1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28545
(51) A61K 36/00 (2006.01)
A61P 37/04 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/0956.1
(22) 18.07.2013
(45) 16.06.2014, бюл. №6
(72) Самофалов Иван Евгеньевич; Бурашева Гаухар
Шахмановна; Литвиненко Юлия Алексеевна;
Тулеуханов Султан Тулеуханович; Бактыбаева
Ляйля Кыргызбаевна
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Казахский
национальный университет им. аль-Фараби"
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) Предварительный патент РК №14531, кл. А61K
35/78, 15.07.2004
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО СРЕДСТВА
ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
(57) Изобретение относится к медицине, а именно к
химико-фармацевтической промышленности, и
касается способа получения вещества, обладающего
иммуностимулирующей активностью, которое
может быть использовано в комплексной терапии
хронических, вялотекущих и рецидивирующих
заболеваний в качестве препарата, усиливающего
иммунный ответ для коррекции нарушений системы
иммунитета при лечении заболеваний разной
этиологии: нарушений обмена веществ, эрозивно-
язвенные поражений желудочно-кишечного тракта,
псориаза, нейродермитов, а также сердечно-
сосудистых и онкологических заболеваний.
Сущность способа заключается в экстракции
надземной части Сведы мелколистной (Suaeda
microphylla) 70% водным этиловым спиртом трижды
при соотношении сырья : экстрагент - 1:5 в течении
12 часов при температуре 20-28°С, с последующим
фильтрованием извлечений, концентрированием в
вакууме водоструйного насоса при температуре 35-
40°С и высушиванием досуха методом сублимаций
в аппарате для лиофильной сушки Иней-4.
Технический результат заключается в упрощении
процесса и расширении арсенала
иммуностимулирующих средств, а также в
получении продукта, обладающего сильно
выраженным иммуностимулирующим эффектом.
(19)KZ(13)A4(11)28545
2. 28545
2
Изобретение относится к области медицины,
точнее к иммунологии, и касается средств,
обладающих иммуностимулирующим действием,
применяемых для лечения и профилактики
заболеваний, связанных с недостаточностью
иммунной системы при хронических
рецидивирующих заболеваниях воспалительного
характера, в случаях недостаточной эффективности
антибактериальной и противовоспалительной
терапии.
В настоящее время в медицине известны
средства синтетического и природного
происхождения, применяемые для стимуляции
иммунной системы. К ним относятся вещества
микробного (бактериального и грибкового)
происхождения (продигиозан, пирогенал,
рибомунил, нуклеинат натрия), вещества
растительного происхождения (тонзилгон, иммунал,
различные препараты эхинацеи),
иммунорегуляторные пептиды естественного
происхождения: препараты из вилочковой железы
(тималин, тактивин, тимоптин, вилозен); препараты
из селезенки (спленин); препараты из костного
мозга: миелопид; цитокины (натуральные и
рекомбинантные), синтетические и химически
чистые иммуномодуляторы: аналоги препаратов
эндогенного происхождения (тимоген, иммунофан,
ликопид); лекарственные препараты (даларгин,
левамизол, дибазол, дитиокарб, полиоксидоний)
[Лесков В.П., Чередеев А.Н., Горлина Н.К.,
Новоженов В.Г. Клиническая иммунология для
врачей. М, 1997. c.124; Новиков Д.К., Деркач Ю.Н.,
Новиков П.Д. Иммунотропные лекарства // В мире
лекарств. - 1999. №2. c.48-57; Утешев B.C.,
Сергеев А.С, Коростелев С.А. Анализ современных
направлений в создании иммунотропных средств //
Эксперим. и клинич. фармакол. - 1995. - №3. c.3-7:
Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные представления
об иммунотропных лекарственных средствах //
Иммунология. - 1996. - №6. c.4-9; Ширинский B.C.
Вторичные иммунодефицит -проблемы диагностики
и лечения. Новосибирск, 1997. с.111].
Наличие побочных эффектов у большинства
перечисленных препаратов в виде озноба,
повышения температуры тела, головной боли,
диспепсических нарушений, болезненности в месте
парентерального введения препарата, отрицательное
влияние при беременности, астме, аллергических
заболеваниях в значительной мере ограничивают
применение многих лекарственных средств с
иммуностимулирующим действием.
Основными преимуществами препаратов
растительного происхождения являются их
многосторонность и мягкость воздействия на
организм, отсутствие или незначительный побочный
эффект, хорошая переносимость больными. Также, в
отличие от синтетических, они более дешевые, не
обладают кумулятивными свойствами.
Поэтому задача поиска профилактических и
лечебных средств растительного происхождения
остается актуальной.
Целью настоящего изобретения является
увеличение ассортимента иммуностимулирующих
средств растительного происхождения.
Микробиологические исследования,
проведенные в лаборатории экологической
физиологии и хронобиологии НИИ проблем
биологии и биотехнологии при КазНУ имени аль-
Фараби свидетельствуют о том, что водно-
спиртовый экстракт сведы мелколистной (Suaeda
microphylla) семейства маревых (Chenopodiaceae)
обладает иммуностимулирующим действием.
Известен способ получения
иммуностимулирующего средства в виде сухого
препарата, полученного из надземной части
пятилистника кустарникового (Pentaphylloides
fruticosa). Предложенное средство получают путем
экстрагирования предварительно высушенной
надземной части растения лапчатки кустарниковой
75%-ным спиртом, сгущают полученный экстракт
до объема 20% от массы взятого сырья до полного
удаления остатков спирта. Полученный водный
раствор обрабатывают 3 раза хлороформом в
соотношении 1:3 для удаления смолистых
сопутствующих веществ и упаривают в вакуум-
сушильном шкафу (Патент RU 2072865, МПК А61K
35/00, опубл. 10.02.1997).
Недостатком данного метода является
использование токсичного дорогостоящего
экстрагента.
Известен способ получения
иммуностимулирующего средства в виде
высушенной измельченной надземной части, или
водной или спиртовой вытяжки надземной части
лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L)
Maxim.
Средство получали следующими способами:
Способ 1. Надземную часть лабазника
вязолистного высушивают и измельчают до
мелкодисперсного порошка;
Способ 2. Высушенную измельченную
надземную часть лабазника вязолистного кипятят в
дистиллированной воде при соотношении сырья и
экстрагента 1:9 на водяной бане в течение 15 мин,
затем остужают в течение 45 мин, фильтруют через
4 слоя марли, после чего упаривают досуха;
Способ 3. Высушенную измельченную
надземную часть лабазника вязолистного заливают
40% этиловым спиртом при соотношении сырья и
экстрагента 1:9, настаивают 14 суток, полученный
экстракт фильтруют через 4 слоя марли, после чего
упаривают досуха;
Способ 4. Высушенную измельченную
надземную часть лабазника вязолистного заливают
70%> этиловым спиртом при соотношении сырья и
экстрагента 1:9, настаивают 14 суток, полученный
экстракт фильтруют через 4 слоя марли, после чего
упаривают досуха (Патент RU 2246962, МПК А61K
35/04, опубл. 27.02.2005). Недостатком первого
способа является неподготовленность средства к
употреблению; недостатком второго - крайне
непродолжительный срок хранения; третий и
четвертый способы относительно продолжительны
во времени и требуют нагрева до сравнительно
3. 28545
3
высоких температур, что влечет высокие
энергозатраты и может привести к разрушению
некоторых важных групп БАВ растения.
Наиболее близким аналогом к предлагаемому
способу является способ получения
иммуностимулирующего средства в виде экстракта
корня репейника гладкосеменного (Arctium
leiospermum). Его получают следующим способом:
корни коричнево-красного цвета у растений первого
года существования выкапывают в октябре, после
опадания листьев, и измельчают до размеров до
размеров 3 мм, полученное сырье экстрагируют
водой, соотношение сырья и воды 1:10; время
экстракции - 3 часа; температура экстракции - 80°С.
Водные извлечения фильтруют через бумажный
фильтр, сгущают до 1/3 первоначального объема на
вакуум-выпарном аппарате, сушат в вакуум-
сушильном шкафу до остаточной влажности 5%;
полученный препарат темно-коричневого цвета с
приятным специфическим запахом, горьковато-
вяжущим вкусом (Предварительный патент РК
№14531, МПК А61K 35/78, опубл. 15.07.2004, бюлл.
№7).
Недостатком всех перечисленных средств
является их получение из растений,
произрастающих на особых видах почв. В отличие
от перечисленных растений, сведа мелколистная
(Suaeda microphylla) способна произрастать на
степных, пустынных, соленых и обедненных почвах,
что значительно упрощает и удешевляет
производство сырья [Байтенов М. С. Флора
Казахстана. - Алматы: Гылым, 2001. Т. 3. с.274].
Задачей настоящего изобретения является
разработка способа получения
иммуностимулирующего средства из растительного
сырья сведа мелколистная (Suaeda microphylla).
Технический результат - упрощение процесса и
расширение арсенала средств, проявляющих
иммуностимулирующее действие.
Поставленная задача достигается предлагаемым
способом получения иммуностимулирующего
средства, включающим экстракцию растительного
сырья водным органическим растворителем, с
последующим фильтрованием извлечений,
концентрированием и высушиванием досуха, но в
отличие от известного способа, в качестве
растительного сырья используют надземную часть
сведы мелколистной, в качестве экстрагента - 70%
водный этиловый спирт при соотношении сырье :
экстрагент - 1:5, процесс экстракции повторяют
трижды в течение 24 часов при температуре 20-
28°С, и концентрирование проводят в вакууме
водоструйного насоса при температуре 35-40°С на
аппарате для лиофильной сушки Иней-4.
Новым в предлагаемом изобретении является то,
что выявлено новое свойство надземной части
сведы мелколистной, а именно - ее
иммуностимулирующее действие.
В результате литературного анализа было
установлено, что препараты на основе сведы
мелколистной в народной и традиционной медицине
не известны. Имеется информация о том, что сведа
мелколистная является зимовым кормовым
растением для скота (Байтенов М. С. Флора
Казахстана. - Алматы: Гылым, 2001. Т. 3. с.274).
В качестве растительного сырья используют
надземную часть сведы мелколистной (Suaeda
microphylla). Сырье экстрагируют 70% водно-
этиловым спиртом при соотношении сырья к
экстрагенту 1:5, потому что этот растворитель
является оптимальным, так как забирает до 40%
биологически активных веществ.
Действующими веществами данного
фитопрепарата являются фенолы, флавоноиды и их
гликозиды, феноло- и аминокислоты, углеводы,
дубильные вещества. Качественными реакциями с
использованием специфических проявителей
обнаружены алкалоиды, кумарины и полисахариды.
Определен качественный состав в присутствии
веществ-метчиков и количественное содержание
основных групп БАВ растительного средства по
методикам Государственной Фармакопеи XI
издания (часть 2).
По результатам хроматографического анализа в
фитопрепарате обнаружены следующие БАВ: 20
аминокислот (аланин, глицин, лейцин, изолейцин,
валин, треонин, пролин, метионин, серии, цистин,
оксипролин, фенилаланин, тирозин, гистидин,
орнитин, аргинин, лизин, триптофан, глутаминовая
и аспарагиновая кислоты), 3 углевода (фруктоза,
галактоза, рамноза), 2 фенола (резорцин,
гидрохинон), алкалоиды, 2 флавоноида
(изорамнетин, кверцетин). Количественное
содержание основных групп БАВ фитопрепарата
представлено в таблице 1.
Таблица 1
Данные количественного анализа компонентов фитопрепарата
Группа БАВ Содержание в %
Флавоноиды 3,02%
Аминокислоты 3,67%
Кумарины 0,68%
Органические кислоты 4,24%
Пример 1
100 г измельченной надземной части сведы
мелколистной заливают 250-500 мл 70% водно-
этилового спирта, то есть при соотношении сырье :
экстрагент - 1:5, и настаивают в течение 12 часов без
доступа света при температуре 20-28°С.
Содержимое колбы охлаждают, тщательно
взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр в
сухую колбу. Процесс экстракции повторяют еще
трижды указанным выше способом. Извлечения
4. 28545
4
объединяют, фильтруют через тот же фильтр в ту же
колбу и концентрируют досуха в вакууме
водоструйного насоса при температуре 35-40°С до
объема 100-120 мл. Затем извлечение заливается в
специальные формы и помещается в морозильную
камеру с температурой -20°С на 12 часов. После
этого замороженный экстракт сублимируют на
аппарате для лиофильной сушки Иней-4. Получают
10г фитопрепарата.
В таблицах представлены данные влияния
температуры, времени экстракции и мольного
соотношения сырье-экстрагент на конечный
продукт в 8 примерах.
Таблица 2
Влияние кратности экстракции на конечный результат
№
п/п
Температура, °С Соотношение
сырьегэкстрагент
Время
экстракции, час
Кратность
экстракций
Выводы
1 24 1:5 12 1 Неполная
экстракция
2 24 1:5 12 3 Результат
достигается
полностью
3 24 1:5 12 4 Извлекаются
балластные
вещества
Таблица 3
Влияние мольного соотношения сырье : экстрагент на конечный результат
№
п/п
Соотношение
сырье: экстрагент
Температура, °С Время
экстракции, час
Кратность
экстракций
Выводы
1 1:5 24 12 3 Результат достигается
полностью
4 1:3 24 12 3 Результат достигается
на 90%
5 1:2 24 12 3 Недостаточное
количество
растворителя, сырье
впитывает много
растворителя
6 1:6 24 12 3 Расход большого
количества
растворителя
Таблица 4
Влияние времени экстракции на конечный результат
№
п/п
Соотношение
сырье: экстрагент
Температура, °С Время
экстракции, час
Кратность
экстракций
Выводы
1 1:5 24 12 3 Результат достигается
полностью
7 1:5 24 6 3 Происходит неполная
экстракция основного
продукта
8 1:5 24 24 3 Наравне с основным
продуктом образуется
ряд побочных
продуктов
5. 28545
5
Учитывая полученные данные, выбрано 12-ти
часовое время экстракции надземной части сведы
мелколистной при температуре 20-28°С.
Полученный экстракт из надземной части сведы
мелколистной проявляет иммуностимулирующую
активность, действующим началом которой
являются, вероятно, полифенолы и алкалоиды.
Иммуностимулирующая активность средства
изучена в лаборатории экологической физиологии и
хронобиологии НИИ проблем биологии и
биотехнологии при КазНУ имени аль-Фараби, где
выявлено, что водно-спиртовый экстракт сведы
мелколистной обладает миелостимулирующим
действием на гранулоцитарные лейкоциты.
Методы проведения испытаний. В работе
использовали здоровых половозрелых животных -
лабораторных крыс обоего пола, 10-15 нед.
возраста, массой тела 210-280 г. До и в период
эксперимента контрольные и опытные животные
содержались в одинаковых стандартных условиях,
на стандартном рационе, по 6 особей в клетке. Забор
крови проводили из орбитальной вены крыс,
наркотизированных слабым эфирным наркозом в
09.00 часов утра. Анализ крови проводили на
гематологическом анализаторе для лабораторных
животных «Аbacus junior vet» (пр-во Diatron, Дания).
Миелосупрессию вызывали внутримышечным
введением цитостатика -циклофосфамида натрия в
дозе 30 мг/кг веса животного. Опытным группам
животных соединения вводили в дозе 10 мг/мл
(растворитель физиологический раствор),
внутримышечно в объеме 0,5 мл ежедневно в
течение 3 дней, спустя 3 дня после последнего
введения определяли количество клеток в
периферической крови. Контрольным животным в
таком же объеме и режиме вводили
физиологический раствор. Препаратом сравнения
являлся пантогематоген.
Данные о иммуностимулирующей активности
фитопрепарата
wbc общий лейкоцитарный показатель
lym лимфоцитарный показатель
mid моноцитарно-эозинофильный показатель
gra гранулоцитарный показатель
1у относительный лимфоцитарный показатель
mi относительный моноцитарно-эозинофильный
показатель
gr относительный гранулоцитарный показатель
rbc общий эритроцитарный показатель
hgb гемоглобин
net гематокрит
mcv средний объем эритроцитов
mch среднее содержание гемоглобина
mchc средняя концентрация гемоглобина в
эритроцитах
rdwc широта распределения эритроцитов
pit тромбоцитарный показатель
pet количество тромбокрита
mpv средний объем тромбоцитов
pdwc широта распределения тромбоцитов.
Таблица 5
Контрольные показатели иммуностимулирующей активности
Название
показателя
физ раствор1 физ раствор2 физ растворЗ физ раствор24 Среднее
значение
Средняя
ошибка
WBC 3,7 1,87 1,87 3,7 2,785 0,93
LYM 2,42 0,67 0,67 2,42 1,545 0,9
MID 0,02 0,21 0,21 0,02 0,115 -0,095
GRA 1,26 0,99 0,99 1,26 1,125 0,13
LY% 65,3 36 36 65,3 50,65 14,65
ML% 0,7 11,3 11,3 0,7 6 5,3
GR% 34 52,7 52,7 34 43,35 9,3
RBC 5,83 5,5 5,5 5,83 5,665 0,1
HGB 97 95 95 97 96 1
HCT 28,93 27,26 27,26 28,93 28,095 0,835
MCV 50 50 50 50 50 0
MCH 16,7 17,3 17,3 16,7 17 0,3
MCHC 336 349 349 336 342,5 6,5
RDWc 13,8 13,3 13,3 13,8 13,55 0,22
PLT 498 396 396 498 447 51
PCT 0,35 0,28 0,28 0,35 0,315 0,035
MPV 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 0
PDWc 31,7 33 33 31,7 32,35 1,3
6. 28545
6
Таблица 6
Показатели иммуностимулирующей активности фитотерапевта
Фитопрепарат Фитопрепарат Фитопрепарат Среднее
значение
Средняя
ошибка
WBC 0,97 2,12 0,83 1,306667 0,33
LYM 0,71 0,99 0,53 0,743333 0,03
MID 0,03 0,02 0,11 0,053333 0,02
GRA 0,23 1,11 0,19 0,51 0,28
LY% 72,6 46,9 63,9 61,13333 -2,77
ML% 3,3 0,7 13,4 5,8 -4,2
GR% 24,1 52,3 22,7 33,03333 5,83
RBC 4,23 4,11 4,19 4,176667 0,06
HGB 81 79 77 79 -0,1
нет 24,08 23,74 24,14 23,98667 0,24
MCV 57 58 58 57,66667 -0,34
MCH 19,1 19,2 18,4 18,9 0,5
MCHC 336 332 319 329 10
RDWc 17,1 17,2 17,4 17,23333 0,13
PLT 285 555 264 368 83
PCT 0,19 0,36 0,17 0,24 0,07
MPV 6,6 6,4 6,4 6,466667 0,06
PDWc 30,7 30,7 30,7 30,7 0
Из данных, представленных в таблицах 5 и 6,
видно, что в группах введения препарата общий
лейкоцитарный показатель составил
(5,64±0,03)·109/L крови против контрольного
значения (2,79±0,65)T09/L крови, т.е. вырос в 2,02
раза. Абсолютное значение гранулоцитов в группе
введения препарата составило (26,27±2,28) ·109/L
против контрольного значения (1,13+0,0) ·109/L
крови, т.e. в 23,25 раза (р ≤ 0,01) превышая
контрольные образцы. Относительное значение в
группе введение препарата также превосходило
контрольные значение в 1,45 раза. Значимых
отличий в показателях моноцитов и лимфоцитов
зарегистрировано не было.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения вещества, обладающего
иммуностимулирующей активностью, включающий
трехкратную экстракцию растительного сырья с
последующей очисткой извлечений фильтрацией,
удаление растворителя путем концентрирования и
сублимации, отличающийся тем, что в качестве
растительного сырья используют надземную часть
сведы мелколистной (Suaeda microphylla), а в
качестве органического растворителя - 70% водный
этиловый спирт при соотношении сырье :
экстрагент - 1:5, экстракцию проводят трижды в
течение 24 часов при температуре 20-28°С,
концентрирование осуществляют в вакууме
водоструйного насоса досуха при температуре 35-
40°С с последующей заморозкой и лиофилизацией.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч