
sau này.
2.5.1.2. Phương pháp hoạt hóa và nhân giống giống nấm men
Giống nấm men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống
trước khi đưa vào lên men. Ở quy mô phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành nhân giống
qua các bước:
- Giai đoạn 1: Sau khi nấm men đã phát triển tốt trên môi trường thạch nghiêng,
tiến hành cấy ria sang đĩa petri chứa môi trường SDA, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng.
- Giai đoạn 2: Nhân giống cấp 1: Nấm men sau khi được tăng sinh trên môi trường
SDA thì sẽ hình thành các khuẩn lạc riêng lẻ, lấy 1 khuẩn lạc rời cấy vào ống
nghiệm chứa 10mL môi trường SDB đã được hấp tiệt trùng. Nuôi ở nhiệt độ
phòng trong 24 giờ.
- Giai đoạn 3: Nhân giống cấp 2: Chuyển ông nghiệm nhân giống cấp một vào 90
mL môi trường SDB nuôi ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Giống nấm men sau khi nhân giống cấp 2 đạt đủ sinh khối sẽ được dùng để lên
men bioethanol. Trước khi giống này được sử dụng cho đợt lên men sau thì cần hoạt
hóa trươc 18 - 24 giờ trong môi mới để nấm men phát triển sinh khối và có hoạt lực
trở lại.

44. Đồ án tốt nghiệp
35
2.5.1.3. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc:
Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn
lạc mọc trên môi trường thạch, qua đó xác định được số tế bào sống.
Tiến hành:
 Pha loãng mẫu: Pha loãng mẫu theo các dãy số thập phân thích hợp như: 10-1
,
10-2
, 10-3
, 10-4
, 10-5
..., chọn ba nồng độ pha loãng thích hợp nhất.
 Cấy mẫu: Dùng micropipet hút 0,1 mL dịch mẫu đã pha loãng cho vào mỗi đĩa
thạch. Khi tất cả các thể tích 0,1 mL dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau
đều đã được chuyển lên bề mặt thạch của đĩa Petri, sử dụng que cấy gạt bằng
thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch.
 Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 350
C và ủ trong 48 giờ.
 Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số
lượng tế bào trong 1mL mẫu theo công thức. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc
đếm được từ 25 – 250 để tính toán.
Mật độ tổng của nấm men.
A =
N
n1.V.f1+⋯+ni.V.fi
(
cfu
mL
)
Trong đó:
A: Số tế bào (cfu) nấm men trong 1mL mẫu.
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
ni: Số lượng đĩa cấy tại mỗi độ pha loãng thứ i.
V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa.
fi: Độ pha loãng tương ứng.
Đặc biệt:
- Nếu ở độ pha loãng cao nhất trong dãy các ống nghiệm nói trên, số khuẩn lạc
đếm được trên 1 đĩa > 250 thì kết quả ghi là > 2,5.107
cfu/mL.
- Nếu độ pha loãng thấp nhất trong dãy các ống nghiệm nói trên, số khuẩn lạc đếm
được trên 1 đĩa < 25, kết quả ghi là < 2,5.103
cfu/mL.

45. Đồ án tốt nghiệp
36
2.5.2. Phương pháp hóa lý
2.5.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm
Nguyên tắc: Dùng nhiệt nóng của tủ sấy làm bay hết nước trong mẫu.
Tiến hành:
- Lấy một cốc sứ đem đi sấy đến khối lượng không đổi
- Cân a (g) mẫu (m1)
- Cho mẫu vừa cân vào cốc sứ đã sấy đến khối lượng không đổi, cân khối lượng
cốc chứa mẫu (m2).
- Mang cốc chứa mẫu đi sấy khô ở nhiệt độ 1050
C đến khối lượng không đổi. Cân
chính xác khối lượng cốc chứa mẫu sau khi sấy (m3).
Tính toán:
Cách tính hàm ẩm: W =
m2−m3
m1
x 100%.
2.5.2.2. Xác định hàm lượng tro toàn phần.
Nguyên tắc: Dùng sức nóng (500 – 6500
C) của tủ nung để nung cháy hoàn toàn các
chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong vỏ.
Tiến hành:
Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 500 – 6500
C đến trọng lượng không đổi. Để
nguội ở bình hút ẩm, cân phân tích chính xác đến 0,0001 g.
Cho vào chén 5 g mẫu. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác như trên.
Cho vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ lên đến 550 – 6000
C, nung cho đến tro trắng
(khoảng 6 – 7 giờ). Trường hợp tro còn đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2
hoặc HNO3 đậm đặc và nung cho đến tro trắng.
Để nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác như trên.
Tính kết quả:
Hàm lượng tro toàn phần theo phần trăm (X) tính bằng công thức:
X =
𝐆𝟑−𝐆𝟏
𝐆𝟐−𝐆𝟏
x 100%

46. Đồ án tốt nghiệp
37
Trong đó:
G1: Trọng lượng của chén (g).
G2: Trọng lượng của chén và trọng lượng mẫu thử (g).
G3: Trọng lượng của chén và tro trắng sau khi nung đến khối lượng không
đổi (g).
2.5.2.3. Phương pháp xác định đường khử bằng phương pháp Miller.
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3,
5 -dinitrosalycylic acid (DNS). DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử
thành acid 3 - amino - nitrosalycylic có màu đỏ cam khi đun nóng hỗn hợp phản ứng.
Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một
phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu UV-Vis.
Dựa theo đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm
lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất
trong khoảng bước sóng 540 nm.
Tiến hành:
 Chiết xuất đường trong vỏ cacao (xác định đường khử trong vỏ tươi, khô).
- 5g mẫu cacao khô đã nghiền nhỏ cho vào becher 100mL + 30mL cồn 960 → đun
cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn
lấy phần trong).
- Cho tiếp 10 mL cồn 80o
vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi đun
cách thủy → để nguội → lọc (lặp lại 2 lần).
- Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (80o
)
- Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ.
Sau khi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.
- Cặn khô trong cốc được pha loãng thành thể tích V = 50mL với nước cất ta được
dung dịch đường gốc. Pha loãng dung dịch đường gốc với một hệ số pha loãng n
thích hợp.

47. Đồ án tốt nghiệp
38
 Chuẩn bị dung dịch đo quang phổ.
- Cho 3mL dung dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm,
thêm 1mL thuốc thử DNS.
- Đun cách thủy hỗn hợp trong 15-20 phút. Làm lạnh nhanh về nhiệt độ phòng
rồi đo OD ở bước sóng 540nm.
- Từ giá trị OD đo được, dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose suy ra hàm lượng
đường khử trong mẫu.
Tính toán kết quả:
D =
X × n × V
m
(mg/g)
Trong đó:
X (mg/mL) đường khử trong dung dịch đường pha loãng.
n: hệ số pha loãng
V: Thể tích dịch đường gốc (mL)
m: Khối lượng mẫu cân (g).
2.5.2.4. Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher-Hofft
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa cellulose với thuốc thử
anthrone có màu vàng trong dung dịch acid H2SO4 đặc sẽ tạo màu xanh từ nhạt đến
đậm đến nâu khi đun nóng hỗn hợp phản ứng. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng
tỉ lệ thuận với nồng độ cellulose trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy
quang phổ so màu UV-Vis.
Dựa theo đồ thị chuẩn cellulose với thuốc thử, sẽ tính được hàm lượng
cellulose của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất ở bước
sóng 630 nm.
Tiến hành:
Cho 1mL dịch mẫu (pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm, thêm
10 mL thuốc thử Anthrone.

48. Đồ án tốt nghiệp
39
Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 - 7 phút. Làm lạnh nhanh về nhiệt độ phòng
rồi đo OD ở bước sóng 630nm.
Từ giá trị OD thu được, dựa vào đồ thị đường chuẩn cellulose suy ra hàm
lượng cellulose trong mẫu.
2.5.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng Lignin
 Chuẩn bị mẫu.
Cân chính xác 0,3 g ± 0,01 g mẫu bỏ vào chai 100mL có nắp vặn, thêm 3mL
± 0,01mL acid H2SO4 72 %. Đặt chai nắp vặn vào bể ổn nhiệt ở 300
C ± 30
C trong 60
± 5 phút. Dung dịch phản ứng luôn luôn phải được khuấy từ.
Sau 60 phút thủy phân, pha loãng acid tới nồng độ 4 % bằng cách thêm 84mL
± 0,04mL nước cất. Trộn mẫu bằng cách đảo ngược chai nhiều lần để loại bỏ sự tách
pha giữa các lớp acid nồng độ cao và thấp.
Hấp khử trùng ở 1210
C trong 60 phút.
 Phân tích lignin không hòa tan trong acid:
- Nung crucible (cốc lọc chân không) ở 6000
C trong ít nhất 4 tiếng, sau đó bỏ vào
hộp hút ẩm để nguội trong 2 tiếng rồi đem cân trọng lượng, ghi trọng lượng tới
0,1mg.
- Lọc mẫu bằng phương pháp lọc chân không, chuyển 50mL dịch lọc vào bình
bảo quản mẫu, dịch này sẽ dùng để đo lignin hòa tan. Dịch này phải được đo
trong vòng 6 tiếng sau thủy phân, nếu không phải được bảo quản trong tủ lạnh
tối đa là 2 tuần.
- Rửa phần rắn còn lại bằng ít nhất 50mL nước cất, chia làm 3 lần rửa.
- Đem phần rắn sấy ở 1050
C trong hơn 4 tiếng, sau đó bỏ vào hộp hút ẩm để nguội
1 tiếng, cân và ghi lại khối lượng mẫu.
- Sau đó đem crucible nung ở 6000
C qua đêm, đem cân xác định hàm lượng tro.
 Phân tích lignin hòa tan trong acid:
- Sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis, chạy mẫu trắng là acid H2SO4 4 %.

