Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ BIẾN DỊ DI TRUYỀN CỦA NGUỒN TÔM
SÚ (PENAEUS MONODON) BỐ MẸ THẾ HỆ ĐẦU
TIÊN CHO CHƢƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG
Nghành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên nghành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn: Th.S BÙI THỊ LIÊN HÀ
Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ LÝ
MSSV: 1151110018 Lớp: 11DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2015

2. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của
tôi được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu thực nghiệm và dưới
sự hỗ trợ từ người hướng dẫn khoa học là Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà, thuộc Viện
Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Các số liệu, hình ảnh, những kết quả trong bài
báo cáo là trung thực. Đề tài có sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu
của các tác giả, cơ quan tổ chức khác và cũng đã được thể hiện trong phần tài liệu
tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 8 năm 2015
Sinh viên
Lê Thị Lý

3. LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn thầy Th.s Phạm Minh Nhựt - Giảng
viên khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường đã giới thiệu em vào làm
đề tài ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường Đại học Công Nghệ
TP. HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập tại trường. Và
đồng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô thuộc Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm -
Môi trường đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian qua.
Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Th.s Bùi Thị Liên Hà
cùng các anh chị thuộc Phòng Sinh học thực nghiệm đã chỉ bảo ân cần và tận tình
giúp đỡ em hoàn thành tốt thời gian làm đề tài.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã luôn
bên em, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em được học tập và đạt kết quả như ngày hôm
nay.
Trong quá trình nghiên cứu cũng như trong quá trình làm báo cáo, khó tránh
khỏi những khiếm khuyết nhất định, em rất mong nhận được sự phê bình cũng như
các ý kiến đóng góp của quý thầy cô giáo.
Em xin chân thành cảm ơn !
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 8 năm 2015
Sinh viên
Lê Thị Lý

4. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC..............................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.....................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................vii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH .....................viii
LỜI MỞ ĐẦU.......................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài..............................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................................2
3. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................................2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................3
1.1. Giới thiệu về tôm sú.................................................................................................3
1.1.1. Phân loại ..........................................................................................................3
1.1.2. Cấu tạo.............................................................................................................3
1.1.3. Phân bố ............................................................................................................4
1.1.4. Chu kì sống......................................................................................................5
1.1.5. Sinh sản ...........................................................................................................7
1.1.6. Đặc điểm sinh trưởng ......................................................................................8
1.2. Giới thiệu chung về đa dạng di truyền.....................................................................9
1.2.1. Đa dạng di truyền ............................................................................................9
1.2.2. Quần thể.........................................................................................................10
1.2.3. Sự đa dạng di truyền trong quần thể..............................................................11
1.2.4. Nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng di truyền trong quần thể ..........................11
1.2.5. Vai trò của di truyền và di truyền quần thể trong nuôi trồng thủy sản..........12
1.3. Kỹ thuật Microsatellite ..........................................................................................14
1.3.1. Định nghĩa về Microsatellite .........................................................................14
1.3.2. Giới hạn của Microsatellite ...........................................................................15
1.3.3. Các loại Microsatellite...................................................................................16
1.3.4. Sự phát triển của Primer Microsatellites .......................................................17
1.3.5. Cơ chế hình thành Microsatellite ..................................................................17

5. Đồ án tốt nghiệp
ii
1.3.6. Vai trò của Microsatellite..............................................................................19
1.3.7. Các phương pháp phát hiện Microsatellite....................................................20
1.4. Tình hình nghiên cứu.............................................................................................24
1.4.1. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước..........................................25
1.4.2. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới.........................................26
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .............................................28
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .........................................................................28
2.2. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................28
2.2.1. Nguyên liệu ...................................................................................................28
2.2.2. Hóa chất thí nghiệm.......................................................................................30
2.2.3. Các hóa chất ly trích DNA ............................................................................31
2.2.4. Hóa chất chạy PCR........................................................................................32
2.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose.......................................................................32
2.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản ...................................................................32
2.2.7. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................32
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................33
2.3.1. Phương pháp thu mẫu....................................................................................33
2.3.2. Phương pháp ly trích DNA tổng số...............................................................33
2.3.3. Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA ..............................35
2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).........................................36
2.3.5. Phương pháp điện di......................................................................................43
2.3.6. Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng
các phần mềm Cervus, Fstat.....................................................................................46
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................48
3.1. Kết quả trích ly DNA.............................................................................................48
3.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi Microsatellite ...........................................50
3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite W10 trên 4 mẫu
tôm sú AA4, TT1, GT3, NG12, đại diện cho 16 phép phối....................................50

6. Đồ án tốt nghiệp
iii
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite P1 trên 4 mẫu
tôm sú AA4, TT1, NG12, GT3 đại diện cho 16 phép phối.....................................52
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite L1 trên 4 mẫu
tôm sú AA4, TT1, NG12, GT3 đại diện cho 16 phép phối.....................................53
3.3. Khảo sát nồng độ MgCl2........................................................................................54
3.3.1. Microsatellite W10 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR................55
3.3.2. Microsatellite P1 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR....................55
3.3.3. Microsatellite L1 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR ...................57
3.4. Khảo sát hàm lượng DNA .....................................................................................58
3.4.1. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu cho cặp mồi Microsatellite W10...58
3.4.2. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu cho cặp mồi Microsatellite P1 ......59
3.5. Khảo sát tính hoạt động của phản ứng PCR và sàng lọc các cặp mồi
Microsatellite ……………………………………………………………....................60
3.5.1. Khảo sát tính hoạt động của phản ứng PCR..................................................60
3.5.2. Sàng lọc các các cặp mồi Microsatellite .......................................................62
3.6. Khảo sát đa dạng di truyền của mười sáu phép phối tôm sú đàn con phân tích....64
3.6.1. Tính đa dạng di truyền của mười sáu phép phối tôm sú đàn con..................64
3.6.2. Kiểm tra cân bằng Hardy - Weinberg ...........................................................69
3.6.3. Sự khác biệt di truyền của các phép phối trong mẫu phân tích.....................69
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................73
4.1. Kết luận……………………………………………………………......................73
4.2. Kiến nghị………………………………………………………… .......................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................75
Tài liệu Tiếng Việt .........................................................................................................75
Tài liệu Tiếng Anh .........................................................................................................76
Tài liệu từ Internet..........................................................................................................77
PHỤ LỤC..............................................................................................................1
PHỤ LỤC A. Kết quả xử lý số liệu trên hai phần mềm Fstat và cervus .........................1
A.1. Chỉ số phong phú alen của 16 phép phối trên 10 microsatellite loci..................2

7. Đồ án tốt nghiệp
iv
A.2. Chỉ số cận huyết giữa 16 phép phối trên 10 microsatellite loci .........................2
A.3. Sự khác biệt di truyền của 16 phép phối trong mẫu phân tích ...........................3
A.4. Các chỉ số đánh giá biến dị di truyền của 16 phép phối.....................................6
PHỤ LỤC B. Một số hình ảnh phân tích DNA từ máy điện di mao quản ......................7
B.1. Microsatellite P1: Mẫu D9, đồng hợp tử 134 - 134............................................7
B.2. Microsatellite P4: Mẫu E9, đồng hợp tử 211 - 211 ............................................8
B.3. Microsatellite W10: Mẫu A10, dị hợp tử 116 - 112 ...........................................8
B.4. Microsatellite L1: Mẫu A8, dị hợp tử 165 - 179.................................................9

8. Đồ án tốt nghiệp
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
***: Không cân bằng di truyền Hardy - Weinberg với mức ý nghĩa sau khi hiệu
chuẩn với Bonferroni p < 0,0042.
µg: Microgram
µl: Microlite
µM: Micromol/lite
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Ar: Allelic richness (mức độ phong phú alen)
Bp: Base pair
CE: Capillary Electropherosis (Điện di mao quản)
DMS: Dimethyl sulfoxide
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
EBV: Estimated Breeding Value (giá trị chọn giống )
EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid
EFF: Electric Field Force
EOF: Electro - Osmotic Flo
Fis: Chỉ số cận huyết
Fst: Sự sai khác di truyền
GTE: Glucose - Tris - EDTA
He: Expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi)
Ho: Observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện)
HWE: Cân bằng Hardy - Weinberg
ISSR: Inter Simple Sequence Repeats
M: Ladder DNA
Marker: Chỉ thị
mM: Milimolar (milimol/lite)
Na: Number of alleles per locus (số lượng alen trên locus)
NS: Không khác biệt có ý nghĩa

9. Đồ án tốt nghiệp
vi
NST: Nhiễm sắc thể
PCR: Polymerase chain reaction
PIC: Polymorphic Information Content (thông tin đa hình)
RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
SDS: Sodium Dodecyl Sulphate
SSR: Single sequence repeat - Microsatellite
STE: Sodium Chloride - Tris - EDTA
Ta: Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)
TBE: Tris Borate EDTA
Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)
VNCNTTS I: Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I
VNCNTTS II: Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II
VNTR : Variable Number Tamdem Repeat

10. Đồ án tốt nghiệp
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách 69 gia đình mẫu tôm sú đàn con.............................................28
Bảng 2.2. Thông tin các cặp mồi microsatellite .......................................................30
Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho từng cặp mồi microsatellite .............................40
Bảng 2.4. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite ......................41
Bảng 2.5. Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite.........41
Bảng 2.6. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq
polymerase cho một phản ứng PCR..........................................................................42
Bảng 3.1. Kết quả đo OD kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA............48
Bảng 3.2. Nhiệt độ bắt cặp (Ta) thích hợp cho các cặp mồi microsatellite..............54
Bảng 3.3. Nồng độ MgCl2 tối ưu của các cặp mồi microsatellite cho một phản ứng
PCR ...........................................................................................................................57
Bảng 3.4. Hàm lượng DNA khuôn tối ưu của các cặp mồi microsatellite cho một
phản ứng PCR ...........................................................................................................60
Bảng 3.5. Hiệu suất PCR và số alen của 19 cặp mồi microsatellite trên 28 mẫu.....60
DNA tôm sú. .............................................................................................................60
Bảng 3.6. Đặc điểm đa dạng di truyền chung trên microsatellite của 16 tổ hợp tôm
sú đàn con trong nghiên cứu. ....................................................................................64
Bảng 3.7. Biến động hệ số dị hợp tử mong đợi (He) của 16 tổ hợp tôm sú đàn con 67
Bảng 3.8. Chỉ số phong phú alen (Allelic richness).................................................68
Bảng 3.9. Giá trị Fst được phân tích các tổ hợp tôm sú đàn con...............................70
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát về nhiệt độ bắt cặp tối ưu, nồng độ MgCl2 và nồng độ
DNA cho 10 cặp mồi microsatellite..........................................................................73

11. Đồ án tốt nghiệp
viii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon).......................................................................3
Hình 1.2. Bản đồ phân bố tôm sú (Fao.org)...............................................................5
Hình 1.3. Vòng đời của tôm sú Penaeus monodon ....................................................6
Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển của tôm sú Penaeus monodon .............................7
Hình 1.5. Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân ....................................18
Hình 1.6. Mô tả quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage) ..................18
Hình 1.7. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số..................................................22
Hình 1.8. Vùng flanking (vùng sườn) ở hai bên trình tự microsatellite...................22
Hình 2.1. Thang chuẩn 100bp ..................................................................................31
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction ................................................34
Hình 2.3. Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR.....................................................38
Hình 2.4. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp
mồimicrosatellite.......................................................................................................43
Hình 2.5. Điện di trên Agarose.................................................................................44
Hình 2.6. Mô tả hệ điện di mao quản dạng đơn giản ...............................................46
Hình 3.1. Kết quả ly trích DNA các mẫu chân bơi tôm ngẫu nhiên đại diện cho 16
phép phối...................................................................................................................48
Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite W10 khi tiến hành phản ứng
PCR theo gradient nhiệt độ. ......................................................................................51
Hình 3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng
PCR theo gradient nhiệt độ. ......................................................................................52
Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng
PCR theo gradient nhiệt độ. ......................................................................................53
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite W10............55
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite P1 ...............56
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite L1 ...............57
Hình 3.8. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của cặp mồi microsatellite W10
...................................................................................................................................58

12. Đồ án tốt nghiệp
ix
Hình 3.9. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của cặp mồi microsatellite P1..59
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện hiệu suất PCR của 19 cặp mồi microsatellite..........61
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện số alen của mỗi cặp mồi microsatellite.......................62
Hình 3.12. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite L1
...................................................................................................................................63
Hình 3.13. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P4
...................................................................................................................................63
Hình 3.14. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P1
...................................................................................................................................64
Hình 3.15. Đồ thị so sánh giá trị đa hình các alen trên mỗi locus............................66

13. Đồ án tốt nghiệp
1
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, nghành nuôi trồng thủy sản là một trong những
nghành trọng điểm phát triển tại Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Hằng
năm, lĩnh vực này đã mang lại một giá trị kim ngạch xuất khẩu lớn cho đất nước và
tạo thu nhập ổn định cho người nuôi trồng thủy sản. Theo Tổng cục Thủy sản
Thống kê, ước tính giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 (tính theo giá so sánh 2010)
ước đạt 188 nghìn tỷ đồng, tăng 6,5% so với cùng kì năm 2013, trong đó giá trị nuôi
trồng thủy sản ước đạt hơn 115 nghìn tỷ đồng (chiếm 61,2%). Các đối tượng nuôi
trồng thủy sản phổ biến bao gồm: cá tra, cá rô phi, tôm sú, tôm càng xanh, cá chép
Ấn Độ, ốc hương, rong câu…Trong đó nghề nuôi tôm được nuôi trồng rộng rãi nhất
và ngày càng thu hút mạnh sự đầu tư của các hộ dân đặc biệt là tôm sú (Penaeus
monodo), loài tôm có giá trị kinh tế lớn được liệt kê bởi tổ chức nông nghiệp thế
giới (Food Agriculture Organization - FAO), tính đến cuối tháng 11/2013, giá trị
xuất nhập khẩu tôm 10 tháng năm 2013 đạt gần 2,5 tỷ USD, tăng gần 32,7% so với
cùng kì năm 2012, chiếm 44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản đất nước
(http://www.fistenet.gov.vn/).
Hiện nay, nghành nuôi trồng sản xuất tôm sú ngày càng mở rộng và phát
triển thì nhu cầu tôm giống càng tăng cao. Để đáp ứng một lượng lớn tôm giống,
nhiều trại sản xuất tôm giống đã được hình thành và thực hiện trên quy mô lớn. Tuy
nhiên, tôm sú bố mẹ cung cấp cho các trại sản xuất tôm giống hiện nay hoàn toàn
phụ thuộc vào nguồn bố mẹ từ tự nhiên và nhập nội. Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn
thụ động, tự nhiên, chủ quan và phụ thuộc vào các yếu tố khác do điều kiện sản
xuất, kinh doanh tại các trại tôm giống này là khác nhau dẫn tới chất lượng của tôm
sú giống không được đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng sau các thế hệ
nuôi, mang các mầm bệnh tiềm tàng, tiềm ẩn rủi ro lớn cho người nuôi tôm.
Để có được nguồn giống tăng trưởng tốt, sức chống chịu, kháng bệnh tốt
cung cấp cho người nuôi trồng tôm sú, không phải phụ thuộc vào nguồn tự nhiên
hay nhập nội thì việc nghiên cứu sản xuất giống tôm sú cung cấp cho người nuôi

14. Đồ án tốt nghiệp
2
sản phẩm giống tốt, có tốc độ sinh trưởng nhanh, chống chịu tốt là điều hết sức cần
thiết. Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chú ý đến nâng cao chất
lượng di truyền, tăng khả năng chống chịu ở tôm sú đã được thực hiện nhằm đặt ra
cơ sở khoa học, kỹ thuật để có thể nâng cao chất lượng của loài thủy sản giá trị cao
này.
Mục tiêu có được sản phẩm giống tôm sú tốt đòi hỏi vào những nghiên cứu
cải thiện di truyền sản phẩm giống, tập trung cao vào các tính trạng kinh tế quan
trọng là sức sinh trưởng, kháng bệnh, chống chịu và phải đa hình di truyền. Để giải
quyết các vấn đề trên, các nghiên cứu xác định biến dị di truyền phải kết hợp với so
sánh các biến dị hình thái thể hiện về sinh trưởng, sức sống với các chỉ thị ở mức độ
phân tử của các quần thể tôm sú, giữa các cá thể trong cùng một quần đàn là hướng
nghiên cứu phù hợp cần thiết, ứng dụng cao. Vì thế nhóm nghiên cứu tham gia vào
đề tài “Đánh giá biến dị di truyền của nguồn tôm sú (Penaeus monodon) bố mẹ thế
hệ đầu tiên cho chương trình chọn giống” nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho
chương trình chọn giống tôm sú quốc gia. Đề tài được thực hiện ở Viện Nghiên cứu
Nuôi trồng Thủy sản II dưới sự hướng dẫn của Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà.
2. Mục đích nghiên cứu
Chương trình chọn giống truyền thống dựa vào kiểu hình kết hợp với chỉ thị
sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền hỗ trợ trong việc
chọn lọc giống bố mẹ, hoặc xác định con cái của chúng có tiềm năng tạo ra những
con giống tốt, có năng suất cao. Tích lũy những gia đình mang tính đa dạng di
truyền cao cho mục đích chọn lọc nhiều tính trạng phù hợp trong những điều kiện
khác nhau.
3. Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi Microsatellite qua quy trình PCR.
- Phân tích đa dạng di truyền của các tổ hợp phối đàn con tôm sú trong chọn
giống thông qua chỉ thị Microsatellite.

15. Đồ án tốt nghiệp
3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về tôm sú
1.1.1. Phân loại
Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác đại
dương nuôi để dùng làm thực phẩm. Theo Hothuis (1980) và Bames trích dẫn bởi
Trần Ngọc Hải và cộng sự (1999) thì tôm sú được định loại như sau:
Nghành: Arthropoda
Lớp: Crustacea
Bộ: Decapoda
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeus Fabricius
Giống: Penaeus
Loài: Penaeus Monodo (Fabricius , 1798)
Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius
Tên tiếng anh: Tiger Shrimp
Tên tiếng việt: Tôm sú, tôm cỏ
Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon)
1.1.2. Cấu tạo
Cơ thể tôm sú chia 2 phần: Phần đầu ngực và phần bụng.

16. Đồ án tốt nghiệp
4
Phần đầu ngực gồm có:
- Chủy: Dạng lưỡi kiếm, cứng, có răng cưa. Chủy cong xuống rất ít,
phía trên chủy có 7 - 8 răng, dưới chủy có 3 răng.
- Mũi khứu giác và râu: Cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm.
- 3 cặp chân hàm: Giúp tôm lấy thức ăn và bơi lội.
- 5 cặp chân ngực (chân bò): Đây là cơ quan giúp lấy thức ăn và di
chuyển của tôm sú (bò).
Phần bụng gồm có: 6 đốt bụng và 1 đốt đuôi, mỗi đốt có 1 vùng vỏ, có 5 đôi
chân bơi giúp tôm bơi lội dễ dàng trong thủy lực.
Tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước to hơn con đực.
Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái, thông qua cơ quan sinh dục phụ bên
ngoài.
- Con đực: Cơ quan sinh dục chính của tôm đực nằm ở phía trong phần
đầu ngực, bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi
chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục đực mở ra hốc háng đôi chân ngực số 5.
Tinh trùng thuộc dạng chứa trong túi.
- Con cái: Buồng trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn
trứng mở ra ở khớp háng đôi chận ngực số 3. Bộ phận chứa túi tinh
gồm 2 tấm phồng lên ở đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dưới bụng tôm.
1.1.3. Phân bố
Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới, từ
Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Tây Châu
Phi và phía Nam Châu Úc (Motoh, 1981). Nhìn chung loài này phân bố hầu hết
vùng Đông Nam Á từ 30 kinh độ Đông đến 155 kinh độ Đông và từ 35 vĩ độ Bắc
đến 35 vĩ độ Nam xung quanh các vùng xích đạo đặc biệt như: Philipines, Malaysia,
Indonesia và Việt Nam.
Tại Việt Nam tôm sú xuất hiện dọc theo bờ biển Đông và vùng Đảo Phú
Quốc nhưng tập trung chủ yếu ở các vùng Miền Trung và Nam Bộ. Tôm sú (Post
Larvae), tôm giống (Juvenile) và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển

17. Đồ án tốt nghiệp
5
và rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành sẽ di chuyển ra xa bờ vì chúng
thích sống vùng nước sâu hơn
Hình 1.2. Bản đồ phân bố tôm sú (Fao.org)
1.1.4. Chu kì sống
Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm và con cái khoảng 2 năm.
Có 2 đặc điểm cần chú ý đến vòng đời tôm sú:
- Tăng trưởng từ hậu ấu trùng đến lúc trưởng thành xảy ra vùng cửa
sông (đặc trưng ở vùng nước lợ).
- Sự chín sinh dục, kết cặp, đẻ trứng và sự phát triển ấu trùng đều xảy
ra ở ngoài khơi nơi có nồng độ muối dao động trong khoảng 18 -
32o
/oo và ổn định.

18. Đồ án tốt nghiệp
6
Hình 1.3. Vòng đời của tôm sú Penaeus monodon
Vòng đời tôm sú được chia làm các giai đoạn: Phôi, ấu trùng, hậu ấu trùng,
tôm giống, tôm tiền trưởng thành và trưởng thành (Nguyễn Thanh Phương và cộng
sự, 1999).
Giai đoạn phôi: Bắt đầu giai đoạn từ khi trứng thụ tinh và phân cắt thành 2,
4, 8, 16, 32, 64 tế bào, phôi dâu, phôi nang, phôi vị đến khi nở. Thời gian hoàn tất
giai đoạn này khoảng 12 đến 15 giờ tùy thuộc vào điều kiện nhiệt độ nước.
Nauplli: Gồm 6 giai đoạn, giai đoạn phụ kéo dài từ 36 - 51 giờ, các Nauplli
bơi từng đoạn ngắn rồi nghĩ, lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn
hoàn không cần thức ăn. Giai đoạn đầu có chiều dài 0,4 mm và chiều dài tăng dần
đến giai đoạn cuối đạt 0,61 mm, bề dày 0,2 mm.
Zoea: Gồm 3 giai đoạn kéo dài 105 - 120 giờ, các Zoea bơi liên tục gần mặt
nước, lột vỏ 2 lần, mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vật phiêu sinh. Giai đoạn bắt đầu
xuất hiện hai phần đầu và bụng rõ rệt, dài khoảng 1mm, giai đoạn kế tiếp xuất hiện
mặt và chủy dài 1,9 mm, khi đạt chiều dài 2,7 mm thì thấy xuất hiện gai trên bụng
dày 0,45 mm.
Mysis: Gồm 3 giai đoạn kéo dài 72 giờ, các Mysis bơi hướng sâu, đuôi đi
trước, đầu đi sau. Tôm có hình dạng của tôm trưởng thành dài 3,4 mm xuất hiện các
cặp chân bụng, đuôi và quạt đuôi, các gai bụng thu nhỏ lại. Đến khi tôm đạt chiều

19. Đồ án tốt nghiệp
7
dài khoảng 4,4 mm chân bụng dài hơn, phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng trên
chủy.
Postlarvae (giai đoạn hậu ấu trùng): Giai đoạn ấu trùng mất khoảng 9 - 10
ngày, sau đó biến thái sang giai đoạn hậu ấu trùng. Giai đoạn này tôm bám thành
bể, sống đáy, có hình dạng giống như tôm trưởng thành. Tôm ăn động vật, mùn bã
hữu cơ, sinh vật đáy: Oligochaeta, Polychaeta, Bivalvia, 5 - 6 tuần sau trở thành
tôm giống.
Juvenile (giai đoạn trưởng thành): Tôm giống 6 - 8 tháng sau đạt tiêu chuẩn
tôm trưởng thành và có thể tham gia sinh sản (Nguyễn Thanh Phương và cộng sự,
1999).
Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển của tôm sú Penaeus monodon
1.1.5. Sinh sản
Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi. Xác
định sự thành thục của tôm cái dễ hơn, chỉ cần quan sát có túi tinh ở cơ quan sinh
dục phụ. Phương pháp xác định thành thục ở con đực khó hơn, thường dựa vào
trọng lượng để xác định khi con đực nặng từ 50 g trở lên, chỉ khi nào tìm thấy được
tinh trùng ở cuối ống dẫn tinh.

20. Đồ án tốt nghiệp
8
Hormone điều khiển sự thành thục sinh dục (GIH - Gonal Inhibiting
Hormone) được sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống mắt, vận
chuyển tới tuyến giáp synap đưa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra. Sự thành thục
sinh dục của tôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết, khi cắt mắt tức là thúc
đẩy chu kì lột xác, đem lại sự thành thục mau chóng hơn.
Số lượng trứng đẻ của tôm cái nhiều hay ít phụ thuộc vào chất lượng buồng
trứng và trọng lượng cá thể, trọng lượng lớn cho trứng nhiều hơn. Khi con cái thành
thục ngoài tự nhiên có trọng lượng từ 100 - 300 g cho 300.000 - 1.200.000 trứng.
Nếu cắt mắt nuôi vỗ trong bể xi măng thành thục và đẻ cho số lượng trứng từ
200.000 - 600.000 trứng.
Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ), trứng sau khi đẻ
được 14 - 15 giờ, ở nhiệt độ 27 - 28o
C sẽ trở thành ấu trùng (Nauplii). Tôm sú đẻ
quanh năm, nhưng tập trung vào hai thời kì chính đó là vào tháng 3 - 4 và tháng 7 -
10 hàng năm (Phạm Văn Tình, 2004).
1.1.6. Đặc điểm sinh trưởng
Tôm sú là loài giáp xác có lớp vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể, nên sự sinh
trưởng của tôm mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về kích
thước và trọng lượng. Tôm muốn gia tăng kích thước phải tiến hành lột bỏ lớp vỏ
cũ và mang tính đặc trưng riêng biệt cho loài cùng với giai đoạn sinh trưởng của
tôm. Mỗi lần lột xác tôm trưởng thành về chiều dài và trọng lượng, chiều dài trung
bình từ 10 - 15% so với trước lột xác. Chu kì lột xác sẽ ngắn ở giai đoạn tôm con và
kéo dài khi tôm càng lớn, thường xảy ra vào ban đêm. Sự lột xác của tôm do một
loại hormone ở cuống mắt quy định. Cuống mắt còn lại chứa các tế bào kết tủa ion
canxi và ion photpho làm cho vỏ tôm cứng lại sau khi lột xác được 0,5 - 1 giờ. Các
tế bào này hoạt động dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời.
Khi loại bỏ được lớp vỏ kitin bám vào lớp biểu bì bám cơ thể tôm, giai đoạn
lột vỏ chỉ xảy ra trong vài phút, lớp vỏ cũ vỡ ra ở phần lưng nơi tiếp giáp giữa vùng
đầu ngực và phần bụng, sau đó tôm được thoát ra từ vị trí hở của vỏ. Tiếp theo tôm
sẽ hút nước để tăng kích cỡ cơ thể khi lớp vỏ mới bên ngoài còn mềm, sau đó lớp

21. Đồ án tốt nghiệp
9
vỏ mới cứng nhanh nhờ các nguyên tố vi lượng và protein. Các mỡ dự trữ sẽ chuyển
hóa vào trong tuyến ruột giữa. Các tế bào phân chia nhanh chóng, các mARN được
hình thành và sau đó là sự tổng hợp của các protein mới. Giữa hai lần lột xác thì các
phần chiếm chỗ bởi nước trong lúc gia tăng đột ngột sẽ dần thay thế bằng tế bào
mới hình thành.
Tuổi thọ của tôm có sự thay đổi theo loài và theo giới tính nên tuổi thọ của
tôm sú nuôi thí nghiệm trong ao và các mẫu thu ngoài tự nhiên từ 1,5 năm đối với
tôm đực và 2 năm đối với tôm cái (Hothius, 1980).
1.2. Giới thiệu chung về đa dạng di truyền
1.2.1. Đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gien giữa các cá thể tồn tại
trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau, thể hiện qua sự khác nhau của tất cả
các gien di truyền trên tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật.
Những hình thái khác nhau của gien được thể hiện bằng những alen và
những khác biệt do sự đột biến. Những alen khác nhau của một gien có thể ảnh
hưởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau.
Những sự khác biệt về gien trong di truyền học tăng dần khi con cái nhận
đầy đủ tổ hợp gien và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của gien
trong quá trình sinh sản. Các gien trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp
mới được thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp
thống nhất mới cho con cái.
Tổng các gien và alen trong một quần thể là vốn gien của quần thể và những
tổ hợp của các alen mà mỗi cá thể có được gọi là kiểu gien - kiểu di truyền
(genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể được biểu hiện bởi các đặc điểm
về hình thái, sinh lý, hóa sinh và được đặc trưng bởi các kiểu di truyền trong từng
môi trường nhất định.
Số lượng khác biệt nhau về gien trong một quần thể được xác định bởi số
gien trong vốn gien đó, thường mỗi gien có nhiều hơn một alen (các gien đa hình)
và số các alen cho mỗi một gien đa hình. Sự tồn tại của các gien đa hình cho phép

22. Đồ án tốt nghiệp
10
các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gien dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận được
những alen khác nhau từ các gien của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gien cho phép các
loài thích ứng được với sự thay đổi của môi trường.
1.2.2. Quần thể
Trong tiến hóa, cá thể không được xem là đơn vị thích hợp bởi vì kiểu gien
của một cá thể được giữ nguyên trong quãng đời của nó, hơn nữa cá thể có tính tạm
bợ. Ngược lại, một quần thể thì có tính liên tục qua thời gian và thành phần di
truyền của nó có thể thay đổi tiến hóa qua các thế hệ. Sự hình thành các quần thể
địa phương tại những vùng lãnh thổ khác nhau chính là phương thức thích ứng của
loài trước tự nhiên. Quần thể vì vậy được xem là đơn vị tiến hóa cơ sở. Có nhiều
khái niệm “quần thể” khác nhau:
Đối với các loài sinh sản hữu tính, quần thể là một tập hợp các cá thể cùng
loài, trải qua nhiều thế hệ, cùng chung sống trong một khoảng không gian xác định,
trong đó các cá thể có thể giao phối tự do với nhau và được cách ly ở mức độ nhất
định với các nhóm cá thể lân cận thuộc loài đó (Lê Đình Lương và Phan Cự Nhân,
2004).
Quần thể là một nhóm các cá thể cùng loài có khả năng giao phối tự do với
nhau, chiếm cứ một khu phân bố xác định và trải qua một khoảng thời gian tiến hoá
lâu dài để hình thành nên một hệ thống di truyền độc lập và một khu vực sinh thái
riêng (Yablokov, 1986).
Nói ngắn gọn, quần thể là một nhóm sinh vật có khả năng giao phối qua lại
và cùng chia sẻ một vốn gien chung (Ridley, 1993). Nó còn được gọi là quần thể
Mendel, mà tập hợp lớn nhất là loài (species). Quần thể hình thành dưới ảnh hưởng
của các điều kiện sinh tồn trên cơ sở tác dụng tương hỗ giữa ba nhân tố tiến hóa: di
truyền, biến dị và chọn lọc.
Định luật Hardy Weinberg phát biểu rằng: “Trong một quần thể toàn phối có
số lượng cá thể lớn và không bị tác động bởi chọn lọc, đột biến hay di nhập gien,
tần số alen và tần số kiểu gien sẽ không thay đổi từ thế hệ này sang thế hệ khác”
(Hardy và Weinberg, 1908)

23. Đồ án tốt nghiệp
11
1.2.3. Sự đa dạng di truyền trong quần thể
Biến dị di truyền hay còn gọi là đa dạng di truyền trong quần thể là tất cả
thông tin có thể kế thừa từ thế hệ này sang thế hệ khác được chứa trong bộ gien của
bất kì một quần thể hay loài nào (Kottelat và Whitten, 1996). Đa dạng di truyền là
sự đa dạng về thành phần gien giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài
khác nhau; là sự đa dạng về gien có thể di truyền được trong một quần thể hoặc
giữa các quần thể hay hình thái thay thế của gien quan tâm được tìm thấy trong
quần thể đang khảo sát.
Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền
trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng
di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành
phần của acid nucleic, tạo thành mã di truyền (Griffiths, 2000).
Di truyền quần thể là một lĩnh vực sinh học mà những nghiên cứu của nó tập
trung vào thành phần di truyền của quần thể sinh học (tần xuất phân bố của alen) và
sự thay đổi về thành phần di truyền được bắt nguồn từ áp lực của tiến hóa, chọn lọc
tự nhiên (natural selection), xu hướng chuyển đổi kết cấu di truyền (genetic drift),
đột biến (mutation) và sự phiêu bạt gien (gene flow) được quan tâm như những ảnh
hưởng chủ đạo trong tần xuất phân bố alen trong cả quần thể nuôi gia hóa và quần
thể tự nhiên (Hartl và Clark, 1997).
1.2.4. Nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng di truyền trong quần thể
Trong quần thể ngẫu phối, bằng cách chọn lọc và lai các dạng được chọn với
nhau có thể tạo ra các dòng có mức độ biểu hiện tính trạng khác hẳn ở quần thể ban
đầu. Điều đó chứng tỏ tính bất đồng nhất về mặt di truyền trong quần thể. Trong
quần thể tự nhiên, các cá thể có cùng kiểu hình giống nhau nhưng kiểu gien thì rất
đa dạng. Sự đa dạng gien chủ yếu do đột biến tạo gien dị hợp tử và quá trình giao
phối tái tổ hợp. Tái tổ hợp là nhân tố biến dị quan trọng nhất và đột biến xảy ra
ngẫu nhiên.
Các đột biến về cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) và sự thay đổi về số lượng
NST có ý nghĩa quan trọng trong sự hình thành loài. Đồng thời sự cách ly địa lý

24. Đồ án tốt nghiệp
12
ngăn cản sự giao phối tự do, tạo điều kiện hình thành quần thể mới phân hóa thành
loài mới. Nhưng những đột biến gien lặn thì không bị mất đi, chúng là nguồn dự trữ
biến dị quần thể.
Hệ thống gien mỗi loài mang tính đặc trưng, tồn tại những gien có nhiều
trạng thái biểu hiện tức locus có nhiều trạng thái alen (từ 2 trở lên). Bộ gien của mỗi
cá thể góp phần vào hệ thống gien của loài. Các trạng thái thể hiện di truyền khác
nhau của một locus chỉ có thể được phát hiện khi quan sát trên nhiều cá thể trong
quần thể.
Sự đa dạng di truyền của quần thể liên quan tới các trạng thái thể hiện di
truyền ổn định của locus và sự đa dạng này xuất hiện khi có đột biến gien (Griffiths,
2000).
1.2.5. Vai trò của di truyền và di truyền quần thể trong nuôi trồng thủy sản
Không như hầu hết các loài động vật trên cạn, nguồn đa dạng vật liệu di
truyền của động vật dưới nước rất dễ bị tổn thương và nhanh chóng suy giảm hay
mất đi do bởi đặc tính thừa kế của chúng có những điểm rất khác biệt.
Ví dụ: Hầu như các loài thủy sản được sử dụng trong nuôi thuần thường rất
mắn đẻ, mỗi cá thể có thể sinh sản ra một lượng rất lớn giao tử như con cái thường
sản sinh ra hàng triệu trứng chỉ trong một lần giao phối. Trong khi đó ở ngoài tự
nhiên, tỷ lệ sống cực kỳ thấp (< 1%) thì trong môi trường nuôi thuần tỷ lệ này rất
cao (> 90%). Chính vì điều này mà một lượng rất lớn con giống được truyền lại cho
thế hệ sau có thể chỉ là từ một cặp bố mẹ trong điều kiện nuôi nào đó. Điều này rất
quan trọng trong việc quản lý trại giống vì thông thường các trại giống chỉ cần một
lượng rất ít giống bố mẹ cho sinh sản nhân tạo là có thể đáp ứng nhu cầu cung cấp
ấu trùng hay con giống. Như vậy yếu tố đa dạng rõ ràng sẽ thấp so với tập hợp con
giống tương đương từ nguồn tự nhiên nơi mà với tỷ lệ sống thường rất thấp.
Mặt khác, trong nuôi trồng thủy sản các quần thể bố mẹ tương đối nhỏ
thường được lưu giữ riêng biệt, đây là nguyên nhân làm cấu trúc di truyền của
nguồn giống thủy sản nuôi có thể thay đổi nhanh chóng theo thời gian chỉ qua vài
thế hệ. Vì khi quần thể quá nhỏ, việc bắt cặp ngẫu nhiên sẽ không có nhiều lựa

25. Đồ án tốt nghiệp
13
chọn. Xu hướng bắt cặp lẫn nhau giữa các cá thể có quan hệ huyết thống là không
thể tránh khỏi. Do đó, nguy cơ mất dần những biến dị di truyền sẽ nhanh chóng xảy
ra vì không tích lũy đủ nhiều các biến dị chung cho đáp ứng kịp sự thay đổi môi
trường sống (Gjedrem, 2005). Kích thước quần thể nhỏ, sinh sản cùng dòng hay
giao phối các cá thể có họ hàng gần gũi là những tác nhân góp phần gia tăng cấp độ
cận huyết dẫn đến suy thoái cận huyết; do đó cho đến thời điểm hiện tại, khả năng
hạn chế duy nhất là các nhà tạo giống động vật thủy sản cần duy trì thông tin phả hệ
các thế hệ con giống. Trong thực tiễn, chiến lược phát triển nhằm duy trì nguồn vật
liệu di truyền cơ bản và bền vững cho nuôi trồng rất cần thiết được đưa vào quy chế
và áp dụng rộng rãi (Reisenbichler và Rubin, 1999).
Đây là vấn đề then chốt trong nuôi trồng thủy sản, vì thành quả di truyền đạt
được từ một chương trình chọn giống sẽ phụ thuộc chủ yếu vào sự tích lũy đầy đủ
đa dạng di truyền có mặt trong nguồn bố mẹ. Mức độ biến dị di truyền hiện diện
trong quần thể khảo sát sẽ được chi phối chủ yếu bởi cấp độ đa dạng của bố mẹ và
hệ thống giao phối. Biến dị di truyền là điều kiện tối cần thiết cho sự tồn tại của
quần thể vì một quần thể có yếu tố đa dạng di truyền càng cao càng có tiềm năng
thích nghi và cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho chương trình chọn giống
(Kottelat và Whitten, 1996; Mable và Adam, 2007).
Ứng dụng phương pháp luận di truyền quần thể một cách chính xác có thể
giải quyết được những trở ngại liên quan đến tác động bất lợi trong thực tiễn nuôi
thả gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến yếu tố đa dạng di truyền để lại hậu quả mất
dần tính thích nghi “fitness” trong quần thể động vật nuôi thủy sản. Những nguy cơ
được tìm thấy trong quá trình thuần hóa, đặc biệt trong sinh sản nhân tạo các loài
tôm trong thời gian gần đây đang là mối lo ngại hàng đầu trong nghiên cứu di
truyền quần thể. Nhiều giống tôm nuôi đang trong trạng thái biến dị di truyền tương
đối thấp so với tổ tiên hoang dại của chúng. Một khi biến dị di truyền dần mất đi
gây suy giảm khả năng sinh sản, hiện tượng suy thoái do cận huyết đang xảy ra (các
alen quy định tính thích nghi kém có thể được tích lũy trong con giống do bởi sự tác
động kết hợp của phiêu bạc gien và hiện tượng cận huyết). Việc sử dụng chỉ một số

26. Đồ án tốt nghiệp
14
lượng hạn chế bố mẹ cho sinh sản sẽ dẫn đến hiện tượng cận huyết trong quần thể
rất cao và hậu quả để lại là nguy cơ nhanh chóng mất dần yếu tố đa dạng di truyền
trong quần thể. Điều này được phản ánh qua những biến đổi ngẫu nhiên tần xuất
alen hay thậm chí là mất hẳn alen then chốt đảm nhận việc giải mã những tính trạng
quan trọng. Tầm quan trọng của việc duy trì yếu tố đa dạng di truyền trong bất kỳ
nguồn bố mẹ hậu bị đều được đánh giá cao, phổ biến rộng rãi và được xem là hết
sức cần thiết trong quản lý sản xuất con giống lâu dài và bền vững (Mustafa, 2003).
Việc tìm hiểu đặc điểm di truyền từng cá thể đóng góp trong nuôi thuần sẽ
hỗ trợ nhiều mặt cho các nhà khoa học và người nuôi nhằm cung cấp giải pháp tốt
hơn trong việc xử lý vấn đề hiện tại. Do đó cách tiếp cận của cải tiến con giống
truyền thống và di truyền hiện đại trong nuôi trồng thủy sản có thể được tận dụng từ
giả thuyết và phương pháp luận trong di truyền quần thể nhằm định dạng, kiểm soát
và bảo tồn đa dạng di truyền các dòng vật nuôi.
1.3. Kỹ thuật Microsatellite
1.3.1. Định nghĩa về Microsatellite
Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of
tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên
trên hầu hết genome thực vật là một đoạn DNA được mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra
của số lượng bản copy biến thiên (từ một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy
trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn hay gọi là đơn vị lặp lại (Bùi Chí Bửu và Nguyễn
Thị Lang, 1999). Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng
100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một vị trí
nào (locus), thường xuyên có khoảng 5 - 7 “alen” khác nhau, mà mỗi alen có nhận
biết tùy thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những alen này có thể phát hiện bởi PCR, sữ
dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của
microsatellite. Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, alen được ghi nhận
khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại. Microsatellite là một
marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng được phát hiện bằng PCR và chúng có khuynh
hướng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của genome. Hàng ngàn SSR đã

27. Đồ án tốt nghiệp
15
được lập bản đồ trong nhiều loại khác nhau. Tóm lại, microsatellite ngày nay trở
thành một thuật ngữ chung nhất để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên,
thay vì sử dụng các thuật ngữ STR hay VNTR. Microsatellite bao gồm các đoạn lặp
lại ngắn từ 2 - 6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20 - 100 bp. Microsatellite được
tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gien lớn và
phân bố đều trên genome. Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những
codominant - al hay al đồng trội (bao gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nó có
các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104
- 5.106
tuân theo định
luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng
PCR từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó
thì có thể áp dụng trên những loài nào khác có quan hệ họ hàng.
1.3.2. Giới hạn của Microsatellite
Microsatellite được chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt trong
nghiên cứu quần thể, thế nhưng chúng không phải không có hạn chế. Microsatellite
được phát triển cho những chủng đặc trưng có thể được ứng dụng thường xuyên với
những chủng có mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di
truyền được khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di
truyền.
Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể
dẫn đến sự cố alen không giá trị (null alleles), nơi mà primer microsatellite không
thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Sự phân kì trong trình tự ở vùng
liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo
dài bắt đầu, sự khuếch đại ưu tiên của vị trí alen đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên
của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử được ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ
phận không có giá trị). Sự thất bại của phản ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự
sai khác ở vị trí đặc thù được khuếch đại.
Tuy nhiên, ảnh hưởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết
giới tính cũng cần được xem xét để không đưa ra giá trị sai của alen không giá trị do
sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thước alen

28. Đồ án tốt nghiệp
16
cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự. Đột biến có thể có từ sự thêm vào hay
mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài. Tỉ lệ
đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số vùng
microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lượng hoặc sự
cố trong vùng exon của gien dưới sự chọn lọc.
Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng
khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhưng số vị trí khuếch đại thành công
trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các
loài nghi vấn. Đột biến trong alen microsatellite có thể bị ảnh hưởng xấu trong
trường hợp có một đoạn alen lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể được
dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alen nhỏ hơn tham gia vào việc làm
tăng kích thước, trong khi một alen lớn hơn tham gia để làm giảm kích thước, khi
mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thước, sự ép buộc này
đã được xác định nhưng giá trị khẳng định là chưa chuyên biệt. Nếu có một sự khác
biệt lớn về kích cỡ giữa alen của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững
trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm soát
trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thường xuyên
ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có
thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó.
1.3.3. Các loại Microsatellite
Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 - 6 lần), phân loại microsatellite
gồm:
- Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA
- Dinucleotide SSR (GT) 6GTGTGTGTGTGT
- Trinucleotide SSR (CTG) 4CTGCTGCTGCTG
- Tetranucleotide SSR (ACTC) 4ACTCACTCACTCACTC
Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần và
tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa.

29. Đồ án tốt nghiệp
17
1.3.4. Sự phát triển của Primer Microsatellites
Primer của microsatellite được phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một
đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này được chèn vào plasmid
hoặc phage vector và được chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau
đó phát triển và được chụp lên phim với những trình tự nucleotide được đánh dấu
huỳnh quang được lai với trình tự lặp lại của microsatellite, khi nó hiện diện trên
đoạn DNA. Nếu dòng dương tính có thể thu được từ quy trình này, đoạn DNA được
đọc trình tự và primer PCR sẽ được chọn từ vùng trình tự liên kết như vùng để xác
định vị trí đặc trưng. Quy trình này liên quan đến những thí nghiệm thành công, khi
trình tự lặp lại của microsatellite phải được dự đoán trước và primers được thu nhận
ngẫu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa. Vị trí microsatellite
được trải xuyên suốt genome và có thể được thu nhập từ sự thoái hóa DNA chung
của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch
đại thông qua PCR.
Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện đa hình ở
những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alen) đối với từng cá thể trong loài.
Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của
vùng flanking - vùng nằm ở hai bên trình tự microsatellite để thiết kế primer được
bảo tồn trong quá trình di truyền loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát
hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể.
1.3.5. Cơ chế hình thành Microsatellite
Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách
đầy đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện
và hình thành microsatellite là do 2 quá trình: Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình
giảm phân (unequal crossing - over during meiosis) và quá trình trượt lỗi trong sao
mã.

30. Đồ án tốt nghiệp
18
Hình 1.5. Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân
Trong quá trình giảm phân sự trao đổi chéo giữa các NST không tương đồng
đã tạo nên những đoạn có trình tự lặp của các microsatellite.
Hình 1.6. Mô tả quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage)
Đây được coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging
strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên

31. Đồ án tốt nghiệp
19
phân tử DNA mới tổng hợp mà phân tử enzyme polymerase không nhận biết được
sự trượt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa
lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn.
1.3.6. Vai trò của Microsatellite
Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở phần phía trên các vùng khởi đầu
sao mã của vùng mang mã, và một số có quan hệ với vùng mã hoá. Chức năng rõ
rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa biết rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy
chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền.
Microsatellite được dùng như một chỉ thị di truyền để nghiên cứu về di
truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gien. Tuy nhiên, có rất nhiều chứng cứ
cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố
điều hòa. Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá
có quan hệ với sự biểu hiện của gien và chức năng của gien.
Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của
microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của chất trợ xúc tác
(promotor). Vị trí của microsatellite gần hay xa chất trợ xúc tác cũng làm hoạt động
của chất trợ xúc tác thay đổi. Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như
một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite
đã làm giảm chức năng của gien.
Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức
năng bám dính vào các trình tự khởi động của gien, khi trình tự này được giải
phóng thì gien được khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt
động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao
mã thông qua ảnh hưởng đến protein bám. Như một trình tự mang mã,
microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số
lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức
năng của protein và hoạt động của gien, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh
lý cũng như sự phát triển của cơ thể.

32. Đồ án tốt nghiệp
20
Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, có sự ảnh hưởng của chiều dài
khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được
tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gien. Những tính chất đặc biệt của
microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite
có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình
tiến hóa thích nghi (Kashi và cộng sự, 1990). Nó cho phép một quần thể có thể khôi
phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động
như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gien đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh
chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King
và cộng sự, 1997). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc
nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa.
1.3.7. Các phương pháp phát hiện Microsatellite
Có 3 phương pháp để phát hiện microsatellite: phương pháp lai, phương
pháp PCR và phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite
1.3.7.1. Phương pháp lai
Phương pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite
bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu
microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau. Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng
còn bị hạn chế. Trong phương pháp lai có hai cách: phương pháp phát hiện nhờ
đồng vị phóng xạ và phương pháp nhuộm bạc.
- Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ: Phương pháp hiệu quả
và được dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ. Người ta có thể đánh dấu
vào một đầu của primer (end - labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn
một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation -
labelling). Nhưng ngày nay phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít
được sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con người và đòi hỏi việc xử
lí chất thải tốn kém.

33. Đồ án tốt nghiệp
21
- Phương pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ): Phương
pháp này rẻ, không hại, nhưng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật
rắc rối khi nhuộm.
1.3.7.2. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và
sử dụng máy giải trình tự tự động. Phương pháp này được phát triển cùng với sự
phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh
dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end - labelling primer hoặc incorporation).
Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà
máy tính có thể phát hiện được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR
với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thước chính xác của đoạn DNA quan tâm.
Chất huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại này đủ
dùng cho 10.000 phản ứng PCR. Phương pháp này có hiệu quả rất cao và đang
được sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới. Người ta có thể
đánh dấu bằng ba loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản
ứng PCR và chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thước các đoạn bằng nhau
nhưng chúng ta vẫn có thể xác định được nhờ màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả
được thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích
thước của alen, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide
A…
1.3.7.3. Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite
Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế mồi microsatellite
đặc trưng cho một locus trong bộ gien. Vì vậy một cặp mồi microsatellite có thể áp
dụng cho mọi cá thể trong loài, và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước
khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite.

34. Đồ án tốt nghiệp
22
Hình 1.7. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số
Ở hình 1.7 hai mồi của PCR (hai mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở
vùng bảo toàn nằm hai bên trình tự microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào,
sản phẩm PCR sẽ có chiều dài là 100 bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm
PCR chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình
tự microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm
PCR là 116 bp).
Hình 1.8. Vùng flanking (vùng sườn) ở hai bên trình tự microsatellite
Mồi Microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở
những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alen) đối với từng cá thể trong loài.
Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng

35. Đồ án tốt nghiệp
23
flanking (vùng sườn - vùng nằm ở hai bên trình tự microsatellite để thiết kế mồi)
được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng sườn rất quan trọng vì nó giúp
phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể.
Sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel. Thông thường
sản phẩm PCR có 2 vạch, 1 vạch chính và 1 vạch phụ nhỏ hơn vạch chính 2 bp
(Murray và cộng sự, 1993). Sự xuất hiện của vạch phụ là do quá trình trượt lỗi của
DNA Polymerase (Tautz, 1989), vạch phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định
kích thước chính xác của vạch chính, nhưng vạch phụ cũng có thể được xem như
một dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite. Bằng cách
này thì chúng ta cũng xác định được kích thước của sản phẩm PCR đồng thời đếm
được số lần lặp lại của các nucleotide trên mỗi alen.
Ưu điểm của phương pháp xác định microsatellite bằng cặp mồi
microsatellite:
Microsatellite được ứng dụng nhiều hơn cả vì nó đơn giản hơn, phân bố đều
trên bộ gien. Các thông tin về đa alen của một locus cũng như trên nhiều locus cùng
một lúc có thể được phân tích một cách đơn giản và nó đủ lớn cho các phương pháp
thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích, ứng dụng rộng rãi trong việc lập bản đồ
bộ gien của các loài; phân tích đặc điểm di truyền của các loài, dưới loài và các cá
thể trong một loài phục vụ có hiệu quả cho công tác chọn giống trong chăn nuôi và
trồng trọt, tìm hiểu về cấu trúc quần thể, phả hệ, khoa học hình sự, các gien liên
quan đến năng suất và chất lượng, ngoài ra còn giúp tìm hiểu về nguồn gốc và phân
lập các gien gây bệnh, từ đó nghiên cứu ra phương pháp điều trị phù hợp.
SSR nằm trong số những chỉ thị mạnh nhất để phát hiện sự đa hình. Nhóm
chỉ thị SSR này rất đặc hiệu, có độ chính xác cao, có khả năng nhân bản ổn định.
Tương đối đơn giản, dễ thực hiện. Có độ lặp lại rất cao, có thể phân tích hàng loạt,
tự động. Chúng là chỉ thị di truyền hoàn hảo, chuyên biệt locus và đồng trội (co -
dominant), cho phép xác định thể đồng và dị hợp tử và có khả năng lặp lại (Satoni
và cộng sự, 2000).
Chỉ thị mồi microsatellite có các ưu điểm nổi bật sau:

36. Đồ án tốt nghiệp
24
- Di truyền đa alen và đồng trội.
- Có tính chỉ thị cao (non - abundant).
- Có ở tận hai đầu của bộ gien (tính chỉ thị rộng).
Microsatillite (Simple Sequence Repeats, SSRs) có độ đa hình cao, chỉ thị
đồng trội, hiệu quả này đã được chứng minh qua nhiều mục đích ứng dụng bao gồm
kỹ thuật finger - printing (Smith và Devey, 1994), nghiên cứu di truyền quần thể
(Haymer 1994; Tsumura và cộng sự, 1996; Thomas và cộng sự, 1999), kiểm tra sự
phân bố di truyền cho đời sau (Dow và cộng sự, 1995), kiểm tra sự thuần hóa
(Morchen và cộng sự, 1996).
Khi so sánh với các phương pháp khác thì SSR dễ dàng sử dụng hơn sự đa
hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphisms,
RFLPs) chỉ giải quyết được số lượng nhỏ DNA, sự đa hình cao và khả năng phân
tích nhanh. SSR phân tích nhanh hơn sự khuếch đại đa hình ngẫu nhiên DNA
(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) và sự chuyển đổi tốt hơn AFLP.
SSR hiện giờ thay thế cho RFLP trong lập bản đồ di truyền các cây trồng trong
nông nghiệp. Sự kết hợp của SSR với AFLP tạo nên bản đồ di truyền chi tiết. Sự
đồng trội tự nhiên của SSR cũng là điểm mạnh trong lập bản đồ di truyền. Trong
khi đó, chỉ thị RAPD thì dễ dàng phát triển nhưng giới hạn trong nhiều mục đích
ứng dụng (Haymer, 1994).
Tuy nhiên, việc xác định những đoạn mồi bọc chuyên biệt là một công việc
khá nặng nề đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ thuật cao. Hơn nữa kỹ thuật này đòi
hỏi chi phí rất cao (Gupta và cộng sự, 1999).
1.4. Tình hình nghiên cứu
Trong lĩnh vực nghiên cứu đa dạng di truyền trên động vật thủy sản trong
nước và thế giới. Trước những yêu cầu cấp thiết về nguy cơ mất dần sự đa dạng
nguồn lợi sinh vật, sự thoái hóa giống vật nuôi, cây trồng .v.v… Vấn đề cấp bách
đặt ra cho các nhà nghiên cứu di truyền là phải nhanh chóng tìm hiểu và giải quyết
các vấn đề trên. Ngoài ra, còn phải đưa ra những giải pháp công nghệ nâng cao chất
lượng con giống, tăng nguồn lợi thực phẩm cho cả hai mặt chất và lượng. Đã có rất

37. Đồ án tốt nghiệp
25
nhiều nghiên cứu đi sâu tìm hiểu cấu trúc phân tử của vật liệu di truyền và một số
đã mang lại thành công ngoài mong đợi. Tuy nhiên, vấn đề phục hồi nguồn đa dạng
sinh học đã bị mất đi thì còn phải cần nhiều thời gian. Dưới đây là một số ứng dụng
sinh học phân tử vào lĩnh vực di truyền chọn giống.
1.4.1. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước
Trong phạm vi nước ta, có những nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực
hiện như: Trường Đại học quốc gia TP HCM, Viện NCNTTS I và Viện NCNTTS II
- “Khảo sát đa dạng di truyền một số quần thể đàn tôm sú (Penaeus monodon) bằng
hai kỹ thuật RAPD và mtDNA PCR - RFLP”. Theo đó, kết quả chỉ đánh giá khả
năng ứng dụng từng kỹ thuật vào các mục đích tìm hiểu khác nhau, nhưng đây là
một nỗ lực trong đánh giá di truyền một số quần thể tự nhiên.
Để đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai quần đàn tôm càng xanh Việt
Nam và Trung Quốc và làm cơ sở cho việc quản lý, bảo tồn nguồn gien tôm càng
xanh tại Việt Nam. Nghiên cứu “So sánh sự đa dạng di truyền giữa tôm càng xanh
Việt Nam và tôm càng xanh Trung Quốc sử dụng phương pháp Microsatellite và
RAPD” nhằm kiểm tra sự khác biệt di truyền của hai quần đàn tôm càng xanh Việt
Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp mồi Microsatellite và 5 mồi ngẫu nhiên RAPD
(Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thanh Liêm, 2012).
Nghiên cứu “Đánh giá tính đa hình của ba quần đàn tôm sú nuôi ở Việt Nam
bằng phương pháp Microsatellite” đã phân tích tính đa hình trên 83 cá thể với số
lượng quần đàn: quần đàn I (n = 30) thu ở Rạch Gốc, quần đàn II (n = 32) thu ở Phú
Yên, quần đàn 3 (n = 21) có nguồn gốc ở Singapore. 8 locus microsatellite lấy từ
ngân hàng gien (CSCUP mo1, CSCUP mo2, CSCUP mo3, CSCUP mo4, CSCUP
mo6, CSCUP mo7, CSCUP mo18, CSCUP mo386). Kết quả mà tác giả phân tích
cho thấy 6 locus đầu tiên có tính đa hình bên trong mỗi quần đàn đang rất cao với
giá trị thông tin đa hình PIC > 0,5 (Nguyễn Thị Thảo và cộng sự, 2004).
Một số các nghiên cứu thăm dò khác: “Microsatellite nghiên cứu biến dị về
màu sắc thịt trắng và thịt vàng của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)”
(Nguyễn Hữu Ninh, 2003); “Bước đầu thăm dò, ứng dụng một số chỉ thị DNA phân

38. Đồ án tốt nghiệp
26
tích đa dạng di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Bùi Thị Liên Hà,
2004); “25 Microsatellite loci khảo sát QTL (Quantitative Trait Loci) trên tính trạng
tăng trưởng ở đàn cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Điền,
2005).v.v…
1.4.2. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới
Hiện nay trên thế giới, có những đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền đã
được thực hiện như:
Nghiên cứu “Genetic diversity of intensive cultured and wild tiger shrimp
Penaeus monodon (Fabricius) in Malaysia using microsatellite markers”
(Nahavandi và cộng sự, 2011). Các tác giả sử dụng 6 cặp mồi tham khảo trong báo
cáo của Pongsomboom và cộng sự (2000) cũng cho kết quả đánh giá đa dạng di
truyền quần đàn tôm sú hoang dã và nuôi tự nhiên ở Malaysia khả quan.
Đề tài “Development of microsatellite markers in black tiger shrimp”
(Wuthi và cộng sự, 2003), được đăng trên tạp chí khoa học ngành thủy sản số 224
vào tháng 5/2003. Trong nghiên cứu của mình, các tác giả đã tổng hợp được 30 cặp
mồi microsatellite đặc hiệu cho loài tôm sú (penaeus monodon) dựa trên 9 trình tự
lặp lại (AG)10, (TG)10, (GAA)10, (GAC)10, (CAT)10, (TAC)10, (GACA)8, (GATA)8,
(TCAG) và thực nghiệm trên 30 mẫu tôm. Sau đó các tác giả tiến hành đánh giá đa
dạng di truyền của quần đàn tôm sú hoang dã tại Thái Lan, cho kết quả chỉ số thông
tin đa hình (PIC) dao động từ 0,4275 - 0,9264.
Báo cáo khoa học “Isolation and characterization of 23 polymorphic
microsatellite markers for diversity and stock analysis in tiger shrimp (penaeus
monodon)” (Pan và cộng sự, 2004). Với việc sử dụng các công cụ gần giống như
(Wuthi và cộng sự, 2003), các tác giả đã phân lập được 23 cặp mồi microsatellite
đặc hiệu để phân tích đa dạng di truyền trên 30 mẫu tôm sú (Penaeus monodon).
Kết quả cho thấy, số alen dao động cao từ 15 - 31, số dị hợp tử mong đợi trung bình
Ho = 0,936. Báo cáo này đã được bảo vệ trước Hội đồng Học viện động vật học và
phát triển khoa học Đài Loan, và đăng lên tạp chí Molecular Ecology Notes vào
tháng 7/2004.

39. Đồ án tốt nghiệp
27
“Development of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp
Penaeus monodon and its application in genetic diversity study for two
populations” ( Li và cộng sự, 2007). Trong nghiên cứu này các tác giả sử dụng 90
trình tự gien của tôm sú có kích thước 100 - 350 bp từ ngân hàng gien và thiết kế 13
cặp mồi microsatellite bao gồm 3 và 4 đơn vị lặp lại bằng cách sử dụng primer v.3
(Rozen và Skatetsky, 2000) để đánh giá đa dạng di truyền của 2 quần đàn tôm sú ở
Australia và Thái Lan. Kết quả cho thấy, số alen của quần đàn tôm sú ở Australia
khá cao dao động từ 7 - 27, số dị hợp tử quan sát dao động lớn được từ 0,16 - 0,91.
Đối với quần đàn tôm sú ở Thái Lan số alen từ 6 - 15, số dị hợp tử quan sát dao
động lớn từ 0,09 - 0,90. Báo cáo này được đăng trên tạp chí Aquaculture vào
1/2007.
Khảo sát ban đầu nhận thấy sự ổn định và chất lượng cao của các cặp mồi từ
những bài báo tin cậy trên nhóm nghiên cứu đã chọn ra được 19 cặp mồi: W2, W3,
W4, W5, W6, W10 (Wuthi và cộng sự, 2003), P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7 (Pan và
cộng sự, 2004), L1, L2, L3, L4, L5, L6 (Li và cộng sự, 2007), tiếp tục khảo sát và
sàng lọc ra những cặp mồi có tính đặc hiệu cao nhất để phân tích đánh giá biến dị đa
dạng di truyền có độ tin cậy cao cho 16 phép phối tôm sú đàn con trong chương
trình chọn giống.

40. Đồ án tốt nghiệp
28
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Từ ngày 02/02/2015 đến ngày 30/06/2015.
Các thí nghiệm được tiến hành ở phòng thí nghiệm di Truyền Phân Tử thuộc
Phòng Sinh Học Thực Nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Nguyên liệu
Bảng 2.1. Danh sách 69 gia đình mẫu tôm sú đàn con
STT Tên mẫu STT Tên mẫu STT Tên mẫu
1 AA4 24 NA10 47 GT4
2 AA5 25 NG9 48 TA1
3 AA6 26 NG10 49 TA2
4 AA7 27 NG11 50 TA3
5 AA8 28 NG12 51 TA4
6 AA9 29 NG13 52 TG1
7 AG4 30 NG14 53 TG2
8 AG5 31 NN5 54 TG3
9 AG6 32 NN6 55 TG4
10 AG7 33 NN7 56 TN1
11 AG8 34 NN8 57 TN2
12 AN3 35 NN9 58 TN3
13 AN4 36 NN10 59 TN1
14 AN5 37 NT4 60 TN2
15 AN6 38 NT5 61 TN3
16 AT2 39 NT6 62 TN4
17 AT3 40 NT7 63 TT1
18 AT4 41 NT8 64 TT2
19 AT5 42 GG6 65 TT3

41. Đồ án tốt nghiệp
29
20 NA7 43 GG7 66 TT4
21 NA8 44 GN8 67 TT5
22 NA9 45 GN9 68 TT6
23 GA6 46 GA7 69 AN3
Mẫu: 69 gia đình mẫu chân bơi đã được thực hiện trên 16 phép phối với
nhau qua các quần thể Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa, Nội Địa (AA,
AG, AN, AT, GA, GN, GG, GT, TA, TN, TG, TT, NA, NG, NT, NN). Mẫu được
bảo quản trong cồn 70o
, được cung cấp bởi chương trình tích hợp các dòng Tôm
sú khác nhau cho chương trình chọn giống Tôm sú thuộc Trung tâm Quốc Gia
Giống Hải sản Nam Bộ ( TTQGGHSNB) và tương ứng với số lượng như sau:
6 gia đình AA: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Ấn Độ Dương
5 gia đình AG: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Gia Hóa
5 gia đình AN: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Nội Địa
4 gia đình AT: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Thái Bình Dương
4 gia đình NA: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Ấn Độ Dương
6 gia đình NN: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Nội Địa
6 gia đình NG: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Gia Hóa
5 gia đình NT: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Thái Bình Dương
2 gia đình GG: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Gia Hóa
2 gia đình GN: Phối giữa mẹ Gia Hóa với bố Nội Địa
2 gia đình GA: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Ấn Độ Dương
3 gia đình GT: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Thái Bình Dương
4 gia đình TA: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Ấn Độ Dương
4 gia đình TN: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Nội Địa
4 gia đình TG: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Gia hóa
6 gia đình TT: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Thái Bình Dương

42. Đồ án tốt nghiệp
30
2.2.2. Hóa chất thí nghiệm
2.3.5.1. Mồi
Mười cặp mồi microsatellite sử dụng cho nghiên cứu có chiều dài từ 18 - 27
bp được sàng lọc ra từ 19 cặp microsatellites (hãng Sigma) phân tích đặc hiệu cho
69 gia đình tôm sú, có kí hiệu L1, L3, L4, P1, P2, P4, P5, P7, W10, W2. Trong đó,
các cặp mồi L1, L2, L3 được tham khảo từ Li (Li và cộng sự, 2007), các cặp mồi
P1, P2, P4, P5, P7 được tham khảo từ Pan (Pan và cộng sự, 2004) và các cặp mồi
W10, W2 được tham khảo từ Wuthi (Wuthi và cộng sự, 2003). Thông tin về trình tự
và kích thước của mồi được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thông tin các cặp mồi microsatellite
Tác giả Kí hiệu
mồi
Trình tự
Li và Lion
(2007)
L1
F 5’TGCAGCTTCACACACCCATACACG3’
R 5’TATGACAGGCAGTTGCGCCAGGTA3’
L3
F 5’GAAGGAGAAGGAGGAGGATTACAAGGA3’
R 5’TCGGGCGGAGAATATGCAAATTAAA3’
L4
F 5’GTCTGTCCATCCTTCCGTCTGACC3’
R 5’TGGGAGTAAACAAAGCGTTTGAGATTG3’
Pan (2004)
P1
F 5’GTGTTATTTTCCACGGGTGC3’
R 5’GCTGCAGGAAGTGTAGGGAG3’
P2
F 5’GTTGCGACGGGTTGATTC3’
R 5’TTTATGGCTATGGCTGACAC3’
P4
F 5’ TAATGGGCGTAAGTCTTCGG3’
R 5’TGAAAGGAGTCGGGATATGC3’
P5
F 5’CTTTTTGAAATCGCCCTGTT3’
R 5’CATTCATCCCGCTCTTCTGT3’

43. Đồ án tốt nghiệp
31
P7
F 5’AAAAGCCAGAGGAAACGTG3’
R 5’ACAGTGCACGTACCCACAAA3’
Wuthi
(2003)
W10
F 5’TCTATTGTCTGCCAGTTTGTCC3’
R 5’TAGCACGGGATTTATGAAGTGA3’
W2
F 5’TTATCCGTATAGCCGCGTTATC3’
R 5’TTACAGGACCTGCATTTGTGTC3’
2.2.2.2. Thang
Sử dụng thang M (Ladder) DNA để làm chỉ thị xác định kích thước phân tử
DNA các mẫu tôm khảo sát. Kích thước thang M sử dụng trong thí nghiệm là 100
bp DNA ladder - Promega.
Hình 2.1. Thang chuẩn 100bp
2.2.3. Các hóa chất ly trích DNA
- Dung dịch ly trích 1 (Solution 1): 50 mM Tris - HCl pH 8; 20 mM EDTA pH
8; 2% SDS.
- Dung dịch ly trích 2 (Solution 2): dung dịch NaCl bão hòa 6 M.
- Proteinase K (bảo quản - 24o
C)
- Ethanol 70% lạnh (bảo quản ở - 24o
C)
- Ethanol tuyệt đối lạnh (bảo quản ở - 24o
C)

44. Đồ án tốt nghiệp
32
- Nước cất 2 lần, hấp khử trùng
2.2.4. Hóa chất chạy PCR
- 10 X PCR buffer (Fermentas)
- 25 mM MgCl2 (Fermentas)
- 10 mM dNTP mix (Fermentas)
- Taq DNA polymerase 5 u/µl (Fermentas)
- Primer 100 M (Sigma)
- DNA mẫu (ly trích từ mẫu chân bơi tôm sú)
2.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose
- Agarose (Bio basic)
- TBE 0,5 X
- 6 X DNA Loading Dye (Promega)
- 100 bp DNA Ladder (Promega)
2.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản
- QIAxcel DNA Sreening Kit (Qiagien)
- QX DNA Size Marker 50 - 800 bp (50 ul) (Qiagien)
- QX Aligment Marker 15 bp/1 kb (1,5 ml) (Qiagien)
- QX DNA Dilution Buffer (Quiagien)
- QX Separation Buffer (Qiagien)
- QX Wash Buffer (Qiagien)
- QX Nitrogien Cylinder (Quigien)
2.2.7. Dụng cụ và thiết bị
- Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml; 2,0 ml.
- Đầu tip các loại (Eppendorf)
- Plates 96 well PCR (Eppendorf)
- Máy đo OD SmartSpecTM
Plus (Bio - rad)
- Bồn ủ nhiệt (block heater Bio - rad)
- Lò viba (Electrolux - Thụy Điển)
- Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow).

45. Đồ án tốt nghiệp
33
- Micropipet các loại: 100 - 1000 µl; 0,5 - 10 µl; 10 -100 µl; …(Bio - rad)
- Máy ly tâm lạnh.
- Máy PCR (Bio - rad)
- Bồn điện di Agarose (Bio - rad)
- Máy chụp ảnh điện di Geldoc X (Bio - rad)
- Lò vi sóng (Electrolux - Thụy Điển)
- Tủ mát, tủ âm (- 2o
C, - 80o
C) (Sanyo - Nhật)
- Máy điện di mao quản
- QX 0,2 ml tube trip (Qiagien)
- QX 0,2 ml tube trip caps (Qiagien)
- QX Color 0,2 ml tube Strip (Quiagien)
- Các vật dụng trong tách chiết: chày, crack ….
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu tôm sú được chọn là những cá thể trưởng thành, khỏe mạnh, đã tham
gia sinh sản trong quần thể, thu tại hiện trường được cố định ngay bằng cồn 70o
theo tỉ lệ tôm: cồn = 1: 3. Mẫu được thu bằng cách dùng vợt vớt ngẫu nhiên ít nhất
tại 5 vị trí khác nhau ở cùng một bể giống và mỗi cá thể tôm sú chọn lấy 1 chân bơi
(có cả phần vây và phần thịt), sau đó cho chân bơi vào từng eppendorf 1,5 ml riêng
biệt có chứa sẵn cồn 70o
và được đánh kí hiệu tên cụ thể cho từng con, đem lưu giữ
mẫu trong tủ lạnh phòng thí nghiệm.
2.3.2. Phương pháp ly trích DNA tổng số
Tách chiết DNA dựa vào quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và
cộng sự, 1988).

46. Đồ án tốt nghiệp
34
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction
Hóa chất: dung dịch 1 (50 mM Tris HCl pH 8, 20 mM EDTA pH 8, 2%
SDS); dung dịch 2 (saturated NaCl solution 6 M).
Ủ 550
C trong 2 giờ hoặc qua đêm ở 37o
C
Để lạnh 10 phút và hút 250 µl dung dịch 2
Cắt nhỏ mẫu cho vào efpendorf 1,5 ml
5µl Protein K + 500µl dung dịch 1 và lắc mạnh
Để lạnh 5 phút rồi Ly tâm 8000 vòng/phút trong
15 phút (bỏ cặn)
Thu 500 µl dịch nổi và thêm 1 ml ethanol 100%
để lạnh sau đó ủ - 4o
C /2 giờ
Mẫu chân bơi
Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút (bỏ dịch)
Hút 500 µl ethanol 70% lạnh
Ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút (bỏ dịch)
Làm khô tủa bằng block heater ở 50o
C và cho
100 µl dung dịch TE
Dung dịch DNA

47. Đồ án tốt nghiệp
35
Sử dụng mẫu chân bơi có kích thước xấp xỉ 5 x 5 mm. Rửa trong STE hoặc
GTE nếu cần (nếu mẫu được cất giữ trong một khoảng thời gian dài trong cồn hoặc
dung dịch DMSO).
Tiến hành ly trích DNA bằng cách cắt nhỏ mẫu chân bơi cho vào eppendorf
1,5 ml và thêm 500 µl dung dịch 1. Sau đó, thêm 5 µl proteinase K, vortex nhanh. Ủ
các eppendorf trên ở 55o
C trong 2 giờ (hoặc qua đêm ở nhiệt độ phòng). Sau 2 giờ
(qua đêm), các eppendorf được chuyển sang để lạnh 10 phút. Tiếp theo, thêm 250
µl dung dịch 2 và trộn đều dung dịch, để lạnh 5 phút. Sau 5 phút, tiến hành ly tâm
8000 vòng/phút trong vòng 15 phút. Sau khi ly tâm, cẩn thận thu 500 µl dịch trong
tránh cặn cho vào eppendorf 1,5 ml mới có dán nhãn, thêm 1000 µl Ethanol tuyệt
đối được giữ lạnh. Sau đó, các eppendorf mới này được giữ lạnh ở - 4o
C trong 2 giờ.
Sau 2 giờ, tiến hành ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút. Sau khi ly tâm, tiến
hành loại bỏ dịch nổi và rửa DNA trong eppendorf với 500 µl Ethanol 70%. Tiếp
tục ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm khô
eppendorf bằng máy gia nhiệt ở 55o
C hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng,
thêm 50 - 200 µl TE (nước cất vô trùng) vào mỗi eppendorf (trung bình là 100 µl).
Dán nhãn và bảo quản lạnh - 25o
C.
Quy trình ly trích DNA đạt hiệu quả nhờ sử dụng Protinase K và dung dịch 1
có vai trò như một dung dịch đệm gồm: Tris HCl, EDTA, SDS, phá vỡ màng tế bào
và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, phân hủy các protein liên kết với
DNA. Đồng thời, việc sử dụng hai lần Ethanol 70% và 100% cho hiệu quả rửa giải
và loại bỏ tạp chất cao, hiệu quả kết tủa DNA cao, không bị lẫn tạp và nồng độ đủ
lớn đảm bảo cho phản ứng PCR diễn ra.
2.3.3. Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA
Sau khi tách chiết DNA tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và xác định hàm
lượng của DNA bằng máy đo quang phổ (SmartSpec Plus - Bio rad). Hút 5 µl dung
dịch DNA sau khi tách chiết pha loãng với 495 µl nước cất để đạt độ pha loãng là
100 lần. Sau khi pha loãng tiến hành cho mẫu vào cuvet và đưa vào máy đo quang
phổ, chỉnh bước sóng 260/280 nm, đợi máy hiển thị và đọc kết quả. Máy đo quang

48. Đồ án tốt nghiệp
36
phổ sẽ hiển thị hai kết quả là tỷ lệ giữa bước sóng 260/280 nm và số OD 260 nm để
tính hàm lượng DNA. Nếu tỷ lệ bước sóng 260/280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2
thì DNA được xem là không bị lẫn tạp chất đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho các thí
nghiệm sau. Xác định hàm lượng DNA để tiến hành pha loãng DNA thành hàm
lượng mong muốn để tiến hành các thí nghiệm tiếp.
2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) là kỹ thuật phổ biến trong
sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không
cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men. Ưu và nhược điểm của kỹ
thuật PCR.
Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA là có thể
thực hiện được.
Nhược điểm: Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dương tính
giả.
Trong một số trường hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng
gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính.
Nguyên tắc:
Phương pháp PCR dựa trên nguyên tắc của một phản ứng sinh hóa: tổng hợp
nhiều bản sao DNA từ trình tự DNA xác định nhờ enzyme. Một phản ứng khuếch
đại đặc trưng bao gồm: trình tự DNA cần quan tâm, một enzyme tổng hợp DNA
chịu nhiệt, hai đoạn nucleotid mồi, 4 loại deoxynucleotide triphosphate (dNTP),
dịch đệm cho phản ứng và magnesium. Các thành phần phản ứng nói trên được trộn
đều và phản ứng được đặt vào máy luân nhiệt. Máy luân nhiệt kiểm soát phản ứng
thông qua một chuỗi các nhiệt độ khác nhau trong những lượng thời gian khác
nhau. Sự hài hòa giữa chuỗi nhiệt độ và thời gian do các bước trong chu kỳ khuếch
đại quyết định. Hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn do các
enzyme tổng hợp DNA (DNA Polymerase) với sự hiện diện của những mồi chuyên
biệt thực hiện. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một
đầu của mạch khuôn. DNA polymerase đến, gắn vào và nối dài mồi để hình thành

49. Đồ án tốt nghiệp
37
mạch mới. Nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt gắn vào hai đầu của một trình tự
DNA quan tâm, ta sẽ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi, một mồi xuôi
(sense primer) và mồi ngược (antisense primer).
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR:
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR bao gồm: DNA mẫu, taq
polymerase, mồi, nhiệt độ lai, dNTP, MgCl2, số chu kì của phản ứng PCR.
Mẫu DNA: Mẫu DNA được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối
tượng nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau. Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu
về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu được kết quả tốt
nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lượng DNA cần cho một phản
ứng PCR khoảng 5 - 10 ng DNA thuần khiết.
Mồi (Primer): Là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn
DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F -
primer (mồi xuôi) và R - primer (mồi ngược). Cặp primer quyết định sự thành công
của kỹ thuật PCR. Mồi phải đạt được sự khuếch đại đặc trưng, chuyên biệt và cho
hiệu quả cao. Để đạt được các chỉ tiêu trên mồi phải đạt được các đặc điểm sau:
- Mồi được tổng hợp hóa tự động, khoảng 18 - 24 base.
- Mồi xuôi và mồi ngược không bắt cặp với nhau.
- Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không quá chênh
lệch.
- Khi sử dụng enzyme thông dụng như hiện nay (Taq polymerase) trình
tự nằm giữa hai mồi là không quá lớn (>3 kb). Các mồi được chọn
phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các
trình tự lập lại trên gien.
Nồng độ Mg 2+
: cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá trình PCR, Mg2+
cần
cho DNA polymerase chức năng, nếu nồng độ Mg2+
thấp thì không được hoạt hóa
thành công, nồng độ Mg2+
cao làm phản ứng PCR mất tính đặc hiệu và quá nhiều
sản phẩm tạo ra. Không có quy luật chung cho nồng độ Mg2+
trong phản ứng PCR.
Do đó, nồng độ Mg2+
phải được xác định cho từng phản ứng qua các thử nghiệm.

50. Đồ án tốt nghiệp
38
dNTP: thường sử dụng trong khoảng 20 - 200 µM/ mỗi loại nucleotide.
Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”. Ngoài ra, theo kết quả tham
khảo từ nghiên cứu của các tác giả Muhammad, Barry Jaquish và Khasa, các yếu tố:
nồng độ mồi, Taq polymerase khá ổn định và việc tăng các yếu tố trên cũng không
làm tăng chất lượng của phản ứng PCR.
Đối với điện di cũng cần khảo sát nồng độ phần trăm (%) agarose, hiệu điện
thế và thời gian thích hợp để sản phẩm khuếch đại và thang phân tách rõ ràng.
Từ những vấn đề nêu trên, yếu tố nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm
lượng DNA khuôn được chọn để tiến hành tối ưu hoá phản ứng PCR.
Quy trình PCR:
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ (cycle) kế tiếp nhau,
mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo
dài.
Hình 2.3. Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR
(1) Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94o
C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro
của mạch DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn,
giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính.