Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng s – xt và h – cp16 trên sâu xanh da láng spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HIỆU LỰC DIỆT SÂU VÀ KHẢ NĂNG SINH
SẢN CỦA HAI CHỦNG TUYẾN TRÙNG S – XT VÀ H –
CP16 TRÊN SÂU XANH DA LÁNG Spodoptera exigua VÀ
XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH CÔN TRÙNG CỦA
TUYẾN TRÙNG
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện : LÊ QUỐC VŨ
MSSV: 1151110545 Lớp: 11DSH05
TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN
Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, nay
được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình. Tôi cam
đoan đây là nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học
– Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh.
Những số liệu, hình ảnh trong bài hoàn toàn trung thực chưa từng có ai công bố.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Lê Quốc Vũ

LỜI CẢM ƠN
Tận đáy lòng con xin ghi khắc công lao cha mẹ đã gian khó nuôi dạy con thành
người. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất, là người nâng con dậy sau mỗi lần vấp
ngã, là động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống.
Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Trường
Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức
quý giá ngay từ những ngày đầu tiên bước vào giảng đường đại học.
Đặc biệt, con xin chân thành biết ơn cô Nguyễn Hoài Hương, người thầy đáng
kính, luôn hết mình chỉ dạy để con có thể hoàn thành đồ án. Và hơn thế nữa là những
lời khuyên, bài học cuộc sống cô dạy bảo, sẽ là hành trang quý báu cho con sau này.
Con cũng xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn con về
phương pháp nuôi sâu, tuyến trùng và cũng là người cho con nguồn nấm bệnh trong
những thí nghiệm. Con cũng chân thành cô Đỗ Thị Tuyến đã cho con vi khuẩn chỉ thị
và hoá chất để con có thể hoàn thành đồ án.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cô
Nguyễn Trần Thái Khanh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng
thí nghiệm.
Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH đã luôn khích lệ và giúp đỡ mình trong suốt quá
trình học tập tại trường. Cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh Kha, anh Nguyễn Ngọc
Phong, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, bạn Phan Nguyễn Hương Thảo, Phạm Hải Hậu, Đinh
Thị Minh Châu, Hồ Thị Bích Phương cùng em Lê Thị Ngọc Dung 12DSH01 đã cùng
đồng hành, sát cánh trong những ngày làm đồ án tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015
SVTH: Lê Quốc Vũ

Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG............................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................x
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.......................................................................................4
1.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) ..............................................4
1.1.1. Khái niệm EPN .................................................................................................4
1.1.2. Vai trò và ƣu thế của EPN.................................................................................4
1.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng.........................................................5
1.2.1. Phân loại............................................................................................................5
1.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis.....................6
1.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus.......................7
1.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae.....................................................8
1.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus.........................................................9
1.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản ..................................................................11
1.4. Tổng quan về Serratia marcescens....................................................................16
1.4.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens ...........................................................16
1.4.2. Phân loại Serratia marcescens........................................................................17
1.4.3. Đặc điểm của Serratia marcescens.................................................................17
1.4.3.1. Đặc điểm sinh lý...........................................................................................17
1.4.3.2. Đặc điểm sinh hóa........................................................................................18
1.4.3.3. Đặc điểm phân bố.........................................................................................20

ii
1.4.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens ..............................20
1.4.4.1. Sắc tố............................................................................................................20
1.4.4.2. Biosurfactants...............................................................................................21
1.4.4.3. Acid béo .......................................................................................................22
1.4.4.4. Enzyme.........................................................................................................22
1.4.5. Yếu tố độc lực của Serratia marcescens.........................................................22
1.5. Mối quan hệ cộng sinh.......................................................................................23
1.5.1. Vai trò của tuyến trùng....................................................................................23
1.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh........................................................................24
1.5.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn..........................24
1.5.4. Mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng EPN và Serratia sp.. ......................28
1.6. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt ...........................29
1.6.1. Đặc trƣng côn trùng bị EPN tiêu diệt..............................................................29
1.6.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt.................................................................29
1.7. Khái quát về SXDL Spodoptera exigua............................................................30
1.7.1. Đặc điểm hình thái ..........................................................................................30
1.7.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái .......................................................................30
1.6.2.1. Vòng đời (30 – 40 ngày) ..............................................................................30
1.7.2.2. Thiên địch.....................................................................................................31
1.7.3. Một số biện pháp phòng trừ ............................................................................32
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................33
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu......................................................................33
2.1.1. Thời gian .........................................................................................................33
2.1.2. Địa điểm..........................................................................................................33

iii
2.2. Vật liệu – thiết bị - hoá chất...............................................................................33
2.2.1. Nguồn vi sinh vật ............................................................................................33
2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất sử dụng.......................................................33
2.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................36
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm.....................................................38
2.4.1. Phƣơng pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm ..............................................38
2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu tuyến trùng in vivo..................................................38
2.4.2.1 Phƣơng pháp thử nghiệm trong đĩa petri (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).........38
2.4.2.2 Phƣơng pháp bẫy nƣớc thu tuyến trùng Whitetrap (White, 1927)................39
2.4.2.3. Phƣơng pháp lọc rửa tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2009) ...................39
2.4.2.4. Phƣơng pháp đếm tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)........................40
2.4.2.5. Phƣơng pháp bảo quản tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Phong, 2013) ..............40
2.4.2.6. Phƣơng pháp xác định hoạt động của tuyến trùng (Albrecht M.
Koppenhofer, 2007) ..................................................................................................41
2.4.2.7. Thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16
trên đối tƣợng SXDL tuổi .........................................................................................41
2.4.2.8. Thí nghiệm khảo sát sự tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm - sản lƣợng IJ
và chu kì kí sinh – phát tán của các chủng tuyến trùng trên vật chủ SXDL.............43
2.4.2.9. Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S – XT, H
– CP16 bằng phƣơng pháp tiêm và bƣớc đầu xác định tác nhân gây chết................44
2.4.3. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn.....................................................................46
2.4.3.1. Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp của Akhurst (1980) và
Sun Ho Park và Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2009) ...................46
2.4.3.2. Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp của Lawrwnce A.
Lacey (2011) .............................................................................................................48

iv
2.4.3.3. Phƣơng pháp chứng minh nội sinh ..............................................................48
2.4.3.4. Phƣơng pháp định lƣợng vi khuẩn nội sinh ................................................49
2.4.4. Phƣơng pháp định danh vi khuẩn phân lập.....................................................49
2.4.4.1. Phƣơng pháp kiểm tra độ thuần khiết ..........................................................49
2.4.4.2. Phƣơng pháp quan sát hình thái, sinh lý ......................................................50
2.4.4.3. Thử nghiệm sinh hoá....................................................................................50
2.4.4.4. Phƣơng pháp định danh bằng APIKIT 20E
..................................................50
2.4.4.5. Giải trình tự 16S rRNA................................................................................50
2.4.5. Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học........................................................50
2.4.5.1. Phƣơng pháp định tính enzyme....................................................................50
2.4.5.2. Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng kháng sinh .....................................51
2.4.5.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn- phƣơng pháp cấy chéo ............................51
2.4.5.4. Khảo sát hoạt tính kháng nấm......................................................................53
2.4.5.5. Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phƣơng pháp tiêm .....................................53
2.4.5.6. Khảo sát sự tính tƣơng tác tổ hợp vi khuẩn và tuyến trùng EPN.................54
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN...................................................................56
3.1. Kết quả đánh giá LD50 của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 .........56
3.1.1. Chủng S – XT..................................................................................................57
3.1.2. Chủng H – CP16 .............................................................................................58
3.2. Khả năng sinh sản của tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL ...............60
3.2.1. Khả năng nhân của 2 chủng tuyến trùng trên SXDL tuổi 4............................62
3.2.1.1. Chủng S – XT...............................................................................................62
3.2.1.2. Chủng H – CP16 ..........................................................................................63
3.2.2. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng IJ gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra.............63

v
3.2.2.1. Chủng S – XT...............................................................................................64
3.2.2.2. Chủng H – CP16 ..........................................................................................66
3.2.3. Chu kỳ kí sinh và phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H –
CP16 trên SXDL .......................................................................................................68
3.2.3.1. Chu kỳ kí sinh hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên SXDL
...................................................................................................................................68
3.2.3.2. Chu kỳ phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên
SXDL ........................................................................................................................69
3.3. Xác định tác nhân gây chết sâu..........................................................................72
3.4. Phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng..............................................................75
3.5. Kết quả định lƣợng tổng số vi khuẩn trong tuyến trùng (cfu/IJ) .......................79
3.6. Quan sát hình thái, sinh lý..................................................................................80
3.7. Thử nghiệm sinh hóa..........................................................................................83
3.8. Kết quả định danh bằng KIT API 20E (Biomerieux).........................................85
3.9. Kết quả giải trình tự rRNA 16S .........................................................................86
3.10. Khả năng tiết enzymme ngoại bào...................................................................88
3.11. Khả năng kháng kháng sinh .............................................................................91
3.12. Hoạt tính kháng khuẩn .....................................................................................94
3.14.1. Đối kháng không tiếp xúc .............................................................................95
3.14.2. Đối kháng tiếp xúc ........................................................................................96
3.13. Hoạt tính kháng nấm........................................................................................98
3.14. Hiệu lực diêt sâu.............................................................................................101
3.17. Khảo sát sự tƣơng tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn......................................104
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................107

vi
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................109

vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
PTSH : P òng trừ sinh học
IJ : Ấu trùng xâm nhiễm (viết tắt tên tiếng Anh: Infective juveniles).
EPN : tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh:
entomopathogenic nematodes).
S-XT : Steinernema guangdongense XT
H-CP16: Heterorhabditis indica CP16
VKCS : Vi khuẩn cộng sinh.
BSL : Bƣớm sáp lớn.
SB : Serratia marcescens SB
HB : Serratia marcescens HB
VSV : Vi sinh vật.
SXDL : Sâu xanh da láng

viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng............................................... 6
Bảng 1.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus ...................................... 9
Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus....... 11
Bảng 1.4.Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của
Xenorhabdus / Photorhabdus.............................................................................. 12
Bảng 1.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus .................................... 14
Bảng 1.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus....................................... 15
Bảng 1.7. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens .......................... 19
Bảng 1.8. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh ................................ 27
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H –
CP16 trên đối tƣợng SXDL tuổi 4 ...................................................................... 42
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ
sinh ra đối với 2 chủng tuyến trùng .................................................................... 43
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S
– XT, H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm............................................................ 45
Bảng 3.1. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng S – XT........................... 57
Bảng 3.2. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng H – CP16....................... 59
Bảng 3.3. Khả năng sinh sản của chủng S – XT trên SXDL............................... 61
Bảng 3.4. Khả năng sinh sản của chủng H – CP16 trên SXDL .......................... 61
Bảng 3.5. Chu kỳ kí sinh của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên
SXDL ................................................................................................................... 68
Bảng 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT ...................... 70
Bảng 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16 ................. 71
Bảng 3.8 Kết quả diệt sâu ở một số nồng độ gây nhiễm của hai chủng S – XT và H
– CP16 bằng phƣơng pháp tiêm .......................................................................... 73
Bảng 3.9. Kết quả khử trùng bề mặt tuyến trùng ................................................ 76

ix
Bảng 3.10. Bảng tóm tắt đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng phân lập
............................................................................................................................ 84
Bảng 3.11. Kết quả định danh bằng KIT API 20E của hai chủng SB và HB..... 85
Bảng 3.12. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của SB và HB .............................. 89
Bảng 3.13. Tỷ lệ đối kháng nấm của 2 chủng SB, HB..................................... 100
Bảng 3.14. LD50, LD90 của chủng SB và HB sau 48 giờ đƣợc tiêm vào sâu . 103
Bảng 3.15. Tỷ lệ chết của S – XT sau 12 ngày.................................................. 104
Bảng 3.16. Tỷ lệ chết của H – CP16 sau 12 ngày ............................................. 104

x
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng....................................... 7
Hình 1.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus......................... 10
Hình 1.3. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) ...... 17
Hình 1.4. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở 25o
C
sau 48 giờ (David, 2012) ..................................................................................... 18
Hình 1.5. Vòng đời SXDL da láng ..................................................................... 31
Hình 2.1. Quy trình khảo sát sản lƣợng, chu kì kí sinh- phát tuyến trùng trên kí chủ
SXDL và phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng ............................................... 36
Hình 2.2. Quy trình khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định danh vi
khuẩn.................................................................................................................... 37
Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn mới phân lập.. 37
Hình 2.4. Quy trình phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng EPN............................... 47
Hình 3.1. Dấu hiệu sâu chết bởi tuyến trùng...................................................... 56
Hình 3.2. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng S – XT
trên SXDL tuổi 4................................................................................................. 58
Hình 3.3. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng H –
CP16 trên SXDL tuổi 4........................................................................................ 60
Hình 3.4. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của chủng S
– XT ..................................................................................................................... 65
Hình 3.5. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của chủng
H – CP16............................................................................................................. 67
Hình 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT ....................... 70
Hình 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16 .................. 72
Hình 3.8. Sâu chết bởi tuyến trùng bằng phƣơng pháp tiêm............................... 74
Hình 3.9. Khuẩn lạc vi khuẩn từ huyết tƣơng sâu trên môi trƣờng NBTA......... 75
Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ tuyến trùng
khử trùng bề mặt trên NBTA, MacConkey, NA và PGA.................................... 78

xi
Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng SB .................................................... 80
Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc của chủng HB.................................................... 81
Hình 3.13. Kết quả nhuộm Gram của hai chủng SS1 và SH1............................. 83
Hình 3.14. Cây phát sinh loài của SB và HB ...................................................... 88
Hình 3.15. Khả năng tiết enzyme ngoại bào ....................................................... 90
Hình 3.16. Kết quả kháng sinh đồ....................................................................... 92
Hình 3.17. Kết quả đối kháng không tiếp xúc..................................................... 95
Hình 3.18. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt trên)............................................... 96
Hình 3.19. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt dƣới).............................................. 97
Hình 3.20. Kết quả đối kháng với các chủng nấm ............................................ 100
Hình 3.21. Khả năng diệt sâu của SB, HB sau 48 giờ tiêm vào sâu ................. 102
Hình 3.22. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm SB vào SXDL.......... 102
Hình 3.23. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm HB vào SXDL......... 103
Hình 3.24. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng S – XT ....................................... 105
Hình 3.25. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng H – CP16.................................... 105

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay ngành nông nghiệp Việt Nam đang trên đà phát triển hết sức mạnh mẽ
cả về số lƣợng và chất lƣợng, trong đó một số mặt hàng nông sản nhƣ cà phê, lúa
gạo có kim nghạch xuất khẩu cao và có vị thế trên thị trƣờng quốc tế. Nhu cầu tăng
sản lƣợng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đang đƣợc đặt ra, đi
đôi với nó luôn đòi hỏi những kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn.
Tuy nhiên không phải chỉ riêng Việt Nam mà hầu nhƣ tất cả các nƣớc nông
nghiệp ngƣời nông dân ít đƣợc trang bị đầy đủ kiến thức về sản xuất để đảm bảo
tính bền vững. Vì vậy ở không ít nơi ngƣời nông dân sử dụng ồ ạt các loại thuốc trừ
sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học vì không hiểu biết hay đã biết đƣợc tác hại
nhƣng vẫn cố ý sử dụng để tăng sản lƣợng, thu lợi nhuận. Chính việc sử dụng mà
không tuân thủ các quy định về liều lƣợng và cách thức đã làm dịch bệnh trở nên
nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, SXDL da láng
(Spodoptera exigua) là một trong những loài sâu ăn tạp khá phổ biến, phá hoại trên
nhiều loại cây trồng nhƣ họ bầu bí, họ thập tự, hành, lạc, nho,… có khả năng kháng
thuốc hóa học rất cao nếu ngƣời dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học
không đúng cách. Vì vậy xu hƣớng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đang
trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, đảm bảo sức
khỏe cho con ngƣời, đồng thời tính an toàn môi trƣờng cao.
Trong các biện pháp sinh học đƣợc sử dụng hiện nay thì dùng tuyến trùng ký
sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema và Heterorhabditis đang
đƣợc các nƣớc trên thế giới và Việt Nam đặc biệt chú ý. Tuy nhiên, các loài tuyến
trùng EPN này sẽ không thực sự phát huy hiệu quả nếu không có mặt VKCS trong
ruột chúng là nguyên nhân chính gây ra cái chết của côn trùng. Hai loài VKCS phổ
biến từng đƣợc nghiên cứu và biết đến nhiều nhất gồm Photorhabdus, Xenorhabdus
nhƣng theo một số báo cáo gần đây thì Serratia macescens cũng có vai trò này.Với
vai trò đặc biệt, VKCS trở thành mấu chốt trong mối quan hệ giữa sâu hại – tuyến

2
trùng – vi khuẩn. Đây đƣợc coi là những loài vi khuẩn có đời sống rất đặc biệt khi
cộng sinh trong một vật chủ và gây hại cho một vật chủ khác thông qua vật chủ mà
nó cộng sinh. Mặt khác có thể thấy đƣợc khả năng kháng mạnh với các loài vi
khuẩn có hại gây bệnh cho gia súc và các loài nấm gây hại cho nông nghiệp, điều
này mở ra những ứng dụng rất lớn. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện chỉ có một số
nghiên cứu tại Hà Nội có liên quan đến VKCS trong tuyến trùng EPN, ở các tỉnh
thành miền Nam chƣa có nghiên cứu về vấn đề phân lập và ứng dụng vi khuẩn
cộng sinh này. Trong nghiên cứu này sử dụng hai nguồn tuyến trùng gồm
Heterorhabditis indica (H – CP16) và Steinernem guangdongense (S – XT), H –
CP16 và S – XT là hai chủng tuyến trùng mới chƣa có bất kỳ nghiên cứu về các
chủng VKCS với nó cũng nhƣ việc đánh giá hiệu lực diệt sâu của chúng trên đối
tƣợng SXDL (Spodoptera exigua) . Vì những lợi ích rất quan trọng của hai chủng
tuyến trùng và VKCS ngƣời tiến hành đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là
: “Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S
– XT và H – CP16 trên sâu xanh da láng Spodoptera exigua và xác định tác
nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng ”
2. Mục đích của nghiên cứu
Ứng dụng khả năng phòng trừ sâu hại và nhân nuôi in vivo tuyến trùng EPN trên
đối tƣợng SXDL Spodoptera exigua của hai chủng tuyến trùng S – XT và H –
CP16.
Xác định các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh côn trùng của hai chủng tuyến
trùng S – XT và H – CP16 và ứng dụng chúng trong đấu tranh sinh học bảo vệ thực
vật.
3. Nhiệm vụ của nghiên cứu
Đánh giá hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S –
XT và H – CP16 trên đối tƣợng SXDL.
Phân lập các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh côn trùng của hai chủng tuyến
trùng S – XT và H – CP16.

3
Khảo sát các hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập và bƣớc đầu xác
định mối quan hệ giữa chúng với hai loài tuyến trùng khảo sát.
4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài.
Xác định đƣợc chỉ số LD50 và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng trên
đối tƣợng SXDL.
Phân lập đƣợc hai chủng vi khuẩn SB, HB lần lƣợt trên tuyến trùng S – XT và H
– CP16. Kết quả định danh cho thấy 2 chủng SB, HB đều thuộc loài Serratia
macescens.
Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng kháng sinh, hoạt tính enzyme, tỉ lệ ức
chế nấm bệnh gây hại cây trồng, hiệu lực diệt sâu và sự tƣơng tác với kí chủ tuyến
trùng của hai chủng vi khuẩn SB, HB.

4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN)
1.1.1. Khái niệm EPN
EPN viết tắt của từ Entomopathogenic Nematodes, đây là thuật ngữ dùng để chỉ
các loài tuyến trùng kí sinh thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis, chúng
vừa có khả năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh giết chết côn trùng.
Thực chất các loài tuyến trùng kí sinh này là tổ hợp đƣợc hình thành trong tự
nhiên và có sự chuyên hóa cao, trong đó các loài tuyến trùng thuộc giống
Steinernema cộng sinh với vi khuẩn Xenorhabdus, còn Heterorhabditis thì cộng
sinh với vi khuẩn Photorhabdus. Sở dĩ đƣợc gọi là cộng sinh vì cả vi khuẩn và
tuyến trùng đều dựa vào nhau để tồn tại, phát triển, sinh sản. Đây là một hiện tƣợng
cộng sinh bắt buộc, cả tuyến trùng và vi khuẩn không thể tồn tại độc lập trong tự
nhiên (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
1.1.2. Vai trò và ưu thế của EPN
Vai trò của EPN đƣợc thấy trƣớc tiên nhƣ là các thiên địch tự nhiên có tác dụng
điều chỉnh mật độ quần thể côn trùng, trong đó có nhiều loài sâu hại. Thực tế cho
thấy, trong tự nhiên nơi đâu có sự tồn tại của EPN thì nơi đó hầu nhƣ không bùng
phát dịch hại do côn trùng gây ra (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
EPN đang nhận đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng có
những ƣu thế sau :
a. Phƣơng pháp s đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
có những ƣu thế sau :t độ quần thể cô
b. EPN có kháp s đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
có những ƣu thế sau
c. Các loài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chú
d. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
e. Áp dhoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
có những ƣu thế

5
f. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
có
g. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là
h. Tó khoà bsâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và in vitro và in vivo. to
những ƣu thế sau :t độ quần thể côn trù
i. Dà bsâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và in vitro và in v
1.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng
1.2.1. Phân loại
Tuyến trùng ký sinh côn trùng đã đƣợc tìm thấy trong sáu bộ tuyến trùng:
- Aphelenchida
- Diplogasterida
- Mermithida
- Oxyurid
- Rhabditida
- Tylenchida
Trong các bộ trên thì bộ Rhabditida, Mermithida và Tylenchida là quan trọng
nhất.
Trong bộ Rhabditida, tuyến trùng trong hai họ sau đây đã đƣợc đề cập:
- Hrong bộ Rhabditida, tuyến trùng tSteinernema và Neosteinernema
- Heosteinernemaitida, tuyến trùng trong Heterorhabditis.
Steinernema đã đƣợc Steiner mô tả năm 1923 với tên gọi Aplectana, vì tên này
đã đƣợc sử dụng trƣớc đó, nên năm 1927, Travassos đổi tên thành Steinernema,
trƣớc năm 1982 rất nhiều loài của tuyến trùng này có tên khác là Neoaplectana.
Hiện nay có khoảng 56 loài đã đƣợc mô tả. Neosteinernema đƣợc Nguyễn và Smart
mô tả năm 1994, tuyến trùng này chỉ có một loài và ký sinh trên mối.
Heterorhabditis đƣợc Poinar mô tả năm 1976, Heterorhabditis có 12 loài. Đây đƣợc
đánh giá là nhóm tuyến trùng quan trọng nhất trong bảo vệ mùa màng, vì vậy có
nhiều nghiên cứu tập trung về các giống này.

6
Vòng đời của EPN khoảng 10 - 12 ngày và trung bình từ một vật chủ cho khoảng
5×104
ấu trùng tùy thuộc vào loài và trọng lƣợng vật chủ.
Bảng 1.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng
1.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis
Ấu trùng tuyến trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJ) mang vi khuẩn cộng sinh trong ruột.
Khi vào đến bên trong vật chủ, chúng xâm nhập vào xoang máu, tuyến trùng sẽ
phóng thích các vi khuẩn cộng sinh từ ruột của chúng vào trong máu của côn trùng.
Vi khuẩn sẽ phát triển nhanh nhờ huyết tƣơng của côn trùng tạo ra hiện tƣợng ngộ
độc máu làm côn trùng chết trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đồng hồ. Vi khuẩn sẽ
phân hủy mô trong cơ thể côn trùng giúp ấu trùng tuyến trùng hấp thu chất dinh
dƣỡng để phát triển sang tuổi 4 và thành thành trùng thế hệ 1. Phụ thuộc vào nguồn
dinh dƣỡng mà tuyến trùng có cách phát triển khác nhau trong cơ thể côn trùng nhƣ
hình 2.1.
Tên Phân loại
Ngành Nematoda
Lớp Chromadorea
Phân
lớp
Chromadoria
Bộ Rhabditida
Phân
bộ
Panagrolaimomorpha
Họ Steinernematidae Heterorhabditiae
Giống Steinernema Neosteinernema Heterorhabditis

7
Hình 1.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng
a. Chu trình sinh sản tuyến trùng trong cơ thể côn trùng
Khi nguồn thức ăn phong phú thì tuyến trùng sẽ sống theo vòng tròn nhƣ hình
2.1. Trứng của tuyến trùng thế hệ 1 sẽ nở ra ấu trùng tuyến trùng thế hệ 1 và chúng
lại tiếp tục ăn vi khuẩn để phát triển sang ấu trùng tuổi 2, 3, 4 và thành trùng thế hệ
thứ 2. Thành trùng thế hệ mới sẽ tiếp tục chu trình sống và sinh sản nhƣ ở thế hệ 1.
b. Chu trình sống khi không đủ dinh dưỡng
Khi không có đủ nguồn dinh dƣỡng thì tuyến trùng sẽ sống theo chu kỳ ngắn nhƣ
vòng nửa vòng cung phía dƣới của hình 2.1. Trứng của thành trùng thế hệ thứ 1 sẽ
nở ra ấu trùng tuổi 1, từ đây phát triển sang dạng ấu trùng tuổi 2, kế đó sẽ chuyển
sang dạng trung gian giữa ký sinh và tiềm sinh, cuối cùng thành ấu trùng gây
nhiễm, chờ thời cơ để xâm nhập vào vật chủ.
1.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus
Photorhabdus và Xenorhabdus đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh
với côn trùng cũng nhƣ cung cấp dinh dƣỡng cho tuyến trùng. Đây đƣợc đánh giá là
hai chi vi khuẩn đặc biệt nhất trong giới vi sinh vật khi cộng sinh với một vật chủ là
tuyến trùng và ký sinh gây hại với một vật chủ khác là côn trùng (Steven Forst và
David Clarke, 2011).

8
Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus
thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đƣờng ruột).
1.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae là một họ vi khuẩn lớn, gồm trên 100 loài mang những đặc
điểm cơ bản sau:
a.Nơi cư trú
Họ vi khuẩn đƣờng ruột gồm những vi khuẩn thƣờng trú trên cơ thể, ở ống tiêu
hóa của ngƣời và động vật, có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh.
b.Hình thái
Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn, không sinh nha
bào. Một số giống vi khuẩn thƣờng không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi
khuẩn khác di động (E. coli, Salmonella) nhờ có tiên mao ở xung quanh thân tế
bào. Một số giống có vỏ nhìn thấy đƣợc nhờ kính hiển vi thƣờng nhƣ Klebsiella.
c. Sinh lý
Các vi khuẩn đƣờng ruột là gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, phát triển
đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng.
d.Tính chkhuẩn đường
Lên men glucose, có sinh hơi hoặc không sinh hơi, oxidase âm tính, hầu hết
catalase dƣơng tính, khử nitrate thành nitrite.
Lên men một số đƣờng nhƣ glucose, galactose hoặc không lên men một số đƣờng
nhƣ lactose, manose, saccharose.
Có thể có một số enzyme nhƣ urease, tryptophanase.
Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có lƣu
huỳnh.

9
1.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus
Bảng 1.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus
STT Phân loại
1 Giới Bacteria
2 Ngành Proteobacteria
3 Lớp Gramma proteobacteria
4 Bộ Enterobacteriales
5 Họ Enterobacteriaceae
6 Chi Photorhabdus Xenorhabdus
Hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có mối quan hệ với nhau, có thể thấy mối
quan hệ giữa hai chi qua hình 2.1.

10
Hình 1.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus

11
1.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản
Đây là hai chi có sự tƣơng tự cả về hình thái, sinh lý và sinh hóa, tuy nhiên có thể
phân biệt chúng theo một số đặc điểm cơ bản đƣợc nhắc đến trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus
STT Đặc điểm Photorhabdus Xenorhabdus
1
Trình tự 16S
rRNA
Tại vị trí 208 – 213
TGAAAG
Tại vị trí 208 – 211
TTCG
2
Đặc điểm
hình thái
Tế bào có hình que,
kích thƣớc vào khoảng
(0,5 - 2 × 1 – 10 µm)
Tế bào có hình que
và kích thƣớc là (0,3 - 2
× 2 – 10 µm)
3
Điều kiện
nuôi cấy
Phát triển tối ƣu ở
280
C, một vài chủng phát
triển ở 37 - 380
C.
Điều kiện phát triển
tốt nhất là 280
C hoặc
nhỏ hơn, một vài chủng
phát triển ở 40
C.
5
Loài vật chủ
cộng sinh
Heterorhabditis Steinernema
Ngoài ra còn có một số đặc điểm cơ bản khác về mặt sinh hóa thì tùy thuộc từng
loài và chủng cụ thể.
a. Đặc điểm sinh lý nổi bật
Photorhabdus và Xenorhabdus là Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có cả hai quá trình
lên men và hô hấp trong tế bào.
Đặc điểm nổi bật nhất phải nhắc đến là hiện tƣợng biến đổi pha, đây đƣợc coi là
một hiện tƣợng rất độc đáo trong hai chi vi khuẩn này.
Hiện tượng biến đổi pha:
Đây là thuật ngữ để chỉ giai đoạn biến đổi tự nhiên xảy ra ở một số vi khuẩn về
một số điểm nhƣ hình thái, màu sắc, tính chất hóa lý trong tế bào vi khuẩn. Nguyên
nhân do biến đổi trong cấu trúc DNA đã làm thay đổi cấu trúc phân tử của các