49. Đồ án tốt nghiệp
40
- Sử dụng dịch thủy phân thu được (pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng H2SO4
4%) đo ở bước sóng 240nm và 320nm.
- Tính hàm lượng lignin bằng đường chuẩn.
2.5.2.6. Phương pháp xác định hàm lượng pectin thô.
Nguyên tắc: Dùng nước nóng để tách pectin ở nhiệt độ cao bằng cách nung cách
thủy hỗn hợp nguyên liệu và nước.
Tiến hành:
- Cân 3g nguyên liệu cho vào 60 mL nước cất, điều chỉnh pH bằng HCl 0,5 N.
- Cho cốc lên nồi đun cách thủy và khuấy đều.
- Lọc thu dịch lọc và bổ sung thêm nước cất đến thể tích 100mL.
- Thêm tiếp 200 mL cồn 960
để tủa pectin. Lọc thu tủa (dùng giấy lọc)
- Rửa tủa 2 lần với ethanol 700
.
- Sấy khô tủa pectin ở 700
C đến khối lượng không đổi thu được pectin thô.
Tính hàm lượng pectin:
% Pectin =
Khô
́ i lươ
̣ ng pectin thô (g)
Khô
́ i lươ
̣ ng vỏ cacao khô (g)
x 100
2.5.2.7. Phương pháp xác định pH
Nguyên tắc: Dùng pH kế điện tử.
2.5.2.8. Phương pháp xác định nồng độ cồn.
Nồng độ cồn đo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Nguyên lý:
Ethanol được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng pha
động là acid sulfuric 0,005N. Mẫu và chuẩn được chạy ở chế độ:
 Nhiệt độ cột 500
C
 Tốc độ pha động 1mL/phút.
Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác nhau trên cột, khi
dung môi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự

50. Đồ án tốt nghiệp
41
tùy thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau ( thuộc cùng một chất)
sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp nhiều chất
ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân tách
khá cao.
 Chuẩn bị pha động.
- Hóa chất gồm acid H2SO4 tinh khiết 96 %: 267µL
 Nước khử ion 1000 mL
- Bình chứa pha động phải được rửa nhiều lần bằng nước cất và tráng lại bằng nước
khừ ion.
- Cho 1lít nước khử ion vào bình chứa, thêm vào 267µl H2SO4 tinh khiết 96% vào
và khuấy kĩ.
- Lọc nước bằng màng lọc vi sinh, kích thước lỗ là 0,22µm.
- Loại khí trong pha động bằng cách hút chân không bình chứa pha động, vừa hút
vừa khuấy trộn kĩ.
- Đánh siêu âm bình chứa pha động từ 10 - 20 phút để loại bỏ hết bọt khí trong
bình.
- Tiến hành chạy HPLC.
 Tính kết quả cồn.
Mẫu được lọc qua màng lọc vi sinh kích thước lỗ 0,22 µm và đo bằng HPLC.
Từ diện tích peak thu được trên sắc kí đồ, tính được nồng độ cồn theo phương trình:
y = 5,031.10-7
x – 0,002.

51. Đồ án tốt nghiệp
42
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát giống nấm men
3.1.1. Quan sát hình thái nấm men
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của Saccharomyces cerevisiae
Các khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae có màu trắng ở ngày thứ nhất, màu
trắng ngà ở ngày thứ hai và chuyển sang màu ngà ở ngày nuôi cấy thứ 3 kể từ lúc
cấy trãi. Khuẩn lạc có bề mặt bóng mịn, rìa tròn, lồi lên, đường kính khoảng 1 - 2
mm vào ngày thứ ba (hình 3.1a).
Khi quan sát dưới kính hiển vi, tế bào S.cerevisiae có dạng hình cầu hay hình
trứng, có kích thước nhỏ, sinh sản bằng cách tạo chồi vào tạo bào tử, có thể đứng
riêng lẻ, từng đôi hoặc một chuỗi (hình 3.1b).
3.1.2. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae
Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae
b. Tế bào
a. Khuẩn lạc
3
4
5
6
7
8
9
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
log
(số
tb/ml)
thời gian(h)

52. Đồ án tốt nghiệp
43
Nhận xét:
Môi trường nhân giống và môi trường lên men là giống nhau.
Điều kiện lên men không khác nhiều so với khi nhân giống: thể tích lên men ít nên
không bị ảnh hưởng bởi áp lực nước, nhiệt độ,…
Nhìn vào đồ thị ta thấy đường cong sinh trưởng chia làm 4 giai đoạn:
 Giai đoạn thích nghi: 0 – 6 h
 Giai đoạn tăng trưởng: 6 – 39 h
 Giai đoạn ổn định: từ 39 – 51 h, mật độ tế bào theo log(cfu/mL) trong khoảng từ
7,75 đến 8,19. Trong giai đoạn này có sự cân bằng giữa tế bào sinh ra và tế bào
mất đi.
 Giai đoạn suy vong: từ 51 – 72 h
Trong giai đoạn này, chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, không đủ
cung cấp cho hoạt động sinh trưởng, phát triển của nấm men.Tế bào già và chết đi.
3.2. Khảo sát thành phần hóa học của vỏ cacao khô
Kết quả khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ cacao khô được trình bày trong
bảng 3.1.
Hình 3.3. Vỏ cacao khô