đáNh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ BIẾN DỊ DI TRUYỀN CÁC NHÓM TÔM
SÚ (PENAEUS MONODON) LÀM VẬT LIỆU BAN
ĐẦU CHO CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG.
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Th.s Bùi Thị Liên Hà
Sinh viên thực hiện : Trần Thị Thanh Trúc
MSSV: 115 111 0388 Lớp: 11DSH02
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp
i
LỜI CAM ĐOAN
Nhóm thực hiện đồ án với đề tài “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú
(penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” cam đoan
rằng nội dung trong đồ án này là do nhóm thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp
của Th.s Bùi Thị Liên Hà – cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viên Nghiên
Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II.
Số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn trung thực chưa từng
được ai sử dụng để công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi tham khảo dùng
trong đồ án này được trích dẫn rõ ràng, tên tác giả, tên công trình, thời gian và địa
điểm công bố.
Mọi hành vi sao chép không hợp lệ hay vi phạm quy chế đào tạo, nhóm thực hiện
đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Sinh viên
Trần Thị Thanh Trúc

ii
LỜI CẢM ƠN
Qua thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II, em đã học
hỏi được nhiều kinh nghiệm, kiến thức thực tiễn cũng như được thực hành trên các
thiết bị hiện đại mà em đã được học trên lý thuyết.
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Th.s Phạm Minh Nhựt đã tạo
điều kiện cho em có cơ hội được thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu và Nuôi
Trồng Thủy Sản II.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến với các quý thầy cô trường Đại học Công
Nghệ TP.HCM đặc biệt là thầy cô thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm –
Môi Trường đã tận tình giảng dạy, trang bị kiến thức giúp em nắm bắt và chủ động
trong quá trình thực tập.
Em xin trân trọng cảm ơn chị Th.s Bùi Thị Liên Hà cùng các anh chị đang công tác
tại phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy sản II đã
trực tiếp hướng dẫn cũng như tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập.
Và cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh và
ủng hộ em vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt bài báo cáo này.
Tuy đã rất cố gắng nhưng không tránh khỏi thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý
quý báu từ quý thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn.

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN..........................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG.................................................................................................. ix
DANH MỤC BIỂU ĐỒ HÌNH ẢNH ..........................................................................x
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................7
1.1 Giới thiệu về tôm sú............................................................................................8
1.1.1 Vị trí phân loại..............................................................................................8
1.1.2 Phân bố .........................................................................................................8
1.1.3 Đặc điểm hình thái cấu tạo...........................................................................9
1.1.4 Chu kì phát triển.........................................................................................10
1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng.................................................................................12
1.1.6 Đặc điểm về sinh trưởng, sinh sản và phát triển........................................13
1.1.7 Tình hình nuôi trồng tôm sú ở thế giới. .....................................................14
1.1.8 Tình hình nuôi trông tôm sú ở Việt Nam...................................................14
1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN.....................................15
1.2.1. Đa dạng di truyền. .....................................................................................15
1.2.2. Quần thể.....................................................................................................16
1.2.3 Nguyên nhân xuất hiện đa dạng di truyền trong quần thể.........................17
1.2.4 Ý nghĩa của đa dạng di truyền trong nuôi trồng thủy sản. ........................18
1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE...................................................................19
1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật Microsatellite.........................................................19
1.3.2 Tính chất.....................................................................................................20
1.3.3. Ưu - nhược điểm của microsatellite..........................................................20
1.3.4 Các loại Microsatellite................................................................................21
1.3.5. Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite .......................................22

iv
1.3.5.1. Cơ chế hình thành Microsatellite........................................................22
1.3.5.2 Vai trò của Microsatellite ....................................................................22
1.3.6. Các phương pháp phát hiện Microsatellite ...............................................23
1.3.6.1. Phương pháp lai ..................................................................................24
1.3.6.2. Phương pháp PCR...............................................................................24
1.3.6.3. Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite ...............................25
1.4. ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ....................28
1.5 KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ..........................29
1.5.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR...........................................................29
1.5.2 Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR ....................................................30
2.6 KỸ THUẬT ĐIỆN DI ......................................................................................31
2.6.1 Điện di trên gel agarose..............................................................................31
2.6.1.1 Khái niệm.............................................................................................31
2.6.1.2 Các bước thực hiện ..............................................................................32
2.6.2 Điện di mao quản Capillary Electrophoresis (CE) ....................................33
2.6.2.1. Nguyên tắc ..........................................................................................33
2.6.2.2. Cơ chế điện di .....................................................................................33
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................................34
2.1 Vật liệu..............................................................................................................35
2.1.1 Vật liệu sinh học.........................................................................................35
2.1.2 Hóa chất......................................................................................................36
2.1.2.1 Mồi (primer) .......................................................................................36
2.1.2.2 Thang (ladder)......................................................................................38
2.1.2.3.Hóa chất ly trích DNA.........................................................................38
2.1.2.4. Hóa chất chạy PCR.............................................................................38
2.1.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose ............................................................39
2.1.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản.........................................................39
2.1.2.7. Dụng cụ thí nghiệm.............................................................................39
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................40

v
2.2.1 Phương pháp trích ly DNA tổng số............................................................40
2.2.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA ..........................43
2.2.3 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát tính hoạt động của các
cặp mồi microsatellite..........................................................................................44
2.2.3.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite..................45
2.2.3.2 Khảo sát nồng độ MgCl2......................................................................47
2.2.3.3 Khảo sát hàm lượng DNA khuôn ........................................................48
2.2.3.4 Khảo sát tính ổn định của quy trình PCR............................................49
2.3. Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các
phần mềm Cervus, Fstat, Genepop ........................................................................50
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................52
3.1 Kết quả trích ly DNA........................................................................................53
3.2 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite .................................55
3.2.1 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite W1 trên bốn mẫu tôm
A09, T30, G30, N03 đại diện cho bốn vùng Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương,
Gia Hóa và Nội Địa. ............................................................................................55
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite P1 trên bốn mẫu tôm
A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương,
Gia Hóa và Nội Địa .............................................................................................56
3.2.3. Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite L1 trên bốn mẫu tôm
A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương,
Gia Hóa và Nội Địa. ............................................................................................57
3.3 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu........................................................................59
3.3.1 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite W1. .................................60
3.3.2 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite P1....................................60
3.3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite L1...................................61
3.3.4. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite N1..................................62
3.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn...........................................................64
3.4.1. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite W1..64
3.4.2. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite L1 ...65
3.4.3. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite P1 ...66

vi
3.4.4. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite N1...67
3.5. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR và sàng lọc các cặp mồi
microsatellite...........................................................................................................69
3.5.1. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR....................................69
3.5.2 Sàng lọc các cặp mồi microsatellite...........................................................72
3.6 Kết quả phân tích đa dạng di truyền của bốn quần đàn tôm sú .......................74
3.6.1 Kết quả thông tin đa hình của 4 quần đàn tôm sú: Ấn Độ Dương, Thái
Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa.......................................................................74
3.6.2 Sự khác biệt di truyền của các quần đàn mẫu phân tích............................78
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................80
4.1 Kết luận.............................................................................................................81
4.2 Kiến nghị...........................................................................................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................83
Tài liệu tiếng việt ....................................................................................................83
Tài tiệu tiếng anh.....................................................................................................85
Tài liệu internet.......................................................................................................87
PHỤ LỤC A ..............................................................................................................A1
PHỤ LỤC B...............................................................................................................B1

vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
μl : Microlite
μM : Micromol/lite
μg : Microgram
Ar : Allelic richness (mức độ phong phú alen)
bp : Base pair
ctv : cộng tác viên
TP HCM : Thành phố Hồ Chí Minh
DMSO : Dimethyl sulfoxide
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid
GTE : Glucose-Tris-EDTA
He : Expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi)
Ho : Observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện)
HWE : Cân bằng Hardy - Weinberg
ISSR : Inter Simple Sequence Repeats
M : Ladder DNA (thang DNA)
Marker : Chỉ thị
mM : Milimolar (milimol/lite)
Na : Number of alleles per locus (số lƣợng alen trên locus)
NS : không khác biệt có ý nghĩa
NST : Nhiễm sắc thể
PCR : Polymerase chain reaction
CE : Capillary Electropherosis (Điện di mao quản)
EOF : Electro – Osmotic Flow xi

viii
EFF : Electric Field Force
PIC : Polymorphic Information Content (thông tin đa hình)
SDS : Sodium Dodecyl Sulphate
SSR : Single sequence repeat - Microsatellite
STE : Sodium Chloride-Tris-EDTA
RE : Restristion Enzyme (enzyme cắt giới hạn)
Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)
TBE : Tris Borate EDTA
Tm : Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)
VNCNTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II
VNTR : Variable Number Tamdem Repeat

ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Danh sách 137 mẫu tôm sú. .......................................................................35
Bảng 2.2 Thông tin các cặp mồi................................................................................37
Bảng 2.3 Gradient nhiệt độ lai cho 15 cặp mồi microsatellite..................................46
Bảng 2.4. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite.......................47
Bảng 2.5. Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite.........48
Bảng 2.6. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi microsatellite, DNA khuôn, Taq
polymerase cho một phản ứng PCR...........................................................................49
Bảng 3.1.Kết quả đo OD kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA.....................54
Bảng 3.2. Nhiệt độ bắt cặp (Ta) sau khi tối ưu của 15 cặp mồi microsatellite.........59
Bảng 3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 15 cặp mồi microsatellite .................64
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của 15 cặp mồi
microsatellite ..............................................................................................................69
Bảng 3.5. Hiệu suất PCR và số allen của 15 cặp mồi microsatellite trên 28 mẫu
DNA tôm sú................................................................................................................72
Bảng 3.6. Thông tin đa dạng di truyền của 4 quần đàn tôm sú.................................75
Bảng 3.7. Giá trị Fst được phân tích theo nhóm. ......................................................79
Bảng 3.8. Tổng hợp kết quả tối ưu của 10 cặp mồi microsatellite...........................81

x
DANH MỤC BIỂU ĐỒ HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon)........................................................................8
Hình 1.2. Đặc điểm cấu tạo bên ngoài của tôm sú (Penaeus monodon)....................9
Hình 1.3. Vòng đời tôm sú (Penaeus monodon).......................................................12
Hình 1.4. Quá trình giao vĩ của tôm sú (Penaeus monodon)....................................13
Hình 1.5. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. .................................................25
Hình 1.6. Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite......................26
Hình 2.1. Thang chuẩn DNA 100bp..........................................................................38
Hình 2.2 Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi
.....................................................................................................................................50
Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo gradient nhiệt độ.................................................................................56
Hình 3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản
Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản
Hình 3.5. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản
ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu.....................................................................................60
Hình 3.6. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản
Hình 3.6. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản
Hình 3.7. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản
Hình 3.8. Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite N1 khi tiến hành phản
Hình 3.9. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite W1..65
Hình 3.10. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite L1 .66
Hình 3.11. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite P1.67

xi
Hình 3.12. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1.67
Hình 3.12. Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1.68
Hình 3.13. Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi
microsatellite W1........................................................................................................70
microsatellite P1 .........................................................................................................70
microsatellite N1 ........................................................................................................71
microsatellite L1.........................................................................................................71
Hình 3.17. Biểu đồ thể hiện hiệu suất PCR (%) của 15 cặp mồi microsatellite.......73
Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện số allen của 15 cặp mồi microsatellite ........................73
Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện giá trị Ho và He theo từng quần đàn tôm sú ...............78

1
MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Tôm sú là đối tượng nuôi phổ biến ở các vùng nước lợ, mặn trên toàn quốc. Trong
báo cáo tổng kết ngành thủy sản 2004 và kế hoạch 2005 của Bộ Thủy Sản cho biết
hằng năm, ước tính có khoảng hơn 10 tỷ tôm sú giống giai đoạn PL15 được sản
xuất từ hàng nghìn trại sản xuất tôm giống. Tôm bố mẹ cung cấp cho các trại sản
xuất tôm giống hiện nay hầu như hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn tôm bố mẹ khai
thác tự nhiên và nhập nội. Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn mang tính thụ động, tự
nhiên, cộng với những yếu tố khác do chính điều kiện sản xuất, kinh doanh tại các
trại sản xuất tôm giống không được đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng,
mang mầm bệnh, tiềm ẩn rủi ro lớn cho người nuôi tôm.
Do đó, để có được nguồn giống tăng trưởng tốt, sức chống chịu, kháng bệnh tốt
cung cấp cho người nuôi trồng tôm sú, không phải phụ thuộc vào nguồn tự nhiên
hay nhập nội thì việc nghiên cứu sản xuất giống tôm sú cung cấp cho người nuôi
sản phẩm giống tốt, có tốc độ sinh trưởng nhanh, chống chịu tốt là điều hết sức cần
thiết.
Nước ta có diện tích mặt nước ngọt, lợ, biển khá lớn, bao gồm các sông, suối, ao, hồ
chứa nước... với thành phần giống loài thủy sản phong phú là tiềm năng to lớn để
phát triển và nuôi trồng thủy sản. Năm 2012, diện tích nuôi trồng thủy sản toàn
quốc ước tính 1.200.000 ha, trong đó diện tích nuôi tôm sú chiếm phần lớn với
622.118 ha chiếm 88,1%, hàng thủy sản Việt Nam đã có mặt ở trên 164 quốc gia và
vùng lãnh thổ trên thế giới. Kim ngạch xuất khẩu năm 2014 đạt 7,9 tỷ USD, tăng
gấp 18% lần so với cùng kì năm trước. Sự tăng trưởng này chủ yếu nhờ vào kết quả
xuất khẩu của mặt hàng tôm, với giá trị xuất khẩu cao nhất từ trước tới nay khoảng
4,1 tỷ USD, tăng 25% so với năm 2013 (http://xttm.agroviet.gov.vn/).

2
Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chú ý đến nâng cao chất lượng
di truyền, tăng khả năng chống chịu ở tôm sú đã được thực hiện nhằm đặt ra cơ sở
khoa học, kỹ thuật để có thể nâng cao chất lượng của loài thủy sản giá trị cao này
như “Nghiên cứu buồng trứng và khả năng sinh sản của các dòng tôm sú gia hóa”
(Nguyễn Văn Bình, 2012), “Đánh giá tính đa hình của ba quần đàn tôm sú
(Penaeus monodon) nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp microsatellite” (Nguyễn
Thị Thảo và ctv, 2004) với mục tiêu có được sản phẩm giống tôm sú tốt, cải thiện di
truyền sản phẩm giống, tập trung cao vào các tính trạng kinh tế quan trọng là sức
sinh trưởng, kháng bệnh, chống chịu và phải đa hình di truyền.
Các nghiên cứu xác định biến dị di truyền kết hợp với các biến dị hình thái thể hiện
về sinh trưởng, sức sống với các chỉ thị ở mức độ phân tử của các quần thể tôm sú,
giữa các cá thể trong cùng một quần đàn là hướng nghiên cứu phù hợp cần thiết,
ứng dụng cao. Chính vì thế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn giao cho Viện
Nghiên cứu và Nuôi trồng thủy sản II thực hiện đề tài cấp nhà nước “Ứng dụng di
truyền số lượng và di truyền phân tử để tạo vật liệu ban đầu cho chọn giống tôm sú
(Penaeus monodon) theo tính trạng tăng trưởng”, đề tài này được thực hiện trong 4
năm (1/2012 – 12/2015) và nhóm thực hiện đồ án tham gia vào một phần nhỏ với đề
tài “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon) làm vật liệu
ban đầu cho chương trình chọn giống” nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chương
trình chọn giống tôm sú quốc gia. Đề tài được thực hiện ở Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng Thủy sản II dưới sự hướng dẫn của Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà.
2. Tình hình nghiên cứu
Trên thế giới
Trên thế giới, có những đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền đã được thực hiện
như:
-“Sử dụng chỉ thị microsatellite phân tích đa dạng di truyền tôm sú (Penaeus
monodon) ở Philippines” (Zhenkang Xu và ctv, 2001). Trong nghiên cứu này đã

3
phân lập được 49 cặp mồi microsatellite từ ngân hàng gen của loài tôm sú (Penaeus
monodon), qua sàng lọc đã chọn ra được 36 cặp tốt nhất được sử dụng để đánh giá
đa dạng di truyền quần đàn tôm sú nuôi tự nhiên cho kết quả thông tin đa hình dao
động trong khoảng từ 0,63 – 0,96.
-“Sử dụng các chỉ thị microsatellite trong chọn giống tôm sú (Penaeus monodon)”
(Wuthisuthimethavee và ctv, 2003). Nghiên cứu này được tác giả thực hiện trên
quần đàn tôm sú hoang dã ở Thái Lan, sử dụng 30 cặp mồi microsatellite tự thiết kế
để đánh giá tính đa hình. Kết quả cho thấy thông tin đa hình (PIC) dao động trong
khoảng từ 0,4275 – 0,9264.
-“Sử dụng các chỉ thị microsatellite để phân tích sự khác biệt di truyền giữa các
quần đàn tôm sú vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương” (En-Min You và ctv,
2005). Trong bài báo này, các tác giả đã sử dụng 10 cặp mồi microsatellite có số dị
hợp tử mong đợi >0,92 của Pan và ctv (2004) để phân tích khác biệt di truyền của
330 cá thể tôm sú thuộc 2 vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Kết quả phân
tích thông tin đa dạng di truyền cho thấy: số dị hợp tử quan sát được dao động từ
0,638 – 0,743. Sự khác biệt có ý nghĩa về cân bằng di truyền Hardy – Weinberg
(p<0,05). Giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa quần đàn tôm sú Ấn Độ Dương và
Thái Bình Dương là khá cao (Fst=0,069; p≤ 0,0067).
-“Đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú (Penaeus monodon) nuôi tự
nhiên và hoang dã bằng chỉ thị microsatellite” (D.Aziz và ctv, 2011). Tác giả và
cộng sự đã tiến hành thu mẫu tôm sú nuôi tự nhiên và hoang dã ở Malaysia, bằng 30
cặp mồi microsatellite được lấy từ ngân hàng gen Biobasic, Canada, các tác giả đã
công bố kết quả phân tích đa dạng di truyền của mẫu tôm sú trên. Số lượng allen
trên mỗi cặp mồi là từ 3 – 36, số dị hợp tử quan sát He= 0,5166 nhỏ hơn so với dị
hợp tử mong đợi He=0,5552. Giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa quần đàn tôm sú
nuôi tự nhiên và hoang dã là rất cao (Fst=0,6308; p≤ 0,009).
Trong nước

4
Những nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện như: Trường Đại học quốc
gia TP HCM, Viện NCNTTS I và Viện NCNTTS II đã có những khảo sát đa dạng
di truyền một số quần thể đàn tôm sú (Penaeus monodon) bằng hai kỹ thuật RAPD
và mtDNA PCR-RFLP. Theo đó, kết quả chỉ đánh giá khả năng ứng dụng từng kỹ
thuật vào các mục đích tìm hiểu khác nhau, nhưng đây là một nỗ lực trong đánh giá
di truyền một số quần thể tự nhiên.
Để đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và
Trung Quốc và làm cơ sở cho việc quản lý, bảo tồn nguồn gen tôm càng xanh tại
Việt Nam. Nghiên cứu “So sánh sự đa dạng di truyền giữa tôm càng xanh Việt Nam
và tôm càng xanh Trung Quốc sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD”
(Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thanh Liêm, 2012) nhằm kiểm tra sự khác biệt di
truyền của hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp
mồi microsatellite và 5 mồi ngẫu nhiên RAPD. Theo kết quả báo cáo không có sự
khác biệt di truyền giữa quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc khi phân
tích bằng chỉ thị microssatellite tuy nhiên với 5 mồi ngẫu nhiên RAPD cho kết quả
thông tin đa hình (PIC) của quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc lần
lượt là 0,84 và 0,88.
Một số các nghiên cứu thăm dò khác: “Microsatellite nghiên cứu biến dị về màu sắc
thịt trắng và thịt vàng của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Hữu
Ninh, 2003); “Bước đầu thăm dò, ứng dụng một số chỉ thị DNA phân tích đa dạng
di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Bùi Thị Liên Hà, 2004).v.v…
3. Mục đích nghiên cứu
- Tìm được một số chỉ thị microsatellite phù hợp và tiềm năng trong việc đánh giá
đa dạng di truyền giữa các quần đàn tôm sú Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia
Hóa và Nội Địa.
- Cung cấp thông tin di truyền cho chương trình chọn giống quốc gia.

5
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite qua quy trình PCR.
- Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu tôm sú thuộc 4 nhóm khác nhau trong
chọn giống thông qua chỉ thị microsatellite nhằm phục vụ cải tạo giống tôm sú.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp trích ly DNA tổng số dựa trên quy trình tách chiết DNA Salt
extraction (Miller và ctv, 1988).
- Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA
- Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi
microsatellite
- Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần
mềm Cervus 3.0.3, Fstat, Genepop.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
- Tối ưu hóa các phản ứng khuếch đại của các chỉ thị microsatellite.
- Kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của các chỉ thị microsatellite lựa chọn.
- Phân tích đa dạng di truyền của các nhóm mẫu tôm sú chọn giống.
- Đưa ra nhận định hỗ trợ cho chương trình chọn giống tôm sú.
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon)
làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” bao gồm 4 chương:

6
Chương 1. Tổng quan tài liệu: tóm tắt về các đặc điểm, đặc tính của đối tượng
nghiên cứu là loài tôm sú (Penaeus monodon). Giới thiệu về kỹ thuật microsatellite
và các cặp mồi microsatellite sử dụng trong báo cáo này.
Chương 2.Vật liệu và phương pháp: nêu ra các vật liệu sử dụng và những phương
pháp dùng để phân tích trong đề tài.
Chương 3. Kết quả và thảo luận: báo cáo về các kết quả đã đạt được trong đề tài và
đưa ra nhận xét, so sánh với các nghiên cứu liên quan.
Chương 4. Kết luận và kiến nghị: đưa ra các kết luận chung về các kết quả đã đạt
được và đề xuất các hướng giải quyết tiếp theo để hoàn thiện hơn.

7
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

8
1.1 Giới thiệu về tôm sú
1.1.1 Vị trí phân loại
Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác đại dương
được nuôi để dùng làm thực phẩm, là đối tượng rất quan trọng trong lĩnh vực
nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản. Theo Hothuis (1980) và Barnes (1987) (trích dẫn
bởi Nguyễn Văn Chung và Trần Ngọc Hải, 2004) tôm được phân loại trong hệ
thống phân loại như sau:
Ngành: Arthropoda
Lớp : Malacostraca
Bộ : Decapoda
Họ : Penaeidae
Giống : Penaeus
Loài : Penaeus monodon (Fabricius, 1798).
1.1.2 Phân bố
Trên thế giới, tôm sú được phân bố chủ yếu ở Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, Đông
và Đông Nam Châu Phi, Pakistan, Nhật Bản, Malaysia. Đặc biệt, bắt gặp nhiều nhất
ở vùng Đông Nam Á như: Philippins, Indonesia, Thái Lan, Việt Nam… Tôm
Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon)

9
trưởng thành có tập tính sống ở biển khơi, thường được tìm thấy ở độ sâu 180m,
nhưng tôm giống thường xuất hiện ở vùng ven bờ. ( Nguyễn Văn Thường và
Trương Quốc Phú, 2004).
Ở Việt Nam, theo Nguyễn Văn Chung (1995) (được trích dẫn bởi Nguyễn Đel,
2009). Tôm sú phân bố ở vịnh Bắc Bộ, ven biển Nam Trung Bộ, vùng Tây Nam Bộ,
sông Ông Đốc, Khánh Hội, Kim Quy, Hòn Chông, Hà Tiên… Tôm sống ở độ sâu từ
0 – 126m, đáy cát bùn hay bùn cát, thích hợp nhất là các thủy vực có độ mặn cao,
ổn định.
1.1.3 Đặc điểm hình thái cấu tạo
Quan sát cơ quan bên ngoài của tôm sú gồm các bộ phận sau:
Chủy: tôm sú có chủy dài kéo dài đến rìa của cuốn râu I, hơi cong lên ở vuốt, hình
dạng như lưỡi kiếm, có răng cưa ở phía trên lưng và cả phần phía dưới, nhờ có răng
cưa này mà ta phân biệt được các loài tôm khác nhau trong giống penaeus. Với tôm
sú, phía trên chủy có 7-8 răng và phía dưới chủy có 3 răng:
Hình 1.2. Đặc điểm cấu tạo bên ngoài của tôm sú (Penaeus monodon)

10
Antennule và Antennae là cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho cơ thể của tôm.
3 cặp châm hàm: giúp cho việc ăn
5 cặp chân ngực: giúp để ăn và bò
5 cặp chân bụng: dùng để bơi.
Hai đôi mắt kép có 2 cuống mắt
Carapace có gai râu và gai gan nhưng không có gai hốc mắt.
Đuôi có một cặp chân đuôi giúp cho tôm có thể bơi lên cao hay bơi xuống thấp.
Cơ quan sinh dục nằm ở dưới bụng: tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có
kích thước to hơn con đực. Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái thông qua cơ
quan sinh dục phụ bên ngoài. Petasma và thelycum là cơ quan phân biệt đực cái ở
tôm, Petasma có ở con đực và thelycum có ở con cái.
Con đực: cơ quan sinh dục chính của con đực nằm ở phía trong phần đầu ngực, bên
ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục
đực mở ra hốc háng đôi chân ngực thứ 5. Tinh trùng thuộc dạng chứa trong túi.
Con cái: buống trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn trứng mở ra ở
khớp háng đôi chân ngực thứ 3. Thelycum nằm giữa gốc đôi chân bò thứ 4 và 5.
1.1.4 Chu kì phát triển.
Vòng đời của tôm sú chia làm 6 thời kì: phát triển phôi, ấu trùng và hậu ấu trùng,
giai đoạn ấu niên, giai đoạn thiếu niên, giai đoạn sắp trưởng thành, giai đoạn trưởng
thành (Nguyễn Văn Chung và ctv, 1997)
Phát triển phôi: trứng tôm sú hình cầu, màu vàng xanh, đường kính trung bình
0,3mm. Thời gian để phôi phát triển qua 2 giai đoạn tế bào, giai đoạn phôi nang và
thời điểm xuất hiện Nauplius trong trứng là 0,5; 1,5; 8 giờ sau khi đẻ xong.

11
Ấu trùng và hậu ấu trùng: ấu trùng và hậu ấu trùng tôm lột xác nhiều lần, phát
triển qua các giai đoạn Nauplius, Zoea, Mysis, Postlarvae.
- Giai đoạn Nauplius: nauplius mới nở hình quả lê, qua 5 lần lột xác biến đổi
dần và trở nên dài ra. Nauplius sống phù du trôi nổi ở tầng trên, dinh dưỡng
chủ yếu bằng noãn hoàng, vận động theo kiểu zích zắc, không định hướng,
không liên tục, hướng quang mạnh.
- Giai đoạn Zoea: cơ thể bao gồm 3 phần rõ rệt (đầu- ngực- bụng). Zoea bơi
nhờ 2 đôi râu (đôi 1 phân đốt, đôi 2 phân nhánh) bơi lội có định hướng về
phía trước. Ấu trùng Zoea bắt đầu ăn thức ăn ngoài bằng hình thức ăn lọc.
Do chúng bắt mồi liên tục nên chúng có phần đuôi phân dài (Lục Minh Diệp
(2003) trích dẫn bởi Nguyễn Văn Bình, 2012). Ba giai đoạn phụ của ấu trùng
Zoea phân biệt nhờ sự xuất hiện của chùy trán, cuống mắt kép, sự phân đốt
của phần bụng và sự phát triển của gai cứng, gai bên các đốt bụng. Thời gian
phát triển các giai đoạn phụ là từ 30-48 h tùy theo nhiệt độ.
- Giai đoạn Mysis: trải qua 3 giai đoạn biến thái phụ. Cơ thể tôm sú đã giống
dạng trưởng thành hơn so với Zoea. Mysis sống ở tầng trên, đặc trưng của
Mysis là bơi ngược về sau, đầu chúc xuống dưới. Phân biệt các giai đoạn phụ
của Mysis dựa vào sự xuất hiện và phân đốt của chân bơi.
- Giai đoạn ấu hậu ấu trùng Postlarvae: hình dạng giống tôm trưởng thành
nhưng chưa hoàn thiện về màu sắc. Postlarvae bơi thẳng, có định hướng về
phía trước, hoạt động bơi lội chủ yếu nhờ vào chân bụng. Tuổi của
Postlarvae được tính theo ngày kể từ khi biến thành Postlarvae đầu tiên. Từ
P1-P5 chúng sống trôi nổi, từ P5 trở đi chúng sống đáy.
Giai đoạn ấu niên: từ P5-P20 tôm chuyển sang sống đáy, giai đoạn này tôm bắt
đầu bò bằng chân bò và bơi bằng chân bơi.