12
protein mà chúng tổng hợp ra điều này làm thay đổi các kiểu hình và kháng nguyên
ở pha thứ cấp. Đối với vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus, pha I (sơ cấp) là
dạng tế bào tự nhiên có quan hệ với tuyến trùng, còn pha II (thứ cấp) có thể xuất
hiện một cách tự phát khi vi khuẩn đi vào pha cân bằng không tăng trƣởng.
Đặc điểm của hai pha:
Đặc điểm trƣớc tiên để dễ dàng phân biệt hai pha là khả năng hấp thu màu
môi trƣờng để tạo màu khuẩn lạc ở pha sơ cấp nhƣng ngƣợc lại pha thứ cấp lại
không thể hấp thu màu nên không tạo màu đặc trƣng nhƣ pha I. Một đặc điểm rất
quan trọng khác là khả năng sinh enzyme và chất kháng sinh mạnh ở pha I nhƣng
hầu nhƣ không có ở pha II. Có thể thấy đƣợc một số các đặc điểm khác nhau cơ bản
ở bảng 1.4.
Bảng 1.4. Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của
Xenorhabdus / Photorhabdus
Đặc điểm Dạng sơ cấp Dạng thứ cấp
Hình thái khuẩn lạc
trên nutrient agar
Tròng, lồi, dạng hạt,
màu đục, cạnh không
đều.
Phẳng, trong mờ, cạnh
đều.
trên MacConkey
Các khuẩn lạc hút
nƣớc, có màu đỏ trung
tính, đỏ, đỏ hồng.
Không xốp, màu đỏ,
trung tính, trắng, vàng.
trên NBTA
Dạng xốp, xanh
dƣơng, oliu hoặc xanh lá.
Xung quanh khuẩn lạc
có vùng trong, một phần
agar bị biến màu.
Không có dạng xốp,
màu đỏ hoặc nâu sẫm.
Không tạo thành vùng
trong suốt bao quanh.
Sắc tố tạo thành trong
môi trƣờng lỏng
Phụ thuộc chủng và
môi trƣờng. Ở P.
luminesens có màu thay
Phụ thuộc chủng và
môi trƣờng. Thƣờng có
màu vàng thẫm, da cam.

13
đổi từ tím đến màu tía
khi tăng nồng độ NaOH.
Màu thay đổi không
mạnh khi thêm NaOH do
nồng độ sắc tố thấp.
Hình dạng và hình
thái tế bào
Tế bào dạng que, kích
thƣớc nỏ đến trung bình
(dài 3 - 5 , rộng 1,5 –
2 ). Cơ thể có thể vùi
hình oval hoặc hình
vuông.
Tế bào tƣơng đối dài,
kích thƣớc nhỏ đến trung
bình (6-7 , rộng 1 -
1,5 ). Cơ thể ít có thể
vùi
Phát huỳnh quang ở
Photorhabdus
Dƣơng tính Âm tính
Hoạt tính kháng
khuẩn
Dƣơng tính Âm tính
Sinh trƣởng của tuyến
trùng trong nhân nuôi vi
khuẩn
Tuyến trùng sinh
trƣởng tốt, tăng nhanh
kích thƣớc, số lƣợng thế
hệ sau và khả năng sống
sót.
Nhân giống tuyến
trùng khó khăn, sinh
trƣởng đình trệ, chết
nhiều.
b. Đặc điểm hình thái nổi bật
Khuẩn mao:
Khuẩn mao là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn, cứng, mọc quanh bề mặt tế bào
nhiều vi khuẩn Gram âm. Chúng có đƣờng kính khoảng 7 - 9 nm, rỗng ruột (đƣờng
kính trong là 2 - 2,5 nm), số lƣợng khoảng 250 - 300 sợi/vi khuẩn, có một tiểu đơn
vị lớn hơn 17 kDa, vai trò chính là giúp vi khuẩn bám dính. Khuẩn mao của vi
khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus đƣợc đánh giá có vai trò trong gây độc vì
bám vào tế bào, mô côn trùng tạo điều kiện cho các yếu tố gây độc khác hoạt động.

14
Tiên mao:
Tiên mao là những sợi lông dài, dƣới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ
khi nhuộm theo phƣơng pháp riêng, vai trò chính là giúp cho vi khuẩn vận động.
Mặt khác, chúng đóng một vai trò quan trọng trong gây độc vì nó sẽ đƣa vi khuẩn
đến những vị trí thích hợp để gây bệnh, né tránh những vị trí bất lợi và tìm đến các
nguồn dinh dƣỡng.
Trong hầu hết chủng X. nematophila đã đƣợc kiểm tra, tế bào sơ cấp đều thể
hiện hai đặc tính là di động và quần tụ bầy đàn trong khi tế bào thứ cấp không có
tiên mao và không thể di động. Trong một nghiên cứu để tìm ra nguyên nhân thiếu
tiên mao trong tế bào thứ cấp, Givaudan và cộng sự (1996) tách dòng gen mã hóa
tiên mao fliC và filD của X. nematophila cho thấy fliCD operon không bị thay đổi
trong tế bào thứ cấp nhƣng không đƣợc sao chép. Sự sao chép của fliCD operon bị
điều khiển bởi flhDC (đây là operon ở Enterobacteriaceae kiểm soát sự biểu hiện
của hơn 50 gen mã hóa chức năng tiên mao). Việc không có tiên mao ở tế bào thứ
cấp là do thiếu yếu tố sigma fliA đây là yếu tố cần cho việc sao chép của fliCD.
c. Đặc điểm sinh hóa
Photorhabdus:
Các đặc tính sinh hóa có sự khác nhau giữa các chủng của chi Photorhabdus, hầu
hết âm tính trong các mô tả của Enterobacteriaceae
Bảng 1.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus
Tên thử nghiệm
Kết quả
Pha I Pha II
Catalase +
Khử nitrate -
Thủy phân gelatine +
Tan huyết cừu Hầu hết +
Tan máu ngựa Hầu hết +
Phân giải tween 20 +

15
Xenorhabdus:
Xenorhabdus âm tính với hầu hết thử nghiệm của Enterobacteriaceae.
Bảng 1.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus
Tween - 40, 60, 80 và 85 Hầu hết +
Acid hóa fructose, D - mannose,
maltose, ribose, N – acetylglucosamine
Hầu hết +
Lên men từ glycerol + yếu
Nguồn cacbon và năng lƣợng từ
fumarate, glucosamine, L - glutamate,
L - malate, L - proline, Succinate, L –
tyrosine
+
Phát quang + + yếu
Tên thử nghiệm
Kết quả
Pha I Pha II
Catalase +
Khử nitrate -
Thủy phân gelatine +
Tan huyết cừu Hầu hết +
Tan máu ngựa Hầu hết +
Phân giải tween 20 +
Tween - 40, 60, 80 và
85
Hầu hết +
Acid hóa glucose +
Di động + + yếu
Hấp thu màu môi
trƣờng
+ -
Kháng sinh + -

16
1.4. Tổng quan về Serratia marcescens
1.4.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens
Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6
trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh
mì. Sau đó, vào năm 332 trƣớc công nguyên, những ngƣời lính trong quân đội
Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có
“máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy
máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng.
Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện
kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969),
đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ
vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch.
Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc
sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens, tuy nhiên,
điều này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là
một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011).
Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên
Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang
màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để
ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi
sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia,
theo tên nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên
loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này
phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta.
Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy
những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà
khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn.

17
1.4.2. Phân loại Serratia marcescens
Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với
nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là
Serratia marcescens.
Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:
- Giới: Bacteria
- Ngành: Proteobacteria
- Lớp: Gramma proteobacteria
- Bộ: Enterobacteriales
- Họ: Enterobacteriaceae
- Chi: Serratia
- Loài: Serratia marcescens
1.4.3. Đặc điểm của Serratia marcescens
1.4.3.1. Đặc điểm sinh lý
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia
marcescens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 –
2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40o
C
và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).
Hình 1.3. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011)

18
Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả
là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng
chính là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia
marcescens thƣờng bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012).
Hình 1.4. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở
25o
C sau 48 giờ (David, 2012)
Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo thành
nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl.
Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.
1.4.3.2. Đặc điểm sinh hóa
Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng có oxy hoặc trong
trƣờng hợp không có oxy. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên
men để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatas,
peroxides,… bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi
trƣờng oxy hóa.
Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ
Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase
(Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia
marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease,
protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là

19
một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong
sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử
dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein.
Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.7.
(Tariq và John, 2010).
Bảng 1.7. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens
STT
Đặc điểm sinh
hóa
Kết quả
1 Di động +
2 Indole –
3 Methyl Red –
4 Voges Proskauer +
5 Citrate +
6 Dnase +
7 Catalase +
8 Oxidase –
9 Urease –
10 Gelatinase +
11 Chitinase +
12 Triple sugar iron
Môi trƣờng chuyển sang acid,
không sinh khí và không sinh H2S
13 Hydrogen sulphide
peoduction
–
14 Lysine decarboxylase +
15 Ornithine decarboxylase +
16 Lên men glucose +
17 Lên men sucrose +
18 Lên men sorbitol +
19 Lên men fructose +
20 Lên men xylose –
21 Lên men rhaminose –
22 Lên men lactose –
23 Lên men arabinose –

20
1.4.3.3. Đặc điểm phân bố
Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực
vật, côn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hóa của ngƣời và động vật có xƣơng sống.
Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông và
Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng
một vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng
hóa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964).
Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn
trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế.
Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng
đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng
huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006).
Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là
trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của
chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).
Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các
loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo
mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia
marcescens với Steinernema carpocapsae.
1.4.4. Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens
1.4.4.1. Sắc tố
Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn
Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố đặc
biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm:
prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin,
metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn
dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin
hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008).

21
Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup A1
và A2/6, nó không đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT (Grimont,
1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thƣờng
gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont, 1977;
Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigiosin đã đƣợc
biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Các dòng đƣợc tạo
thành này có khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc tổng hợp
giai đoạn MAP ở bên ngoài (Francine và Patrick, 2006). Prodigiosin đƣợc biết đến
là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì
vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, có thể chúng sẽ không tổng
hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và
Falkiner, 1997).
Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic
semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid
(3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988). Enzyme
này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy
nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển trên
các hợp chất thơm, để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick,
2006).
1.4.4.2. Biosurfactants
Các chủng sinh sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia
marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất
thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30°C nhƣng không đƣợc sản xuất ở
37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1 đến
W3, có các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama
và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 đƣợc xác định là serratamolide, một
cyclodepsipeptide mà trƣớc đó đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng sự
(1961).

22
1.4.4.3. Acid béo
Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là
3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và octadecanoic acid.
Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế bào, trong đó, n-
tetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983).
1.4.4.4. Enzyme
Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase,
DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,...
Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có
chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh
học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc,… (Joshi và cộng sự,
1989).
Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme
chitinase (ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding
(CBP21) (Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự,
1988; Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự,
1996; Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998),
chúng có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt
động chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986).
1.4.5. Yếu tố độc lực của Serratia marcescens
Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác
nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh
sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ, mà
phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss
và Hewlett, 1986).
Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm
sự bám dính, tính kị nƣớc, mannose-resistant, mannose-sensitive, LPS,…
Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa tác nhân
gây bệnh và vật chủ là sự bám dính.

23
Các yếu tố bám dính của vi sinh vật đƣợc gọi là các adhesion, chúng có thể
có bản chất polypeptide hoặc polysaccharide. Đối với các adhesin có bản chất
polypeptide thì đƣợc chia thành hai nhóm là nhóm có fimbriae và nhóm không
có fimbriae. Mà các vi khuẩn Gram âm, nhƣ là Serratia marcescens, thƣờng bám
dính nhờ các fimbriae này.
Các fimbriae (hay còn gọi là các pili) là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có
dạng nhƣ sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các fimbriae đƣợc cấu tạo bởi nhiều
protein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống nhƣ trụ xoắn ốc. Thƣờng thì chỉ
có một loại protein là cấu trúc chính của một phân nhóm fimbriae tuy nhiên các
protein phụ trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc fimbriae.
Đỉnh của các fimbriae có chức năng gắn với tế bào vật chủ.
Bên cạnh đó, LPS hay còn đƣợc gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lƣỡng tính
nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide liên kết
với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ màng tế
bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – antigen, lõi
oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần gây độc của phân tử
LPS, gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm.
Ngoài ra, việc sản xuất các enzyme khác nhau bởi Serratia marcescens cũng
đƣợc xem nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme chitinase, lipase,
chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).
1.5. Mối quan hệ cộng sinh
1.5.1. Vai trò của tuyến trùng
Tuyến trùng đóng một vai trò quan trọng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:
- Vector vùng đóng một vai tròIJ khi xâm nh đóng một vai trò quan trọng
trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e, chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA
(Hejazi và Falkiner, 1997).ide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc
coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ màng tế bào khỏi các táđây vi khuẩn sẽ sinh sôi, tạo độc
tố giết chết vật chủ.

24
- Bkhi xâm nh đóng một vai trò quan trọng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,
chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).ide liên
kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPSqua lỗ hậu môn để vi khuẩn vào xoang
máu côn trùng. Tạiác chất kháng thể để chống lại vi khuẩn cộng sinh, tuyến trùng sẽ
tiết ra các chất làm trung hòa và làm mất tác dụng của kháng thể này (Nguyễn Ngọc
Châu, 2008).
1.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh
S.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,
chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).ide liên
kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPSqua lỗ hậu môn để vi khuẩn vào xoang
máu
Cung c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,
chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ - 48
giờ,ày các IJ (tu c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao
gồm:e, chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ -
48 giờ,ày các ian này phụ
Hotu c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,
giờ,ày các ian này phụ ên kế vào tổ hợp tuyến trùng, vi khuẩn và lo
Ngăn c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,
giờ,ày các ian này phụ ên kế vào tổ hợp tuyến
1.5.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn
Mối liên hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn có thể đƣợc khái quát hóa qua ba giai
đoạn nhƣ sau:
a) Giai đon hệ
Tuyến trùng sẽ tồn tại ở dạng ấu trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJ) đƣợc bao bọc bởi
lớp vỏ cutin của ấu trùng tuổi 2. Đây là hình thức tồn tại mà không cần đến dinh
dƣỡng, chúng sẽ tồn tại bền bỉ trong đất cho đến khi tìm đƣợc vật chủ. IJ của

25
Steinernema sẽ mang vi khuẩn ở bọng trƣớc ống ruột, trong khi đó Ciche và Ensign
(2000) cho thấy Heterorhabditis mang vi khuẩn nằm rải rác giữa ruột nhƣng chủ
yếu vẫn là nửa trƣớc ống ruột. IJ tìm vật chủ theo hai hình thức:
* Hình tht chủ theo : Vh tht chủ tHeterorhabditis và mrorhabditi
Steinernema thì có tập tính săn lùng vật chủ. Nhờ khả năng nhận biết khí CO2
mà vật chủ thải ra giúp chúng định hƣớng đƣợc mục tiêu và di chuyển nhanh đến
vật chủ.
* Hình thtập tính s: Vh thtập tínSteinernema thì chúng a ính chn lùng
đất chờ khi vật chủ đi qua chúng sẽ tấn công.
Sau khi đã tìm thấy vật chủ chúng sẽ vào cơ thể vật chủ theo hai hình thức:
* Hình th đã tìm thấ: Heterorhabditis s vật chủ chúng sẽ vào cơ thể vật
miệng để đâm thủng biểu bì tại nơi xung yếu nhất là ranh giới giữa các đốt trong
cơ thể, sau đó đi trực tiếp vào xoang máu của vật chủ.
* Hình thđi trực ti: Steinernema seinernemarực tiếp vào xoang máu của
qua miệng, lỗ thở, hậu môn và sau cùng sẽ di trú vào xoang máu.
b) Giai đong, lỗ thở,
Đây là giai đoạn kết hợp việc phục hồi của IJ, sự phóng thích vi khuẩn vào huyết
tƣơng và giết chết vật chủ côn trùng. Tuy nhiên đồng thời với việc xâm nhập của IJ
là một loạt các phản ứng của cơ thể vật chủ côn trùng để chống lại cả tuyến trùng và
vi khuẩn. Phản ứng của tế bào để đáp lại thông qua tế bào máu để tiêu diệt các vi
sinh vật bằng cơ chế thực bào. Khi mà sinh vật xâm nhập trên diện rộng (ở đây là
tuyến trùng) thì tế bào máu sẽ phối hợp với nhau tạo thành một lớp bao vây quanh
sinh vật là gọi là nốt sần. Cách khác là tế bào máu hoạt hóa enzyme phenoloxidase
tạo thành lớp melanin quanh vi sinh vật gây hại. Và các phản ứng miễn dịch dịch
thể gồm sản xuất lyzozyme và sản xuất các pepetide kháng sinh nhƣ cecropin.
* Phà một lIJ:
Trong huyết tƣơng, tuyến trùng vẫn tồn tại ở dạng IJ và tiếp tục phát triển. Bƣớc
phát triển này của tuyến trùng gọi là sự phục hồi. IJ của Heterorhabditis sẽ phục hồi

26
và phát triển thành dạng lƣỡng tính, trong khi đó IJ của Steinernema phát triển
thành hai dạng giới tính rõ ràng.
* Gây btriể
Đây là yếu tố mấu chốt của mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn,
vi khuẩn sẽ sản xuất ra các yếu tố độc tố gây ra cái chết của côn trùng chuẩn bị cho
các bƣớc kế tiếp.
c) Giai đouẩn, vi khuẩ
Trong giai đoạn này là sự phát triển mạnh của vi khẩn đạt mật độ tế bào cao nhất
và quá trình biến đổi sinh học xác côn trùng thành nguồn dinh dƣỡng thích hợp cho
tuyến trùng sinh sôi và phát triển.
* Biong giai đoạn này là sự phát t
Huyết tƣơng là một nguồn dinh dƣỡng rất phong phú cho sự phát triển của vi
khuẩn. Gian đoạn này bắt đầu sau khoảng 24 giờ – 48 giờ sau khi nhiễm, côn trùng
sẽ bị khống chế hoàn toàn bởi các chất gây độc của vi khuẩn sau đó bị phân hủy dần
vì các enzyme ngoại bào mà vi khuẩn tiết ra. Ví dụ nhƣ trong môi trƣờng nhân tạo
Photorhabdus và Xenorhabdus sản xuất ra phức hợp protease, lipase, lecithinase,
chitinase trong suốt giai đoạn tăng trƣởng. Ngoài ra P. luminescens cũng tiết ra một
metalloprotease trong cả điều kiện invitro và invivo.
* Nâng đoiết ra một metalloprotease tron
Sản xuất enzyme phân giải cơ thể côn trùng để lấy dinh dƣỡng cho tuyến trùng
và chính nó:
Khả năng sinh sôi của tuyến trùng phụ thuộc vào sự hiện diện của vi khuẩn trong
cơ thể côn trùng. Trong trƣờng hợp của Photorhabdus – Heterorhabditis cho thấy
Heterorhabditis chỉ phát triển khi có Photorhabdus, điều này cho thấy vai trò rất
quan trọng trong việc chuyển hóa sinh học xác côn trùng. Ở một nghiên cứu khác,
Steinernema có thể sinh sôi dù không có sự hiện diện của Xenorhabdus, nhƣng sự
sinh sôi này có sự hạn chế về số lƣợng.
* B nhưng sự sinh sôi này có sự hạn chế về số lượng.iệc chuyển hóa sinh học

27
Phụ thuộc điều kiện nuôi cấy, thời gian của một thế hệ ấu trùng xâm nhiễm thoát
ra ngoài là khoảng 7 – 21 ngày sau khi chúng vào côn trùng. Trong suốt thời gian
này điều rất quan trọng là xác chết côn trùng phải đƣợc bảo vệ khỏi sinh vật lạ. Cả
Photorhabdus và Xenorhabdus sản xuất ra kháng sinh để chống lại các loài sinh vật
khác.
d) Giai đot ra k
Giai đoạn trƣởng thành của IJ và hình thành tập đoàn IJ mới cộng sinh với vi
khuẩn.
Sự trưởng thành của IJ: IJ sẽ sử dụng dinh dƣỡng đƣợc cung cấp để phát triển
thành dạng thành trùng trƣởng thành.
Hình thành tập đoàn IJ: Khi phát triển đến trƣởng thành trong cơ thể vật chủ,
tuyến trùng tiếp tục phát triển qua một, hai hay nhiều thế hệ và tạo ra nhiều IJ sau
khi kết thúc quá trình sinh sản trong vật chủ. Sau đó các IJ đồng loạt chui ra ngoài
xác côn trùng và phát tán vào môi trƣờng đất xung quanh xác chết và trở thành ấu
trùng xâm nhiễm.
Bảng 1.8. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh
Giai đoi Vòng đoi của tuyến trùng Vòng đoi của tuyến tr
I
Tuyg đoi của tuyến trùng –
vi khuẩn cộng sin
Tìm vđoi của tuyến trùn
Xâm nhoi của tuyến trùng –
vi khuẩn cộng
Vi khuoi của tuyến
trùng – vi khuẩn cộng sin
II (suoi
Ph (suoi của tuyến trùng – vi
khuẩn cộ
Vi khum) của tuyến
trùng – vi khuẩn cộng s
Si khum) của tuyến
trùng
Làm chết côn trùng.
II (muết Tuy(muết côn trùng.t Vi khuết côn trùng.trùng

28
–
Si khuết côn trùng.trùng
– vi khuẩn cộng sinht tán
vào m
Bi khđết côn trùng.trùng
–
III Tuykhđết côn trùng.trùng –
Hình thành th
hùng.trùng – vi khuẩn
cộng sinht tá
1.5.4. Mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng EPN và Serratia sp.
Không nhƣ mối quan hệ cộng sinh truyền thống giữa tuyến trùng EPN và hai chi
VKCS Photorhabdus, Xenorhabdus đƣợc báo cáo trƣớc đây. Trong công bố của
Eyualem Abebe và cộng sự, 2011 đã khẳng định mối quan hệ cộng sinh mới giữa
tuyến trùng Caenorhabditis briggsae và chủng Serratia sp. SCBI khi gây nhiễm
trên ấu trùng BSL. Mặc dù mối quan hệ này có nhiều nét tƣơng đồng với tổ hợp
Heterohabditis – Photorhabdus nhƣ việc Serratia sp. SCBI cũng đƣợc phát hiện
trong ống tiêu hóa của tuyến trùng C. briggsae, đƣợc truyền cho các thế hệ tuyến
trùng thông qua cơ thể tuyến trùng cái. Tuy nhiên hầu nhƣ chỉ có tuyến trùng trƣởng
thành mới mang vi khuẩn Serratia sp. SCBI (gần cơ quan sinh sản) và mối quan hệ
cộng sinh này dƣờng nhƣ không bắt buộc. Vì thực tế Serratia sp. SCBI đều có khả
năng giết chết sâu bằng cách nhiễm trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tuyến trùng.
Đây chính là bằng chứng của việc cộng sinh không bắt buộc và Serratia sp. SCBI
trong mối quan hệ này cũng không đóng vai trò là thức ăn chính của tuyến trùng C.
briggsae.
Trong nghiên cứu tƣơng tự của Zhang và cộng sự, năm 2009 cũng tìm thấy một
chủng vi khuẩn DZ0503SBS1(T) gram âm, tạo sắc tố đỏ, có khả năng phát quan, di
động trong ống tiêu hóa của tuyến trùng Heterorhabditidoides chongmingensis.

29
Việc giải trình tự 16s rRNA, cho thấy chủng DZ0503SBS1(T) tƣơng đồng 99,8%
với Serratia marcescens subsp. sakuensis JCM 11315(T), 99,5% với S. marcescens
subsp. marcescens DSM 30121(T). Do vậy, tiến hành giải trình tự acid béo ở vỏ
màng nhầy, kết quả thu đƣợc chủng DZ0503SBS1(T) chƣa từng tồn tại trong chi
Serratia và đƣợc đặt tên là Serratia nematodiphila sp. nov. DZ0503SBS1(T).
1.6. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt
Côn trùng là nguồn cung cấp dinh dƣỡng hết sức phong phú gồm protein, lipid và
một số thành phần khác, ngoài ra nó còn cung cấp chỗ trú ngụ tạm thời cho một vài
thế hệ tuyến trùng.
1.6.1. Đặc trưng côn trùng bị EPN tiêu diệt
N1. Đặc trSteinernema thì xác chng côn trùng bị EPN tiêu diệ
Nthì xác cHeterorhabditis thì da có màu đ n trùng bị EPN
Da xác ch màu đ n trùng bị EPN tiêu diệtết sức
1.6.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt
a) Sâu hác
EPN có hiệu quả trong diệt trừ nhiều loài sâu hại nhƣ: sâu khoang (Spodopetera
litura); sâu keo da láng (S. exigua); sâu keo (S. mauritia); sâu xám (Agrotis
ypsilon); sâu đo xanh (Plusia sp.); sâu cuốn lá đậu tƣơng (Lamprosema indicata);
SXDL bông (Helicoverpa armigera); sâu cuốn lá bông (Sylepta flava); SXDL
bƣớm trắng ( Pieris rapae); sâu cuốn lá đơn (Parnara guttata); sâu tơ (Plutella
xylostella).
b) B. rel
Sùng bọ rầy là một loài côn trùng gây hại trầm trọng cho các sân cỏ và sân golf ở
nƣớc Mỹ. Hai loại tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis đã đƣợc thí nghiệm
bằng cách xịt lên sân cỏ và cho thấy có thể diệt 100% côn trùng hiện diện trên sân
cỏ. Các loài S. carpocapsae, S. glaseri, S. arenarium, H. bacteriophora, H. megidis.
c) Côn trùng hsaeurculionidae trên cam quýt
Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhà kính, ngoài đồng với các loại tuyến
trùng S. carpocapsae, S. glaseri, S. riobrave và H. bacteriophora cho thấy các loại

30
tuyến trùng này có thể diệt trừ một phần hoặc toàn bộ côn trùng gây hại cam quýt
trong tiểu bang Florida.
d) Dcho th
Dế nhũi là một côn trùng gây hại trầm trọng cho sân cỏ, sân đánh golf. Nguyễn
và Smart, 1990 đã tìm ra đƣợc một loài tuyến trùng từ Brazil và Uruguay và đƣợc
đặt tên là S. scapterisci. Loài tuyến trùng này có khả năng ký sinh hầu hết các loài
dế nhũi trong tiểu bang Florida và các tiểu bang Florida và các tiểu bang có khí hậu
ấm ở miền nam nƣớc Mỹ.
1.7. Khái quát về SXDL Spodoptera exigua
SXDL da láng là một loài sâu đa thực, ngoài cây hành chúng còn gây hại khá
nhiều loại cây trồng khác thuộc họ đậu đỗ, họ bầu bí, họ thập tự, họ cà, cây bông
vải, cây bắp, cây nho... vì thế việc phòng trị chúng vốn đã khó (vì loài này kháng
thuốc rất nhanh) lại càng khó hơn. Sâu non ăn lá, lúc nhỏ chừa lại biểu bì, sâu
tuổi lớn ăn thủng lỗ trên lá, không hình dạng, mật độ sâu cao có thể làm ảnh
hƣởng đến năng suất.
1.7.1. Đặc điểm hình thái
Thành trùng có kích thƣớc trung bình, thân dài 18-20 mm, sải cánh rộng 30-35
mm, màu nâu xám nhạt, cuối bụng con cái có một chùm lông.
Trứng đƣợc đẻ tập trung vào nửa đêm thành từng ổ, mỗi ổ có hàng trăm trứng.
Trên ổ trứng có phủ một lớp lông màu trắng hoặc vàng nhạt.
Sâu non có màu xanh nhạt, da bóng láng trên lƣng có năm sọc, 2 sọc ở mỗi bên
hông rất to và đậm, sọc giữa lƣng có màu đen xen kẽ màu trắng. Nhộng màu nâu
sẫm hay đỏ sẫm thƣờng ở trong đất.
1.7.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái
1.6.2.1. Vòng đời (30 – 40 ngày)
Trứng: 2 – 5 ngày
Sâu non: 15 – 20 ngày
Nhộng: 7 – 10 ngày
Trƣởng thành: 2 – 3 ngày

31
Trƣởng thành chủ yếu hoạt động vào ban đêm, nhất là những đêm có trăng.
Trứng đƣợc đẻ thành ổ trên lá.
Sâu non mới nở sống tập trung quanh ổ trứng, ăn chất xanh của lá để lại màng
biểu bì. Sâu tuổi 3 bắt đầu phân tán ăn toàn bộ thịt lá chỉ chừa lại gân, sâu còn ăn cả
ngọn, hoa và đục vào trái. Sâu non có 6 tuổi, sâu non ăn rất mạnh, cắn phá thành
từng lỗ không hình dạng trên lá mật độ cao có thể làm các ruộng cây màu xơ xác.
Sâu non ban ngày ẩn trong tán lá hoặc dƣới đất, phá hại mạnh vào ban đêm và
những khi trời âm u, ít nắng. Sâu đẫy sức hóa nhộng trong đất, lùm cỏ hoặc dƣới
lớp lá khô.
1.7.2.2. Thiên địch
Nhóm ký sinh có hai loài ong kén nhỏ thuộc họ Braconidae.
Loài ruồi thuộc họ Tachinidae.
Nhóm vi sinh vật có vi khuẩn tấn công.
Hình 1.5. Vòng đời SXDL da láng

32
1.7.3. Một số biện pháp phòng trừ
* Biện pháp canh tác:
Trƣớc khi trồng cần đƣa nƣớc làm ngập ruộng để diệt nhộng.
Cày ải phơi ruộng để diệt sâu và nhộng.
Vệ sinh đồng ruộng hủy bỏ tàn dƣ cây trồng.
Mật độ trồng thích hợp.
Bón phân cân đối hợp lý cũng là biện pháp hạn chế bớt sâu bệnh phát triển.
* Biện pháp cơ học:
Ở những thửa ruộng nhỏ có thể ngắt bỏ ổ trứng và thu sâu non khi sâu non đang
sống tập trung quanh ổ.
* Biện pháp hóa học:
Dùng chế phẩm NPV đặc hiệu trừ SXDL da láng có hiệu quả cao. Nên kết
hợp dùng thuốc thảo mộc Rotenone hay Azadirachtin. Thuốc vi sinh nhƣ: Biocin
16WP; Olong 55WP; Biocin 8000SC; Vi-BT; Xentari 15FC; Delfin WG... Ngoài ra
có thể dùng các loại thuốc nhóm Pyrethroid, Abamectin…lƣu ý dùng luân phiên
thuốc.

33
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Thời gian
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 25/05/2015 đến ngày 15/08/2015.
2.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng,
trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Vật liệu – thiết bị - hoá chất
2.2.1. Nguồn vi sinh vật
Tuyến trùng Steinernema quangdongsense XT (S – XT) và Heterorhabditis
indica CP 16 (H – CP16) do TS. Nguyễn Ngọc Châu, Viện Sinh thái Tài nguyên
Sinh vật Việt Nam cung cấp.
Nguồn vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi do
cô Đỗ Thị Tuyến, Phòng các hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện sinh học nhiệt đới
cung cấp.
Nguồn nấm Fusarium sp., Colletotrichum sp., Rhizoctonia sp., Neoscytalidium
sp. do TS. Nguyễn Thị Hai phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trƣờng – Đại học Công Nghệ TP. HCM cung cấp.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng
a. Môi trường (Thành phần môi trƣờng xem phụ lục 1)
- Môi trƣờng MacConkey (Mac)
- Môi trƣờng NBTA
- Môi trƣờng Nutrient agar (NA)
- Môi trƣờng Nutrient broth (NB)
- Môi trƣờng Peptone glycerone agar (PGA)
- Môi trƣờng Peptone glycerone broth (PG)
- Môi trƣờng Triple Sugar Iron Agar (TSI)
- Môi trƣờng Phenol Red Lactose Broth

34
- Môi trƣờng Tryptone Broth
- Môi trƣờng Simmon Citrate
- Môi trƣờng Nitrate Broth
- Môi trƣờng thạch mềm NA
- Môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase
- Môi trƣờng Gelatine
- Môi trƣờng Casein
- Môi trƣờng huyền phù chitin
b. Hóa chất sử dụng
- Cồn 70o
, cồn 96o
- NaCl
- HCl, NaOH
- Hóa chất nhuộm Gram
- H2O2
- Thuốc thử Kovac’s
- Thuốc thử Griess A và Griess B
- Trichloroacetic acid (TCA)
- Nƣớc muối bão hòa
2.2.3. Dụng cụ và thiết bị
a. Dụng cụ
- Hộp nuôi sâu
- Đĩa petri nhựa
- Thùng nuôi bƣớm
- Chổi lông bắt sâu
- Giấy lọc
- Ống nghiệm
- Đĩa petri
- Erlen 50ml, 100 ml, 250ml
- Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml

35
- Pipetman 100μl, 1000μl
- Đầu típ
- Đũa thủy tinh
- Bao hấp, giấy gói, thun
- Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng
- Bông không thấm, bông thấm
- Kim tiêm, que cấy
b. Thiết bị
- Tủ cấy vi sinh
- Tủ lạnh
- Cân phân tích
- Bếp từ
- Máy nƣớc cất
- Autolave
- Tủ hút
- Máy ly tâm
- Máy lắc
- Bể điều nhiệt
- Kính hiển vi

36
2.3. Bố trí thí nghiệm
Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau:
Hình 2.1. Quy trình khảo sát sản lƣợng, chu kì kí sinh- phát tuyến trùng trên kí chủ
SXDL và phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng
Bảo
quản trong
nƣớc cất
Định lƣợng vi sinh vật
Khảo sát hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng NBTA, NA, MacConkey
Chứng minh nội sinh
Xâm nhiễm trên SXDL
Thu và bảo quản sâu chết bởi
tuyến trùng
Lựa chọn phƣơng pháp
khử trùng – phân lập
Nguồn tuyến trùng
Nguồn tuyến trùng
mới
Chủng thuần khiết
Đánh giá hiệu lực
Khảo sát sản lƣợng,
chu kì kí sinh-phát tán IJ

37
Hình 2.2. Quy trình khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định danh vi khuẩn
Soi khuẩn lạc
Nhuộm Gram
Thử nghiệm sinh hoá
Định danh sinh hóa trên
KIT API 20E
Định danh bằng giải mã
trình tự gene 16S rRNA
TSI
Lên men
đƣờng
OF/O–OF/F
Catalase
Indole
Khử nitrate
Quan sát hình thái, sinh lý
Kiểm tra tính thuần khiết
Chủng vi khuẩn
So sánh trình tự gene trên
Blast NCBI
Khử citrate
Oxidase
Di động
Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn mới phân lập
Kháng
nấm
Enzyme
Tăng sinh 24 giờ
Chủng vi khuẩn
Khả năng
diệt sâu
Kháng
kháng sinh
Tƣơng tác
tuyến trùng
Khảo sát hoạt tính sinh học
Kháng
khuẩn

38
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm
2.4.1. Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm
Phòng nuôi sâu phải đảm bảo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho SXDL phát triển
27 ± 20
C, và ẩm độ 70 ± 5%.
SXDL da láng Spodoptera exigua đƣợc thu mẫu từ các ruộng hành tại tỉnh Vĩnh
Long.
Thế hệ P đƣợc nuôi trong hộp nhựa và cho ăn bằng thức ăn tự nhiên (hành hái tại
ruộng) cho tới khi hóa nhộng.
Sau khi sâu hóa nh tr, lót khăn giu hóa nh trong hộp nhựa và cho ăn bằng thức ăn
tự nhiên (hành hái tại ruộng) cho tới khi 5-6 ngày nhgiu hóa nh trong hộp n
Sau khi vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn là
mật ong pha loãng. Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày.
Ổau khi vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn là
mật ong pha loãng. Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh
Sâu non F1 m u non vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong t u non vũ hóa,
bƣớm t đã chu vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn
là mật ong pha loãng. Tiến hành kiểm tra thu trứng, t30 sâu/ hu v(Ph/ hu vũ hóa,
bƣớm thế hệ. C/ hu vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghé
T C/ hu v F1 thC/ hu v Fhóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy,
thức ăn là mật ong pha loãng. Tiến hành kiể
Nhân nuôi SXDL cho đnhi Fhóa, bƣớm thế hệ P đƣợc
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu tuyến trùng in vivo
2.4.2.1 Phương pháp thử nghiệm trong đĩa petri (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)
Đặt 2 giấy lọc whatman (hoặc một lớp cát) vào đĩa petri có đƣờng kính 10 cm.
Đƣa số lƣợng IJ theo yếu cầu vào trên giấy lọc trong một thể tích nƣớc sao cho
giấy lọc đủ ấm nhƣng không chảy nƣớc khi nghiên đĩa.
Thêm số vật chủ vào trong đĩa theo yêu cầu và đậy nắp lại.
Giữ ẩm bằng cách cho vào một túi nilon, có trao đổi khí với bên ngoài, ủ ít nhất
trong vòng 48 giờ (lâu hơn trong điều kiện nhiệt độ lạnh).

39
Các ký chủ không có dấu hiệu bị ký sinh do tuyến trùng mà có biểu hiện bị
nhiễm bởi các vi sinh vật khác ký sinh, có mùi hôi và bị thối rửa sẽ bị loại ngay.
Còn các ký chủ chết mà không có mùi hôi và có các biểu hiện là do tuyến trùng ký
sinh sẽ đƣợc giữ lại và tiếp tục theo dõi cho đến khi phát tán.
Ghi lại tỷ lệ tử vong và kiểm tra nhiễm tuyến trùng bằng cách giải phẫu xác chết
côn trùng hoặc đếm số tuyến trùng xâm nhập vào tử thi trong vòng 48 giờ sau khi.
Các số liệu sâu chết sau khi ghi nhận sẽ đƣợc đem đi xử lý bằng dùng công thức
Abbott (1925) để tính hiệu lực diệt sâu nhƣ sau:
H% = (1- ) x 100
Trong đó:
- H: tỷ lệ sâu chết (%)
- Ta: số sâu sống ở các công thức sau thí nghiệm
- Ca: số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm
2.4.2.2 Phương pháp bẫy nước thu tuyến trùng Whitetrap (White, 1927)
Sau khi côn trùng bị nhiễm tuyến trùng và chết thì tiến hành thu bằng bẫy nƣớc
nhƣ sau.
Dùng một đĩa petri thủy tinh có đƣờng kính 15 cm đổ vào khoàng 70 ml nƣớc
cất. Đặt vào trong một gƣơng cầu lõm úp ngƣợc không để nƣớc lọt vào bên trong,
đặt lên trên một tờ giấy lọc whatman sao cho vừa gƣơng cầu và mép gấp vừa chạm
mặt nƣớc.
Đặt sâu chết (sau 3-4 ngày) lên mép mặt cầu, giữ ấm trong túi nilon, quan sát đến
khi phát tán IJ thì ta thu nƣớc phía dƣới, lấy tuyến trùng và thêm nƣớc vào thu đợt
mới.
Tuyến trùng sau khi thu đƣợc lọc rửa và bảo quản.
2.4.2.3. Phương pháp lọc rửa tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2009)
Nếu dung dịch chứa tuyến trùng mang nhiều cặn bẩn có thể dùng rây lọc kích
thƣớc lỗ 50 μm để lọc lấy IJ.

40
Để cho tuyến trùng vào một cốc nƣớc cất, để lắng, gạn phần nƣớc phía trên bỏ đi
và cho nƣớc cất mới vào (2-4 lần) cho đến khi dung dịch trở nên sạch.
Có thể dùng formalin 0.1% để rửa tuyến trùng trong lần rửa đầu tiên nếu dung
dịch có nguy cơ ôi nhiễm.
Để đẩy nhanh quá trình lắng có thể li tâm dung dịach chứa tuyến trùng ở tốc độ
300 vòng/phút trong 1 phút.
Sau khi dung dịch trong ta tiến đếm xác định mật độ và tiến hành bảo quản.
2.4.2.4. Phương pháp đếm tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)
Có hai phƣơng pháp chính là đếm trực tiếp và pha loãng.
* Đếm trực tiếp:
Chỉ dùng khi lƣợng tuyến trùng ít (1- 50 IJ), đếm từng cá thể trực tiếp dƣới kính
hiển vi. Với độ phóng đại 10 – 40X.
* Pha loãng:
Khi nồng độ tuyến trùng trong mẫu cao hơn 200 IJ/ ml thì áp dụng phƣơng pháp
này.
Bước 1: Chuẩn bị dịch pha loãng. Lắc nhẹ dung dịch chứa tuyến trùng cho phân
bố mật độ đều, lấy 1 ml từ dịch này và thêm vào X ml nƣớc, X đƣợc ƣớc lƣợng để
số lƣợng tuyến trùng vào khoảng 100 IJ/ml. Đây là l: X+1 pha loãng.
Bước 2: Đếm dung dịch pha loãng: Lần lƣợt, 1 ml dung dịch sẽ đƣợc trải ra 4-5
đĩa đếm và đếm dƣới kính hiển vi. Tiến hành đếm từ 3-5 mẫu từ 2-3 dung dịch pha
loãng khác nhau.
Để xác định nồng độ tuyến trùng trong dung dịch ban đầu sử dụng công thức:
N x x (X+1) = S
Trong đó: N là số tuyến trùng trung bình trong 1 mẫu đếm, M là số ml trong 1
mẫu đếm, X+1 là số ml pha loãng, và S là nồng độ tuyến trùng trong dung dịch ban
đầu.
2.4.2.5. Phương pháp bảo quản tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Phong, 2013)
Tuyến trùng đƣợc bảo quản ở điều kiện lạnh 10o
C.

41
Nƣớc cất, pH 6.5.
Nồng độ bảo quản: 104
IJ/ml.
Thể tích bảo quản: 15 ml/lọ.
2.4.2.6. Phương pháp xác định hoạt động của tuyến trùng (Albrecht M.
Koppenhofer, 2007)
Để quan sát trạng thái sống – chết của tuyến trùng trong quá trình bảo quản dƣới
kính hiển hiển vi ta dựa vào một số đặc điểm khác nhau của tuyến trùng sống vàđã
chết.
Tuyến trùng còn sống sẽ bắt đầu di chuyển sau khi đƣợc khuấy động mạnh, nhìn
chung các IJ đã chết thƣờng nằm bất động với tƣ thế thẳng còn các IJ sống di
chuyển hoặc thƣờng nằm với tƣ thế cong.
Dƣới kính hiển vi, các IJ còn sống ngoại trừ phần đầu và đuôi thì có màu tối hơn
so với các IJ đã chết. Màu tối này là bởi lƣợng lipid dự trữ bên trong tuyến trùng.
Vì vậy các IJ đã chết có thân hình trong hơn do lƣợng lipid dự trữ không còn.
Cuối cùng kiểm tra khả năng xâm nhiễm của tuyến trùng bằng cách thử nghiệm
trên đĩa petri.
2.4.2.7. Thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16
trên đối tƣợng SXDL tuổi 4

42
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H –
CP16 trên đối tượng SXDL tuổi 4
Nghiệm thức Nồng độ gây nhiễm
(IJ/sâu)
Số lƣợng sâu gây nhiễm
1 5 20
2 10 20
3 15 20
4 20 20
5 25 20
6 30 20
7 35 20
8 40 20
9 45 20
10 50 20
Đối chứng 0 20
- Điều kiện:
Nhiệt độ: nhiệt độ phòng.
Thời gian: 2 ngày.
Độ ẩm: 70- 95%.
Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp thí nghiệm trên đĩa prtei
và thu hoạch bằng phƣơng pháp bẫy nƣớc Whitetrap.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 10 nghiệm
thức gây nhiễm và 1 nghiệm thức đối chứng.
- Chỉ tiêu theo dõi:
Nồng độ (mật độ) IJ gây nhiễm lên ký chủ.
Số lƣợng sâu chết.

43
- Ghi nhận và xử lý số liệu:
Ghi nhận số sâu chết, đặc điểm sâu chết do tuyến trùng.
Xác định tỷ lệ sâu chết bằng dùng công thức Abbott (1925).
Xác định chỉ số LD50.
Vẽ biểu đồ thể hiện mối tƣơng quan giữa tỷ lệ chết và nồng độ IJ gây nhiễm.
2.4.2.8. Thí nghiệm khảo sát sự tương quan giữa số lượng gây nhiễm - sản lượng IJ
và chu kì kí sinh – phát tán của các chủng tuyến trùng trên vật chủ SXDL
* Thí nghiệm a: Sự tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ
sinh ra đối với 2 chủng tuyến trùng
(IJ/sâu)
1 5 1
2 10 1
3 15 1
4 20 1
5 25 1
6 30 1
7 35 1
8 40 1
Đối chứng 0 1
- Điều kiện:
Sâu tuổi 4.
Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
Độ ẩm: 70- 95%

44
Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp thí nghiệm trên đĩa petri
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 5
nghiệm thức gây nhiễm và 1 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Tổng sản lƣợng IJ sinh ra ở mỗi nồng độ gây nhiễm từ đó suy ra nồng độ
nhiễm tối ƣu.
* Thí nghiệm b: Khảo sát chu kỳ kí sinh và phát tán của các chủng tuyến trùng
- Bố trí thí nghiệm:
Số lƣợng: 1 sâu/đĩa
Nồng độ: chọn nồng độ tối ƣu ở thí nghiệm 1
Thí nghiệm lặp lại 3 lần
- Điều kiện:
Sâu tuổi 4.
Độ ẩm: 70- 95%
Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp thí nghiệm trên đĩa prtei
Ngày bắt đầu phát tán và sản lƣợng IJ sinh ra ở mỗi ngày, từ đó xem xét độ
phát tán tập trung.
2.4.2.9. Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S – XT, H
– CP16 bằng phương pháp tiêm và bước đầu xác định tác nhân gây chết

45
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng
S – XT, H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm
(IJ/sâu)
1 5 6
2 10 6
Đối chứng 0 6
- Điều kiện:
Sâu tuổi 4.
Tuyến trùng đã khử trùng bề mặt.
Thời gian: theo dõi đến khi đối chứng hoá nhộng.
Độ ẩm: 70- 95%
Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp tiêm, đối chứng.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 2
nghiệm thức gây nhiễm và 1 nghiệm thức đối chứng.
Sâu ở nghiệm thức đối chứng đƣợc tiêm dung dịch tiêm (0,85% NaCl và 0,1%
peptone).
Tiến hành rút và ria giọt huyết tƣơng từ sâu chết do tuyến trùng sau 48 giờ trên
môi trƣờng NBTA, bƣớc đầu xác định nguyên nhân gây chết sâu.
Thời gian và dấu hiệu sâu chết do phƣơng pháp tiêm.
Sự hiện diện của vi sinh vật trên môi trƣờng NBTA.

46
2.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn
2.4.3.1. Phương pháp phân lập được cải tiến từ phương pháp của Akhurst (1980) và
Sun Ho Park và Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2009)
Tuyến trùng đƣợc trữ lạnh ở 10o
C lấy ra để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để
tuyến trùng hoạt động trở lại.
Khử trùng bề mặt IJ
Rửa 2 – 3 lần bằng formalin 0,1%, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần.
Ly tâm ở 500 vòng/phút trong 2 phút hoặc để lắng tự nhiên, thu dịch tuyến trùng.
Ngâm trong dung dịch NaClO 0,5% 10 phút, lặp lại 2 lần, rửa lại bằng nƣớc cất
vô trùng 3 lần. Ly tâm ở 500 vòng/phút trong 2 phút hoặc để lắng tự nhiên, thu dịch
tuyến trùng.
Ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 30 phút để giải phóng vi khuẩn.
Cho vi khuẩn tăng sinh trên môi trƣờng NB trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng, điều
kiện tối và lắc 210 vòng/phút.
Sau khi tăng sinh pha loãng canh trƣờng vi khuẩn bằng nƣớc muối sinh lý 0,85%,
chọn 3 độ pha loãng cấy trang trên môi trƣờng MacConkey, ủ ở nhiệt độ phòng
trong bóng tối 48 giờ, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần.
Sau thời gian ủ, chọn khuẩn lạc đặc trƣng cấy thuần lại trên môi trƣờng
MacConkey, Nutrient agar (NA) và Peptone glycerol agar (PGA) để khảo sát hình
thái khuẩn lạc.

Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng s – xt và h – cp16 trên sâu xanh da láng spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng

Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng s – xt và h – cp16 trên sâu xanh da láng spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng s – xt và h – cp16 trên sâu xanh da láng spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng

Similar to Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng s – xt và h – cp16 trên sâu xanh da láng spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng s – xt và h – cp16 trên sâu xanh da láng spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng