Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra (pangasianodon hypophthamus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TỐI ƯU HÓA CÁC CẶP MỒI MICROSATELLITE TRONG
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthamus)
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : BÙI THỊ LIÊN HÀ
Sinh viên thực hiện : TẠ THANH THẾ
MSSV: 1151110518 Lớp: 11DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp
iii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, hình
ảnh và kết quả trong luận văn là trung thực. Nếu có bất kỳ sự gian dối nào, tôi xin
chịu hoàn toàn trách nhiệm.
TP. HCM, ngày … tháng … năm 2015
Sinh viên,
Tạ Thanh Thế

iv
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô trong Khoa Công
Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tình giảng dạy và truyền đạt
kiến thức cho em trong những năm học qua. Những kiến thức mà em nhận được
trên giảng đường đại học không chỉ là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn tốt
nghiệp này mà còn là hành trang quý báu giúp em vững bước trong tương lai.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng
Thủy Sản II và Ths. Bùi Thị Liên Hà đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm
và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó,
em xin gửi lời cảm ơn đến chị Lê Ngọc Thùy Trang cùng các bạn sinh viên tại
phòng thí nghiệm Di Truyền Phân Tử đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ và động viên em
trong suốt thời gian qua.
Đồng thời, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến những người bạn đã là chỗ
dựa vững chắc và cùng sát cánh bên nhau trong suốt những năm học qua.
Cuối cùng, con gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến ba mẹ đã động viên và giúp đỡ
con vượt qua những khó khăn trong cuộc sống và trong quá trình học tập.
TP. HCM, ngày … tháng … năm 2015
Sinh viên,
Tạ Thanh Thế

v
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT........................................................................ ix
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... xi
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... xii
MỞ ĐẦU……… ........................................................................................................1
1. Đặt vấn đề.....................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu....................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu....................................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................3
1.1. Giới thiệu về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)..............................3
1.1.1. Hệ thống phân loại ..............................................................................3
1.1.2. Đặc điểm hình thái ..............................................................................4
1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái ............................................................6
1.1.3.1. Đặc điểm phân bố ............................................................................6
1.1.3.2. Đặc điểm sinh sản............................................................................7
1.2. Tình hình chọn giống cá tra tại đồng bằng sông Cửu Long....................8
1.2.1. Tình hình nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long.............................8
1.2.2. Tình hình chất lượng con giống cá Tra ở đồng bằng sông Cửu Long 8
1.2.3. Một số chương trình nghiên cứu liên quan đến cá tra.........................9
1.3. Ứng dụng di truyền phân tử vào trong chọn giống................................10
1.3.1. Phân loại............................................................................................10
1.3.2. RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP)........................11
1.3.3. Amplifíed Fragment Length Polymorphism (AFLP)........................12

vi
1.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplifíed Polymorphism DNA) ............13
1.3.5. Microsatellite (SSR)..........................................................................13
1.4. Chỉ thị Microsatellite trong nghiên cứu đa dạng di truyền...................14
1.4.1. Khái niệm về Microsatellite ..............................................................14
1.4.2. Tính chất............................................................................................15
1.4.3. Sự phát triển của primer Microsatellite.............................................16
1.4.4. Giới hạn của Microsatellite ...............................................................16
1.4.5. Các loại Microsatellite.......................................................................18
1.4.6. Cơ chế hình thành microsatellite.......................................................18
1.4.7. Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite ...........19
1.4.8. Ưu và nhược điểm cùa microsatellite................................................21
1.4.8.1. Ưu điểm .........................................................................................21
1.4.8.2. Nhược điểm ...................................................................................21
1.4.9. Vai trò của microsatellite ..................................................................22
1.4.10. Ứng dụng của microsatellite..............................................................23
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................24
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................24
2.2. Vật liệu nghiên cứu....................................................................................24
2.2.1. Nguồn mẫu ........................................................................................24
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.............................................................24
2.2.2.1. Mồi.................................................................................................24
2.2.2.2. Thang .............................................................................................25
2.2.2.3. Các hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA .................................26
2.2.2.4. Hóa chất sử dụng trong PCR .........................................................26

vii
2.2.2.5. Hóa chất sử dụng trong điện di agarose ........................................27
2.2.2.6. Dụng cụ và thiết bị.........................................................................27
2.3. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................27
2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu ...................................................27
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA............................................................28
2.3.2.1. Quy trình........................................................................................28
2.3.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết...................................28
2.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).............................29
2.3.3.1. Khái niệm.......................................................................................29
2.3.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR......................................................29
2.3.3.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR...................................31
2.3.3.4. Ưu nhược điểm của phản ứng PCR...............................................33
2.3.3.5. Ứng dụng .......................................................................................33
2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose ..............................................33
2.3.4.1. Nguyên tắc.....................................................................................34
2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng ....................................................................35
2.4. Bố trí thí nghiệm........................................................................................37
2.4.1. Thí nghiệm 1: tách chiết DNA ..........................................................38
2.4.1.1. Tách chiết DNA.............................................................................38
2.4.1.2. Kiểm tra DNA tách chiết...............................................................38
2.4.2. Thí nghiệm 2: tối ưu hóa phản ứng PCR...........................................39
2.4.2.1. Thí nghiệm 2.1: khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi
microsatellite.................................................................................................39
2.4.2.2. Thí nghiệm 2.2: khảo sát nồng độ MgCl2......................................42

viii
2.4.2.3. Thí nghiệm 2.3: khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase.............42
2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi
microsatellite.....................................................................................................43
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................45
3.1. Kết quả tách chiết DNA ............................................................................45
3.2. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR...........................................................46
3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite.................46
3.2.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 ...................................................................53
3.2.3. Khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase ..........................................57
3.3. Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite........................58
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..........................................................60
4.1. Kết luận........................................................................................................60
4.2. Đề nghị ........................................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................61

ix
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
µg : Microgram
µl : Microlite
µM : Micromol/lite
mM : Milimolar (milimol/lite)
AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism
ALP : Amplicon Length Polymorphism
AP-PCR : Arbitrary Primer-PCR
bp : Base pair
DAF : DNA Amplification Fingerprinting
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
EBV : Estimated Breeding Value
EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid
g : Gram
ha : Hecta
kb : kilobases
kg : Kilogram
M : Ladder DNA
mA : Miliampe
mM : Milimolar (milimol/lite)
nu : Nucleotide
PCR : Polymerase chain reaction
RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA
RE : Restriction enzyme
RFLP : RestrictionFragment Length Polymorphism
SDS : Sodium Dodecyl Sulphate
SNP : Single Nucleotide Polymorphism
SSCP : Single Strand Conformation Polymorphism

x
SSR : Simple Sequence Repeat (Microsatellite)
STR : short tandem repeats
STS : Sequence-Taqged Sites
Ta : Annealing temperature
Taq DNA polymerase: Thermos aquaticus DNA polymerase
TBE : Tris Borate EDTA
UV : Ultra Violet - tia cực tím
V : Vôn
VNTR : Variable Number Tamdem Repeat

xi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005). .........11
Bảng 2.1. Thông tin 16 cặp mồi microsatellite dùng trong nghiên cứu. ..................24
Bảng 2.2. Các thông số điện di DNA bằng gel agarose. ..........................................36
Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi microsatellite. ...............................40
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của các mồi CB12, CB13, CB14, CB15, CB18, CB19.
...................................................................................................................................40
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của mồi Pg –13, PSP – G565, PSP – G579, PSP – G593.
...................................................................................................................................41
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của mồi Ph–7, Ph–9, Ph–21, Ph–25. ............................41
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của mồi Phy01, Phy03. .................................................41
Bảng 2.8. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite. .....................42
Bảng 2.9. Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát. ................................................42
Bảng 2.10. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq
polymerase cho một phản ứng PCR..........................................................................43
Bảng 3.1. Nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu. .....................52
Bảng 3.2. Bảng kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 12 cặp mồi................................56

xii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1.Cấu tạo răng vòm miệng của cá Tra nuôi (Roberts và Vidthayanon, 1991).
.....................................................................................................................................5
Hình 1.2. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)...................................................5
Hình 1.3. 2 đôi râu ở cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus); 1 đôi râu mép dài; 1
đôi râu hàm dưới ngắn. ...............................................................................................5
Hình 1.4. Vị trí và hình dạng bong bóng khí của cá Tra............................................6
Hình 1.5. Cấu tạo bong bóng khí của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)........6
Hình 1.6. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân........................................................18
Hình 1.7. Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã....................................................19
Hình 1.8. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số..................................................20
Hình 1.9.Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite.......................20
Hình 2.1. Thang chuẩn 100 bp. ................................................................................26
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988)..............28
Hình 2.3. Các bước cơ bản của phàn ứng PCR........................................................30
Hình 2.4. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel. ................35
Hình 2.5. Kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại
mạch thẳng ở bên phải. .............................................................................................36
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.............................................................................37
Hình 2.7. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi
microsatellite.............................................................................................................44
Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA 15 mẫu vây đuôi cá tra ngẫu nhiên cho 4 quần
đàn G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001. ........................................................45
Hình 3.2. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB12.................................46
Hình 3.4. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB14................................47

xiii
Hình 3.8. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy01................................50
Hình 3.9. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy03................................50
Hình 3.10. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–7................................51
Hình 3.11. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–21..............................51
Hình 3.12. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi PSP–G579. .....................52
Hình 3.13. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Pg–13..............................52
Hình 3.14. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB14. ..........................54
Hình 3.15.Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB15. ...........................54
Hình 3.19. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB19 ...........................55
Hình 3.20. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy01...........................55
Hình 3.21. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy03...........................56
Hình 3.22. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Ph-7..............................56
Hình 3.23. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Ph-21............................56
Hình 3.24. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi PSP-G579. ...................56
Hình 3.25. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Pg–13...........................56
Hình 3.26. Kết quả điện di thay đổi nồng độ Taq DNA polymerase trên gel Agarose
2,5 %..........................................................................................................................57
Hình 3.27. Sản phẩm khuếch đại của mồi CB19 trên 12 mẫu cá tra........................59
Hình 3.28. Hình kiểm tra đa hình sản phẩm khuếch đại của các mồi CB13, CB14,
CB18, CB19, Pg-13, Ph-7 trên 4 mẫu cá tra............................................................59

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam đang là một trong năm nước đứng đầu thế giới về sản lượng nuôi
trồng thủy sản. Sau nghề nuôi tôm thì nghề nuôi cá tra là một trong những nghề
phát triển mạnh nhất trong thời gian qua ở vùng đồng bằng sông Cửu Long.
Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nước ngọt bản địa của Việt
Nam và được biết phổ biến như là một biểu tượng thương mại của ngành nuôi trồng
thủy sản nói riêng, đóng vai trò chủ chốt trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản của
Việt Nam.
Hiện nay, nghề nuôi cá Tra sản xuất ngày càng phát triển và mở rộng dẫn đến
nhu cầu con giống cá Tra càng tăng cao. Tuy nhiên, việc sản xuất và cung ứng
giống cá tra tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long chủ yếu do người dân tự phát, tự
cân đối nên chưa có sự phát triển đồng bộ giữa số lượng cũng như chất lượng con
giống. Chất lượng con giống có chiều hướng suy giảm trong những năm trở lại đây
với những biểu hiện như tỷ lệ dị hình cao, chậm lớn, dễ nhiễm bệnh và tỷ lệ sống
thấp. Giá cá bột không có sự khác biệt giữa cá có cải thiện di truyền và cá tại địa
phương. Từ đó ảnh hưởng tới vệc nuôi trồng và sản xuất của các hộ nuôi cá tra
thương phẩm cũng như ảnh hưởng tới việc xuất khầu cá tra ra thị trường nước
ngoài.
Trước tình hình như vậy bên cạnh việc ban hành các thông tư và nghị định về
nuôi chế biến và sản xuất cá tra thì hỗ trợ những trang thiết bị, máy móc cần thiết để
phục vụ cho công tác kiểm soát chất lượng con giống, kiểm soát môi trường nuôi,
đào tạo nghiệp vụ cho các cơ quan quản lý địa phương nhằm chủ động hơn trong
nhiệm vụ quản lý cá tra giống là việc rất cần thiết.
Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực
hiền đề tài “Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di
truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)”. Nghiên cứu này được hy vọng sẽ
tạo tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo trong việc phân tích đa dạng di truyền cá Tra

2
nhằm góp phần vực dậy chất lượng con giống tra, nâng cao năng suất, tạo ra những
sản phẩm có chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường trong và
ngoài nước. Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Ngiệm Di Truyền Phân Tử, Viện
Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tối ưu hóa và tuyển chọn các cặp mồi microsatellite có tính đa hình cao từ 16
cặp mồi microsatellite.
3. Nội dung nghiên cứu
 Tách chiết DNA mẫu cá Tra từ 4 quần đàn khác nhau.
 Tối ưu hóa phản ứng PCR.
 Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite.

3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)
Bộ Siluriformes gồm có 36 họ, 477 giống, 3088 loài cá phân bố rộng khắp trên
toàn thế giới. Trong 36 họ cá đã nêu có một số họ cá có giá trị kinh tế được nuôi và
khai thác phổ biến như các họ: Ariidae (cá Úc), Bagridae (cá Chốt), Clariidae (cá
Trê), Ictaluriidae (cá Nheo), Pangasiidae (cá Trơn), Plotosidae (cá Ngát),
Silurudae (cá Leo) và Sisoridae (cá Chiên)…(Carl và ctv, 2007).
Cá Tra là loài cá kinh tế phổ biến ở khu vực châu Á và là một trong 30 loài cá
thuộc họ Pangasiidae (http://www.fishbase.org). Pangasiidae được phát hiện đầu
tiên trong thủy vực nước ngọt ở các quốc gia phụ cận khu vực hạ lưu của Ấn Độ
Dương; sự đa dạng thành phần loài của họ cá này tập trung chủ yếu ở khu vực Đông
Nam châu Á (Roberts và Vithayanon, 1991). Cá Tra có nguồn gốc từ Cambodia,
Lào, Thái Lan và Việt Nam (www.fishbase.org). Ngoài ra, cá Tra còn được đưa vào
nuôi rộng rãi khắp các nước Đông Nam Á.
Kiến thức về sinh học và sinh thái học của loài này trong tự nhiên còn hạn chế
(Hung và ctv, 2003). Cá Tra có tính ăn tạp và thức ăn chủ yếu là thực vật và một số
loài động vật thân mềm (Vithayanon, 1993).
Cá Tra phân bố tự nhiên ở vùng hạ lưu sông Mekong bao gồm các nước:
Cambodia, Lào, Thái Lan, Việt Nam và chúng cũng được phát hiện ở sông Chao
Praya – Thái Lan.
1.1.1. Hệ thống phân loại
Theo hệ thống phân loại Roberts và Vidohayanon (1991) cá Tra thuộc :
Giới: Animalia Linnaeus
Ngành: Chordata Bateson
Ngành phụ: Vertebrata Cuvier
Tổng lớp: Osteichthyes Huxley
Lớp: Actinopterygii Huxley
Lớp phụ: Neopterygii Infraclass: Teleostei

4
Tổng bộ: Ostaryphysi
Bộ: Siluriformes
Họ: Pangasiidae Bleeker
Giống (chi): Pangasius
Loài: Pangasius hypophthalmus
Các đồng danh của loài cá Tra :
 Helicophagus hypophthalmus
 Pangasianodon hypophthalmus
 Pangasius hypophthalmus
 Pangasius pangasius
 Pangasius pleurotaenia
 Pangasius sutchi
Tên loài Pangasianodon hypophthalmus được Rainboth sử dụng lần đầu vào
năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được nhiều tác giả khác sử dụng
phổ biến đến nay. Tuy nhiên tên khoa học Pangasius sutchi thì không còn sử dụng
nữa. Tên đặt cho loài này khác nhau theo các nước trong vùng nó phân bố. Ở
Campuchia là Trey pra (tên Khmer), Lào là Pa souay kheo, Pa suay, Thái là Pla saa
wha, Pla suey và Việt Nam là Cá Tra (Nguyễn Văn Thường, 2008).
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993) cá Tra được mô tả
như sau:
 Đầu rộng, dẹp bằng. Mõm ngắn, nhìn từ trên xuống chót mõm tròn.
 Miệng trước, rộng ngang, không co duỗi được có dạng hình vòng cung và
nằm trên mặt phẳng ngang.
 Răng nhỏ mịn, răng vòm miệng chia thành 4 đám nhỏ, mỏng, nằm trên
đường vòng cung, đôi khi bị che lấp bởi nếp da vòm miệng (Hình 1.1).

5
Hình 1.1.Cấu tạo răng vòm miệng của cá Tra nuôi (Roberts và Vidthayanon, 1991).
 Lỗ mũi sau gần lỗ mũi trước hơn mắt và nằm trên đường thẳng kẻ từ lỗ mũi
trước đến cạnh trên của mắt.
 Có hai đôi râu, râu mép kéo dài chưa chạm đến gốc vi ngực, râu cằm ngắn
hơn.
 Thân thon dài, phần sau dẹp bên. Đường bên hoàn toàn và phân nhánh, bắt
đầu từ mép trên của lỗ mang đến điểm giữa gốc vi đuôi. Mặt sau của vi
lưng, vi ngực có răng cưa hướng xuống gốc vi. Vi bụng kéo dài chưa chạm
đến khởi điểm của gốc vi hậu môn.
Hình 1.2. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus).
Hình 1.3. 2 đôi râu ở cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus); 1 đôi râu mép dài; 1
đôi râu hàm dưới ngắn.

6
Hình 1.4. Vị trí và hình dạng bong bóng khí của cá Tra.
Hình 1.5. Cấu tạo bong bóng khí của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus).
1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái
1.1.3.1. Đặc điểm phân bố
Vùng phân bố tự nhiên của cá Tra giới hạn trong hạ lưu sông Mekong, bao
gồm Cambodia, Lào, Thái Lan và Việt Nam, kể cả sông Chao Praya ở Thái Lan
(Roberts và Vidthayanon, 1991; Poulsen và ctv, 2004).
Theo Nguyễn Thị Thu Thủy (2009) có ít nhất hai quần thể lớn khác nhau được
tìm thấy ở khu vực hạ lưu sông Mekong:
Một quần thể ở khu thượng nguồn sông Mekong (Thái Lan, Lào). Quần thể này có
thể mở rộng từ cửa sông Loei đi ngược lên biên giới Myanmar và Trung Quốc.

7
 Quần thể hạ nguồn là quần thể trội hơn, và chiếm ưu thế trong khắp khu
vực phân bố của chúng, kéo dài từ đồng bằng sông Mekong ở Việt Nam,
trong hệ thống hồ lớn Campuchia và ngược lên Khone Falls (Campuchia).
Cũng có thể có một quần thể nhỏ hơn ở khu vục sông Xe Bang Fai và sông
Songkhram. Quần thể này có thể trùng lặp một phần với quần thể nói trên
do sự di cư chậm về phương diện không gian lẫn di truyền.
1.1.3.2. Đặc điểm sinh sản
Cá Tra là loài cá di cư sinh sản, ngược dòng Mekong từ một vùng chưa rõ vào
tháng 5 – 7 và quay lại dòng chính khi nước sông đổ về dâng ngập vào tháng 9 – 12.
Ở phía Nam thác Khône, sự di cư ngược dòng của cá Tra xảy ra từ tháng 10 – 2
năm sau, cao điểm vào tháng 11 – 12. Sự di cư này xảy ra khi nước rút và xuất hiện
rải rác theo sau đó là các hoạt động di cư theo chiều ngang của cá từ các vùng ngập
nước trở về dòng Mekong vào cuối thới kỳ mùa lũ.
Hoạt động di cư xuôi dòng của cá xảy ra vào tháng 5 – 8 từ Stung Treng đến
Kandal ở Cambodia và sau đó đến hạ lưu sông Mekong ở Việt Nam. Trứng cá xuất
hiện vào tháng 3 – 8 từ Stung Treng đến Kandal, cho thấy rằng sự di cư xuôi dòng
của cá bao gồm cả hai hoạt động: di cư sinh sản và di cư dinh dưỡng và cuối cùng
cá di chuyển đến các cánh đồng ngập nước ở Cambodia và Việt Nam trong mùa lũ.
Ở Việt Nam, cá Tra thuộc đàn cá hạ lưu, phân bố rộng khắp trên sông Tiền và
sông Hậu. Vào mùa mưa (tháng 5 – 6) cá Tra bột trôi theo dòng nước từ bãi đẻ ở
đoạn giữa Kra – chê và thác Khône. Khi chúng đến biên giới giữa Cambodia và
Việt Nam, cá sẽ dạt vào các vùng ngập nước ở đây. Sông Tonle Sap chảy theo chiều
nguợc lại giúp cho cá bột có thể đi sâu vào vùng ngập thuộc hệ thống này.
Sức sinh sản của cá tra là 120.000 – 145.700 trứng/kg cá cái (Huỳnh Quốc
Khanh, 2009).

8
1.2. Tình hình chọn giống cá tra tại đồng bằng sông Cửu Long
1.2.1. Tình hình nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long
Việt Nam đang là một trong năm nước đứng đầu thế giới về sản lượng nuôi
trồng thủy sản. Sau nghề nuôi tôm thì nghề nuôi cá tra là một trong những nghề
phát triển mạnh nhất trong thời gian qua ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Đây là
loài cá nước ngọt bản địa của Việt Nam thường được nuôi trong ao hoặc trong lồng
bè và xu hướng hiện nay chủ yếu là nuôi trong ao.
Theo Tổng cục Thủy sản: ước tính tổng diện tích thả nuôi cá tra tháng 1/2015
là 1.701 ha, tăng nhẹ 3,5 % so với cùng kì năm 2014. Trong đó tỉnh Đồng Tháp có
diện tích nuôi cá tra đạt 1.072 ha chiếm 63% diện tích nuôi cá tra, tăng 10,7% so
với năm 2014. Sản lượng thu hoạch lũy kế tính ước tính đạt 73 nghìn tấn, năng suất
bình quân đạt 300 tấn/ha, tăng 1,6 lần so với năng suất bình quân năm 2014, trong
đó tỉnh Đồng Tháp có năng suất cao nhất đạt 410 tấn/ha và năng suất thấp nhất của
Bến Tre đạt 205,2 tấn/ha.
Đến đầu năm 2015, giá cá tra nguyên liệu tăng thêm 500 đồng/kg so với cuối
tháng 12 năm 2014, phổ biến ở mức 24.000 – 25.000 đồng/kg tùy theo địa phương,
doanh nghiệp và thời điểm. Sau khi trừ chi phí sản xuất, người nuôi có thể thu lãi từ
2.000 – 2.500 đồng/kg, tương đương lợi nhuận 600 – 900 triệu đồng/ha. Với mức
giá này, khả năng diện tích nuôi cá tra thâm canh sẽ gia tăng trong thời gian tới.
1.2.2. Tình hình chất lượng con giống cá Tra ở đồng bằng sông Cửu Long
Chất lượng cá tra giống là một trong những yếu tố quan trọng để nâng cao
hiệu quả nghề nuôi cá tra thâm canh, từ đó góp phần phát triển bền vững nghề nuôi
và chế biến cá tra xuất khẩu. Tuy nhiên, hiện nay cá tra giống vẫn chưa đạt yêu cầu
về chất lượng mặc dù ngành chức năng các cấp đã có nhiều nỗ lực.
Việc sản xuất và cung ứng giống cá tra tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long
phần lớn do người dân tự phát, tự cân đối nên phát triển chưa đồng bộ giữa số lượng
cũng như chất lượng. Chất lượng con giống có chiều hướng suy giảm trong những
năm gần đây với những biểu hiện như tỷ lệ dị hình cao, chậm lớn, dễ nhiễm bệnh và
tỷ lệ sống thấp.

9
Năm 2014, cả nước có 230 cơ sở sản xuất giống cá tra, trên 4.000 hộ ương
dưỡng cá giống trên diện tích 2.250 ha, sản xuất được hơn 2 tỷ con cá tra giống. Sản
lượng cá tra giống tập trung nhiều nhất ở Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Tiền
Giang. Tuy nhiên, tỷ lệ sống trong ương dưỡng khá thấp, tỷ lệ ương từ cá bột lên cá
hương chỉ đạt 20 – 24 % và từ cá hương lên cá giống trung bình chỉ 21 %
(http://www. http://thuysanvietnam.com.vn).
1.2.3. Một số chương trình nghiên cứu liên quan đến cá tra
Chương trình nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá tra được bắt đầu từ năm 1978
với sự tham gia của nhiều Viện và trường Đại học trong khu vực (Đại học Nông
Lâm, Viện NCNTTS II, Đại học Cần Thơ, tổ chức CIRAD (Pháp)).
Thông qua sự tài trợ của SUFA_Bộ Thuỷ sản trong 5 năm (2001 – 2005),
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã thực hiện chương trình chọn giống về
tính trạng tăng trưởng bằng phương pháp chọn lọc cá thể (2001 – 2004). Ba quần
đàn gốc cho chọn giống năm 2001, 2002 (chọn theo tăng trưởng) và 2003 (chọn
theo tỷ lệ philê) đã được hình thành. Hiệu quả của chọn lọc thực tế đã được tính
toán trong năm 2006 – 2008.
Các nghiên cứu thăm dò về sinh học phân tử nhằm đánh giá biến dị di truyền
của cá tra cũng đã được tiến hành. Kỹ thuật microsatellite với 10 primer đặc hiệu
cho cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long được phát triển bởi BIOTEC_Thái Lan để
đánh giá biến dị cá đã được thực hiện trong năm 2004. Các primer đều cho kết quả
đa hình, đặc biệt primer 10 cho kết quả đa hình rất cao. Kết quả này mở ra triển
vọng sử dụng những primer để đánh giá biến dị di truyền và tìm ra chỉ thị liên kết
với tính trạng có ý nghĩa về mặt kinh tế trên cá tra bằng kỹ thuật microsatellite.
Đề tài ‘‘Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cá tra thương phẩm đạt tiêu chuẩn thịt trắng
phục vụ xuất khẩu (2001 – 2003)”.
Dự án sản xuất thử “Nuôi cá tra thâm canh đạt tiêu chuẩn xuất khẩu và giảm ô
nhiễm môi trường” được thực hiện bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II
năm 2006 – 2007.

10
Dự án ‘‘Thử nghiệm mô hình nuôi cá tra thương phẩm phục vụ xuất khẩu và
hạn chế ô nhiễm môi trường, 2007 – 2008’’.
Dự án “Xây dựng qui phạm thực hành nuôi cá tra tốt hơn (BMP) ở đồng
bằng sông Cửu Long, Việt Nam” đã bắt đầu thực hiện từ năm 2007.
1.3. Ứng dụng di truyền phân tử vào trong chọn giống
Di truyền phân tử là một lĩnh vực được quan tâm và được ứng dụng rộng rãi
trong nghiên cứu.
Các kỹ thuật di truyền phân tử được sử dụng gồm các kỹ thuật về DNA, các
kỹ thuật về tách dòng gene, về biểu hiện gene, về RNA và chủ yếu là RNA thông
tin, về enzyme …
Các kỹ thuật về DNA hiện được sử dụng phổ biến là đa hình độ dài đoạn cắt
giới hạn (RestrictionFragment Lenth Polymorphism – RFLP) và các kỹ thuật dựa
vào chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) như: đa hình các đoạn
DNA nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphim DNA – RADP), đa hình
độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Frangment Length Polymorphism –
AFLP), Microsatellite.
1.3.1. Phân loại
Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt hai cá thể, hai
dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể xem như một DNA marker. Những
marker có tính chất như vậy rất cần thiết vì số lượng của chúng lớn hơn rất nhiều so
với các marker hình thái, marker ở dạng protein (isoenzyme) (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 2005).
Dựa vào kỹ thuật thực hiện các DNA marker có thể chia làm hai nhóm (Phạm
Thành Hổ, 2005):
 Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP.
 Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR,
SSCP, RAPD.
Dựa trên kiểu hình có thể chia DNA marker thành hai nhóm (Phạm Thành Hổ,
2005):

11
 Marker đồng trội: Những marker có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử
và cá thể dị hợp tử. Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP.
 Marker trội: Những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử
và dị hợp tử. Bao gồm RAPD, AFLP.
Bảng 1.1. Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005).
Chỉ thị (marker) Tên đây đủ
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
AP-PCR Arbitrary Primer-PCR
DAF DNA Amplification Fingerprinting
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
ALP Amplicon Length Polymorphism
SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite)
SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
RFLP RestrictionFragment Length Polymorphism
SNP Single Nucleotide Polymorphism
STS Sequence-Taqged Sites
1.3.2. RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP)
Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh
giá đa dạng di truyền. RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân
đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra
khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme – RE) khi có sự
thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác (Wayne Powell
và ctv,1996).
Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền được sử dụng phổ
biến nhất. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt

12
giới hạn (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene. DNA bộ gene sẽ
được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua
màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một
locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt
khác nhau (Wayne Powell và ctv,1996).
RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng
hợp và dị hợp. Do kích thước khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo
ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp,
nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (do phải sử dụng phóng xạ đánh
dấu), DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này.
Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn.
Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát,
sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các Restriction enzyme, điện di
và phân tích trên gel nhuộm Ethidium bromide hoặc bạc. PCR – RFLP bỏ qua bước
lai phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP.
1.3.3. Amplifíed Fragment Length Polymorphism (AFLP)
AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết
hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử
dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có
thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng
gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi
của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt (
Povvell và ctv, 1996; Winfield và ctv, 1998).
Thông thường, trong AFLP sử dụng một cặp Restriction enzyme gồm một
enzyme cắt thường xuyên và một enzyme cắt không thường xuyên. Enzyme cắt
thường xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt không thường xuyên sẽ hạn
chế số lượng các đoạn cắt. Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI – Msel.
Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn
vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần

13
trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR
được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài
nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự
nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự
xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích (Matthes và ctv, 1998;
Karp và ctv, 1997).
AFLP nhanh, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ
gene. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu. Tuy nhiên, thông tin di truyền
phải được biết rõ để chuẩn bị primer tương ứng, và AFLP là một marker trội, điều
này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.
1.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplifíed Polymorphism DNA)
Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi
thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà
không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp,
đơn, ngắn, dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại
các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các
đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thước khác
nhau được nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa
các cá thể và các đoạn đa hình có thể được dùng như những marker để xác định sự
đa dạng di truyền. RAPD được xem như một phương pháp tạo sự đa hình DNA
nhanh và hữu hiệu. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã được thương mại hóa trên
thị trường và các primer cũng rất dễ được tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy
PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí
nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình
cao (Harris, 1999).
1.3.5. Microsatellite (SSR)
Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene Eukaryote là những vùng có tính
biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable
number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trưng bởi số

14
lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA như: (AC)n, (AG)n, (AT)n,
(TAT)n, (TCT)n, (CAG)n ... Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở
mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phương pháp này là rất cao.
Dựa trên trình tự DNA, microsatellite được bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho
phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene,
trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kích thước các
đoạn DNA được khuếch đại thường từ 100 – 200 bp. Kết quả tạo ra các đoạn DNA
có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide.
1.4. Chỉ thị Microsatellite trong nghiên cứu đa dạng di truyền
1.4.1. Khái niệm về Microsatellite
Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of
tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên
trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005), là một
đoạn DNA được mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lượng bản copy biến thiên (từ
một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn
(gọi là đơn vị lặp lại). Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở
khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một
vị trí nào (locus), thường xuyên có khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles
có thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những alleles này có thể phát hiện
bởi PCR , sử dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia
của microsatellite. Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, alleles được ghi
nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại, …
Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng được phát hiện bằng
PCR và chúng có khuynh hướng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của
genome. Hàng ngàn SSR đã được lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau.
Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu
tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short
tandem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats) (Edward, 1991).
Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 – 6 bp và kích thước tại mỗi locus

15
là 20 – 100 bp. Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở
những cơ thể sống có bộ gene lớn và phân bố đều trên genome.
Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-alleles hay alleles
đồng trội (bao gồm 2 loại: alleles đồng hợp và alleles dị hợp), nó có các tính chất
cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104
– 5x106
, tuân theo định luật
Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR
từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có
thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng.
1.4.2. Tính chất
Những markers này thường hiện diện với mức độ cao của hiện tượng đa hình,
đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự được lặp lại thường đơn
giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tương ứng với việc lặp lại di-, tri-, và
tetranucleotide), và có thể được lặp lại từ 10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide
CA xảy ra rất thường xuyên trong bộ gene người và các loài khác, và được hiện
diện trong khoảng vài ngàn bases pair. Như vậy có sự xuất hiện thường xuyên của
nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ thường cung cấp đầy đủ
thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể được nhận biết dễ
dàng. Bằng cách này, microsatellite là marker lý tưởng để xác định nguồn gốc,
nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó còn là marker phân tử dùng
để cung cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn.
Microsatellite thường thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung
tính khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này có thể được giải thích bởi sự bắt cặp sai
trong bộ phận trượt (slipped strand mispairing – sự giữ không đúng mục tiêu) trong
suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra
suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu được
sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể không
được sửa chữa. Kích thước của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự
lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng như là tính thường xuyên của sự dịch mã
trong khu vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến,

16
có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tương tự này
thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu
sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác
của microsatellites có thể được khuếch đại.
1.4.3. Sự phát triển của primer Microsatellite
Primer của microsatellite được phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một
đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này được chèn vào plasmid
hoặc phage vector, và được chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau
đó phát triển và được chụp lên phim với những trình tự nucleotide được đánh dấu
huỳnh quang được lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên
đoạn DNA. Nếu dòng dương tính có thể thu được từ quy trình này, đoạn DNA được
đọc trình tự và primers PCR sẽ được chọn từ vùng trình tự liên kết như vùng để xác
định vị trí đặc trưng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi
trình tự lặp lại của microsatellites phải được dự đoán trước và primers được thu
nhận ngẫu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa. Vị trí microsatellite
được trải xuyên suốt genome và có thể được thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung
của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch
đại thông qua PCR.
Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở
những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài.
Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng
flanking – vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer – được bảo
tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát
hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể.
1.4.4. Giới hạn của Microsatellite
Microsatellite là marker phân tử hữu hiệu và đặc biệt trong nghiên cứu quần
thể. Thế nhưng chúng không phải không có hạn chế. Microsatellite được phát triển
cho những chủng đặc trưng, có thể được ứng dụng thường xuyên với những chủng

17
có mối quan hệ họ hàng gần nhau. Tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền được
khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền.
Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẫn
đến sự cố alleles không giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể
đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên
kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo dài
bắt đầu. Sự khuếch đại ưu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên
của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử được ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ
phận không có giá trị) (Hayden và Sharp, 2001). Sự thất bại của phản ứng PCR có
thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù được khuếch đại.
Tuy nhiên, ảnh hưởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết
giới tính cũng cần được xem xét để không đưa ra giá trị sai của alleles không giá trị
do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thước
alleles cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự. Đột biến có thể có từ sự thêm
vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều
dài. Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số
vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lượng
hoặc sự cố trong vùng exon của gene dưới sự chọn lọc.
Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng
khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhưng số vị trí khuếch đại thành công
trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các
loài nghi vấn. Đột biến trong alleles microsatellite có thể bị ảnh hưởng xấu trong
trường hợp có một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể được
dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm
tăng kích thước, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thước, khi
mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thước; sự ép buộc này
đã được xác định nhưng giá trị khẳng định là chưa chuyên biệt. Nếu có một sự khác
biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền
vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân.

18
Trong tế bào khối u – nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy,
microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thường xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong
mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc
điểm khác biệt di truyền.
1.4.5. Các loại Microsatellite
Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 – 6 lần) có :
Mononucleotide SSR (A)
AAAAAAAAAAA
Dinucleotide SSR (GT) 6
GTGTGTGTGTGT
Trinucleotide SSR (CTG) 4
CTGCTGCTGCTG
Tetranucleotide SSR (ACTC) 4
ACTCACTCACTCACTC
Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và
tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv, 1996).
1.4.6. Cơ chế hình thành microsatellite
Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách
đầy đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện
và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau:
 Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing - over
during meiosis). Quá trình này được mô tả trong hình 1.6.
Hình 1.6. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân.

19
 Quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage).
Hình 1.7. Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã.
Hình 1.7 mô tả quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage). Đây
được coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand).
Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử
DNA mới tổng hợp mà phân tử enzyme polymerase không nhận biết được. Sự trượt
lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc
là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn.
1.4.7. Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite
Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế mồi microsatellite
đặc trưng cho một locus trong bộ gene. Vì vậy một cặp mồi microsatellite có thể áp
dụng cho mọi cá thể trong loài, và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước
khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite.

20
Hình 1.8. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số.
Hình 1.8 hai mồi của PCR (2 mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo
toàn nằm 2 bên trình tự microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm
PCR sẽ có chiều dài là 100 bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR
chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự
microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm
PCR là 116 bp)
Hình 1.9.Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite.
Mồi microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở
những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài.
Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng
flanking (vùng sườn – vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế mồi)
được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng sườn rất quan trọng vì nó giúp
phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể.

21
Sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel. Thông thường sản
phẩm PCR có 2 vạch, 1 vạch chính và 1 vạch phụ nhỏ hơn vạch chính 2 bp (Murray
và ctv, 1993). Sự xuất hiện của vạch phụ là do quá trình trượt lỗi của DNA
polymerase (Tautz, 1989), vạch phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định kích
thước chính xác của vạch chính, nhưng vạch phụ cũng có thể được xem như một
dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite. Bằng cách này
thì chúng ta cũng xác định được kích thước của sản phẩm PCR đồng thời đếm được
số lần lặp lại của các nucleotide trên mỗi alleles.
1.4.8. Ưu và nhược điểm cùa microsatellite
1.4.8.1. Ưu điểm
 Microsatellite có số đơn vị trình tự lõi từ 1 – 6bp, số lần lặp lại của
microsatellite khoảng 70 lần. Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là
khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng kỹ thuật này là
rất cao.
 Microsatellite có khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus
được kiểm tra nên kỹ thuật này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng
chảy gene và phân tích mối quan hệ huyết thống.
 Microsatellite là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác
định. Tính đồng trội của microsatllite gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác
của những phép tính toán di truyền quần thể so với những marker khác như:
AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho
những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gene trở nên dễ dàng hơn.
1.4.8.2. Nhược điểm
 Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bước đầu tiên rất
quan trọng trong kỹ thuậtnnày. Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải
nhược điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình.
 Không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có
quan hệ di truyền xa nhau.

22
1.4.9. Vai trò của microsatellite
Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở phần phía trên các vùng khởi đầu
sao mã của vùng mang mã, và một số có quan hệ với vùng mã hoá. Chức năng rõ
rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa biết rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy
chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền.
Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền
quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gene. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho
rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều
hòa. Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của
vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. số lượng
khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự
biểu hiện của gene và chức năng của gene.
Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của
microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của
microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi.
Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá
trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng
của gene.
Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức
năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này được giải
phóng thì gene được khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt
động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao
mã thông qua ảnh hưởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh
hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của
các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Như một trình tự
mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác
nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác
nhau về chức năng của protein và hoạt động của gene, do đó có thể ảnh hưởng đến
chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể.

23
Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hưởng của chiều dài khác
nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng
kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gene. Những tính chất đặc biệt của
microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite
có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình
tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv, 1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi
phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động
như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gene đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh
chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King
và ctv, 1997). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên
cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa.
1.4.10.Ứng dụng của microsatellite
Trong việc xác định cấu trúc quần thể (đặc biệt là các quần thể tự nhiên) từ các
loài khác nhau như vi sinh vật, thực vật, động vật có vú, côn trùng,chim … Đặc biệt
là việc xác định cấu trúc xã hội và liên kết giữa các cá thể, cấu trúc quần thể của các
loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần
thể.
Trong chuẩn đoán bệnh: vì DNA microsatellite thay đổi về chiều dài trong sự
phát triển của một số bệnh ung thư. Nên chúng là những marker rất hữu ích trong
việc dò tìm, phát hiện ung thư sớm. Tính đa hình của microsatellite hữu ích trong
nghiên cứu các liên kết để định vị những gene chiụ trách nhiệm về nhiều sự mất trật
tự di truyền học.

24
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
 Địa điểm nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Ngiệm Di Truyền
Phân Tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II (116 Nguyễn Đình
Chiểu, Phường Đakao, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh).
 Thời gian nghiên cứu: đề tài được thực hiện từ tháng 04/2015 đến tháng
07/2015.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Nguồn mẫu
Mẫu vây đuôi cá Tra sử dụng trong nghiên được cung cấp bởi Trung tâm quốc
gia giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ tại xã An Thái Trung, huyện Cái Bè, tỉnh
Tiền Giang.
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.2.1. Mồi
Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê dưới bảng sau:
Bảng 2.1. Thông tin 16 cặp mồi microsatellite dùng trong nghiên cứu.
Loci Sequencing 5’-3’ Size range Ta (0
C)
CB12
R 5’ATCTGGGTCAAAATGATTGGAAC 3’
F 5’ GCGATAQAGACAGAGAGTCATGG 3’
300 52,1
CB13
R 5’ CTCCATTTACAGACCATCCGTAQ 3’
F 5’ GTGTGTCAAGTTGGGATCATGG3’
300 57,2
CB14
R 5’ GGAAGAAAATCATCTGACTGCAC3’
F 5’ ATACAAACCTCTGAAATGGGTTC 3’
250 52,1
CB15
R 5’ CCCTTAQTCCGAATTACTGGAAGC3’
F 5’CGGGGGAGTGTTGTCTGTCAG 3’
250 57,8
CB18
R 5’TATACCTGCTGGGAGAATGGATG3’
F 5’AGAAGGAACGCTGGACTGAGG3’
350 52,5

25
CB19
R 5’CAGACATGAGGAGGATGAAGACG3’
F 5’TCGAGAGTCTGAAGCACAAACC 3’
250 52,1
Phy01
F-5’-GTAAACAGAGCCACCTGCGG-3’
R-5’-CAGATCCACACCCACAACACC-3’
154 - 160 66
Phy03
F-5’-TAQGAGTCAGGAGTCGC-3’
R-5’-TGCAACGGTAACAAACC-3’
166 - 194 54
Ph-7
F-5’-GGAGGAGCAGCTTCAGAGTC-3’
R-5’-AGCGTGTCATGAAGAGGGTG-3’
153 57,1
Ph-9
F-5’-TTGCGTGATGACTTTGCGTG-3’
R-5’-ACGATGGCTTCAGTTACGCATC-3’
175 61
Ph-21
F-5’-CGATGAGCAGGAACGACATG-3’
R-5’-AGCACTCTGTCCATCCATCC-3’
115 57,1
Ph-25
F-5’-GGTGAAGAGGCTCCATGAAG-3’
R-5’-TGTACCCAGAGTCATCAGATCC-3’
133 59,1
PSP-G579
F-5’-GAGAGGGGGTGAAATAATGATAQG-3’
R-5’-ATGGTTCTCCTGCAAGCAATGTCT-3’
300 54,3
PSP-G565
F-5’-ACCGGGTTTTAQAGTGACG-3’
R-5’-GTGGGACAAAGGGAAAAGTG-3’
250 52
PSP-G593
F-5’-ATTGTCTATTGCTGCTGGATACCA-3’
R-5’-GATTTTTGCCTTTGTTCTCCTGAG-3’
250 50
Pg-13
F-5’-GTTTTCCATCCAGGTTGTTTTCC-3’
R-5’-TAAGTCCATGTGGGTTTCCTCTG-3’
350 54,3
2.2.2.2. Thang
Thang DNA được để xác định kích thước DNA các mẫu cá Tra. Kích thước
thang sử dụng trong nghiên cứu là 100 bp.

26
Hình 2.1. Thang chuẩn 100 bp.
2.2.2.3. Các hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA
 Dung dịch tách chiết 1 (Solution 1): 50 mM Tris – HCl pH 8; 20 mM
EDTA pH 8; 2 % SDS.
 Dung dịch tách chiết 2 (Solution 2): dung dịch NaCl bão hòa 6 M.
 Proteinase K.
 Ethanol 70 %.
 Ethanol tuyệt đối.
2.2.2.4. Hóa chất sử dụng trong PCR
 10X PCR buffer (Fermentas).
 25 mM MgCl2 (Fermentas).
 10 mM dNTP mix (Fermentas).
 Taq DNA polymerase 5 U/l (Fermentas).
 Primer 100M (Sigma).
 DNA mẫu (tách chiết từ mẫu vây).

27
2.2.2.5. Hóa chất sử dụng trong điện di agarose
 Agarose (Bio basic).
 TBE 1X.
 6X DNA Loading Dye (Promega).
 100 bp DNA Ladder (Promega).
2.2.2.6. Dụng cụ và thiết bị
 Kéo, kẹp cắt mẫu.
 Đèn cồn.
 Cốc thủy tinh 100 ml, 1000
ml.
 Eppendorf 0,2 ml; 1,5 ml; 2
ml.
 Đầu tip các loại.
 Máy vortex.
 Cân điện tử MS 204.
 Trip 8, 12.
 Plates 96 well PCR.
 Lò viba.
 Máy hút và tủ cấy vô trùng
(Astec Microflow).
 Máy khuấy từ gia nhiệt.
 Bể điều nhiệt.
 Máy ủ.
 Máy cất nước siêu sạch.
 Micropipet các loại: 100 –
1000 µl; 0,5 – 10 µl; 10 – 100
µl; …(Bio – Rad).
 Máy ly tâm lạnh.
 Máy PCR (Bio – Rad).
 Máy điện di (Bio – Rad).
 Máy chụp ảnh điện di (Bio –
Rad).
 Lò vi sóng (Electrolux – Thụy
Điển).
 Tủ mát (40
C), tủ âm (-250
C)
(Sanyo – Nhật).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu
Mẫu vây đuôi của cá được cắt, rửa bằng cồn 96 % và được bảo quản trong cồn
70 % (mẫu luôn ngập trong cồn), riêng biệt trong từng eppendorf 1,5 ml (đã được
hấp vô trùng). Mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ 40
C cho đến khi tiến hành tách chiết
DNA và được tiến hành thay cồn định kỳ 3 tháng/lần.

28
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA
2.3.2.1. Quy trình
Tách chiết DNA tổng số dựa trên quy trình tách chiết DNA Salt extraction
(Miller và ctv, 1988).
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988).
2.3.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết
Tiến hành điện di mẫu DNA tách chiết trên gel Agarose 1 %, trong dung dịch
đệm TBE 1X ở hiệu điện thế 100 V, cường độ dòng diện 400 mA trong 30 phút.

29
Sau khi chạy điện di xong, đưa gel vào máy chụp ảnh DNA. Dưới tia UV,
Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các vạch
trên gel.
Dựa vào khoảng cách 2 vạch, có thể ước tính được khối lượng. Độ tinh sạch
của DNA tách chiết được tính bằng cách tính tỷ lệ OD260 nm/OD280 nm. Nếu tỷ lệ
này nằm trong khoảng 1,7 – 2,2 thì mẫu tách chiết được xem là sạch. Nếu tỷ lệ <1,7
là mẫu nhiễm nhiều protein.
2.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.3.3.1. Khái niệm
Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Polymerase Chain Reaction), được
Karry Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phát minh này nhận được giải Nobel
về hóa học vào năm 1993.
PCR là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, độ chính
xác cao và được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR). Nhờ kỹ thuật
PCR mà với lượng nhỏ DNA mẫu ban đầu ta có thể thu được đủ lượng DNA cần
thiết để tiến hành các thí nghiệm về DNA. Cho đến nay, kỹ thuật PCR được coi là
phương pháp nền tảng quan trọng của công nghệ di truyền (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
2003).
Mục đích của việc sử dụng phương pháp PCR trong nghiên cứu này là để
khuếch đại sản phẩm đặc hiệu từ các chỉ thị microsatellite khác nhau, nhầm chọn ra
những cặp mồi tốt nhất.
2.3.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản
của sao chép DNA trong cơ thể. Tuy nhiên, PCR dùng nhiệt độ cao (94°C) để tháo
xoắn DNA, kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt
thích hợp cho từng giai đoạn của phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn primer được
thiết kế chủ động (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).

30
PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (25 – 35 chu kỳ) nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm 3 bước:
 Bước 1: Biến tính (denaturing): 60 giây(thời gian có thể dài hoặc ngắn
hơn tùy theo độ dài DNA mẫu). Nhiệt độ 94 – 950C, trong, DNA mẫu bị
biến tính từ sợi kép thành sợi đơn dưới tác dụng của nhiệt độ.
 Bước 2: Gắn primer (annealing): 30 giây. Nhiệt độ 50 – 600C (tùy thuộc
vào độ dài của cặp primer). Ở bước này cặp primer gắn chuyên biệt vào sợi
DNA đích (sợi đơn).
 Bước 3: Kéo dài (extending): 30 giâyNhiệt độ 720C, là nhiệt độ thích hợp
cho Taq polymerase hoạt động giúp tổng hợp sợi DNA mới từ primer (Bùi
Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005).
Sau 25 – 35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 720C trong 5 – 20 phút để
hoàn thiện các sản phẩm PCR.
Kết quả cuối cùng là đoạn DNA khuôn mẫu được khuếch đại lên gấp nhiều lần
(xem hình 2.3) với tổng số DNA khuếch đại là mx2n
(với m là số DNA đích ban đầu
và n là số chu kỳ) (Trịnh Đình Đạt, 2006).
Hình 2.3. Các bước cơ bản của phàn ứng PCR.

31
2.3.3.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Theo Trịnh Đình Đạt (2006) thì cần lưu ý các chỉ tiêu:
 Mẫu DNA
 Mẫu DNA sẽ được tách chiết từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng
nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau.
 Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhưng nhiều kỹ
thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA lấy trực tiếp từ dịch
chiết tế bào. PCR còn cho phép khuếch đại những mẫu DNA không được
bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như: vết máu để lâu, tinh dịch đã
khô, hóa thạch...
 Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR vào khoảng 5 – 10 ng.
 Taq polymerase
 Ban đầu, khi chưa sử dụng enzyme Taq polymerase người ta phải thêm
DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho
quá trình tổng hợp DNA nhưng không chịu được nhiệt độ lớn hơn 900
C ở
giai đoạn biến tính tách hai sơi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq
polymerase được phát hiện, đây là một loại DNA polymerase bền với nhiệt,
được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng. Với
enzyme này thì chỉ cần cho một lần Taq polymerase là được.
 Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0,5 – 5 đơn vị/100
µl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ quá cao, những sản phẩm không mong
muốn có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ
không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn.
 Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một
nucleotide loại A vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan
trọng trong việc tạo dòng (TA – cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn
kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể
làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với
một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu, …

32
Theo Trần Thị Thu Hương (2007):
 Primer và nhiệt đô lai: Primer là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt sự khuếch
đại đặc trưng và hiệu quả cao. Việc chọn primer phải tuân thủ một số
nguyên tắc sau:
 Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp giữa primer “xuôi”
và “ngược”, không xuất hiện cấu trúc “kẹp tóc” (các phần khác nhau của
một primer bắt cặp với nhau).
 Tm của primer xuôi và ngược không cách biệt quá xa, tránh các cặp G – C
lặp lại nhiều lần.
 Primer đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng các trình tự
lặp lại trên gene.
 Trình tự khuếch đại không quá lớn (< 1 kb).
 Số lương chu kỳ của phản ứng PCR: số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc
lượng mẫu ban đầu. số chu kỳ không quá 40 chu kỳ. Nếu vượt quá, hiệu
quả khuếch đại giảm hẳn do:
 Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
 Xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
 Các bản sao vừa được tổng hợp bắt cặp với nhau
 Các thảnh phần khác
 Nồng độ bốn loại dNTP không quá 20 – 200 µM/ mỗi loại nu. Nồng độ cao
hơn dễ dẫn đến hiện tượng “kí sinh”. Sự mất cân bằng thành phần các Nu
làm tăng lỗi sao chép của polymerase.
 Dung dịch buffer: tạo môi trường tối ưu nhất cho Taq polymerase hoạt
động.
 Ion kim loại Mg2+
: nồng độ Mg2+
cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá
trình PCR, Mg2+
cần cho DNA polymerase chức năng, nếu nồng độ Mg2+
thấp thì không được hoạt hóa thành công, nồng độ Mg2+
cao làm phản ứng
PCR mất tính đặc hiệu và quá nhiều sản phẩm tạo ra. Không có quy luật

33
chung cho nồng độ Mg2+
trong phản ứng PCR. Do đó, nồng độ Mg2+
phải
được xác định cho từng phản ứng qua các thử nghiệm.
2.3.3.4. Ưu nhược điểm của phản ứng PCR
 Ưu điểm: Cho kết quả chính xác, nhanh, khếch đại lượng đủ DNA cần thiết
cần cho các thí nghiệm chỉ từ một lượng nhỏ DNA.
 Nhược điểm: có thể cho kết quả dương tính giả: trong một số trường hợp vi
sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng gây bệnh thì phản ứng PCR
vẫn cho kết quả dương tính.
2.3.3.5. Ứng dụng
Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) và Nguyễn Thị Lang (2002), PCR được
sử dụng rất phổ biến trong các lĩnh vực sinh học với các ứng dụng như:
 Sản xuất mẫu dò.
 Tách nhanh chóng, chính xác từng gene, từng đoạn DNA riêng biệt
 Là kỹ thuật nền cho các nghiên cứu di truyền phân tà như: xác định trình tự
gene, đa hình DNA, xác định marker phân tử cho chọn giống, phát hiện đột
biến gene.
 Chẩn đoán nhanh, nhạy các bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng (virus, vi
khuẩn, nấm...).
 Xác định giới tính động vật ở giai đoạn phôi thai.
 Khôi phục gene của các sinh vật cổ cách đây hàng triệu năm.
Xác định nguồn gốc hài cốt, quan hệ họ hàng, xác định cá thể dùng trong
việc xác định huyết thống, trong khoa học hình sự.
2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose
Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành phần
chính của agar chiếm khoảng 70 %, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30 %.
Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ
nhau là D–galactose và 3,6–anhydro–L–galactose.

34
Agarose gel là một chất trong suốt hoặc trong mờ, tạo thành khi hỗn hợp
agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100o
C và sau đó được làm
lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40 – 45o
C. Bản chất quá trình đông lại của
agarose là phản ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt
độ. Các
chuỗi polymer liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích
thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hoá.
2.3.4.1. Nguyên tắc
Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra
khi di chuyển từ cực âm sang cực dượng của hệ điện di trong một điên trường có
điện thế và cường độ thích hợp . Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ
thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường...
Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel
được nhuốm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide
(EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
Điện di trên gel agarose được xem là phượng pháp tối ưu nhất dùng để phân
tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA.

35
Hình 2.4. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel.
2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng
Theo Mạc Văn Trọng (2007), cần lưu ý một số yếu tố sau:
 Kích thước của phân tử: các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối
lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm. Các phân tử DNA
mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc đố tỷ lệ nghịch với hàm log10
của khối lượng phân tử của chúng.
 Nồng đô agarose: Đoạn DNA mang kích thước khác nhau dịch chuyển ở
các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.

36
Bảng 2.2. Các thông số điện di DNA bằng gel agarose.
Hàm lượng agarose trong gel (%)
Kích thước đoạn DNA (kb) sử dụng có
hiệu quả
0,5  0,8
0,9  2,0
2,1  2,5
1  10
0,5  5
0,1  0,5
 Cấu hình DNA
 Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng có cùng một khối
lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên gel agarose ở các tốc độ khác nhau.
 DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid
cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng.
Hình 2.5. Kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại
mạch thẳng ở bên phải.
 Thành phần base và nhiệt độ: điện di DNA trên gel agarose không bị ảnh
hưởng rõ bởi thành phần base của DNA hoặc nhiệt độ.

37
2.4. Bố trí thí nghiệm
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.
Nguồn mẫu
Tách chiết DNA
Khảo nồng độ
Taq DNA
polymerase
Khảo sát nhiệt
độ bắt cặp của
các cặp mồi
microsatellite
Khảo sát nồng
độ MgCl2
Tối ưu hóa phản ứng PCR
Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite.

38
2.4.1. Thí nghiệm 1: tách chiết DNA
2.4.1.1. Tách chiết DNA
Cách tiến hành:
- Mẫu vây đuôi cá được cắt nhỏ cho vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 µl
dung dịch solution 1,5 µl proteinase K rồi votex nhanh.
- Ủ các eppendorf trên ở 550
C trong 2 giờ (hoặc qua đêm).
- Sau khi ủ tiến hành chuyển các eppendorf sang đá đã chuẩn bị sẵn để trên đá
10 phút.
- Thêm 250µl dung dịch solution 2, trộn đều và để trên đá 5 phút.
- Tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút ở 40
C trong 15 phút và cẩn thận hút 300µl
dịch nổi vào các eppendorf mới.
- Thêm 600µl ethanol 100 % lạnh và tiến hành ủ ở 550
C trong 2 giờ rồi tiến
hành ly tâm 11000 vòng/phút ở 4o
C trong 15 phút.
- Loại bỏ dịch nổi và rửa DNA trong eppendorf bằng 500 µl ethanol 70 % và
ly tâm 11000 vòng/phút ở 40
C trong 5 phút.
- Cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm khô các eppendorf bằng máy gia nhiệt ở
550
C hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
- Thêm 100µl TE và bảo quản ở –250
C.
2.4.1.2. Kiểm tra DNA tách chiết
 Chuẩn bị gel agarose 1%
Cân 1,5g agarose cho vào 150 ml dung dịch TBE 1X, lắc đều và đun nhiều lần
bằng lo vi ba cho đến khi agarose tan hoàn toàn (nếu quá trình đun mất nước quá
nhiều thì phải thêm nước cho đủ 150 ml). Để nguội đến 50 – 600
C rồi tiến hành
thêm 7,5 µl Ethidimum bromide, lắc đều và đổ gel vào khuôn đã cài lượt sẵn
(không để có bọt khí). Đợi 15 – 20 phút để gel đông hoàn toàn, tháo lượt và cho gel
vào bồn điện di (để gel ngập trong dung dịch đệm TBE 1X).
 Nạp mẫu

39
Dùng micropipette hút 3 µl dung dịch nạp mẫu (Bromophenol blue) trộn
với 7 µl sản phẩm PCR rồi bơm vào giếng trên bản gel. Bơm thang chuẩn vào
bản giếng. Chạy ở điện thế 100 V trong 30 phút.
 Phát hiện vạch DNA sản phẩm
Sau khi chạy điện di, các phân tử DNA đã được nhuộm bởi Ethium
Bromide. Bản gel được cho vào máy chụp UV và hình ảnh sẽ hiển thị trên màn
hình máy vi tính, sản phẩm DNA là những vạch trắng.
2.4.2. Thí nghiệm 2: tối ưu hóa phản ứng PCR
2.4.2.1. Thí nghiệm 2.1: khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite
Để cho cặp mồi có thể bắt cặp một cách hoàn toàn đặc hiệu trên sợi DNA
khuôn thì phải duy trì giai đoạn bắt cặp của chu kỳ nhiệt ở nhiệt độ tối ưu cho sự bắt
cặp của mồi, gọi là nhiệt độ bắt cặp (Ta). Vì vậy việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp của
mồi là cần thiết để phản ứng PCR.
Sử dụng 3 mẫu DNA tách chiết tốt nhất trong phần tách chiết để thực hiện thí
nghiệm này. Đối với mỗi mồi, thực hiện phản ứng PCR 8 mẫu với gradian nhiệt độ
bắt mồi trong Bảng 2.4, dao động điều chỉnh theo nhiệt độ bắt cặp của các mồi theo
lý thuyết.
Kết quả được kiểm tra trên gel Agarose 2,5 %, TBE 1X, hiệu điện thế180 V,
cường độ dòng điện 400 mA trong thời gian 60 phút để xác dịnh vạch sản phẩm tốt
nhất.

40
Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi microsatellite.
Dãy nhiệt độ
khảo sát
Mồi
1 2 3 4 5 6 7 8
CB12, CB14,
CB18, CB19
500
C 51,40
C 52,90
C 54,30
C 55,70
C 57,10
C 58,60
C 600
C
CB13, CB15 550
C 56,40
C 57,90
C 59,30
C 60,70
C 62,10
C 63,60
C 650
C
Ph–7, Ph–9,
Ph–21, Ph–
25
550
C 56,40
C 57,90
C 59,30
C 60,70
C 62,10
C 63,60
C 650
C
Phy01 600
C 61,40
C 62,90
C 64,30
C 65,70
C 67,10
C 68,60
C 700
C
Phy03 500
C 51,40
C 52,90
C 54,30
C 55,70
C 57,10
C 58,60
C 600
C
Pg–13, PSP–
565, PSP–
G579, PSP–
G593
500
C 51,40
C 52,90
C 54,30
C 55,70
C 57,10
C 58,60
C 600
C
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của các mồi CB12, CB13, CB14, CB15, CB18, CB19.
Chu kỳ Nhiệt độ (0
C) Thời gian
1 95 4 phút
30
95 30 giây
Ta 30 giây
72 30 giây
1 72 5 phút
1 8 ∞

41
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của mồi Pg –13, PSP – G565, PSP – G579, PSP – G593.
C) Thời gian
1 94 5 phút
34
94 40 giây
Ta 30 giây
72 1 phút 20 giây
1 72 20 phút
1 8 ∞
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của mồi Ph–7, Ph–9, Ph–21, Ph–25.
C) Thời gian
1 94 3 phút
30
94 30 giây
Ta 30 giây
72 30 giây
1 72 2 phút
1 8 ∞
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của mồi Phy01, Phy03.
C) Thời gian
1 95 4 phút
30
95 45 giây
Ta 30 giây
72 30 giây
1 72 10 phút
1 8 ∞

42
2.4.2.2. Thí nghiệm 2.2: khảo sát nồng độ MgCl2
Sử dụng mẫu DNA tách chiết tốt nhất ở phần tách chiết để thực hiện thí
nghiệm này.
Đối với mỗi mồi thực hiện 5 phản ứng PCR với thể tích MgCl2 (25 mM) thay
đổi lần lượt là 1 – 1,5 – 2 – 2,5 – 3 µl tương ứng với nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp
phản ứng PCR là: 1,25 – 1,875 – 2,5 – 3,125 – 3,75 mM và nhiệt độ Ta là nhiệt độ
thích hợp nhất cho quá trình bắt mồi đã được xác định ở thí nghiệm trên (vì tổng thể
tích phản ứng PCR luôn là 20 µl nên thể tích của nước cất cho mỗi mẫu lần lượt là
11,75 – 11,25 – 10,75 – 10,25 – 9,75 µl).
Kết quả được kiểm tra trên gel Agarose 2,5 %, TBE 1X, hiệu điện thế180 V,
cường độ dòng điện 400 mA trong thời gian 60 phút để xác dịnh vạch sản phẩm tốt
nhất.
Bảng 2.8. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite.
Phản ứng 1 2 3 4 5
Thể tích MgCl2 (µl) 1 1,5 2 2,5 3
Nồng độ MgCl2 (mM) 1,25 1,875 2,5 3,125 3,75
Thể tích H2O (µl) 11,75 11,25 10,75 10,25 9,75
2.4.2.3. Thí nghiệm 2.3: khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase
Nếu nồng độ Taq DNA polymerase quá cao, những sản phẩm không mong
muốn có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ không đủ
lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn. Vì vậy cần tiến
hành khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase để phản ứng PCR được tối ưu.
Bảng 2.9. Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát.
Phản ứng 1 2 3 4
Thể tích Taq DNA polymerase (µl) 0,25 0,3 0,35 0.4
Nồng độ Taq DNA polymerase (U) 1,25 1,5 1,75 2

43
Phản ứng được tiến hành trên máy luân nhiệt iCycle (Bio – rad ) đã được cài
đặt sẵn chu trình nhiệt. Các thành phần phản ứng PCR là không đổi, chỉ thay đổi thể
tích Taq DNA polymerase. Thể tích của mỗi phản ứng là 20 µl.
Sản phẩm khuếch đại, sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 2,5 %, hiệu
điện 180 V, cường độ dòng điện là 400 mA trong thời gian 60 phút, TBE 1X, thể
tích mẫu là 7 µl. Dùng thang M kích thước 100 bp để so sánh kích thước DNA, với
thể tích thang M là 5 µl. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh
DNA để kiểm tra sản phẩm và chụp ảnh dưới ánh sang đèn UV.
2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite
Sau khi đã có kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các mồi, nồng độ Mg2+
tối
ưu và hàm lượng DNA tối ưu cho mỗi cặp mồi của phản ứng PCR, tiếp tục thực
hiện phản ứng PCR của các cặp mồi microsatellite đặc trưng cho cá Tra trên 10 mẫu
DNA thuộc 4 quần đàn (G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001), nhằm tiếp tục
kiểm tra độ hoạt động của primer microsatellite, kiểm tra tính ổn định của phản ứng
sau khi đã tối ưu hóa.
Phản ứng PCR cho từng cặp mồi được tiến hành trên thiết bị luân nhiệt PCR
iCycle (Bio – rad). Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 20 µl, bao gồm các thành
phần : buffer, dNTP, primer, Taq polymerase, MgCl2, DNA khuôn, nồng độ và thể
tích của từng thành phần được thể hiện dưới bảng 2.11.
Bảng 2.10. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq
polymerase cho một phản ứng PCR.
Thành phần Thể tích (µl)
PCR buffer 10 X 2,5
dNTP 10 mM 1
MgCl2 25 mM Nồng độ tối ưu
Forward Primer 10 µM 0,2

44
Reverse Primer 10 µM 0,2
Taq polymerase 5 U/µl Nồng độ tối ưu
DNA khuôn 50 ng/µl 1
Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt PCR iCycle (Bio – rad)
với chu kỳ nhiệt.
Hình 2.7. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi
microsatellite.
Sản phẩm khuếch đại, sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 2,5 %, hiệu
điện 180 V, cường độ dòng điện là 400 mA trong thời gian 60 phút, TBE 1X, thể
tích mẫu là 7 µl. Dùng thang M kích thước 100 bp để so sánh kích thước DNA, với
thể tích thang M là 5 µl. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh
DNA để kiểm tra sản phẩm và chụp ảnh dưới ánh sang đèn UV

45
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA
Tách chiết DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự
thành công cho phản ứng PCR sau này.
Sản phẩm tách chiết DNA chạy điện di trên gel Agarose 1% cho thấy nồng
độ DNA tách chiết tương đối cao với kích thước khá đồng đều. Các vạch điện di
khá rõ nét, sản phẩm DNA ít bị đứt gãy trong quá trình tách chiết (Hình 3.1).
Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA 15 mẫu vây đuôi cá tra ngẫu nhiên cho 4 quần
đàn G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001.
Kết quả hình ảnh 3.1 cho thấy sản phẩm tách chiết DNA chạy điện di trên gel
agarose 1 % cho vạch DNA đều, nồng độ DNA khá cao. Sản phẩm DNA tách chiết
ít bị đứt, gãy và các DNA cùng kích thước.
Quy trình tách chiết DNA đạt hiệu quả nhờ sử dụng protinase K và dung dịch
1(Solution 1) có vai trò như một dung dịch đệm gồm Tris, EDTA, phá vỡ màng tế
bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, phân hủy các protein liên kết
với DNA. Đồng thời, việc sử dụng hai lần Ethanol 70 % và 100 % cho hiệu quả rửa
giải và loại bỏ tạp chất cao, hiệu quả kết tủa DNA cao, không bị lẫn tạp và nồng độ
đủ lớn đảm bảo cho phản ứng PCR diễn ra.

46
3.2. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR
3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite
Tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho 16 cặp mồi microsatellite theo
gradient nhiệt độ ở bảng 2.4 (bảng gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi
microsatellite).
Sau khi thực hiện khảo sát nhiệt độ bắt cặp của 16 cặp mồi microsatallite thì
có 12 cặp mồi có thể bắt mồi và hoạt động ở các nhiệt độ lai của nó, sản phẩm PCR
của các cặp mồi khá rõ ràng, ít sản phẩm không đặc hiệu. Trong 16 cặp mồi có 4
cặp mồi không thể bắt mồi và hoạt động ở nhiệt độ lai, sản phẩm khếch đại mờ dù
đã tối ưu: Ph–9, Ph–25, PSP – G579, PSP – G593. Hình minh họa phản ứng PCR
gradient nhiệt độ của các cặp mồi trên mẫu DNA cá tra có chất lượng DNA tinh
sạch tốt.
Hình 3.2. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB12.
Từ kết quả hình 3.2 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho
sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Vạch sản phẩm đậm,
rõ nét dần từ nhiệt độ 500
C đến 57,10
C. Tuy nhiên khi nhiệt độ lên đến 58,60
C và
600
C thì vạch sản phẩm bắt đầu mờ. Điều này cho thấy rằng nhiệt độ quá thấp hay
quá cao ảnh hưởng đến kết quả PCR của mồi CB12. Giếng số 5 ứng với nhiệt độ
55,70
C cho vạch sản phẩm rõ, lượng sản phẩm nhiều nhất nên được chọn là nhiệt độ
bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB12, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt
độ Ta chuẩn là 52,10
C.

Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra (pangasianodon hypophthamus)

Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra (pangasianodon hypophthamus)

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra (pangasianodon hypophthamus)

Similar to Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra (pangasianodon hypophthamus) (20)

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra (pangasianodon hypophthamus)