1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28420
(51) A61B 10/00 (2006.01)
A61K 39/10 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1039.1
(22) 02.08.2013
(45) 15.05.2014, бюл. №5
(72) Барамова Шолпан Аузаровна; Султанов
Ахметжан Акиевич; Оспанов Ержан
Калиолдинович; Мырзалиев Ахан Жакангерович;
Т)сіп+ан,лы Орал+ан
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) KZ 162B, кл. А61K 39/10, G01N 33/531, 1993
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО
ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ
АНТИТЕЛ К БРУЦЕЛЛЕЗНЫМ ФАГАМ
(57) Изобретение относится к ветеринарной
медицине, в частности, к лабораторной диагностике
бруцеллеза животных, а именно к способам
разработки эффективных методов, предназначенных
для ускоренной серологической диагностики
бруцеллезной инфекции.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в повышении
специфичности, чувствительности и стандартности
приготавливаемого иммунологического реагента и
ускоренном выявлении бруцеллеза
сельскохозяйственных животных.
Способ получения антигенного эритроцитарного
диагностикума для определения специфических
антител к бруцеллезным фагам, включающий
выращивание штамма Brucella abortus 19 на плотной
питательной среде, смыв выросшей культуры 0,5%
формалинизированным физиологическим
раствором, инактивацию бактериальных клеток
нагреванием, адсорбцию на инактивированные
бактериальные клетки бруцеллезного фага Тб в
количестве 100 корпускул на 1 клетку, в качестве
антигена используют бруцеллезные фаги Тб и Iz в
равных соотношениях с 1,5% конъюгатом водного
раствора метола, после чего эритроциты
обрабатывают 0,0075% стабилизирующим
раствором тритона Х-100 и инкубируют при 50°С,
затем консервируют 0,05% раствором азида натрия
и получают целевой продукт.
(19)KZ(13)A4(11)28420

2. 28420
2
Изобретение относится к ветеринарной медицине, в
частности к лабораторной диагностике бруцеллеза
животных, а именно к способам разработки
эффективных методов, предназначенных для
ускоренной серологической диагностики
бруцеллезной инфекции.
Известен способ получения антигенного
эритроцитарного диагностикума для определения
специфических антител к бруцеллезным фагам,
включающий выращивание штамма Brucella abortus 19
на плотной питательной среде, смыв выросшей
культуры 0,5% формалинизированным
физиологическим раствором, инактивацию
бактериальных клеток нагреванием, адсорбцию на
инактивированные бактериальные клетки
бруцеллезного фага Тб в количестве 100 корпускул на
1 клетку [Патент Республики Казахстан №162, кл.
А61K 39/10, G01N 33/531, 1993].
Недостатком известного способа является не
высокая чувствительность и специфичность препарата,
а также необходимость приготовления танина ex
tempore, что ограничивает возможности данного
метода.
Задачей изобретения является разработка способа
получения антигенного эритроцитарного
диагностикума для определения специфических
антител к бруцеллезным фагам, который расширяет
возможность применения этого способа в
учреждениях ветеринарного профиля.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в повышении
специфичности, чувствительности и стандартности
приготавливаемого иммунологического реагента и
ускоренном выявлении бруцеллеза
сельскохозяйственных животных.
Способ получения антигенного эритроцитарного
диагностикума для определения специфических
антител к бруцеллезным фагам, включающий
выращивание штамма Brucella abortus 19 на плотной
питательной среде, смыв выросшей культуры 0,5%
формалинизированным физиологическим раствором,
инактивацию бактериальных клеток нагреванием,
адсорбцию на инактивированные бактериальные
клетки бруцеллезного фага Тб в количестве 100
корпускул на 1 клетку, в качестве антигена
используют бруцеллезные фаги Тб и Iz в равных
соотношениях с 1,5% конъюгатом водного раствора
метола, после чего эритроциты обрабатывают 0,0075%
стабилизирующим раствором тритона Х-100 и
инкубируют при 50°С, затем консервируют 0,05%
раствором азида натрия и получают целевой продукт.
Предлагаемый способ осуществляют следующим
образом.
Пример 1. Приготовление антигенного
эритроцитарного диагностикума, содержащего
специфические фаги Тб и Iz для адсорбции на
эритроциты барана.
Тщательно смешивают 2 объема 10% взвеси
формалинизированных эритроцитов барана 0,5 см3
, 1
объем рабочего разведения сенситина на
забуференном физиологическом растворе (ЗФР)
0,025 см3
(1 мг/см3
белка) и 1 объем
свежеприготовленного 1,5% водного раствора метола
0,5 см3
.
Смесь выдерживают в водяной бане при
температуре 50°С в течение 120 мин, периодически, с
интервалом 15 мин, встряхивают. Нагруженные таким
образом эритроциты дважды отмывают
физиологическим раствором рН 7,2, содержащим
0,0075% тритона Х-100, путем центрифугирования при
3000 об/мин в течение 15 мин. Отмытые эритроциты
суспендируют в этом же растворе до 0,5% (по объему)
концентрации. Полученный диагностикум в объеме
0,025 см3
вносят в приготовленные на ЗФР,
содержащем 0,0075% тритона Х-100,
последовательные разведения исследуемой на наличие
бруцеллезных фаговых антител сывороток
(объем 0,05 см3
).
Пример 2. Определение чувствительности
антигенного эритроцитарного диагностикума,
содержащего специфические фаги Тб и Iz.
Изучение чувствительности приготовленного по
указанному способу, содержащих специфические фаги
диагностикума, проводят в реакции непрямой
гемагглютинации путем исследования 10 серий
заведомо известных бруцеллезных (биофабричных)
сывороток, а также 48 проб сывороток крови,
полученных от 28 экспериментально зараженных
бруцеллезом морских свинок и 20 кроликов
иммунизированных бруцеллезными фагами.
Для сравнительного анализа полученных
результатов эти же пробы опытных сывороток
параллельно исследуют в РИГА с антигенными
эритроцитарными бруцеллезными диагностикумами
Одесской биофабрики, а также антигенами
собственного изготовления, не содержащих фаги.
Предварительно все пробы испытуемых сывороток,
кроме антифаговых исследуют общепринятыми
методами в РА, РДСК, РБП, результаты которых были
во всех случаях положительными и свидетельствуют о
наличии высоких титров бруцеллезных антител.
Результаты чувствительности антигенных
эритроцитарных диагностикумов представлены в
таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что чувствительность
предлагаемого диагностикума, содержащего
специфические фаги достаточно высокая - титр
обнаруживаемых им антифаговых антител составляет
1 : 3200, а с помощью диагностикумов, изготовленных
без дополнительной сенисибилизации специфическим
фагом - 1: 400.
Пример 3. Определение специфичности
антигенного эритроцитарного диагностикума,
содержащего специфические фаги Тб и Iz.
Изучение специфичности приготовленного по
указанному способу, содержащих специфические фаги
диагностикума, проводят в РНГА путем исследования
10 серий заведомо известных иммунных овисных
(биофабричных) сывороток, 36 проб сывороток крови,
полученных от экспериментально зараженных В. ovis
24 морских свинок и 12 кроликов, а также
туляремийной, пастереллезной, йерсиниозной,
вибриозной, сальмонеллезной иммунных сывороток и
проб сывороток крови от интактных и
иммунизированных бруцеллезными фагами животных.

3. 28420
3
Предварительно все пробы овисных иммунных
сывороток исследуют в РДСК биофабричными
овисным и бруцеллезными антигенами. Во всех
случаях в РДСК с овисным антигеном получают
положительные результаты, а с бруцеллезным
антигеном показания были отрицательными.
Проверенные таким образом овисные иммунные
сыворотки используют в РИГА для изучения
специфичности предлагаемого антигенного
диагностикума.
Результаты специфичности антигенных
эритроцитарных бруцеллезных диагностикумов
приведены в таблице 2.
В таблице 2 показано, что предлагаемый
диагностикум, содержащий фаги обладает высокой
специфичностью и не вступает в реакцию с
гетерологичными и негативной сыворотками. При
исследовании иммунных сывороток (овисной,
йерсиниозной, туляремийной, пастереллезной)
показания РНГА были отрицательными, что
подтверждает наличие высокой специфичности
разработанного антигенного эритроцитарного
диагностикума, содержащего бруцеллезные фаги.
При этом диагностикумы, не содержащие
специфические фаги, вступают в перекрестные
реакции, в невысоких разведениях, с гетерологичными
иммунными сыворотками - в первых двух лунках
планшетки отмечают четырех и двукрестовые
показания реакции с разведениями сывороток 1:25 и
1:50.
Использование способа получения антигенного
эритроцитарного диагностикума для определения
специфических антител к бруцеллезным фагам
позволит повысить специфичность, чувствительность
и обнаружить инфицированный организм, как в
острой, так и в хронической форме.
Таблица 1
Результаты изучения чувствительности антигенных эритроцитарных бруцеллезных диагностикумов
Положительные показания при
исследовании сывороток крови
Диагностикумы Предельные титры антител
иммунных сывороток
Морские свинки
(28 голов)
Кролики (20
голов)
Антигенный эритроцитарный
диагностикум, содержащий
специфические фаги
1:3200 28 20
Бруцеллезный без фага КазНИВИ 1:400 18 0
Бруцеллезный биофабричный без
фага российского производства
1:400 18 0
Таблица 2
Результаты изучения специфичности антигенных эритроцитарных бруцеллезных диагностикумов
Испытуемые сыворотки Показания РНГА с антигенным
эритроцитарным диагностикумом,
содержащим специфические
бруцеллезные фаги Iz иТб
Показания РНГА с бруцеллезным
диагностикумом без фага
Позитивные антифаговые # # # # # # # # # # // = = = = =
Бруцеллезная # # // = = = = = # # # # # # # #
Овисная = = = = = = = = # /// = = = = = =
Йерсиниозная += = = = = = = # # // = = = = =
Пастереллезная = = = = = = = = # = = = = = = =
Сальмонелл езная = = = = = = = = = = = = = = = =
Вибриозная = = = = = = = = = = = = = = = =
Туляремийная = = = = = = = = = = = = = = = =
Негативная = = = = = = = = = = = = = = = =
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения антигенного эритроцитарного
диагностикума для определения специфических
антител к бруцеллезным фагам, включающий
выращивание штамма Brucella abortus 19 на плотной
питательной среде, смыв выросшей культуры 0,5%
формалинизированным физиологическим раствором,
инактивацию бактериальных клеток нагреванием,
адсорбцию на инактивированные бактериальные
клетки бруцеллезного фага Тб в количестве 100
корпускул на 1 клетку, отличающийся тем, что в
качестве антигена используют бруцеллезные фаги Тб и
Iz в равных соотношениях с 1,5% конъюгатом водного
раствора метола, после чего эритроциты обрабатывают
0,0075% стабилизирующим раствором тритона X-100
и инкубируют при 50°С, затем консервируют 0,05%
раствором азида натрия и получают целевой продукт.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч