Документ описывает изобретение нового малотоксичного иммуностимулирующего препарата растительного происхождения "сапанокс-иммуно+", получаемого из растения saponaria officinalis. Препарат демонстрирует высокую эффективность в повышении иммунного ответа при вакцинации и менее токсичен по сравнению с традиционными адъювантами. В испытаниях на животных препарат показал значительные улучшения в уровнях антител и клеточном иммунитете при иммунизации антигенами паразита eimeria tenella.

1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28664
(51) A61K 36/36 (2006.01)
A61P 37/04 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/0821.1
(22) 19.06.2013
(45) 15.07.2014, бюл. №7
(72) Богоявленский Андрей Павлинович; Березин
Владимир Элеазарович; Турмагамбетова Айжан
Сабиржановна; Зайцева Ирина Алексеевна;
Омиртаева Эльмира Серикказиновна; Алексюк
Павел Геннадьевич
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Институт
микробиологии и вирусологии" Комитета науки
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) Gautam M., Saha S., Bani S., Kaul A., Mishra S.,
Patil D. et.al. Immunomodulatory activity of Asparagus
racemosus onsystemic Thl/Th2 immunity: implications
for immunoadjuvant potential// J Ethnopharmacol,
2009, vol. 121, №2, p.241-247
(54) ИММУНОСТИМУЛЯТОР
РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
"САПАНОКС-ИММУНО+" ДЛЯ
ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИН
(57) Использование: медицина, ветеринария, а
именно разработка средств повышения иммунитета.
Цель: получение нового малотоксичного
препарата, обладающего иммуностимулирующей
активностью и протективными свойствами, для
применения в медицинской и ветеринарной
практике.
Сущность изобретения: в качестве
иммуностимулирующего препарата используют
очищенные сапонины, полученные из водно-
спиртового экстракта растения Saponaria officinalis
методом хроматографии высокого давления HPLC.
Положительный эффект: Предлагаемый
адъювант обладает следующими преимуществами:
- он доступен, так как выделяется из широко
распространенного растения Saponaria officinalis,
растение может быть культивировано;
- используемый способ получения прост в
технологическом отношении, позволяет получить
высокоочищенный сапонинсодержащий препарат;
- исследуемый сапонинсодержащий препарат
менее токсичен в сравнении с аналогичными
коммерческими иммуностимулирующими
препаратами;
- заявляемый сапонинсодержащий препарат
обладает выраженной иммуностимулирующей
активностью.
(19)KZ(13)A4(11)28664

2. 28664
2
Изобретение относится к области медицины и
ветеринарии, а именно к разработке адъювантов
растительного происхождения. В качестве
адъюванта растительного происхождения
предлагается иммуностимулирующий препарат
сапониновой природы из растения мыльнянка
лекарственная Saponaria officinalis (в дальнейшем
именуемый «САПАНОКС-иммуно+»), лиофильно
высушенный в виде порошка.
Изобретение относится к разработке средств
повышения иммунного ответа при вакцинации. Для
повышения эффективности вакцин, вызывающих
стойкий и длительный иммунитет используют
адъюванты, усиливающие эффект иммунизации.
Большинство из известных адъювантов ограничено
в применении из-за своей токсичности и наличия
побочных эффектов. В связи с этим большое
внимание уделяется малотоксичным адъювантам
растительного происхождения.
Известен сапонинсодержащий экстракт из
растения Polygala senega, который способен
стимулировать иммунный ответ на введенный
антиген (Патент USA 6,241,995, June 5, 2001, Estrada
A., Barl В., Katselis Georgios S., Laarveld В.).
Известно применение для активации иммунного
ответа флавоноидов, выделенных из этанольного
экстракта солодки уральской Glycyrrhiza uralensis F
(Патент RU, заявка 99108701/14, Шульц Э.Э.,
Толстиков Г.А., Петрова Т.Н., Толстикова Т.Г.,
Покровский А.Г., Ильичева Т.Н., Проняева Т.Р.).
Известно применение для активации иммунного
ответа фракции сапонинов Quil А, выделенных из
южно-американского дерева Quillaia saponaria и
представляющий собой смесь тритерпеновых
сапонинов. На основе этих сапонинов получены
иммуностимулирующие комплексы ИСКОМ
(ISCOMs), в состав которых входят антиген,
холестерол, фосфолипиды и растительные
сапонины. (Rajput Z.I., HU S.-H., Xiao Ch.-W., Arijo
A.G. Adjuvant effects of saponins on animal immune
responses// Journal of Zhejiang University SCIENCE B.
- 200. - vol. 8, №3. p.153-16).
