1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29934
(51) A61K 39/112 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0676.1
(22) 15.05.2014
(45) 15.06.2015, бюл. №6
(72) Егорова Наталья Николаевна; Мусаева Асия
Кыблашевна; Даугалиева Аида Тлековна
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) KZ 12825 A, 1997
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ
ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ТЕЛЯТ
(57) Изобретение относится к области ветеринарной
микробиологии, к способам получения
биопрепаратов против инфекционных болезней
животных и представляет собой способ получения
вакцины против сальмонеллеза телят.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в разработке способа
получения иммуногенной, безвредной вакцины,
создающий напряженный иммунитет против
сальмонеллеза у телят.
Способ получения живой вакцины против
сальмонеллеза телят, включает культивирование
аттенуированного штамма бактерии Salmonella
dublin В-0284 на плотной питательной среде в две
стадии, концентрирование полученной
бактериальной массы до 20 млрд м. к./см3
,
расфасовку, лиофилизацию в сахарозо -
желатиновой среде и получение целевого продукта.
(19)KZ(13)A4(11)29934

2. 29934
2
Изобретение относится к области ветеринарной
микробиологии, к способам получения
биопрепаратов против инфекционных болезней
животных и представляет собой способ получения
вакцины против сальмонеллеза телят.
Известен способ получения вакцины против
сальмонеллеза телят, включающий культивирование
аттенуированного штамма на питательной среде,
концентрирование полученной бактериальной массы,
расфасовку и лиофилизацию [Патент Республики
Казахстан №12825, Кл. А61К 39/112, 1997].
Недостатком данного способа является то, что
вакцина, полученная указанным способом, для
профилактики сальмонеллеза телят не обладает
достаточной безвредностью для телят.
Задачей изобретения является разработка
способа получения вакцины против сальмонеллеза
телят из аттенуированного штамма бактерии
Salmonella dublin, позволяющего повысить
иммуногенную активность вакцины и
эффективность профилактики сальмонеллеза телят,
не обладала бы реактогенными свойствами.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в разработке способа
получения иммуногенной, безвредной вакцины,
создающий напряженный иммунитет против
сальмонеллеза у телят.
Способ получения вакцины против
сальмонеллеза телят, включающий культивирование
аттенуированного штамма на питательной среде в
две стадии, концентрирование полученной
бактериальной массы, расфасовку и лиофилизацию,
в качестве аттенуированного штамма используют
штамм бактерии Salmonella dublin В-0284, который
культивируют на плотной питательной среде,
доводят концентрацию микробной массы до
20 млрд м. к./см3
, фасуют, лиофилизируют в
сахарозо - желатиновой среде и получают целевой
продукт.
Штамм культуры Salmonella dublin В-0284
депонирован в лаборатории генофонда
микроорганизмов ТОО «Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт»
(КазНИВИ).
Идентификацию штамма бактерии Salmonella
dublin В-0284, на основе которого изготавливается
вакцина, проводят по основным биологическим
свойствам (морфологическим, культуральным,
биохимическим, антигенным), согласно
определителю бактерий:Веrgеу’ s Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology /Department of Microbiology
and Molecular Genetics: Michigan State University:
USA, 2005, Volum 2, Part B, p. 764 - 799.
Штамм характеризуется следующими
признаками.
Морфологические признаки. Штамм бактерии
Salmonella dublin В-0284 палочки с закругленными
краями, реже овоидной формы, 2-4 мкм в длину и
0,2 - 0,4 мкм в ширину. Сальмонеллы подвижные, с
перитрихиально расположенными жгутиками, легко
окрашиваются анилиновыми красками,
грамотрицательные. Спор и капсул не образуют.
Культуральные свойства. Сальмонеллы - аэробы
или факультативные аэробы. Хорошо развиваются
на обычных питательных средах, оптимальная
температура роста 37°С, при pH среды 7,2 - 7,4. На
МПБ штамм бактерии Salmonella dublin В-0284
образует равномерное помутнение со слизистым
осадком, на МПА - серовато - голубоватые
опалесцирующие колонии, вокруг которых иногда
образуются периферические валики. При хранении
культуры довольно быстро диссоциируют в R -
формы. На среде Эндо сальмонеллы образуют
слегка розоватые прозрачные колонии; на висмут -
сульфитном агаре мелкие черные колонии с
металлическим блеском, участки среды под
колонией также окрашиваются в черный цвет; на
среде Плоскирева - бесцветные колонии. Для
культивирования сальмонелл используют также
среды накопления - селинитовую, Мюллера,
Кауфмана, Киллиана. Учет характера роста
необходимо проводить через 24-48 часов.
Биохимические свойства. Штамм бактерии
Salmonella dublin В-0284 не изменяет инозит,
глицерино - фуксиновый бульон, раффинозу,
салицин; образует сероводород и не образует
индола. Не ферментирует мочевину, лактозу,
сахарозу, не разлагает желатин. Ферментирует с
образованием кислоты и газа глюкозу, галактозу,
маннозу, арабинозу, рамнозу, маннит, мальтозу,
дульцит, сорбит, восстанавливает нитраты в
нитриты. Сальмонеллы растут на агаре Симмонса
(усваивают цитратно-амонийные соли). Реакция
Фогес-Проскауэра отрицательная (желтое
окрашивание среды).
Антигенная структура. У штамма бактерии
Salmonella dublin В-0284 имеются два основных
антигенных комплекса: О - антигена (соматический)
термостабильный 1,9, 12; Н-антиген
(термолабильный), белковой природы 1-я фаза g, р,
2-я фаза Н - антигена отсутствует. О-и Н- антигены
вызывают образование различных антител,
отличающихся по характеру агглютината.
О - агглютинация мелкозернистая, клетки
соединяются полярными поверхностями, образуя
мелкие агрегаты. Н - агглютинация характеризуется
образованием хлопьевидного рыхлого агглютината,
клетки соединяются своими жгутиками, происходит
полное обездвиживание сальмонелл.
Штамм бактерии В-0284 Salmonella dublin
относится к серологической группе Д.
Штамм бактерии Salmonella dublin В-0284
является аттенуированным вакцинным, не обладает
вирулентными свойствами для телят. Штамм
обладает слабой остаточной вирулентностью, его
вирулентность снижена в 25 раз по сравнению с
природным прототипом. За время хранения в
лабораторных условиях штамм не изменил
культурально - морфологические, биохимические
свойства, также антигенную структуру.
Штамм бактерии Salmonella dublin В-0284,
полученный из вирулентной культуры под влиянием
стрептомицина с последующей селекцией и отбором
клонов мутантов, отличается слабой
вирулентностью, выраженными иммуногенными

3. 29934
3
свойствами, отсутствием вирулентных и
реактогенных свойств. Образовывает сероводород и
не образовывает индола, не ферментирует лактозу и
сахарозу. Существенным отличием от штамма
бактерии Salmonella dublin В-0284 от вирулентного
прототипа является ауксотрофность в отношении
тиамина и никотиновой кислоты; штамм образует
аргинин - декарбоксилазу и слабо-лизин-
декарбоксилазу. Вакцинный штамм не реверсирует
при пассировании на восприимчивых животных
(белые мыши, куриные эмбрионы). Титр сыворотки
в РА 1:400 - 1:800.
Физиологические - прототроф, хемоорганотроф,
обладает дыхательным и бродильным типом
метаболима. Аэроб.
Серологические - при типизации с
диагностическими сальмонелезными сыворотками
имеет постоянную реакцию с О-сывороткой 1, 9, 12
и Н сывороткой 1-я фаза g,p.
Патогенные свойства. Штамм бактерии Salmonella
dublin В-0284 безвреден для белых мышей. При
подкожном введении белым мышам массой 16-18 г в
дозе 10 млн микробных клеток (0,2 см3
50 млн
взвеси суточной агаровой культуры сальмонелл) по
стандартному образцу ГИСК им. Тарасевича в
объеме 0,2 см3
, штамм не вызывает гибели более 2
белых мышей в течение 10 сут наблюдения.
Иммуногенность для белых мышей. Штамм
бактерии Salmonella dublin В-0284 обладает
выраженной иммуногенностью для белых мышей
массой 16 - 18 граммов, защищая 100% животных
при однократной подкожной иммунизации их живой
вакциной из штамма в дозе 10 млн микробных
клеток в объеме 0,2 см3
и последующим подкожным
заражением через 21 сутки 2,5 LD50 вирулентным
(контрольным) штаммом Salmonella dublin 373.
Выживаемость опытных животных составила 100%-
10 голов. Из 10 контрольных мышей аналогичной
массы, зараженных одновременно с
вакцинированными, погибли 8 животных. Срок
наблюдения 10 суток.
Пример 1. Питательной средой для изготовления
сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят
служит бульон Хоттингера (200-250 мг% аминного
азота), содержащий 10% печеночного экстракта,
0,4% пептона. Для приготовления питательной
среды используют основной перевар Хоттингера. На
1 кг мясного фарша добавляют 1,5 дм3
дистиллированной воды, подогретой до 40°С, и
подщелачивают 20% раствором едкого натра, так
чтобы концентрация водородных ионов была 7,8-
8,0. Затем на каждый килограмм фарша добавляют
150-170 г измельченной поджелудочной железы или
18-20 г панкреатина и на каждый дм3
смеси- 10 см3
хлороформа.
Ферментативное расщепление должно
продолжаться 5-6 сут при 40-45°С. Химические
показатели качественного перевара: общий азот -
800-1200 мг%; аминный азот -500-750 мг%;
триптофан - 100 150 мг%. Содержание (мг%)
общего азота определяют методом перегонки
Къельдаля; аминного азота (мг%) - формольным
титрованием; триптофана (мг%) - методом Пешкова.
Приготовление печеночного экстракта. На 400 г
свежей или свежезамороженной печени к. р. с. или
свиней, освобожденной от жира и пленок,
измельченной на кусочки по 30-50 г, добавляют
0,5 дм3
дистиллированной воды и кипятят в течение
часа, после чего фильтруют через ватно-марлевый
фильтр.
Приготовление питательной среды. Для
приготовления питательной среды к надосадочной
жидкости основного перевара Хоттингера
добавляют дистиллированную воду с таким
расчетом, чтобы содержание аминного азота было
не менее 200-250 мг%. Затем добавляют 10%
печеночного экстракта. 0,4% пептона, 3-4% агара.
Смесь кипятят в течение 30 минут, затем
устанавливают pH среды до 7,7-7,8 путем
добавления 20% едкого натра, добавляют 15%
дистиллированной воды на выкипание, после чего
добавляют 0,3% химически чистого хлорида натрия.
После растворения указанных ингредиентов
добавлением 20% едкого натра устанавливают pH
7,8-9,0. Среду кипятят 30 минут, отстаивают 1-1,5
часа, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
Для контроля стерильности приготовленную
питательную среду выдерживают термостате
72 часа при 37°С (отсутствие контаминации).
Готовая питательная среда должна быть стерильной,
прозрачной или слегка опалесцирующей, pH 7,4-7,6
и содержать аминный азот 200 -250 мг%.
Приготовление сахарозо - желатиновой среды В
кипящей дистиллированной воде растворяют 1,3-
2,0% желатина (pH 7,4-7,6), добавляют 10%
сахарозы. После растворения компонентов смесь
фильтруют через ватно-полотняный фильтр.
Стерилизуют 20 мин при 110°С, pH 7,0-7,2.
Приготовление посевного материала. Для
изготовления сухой живой вакцины против
сальмонеллеза телят многократно используют
отдельную ампулу с лиофилизированной культурой
штамма Salmonella dublin В-0284. Затем проверяют
морфологические, культуральные, биохимические
свойства и агглютинабельность штамма бактерии
Salmonella dublin В-0284 с монорецепторными
сыворотками О-I, IX, XII и Н - g,p производства
Краснодарской биофабрики и Санкт-
Петербургского научно-исследовательского
института вакцин и сывороток и предприятия по
производству бактерийных препаратов. Бактерии
штамма Salmonella dublin В-0284 агглютинируются
сыворотками О-I/+++/, IХ/++++/, ХII/+++/,
Н-g,p /+++/. Ампулу с сухим штаммом вскрывают и
добавляют в нее 2 см3
стерильного
физиологического раствора.. Полученную взвесь
заливают по 1 см3
в два флакона с бульоном
Хоттингера (вместимость флакона 100 см3
, объем
среды - 1/3 флакона). Выращивают в термостате
14-15 часов при температуре 37±1,0°С (культура
первой генерации).
Культуру первой генерации проверяют на
чистоту микроскопией мазков, окрашенных по
Граму, типичность роста, стерильность и засевают
50 см3
в бутыль, содержащую 10 дм3
бульона
Хоттингера (культура второй генерации).

4. 29934
4
Культивирование проводят при 37±1,0°С 18-20
часов. Культура второй генерации служит посевным
материалом для получения в последующем
биомассы.
Выращенную и проверенную на чистоту
суточную матриксную культуру второй генерации с
соблюдением условий стерильности засевают в
бутыли со стерильной питательной средой,
охлажденной до 37-30°С из расчета 5-10%
матриксной расплодки к общему объему
питательной среды, одновременно добавляют 0,1 %
(в перерасчете на сухое вещество) стерильного 40%
раствора глюкозы 5-10%.
Культуру, засеянную в бутыли, выращивают
18-20 часов при (37±1,0)°С с постоянным
перемешиванием и непрерывной аэрации при
(37±1,0)°С. В процессе выращивания культуры
через 5-6 часов после засева берут пробу для
определения pH, чистоты роста и концентрации
микробных тел. Добавляют 40% раствор глюкозы и
продолжают выращивать еще в течение 4-6 часов.
Выращенную культуру проверяют на чистоту
популяции путем микроскопии и высева в пробирки
с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, агар
Сабуро, на чашки Петри с МПА. Культура должна
агглютинироваться монорецепторными
сыворотками О-I, IX, XII и Н-g,p. После получения
результатов, подтверждающих отсутствие
загрязнения посторонней микрофлорой выращенной
культуры (просмотр посевов, микроскопия),
производят определение концентрации микробных
тел по оптическому стандарту мутности ГИСК
им. Тарасевича. Микробную массу хранят при
температуре от 2 до 4°С 1-1,5 суток. Культура
сальмонелл должна иметь концентрацию 20 млрд
микробных клеток в 1 см3
и pH 7,2-7,4.
Бактериальную суспензию, разведенную средой
для лиофилизации до концентрации 20 млрд ±1,0
млрд микробных клеток в 1,0 см3
по оптическому
стандарту мутности, расфасовывают по 4,0 см3
в
стерильные ампулы . Погрешность расфасовки ±1%.
После этого ампулы с вакциной подвергают
лиофильной сушке и запаивают под вакуумом.
Пример 2. Контроль вакцины сухой живой
против сальмонеллеза телят.
Физико-химические и биологические свойства
Внешний вид Сухая мелкопористая масса белого
или серовато-желтого цвета. Внешний вид, цвет,
наличие посторонней примеси, плесени, трещин
ампул проверяют визуально. Одновременно
проверяют прочность запайки ампул, упаковку и
правильность нанесения маркировки.
Вакуума в ампулах
Наличие вакуума в ампулах определяют с
помощью аппарата типа «д'Арсонваль» или «Тесла».
В ампулах с сухой вакциной должен быть вакуум.
Фиолетово-яркое свечение, сопровождающееся
характерным потрескиванием при проверке
аппаратом «д'Арсонваля»
Растворимость
При добавлении в ампулы с вакциной
физиологического раствора или воды, равном
объему до высушивания, сухая масса должна
полностью раствориться в течение 2-5 мин, образуя
гомогенную взвесь белового или серовато-желтого
цвета без хлопьев, комочков, осадка.
Для проведения испытаний используют три
ампулы с сухой вакциной, в которые после их
вскрытия вносят физиологический раствор в объеме,
равном объему вакцины до высушивания (по 4 см3
).
Содержимое ампул после встряхивания должно
полностью ресуспендироваться в течение (2-5) мин.
Массовая доля влаги
Массовая доля влаги должна быть не более 3%.
Концентрации водородных ионов (pH)
Концентрации водородных ионов (pH) в вакцине
определяют потенциометром рН-121 или другим
прибором того же класса точности, предварительно
растворив препарат.
Количество микробных клеток в 1,0 см3
по
стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича
20 млрд м.к./см3
.
Количество живых сальмонелл в 1,0 см3
, млрд
10-12 млрд живых м.к./см3
Стерильность
Стерильной считается вакцина не
контаминированная посторонней микрофлорой и
грибами (плесенью). Не допускается следов
оттаивания, трещин ампул.
Типичность роста культуры
Посевы выдерживают в течение 10 сут и
ежедневно просматривают визуально на типичность
роста сальмонеллезной культуры штамма В-0284
Salmonella dublin 15 S, на МПА и среду Эндо на
чашках Петри - 1 сут при температуре (37±1)°С.
Пробирки с посевами на среде Сабуро выдерживают
10 сут при температуре (20-22)°С. На питательных
средах должен быть типичный рост вакцинного
штамма бактерии Salmonella dublin
В-0284 - однородные грамотрицательные палочки,
на среде Сабуро не должно быть роста плесени.
Роста посторонней микрофлоры не допускается.
В посевах вакцины в МПБ должен быть
характерный рост сальмонеллезной культуры
штамма бактерии Salmonella dublin В-0284 в виде
равномерного помутнения пробирки или флакона со
средой. Недопустим рост с образованием пленки,
помутнением среды, через 24 часа образуется
осадок. На поверхности МПА должен быть рост
культуры штамма бактерии B-0284 Salmonella dublin
в виде полупрозрачных, голубоватых колоний
S-формы, диаметром 2-4 мм. На среде Эндо через
(6-18) ч культивирования вырастают бесцветные
полупрозрачные выпуклые колонии.
Определение количества микробных клеток в
1,0 см3
Вакцину в ампулах (флаконах) разводят до
первоначального объема стерильным
физиологическим раствором, смешивают
содержимое двух ампул в одной пробирке и
определяют количество сальмонелл в 1,0 см3
по
стандартному образцу мутности ГИСК
им. Тарасевича. Оно должно соответствовать (20±1)
млрд микробных клеток в 1,0 см3
.
Определение количества живых сальмонелл

5. 29934
5
Для определения количества живых микробных
клеток готовят две пробы, каждая из которых
состоит из двух ампул с вакциной. Вакцину в
ампулах разводят до первоначального объема
стерильным физиологическим раствором,
смешивают содержимое двух ампул в одной
пробирке и определяют количество сальмонелл в
обеих пробах по стандартному образцу мутности
ГИСК им. Тарасевича. на должна соответствовать
20±1 млрд микробных клеток в 1,0 см3
. Из обеих
проб методом десятикратных разведений
отдельными пипетками готовят разведения
10-7
и 10-8
. Из каждого разведения обеих проб делают
высевы на МПА на 3 чашки Петри. Чашки с
посевами помещают в термостат при температуре
37-38°С на 24-36 ч, после чего подсчитывают
количество колоний по каждому разведению.
Полученные показатели суммируют и делят их на
количество чашек, определяют среднее количество
живых бактерий для каждого разведения,
содержащееся в 0,1 см3
. Затем средние показатели
по каждому разведению увеличивают в 10 раз,
получая количество микробных клеток 1,0 см3
данного разведения. После этого добавляют столько
нулей, каков показатель разведения вакцины,
получая концентрацию микробных клеток 1,0 см3
по
каждому разведению.
Среднюю концентрацию микробных клеток в
1,0 см3
выводят, сложив результаты дух взятых
разведений и разделив их на два.
Количество живых сальмонелл по отношению к
содержанию их в стандартном образце должно быть
не менее 40% (10 млрд в 1 см3
).
Количество доз вакцины устанавливают путем
деления показателя живых сальмонелл в 4 см3
на
0,5 млрд живых микробных клеток.
Иммунизирующая доза для телят соответствует
0,5 млрд живых микробных клеток.
Определение безвредности
Сущность метода заключается во введении
вакцины в дозе 10 млн микробных клеток в объеме
0,2 см3
лабораторным животным. Для испытания
используют 3 ампулы вакцины, разводят
стерильным физиологическим раствором до
концентрации 50 млн микробных клеток в 1,0 см3
. В
каждую ампулу вносят стерильный
физиологический раствор в объеме, равном объему
до высушивания. Растворенную вакцину вакцину из
ампул переносят в стерильную пробирку и из общей
массы готовят разведение ее на стерильном
физиологическом растворе с концентрацией 50 млн
микробных клеток в 1,0 см3
. Безвредность каждой
серии вакцины проверяют на 10 белых мышах
массой 16-18 г, которым вводят вакцину
внутрибрюшинно в дозе 10 млн микробных клеток в
объеме 0,2 см3
. Вакцина считается безвредной, если
не вызывает гибели более 2 белых мышей в течение
10 сут наблюдения. Допускается у привитых
лабораторных животных слабое угнетение на 1-
2 сут, которое нормализуется на 3-4 сут.
Определение иммуногенности
Вакцину из смеси трех ампул разводят
стерильным физиологическим раствором до
концентрации 50 млн микробных клеток в 1,0 см3
.
Для определения иммуногенной активности
обирают 20 белых мышей массой 16-18 г, из них 10
белым мышам вакцину вводят подкожно в область
спины в дозе 10 млн микробных клеток в объеме
0,2 см3
. Через 20 сут 10 иммунизированных и 10
контрольных белых мышей заражают подкожно в
дозе 2,5 LD50 (2,5 млн м. к.) вирулентной культурой
контрольного штамма Salmonella dublin 373.
Смертельную дозу контрольного штамма
определяют титрованием на белых мышах массой
16-18 г. Вакцину считают активной при выживании
8 опытных белых мышей и гибели 8 контрольных
белых мышей в течении 10 суток. Наблюдение за
животными ведут в течение 5 суток после гибели
восьмой контрольной белой мыши. Вакцина
считается иммуногенной, если 8 из 10 опытных
(привитых) и гибели не менее 8 из 10 контрольных
(не привитых) белых мышей. Срок наблюдения
- 10 сут.
Апробация вакцины сухой живой против
сальмонеллеза телят в неблагополучных по данной
инфекции хозяйствах Алматинской области
показала, что препарат является безвредным,
ареактогенными и иммуногенно активным для
телят. Профилактическая эффективность составляет
95-98%. Вакцину применяют однократно телятам 3-
4 месячного возраста в дозе 0,5 млрд живых
микробных клеток подкожно в среднюю треть шеи.
Срок годности вакцины 1 год со дня её
изготовления.
Предложенный способ позволит получить
вакцину на основе штамма бактерии В-0284
Salmonella dublin, обладающую высокой
иммуногенностью, безвредностью и
эффективностью для профилактики сальмонеллеза
телят.
Применение вакцины, изготовленной данным
способом, позволит профилактировать сальмонеллез
у телят и значительно сократить экономический
ущерб вследствие увеличения поголовья телят.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения вакцины против сальмонеллеза
телят, включающий культивирование
аттенуированного штамма на питательной среде в две
стадии, концентрирование полученной
бактериальной массы, расфасовку и лиофилизацию,
отличающийся тем, что в качестве
аттенуированного штамма используют штамм
бактерии Salmonella dublin В-0284, который
культивируют на плотной питательной среде,
доводят концентрацию микробной массы до 20 млрд
м. к./см3
, фасуют, лиофилизируют в сахарозо -
желатиновой среде и получают целевой продукт.
Верстка Н. Киселева
Корректор К. Нгметжанова