1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29271
(51) C12N 1/20 (2006.01)
C12R 1/125 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1949.1
(22) 25.12.2013
(45) 15.12.2014, бюл. №12
(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович; Балпанов
Дархан Серикович; Тен Олег Андреевич;
Сураганова Динара Аскаровна; Жусупов Серик
Искакович
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Национальный
центр биотехнологии" Комитета науки
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) RU 2019966 С1, кл. A01N 63/00, 1994
(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS
ВП, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ
ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО
ПРЕПАРАТА С ПРОБИОТИЧЕСКИМ
ЭФФЕКТОМ ДЛЯ ЖИВОТНОВОДСТВА
(57) Изобретение относится к биотехнологии,
ветеринарии и может быть использовано для
получения пробиотического препарата для
профилактики желудочно-кишечных заболеваний
животных.
Задачей изобретения является выделение нового
эффективного штамма, обладающего
антагонистической активностью и перспективного
для создания пробиотического препарата для
ветеринарных целей.
Задача решена выделением штамма Bacillus
subtilis ВП из содержимого желудочно-кишечного
тракта крупного рогатого скота. Штамм
депонирован 04.02.2013 г. в коллекцию культур
ТОО «КазНИИППП» под номером В-346.
Свидетельство о депонировании от 04.02.2013 года
Депозитария ТОО «Казахского научно-
исследовательского института перерабатывающей и
пищевой промышленности» 050060, г. Алматы, пр.
Гагарина, 238 Г.
Технический результат изобретения заключается
в выделении штамма, обладающего высокой
антагонистической активностью в отношении
грамотрицательной и грамположительной
микрофлоры, например культуры Escherichia coli и
Staphylococcus aureus. Выделенный штамм
сохраняет жизнеспособность в условиях
повышенной кислотности желудочного сока, а
также в условиях щелочной среды и повышенного
содержания желчных солей, характерных для
кишечного сока.
Применение штамма Bacillus subtilis ВП
позволяет восстановить нормальную микрофлору
кишечника у животных с дисбактериозом.
(19)KZ(13)A4(11)29271

2. 29271
2
Изобретение относится к биотехнологии,
ветеринарии и может быть использовано для
получения пробиотического препарата для
профилактики желудочно-кишечных заболеваний
животных. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВП
выделен из содержимого желудочно-кишечного
тракта крупного рогатого скота.
Проблема профилактики и лечения желудочно-
кишечных патологий у животных и птицы,
возбудителями которых являются условно-
патогенные кишечные микроорганизмы, имеет
экономическое и социальное значение. В странах
СНГ за последние годы заболеваемость людей,
животных и птицы сальмонелезом возросла в 7 раз,
при этом этиологическое значение S. enteridis в
заболевании людей возросло на 30%, у животных и
птицы на 75%, а индикация возбудителя в
продуктах питания увеличилась на 50% [Ушакова
Н.А., Некрасов Р.В., Правдин В.Г., Кравцова Л.З.,
Бобровская О.И., Павлов Д.С. Новое поколение
пробиотических препаратов кормового назначения
// Фундаментальные исследования. №1. 2012. с.184-
192]. Предотвратить развитие многих патологий у
животных позволяет использование кормов,
обогащенных биологически активными кормовыми
пробиотическими добавками.
В качестве пробиотических культур чаще всего
используется группа постоянных обитателей ЖКТ,
таких как лакто- и бифидобактерии, кишечная
палочка. В последние годы установлено, что
пробиотическим действием обладают
микроорганизмы, не входящие в состав постоянной
микрофлоры кишечника. Это так называемые
самоэлиминирующиеся антагонисты, к которым
относятся представители рода Bacillus, главным
образом, Вас. subtilis и Вас. Licheniformis, которые
применяются во многих кормовых пробиотических
препаратах, оказывая положительное влияние на
здоровье и продуктивность животного
[В.Д. Похиленко, В.В. Перелыгин. Пробиотики на
основе спорообразующих бактерий и их
безопасность // Химическая и биологическая
безопасность. - 2007. №2-3. с.32-33]. Бактерии рода
Bacillus применяемые пробиотических препаратах
имеют следующие преимущества перед другими
представителями экзогенной микрофлоры:
безвредность подавляющего большинства
представителей рода для макроорганизма даже в
высоких концентрациях; способность повышать
неспецифическую резистентность организма
хозяина; антагонистическую активность к
широкому спектру патогенных и условно-
патогенных микроорганизмов; высокую
ферментативную активность; устойчивость к
ферментам желудочно-кишечного тракта и
обусловленную этим высокую жизнеспособность;
стабильность при хранении.
Известны ряд микроорганизмов вида Bacillus
subtilis, обладающих антагонистической
активностью и применяемых в бактериальных
препаратах:
Известен способ получения бактериального
препарата на основе Bacillus subtilis (Заявка ЕПВ
№0287699, кл. С12N 1/20, опубл. 26.10.88),
включающий суспензионное культивирование
штамма бактерий в питательной среде, содержащей
источник углерода, источник азота, неорганические
вещества, витамины, аминокислоты в течение от 0,5
до 7 дней. Выращенную бактериальную культуру
отделяют от питательной среды, промывают и
концентрируют. Полученный продукт высушивают
и смешивают с добавками-наполнителями для
получения фармацевтических или ветеринарных
препаратов.
Недостатком данного способа является
сложность технологии получения препарата, т.к.
включает операции по отмывке бактериальных
клеток от компонентов питательной среды, а затем
концентрирование бактерий центрифугированием.
Препарат имеет малые сроки хранения, т.к.
содержит живые бактерии в виде вегетативных
палочек, которые не могут длительно сохранять
свои биологически активные свойства.
Способ получения бактериального препарата на
основе Bacillus subtilis (Заявка Японии №13-31171,
кл. А61K 35/74, опубл. 02.05.91), включающий
культивирование штамма бактерий на зерне или
продукте его измельчения с последующей сушкой и
дополнительным измельчением полученного
продукта. Препарат используют в качестве
кормовой добавки для домашних животных и птиц.
Недостатком данного способа является то, что
препарат имеет малые сроки хранения, т.к.
содержит живые бактерии (вегетативные клетки),
которые не могут длительно сохранять свои
биологически активные свойства.
Существует способ получения препарата для
защиты растений от болезней (Патент РФ №019966,
МКИ А01N 63/00, опубл. 1994), включающий
суспензионное культивирование бактерий Вас.
subtilis ИПМ-215 до максимального накопления
биомассы с последующим снижением концентрации
основных компонентов питательной среды для
перевода бактерий в споровую форму. Полученную
культуральную жидкость со спорами бактерий
подвергают распылительной или лиофильной сушке
и смешивают с наполнителем.
Недостатком данного способа является узкий
спектр антагонистической активности. Причем
компонентный состав препарата не может быть
использован в медицине и ветеринарии, т.к.
содержит добавки, которые не пригодны в пищу
человеку или животным.
Задачей, на решение которой направлено
изобретение, является выделение нового
эффективного штамма, обладающего
антагонистической активностью и перспективного
для создания пробиотического препарата для
ветеринарных целей.
Эта задача решается выделением штамма
Bacillus subtilis ВП из содержимого желудочно-
кишечного тракта крупного рогатого скота. Штамм
депонирован 04.02.2013 г. в коллекцию культур
ТОО «КАЗНИИППП» под номером В-346.
Условия хранения: штамм может храниться в
лиофилизированном состоянии в течение

3. 29271
3
нескольких лет или на косяках со средой МПА с
обязательным пересевом не реже 1 раза в год на эту
же среду.
Характеристики штамма.
Культурально-морфологические признаки.
Палочки. Величина клеток односуточной агаровой
культуры 1,9×0,5 мкм. Клетки окрашиваются
положительно по Грамму, образуют споры,
центральные, диаметр меньше диаметра клетки.
Колонии на МПА телесного цвета, пигмент в среду
не выделяют.
Физиолого-биохимические признаки: Аэроб.
оптимальная температура роста 37°С и pH 7,0.
Продуцирует каталазу. Культура ферментирует
глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, лактозу,
маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа.
Гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует
мочевину, утилизирует цитрат.
Не обладает лецитиназной, коагулазной,
гиалуронидазной активностью. Штамм не является
патогенным для животных и человека.
Изобретение поясняется примерами.
Пример 1.
Оценку антагонистической активности
проводили методом агаровых блоков. В качестве
тест-организмов использовали типичных
представителей грамотрицательной и
грамположительной микрофлоры - культуры
Escherichia coli 113-3 и Staphylococcus aureus 209Р
соответственно.
Поверхность питательной среды МПА засевали
сплошным "газоном" культуры Вас. subtilis ВП.
Через 48 часов на поверхности среды образовывался
сплошной слой биомассы. Полученную культуру на
плотной питательной среде инактивировали
хлороформом в течение 30 минут. Стерильным
пробочным сверлом вырезали агаровые блоки из
питательной среды с инактивированной культурой и
переносили их на поверхность другой агаровой
пластинки в чашке Петри, предварительно
засеянной тест-организмом. После инкубации в
термостате в течение 24 часов вокруг агаровых
блоков образовывались зоны отсутствия роста тест-
организма. По диаметру зон просветления судили
об антагонистической активности микроорганизма.
Результаты оценки антагонистической
активности микроорганизмов методом агаровых
блоков представлены в таблице 1.
Таблица 1
Результаты оценки антагонистической активности Bacillus subtilis ВП
Тест-культура Диаметр зоны, мм (диаметр блока 5 мм)
Staphilococcus aureus 209Р 12
Escherichia coli 11
Пример 2.
Микроорганизмы, используемые в
пробиотических кормовых добавках, должны
сохранять жизнеспособность в условиях
повышенной кислотности желудочного сока, а
также в условиях щелочной среды и повышенного
содержания желчных солей, характерных для
кишечного сока.
Выживаемость микроорганизмов в желудочно-
кишечном тракте оценивали путем определения
сохранения жизнеспособности в растворах,
имитирующих желудочный и кишечный сок. Для
этого готовили физиологический раствор со
значением pH = 2,0 (имитация желудочного сока) и
физиологический раствор со значением рН=8,2 и
0,2% желчи (имитация кишечного сока). Для
приготовления раствора, имитирующего кишечный
сок, использовали сухую желчь крупного рогатого
скота. Культуры инкубировали в жидкой
питательной среде МПБ в течение 48 часов, после
чего вносили в приготовленные растворы и
выдерживали при температуре 37(±1)°С. В растворе,
имитирующем желудочный сок, выживаемость
оценивали через 5, 15 и 40 минут, в растворе,
имитирующем кишечный сок - через 10, 30 минут и
через 3 часа. Титр микроорганизмов оценивали по
методу Коха.
Таблица 2
Выживаемость Вас. subtilis ВП
Имитирующие растворы Время, мин Титр В. subtilis ВП, КОЕ/мл
5 1,7×106
15 1,5×106
Физиологический раствор, рН=2
40 1,5×106
10 2,8×107
30 2,6×107
Физиологический раствор, рН=8,
0,2% желчи
180 1,6×106
Культура Вас. subtilis ВП способна к сохранению
жизнеспособности в жидкостях, имитирующих
желудочный и кишечный сок.
Пример 3.
Для определения пробиотической
эффективности Вас. subtilis ВП были взяты 2
группы мышей (10 особей) с выраженными
изменениями состава кишечной микрофлоры
вследствие антибиотико-ассоциированного

4. 29271
4
дисбактериоза (гентамицин). Животных
рассаживали в индивидуальные кюветы. Одной
группе животных вводили перорально суспензию
Bacillus subtilis ВП ежедневно двукратно в течение 7
суток. Другая группа животных контроль. У
животных обеих групп в начале эксперимента и на 7
сутки введения препаратов отбирали фекальные
массы для определения общего количества
микроорганизмов, а также бифидобактерий,
лактобактерий и эшерихий на 1 г фекалий (КОЕ/г).
Результаты эффективности
Титр клеток, КОЕ/гМикроорганизмы
Исходный (среднее по
двум группам)
Через 7 суток после
введения Вас. subtilis ВП
Через 7 суток без введения
пробиотика (контроль)
общее микробное число 4,2 ± 0,7×103
6,5 ± 0,8×107
7,4 ± 0,8×105
Bacillus sp. 0,0 6,3 ± 0,7×106
0,0
бифидобактерии 1,7 ± 0,5×103
1,4 ± 0,5×106
1,3 ± 0,4×104
лактобактерии 5,6 ± 0,8×101
7,0 ±0,4×105
3,3 ± 0,4×104
эшерихии 2,2 ± 0,4×101
2,6 ± 0,4×105
1,2 ± 0,5×103
Полученные результаты свидетельствуют о
восстановлении нормальной микрофлоры
кишечника у мышей с антибиотико-
ассоциированным дисбактериозом при пероральном
ведении пробиотической культуры Вас. subtilis ВП.
Полученные данные факты говорят о
перспективности использования штамма Вас. subtilis
ВП для профилактики желудочно-кишечных
заболеваний животных.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Штамм бактерий Bacillus subtilis ВП,
депонированный в ТОО «КазНИИППП» под
номером В-346, используемый для получения
лечебно-профилактического препарата с
пробиотическим эффектом для животноводства.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор К. Нгметжанова