Известна иммуностимулирующая активность
стероидных сапонинов, выделенных из растения
Asparagus racemosus (Gautam М., Saha S., Bani S.,
Kaul A., Mishra S., Patil D. et.al. Immunomodulatory
activity of Asparagus racemosus on systemic Th1Th2
immunity: implications for immunoadjuvant potential//
J Ethnopharmacol. - 2009. - vol.121, №2. p.241-247).
Недостатками указанных препаратов является
недоступность растительного сырья для их
получения, проявление указанными препаратами
токсических свойств и их высокая стоимость.
Целью изобретения является способ применения
нового малотоксичного иммуностимулирующего
препарата, который мог бы использоваться в
медицинской и ветеринарной практике для
повышения иммуногенности вакцин.
Данная задача достигается путем применения
растительного препарата представляющего собой
фракцию очищенных сапонинов, полученных путем
разделения сапонинсодержащего экстракта растения
Saponaria officinalis с помощью хроматографии
высокого давления (HPLC), содержащую сапонины
в количестве 70% от сухой массы, получившую
название «САПАНОКС-иммуно+». Сущность
изобретения заключается в применении данного
иммуностимулятора растительного происхождения
для повышения эффективности вакцин.
Препарат представляет собой аморфный
порошок буровато-коричневого цвета с
вкраплениями более темных частиц, со слабым
специфическим запахом. Гигроскопичен, при
хранении комкуется. Растворим в воде очищенной,
50% растворе ацетона, 30% растворе кислоты
уксусной и 10% растворе натрия гидроксида, мало
растворим в эфире диэтиловом, практически
нерастворим в бензоле, хлороформе и спирте
этиловом 95%.
Подлинность препарата подтверждается с
помощью 5 качественных реакций:
а) обработка раствором метилового красного в
этаноле позволяет обнаружить в растительном
экстракте наличие органических кислот (красное
окрашивание); б) обработка 3,5-
динитросалицилатом с последующим нагреванием
при 105ºС позволяет определить наличие
восстанавливающих Сахаров (черное окрашивание)
и невосстанавливающих Сахаров (серо-зеленое
окрашивание); в) обработка 0,5%-ным раствором
йода в хлороформе позволяет обнаружить липиды
(коричневое окрашивание); г) обработка раствором
аммиака позволяет обнаружить флавоноиды (желто-
коричневое окрашивание); д) обработка 2%-ным
раствором FeCl3 метаноле позволяет определить
сапонины (пурпурное окрашивание).
Сущность изобретения поясняется на следующих
примерах.
Пример 1. Характеристика препарата
«САПАНОКС-иммуно+»
Для получения иммуностимулирующего
средства использовали высушенный 75-85%
этанольный экстракт корней растения Saponaria
officinalis
Иммуностимулирующее средство получали
путем фракционирования экстракта методом
хроматографии высокого давления (HPLC).
Разделение проводили в градиенте ацетонитрила
0-80% в присутствии 0,05% трифторуксусной
кислоты (ТФК) на препаративных и
полупрепаративных колонках "С 18", 5u. На
колонку наносили 500 мг экстракта, разведенного в
1 мл дистиллированной воды. Контроль за
хроматографическим процессом осуществляли
спектрофотометрическим методом при длинах волн
208 нм и 353 нм. Отбирали фракцию с наибольшим
поглощением оптической плотности при 208 нм
(зона поглощения сапонинов) и наименьшим
поглощением при 353 нм (зона поглощения
флавоноидов). Полученную сапонинсодержащую
фракцию лиофильно высушивали. Контроль
содержания препарата проводили с помощью
цветной реакции на сапонины, пенообразование и
путем хроматографического анализа. При
хроматографическом анализе в препарате выявлялся
основной пик при длине волны 208 нм,

3. 28664
3
соответствующий сапонинам (рисунок 1).
Содержание сапонинов в конечном препарате
должно составлять не менее 70% от сухой массы.
Отобранный иммуностимулирующий препарат
назван «САПАНОКС-иммуно+».
Пример 2. Определение токсичности препарата
«САПАНОКС-иммуно+»
Для изучения токсичности «САПАНОКС-
иммуно+», полученного из растения Saponaria
officinalis, проводили испытания на двух видах
животных: белых мышах обоего пола, массой
18-20 г, и однодневных цыплятах обоего пола,
массой 50-55 г. В исследованиях использовали
здоровых животных, на которых ранее не проводили
какие-либо испытания, содержащихся в
соответствии с действующими правилами. Перед
началом испытаний у животных определяли
исходную массу.
Испытание на белых мышах. Препарат вводили
внутрибрюшинно и подкожно 10-ти животным в
дозах 10 мг на кг веса и 50 мг на кг веса. Сухой
препарат растворяли в воде очищенной в объеме не
более 0,5 мл. В качестве препарата сравнения
животным вводили аналогичные дозы
коммерческого сапонина Квил А.
Испытание на однодневных цыплятах. Препарат
вводили подкожно 10 цыплятам в дозах 10 мг на кг
веса и 50 мг на кг веса. Сухой препарат растворяли в
воде очищенной в объеме не более 0,5 мл. В
качестве препарата сравнения животным вводили
аналогичные дозы коммерческого сапонина Квил А.
Препараты вводили стерильным шприцем,
погрешность измерения которого не должна была
превышать 4%. Наблюдение за животными
осуществляли ежедневно в течение 7 сут.
Препарат считали выдержавшим испытание,
если:
- в течение периода наблюдения все животные
остались живы и ни у одного из них не были
выявлены видимые признаки заболевания;
- масса каждого животного в день окончания
наблюдения не уменьшалась по сравнению с
исходной.
Если в течение периода наблюдения была
зарегистрирована гибель, заболевание, уменьшение
массы, развитие некроза или абсцесса в месте
введения хотя бы у одного животного, испытание
должно быть повторено на удвоенном количестве
животных того же вида. Повторное испытание
считали удовлетворительным, если препарат
отвечает вышеперечисленным требованиям.
Экспериментально было установлено, что в дозе
до 50 мг на кг веса иммуностимулирующее
средство, полученное из растения Saponaria
officinalis не обладало острым токсическим
действием, подкожное введение сапонина Квил А в
дозе 50 мг на кг веса вызывало 100% гибель
подопытных животных (табл. 1).
Пример 3. Определение активности
гуморального иммунитета при иммунизации цыплят
антигенами паразита Eimeria tenella в сочетании с
препаратом «САПАНОКС-иммуно+»
Активность гуморального иммунитета
определяли при иммунизации однодневных цыплят
антигенами Eimeria tenella в сочетании с препаратом
«САПАНОКС-иммуно+». Антигены Eimeria tenella
в дозе 10 мкг/цыпленок смешивали с препаратом
«САПАНОКС-иммуно+» в дозе 10 мкг/цыпленок.
Цыплят иммунизировали однократно путем
интраназального введения исследуемого препарата.
Для сравнения цыплят иммунизировали антигенами
Eimeria tenella без иммуностимулятора и антигенами
Eimeria tenella в сочетании с коммерческим
иммуностимулятором гидроокисью алюминия в тех
же дозах. Через 2 недели после иммунизации кровь
цыплят забирали для определения уровня антител.
Антитела определяли с помощью
иммуноферментного анализа по стандартной
методике. Результаты испытаний приведены на
рисунке 2.
Показано, что иммунизация цыплят антигенами
Eimeria tenella в смеси с препаратом «САПАНОКС-
иммуно+» приводит к значительно большему
подъему уровня антител в крови цыплят по
сравнению с иммунизацией антигенами без
иммуностимулятора или антигенами в сочетании с
коммерческим иммуностимулятором гидроокисью
алюминия.
Пример 4. Определение факторов клеточного
иммунитета при иммунизации мышей антигенами
паразита Eimeria tenella в сочетании с препаратом
«САПАНОКС-иммуно+»
Активность факторов клеточного иммунитета
определяли при иммунизации белых мышей весом
18-20г антигенами Eimeria tenella. Антигены Eimeria
tenella в дозе 10 мкг/мышь вводили подкожно в
сочетании с препаратом «САПАНОКС-иммуно+», а
также в смеси с коммерческими адъювантами
(полный и неполный адъюванты Фрейнда,
гидроокись алюминия). Мышей также
иммунизировали антигенами Eimeria tenella без
адъювантов.
Через неделю после второй иммунизации у
мышей забирали кровь и в сыворотках определяли
наличие цитокинов: IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10.
Цитокины выявляли методом иммуноферментного
анализа с использованием коммерческих тест-
систем фирмы "R&D systems" (США).
Результаты анализов приведены на рисунках 3 и
4. Показано, что иммунизация животных
антигенами Eimeria tenella в сочетании с препаратом
«САПАНОКС-иммуно+» стимулирует значительно
более высокий уровень клеточного иммунитета по
сравнению с иммунизацией очищенными
антигенами без адъюванта или антигенами в смеси с
адъювантом гидроокисью алюминия. Активность
образования цитокинов после иммунизации
антигенами Eimeria tenella в сочетании с препаратом
«САПАНОКС-иммуно+» была сопоставима с
активностью цитокинов после иммунизации
антигенами в смеси с коммерческими масляными
адъювантами (полный и неполный адъювант
Фрейнда). Однако после подкожной иммунизации
мышей антигенами в смеси с масляными
адъювантами наблюдалось развитие значительных

4. 28664
4
местных токсических реакций у животных
(стерильные абсцессы), чего не происходило при
использовании препарата «САПАНОКС-иммуно+».
Пример 5. Определение индукции гуморального
иммунитета при иммунизации цыплят вакциной
против вируса гриппа птиц в сочетании с
препаратом «САПАНОКС-иммуно+»
Определяли активность гуморального
иммунитета при иммунизации однодневных цыплят
вакциной на основе изолированных
гликопротеидных антигенов вируса гриппа птиц
(ВГП), штамм А/FPV/ Rostock/34 в сочетании с
препаратом «САПАНОКС-иммуно+».
Гликопротеиды ВГП в дозе 10 мкг/цыпленок
смешивали с препаратом «САПАНОКС-иммуно+» в
дозе 10 мкг/цыпленок. Цыплят иммунизировали
однократно путем интраназального введения
исследуемого препарата.
Для сравнения цыплят иммунизировали
антигенами ВГП без иммуностимулятора и
антигенами ВГП в сочетании с адъювантами
гидроокисью алюминия и сапонином Квил А.
Через 2 недели после однократной иммунизации
кровь цыплят забирали для определения уровня
иммуноглобулинов - IgG, IgA, IgM. Наличие
иммуноглобулинов определяли с помощью
иммуноферментного анализа с использованием
меченых пероксидазой моноклональных антител.
Результаты испытаний приведены на рисунке 5.
Показано, что однократная иммунизация цыплят
изолированными гликопротеидами ВГП в смеси с
препаратом «САПАНОКС-иммуно+» индуцирует
более высокие титры иммуноглобулинов классов А,
М и G по сравнению с иммунизацией антигенами
без иммуностимулятора или антигенами в
сочетании с коммерческим адъювантом
гидроокисью алюминия. Активность образования
различных классов иммуноглобулинов после
иммунизации ВГП в смеси с препаратом
«САПАНОКС-иммуно+» была сопоставима с
активностью иммуноглобулинов после
иммунизации ВГП в смеси с коммерческим
препаратом сапонина Квил А.
Пример 6. Определение протективных свойств
экспериментального вакцинного препарата,
содержащего антигены вируса гриппа птиц и
иммуностимулятор «САПАНОКС-иммуно+»
Активность протективного иммунитета
определяли после иммунизации цыплят вакциной
против вируса гриппа птиц (ВГП), штамм А/FPV/
Rostock/34 в условиях экспериментального
заражения цыплят.
Антигены ВГП в дозе 10 мкг/цыпленок
смешивали с препаратом «САПАНОКС-иммуно+» в
дозе 10 мкг/цыпленок. Цыплят иммунизировали
однократно путем интраназального введения
исследуемого препарата.
Для сравнения цыплят иммунизировали
антигенами ВГП в сочетании с коммерческим
препаратом сапонина Квил А, а также антигенами
без адъювантов.
Через две недели после однократной
иммунизации цыплят заражали гомологичным
вирусом гриппа птиц, штамм А/FPV/ Rostock/34 в
дозе 100 ЭЛД50/цыпленок. Специфическую гибель
цыплят учитывали в течение 21 дня после
заражения.
Результаты оценки протективной активности
различных вакцинных препаратов, представлены на
рисунке 6. Показано, что иммунизация цыплят
антигенами ВГП в сочетании с
иммуностимулирующим препаратом «САПАНОКС-
иммуно+» индуцировала защиту от летального
заражения вирусом у 70% цыплят. Иммунизация
антигенами ВГП в смеси с коммерческим
препаратом сапонина Квил А, защищала от
заражения 87,5% цыплят при более высоком уровне
токсических реакций. Иммунизация очищенной
субъединичной вакциной без адъювантов
индуцировала протективный иммунитет только у
40% цыплят.
Таким образом, иммуностимулирующий
препарат «САПАНОКС-иммуно+» может быть
эффективно использован в качестве адъюванта для
повышения иммуногенности вакцинных препаратов,
содержащих различные антигены паразитарного и
вирусного происхождения и усиления их защитных
свойств при меньшей токсичности данного
препарата по сравнению с имеющимися
коммерческими аналогами.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Иммуностимулятор растительного
происхождения для повышения эффективности
вакцин, обладающий способностью повышать
активность гуморального, клеточного и
протективного иммунитета при иммунизации
антигенами вирусного и паразитарного
происхождения, отличающийся тем, что в
качестве иммуностимулятора используют препарат
«Сапанокс-иммуно+», представляющий собой
фракцию очищенных сапонинов (в количестве 70%
от сухой массы), полученную путём разделения
сапонинсодержащего экстракта растения Saponaria
officinalis методом хроматографии высокого
давления (HPLC).
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч