1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29715
(51) A61K 39/005 (2006.01)
A61B 10/00 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0668.1
(22) 15.05.2014
(45) 15.04.2015, бюл. №4
(72) Шалабаев Болат Абуович; Кадыров Серикбай
Оразбаевич; Сулейменов Маратбек Жаксыбекович
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) RU 2327169 C2, 20.06.2008
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОГЕННОГО
АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ
ДИАГНОСТИКИ ТРИПАНОСОМОЗА
ЖИВОТНЫХ
(57) Изобретение относится к области
ветеринарной иммунологии и может быть
использовано при изготовлении антигенов,
применяемых для серологической диагностики
трипаносомозов животных.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением выражается в получении
высокоактивного и стабильного антигена для
постановки серологической реакции при
диагностике трипаносомоза животных.
Способ получения антигена для серологической
диагностики трипаносомоза животных,
возбудителем Trypanosoma equiperdum Р-0001,
которым заражают белых крыс, затем
обескровливают с добавлением в пробирки 20%-
ного раствора цитрата натрия, затем собранную
кровь центрифугируют в течение 10-15 минут при
3000 об/мин, полученную плазму собирают в
стерильные пробирки, осадок трипаносом удаляют
для приготовления соматического антигена, после
чего из плазмы крови выделяют экзогенные
антигены посредством спиртового осаждения, для
этого pH плазмы доводят значение 3-4 и смешивают
1:2 с охлажденным 96% спиртом и оставляют на
24 ч в холодильнике, затем центрифугируют при
6000-800 об/мин в течение 15-20 мин, надосадочную
жидкость удаляют, а полученный осадок
растворяют в физиологическом растворе pH до 8,5 и
доводят концентрацию белка до 1 мг/см3
и pH до
7,2-7,5 и получают целевой продукт.
(19)KZ(13)A4(11)29715

2. 29715
2
Изобретение относится к области ветеринарной
иммунологии и может быть использовано при
изготовления антигена, применяемого для
серологической диагностики трипаносомоза
животных.
Известен способ получения антигена для
серологической диагностики трипаносомозов
животных, включающий заражение возбудителем
Trypanosoma equiperdum белых крыс, взятие
сыворотки крови, осаждение белка,
центрифугирование и отделение осадка от
надосадочной жидкости, [Патент Российской
Федерации №2327169, кл. G01N 33/531, 2008].
Недостатком указанного способа получения
антигена является присутствие в целевом продукте
остаточное количества полиэтиленглюколя, что
снижает реакционную способность антигена и
обусловливает его невысокую специфическую
активность.
Задачей изобретения является разработка
способа получения антигена для серологической
диагностики трипаносомоза животных, вызываемых
Trypanosoma equiperdum, обеспечивающего
получение высокочувствительного,
высокоспецифичного, очищенного от балластных
компонентов антигена.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в получении
высокоактивного и стабильного антигена для
постановки серологической реакции при
диагностике трипаносомоза животных.
Способ приготовления трипаносомного антигена
состоит в следующем: крыс, зараженных
Trypanosoma equiperdum обескровливают с
добавлением в пробирки 20%-ного раствора цитрата
натрия, собранную кровь центрифугируют в течение
10-15 минут при 3000 об/мин, полученную плазму
собирают в стерильные пробирки, осадок
трипаносом удаляют для приготовления
соматического антигена, после чего из плазмы
крови выделяют экзогенные антигены посредством
спиртового осаждения, для этого pH плазмы доводят
значение 3-4 и смешивают 1:2 с охлажденным 96%
спиртом и оставляют на 24 ч. в холодильнике, затем
центрифугируют при 6000-800 об/мин в течение 15-
20 мин, надосадочную жидкость удаляют, а
полученный осадок растворяют в физиологическом
растворе pH до 8,5 и доводят концентрацию белка
до 1 мг/см3
и pH до 7,2-7,5 и получают целевой
продукт.
В изобретении используется штамм Trypanosoma
equiperdum Р-0001 (коллекционный номер
КазНИВИ БШ 68) депонированный в Лаборатории
паразитологии ТОО «Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт».
Штамм характеризуется следующим признаками,
которыми обладает Trypanosoma equiperdum Р-0001.
Морфологические признаки. Штамм
Trypanosoma equiperdum Р-0001 обладает
морфологическими признаками, характерными для
возбудителя трипанозомоза животных. Окраска по
Грамму отрицательная.
Культуральные свойства. Trypanosoma
equiperdum Р-0001 имеет тело веретенообразной
формы, концы его сужены, передний более
застроен. Вдоль тела трипаносомы продолжается
жгутик, соединяющийся с ним ундулирующей
мембраной. Мембраны ядерной оболочки имеют
характерную трехслойную структуру,
гликопротеины с молекулярной массой 65000.
Размеры тела 15-32×1,4-2,8 мк, размеры жгутика
5,53 до 6,67, цвет серый. Обладает активным
поступательным движением. При pH менее 5,5,
трипаносома неустойчива, деление клеток -
бесполое продольное.
Специализированные клетки не образует, при
максимальной паразитемии количество их доходит
от 800 тыс. до 1 млн. трипаносом в 1,0 мл.
Биохимические свойства. Штамм Trypanosoma
equiperdum Р-0001, штамм типовой вирулентный,
адаптированный на лабораторных животных,
предназначен для приготовления диагностических
препаратов. Култивирование in vivo (на белых
мышах) позволяет сохранить высокую
вирулентность штамма, что обеспечивает
максимальную паразитарную реакцию (до 500 и
выше трипаносом в поле зрения микроскопа).
Штамм не культивируется на питательных средах,
культурах клеток и эмбрионах.
Для трипаносомы характерны: паразитизм,
аэробное дыхание и осмотическое питание
(сапрофитное).
Антигенные свойства. Отличительной
особенностью является наличие большого числа
(более 100) различных поверхностных антигенов и
основных антигенных типов, наличие
типоспецифических экзоантигенов. Титры антител в
РСК И РДСК составляют 1:30, 1:40.
Маркерные признаки. Вариабельность
антигенной структуры. Штамм трипаносом имеет 8
мажорных полипептидов с молекулярной массой 36,
44, 47, 50, 64, 86, 92 кДа, из которых
суперможорные с м.м. 44, 54 и 71 кДа.
Патогенные свойства. Штамм Trypanosoma
equiperdum Р-0001 КазНИВИ патогенен для
лошадей, ослов, мулов, лошаков, собак, а также для
лабораторных животных: белых мышей, крыс,
морских свинок, кроликов.
Иммуногенность. Нет.
Реактогенность. Штамм Trypanosoma equiperdum
Р-0001 слабореактогенен для лошадей при
внутримышечном введении.
Спорообразование. Специализированные клетки
не образуются.
Реверсабельность и реактогенность. Штамм не
отличается от эпизоотических изолятов, обладает
высокой активностью при подкожном введении.
Стабильность свойств при пассировании.
Основные биологические свойства, в том числе
патогенные и вирулентные, штамма Trypanosoma
equiperdum Р-0001 стабильно сохраняются.
Способ получения антигена состоит в
следующем.
Пример 1. Способ получения антигена для
серологической диагностики трипаносомоза

3. 29715
3
животных, возбудителем Trypanosoma equiperdum Р-
0001, которым заражают белых крыс, затем
обескровливают с добавлением в пробирки 20%-
ного раствора цитрата натрия. Собранную кровь
центрифугируют в течение 10-15 минут при
3000 об/мин, полученную плазму собирают в
стерильные пробирки. Осадок трипаносом удаляют
для приготовления соматического антигена. Далее
из плазмы крови выделяют экзогенные антигены
посредством спиртового осаждения Для этого pH
плазмы доводят значение 3-4 и смешивают 1:2 с
охлажденным 96% спиртом и оставляют на 24 ч. в
холодильнике, затем центрифугируют при и
6000-800 об/мин в течение 15-20 мин, надосадочную
жидкость удаляют, а полученный осадок растворяют
в физиологическом растворе pH до 8,5 и доводят
концентрацию белка до 1 мг/см3
и pH до 7,2-7,5, и
используют как трипаносомный зкзоантиген в
серологических реакциях. Активность антигена в
РДСК должна составлять 95-97%.
Пример 2. При титровании комплемента морской
свинкой в реакции связывания комплемента (РСК) и
приготовленного антигена в рабочем титре
полученные одинаковые титры комплемента, что
свидетельствует об отсутствии
антикомплементарного свойства приготовленного
антигена.
Активность полученного описанным способом
антигена была проверена в лабораторных условиях
при постановке РСК/РДСК с сыворотками крови от
здоровых и больных лошадей.
Результаты оценки активности предлагаемого
антигена для РСК (РДСК) при трипаносомозе
животных приведены в таблице 1 и 2.
Из таблицы 1 видно, что антиген, полученный
описанным способам, с серопозитивными
сыворотками в разведениях 1:5 и 1:10 дает
положительные результаты при разведении
антигена 1:200, с серонегативными дает
отрицательные результаты, что доказывает его
достаточно высокую активность и специфичность.
Это позволит использовать его в качестве антигена
для в РСК (РДСК), обладающего высокой
чувствительностью в выявлении трипаносомоза
животных.
Из таблицы 2 видно, что антиген, полученный
описанным способом, с серопозитивными
сыворотками в разведениях 1:5 и 1:10 дает
положительные результаты при разведении
антигена 1:200, с серонегативными дает
отрицательные результаты, что доказывает его
достаточно высокую активность и специфичность.
Это позволит использовать его в качестве антигена
для РСК (РДСК), обладающего высокой
чувствительностью в выявлении су-ауру верблюдов.
Готовый антиген расфасовывают, в стерильные
ампулы по 1 см3
подвергают сублимационной
сушке. Антиген может храниться до 6 мес. при
температуре 4°С и в лиофилизированном виде
2-3 года, не теряя своего исходного титра. Перед
использованием его необходимо титровать с
положительными и отрицательными сыворотками.
Предложенный способ получения антигена для
серологической диагностики трипаносомоза
животных и су-ауру верблюдов обеспечивает
высокую активность и специфичность антигена, что
позволяет повысить достоверность серологических
реакций.
Таблица 1
Оценка активности предлагаемого экзогенного антигена для РСК (РДСК) при су-ауру верблюдов
Разведение антигенаНаименование Разведение
сывороток 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400
1:5 ++++ ++++ ++++ +++ ++Положительной
1:10 ++++ ++++ +++ ++ +
Отрицательной 1:10 - - - - -
Контроль (физ.раствор) - - - - - -
Таблица 2
Оценка активности предлагаемого экзогенного антигена для РСК (РДСК) при случной болезней лошадей
Разведение антигенаНаименование Разведение
сывороток 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400
1:5 ++++ ++++ ++++ +++ ++Положительной
1:10 ++++ ++++ +++ ++ +
Отрицательной 1:10 - - - - -
Контроль (физ.раствор) - - - - - -
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения экзогенного антигена для
серологической диагностики трипаносомоза
животных, включающий заражение возбудителем
Trypanosoma equiperdum белых крыс, взятие
сыворотки крови, осаждение белка,
центрифугирование и отделение осадка от
надосадочной жидкости, отличающийся тем, что в
качестве материала для антигена используют штамм
Trypanosoma equiperdum Р-0001, которым заражают
белых крыс, затем обескровливают с добавлением в
пробирки 20%-ного раствора цитрата натрия, затем
собранную кровь центрифугируют в течение
10-15 минут при 3000 об/мин, полученную плазму
собирают в стерильные пробирки, осадок

4. 29715
4
трипаносом удаляют для приготовления
соматического антигена, после чего из плазмы
крови выделяют экзогенные антигены посредством
спиртового осаждения, для этого рН плазмы доводят
значение 3-4 и смешивают 1:2 с охлажденным 96%
спиртом и оставляют на 24 ч в холодильнике, затем
центрифугируют при 6000-8000 об/мин в течение
15-20 мин, надосадочную жидкость удаляют, а
полученный осадок растворяют в физиологическом
растворе рН до 8,5 и доводят концентрацию белка
до 1 мг/см3
и рН до 7,2-7,5 и получают целевой
продукт.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор К. Нгметжанова