12
Giai đoạn thiếu niên: tôm bắt đầu ổn định về tỷ lệ và bây giờ có thể phân biệt được
tôm đực và tôm cái dựa vào petasma của con đực và thelycum của con cái.
Giai đoạn sắp trưởng thành: giai đoạn này đặc trưng bởi sự phát triển của tuyến
sinh dục đực, con đực đã bắt đầu có tinh trùng nằm trong túi tinh và con cái có
buồng trứng phát triển, khi con cái giao vĩ thì nó có túi tinh.
Giai đoạn trưởng thành: là giai đoạn chín sinh dục hoàn toàn, di cư xa bờ tới vùng
biể sâu để sinh sản.
1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng.
Tôm sú là loài ăn tạp, thức ăn của tôm bao gồm giáp xác, giun nhiều tơ, nhuyễn thể,
các côn trùng, tảo và các mảnh thực vật. Tính ăn của chúng thay đổi theo giai đoạn,
ở giai đoạn tôm bột và tôm giống chúng ăn nhiều các mảnh thực vật, vi tảo… Khi
tôm lớn chúng ăn các loại động vật không xương sống như ruốc, mọi giáp xác chân
đều, giun nhiều tơ… Ở giai đoạn thành thục, trong suốt mùa sinh sản tôm ăn nhiều
nhuyễn thể trong khi những tháng khác tôm ăn nhiều cá hơn (Dall, 1998), được
trích dẫn bởi Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004).
Hình 1.3. Vòng đời tôm sú (Penaeus monodon)

13
Tôm ăn suốt ngày đêm nhưng ăn nhiều vào ban đêm, tôm giảm ăn vào những lúc lột
xác, khả năng bắt mồi của tôm còn phụ thuộc rất lớn vào môi trường sống (Nguyễn
Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004).
1.1.6 Đặc điểm về sinh trưởng, sinh sản và phát triển.
Hiện tượng lột xác: trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng
lên đến mức độ nhất định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ cũ để lớn lên. Sự lột xác thường
xảy ra vào ban đêm. Sự lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp
nhưng không tăng thể trọng. Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy
ra như sau: lớp biểu bì giữa khớp đầu ngực và phần bụng bị nứt ra, các phần phụ
của đầu ngực rút ra trước, theo sau là phần bụng và các phần phụ phía sau rút ra
khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốn cong mình toàn cơ thể. Lớp vỏ mới mềm sẽ
cứng lại sau 1-2h đối với tôm nhỏ, 1-2 ngày đối với tôm lớn.
Hiện tượng giao vĩ và đẻ trứng: khi tôm cái vừa lột xác, tôm đực thường giao vĩ,
các túi tinh với sự giúp đỡ của petasma sẽ được đưa vào thelycum của con cái. Hoạt
động giao vĩ thường diễn ra vào ban đêm, sức sinh sản của tôm sú là khoảng
200.000- 1.700.000 trứng.
Hình 1.4. Quá trình giao vĩ của tôm sú (Penaeus monodon)

14
1.1.7 Tình hình nuôi trồng tôm sú ở thế giới.
Nghề nuôi tôm trên thế giới đã xuất hiện cách đây vài thế kỷ nhưng mãi đến năm
1964 quy trình về sản xuất tôm bột mới được hình thành. Tôm sú là loài có sản
lượng đánh bắt và nuôi hàng đầu trên thế giới. Theo thống kê của tổ chức Nông
Lương thế giới (Food Agriculture Organization- FAO), sản lượng tôm sú chiếm
52% năm 1997 trên tổng số sản lượng tôm nuôi trên thế giới, Đông Nam Á là vùng
dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng tôm toàn thế giới trong số 54 quốc gia có
ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển.
Do nhu cầu thị trường ngày càng cao nên nghề nuôi tôm ngày càng phát triển và
được cải tiến. Điều đó đã chứng tỏ rằng nuôi tôm sú công nghiệp đã mang lại hiệu
quả cao cho người nuôi, tạo ra lượng tôm lớn cho nhu cầu xuất khẩu. Hiện nay, trên
thế giới có trên 60 quốc gia nuôi tôm tập trung thành 2 khu vực chính là Nam Mỹ
(các nước Tây bán cầu) và Đông Nam Á (các nước Đông bán cầu). Các quốc gia
Đông Nam Á với điều kiện thiên nhiên ưu đãi và ứng dụng nhanh về khoa học kỹ
thuật vào sản xuất nên sản lượng tôm chiếm 80% tổng sản lượng tôm trên toàn thế
giới. Các nước có sản lượng lớn như Trung Quốc, Thái Lan (276.000 tấn), Ấn Độ
(971.00 tấn), Banglades, Việt Nam (50.000 tấn) (theo thông tin chuyên đề, bộ Thủy
sản số 4, 2003)
1.1.8 Tình hình nuôi trông tôm sú ở Việt Nam.
Ở Việt Nam nghề nuôi tôm là truyền thống có từ lâu, nuôi tôm với hình thức quảng
canh cổ truyền, bán thâm canh với con giống tự nhiên. Theo Trần Ngọc Hải và
Nguyễn Thanh Phương (2009) thì ở nước ta, nghiên cứu sinh sản nhân tạo các loài
tôm đầu tiên được tiến hành ở miền Bắc từ thập niên 70 với các loài tôm Penaeus
merguiensis, P. penicilatus và P. japonicus. Từ năm 1984- 1985, tôm sú penaeus
monodon đã được sinh sản nhân tạo thành công ở Nha Trang và dần trở thành đối
tượng chủ yếu trong sản xuất giống và nuôi tôm biển ở nước ta.
Cho đến nay, thủy sản là một trong những ngành có tốc độ tăng trưởng xuất khẩu
cao nhất trong 9 tháng đầu năm 2014. Theo số liệu của Tổng cục Thống kê, sản

15
lượng thủy sản 9 tháng đầu năm ước đạt 4,7 triệu tấn, tăng 4,9% so với cùng kì năm
trước. Trong đó, sản lượng cá đạt 3,4 triệu tấn, tăng 3,2%; tôm đạt 0,57 triệu tấn,
tăng 14,8%. Giá trị sản xuất thủy sản 9 tháng đầu năm 2014 (theo giá so sánh 2010)
ước đạt 134.000 tỷ đồng, tăng 6,5% so với cùng kỳ năm ngoái. Giá trị xuất khẩu đạt
5,7 tỷ USD tăng 23%. Do tôm chân trắng có hiệu quả kinh tế cao và ổn định hơn
nhiều so với tôm sú nên đã có sự dịch chuyển lớn về diện tích nuôi tôm chân trắng
và tôm sú. Tổng diện tích thả nuôi lũy kế đạt 663 nghìn ha (tăng 5,2% so với cùng
kỳ năm 2013); trong đó diện tích tôm sú là 572 nghìn ha (giảm 1,8%), diện
tích tôm chân trắng là 91 nghìn ha (tăng 91,8%). Tổng sản lượng thu hoạch lũy kế
ước đạt 395 nghìn tấn (tăng 50%); trong đó sản lượng tôm sú là 180 nghìn
tấn, tôm chân trắng là 215 nghìn tấn. (www.tongcucthuysan.gov.vn).
1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
1.2.1. Đa dạng di truyền.
Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các cá thể thực
vật, động vật, nấm, vi sinh vật. Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các
loài khác nhau.
Đa dạng di truyền còn là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng
một loài và giữa các loài khác nhau, là sự đa dạng về gen có thể di truyền được
trong cùng một quần thể hoặc giữa các quần thể. Đa dạng di truyền biểu hiện sự đa
dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài,
các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình
tự của bốn cặp base cơ bản, thành phần của acid nucleic, tạo thành mã di truyền.
Tập hợp các biến dị gen trong cùng một quần thể giao phối cùng loài có được nhờ
chọn lọc. Mức độ sống sót của các biến dị khác nhau dẫ đến tần suất khác nhau của
các gen trong tập hợp gen. Điều này cũng tuong tự như trong tiến hóa của quần thể.
Như vậy tầm quan trọng của biến dị gen là rất rõ ràng, nó tạo sự thay đổi tiến hóa tự
nhiên cũng như chọn lọc nhân tạo.

16
Di truyền quần thể là một lĩnh vực sinh học mà những nghiên cứu của nó tập trung
vào thành phần di truyền của quần thể sinh học (tần suất phân bố của allen) và sự
thay đổi của thành phần di truyền được bắt nguồn từ áp lực của sự tiến hóa, chọn
lọc tự nhiên, xu hướng chuyển đổi kết cấu di truyền, đột biến và phân bố gen được
quan tâm như những ảnh hưởng chủ đạo trong tần xuất phân bố allen trong cả quần
thể nuôi gia hóa và quần thể tự nhiên. Những ứng dụng chủ yếu của di truyền quần
thể trong nghề nuôi tôm và nghề nuôi trồng thủy sản gồm sự mô hình hoá cấu trúc
quần thể trong tự nhiên, xác định cá thể có đóng góp vào quá trình sinh sản, ước
tính giả định khả năng sinh sản của kích thước quần thể hiệu quả, đánh giá tỷ lệ cận
huyết và hệ thống hóa dữ liệu yếu tố biến dị di truyền trong quần thể khảo sát.
1.2.2. Quần thể
Trong tiến hóa, cá thể không được xem là đơn vị thích hợp bởi vì kiểu gen của một
cá thể được giữ nguyên trong quãng đời của nó hơn nữa cá thể có tính tạm bợ (dù
có thể sống tới cả nghìn năm như cây tùng). Ngược lại, một quần thể thì có tính liên
tục qua thời gian và mặt khác thành phần di truyền của nó có thể thay đổi tiến hóa
qua các thế hệ. Sự hình thành các quần thể địa phương tại những vùng lãnh thổ khác
nhau chính là phương thức thích ứng của loài trước tự nhiên. Quần thể được xem là
đơn vị tiến hóa cơ sở.
Đối với các loài sinh sản hữu tính, quần thể là tập hợp các cá thể cùng loài, trải qua
nhiều thế hệ, cùng chung sống trong một khoảng không giai xác định, trong đó các
cá thể có thể giao phối tự do với nhau và được cách ly ở mức độ nhất định với các
nhóm cá thể lân cận thuộc loài đó.
Theo A.V.Yablokov (1986), quần thể là nhóm các cá thể cùng loài và có khả năng
giao phối tự do với nhau, chiếm cứ một khu phân bố xác định và trải qua một thời
gian tiến hóa lâu dài để hình thành nên hệ thống di truyền độc lập và một ổ sinh thái
riêng.

17
Nói cách khác, quần thể là một nhóm sinh vật có khả năng giao phối qua lại và cùng
chia sẻ một vốn gen chung (Ridley 1993). Nó còn được gọi là quần thể Mendel mà
tập hợp lớn nhất là loài (species).
Năm 1908, nhà toán học người Anh Godfrey H.Hardy và bác sĩ người Đức Wilhelm
Weinberg đã độc lập chứng minh rằng có tồn tại một mối quan hệ đơn giản giữa các
tần số allen và các tần số kiểu gen. Nội dung của của nguyên lý: Trong một quẩn thể
ngẫu phối kích thước lớn, nếu như không có áp lực của các quá trình đột biến, di
nhập cư, biến động di truyền và chọn lọc, thì tần số các allen được duy trì ổn định từ
thế hệ này sang thế hệ khác.
1.2.3 Nguyên nhân xuất hiện đa dạng di truyền trong quần thể.
Trong quần thể ngẫu phối, bằng cách chọn lọc và lai các dạng được chọn với nhau
có thể tạo ra các dòng có mức độ biểu hiện tính trạng khác hẳn ở quần thể ban đầu.
Điều đó chứng tỏ tính bất đồng nhất về mặt di truyền trong quần thể. Trong quần
thể tự nhiên, các cá thể có cùng kiểu hình giống nhau nhưng kiểu gen thì rất đa
dạng. Sự đa dạng gen chủ yếu do đột biến tạo gen dị hợp tử và quá trình giao phối
tái tổ hợp. Trong đó biến dị tổ hợp và đột biến gen có ý nghĩa quan trọng nhất.
Biến dị tổ hợp là những tổ hợp sắp xếp gen mới mà đời con thu được khác với bố
mẹ do sự phân ly độc lập và sự trao đổi chéo của các gen khi chúng nằm trên các
cặp nhiễm sắc thể khác nhau. Các cá thể mang biến dị tổ hợp chỉ thừa hưởng
nguyên gốc vật chất di truyền của thế hệ trước mà vật chất di truyền không hề bị
biến đổi về mặt chất lượng.
Đột biến là những biến đổi về cấu trúc, số lượng của DNA và NST. Có ý nghĩa
quan trọng trong sự hình thành loài, là nguyên liệu cho quá trình tiến hóa và chọn
giống.
Ngoài ra, đa dạng di truyền còn do hiện tượng di nhập gen, sự phiêu bạt gen, chọn
lọc tự nhiên, chọn lọc nhân tạo….

18
1.2.4 Ý nghĩa của đa dạng di truyền trong nuôi trồng thủy sản.
Trong nuôi trồng thủy sản các quần thể bố mẹ tương đối nhỏ thường được lưu giữ
riêng biệt, đây là nguyên nhân làm cấu trúc di truyền của nguồn giống thủy sản nuôi
có thể thay đổi nhanh chóng theo thời gian chỉ qua vài thế hệ. Vì khi quần thể quá
nhỏ sẽ xảy ra hiện tượng phiêu bạt gen làm thay đổi cấu trúc di truyền của quần thể
do kích thước quần thể quá nhỏ, xu hướng bắt cặp lẫn nhau giữa các cá thể có quan
hệ huyết thống với nhau là không tránh khỏi. Do đó nguy cơ mất dần những biến dị
di truyền sẽ xảy ra nhanh chóng vì không tích lũy đủ các biến dị di truyền để đáp
ứng mọi thay đổi của điều kiện sống. Hiện tượng sinh sản cùng dòng hay giao phối
giữa các cá thể có quan hệ gần gũi là những tác nhân góp phần gia tăng cấp độ cần
huyết dẫn tới suy thoái cận huyết. Vì vậy, trong thực tiễn chiến lược phát triển nhằm
duy trì nguồn vật liệu di truyền cơ bản và bền vững cho nuôi trồng rất được đưa vào
quy chế và áp dụng rộng rãi.
Đây là vấn đề then chốt trong nuôi trồng thủy sản, vì thành quả di truyền đạt được
từ một chương trình chọn giống sẽ phụ thuộc chủ yếu vào sự tích lũy đầy đủ đa
dạng di truyền có mặt trong nguồn bố mẹ. Mức độ biến dị di truyền hiện diện trong
quần thể khảo sát sẽ được chi phối chủ yếu bởi cấp độ đa dạng của bố mẹ và hệ
thống giao phối. Biến dị di truyền là điều kiện tối cần thiết cho sự tồn tại của quần
thể vì một quần thể có yếu tố đa dạng di truyền càng cao càng có tiềm năng thích
nghi và cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho chương trình chọn giống.
Nghiên cứu đa dạng di truyền giúp nhà khoa học và người nuôi có được những giải
pháp tốt hơn trong việc xử lý vấn đề hiện tại. Do đó cách tiếp cận của cải tiến con
giống truyền thống và di truyền hiện đại trong nuôi trồng thủy sản có thể được tận
dụng từ giả thuyết và phương pháp luận trong di truyền quần thể nhằm định dạng,
kiểm soát và bảo tồn đa dạng di truyền các dòng vật nuôi.

19
1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE
1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật Microsatellite
Microsatellite (SSR marker) là một dạng của VNTR (variable number of tandem
repeats), chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên trên hầu
hết genom thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang. 2005). Các đoạn lặp lại
ngắn từ 2-6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20 -100 bp, chúng được tìm thấy trong
tất cả các cơ thể sống, đặc biệt là những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều
trên genom. Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng
100.000 vị trí khác nhau trong bộ genom động vật điển hình. Ở bất kì một locus
nào, thường xuyên có khoảng 5 – 7 allen khác nhau mà mỗi allen có thể nhận biết
tùy thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những allen này co thể được phát hiện bởi kỹ thuật
PCR, sử dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của
microsatellite. Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, allen được ghi nhận
khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại.
Microsatellite là một DNA marker chuẩn, dễ dàng phát hiện bằng kỹ thuật PCR và
chúng có khuynh hướng xác định vị tri bằng nhau từ đầu đến cuối của genom. Hàng
ngàn SSR đã được lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau. Ngày nay,thuật ngữ
microsatellite được sử dụng phổ biến để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu
nhiên thay vì sử dụng thuật ngữ STR (short tadem repeats) hay VNTR (variable
number of tandem repeats).
Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-al hay al đồng trội (bao
gồm 2 loại: allen đồng hợp và allen dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một
marker. Tần số đột biến từ 104- 5.106, tuân theo định luật Mendel. Vị trí của
microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng
DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng
trên những loài khác có quan hệ họ hàng.

20
1.3.2 Tính chất
Những markers này thường hiện diện với mức độ cao của hiện tượng đa hình, đặc
biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự lặp lại thường đơn giản, bao
gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tương ứng với việc lặp lại di-, tri, -tetranucleotide) và
có thể được lặp lại từ 10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide CA xảy ra rất thường
xuyên trong bộ gen người và các loài khác, và được hiện diện trong khoảng vài
ngàn bases pair. Nhờ vậy có sự xuất hiện thường xuyên của nhiều allen tại vị trí
microsatellite, kiểu gen trong phả hệ thường cung cấp đầy đủ thông tin về di truyền,
trong đó allen đặc thù của tổ tiên có thể được nhận biết dễ dàng. Bằng cách này,
microsatellite là marker lý tưởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần
thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó còn là marker phân tử dùng để cung cấp đầu mối về
những allen có mối quan hệ gần nhau hơn.
Microsatellite thường thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính
khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này có thể được giải thích bởi sự bắt cặp sai trong
bộ phận trượt (slipped strand mispairing - sự giữ không đúng mục tiêu) trong suốt
quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra suốt
quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu được sửa bởi
cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể không được sửa
chữa. Kích thước của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác
nhau là tất cả các yếu tố, cũng như là tính thường xuyên của sự dịch mã trong khu
vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến, có thể là
nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tương tự này thỉnh
thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu sự sai
mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác của
microsatellites có thể được khuếch đại.
1.3.3. Ưu - nhược điểm của microsatellite
Ưu điểm:

21
Cặp mồi microsatellite được ứng dụng nhiều hơn cả vì nó đơn giản hơn, phân bố
đều trên bộ gen, đặc hiệu, có độ chính xác cao, có khả năng nhân bản ổn định ứng
dụng rộng rãi trong việc lập bản đồ bộ gen của các loài. Giúp phân tích đặc điểm di
truyền của các loài, dưới loài và các cá thể trong một loài phục vụ có hiệu quả cho
công tác chọn giống trong chăn nuôi và trồng trọt, tìm hiểu về cấu trúc quần thể,
phả hệ, khoa học hình sự, các gen liên quan đến năng suất và chất lượng, ngoài ra
còn giúp tìm hiểu về nguồn gốc và phân lập các gen gây bệnh, từ đó nghiên cứu ra
phương pháp điều trị phù hợp. Chúng là chỉ thị di truyền hoàn hảo, chuyên biệt
locus và đồng trội (co - dominant), cho phép xác định thể đồng và dị hợp tử và có
khả năng lặp lại.
Nhược điểm:
Tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền được khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự
gia tăng khoảng cách di truyền. Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong
một loài nào đó có thể dẫn đến sự cố allen không giá trị (null alleles), nơi mà primer
microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Nếu có một
sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa allen của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không
bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. Trong tế bào khối u, nơi mà sự
kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi
thường xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế
bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó.
1.3.4 Các loại Microsatellite
Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần), phân loại microsatellite gồm:
• Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA
• Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT
• Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG
• Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC

22
Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và
tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa .
1.3.5. Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite
1.3.5.1. Cơ chế hình thành Microsatellite
Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ.
Di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành
microsatellite là do hai quá trình: quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân
(unequal crossing- over during meiosis) hoặc quá trình trượt lỗi trong sao mã
(replication slippage). Và quá trình trượt lỗi trong sao mã được coi là nguyên nhân
chủ yếu trong việc hình thành các microsatellite, nó xảy ra trên mạch chậm (lagging
strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên
phân tử DNA mới tổng hợp từ đó tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ
trong quá trình sửa lỗi hoặc có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn
lặp lại dài hơn.
1.3.5.2 Vai trò của Microsatellite
Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu
sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa
rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan
tới các bệnh di truyền. Microsatellite được dùng như một marker di truyền để
nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên có rất
nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã
hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng
khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với
vùng mã hoá. Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã
hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gen và chức năng của gen. Ở một số trường
hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay
đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa
promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa

23
microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột
biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng
liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các
trình tự khởi động của gen, khi trình tự này được giải phóng thì gen được khởi động
và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa
trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hưởng đến
protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hưởng thúc đẩy của
microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại
trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Như một trình tự mang mã,
microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số
lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức
năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh
lý cũng như sự phát triển của cơ thể. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có
sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát
triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gen.
Những tính chất đặc biệt của microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả
thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di
truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi . Nó cho phép một quần thể có thể
khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt
động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh
nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa.
Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di
truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa.
1.3.6. Các phương pháp phát hiện Microsatellite
Có 3 phương pháp để phát hiện microsatellite: phương pháp lai, phương pháp PCR
và phương pháp dùng mồi microssatellite

24
1.3.6.1. Phương pháp lai
Phương pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách
chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng
các mẫu dò khác nhau. Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế.
Trong phương pháp lai có hai cách: phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ
và phương pháp nhuộm bạc.
Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ
Phương pháp hiệu quả và được dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ. Người ta có thể
đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một
trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling). Nhưng ngày
nay phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít được sử dụng vì nguy hiểm đến sức
khỏe con người và đòi hỏi việc xử lí chất thải tốn kém.
Phương pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ)
Phương pháp này rẻ, không hại, nhưng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối
khi nhuộm.
1.3.6.2. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử
dụng máy giải trình tự tự động. Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát
triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu
bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation). Khi
kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy
tính có thể phát hiện được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với
DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thước chính xác của đoạn DNA quan tâm. Chất
huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40ng mồi loại này đủ dùng
cho 10.000 phản ứng PCR. Phương pháp này có hiệu quả rất cao và đang được sử
dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới. Người ta có thể đánh dấu
bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và

25
chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thước các đoạn bằng nhau nhưng chúng ta
vẫn có thể xác định được nhờ màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả được thể hiện
trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của allen,
loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide
1.3.6.3. Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite
Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế mồi microsatellite đặc
trưng cho một locus trong bộ gen. Vì vậy một cặp mồi microsatellite có thể áp dụng
cho mọi cá thể trong loài và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước khác
nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite.
Ở hình 1.5, hai mồi của PCR (2 mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo
toàn nằm 2 bên trình tự microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm
PCR sẽ có chiều dài là 100 bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR
chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự
microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm
PCR là 116 bp).
Mồi microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị
trí tương đồng (cùng locus trên mỗi allen) đối với từng cá thể trong loài. Điều này
có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking
(vùng sườn - vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế mồi) được bảo tồn
trong quá trình di truyền của loài. Vùng sườn rất quan trọng vì nó giúp phát hiện
trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể.
Hình 1.5. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số.

26
Đề tài sử dụng 15 cặp mồi microsatellite (W2, W3, W4, W9, W10, L1, L3, L4, P1,
P2, P4, P5, P7, N1, N2) của các tác giả đã công bố trong bài báo khoa học. Cụ thể,
nhóm thực hiện đề tài đã sử dụng các cặp mồi mang kí hiệu W2, W3, W4, W9, W10
trong nghiên cứu “Development of microsatellite markers in black tiger shrimp”
(Wuthisuthimethavee và ctv, 2003), được đăng trong tạp chí khoa học ngành thủy
sản số 224 vào tháng 5/2003. Trong nghiên cứu của mình, các tác giả đã tổng hợp
được 30 cặp mồi microsatellite đặc hiệu cho loài tôm sú Penaeus monodon dựa trên
9 trình tự lặp lại (AG)10, (TG)10, (GAA)10, (GAC)10, (CAT)10, (TAC)10, (GACA)8,
(GATA)8, và (TCAG)8 bằng các kĩ thuật sinh học phân tử (sử dụng 4 enzyme cắt
giới hạn: EcoRV, DraI, HaeIII, SmaI để cắt DNA, plasmid pBLUESCRIPT SK làm
vectơ chuyển gen...). Sau đó các tác giả tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của
quần đàn tôm sú hoang dã tại Thái Lan và cho kết quả chỉ số thông tin đa hình (PIC)
dao động từ 0,4275 – 0,9264. Nhóm thực hiện đề tài nhận thấy sự ổn định và chất
lượng cao của các cặp mồi nên đã chọn và sử dụng 5 cặp mồi microsatellite có chỉ
số PIC cao nhất cho đề tài này.
Các cặp mồi có kí hiệu P1, P2, P4, P5, P7, nhóm thực hiện đồ án tham khảo từ báo
cáo khoa học “Isolation and characterization of 23 polymorphic microsatellite
markers for diversity and stock analysis in tiger shrimp (Penaeus monodon)” của
Pan và ctv (2004). Trong nghiên cứu này, các tác giả đã phân lập và định danh được
Hình 1.6. Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite.

27
23 cặp mồi microsatellite dùng để đánh giá đa dạng di truyền của loài tôm sú
(penaeus monodon). Với việc sử dụng các công cụ gần giống như
Wuthisuthimethavee và ctv (2003), (dùng enzyme cắt giới hạn Sau3AI, plasmid
pUC18...), các tác giả đã phân lập được 23 cặp mồi microsatellite đặc hiệu để phân
tích đa dạng di truyền trên 30 mẫu tôm sú (penaeus monodon). Kết quả cho thấy, số
allen dao động cao từ 15 – 31, số dị hợp tử mong đợi trung bình Ho= 0,936 và kết
qua này được bảo vệ trước Hội đồng Học viện động vật học và phát triển khoa học
Đài Loan, đã đăng lên tạp chí Molecular Ecology Notes vào tháng 7/2004. Đồng
thời, đề tài ”Microsatellite diversity and population genetic differentiation of the
tiger shrimp (penaeus monodon) in Indo-Pacific region” (En-Min You và ctv,
2005). Trong bài báo này, các tác giả đã sử dụng 10 cặp mồi microsatellite có số dị
hợp tử mong đợi >0,92 của Pan và ctv (2004) để phân tích khác biệt di truyền của
330 cá thể tôm sú thuộc 2 vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Kết quả phân
tích thông tin đa dạng di truyền cho thấy: số dị hợp tử quan sát được dao động từ
0,638 – 0,743. Vì thế, nhóm thực hiện đồ án đã chọn ra 5 cặp mồi có kết quả thông
tin đa hình tốt nhất của Pan và ctv (2004) làm vật liệu cho đề tài này.
Để có thêm nhiều vật liệu phục vụ cho đề tài và tăng độ tin cậy, nhóm đã tham khảo
và sử dụng thêm 3 cặp mồi mang kí hiệu L1, L3, L4 trong nghiên cứu“Development
of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon
and its application in genetic diversity study for two populations” ( Li và ctv, 2007)
và 2 cặp mồi kí hiệu N1, N2 trong “Genetic diversity of intensive cultured and wild
tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius) in Malaysia using microsatellite
markers” của Nahavandi và ctv (2011). Trong nghiên cứu của mình, Li và ctv
(2007) đã sử dụng 90 trình tự gen của tôm sú có kích thước 100-350 bp từ ngân
hàng gen và thiết kế 13 cặp mồi microsatellite đa thành phần bao gồm 3 và 4 đơn vị
lặp lại bằng cách sử dụng PRIMER v.3 tham khảo từ Rozen và Skatetsky (2000) để
đánh giá đa dạng di truyền của 2 quần đàn tôm sú ở Australia và Thái Lan. Kết quả
cho thấy, số allen của quần đàn tôm sú ở Australia khá cao dao động từ 7- 27, số dị
hợp tử quan sát dao động lớn được từ 0,16- 0,91. Đối với quần đàn tôm sú ở Thái

28
Lan số allen từ 6- 15, số dị hợp tử quan sát dao động lớn từ 0,09- 0,90. Báo cáo này
được đăng lên tạp chí Aquaculture vào 1/2007.
Nahanvandi và ctv (2011) sử dụng 6 cặp mồi tham khảo trong báo cáo của
Pongsomboom và ctv (2000) cũng cho kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần đàn
tôm sú hoang dã và nuôi tự nhiên ở Malaysia khả quan. Tuy nhiên trong số 6 cặp
mồi đó, nhóm thực hiện đồ án đã chọn 2 cặp mồi N1, N2 có chỉ số thông tin đa hình
(PIC) tốt nhất là 0,7600 và 0,7511.
Như vậy từ 4 bài báo khoa học tin cậy, nhóm thực hiện đồ án đã chọn ra 15 cặp mồi
microsatellite tốt nhất nhằm đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú
(penaesus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống.
1.4. ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ
Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tại nơi đó chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất)
ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ
của các phân tử acid nucleotide là 260nm. Sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa
các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này
người ta có thể định lượng được hàm lượng DNA có trong mẫu ly trích.
Sự hấp thụ ánh sáng ở đây được tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với
DNA tinh khiết một đơn vị OD260nm tương ứng với: 50 g/ml DNA sợi đôi, 40 g/ml
DNA sợi đơn. Nồng độ DNA có thể xác định được nhờ sự đo OD (mật độ quang) ở
độ dài sóng 260nm. Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức :
OD260nm = 50 ng/l (đối với DNA sợi kép).
OD260nm = 40 ng/l (đối với DNA sợi đơn).
Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác. Do
ngoài đỉnh hấp thụ là 280nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như
các acid nucleotide và vì thế sẽ làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleotide
trong dịch ly trích. Để ước lượng độ tinh sạch của mẫu ly trích người ta tính tỷ lệ
OD260nm/OD280nm. Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 -2 thì mẫu ly trích được xem
là sạch.Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều. Tuy nhiên, việc
định lượng bằng phương pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lượng

29
của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lượng DNA ly trích, người ta sử dụng
phương pháp định tính DNA bằng cách điện di trên gel.
1.5 KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh, công bố tháng 10 năm
1985 tạo bước nhảy vọt trong sinh học phân tử và kỹ thuật gen. Phương pháp PCR
cho phép khuếch đại, tạo một số lượng rất lớn bản sao của gen (hay một đoạn
DNA). Nguyên tắc của PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và
nguyên lý tổng hợp DNA. Trên cơ sở trình tự của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi
(primer), các nucleotide tự do (dNTP) và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp
được các đoạn DNA, trong một thời gian ngắn số lượng bản sao DNA tạo thành
tăng theo cấp số nhân.
- Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA là có thể thực
hiện được.
- Nhược điểm: Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dương tính giả.
Trong một số trường hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng gây bệnh
thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính.
1.5.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kì (cycle) kế tiếp nhau, mỗi chu
kì gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính (denaturation): ở nhiệt độ 94- 950C (cao hơn Tm của
DNA khuôn), làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch DNA
tách rời nhau. Giai đoạn này kéo dài từ 1- 2 phút.
- Giai đoạn gắn mồi (annealing): ở nhiệt độ khoảng 55- 650C để các mồi bắt
cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff.
Giai đoạn này khoảng 30- 60 giây.

30
- Giai đoạn tổng hợp (Elongation): ở nhiệt độ 70- 720C thích hợp với điều kiện
hoạt động của enzyme DNA polymerase. Enzyme DNA polymerase xúc tác
hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các mồi
được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lý Chargaff, tạo
nên các mạch đơn DNA mới. Thời gian ở giai đoạn này là từ 30 giây đến vài
chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA.
Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kì liên tục, sản phẩm tạo ra từ chu kì trước
làm khuôn tổng hợp ở chu kì tiếp theo, nên số lượng bản sao tăng theo cấp số
nhân. Một phản ứng PCR bao gồm 20- 40 chu kì. Cần lưu ý ở những chu kì sau,
lượng DNA khuôn tăng, lượng mồi và dNTP giảm, enzyme DNA polymerase
hoạt động yếu dần... do đó cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP, enzyme để đảm
bảo phản ứng PCR đạt kết quả tốt nhất.
1.5.2 Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR
DNA khuôn: đoạn khuôn DNA khuôn tinh sạch là một trong những yếu tố quan
trọng, đảm bảo kết quả phản ứng PCR tạo được các sản phẩm PCR chính xác. Kích
thước đoạn DNA khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất.
Nucleotide tự do (dNTP): nucleotide tự do cần thiết cho phản ứng PCR gồm
dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Trong mỗi phản ứng PCR cần chú ý đến tỷ lệ G- C
trong đoạn khuôn để xác định hàm lượng mỗi loại dNTP phù hợp. Nồng độ dNTP
mỗi loại thường sử dụng trong các phản ứng PCR khoảng 50- 200µM.
Mồi (primer): mồi là các đoạn oligonucleotide ngắn khoảng 14- 35 nucleotide, có
vai trò quan trọng quyết định thành công của phản ứng PCR. Để thực hiện nhân một
đoạn DNA bằng phản ứng PCR cần có một cặp mồi thích hợp. Một cặp mồi trong
phản ứng PCR bao gồm mồi xuôi F (Foward) và mồi ngược (Revert). Mồi có vai trò
tạo các nhóm 3’OH tự do cần thiết cho phản ứng polyme hóa.
Enzyme DNA polymerase: là enzyme có yếu tố rất quan trọng, có vai trò quyết
định đến hiệu quả của phản ứng PCR. Enzyme Tag DNA polymerase có hoạt tính

31
cao ở nhiệt độ cao 75- 800C, xúc tác tổng hợp DNA với tốc độ 130- 300
nucleotide/giây. Hoạt tính của enzyme Tag DNA polymerase chịu ảnh hưởng rất
mạnh bởi ion Mg2+ . Ở điều kiện thích hợp với nồng độ MgCl2 bằng 2mM, enzyme
Tag DNA polymerase đạt hoạt tính cao nhất.
Dung dịch đệm (buffer): dung dịch đệm (buffer) là một trong những thành phần
quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của phản ứng PCR. Dung dịch
đệm trong phản ứng PCR đảm bảo các điều kiện cần thiết cho hoạt động của
enzyme Tag DNA polymerase như MgCl2, KCl, Tris.. Trong dung dịch đệm, ion
Mg2+ là thành phần có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng PCR do ion
Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn mồi với các mạch khuôn.
2.6 KỸ THUẬT ĐIỆN DI
Phương pháp điện di là kỹ thuật thí nghiệm được sử dụng phổ biến trong nghiên
cứu cấu trúc và đặc điểm sinh học của các phân tử mang điện tích (DNA, protein và
enzyme..). DNA là đại phân tử sinh học mang điện tích âm, do đó trong môi trường
có điện trường, các phân tử DNA có kích thước khác nhau di chuyển từ cực âm
sang cực dương với tốc độ khác nhau.
Tùy theo mục đích nghiên cứu và loại bản gel sử dụng, người ta chia thành các
phương pháp điện di khác nhau, thường được gọi theo tên bản gel sử dụng. Các kỹ
thuật điện di chủ yếu gồm: điện di gel agarose, điện di gel polyarcylamide, điện di
trên giấy và điện di trên gel tinh bột.
Đề tài sử dụng kĩ thuật điện di trên gel agarose vì bộ gen của Tôm sú có kích thuớc
lớn, kết quả phân tách khi điện di sẽ tốt hơn.
2.6.1 Điện di trên gel agarose.
2.6.1.1 Khái niệm
Gel là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua.
Kích thước phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Gel agrose: Lỗ

32
có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước
300-10.000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách
các nhóm phân tử có kích thước khác nhau.
2.6.1.2 Các bước thực hiện
Bước 1: chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm sử dụng trong điện di agarose là TBE (Tris- Boric acid- EDTA).
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm 0,5X TBE hòa tan với hàm lượng
agarose thích hợp, đặt trong lò vi sóng đun đến khi agarose tan hoàn toàn, bổ sung
vào một lượng nhất định chất nhuộm ethidium bromide. Đổ vào khuôn có các lược
đã cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết. Lưu ý tránh bọt khí khi đổ
gel. Khi bản gel đã đông cứng hoàn toàn, cẩn thận rút lược ra khỏi bản gel để tránh
làm bể giếng. Đặt bản gel vào bồn điện di và đổ dung dịch đệm ngập bản gel từ 1-
2mm.
Bước 2: nạp mẫu
Mẫu DNA đã được tách chiết hoặc sản phẩm của phản ứng PCR được trộn đều với
chất màu loading buffer tạo thành hỗn hợp có màu xanh giúp dễ quan sát các vạch
mẫu di chuyển trong quá trình điện di và giữ DNA không bị trôi ra khỏi giếng. Để
kiểm tra kích thước các đoạn DNA, thường chạy đồng thời cùng với thang DNA.
Bước 3: chạy điện di
Nguồn điện được sử dụng có điện thế 100V, cường độ 100mA. Thời gian chạy điện
di khoảng 20- 30 phút đối với mẫu DNA tổng số và khoảng 40 phút đối với sản
phẩm PCR.
Bước 4: chụp hình bản gel
Chụp hình kết quả điện di bằng máy chụp hình ảnh GelDocX. Sau khi phân tách
bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel agarose: đã được nhuộm bằng
ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát

33
huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA
trên gel.
2.6.2 Điện di mao quản Capillary Electrophoresis (CE)
Điện di mao quản CE là phương pháp phân tách các chất dựa vào sự khác nhau về
tốc độ chuyển động của chúng dưới tác dụng của lực điện trường trong một mao
quản hẹp.
2.6.2.1. Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất phân tích trong mao quản
(ɸ:25-100mm) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp,
dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế
cao một chiều (V: 10-30kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CE là kỹ thuật tách
được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các
chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác
phục vụ cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xảy ra nhanh và hiệu
quả cao.
2.6.2.2. Cơ chế điện di
Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF) và dòng điện di
thẩm thấu (EOF), các phân tử chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra
khỏi nhau vì điện tích, kích thước và độ linh động của chúng khác nhau.
Phương pháp CE sử dụng mạng lưới gel (gel Cartridge). Trong mao quản để tách
các chất phân tích. Mạng lưới gel có những lỗ xốp kích thước cỡ phân tử chứa đầy
dung dịch đệm, với mạng lưới lỗ xốp như vậy sẽ tạo cho mao quản như một cái
“rây” để phân loại các phân tử chất phân tích theo kích thước.
Ứng dụng: Phương pháp CE được áp dụng rất hiệu quả trong y học lâm sàng, trong
sinh học để tách các protein có khối lượng phân tử lớn, các phân đoạn DNA, các
nucleotid, các peptide, các polymer.

34
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

35
2.1 Vật liệu
2.1.1 Vật liệu sinh học
Bảng 2.1 Danh sách 137 mẫu tôm sú.
Ấn Độ Dương
(A)
Gia Hóa
(G)
Thái Bình Dương
(T)
Nội Địa
(N)
1 A09 35 G02 73 T00 100 N03
2 A13 36 G13 74 T04 101 N11
3 A16 37 G24 75 T06 102 N13
4 A22 38 G28 76 T30 103 N25
5 A23 39 G30 77 T32 104 N29
6 A26 40 G33 78 T33 105 N31
7 A27 41 G34 79 T34 106 N33
8 A30 42 G36 80 T36 107 N47
9 A33 43 G43 81 T37 108 N48
10 A34 44 G47 82 T40 109 N58
11 A36 45 G48 83 T41 110 N60
12 A37 46 G49 84 T43 111 N66
13 A38I 47 G54 85 T44 112 N106
14 A40 48 G55 86 T47 113 N108
15 A41 49 G56 87 T48 114 N110
16 A42 50 G57 88 T49 115 N112
17 A43 51 G60 89 T50 116 N114
18 A44 52 G61 90 T52 117 N118
19 A46 53 G62 91 T55 118 D11
20 A48 54 G64 92 T58 119 D16
21 A50 55 G65 93 T59 120 D19
22 A52 56 G66 94 T62 121 D37
23 A54 57 G67 95 T66 122 D38

36
24 A56 58 G68 96 T84 123 D48
25 A58 59 G69 97 T87 124 D49
26 A60 60 G78 98 T90 125 R00
27 A61 61 G81 99 T92 126 R71
28 A62 62 G83 127 R72
29 A65 63 G85 128 R79
30 A66 64 G87 129 R80
31 A68 65 G88 130 R82
32 A70 66 G93 131 R88
33 A74 67 G94 132 R90
34 A75 68 G95 133 R92
69 G97 134 R94
70 G99 135 R95
71 G102 136 R96
72 G108 137 R99
137 mẫu chân bơi tôm sú thu nhận từ 4 quần thể tương ứng với 4 nhóm: Ấn Độ
Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa. Mẫu được cung cấp từ Thái Lan và
vận chuyển đến Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II. Mẫu tôm sú được
chọn từ những cá thể trưởng thành, khỏe mạnh, đã tham gia sinh sản trong quần thể.
Quy trình thu nhận mẫu: từng cá thể tôm sú chọn lấy 1 chân bơi (có cả phần vây và
phần thịt), sau đó gắp vào từng eppendorf 1,5ml riêng biệt có chứa cồn 96o và được
kí hiệu cụ thể cho từng con, lưu trữ mẫu trong tủ lạnh -25oC.
2.1.2 Hóa chất
2.1.2.1Mồi (primer)
Mười cặp mồi microsatellite sử dụng cho nghiên cứu có chiều dài từ 18- 27bp được
sàng lọc từ 15 cặp microsatellite (hãng Sigma) phân tích đặc hiệu cho 137 mẫu tôm
sú có kí hiệu như sau: L1, L3, L4, P1, P2, P4, P5, P7, W2, W10. Trong đó:

37
- 3 cặp mồi được tham khảo từ (Li và ctv, 2007): L1, L3, L4
- 5 cặp mồi được tham khảo từ (Pan và ctv, 2004): P1, P2, P4, P5, P7
- 2 cặp mồi được tham khảo từ (Wuthisuthimethavee, 2003): W10, W2
Bảng 2.2 Thông tin các cặp mồi.
Tác giả Kí hiệu mồi Trình tự
Li và ctv (2007) L1 F 5’ TGCAGCTTCACACACCCATACACG 3’
R 5’ TATGACAGGCAGTTGCGCCAGGTA 3’
L3 F 5’GAAGGAGAAGGAGGAGGATTACAAGGA 3’
R 5’TCGGGCGGAGAATATGCAAATTAAA 3’
L4 F 5’GTCTGTCCATCCTTCCGTCTGACC 3’
R 5’TGGGAGTAAACAAAGCGTTTGAGATTG 3’
Pan và ctv (2004) P1 F 5’GTGTTATTTTCCACGGGTGC 3’
R 5’GCTGCAGGAAGTGTAGGGAG 3’
P2 F 5’GTTGCGACGGGTTGATTC 3’
R 5’TTTATGGCTATGGCTGACAC 3’
P4 F 5’ TAATGGGCGTAAGTCTTCGG 3’
R 5’TGAAAGGAGTCGGGATATGC 3’
P5 F 5’CTTTTTGAAATCGCCCTGTT 3’
R 5’CATTCATCCCGCTCTTCTGT 3’
P7 F 5’AAAAGCCAGAGGAAACGTG 3’
R 5’ACAGTGCACGTACCCACAAA 3’
Wuthisuthimethavee
và ctv (2003)
W10 F 5’TCTATTGTCTGCCAGTTTGTCC 3’
R 5’TAGCACGGGATTTATGAAGTGA 3’
W2 F 5’TTATCCGTATAGCCGCGTTATC 3’
R 5’ TTACAGGACCTGCATTTGTGTC 3’

38
2.1.2.2 Thang (ladder)
Sử dụng thang M (ladder) DNA để làm chỉ thị xác định kích thước phân tử DNA
của các mẫu khảo sát. Kích thước thang M được sử dụng cho thí nghiệm là 100bp
DNA ladder - Promega.
2.1.2.3.Hóa chất ly trích DNA.
-Dung dịch ly trích 1 (Solution 1): 50 mM Tris - HCl pH8; 20 mM EDTA pH8; 2 %
SDS.
- Dung dịch ly trích 2 (Solution 2): dung dịch NaCl bão hòa 6 M.
- Proteinase K (bảo quản -250C).
- Ethanol 700 lạnh (bảo quản ở -25oC).
- Ethanol tuyệt đối lạnh (bảo quản ở -25oC).
- Nước cất hấp khử trùng 2 lần.
2.1.2.4. Hóa chất chạy PCR
- 10X PCR buffer (Promega)
- 25 mM MgCl2 (Promega)
- 10 mM dNTP mix (Promega)
Hình 2.1. Thang chuẩn DNA 100bp

39
- Taq DNA polymerase 5 U/μl (Promega)
- Primer 100 μM (Sigma)
- DNA mẫu ( ly trích từ mẫu chân bơi Tôm sú )
2.1.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose
- Agarose (Bio basic)
- TBE 0,5 X
- 6X DNA Loading Dye (Promega)
- 100 bp DNA Ladder (Promega)
2.1.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản
- QIAxcel DNA Sreening Kit (Qiagen)
- QX DNA Size Marker 50 – 800bp ( 50 ul) (Qiagen)
- QX Aligment Marker 15bp/1 kb ( 1,5 ml) (Qiagen)
- QX DNA Dilution Buffer ( Quiagen)
- QX Separation Buffer (Qiagen)
- QX Wash Buffer ( Qiagen)
- QX Nitrogen Cylinder (Quigen)
2.1.2.7. Dụng cụ thí nghiệm
- Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml, 2ml.
- Tủ hút (Astec Microflow).
- Micropipet các loại :100 – 1000 μl , 10 – 100 μl , 0,5 – 10 μl … (Bio rad).
- Đầu tip các loại (Eppendorf)

40
- Plates 96 well PCR (Eppendorf).
- Máy luân nhiệt iCycle (Bio rad).
- Máy chụp ảnh điện di GeldocX (Bio rad).
- Máy đo OD SmartSpecTM Plus (Bio rad).
- Bồn ủ nhiệt ( block heater – Bio rad).
- Máy ly tâm (eppendorf).
- Bồn điện di agarose ( Bio rad).
- Lò viba (Electrolux - Thụy Điển).
- Máy điện di mao quản
- Tủ mát, tủ âm (Sanyo - Nhật).
- QX 0,2ml tube trip (Qiagen)
- QX 0,2ml tube trip caps (Qiagen)
- QX Color 0,2ml tube Strip (Quiagen)
- Các vật dụng trong tách chiết : chày , crack ….
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp trích ly DNA tổng số
Quy trình tách chiết DNA tổng số dựa trên quy trình tách chiết DNA Salt extraction
(Miller, 1988).

41
Cắt nhỏ mẫu vào
eppendoff 1,5ml
Ủ 55oC/2h hoặc qua
đêm ở 37oC
Bỏ trên đá 10 phút
Bỏ trên đá 5 phút
Ly tâm 8000v/p 15phút
Hút 500µl dịch nổi qua
eppendoff mới
Ủ 4oC/ 2h hoặc qua đêm
Mẫu chân bơi
Thêm 500µl solution 1
Thêm 5µl proteinase K
Vortex nhanh 15 giây
Thêm 250µl solution 2
Bỏ cặn
Thêm 1ml ethanol
100% lạnh

42
Mẫu chân bơi sau khi được thu về, bảo quản trong dung dịch cồn 96o, được gắp ra
và cắt nhỏ cho vào eppendoff 1,5ml. Thêm 500µl dung dịch solution 1 (50mM Tris
HCl pH8, 2% SDS) và 5µl dung dịch proteinase K nhằm phá vỡ màng tế bào và
màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, thủy phân các protein liên kết với
DNA. Sau đó đem ủ ở điều kiện thích hợp (55oC/2h).
Ly tâm 11000v/p trong
15 phút
Thu cặn
Ly tâm 11000v/p trong 5
phút
Thu tủa DNA
Làm khô ở 55oC
Bỏ dịch
Thêm 500µl ethanol
70% lạnh
Bỏ dịch
Dung dịch DNA
Thêm 100µl dd TE

đáNh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống

đáNh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to đáNh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống

Similar to đáNh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

đáNh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống