khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân rơm rạ, và quá trình lên men rượu.

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ETHANOL
NHIÊN LIỆU TỪ RƠM RẠ
SVTH : TRẦN DIỆU LÝ
MSSV : 60301608
CBHD : PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ
TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2008
i

2. Đại Học Quốc Gia Tp.HCM. CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM.
TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA. Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc.
--------------- -------------
Số: ________/ BKĐT
NHIỆM VỤ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP
KHOA: KỸ THUẬT HÓA HỌC.
BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ.
HỌ VÀ TÊN: TRẦN DIỆU LÝ MSSV: 60301608
NGÀNH: KỸ THUẬT HỮU CƠ LỚP: HC03KSTN
1. Đầu đề luận án: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ETHANOL NHIÊN LIỆU TỪ RƠM RẠ
2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):
Nghiên cứu quá trình thuỷ phân rơm rạ đã qua tiền xử lý, sử dụng enzyme cellulase.
Nghiên cứu quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời rơm rạ đã qua tiền xử lý,, sử dụng enzyme
cellulase và nấm men saccharomyces cerevisiae.
3. Ngày giao nhiệm vụ luận án: 15/9/2007.
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 15/12/2007.
5. Họ tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn
PGS TS. PHAN ĐÌNH TUẤN Toàn bộ.
Nội dung và yêu cầu LATN đã được thông qua Bộ môn.
Ngày 15 tháng 9 năm 2007
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN. NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH.
(Ký và ghi rõ họ tên) ( Ký và ghi rõ họ tên)
PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN:
Người duyệt (chấm sơ bộ):
Đơn vị:
Ngày bảo vệ:
Điểm tổng kết:
Nơi lưu trữ luận án:
ii

3. LỜI CẢM ƠN
Luận văn là tác phẩm của một sinh viên trước khi rời khỏi trường đại học. Để hoàn
thành luận văn, sinh viên cần phải áp dụng tất cả các kiến thức và hiểu biết mà mình đã
tích luỹ được trong suốt những năm học ở trường. Chính vì vậy những kiến thức mà em
đã tiếp thu được trong 5 năm học tại trường Bách Khoa là nền tảng vững chắc giúp em
hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa KỸ THUẬT
HOÁ HỌC nói chung và các thầy cô trong bộ môn KỸ THUẬT HỮU CƠ nói riêng vì đã
tận tình giảng dạy, giúp đỡ em trong suốt những năm vừa qua.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Phan Đình Tuấn, thầy là người đã giúp em đến với
hướng nghiên cứu này, đồng thời cũng là người tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức,
kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt luận văn.
Em cũng xin cảm ơn anh Ngô Đình Minh Hiệp vì đã nhiệt tình giúp đỡ em cả về
kiến thức chuyên môn lẫn thực nghiệm trong suốt những ngày hoàn thành luận văn tại
Tung tâm Lọc Hoá Dầu.
Cuối cùng, em xin cảm ơn bạn bè và người thân trong gia đình, những người luôn là
chỗ dựa vững chắc và luôn ủng hộ em trong mọi việc.
Sinh viên thực hiện
Trần Diệu Lý
iii

4. MỤC LỤC
Chương 1 MỞ ĐẦU......................................................................................................1
1.1 CÂY LÚA Ở VIỆT NAM .......................................................................................1
1.2 RƠM RẠ................................................................................................................2
1.2.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam................................................................................2
1.2.2 Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam ....................................3
1.3 BIOETHANOL TỪ RƠM RẠ................................................................................3
1.4 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................4
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................5
2.1 NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE .................................................................5
2.1.1 Cấu trúc lignocellulose .....................................................................................5
2.1.2 Cellulose ...........................................................................................................6
2.1.3 Hemicellulose ...................................................................................................8
2.1.4 Lignin .............................................................................................................10
2.1.5 Các chất trích ly..............................................................................................12
2.1.6 Tro ..................................................................................................................13
2.2 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RƠM RẠ ...........................................13
2.2.1 Tổng quát........................................................................................................13
2.2.2 Tiền xử lý........................................................................................................14
2.2.3 Thủy phân.......................................................................................................20
2.2.4 Lên men ..........................................................................................................33
2.2.5 Thủy phân và lên men đồng thời....................................................................38
2.3 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL VÀ ETHANOL NHIÊN LIỆU ....................................44
2.3.1 Biofuel ............................................................................................................44
2.3.2 Ethanol nhiên liệu...........................................................................................45
Chương 3 THỰC NGHIỆM ......................................................................................48
3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................................48
3.1.1 Rơm rạ ............................................................................................................48
3.1.2 Enzyme ...........................................................................................................48
3.1.3 Giống nấm men ..............................................................................................49
3.2 CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG .................................................................................49
3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG.....................................................................52
3.3.1 Phương pháp phân tích thành phần xơ sợi trong biomass – rơm rạ ...............52
3.3.2 Phương pháp đo nồng độ glucose và ethanol .................................................56
3.3.3 Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu...............................................63
iv

5. 3.3.4 Phương pháp nuôi cấy và đếm nấm men........................................................64
3.4 TRÌNH TỰ NGHIÊN CỨU.................................................................................66
3.4.1 Sơ đồ quy trình ...............................................................................................67
3.4.2 Quá trình nổ hơi – tiền xử lý rơm rạ...............................................................67
3.4.3 Quá trình thủy phân ........................................................................................68
3.4.4 Quá trình thủy phân và lên men đồng thời .....................................................69
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................71
4.1 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RƠM RẠ ..............................................................71
4.1.1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi.....................................................................71
4.1.2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi........................................................................72
4.1.3 So sánh rơm rạ trước và sau nổ hơi ................................................................72
4.1.4 Thành phần dịch nổ hơi. .................................................................................74
4.2 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN.................................................................................76
4.2.1 Thành phần dịch thủy phân ............................................................................76
4.2.2 Ảnh hưởng của phần trăm bã rắn ...................................................................77
4.2.3 Ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào..........................................................79
4.2.4 Ảnh hưởng của pH .........................................................................................84
4.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................................87
4.2.6 Hiệu suất thủy phân , nồng độ đường tạo thành theo thời gian......................92
4.3 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI ..................................94
4.3.1 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời .........................................94
4.3.2 Ảnh hưởng của lượng emzyme cho vào.........................................................95
4.3.3 Ảnh hưởng của mật độ nấm men ban đầu ......................................................98
4.3.4 Hiệu suất toàn quá trình theo thời gian ........................................................101
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................104
5.1 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN ...........................................................104
5.2 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI.............104
5.3 SO SÁNH HIỆU SUẤT TOÀN QUÁ TRÌNH CỦA THỦY PHÂN VỚI THỦY
PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI .............................................................................105
5.4 ĐỀ NGHỊ .........................................................................................................105
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................106
PHỤ LỤC ........................................................................................................................108
v

6. DANH MỤC HÌNH
Hình 1-1 Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng nông nghiệp .................................................1
Hình 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000.................................................3
Hình 2-1 Cấu trúc của lignocellulose ...................................................................................6
Hình 2-2 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc lignocellulose ..................6
Hình 2-3 Công thức hóa học của cellulose...........................................................................7
Hình 2-4 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain ........................................................7
Hình 2-5 Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan .......................................................................9
Hình 2-6 Glucomannan ........................................................................................................9
Hình 2-7 Galactoglucomannan.............................................................................................9
Hình 2-8 Arabinoglucuronoxylan.......................................................................................10
Hình 2-9 Các đơn vị cơ bản của lignin...............................................................................10
Hình 2-10 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính..................................11
Hình 2-11: Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin); (b) cathechin
(flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo).....................................................................13
Hình 2-12 Mô tả cơ chế quá trình nổ hơi ...........................................................................17
Hình 2-13 Fufural ...............................................................................................................18
Hình 2-14 Hydroxymethyl fufural......................................................................................18
Hình 2-15: Cấu trúc sợi trước và sau khi nổ hơi, bó sợi cellulose được giải phóng ra khỏi
lớp lignin bảo vệ sau khi nổ hơi .................................................................................19
Hình 2-16: (d) sợi lignocellulose không nổ hơi có cấu trúc sít chặt ngăn cản sự tấn công
của enzyme, (e) nổ hơi ở 4atm, (f) nổ hơi ở 8atm......................................................19
Hình 2-17 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase .......................................................21
Hình 2-18 Quá trình tác động của cellobiohydrolase lên đầu vùng kết tinh của cellulose.
....................................................................................................................................25
Hình 2-19 Cơ chế tác động hiệp đồng của enzyme exo-endo và endo-endo. Enzyme
endoglucanase tấn công ngẫu nhiên vào cellulose và tạo cơ chất thích hợp cho
enzyme exoglucanase và sau đó khuếch tán nhanh ra khỏi bề mặt. Exoglucanse có
thể tấn công từ đầu đường khử và không khử. ...........................................................26
Hình 2-20 Cơ chế quá trình thủy phân ...............................................................................27
Hình 2-21 Tốc độ phản ứng enzyme theo nhiệt độ ............................................................29
Hình 2-22 Ảnh hưởng của pH ............................................................................................30
Hình 2-23 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme.......................................................................30
Hình 2-24 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất .......................................................................31
vi

7. Hình 2-25 Chất kìm hãm cạnh tranh ..................................................................................32
Hình 2-26 Chất kìm hãm không cạnh tranh .......................................................................32
Hình 2-27: Quá trình đường phân ......................................................................................34
Hình 2-28 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm men..................................35
Hình 2-29: Giống nấm men Pichia stiptis và Saccharomyces cerevisiae...........................38
Hình 2-30 Nồng độ glucose (ô vuông không màu) và celllobiose (ô vuông màu đen) theo
thời gian của quá trình thủy phân và lên men đồng thời. ...........................................41
Hình 2-31 Nồng độ ethanol theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời.
....................................................................................................................................42
Hình 3-1 Rơm chưa nổ hơi .................................................................................................48
Hình 3-2 Saccharomyces serevisiae chủng turbo yeast extra nhìn dưới kính hiển vi........49
Hình 3-3 Thiết bị nổ hơi quy mô pilot................................................................................50
Hình 3-4 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)..............................................................50
Hình 3-5 Hình dạng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi.............................................51
Hình 3-6 Buồng đếm hồng cầu...........................................................................................51
Hình 3-7 Bộ dụng cụ soxhlet..............................................................................................54
Hình 3-8 Hệ thống phân tích NDS và ADS .......................................................................54
Hình 3-9 Grooch Crucible ..................................................................................................54
Hình 3-10 Đường chuẩn glucose........................................................................................60
Hình 3-11 Đường chuẩn ethanol ........................................................................................61
Hình 3-12 Đường chuẩn cellobiose....................................................................................62
Hình 3-13 Bộ dụng cụ thủy phân và lên men đồng thời ....................................................70
Hình 4-1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi .........................................................................71
Hình 4-2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi. ...........................................................................72
Hình 4-3 So sánh kết quả các thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi...............................73
Hình 4-4 Rơm trước nổ hơi ................................................................................................74
Hình 4-5 Rơm sau nổ hơi ...................................................................................................74
Hình 4-6 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất thu được theo % bã rắn cho vào .......78
Hình 4-7 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian tương ứng với các % enzyme khác
nhau ............................................................................................................................80
Hình 4-8 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với các % enzyme .................81
Hình 4-9 Nồng độ glucose, cellobiose thu được và hiệu suất theo % enzyme ..................82
Hình 4-10 Tốc độ phản ứng ban đầu theo % enzyme cho vào...........................................83
Hình 4-11 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị pH khác nhau ...85
Hình 4-12 Hiệu suất, nồng độ glucose và nồng độ cellobiose theo pH dung dịch ............86
vii

8. Hình 4-13 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ: nhiệt độ
phòng khác nhau.........................................................................................................88
Hình 4-14 Nồng độ cellobiose theo thời gian ứng với các điều kiện nhiệt độ khác nhau. 89
Hình 4-15 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất tại 24 giờ theo nhiệt độ.......................90
Hình 4-16 Tốc độ phản ứng ban đầu theo nhiệt độ. ...........................................................91
Hình 4-17 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian. .................................93
Hình 4-18 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo % enzyme, tại 24 giờ...................96
Hình 4-19 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo % enzyme cho vào tại
48 giờ ..........................................................................................................................97
Hình 4-20 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men cho vào tại 24
giờ ...............................................................................................................................99
Hình 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men
cho vào tại 48 giờ .....................................................................................................100
Hình 4-22 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình
thủy phân và lên men đồng thời. ..............................................................................102
viii

9. DANH MỤC BẢNG
Bảng 1-1 Cơ cấu giá trị sản lượng nông ngư nghiệp Việt Nam năm 2002 [7] ...................1
Bảng 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [8]...........................................2
Bảng 2-1 Thành phần của vài loại lignocellulose theo [10].................................................5
Bảng 2-2 Các thông số vận hành và kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời
được thực hiện trên nhiều nước[9] .............................................................................39
Bảng 2-3 Ảnh hưởng của ethanol, glucose và cellobiose lên enzyme cellulase và β-
glucosidase..................................................................................................................39
Bảng 2-4 Kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời tiến hành với rơm đã qua tiền
xử lý bằng acid loãng, quá trình được tiến hành trong điều kiện kỵ khí....................40
Bảng 2-5 Ảnh hưởng của việc thêm các thành phần mới vào dịch thủy phân và lên men
đồng thời lúc 80 giờ....................................................................................................43
Bảng 3-1 Thành phần dung dịch NDS ...............................................................................52
Bảng 3-2 Kết quả chạy chuẩn.............................................................................................58
Bảng 3-3 Kết quả chuẩn glucose ........................................................................................59
Bảng 3-4 Kết quả cho chuẩn ethanol.................................................................................60
Bảng 3-5 Kết quả chuẩn cellobiose ....................................................................................62
Bảng 3-6 Thành phần môi trường Hansen dùng cho việc nuôi cấy, bảo quản gống nấm
men. ............................................................................................................................64
Bảng 3-7 Thành phần chất dinh dưỡng bổ sung cho dung dịch thủy phân và lên men đồng
thời..............................................................................................................................69
Bảng 4-1 Thành phần rơm rạ khô trước nổ hơi..................................................................71
Bảng 4-2 Thành phần rơm rạ theo Hồ Sĩ Tráng [3] ...........................................................71
Bảng 4-3 Thành phần rơm rạ khô sau nổ hơi .....................................................................72
Bảng 4-4 So sánh thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi .................................................72
Bảng 4-5 Thành phần dịch nổ hơi ......................................................................................74
Bảng 4-6 Thành phần dịch thủy phân.................................................................................76
Bảng 4-7 Kết quả ảnh hưởng của phần trăm bã rắn ...........................................................77
Bảng 4-8 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau ...................79
Bảng 4-9 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với % enzyme khác nhau......80
Bảng 4-10 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau
....................................................................................................................................81
Bảng 4-11 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu theo lượng enzyme
cho vào........................................................................................................................82
ix

10. Bảng 4-12 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau.....84
Bảng 4-13 Hiệu suất thủy phân theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau 85
Bảng 4-14 Hiệu suất và nồng độ glucose, cellobiose theo pH dung dịch ..........................86
Bảng 4-15 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ khác
nhau. ...........................................................................................................................87
Bảng 4-16 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian tương ứng các chế độ nhiệt độ
khác nhau....................................................................................................................88
Bảng 4-17 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian tương ứng các nhiệt độ khác nhau
....................................................................................................................................89
Bảng 4-18 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu đạt được theo nhiệt
độ ................................................................................................................................90
Bảng 4-19 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian..................................92
Bảng 4-20 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời............................................94
Bảng 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất toàn quá trình theo %
enzyme cho vào tại 24 giờ và 48 giờ..........................................................................96
Bảng 4-22 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo mật độ nấm men cho
vào ..............................................................................................................................99
Bảng 4-23 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình
thủy phân và lên men đồng thời ...............................................................................101
x

11. TÓM TẮT LUẬN VĂN
Rơm rạ chiếm tỉ lệ lớn trong các phụ phẩm nông nghiệp ở Việt Nam. Với thành
phần chứa hơn 40% là cellulose, rơm rạ là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản
xuất ethanol. Luận văn này nghiên cứu quá trình sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ và
được chia làm hai phần. Phần đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố :% bã rắn, %
enzyme, nhiệt độ, pH lên quá trình thuỷ phân và phần hai nghiên cứu quá trình thuỷ phân
và lên men đồng thời.
Rơm rạ được cắt nhỏ và được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi để phá vỡ cấu
trúc. Sau đó được tiến hành thuỷ phân bằng enzyme cellulase hoặc thuỷ phân và lên men
đồng thời bằng enzyme cellulase và nấm men saccharomyces cerevisiae chủng turbo
yeast extra.
Kết quả cho thấy rằng, quá trình thuỷ phân diễn ra tốt nhất trong điều kiện: 11% bã
rắn, 5% enzyme, 50oC và pH 4,8, tương ứng nồng độ glucose thu được là 55,08g/l và hiệu
suất đạt 81%.
Quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời đạt được kết quả tốt ở 11% bã rắn, 5%
enzyme, 23,6 triệu tế bào nấm men/ml, 50oC và pH 4,8. quá trình này thu được 30,86g/l
ethanol tương ứng hiệu suất là 86,61%. Kết quả này cho thấy quá trình thuỷ phân và lên
men đồng thời rất thích hợp cho việc sản xuất ethanol từ rơm rạ.
xi

12. ABSTRACT
In Viet Nam, rice straw composes the main portion in agricultural byproducts.
Containing above 40% of cellulose, rice straw is such a potential feedstock for ethanol
production. This thesis does research on producing ethanol form rice straw and can be
divided into 2 parts. The first part studies the effects of the dry solid concentration,
enzyme loading, temperature and pH on the saccharification. The second part explores the
simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process.
Rice straw was pretreated by steam explosion method in order to be more accessible
to enzyme. Then, the residue was introduced to hydrolyzed step or to SSF step. These
steps were taken place during 2 to 3 days. The former utilized enzyme cellulase to
hydrolyze cellulose in rice straw. In the latter, both the yeast saccharomyces cerevisiae
and emzyme cellulase were employed.
The result indicated that the optimized condition for saccharification is 11% of dry
solid, 5% of enzyme, 50oC and pH 4,8. With this condition, 55,08 g/l glucose was formed
and the yield of 81% was obtained.
The experiments in SSF showed that the best condition for this process includes
11% of dry solid; 5% of enzyme; 23,6 million cell/ml; 37oC and pH 4,8. 30,86g/l ethanol
was formed with the yield of 86,61%. This result indicates that SSF is such a suitable
process for producing ethanol from rice straw.
xii

13. Chương 1: MỞ ĐẦU
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 CÂY LÚA Ở VIỆT NAM
Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt Nam. Hình ảnh
đất Việt thường được mô tả như là một chiếc đòn gánh khổng lồ với hai đầu là hai vựa
thóc lớn là Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH).
Khoảng 80% trong tổng số 11 triệu hộ nông dân tham gia sản xuất lúa gạo, chủ yếu đựa
vào phương thức canh tác thủ công truyền thống.
Bảng 1-1 Cơ cấu giá trị sản lượng nông ngư nghiệp Việt Nam năm 2002 [7]
GTSL Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng Nông-Lâm-Ngư nghiệp
Nông-
Nông nghiệp Lâm Ngư
Lâm-Ngư
Tổng số Các nguồn nghiệp nghiệp
(tỉ đồng) Lúa
khác
Cả nước 154478 78,3 38,0 40,3 3,9 17,8
ĐBSH 24415 91,6 46,3 45,3 1,0 7,4
ĐBSCL 59663 69,9 53,5 16,4 2,1 18,5
Tæ leä % trong toång giaù trò saûn löôïng noâng
nghieäp
Ngư nghiệp
Cây lúa
18%
38%
Lâm nghiệp
4%
Các nguồn
khác
40%
Hình 1-1 Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng nông nghiệp
1

14. Chương 1: MỞ ĐẦU
Ghi chú: Các nguồn khác: % giá trị sản lượng của cây hoa màu lương thực, rau đậu,
cây ăn quả, cây công nghiệp, chăn nuôi và dịch vụ nông nghiệp.
Bảng số liệu và đồ thị trên cho ta thấy vai trò quan trọng của cây lúa chiếm 38%
trong tổng giá trị sản lượng nông – lâm - ngư nghiệp cả nước.
1.2 RƠM RẠ
Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một lượng lớn phế phẩm từ cây lúa bao gồm rơm và
trấu. Rơm và trấu là hai trong số nhiều nguồn biomass phổ biến và có nhiều tiềm năng ở
Việt Nam.
1.2.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam
Rơm rạ chiếm một phần rất lớn trong các nguồn biomass ở Việt Nam.
Bảng 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [8]
Năng lượng chứa
STT Biomass Lượng (triệu tấn) Phần trăm(%)
đựng (GJ)
Gỗ thải từ nhà
1 3,1 35,960 2,6
máy cưa
2 Gỗ đốt 12,4 186,000 13,4
3 Rác thải rắn 0,015 57 0
4 Rơm 61,9 866,600 62,6
5 Trấu 5,6 63,840 4,6
6 Vỏ bắp 4,8 60,000 1,3
7 Bã khoai mì 0,6 7,500 0,5
8 Phế phẩm cây mía 1,5 18,750 1,4
9 Bã mía 5,0 36,050 2,6
10 Vỏ đậu 0,1 1,250 0,1
11 Xơ và lá dừa 5,8 104,400 7,5
12 Vỏ hạt cafe 0,3 4,670 0,3
Tổng 101,1 1,385,077 100
2

15. Chương 1: MỞ ĐẦU
goã thaûi töø nhaø
Caùc nguoàn biomass chính ôû Vieät Nam naêm 2000 maùy cöa
goã ñoát
raùc thaûi raén
rôm
traáu
4.6 voû baép
baõ khoai mì
Pheá phaåm
caây mía
baõ mía
voû ñaäu
62.6
xô vaø laù döøa
voû haït cafe
Hình 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000
Bảng số liệu và đồ thị trên cho thấy vị trí và tiềm năng rất lớn của rơm trong viêc sử
dụng làm nguồn nguyên liệu. Rơm chiếm 62,6% trong tổng khối lượng biomass ở Việt
Nam năm 2000 với lượng năng lượng chứa đựng là 866.600 GJ. Rơm hứa hẹn là một
nguồn năng lượng lớn cho nước ta.
1.2.2 Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam
Mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn, rơm rạ nói riêng và từ biomass nói
chung không dược sử dụng một cách hiệu quả ở Việt Nam. Phần lớn rơm rạ được bón trở
lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà nông, làm thức ăn cho
gia súc …
Theo [8], biomass chỉ chiếm 3,8% trong tổng năng lượng sử dụng của thành phố Hồ
Chí Minh năm 2003, trong khi đó, nguồn năng lượng này chiếm 89% trong tổng năng
lượng sử dụng ở nông thôn năm 2001. Ở nông thôn, biomass chủ yếu được dùng làm chất
đốt và hiệu suất sử dụng năng lượng của quá trình này chỉ được 10%.
1.3 BIOETHANOL TỪ RƠM RẠ
Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan
giải của bất cứ quốc gia nào trên thế giới. Mỹ và Brazil đã thành công trong việc sản xuất
3

16. Chương 1: MỞ ĐẦU
ethanol từ nguồn sinh học là bắp và mía. Điều này đã khích lệ các nước khác đầu tư
nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học.
Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol có thể
được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới.
Vì vậy sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giải pháp
thích hợp đặc biệt là với các quốc gia nông nghiệp như Việt Nam.
Nền nông nghiệp Việt Nam hằng năm tạo ra một lượng lớn phế phẩm nông nghiệp,
chủ yếu là lignocellulose từ các vụ mùa. Tận dụng nguồn nguyên liệu này, cụ thể là rơm
rạ để sản xuất bioethanol là phương pháp sử dụng rơm rạ một cách hiệu quả đồng thời
góp phần giải quyết vấn đề năng lượng cho nước ta.
1.4 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Mục đích chính của đề tài là nghiên cứu khả năng xử lý rơm rạ để lên men ethanol.
Các mục tiêu chính trong đề tài là:
• Nghiên cứu quá trình thủy phân rơm đã qua tiền xử lý nổ hơi bằng enzyme
cellulase, tạo ra dịch đường.
• Nghiên cứu quá trình thủy phân và lên men đồng thời để chuyển hóa cellulose
trong nguồn rơm rạ ban đầu thành ethanol.
Các nội dung chính cần phải thực hiện để đạt được mục tiêu trên:
Đối với quá trình thủy phân:
• Khảo sát ảnh hưởng của lượng bã rắn đối với quá trình thủy phân.
• Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào đối với quá trình thủy phân.
• Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đến quá trình thủy phân.
• Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân.
• Khảo sát nồng độ đường tạo thành theo thời gian.
Đối với quá trình thủy phân và lên men đồng thời
• Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme đến quá trình.
• Khảo sát ảnh hưởng của lượng nấm men cho vào lên quá trình.
• So sánh hiệu suất chuyển hóa quá trình thủy phân với quá trình thủy phân và lên
men đồng thời.
4

17. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE
Lignocellulose là vật liệu biomass phổ biến nhất trên trái đất. Lignocellulose có
trong phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu ở dạng phế phẩm của các vụ mùa; trong sản phẩm
phụ của công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy; có trong rác thải rắn của thành phố... Với
thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu to lớn cho việc sản
xuất bioethanol. Rơm rạ là một dạng vật liệu lignocellulose.
2.1.1 Cấu trúc lignocellulose
Thành phần chính của vật liệu lignocellulose là cellulose, hemicellulose, lignin, các
chất trích ly và tro.
Bảng 2-1 Thành phần của vài loại lignocellulose theo [10]
Hemicellulose Chất
Nguồn/% Cellulose Lignin
Xylane Mannan Galactan Arabianan trích ly
Gỗ vân sam 41,9 6,1 14,3 - 1,2 27,1 9,6
Gỗ thông 37,7 4,6 7,0 - - 27,5 10,8
Gỗ cây bulô 38,2 18,5 1,2 - - 22,8 4,8
Gỗ dương 49,9 17,4 4,7 1,2 1,8 18,1 -
Phế phẩm
36,4 18,0 0,6 1,0 3,0 16,6 7,3
cây bắp
Rơm lúa mì 38,2 21,2 0,3 2,5 23,4 13,0
Rơm lúa(*) 34 – 38 32 – 40 12
(*) theo Hồ Sĩ Tráng [3]
Theo [10 ] về cơ bản, trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được
bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như
lignin. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với
nhau. Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-
methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin.
5

18. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Hình 2-1 Cấu trúc của lignocellulose
Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi này được gắn lại với nhau nhờ
hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm. Các vi sợi này được
bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của ezyme
cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân. [9]
Hình 2-2 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc lignocellulose
2.1.2 Cellulose
Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose, các D-glucose được liên kết
với nhau bằng liên kết β 1-4 glucosid. Cellulose là loại polymer phổ biến nhất trên trái đất,
độ trùng hợp đạt được 3.500 – 10.000 DP [9]. Các nhóm OH ở hai đầu mạch có tính chất
6

19. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 có tính khử, trong khi đó OH tại C4 có
tính chất của rượu. [2]
Hình 2-3 Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der
Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình. Trong vùng kết tinh,
các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme
cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với
nhau nên dễ bị tấn công [9]. Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả
vùng kết tinh và vô định hình. [10]
Hình 2-4 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain
1/ Kiểu Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo
chìều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình.
7

20. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2/ Kiểu Folding chain: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại
có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình vẽ. Các đơn vị
đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy
phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết
tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị
thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay
đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định hình sẽ dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân
hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glucosid) sẽ
làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết
hydro. [4]
Cellulose được bao bọc bởi hemicellulos và lignin, điều này làm cho cellulose khá
bền vững với tác động của enzyme cũng như hóa chất.
2.1.3 Hemicellulose
Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70
đến 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường 6 gồm glucose, mannose và galactose và
đường 5 gồm xylose và arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β - D
xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -(1,4).
Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên
có một vài điểm chung gồm:
• Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4).
• Xylose là thành phần quan trọng nhất.
• Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3.
• Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc
trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với
lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn
tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân.
Gỗ cứng, gỗ mềm và nguyên liệu phi gỗ có các đặc điểm hemicellulose khác nhau:
Gỗ cứng chủ yếu có hai loại hemicellulose:
• Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan, là một loại polymer có mạch chính gồm β-D-
xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D (1,4). Trong đó 70% các nhóm
OH ở vị trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết với acid 4-
8

21. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
O-methyl-D-glucuronic. Gỗ cứng còn chứa glucomannan, polymer này chứa một tỉ
lệ bằng nhau β-D-glucopyranose và β-D-mannopyranose. [9]
Hình 2-5 Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan
Hình 2-6 Glucomannan
• Loại thứ hai có mạch chính là β-D-galactopyranose, phân nhánh. Loại
hemicellulose này tạo liên kết –O tại nhóm OH ở vị trí C6 với α-L-arabinose, β-D-
galactose hoặc acid β-D-glucoronic. [9]
Gỗ mềm cũng bao gồm hai loại hemicellulose chính:
• Loại quan trọng nhất là galactoglucomannan, đây là polymer cấu thành từ các
phân tử D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-(1,4) với tỉ
lệ hai monomer tương ứng là 3:1. Tuy nhiên, tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại gỗ[9].
Hình 2-7 Galactoglucomannan
9

22. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• Arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các
monomer này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng α-
L-arabinofuranose. [9]
Đối với cỏ, 20 – 40% hemicellulose là arabinoxylan. Polysaccharide này cấu tạo từ
các D-xylopyranose, OH ở C2 bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic. OH ở vị trí C3 sẽ
tạo mạch nhánh với α-L-arabinofuranose. [9]
Hình 2-8 Arabinoglucuronoxylan
Cấu tạo phức tạp của hemicellolose tạo nên nhiều tính chất hóa sinh và lý sinh cho
cây.
2.1.4 Lignin
Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai
trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và
hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn.
Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc
điển hình được đề nghị là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringly (S),
chất gốc là rượu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p-courmary.
Hình 2-9 Các đơn vị cơ bản của lignin
10

23. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó
trong gỗ. Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể
được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringly lignin.
Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Nghiên cứu chỉ
ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ
khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin. [10]
Hình 2-10 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính
Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu
trúc. Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn
hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao hơn không có vùng vô định hình. Các
vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào.
Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi
mạng polysaccharide. Việc mô hình hóa động học phân tử cho thấy rằng nhóm hydroxyl
11

24. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
và nhóm methoxyl trong các oligomer tiền lignin sẽ tương tác với vi sợi cellulose cho dù
bản chất của lignin là kỵ nước.
Nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin là nhóm phenolic hydroxyl tự do,
methoxy, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu thẳng và nhóm carbonyl.
Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringyl.
Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả với cellulose
(không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và
cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết [4]. Carbon alpha
(Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối
hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid
4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên kết có thể là ether,
ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoxit (phản ứng giữa
nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin)
Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH
thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn
200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose. Những
nghiên cứu trước đây cho thấy đối với gỗ cứng, nhóm ether β-O-4 aryl bị phá trong quá
trình nổ hơi. Đồng thời, đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt các nhóm hoạt
động của lignin ở vị trí α như nhóm hydroxyl hay ether, các nhóm này bị oxy hóa thành
carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết C-C.[10]
2.1.5 Các chất trích ly
Có rất nhiều chất thuộc nhóm thành phần này, chủ yếu là các chất dễ hòa tan. Theo
định nghĩa khái quát trong sách “Kĩ thuật cellulose và giấy” ở trang 64, các chất trích ly là
những chất hoặc có khả năng hòa tan trong những dung môi hữu cơ (như dietyl ether,
methyl terbutyl ether, ether dầu hỏa, diclormethene, acetone, ethanol, methanol, hexan,
toluen, terahydrofuran) hoặc trong nước. Chính vì thế phương pháp thông dụng nhất để
tách nhóm chất này trong việc phân tích thành phần sơ xợi lignocellulose là dùng trích ly
với dung môi ethanol-benzene tỉ lệ 1:2. Những chất này có thể có cả tính ưa dầu và ưa
nước và không được xem là thành phần cấu trúc của gỗ. Chất nhựa là những chất ưa dầu,
có lẽ thường chiếm tỉ lệ ưu thế trong chất trích ly, nên thường chất trích ly hay được gọi là
nhựa (resin).
Các chất trích ly thường có màu, mùi và vị khá đặc trưng. Chúng rất quan trọng để
giữ lại những chức năng sinh học của cây. Đa phần các chất nhựa bảo vệ gỗ khỏi những
12

25. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
tổn thương gây ra bởi vi sinh vật hay côn trùng. Terpenoid, steroid, chất béo, và những
phần tử phenolic như stilbene, lignan, tanmin và flavonoid đều là những chất trích ly. Các
phenolic có thuộc tính diệt nấm và ảnh hưởng đến màu của gỗ. Chất béo và sáp, trong
nhiều hệ thống sinh học được tận dụng như là nguồn năng lượng trong khi terpenoid và
steroid được biết đến là nhựa dầu. Nhóm cuối cùng cũng có hoạt tính kháng vi sinh vật và
côn trùng. Một số chất trích ly là những dược phẩm quan trọng. Ví dụ, flavonoid được sử
dụng như là chất chống tác nhân oxy hóa và chống virus. Một số cấu trúc chất trích ly
được thể hiện ở những hình sau:
Hình 2-11: Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin); (b) cathechin
(flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo)
2.1.6 Tro
Trong các loại gỗ của xứ ôn đới, các nguyên tố khác so với carbon, hydro, oxy và
nito – chiếm khoảng 0,1-0,5% (so với lượng rắn khô trong gỗ). Với loại gỗ xứ nhiệt đới
con số này có thể là 5%. Hàm lượng chất vô cơ được đo bằng hàm lượng tro của mẫu và
nó trong khoảng 0,3-1,5% cho hai loại gỗ mềm và gỗ cứng. Hàm lượng này phụ thuộc
nhiều vào điều kiện môi trường tăng trưởng của cây và vào vị trí trong cây.
Tương tự chất trích ly, thành phần vô cơ của biomass thường thực hiện chức năng
trong một vài con đường sinh học ở thực vật. Kim loại vết thường tồn tại ở dạng phức hợp
như magnesium trong chlorophyll. Một số chất vô cơ từ muối kim loại tồn tại trong vách
tế bào thực vật. Calcium thường là kim loại phong phú nhất, sau đó là kali và magnesium.
2.2 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RƠM RẠ
2.2.1 Tổng quát
Sơ đồ quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ
13

26. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Rơm rạ
Tiền xử lý
Thủy phân
Thủy phân và lên men
Lên men đồng thời
Chưng cất
Ethanol
2.2.2 Tiền xử lý
Để chuyển hóa các carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose
thành ethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi
vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa. Tuy nhiên, bản chất của cellulose lại là
rất bền vững trước sự tấn công của enzyme, nên bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình
đường hóa glucose có thể diễn ra tốt. Cellulose ban đầu có thể bị phá hủy bởi acid mà
không cần được tiền xử lý. Tuy nhiên, trong luận văn này chỉ đề cập đến việc thủy phân
lignocellulose bằng enzyme.
Những yếu tố về cấu trúc và thành phần ảnh hưởng đến khả năng chống lại sự tấn
công của enzyme của lignocellulose gồm có:
• Cấu trúc tinh thể của cellulose: cellulose tự nhiên hình thành cấu trúc tinh thể
chống lại được sự tấn công của enzyme. Trong một bài báo của mình, Fan et al [9]
ước tính rằng tỉ lệ cellulose tinh thể là 50-90%. Tuy nhiên, không có sự liên quan
giữa mức độ tinh thể của cellulose và khả năng phân hủy enzyme đối với rơm rạ và
bã mía.
14

27. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• Sự bao bọc của lignin quanh cellulose: lignin cùng với hemicellulose tạo thành cấu
trúc mô vững chắc cực kì. Những mô được bền hóa với lignin tương tự như nhựa
được gia cố bằng sợi, trong đó lignin đóng vai trò kết dính những sợi cellulose.
Trong thiên nhiên, lignin bảo vệ cellulose khỏi những tác động của môi trường và
khí hậu. Lignin là yếu tố ngăn cản sự tấn công của enzyme đến cellulose được
công nhận nhiều nhất. Theo [9] có nhà nghiên cứu cho rằng khả năng thủy phân
của enzyme tăng khi 40-50% lignin bị tách. Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng, không
có nghiên cứu nào tiến hành loại bỏ lignin mà không kèm theo sự phân hủy
hemicellulose. Ngay cả trong phương pháp tiền xử lý nguyên liệu bằng kiềm ở
nhiệt độ thấp, loại bỏ được 70% lignin thì cũng có 5% hemicellulose bị hòa tan. Vì
vậy, những thí nghiệm trên cũng không hoàn toàn cho thấy ảnh hưởng của việc
loại bỏ lignin riêng lẻ.
• Bề mặt tiếp xúc tự do của cellulose: liên quan đến bề mặt tiếp xúc của cellulose với
enzyme, và thể tích xốp. Stone et al [9] giả thiết rằng tốc độ đầu của quá trình thủy
phân là hàm của bề mặt tiếp xúc tự do. Grethlein et al [9] cho rằng thể tích lỗ xốp
chứ không phải độ kết tinh của cellulose mới ảnh hưởng đến tốc độ đầu. Tuy nhiên,
bề mặt tiếp xúc tự do này có liên quan đến độ kết tinh và sự bảo vệ của lignin.
• Sự hiện diện của hemicellulose: cũng như lignin, hemicellulose tạo thành lớp bảo
vệ xung quanh cellulose. Knappert et al [9], trong nghiên cứu xử lý bằng acid
sulfuric với gỗ dương cho thấy khả năng thủy phân tăng theo tỉ lệ hemicellulose bị
loại bỏ. Grohman, thí nghiệm tiền xử lý rơm lúa mì bằng acid, kết quả cho thấy
việc loại bỏ hemicellulose sẽ gia tăng đáng kể khả năng thủy phân rơm rạ. Họ cho
rằng, việc loại bỏ lignin là không cần thiết, tuy rằng nếu đạt được thì rất tốt. Trong
khi đó, hemicellulose được chứng minh là ngăn cản quá trình tấn công của enzyme
vào rơm rạ [9]. Tuy nhiên, trong những thí nghiệm này, lignin tuy không bị loại bỏ
nhưng lại có thể bị đông hoặc chảy ra một phần, làm giảm khả năng bao bọc
cellulose của nó. Vì thế những thí nghiệm trên chưa cho thấy được hiệu quả của
việc loại bỏ riêng lẻ hemicellulose.
• Mức độ acetyl hóa của hemicelluloses: Đây là yếu tố ít được quan tâm, xylan, loại
hemicellulose chính trong gỗ cứng và cây thân cỏ bị acetyl hóa với tỉ lệ rất cao.
Grohmann et al [9], nghiên cứu với rơm lúa mì và cây dương, cho thấy rằng khi
xylan bị deacetyl hóa, tỉ lệ cellulose bị thủy phân tăng lên 2-3 lần. Ảnh hưởng này
tồn tại đến khoảng 75% hemicellulose bị deacetyl hóa.
Nói tóm lại, quá trình tiền xử lý nhằm:
15

28. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• Tăng vùng vô định hình của cellulose
• Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass
• Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose.
Sau đây là một số công nghệ tiền xử lý phổ biến:
2.2.2.1 Các phương pháp tiền xử lý hóa học:
Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình. Gồm có các quá trình chính:
• Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng, bơm hơi nước có acid và nổ
hơi có acid. Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất, hiển nhiên
vì nó rẻ và hiệu quả. Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong xử lý acid là thiết bị phải
chịu được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung
hòa acid với CaOH.
• Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan, chủ yếu là về xút hoặc xút cùng
các hóa chất khác. Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hóa
chất, thì vôi tôi là hóa chất thích hợp. Detroy et al cho thấy rằng amonia lỏng có
phần hiệu quả trong việc tăng khả năng thủy phân bã rắn, nhưng ethylenediamine
có thể còn hiệu quả hơn.
• Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung
môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2,
NH3 … Các quy trình này hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm.
2.2.2.2 Các phương pháp tiền xử lý cơ học
Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý.
Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy
nhiệt và nổ hơi. Trong đó phương pháp nổ hơi là phương pháp quan trọng nhất, đã được
phát triển, áp dụng trên quy mô pilot và được sử dụng trong đề tài nghiên cứu này.
2.2.2.3 Nổ hơi nước (Steam explosion)
Nổ hơi nước được phát triển vào năm 1925 bởi W. H. Mason trong sản xuất gỗ
ép[1]. Tiền xử lý biomass bằng nổ hơi nước được giới thiệu từ năm 1980[1]. Công ty
Iotech Corporation đã tiến hành một vài thí nghiệm tiên phong để tìm hiểu ảnh hưởng của
nổ hơi nước lên gỗ cây dương[1]. Iotech đã báo cáo lên bộ năng lượng Mỹ trong đó mô tả
ảnh hưởng của thời gian phản ứng và áp suất lên sản lượng xylose và glucose. Iotech cho
rằng ở một áp suất nhất định, với thời gian lưu khác nhau sản lượng cực đại của glucose
16

29. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
và xylose cũng khác nhau, và xylose thường đạt cực đại trước glucose. Tương tự như vậy,
sản lượng cực đại của xylose và glucose được tìm thấy lớn nhất ở những áp suất khác
nhau. Điều kiện phản ứng tối ưu của holocellulose (xylose + glucose) là 500 – 550 psi
trong thời gian 40 giây.[1]
Đã có vài nghiên cứu ứng dụng nổ hơi cho các loại nguyên liệu biomass sau khi
báo cáo của Iotech được trình bày. Shultz et al [1] so sánh hiệu quả của nổ hơi lên hỗn
hợp các mảnh gỗ cứng, vỏ trấu, rơm bắp, và bã mía. Nổ hơi ở 240 – 2500C và 1 phút sẽ
làm gia tăng tốc độ thủy phân enzyme của các mảnh gỗ cứng, vỏ trấu, và bã mía lên
ngang bằng với tốc độ thủy phân giấy lọc. Nghiên cứu cũng tìm thấy không có sự khác
nhau về tốc độ thủy phân của mẫu đã trữ trong 8 tháng trước với tốc độ thủy phân của
mẫu được trữ trong thời gian ngắn hơn.
Martinez et al [1] sử dụng Onopordum nervosum và Cyanara cardunculus làm
nguyên liệu. Hiệu quả đường hóa (lượng glucose giải phóng ra sau 48 giờ thủy phân
enzyme/lượng glucose cực đại trên cơ chất) đạt được trên 90% đối với O. nervosum ở
2300C, 1 – 2 phút và C. cardunculus ở 2100C, 2 – 4 phút.
Theo luận văn cao học của thầy Trịnh Hoài Thanh [6], thời gian xử lý và nhiệt độ
xử lý đối với rơm rạ càng tăng thì lượng bã thu hồi được càng giảm. Khi xem xét ảnh
hưởng của nhiệt độ xử lý đối với lượng đường có khả năng lên men, nhiệt độ xử lý ở mức
độ vừa phải sẽ làm tăng khả năng thủy phân, tăng lượng đường và do đó sẽ làm tăng
lượng cồn thu được. Điều này có thể được giải thích là do sự đề – lignin hóa do tác động
của nhiệt độ và sự phân hủy của hemicellulose làm giải phóng và gia tăng kích thước lỗ
xốp. Tuy nhiên khi nhiệt độ xử lý cao hơn 210oC, lượng đường thu được do thủy phân có
xu hướng giảm xuống vì cellulose bị phân hủy. Theo [6], khi thời gian xử lý tăng thì
lượng đường có khả năng lên men được tăng do khả năng tấn công vào cellulose đã được
cải thiện.
Cơ chế quá trình nổ hơi nước
Hình 2-12 Mô tả cơ chế quá trình nổ hơi
17

30. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Quá trình nổ hơi nước là một quá trình cơ – hóa – nhiệt. Đó là phá vỡ cấu trúc các
hợp phần với sự giúp đỡ của nhiệt ở dạng hơi (nhiệt), lực cắt do sự giãn nở của ẩm (cơ),
và thủy phân các liên kết glycosidic (hóa).
Trong thiết bị phản ứng, nước dưới áp suất cao thâm nhập vào cấu trúc
lignocellulosic bởi quá trình khuếch tán và làm ẩm nguyên liệu. Ẩm trong biomass thủy
phân các nhóm acetyl của hemicellulose hình thành nên các acid hữu cơ như acetic và
uronic acid. Các acid này lần lượt xúc tác quá trình depolymer hóa hemicellulose, giải
phóng xylan và một phần glucan. Dưới điều kiện khắc nghiệt, vùng vô định hình của
cellulose có thể bị thủy phân đến một mức độ nào đó. Dưới điều kiện khắc nghiệt hơn, ví
dụ như nhiệt độ cao và áp suất cao, có thể thúc đẩy sự phân hủy xylose thành furfural và
glucose thành 5-hydroxymethyl furfural. Furfural và 5-hydroxylmethyl furfural kìm hãm
sự phát triển của vi sinh vật, do đó nó không thuận lợi cho quá trình lên men [12].
Hình 2-13 Fufural Hình 2-14 Hydroxymethyl fufural
Ẩm trong biomass sẽ hóa hơi đột ngột ra khi áp suất trong thiết bị phản ứng được
giải phóng và hạ đột ngột từ rất cao khoảng vài chục atm xuống còn áp suất khí trời. Hiện
tượng này cũng giống như hiện tượng nổ. Nguyên liệu được tống mạnh khỏi thiết bị qua
một lỗ nhỏ bởi lực ép. Một vài hiện tượng xảy ra tại thời điểm này. Đầu tiên, ẩm ngưng tụ
trong cấu trúc biomass bốc hơi tức thời do giảm áp đột ngột. Sự giãn nở của hơi nước gây
ra lực cắt bao quanh cấu trúc nguyên liệu. Nếu lực cắt này đủ lớn, hơi nước sẽ gây ra sự
phá hủy cơ học lên cấu trúc lignocellulosic. Hình 2-14 mô tả cơ chế quá trình nổ hơi.
Hình 2-15 mô tả sự giải phóng cellulose khỏi vỏ bọc lignin. Hình 2-16 mô tả khả năng
làm tăng kích thước lỗ xốp trong xơ sợi. Sự mô tả quá trình làm nổi bật tầm quan trọng
của việc tối ưu hai yếu tố: thời gian lưu và nhiệt độ. Thời gian biomass lưu lại trong thiết
bị phản ứng giúp xác định phạm vi thủy phân hemicellulose bởi các acid hữu cơ. Việc
thủy phân hemicellulose giúp cho quá trình lên men thuận lợi hơn. Tuy nhiên, thời gian
lưu dài cũng làm gia tăng sự phân hủy sản phẩm.
18

31. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Hình 2-15: Cấu trúc sợi trước và sau khi nổ hơi, bó sợi cellulose được giải phóng ra khỏi
lớp lignin bảo vệ sau khi nổ hơi
Hình 2-16: (d) sợi lignocellulose không nổ hơi có cấu trúc sít chặt ngăn cản sự tấn công
của enzyme, (e) nổ hơi ở 4atm, (f) nổ hơi ở 8atm
Nhiệt độ có liên quan đến áp suất hơi trong thiết bị phản ứng. Nhiệt độ càng cao thì
áp suất càng cao, do đó càng làm gia tăng sự khác nhau giữa áp suất trong thiết bị phản
ứng so với áp suất khí quyển. Sự chênh lệch về áp suất tỷ lệ với lực cắt của ẩm hóa hơi.
Ưu nhược điểm của quá trình nổ hơi nước:
Tóm tắt lại, theo quá trình nổ hơi nước có mấy tác động sau lên cấu trúc nguyên
liệu lignocellulose
1. Tăng sự kết tinh của cellulose bằng cách thúc đẩy sự kết tinh của vùng vô
định hình.
2. Hemicellulose bị thủy phân trong quá trình nổ hơi.
3. Sự nổ hơi thúc đẩy việc khử lignin.
19

32. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cùng với việc gia tăng kích thước lỗ xốp, tác động (2) và (3) là 3 ưu điểm của quá
trình nổ hơi. Tuy nhiên, tác động (1) lại gây ra khó khăn cho quá trình thủy phân. Ngoài
ra những nhược điểm chính của quá trình nổ hơi là:
• Tốn chi phí, năng lượng vận hành.
• Đòi hỏi thiết bị chịu được nhiệt độ, áp suất rất cao.
• Có thể làm phân hủy cellulose.
• Mất đi đường từ hemicellulose.
• Làm sinh ra fufural và 5-hydroxymethyl fufural gây ức chế quá trình lên men [12]
2.2.3 Thủy phân
Phương trình phản ứng
(C 6 H 10 O5 ) n + nH 2 O ⎯enzyme → nC 6 H 12 O6
⎯ ⎯
2.2.3.1 Ezyme cellulase
a) Khái niệm
Cellulase là một loại enzyme, có thể được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh
vật đơn bào; có khả năng thủy phân cellulose và cả hemicellulose. Ký hiệu là EC 3.2.1.4
b) Yêu cầu đối với cellulase
Sự phát triển của quá trình chuyển hóa biomass – một nguồn nguyên liệu thô, ít giá
trị, thành ethanol thông qua quá trình lên men đặt ra yêu cầu một số bước đặc biệt là việc
sản xuất enzyme cellulase cần phải được tối ưu. Sản xuất cellulase quan trọng vì việc thủy
phân cellulose có hiệu quả cần một lượng lớn enzyme cellulase (1kg cellulase cho 50 kg
cellulose). Giá của enzyme này khá cao từ 0,3 đến 0,81 dollar/gam [9]. Quá trình sản xuất
cellulase gặp hai vấn đề chính: sự sinh trưởng và phát triển chậm của nấm mốc và quá
trình tách cellulase ra khỏi nấm mốc tốn rất nhiều thời gian. Để quá trình sản xuất ethanol
có thể được xây dựng với quy mô lớn, vấn đề được đặt ra là hoạt tính của enzyme
cellulase phải cao hơn loại enzyme đang được sản xuất từ nấm mốc. Hiện nay, yêu cầu cụ
thể đặt ra với enzyme là cellulase phải có giá thành rẻ, hoạt tính đặc hiệu cao, độ ổn định
cao, chịu được pH và nhiệt độ.
20

33. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
c) Nhóm enzyme cellulase
Mặc dù phổ biến trên trái đất, cellulose lại rất bền vững và khó bị phá vỡ vì cellulose
có độ kết tinh cao, không tan trong nước, có khả năng chống lại các quá trình depolymer
hóa. Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng hiệp
đồng của 3 enzyme khác nhau
• “Endo-1,4-β-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolases (EC
3.2.1.4), enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả tan và
không tan.
• “Exo -1,4-β-D-glucanases” bao gồm 1,4-β-D-glucan glucohydrolase (EC
3.2.1.74), enzyme này có tác dụng giải phóng D-glucose từ 1,4-β-D-glucan và thủy
phân chậm D-cellobiose; ngoài ra còn có enzyme 1,4-β-D-glucan
cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (CBH), enzyme này sẽ giải phóng cellobiose từ
1,4-β-glucan.
• “β-D-glucosidase” hay còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có
tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng như các olygomer
của glucose.
Hình 2-17 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase
21

34. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Nhóm enzyme endo và exo thường được gọi chung là enzyme cellulase, còn β-
glucosidase do có cấu trúc khác và cơ chế khác nên được tách thành nhóm riêng. Tuy
nhiên trong luận văn này, để tiện việc trình bày nên gọi chung nhóm 3 enzyme này là
cellulase.
d) Các nguồn sản xuất cellulase.
Người ta thống kê được có hơn 60 loại nấm mốc có khả năng tạo cellulase, gồm có
các loại chính là soft-rot, brown-rot và white-rot. Các loại nấm mốc thuộc nhóm cuối
cùng (white-rot) có thể phân hủy cả cellulose và lignin. Nhiều nghiên cứu vẫn đang được
tiến hành đối với việc sản xuất cellulase từ vi khuẩn. Gần đây, Coughlan và Ljungdahl
trong nghiên cứu của mình [9] đã tìm được 46 loại vi khuẩn có khả năng sản xuất
cellulase . Các vi khuẩn này có khả năng phân hủy cellulose cả trong điều kiện hiếu khí
và kỵ khí. Nhóm kỵ khí điển hình bao gồm các giống acetivibrio, bacteroides, clostridium,
micromonospora và ruminococcus. Nhóm hiếu khí bao gồm các giống Acidothermus,
Bacillus, cellulomonas, cellvibrio, cytophaga, Microbispora, Pseudomonas và
Thermomonospora.
e) Cấu trúc enzyme cellulase
Trong những năm 1970, nhờ những phát triển trong lĩnh vực hóa sinh và sinh học
phân tử, người ta có thể nghiên cứu được cấu trúc của cellulase thông qua giống nấm mốc
Trichoderma reesi. Đây là chủng nấm mốc phổ biến sản sinh ra enzyme cellulase.
Vào cuối những năm 1980, Abuja et al [17,18] đã đề nghị cấu trúc bậc 3 của
Trichoderma reesei CBH I (enzyme thủy phân cellobiose I – cellobiohydrolase I) và CBH
II. Trong đó, enzyme gồm:
• Trung tâm xúc tác (CD: catalytic domain) với kích thước lớn
• Trung tâm tạo liên kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) có kích
thước nhỏ hơn. Nghiên cứu cấu trúc của trung tâm tạo liên kết với cellulose CBD
của CBH I cho thấy đây là một chuỗi polypeptide gồm có 36 amino acid và có một
mặt thể hiện tính chất kỵ nước mạnh. Về mặt lý thuyết, có thể kết luận rằng CBD
có vai trò quan trọng trong việc ổn định sự liên kết tạm thời giữa cellulase và bề
mặt cellulose. Trên bề mặt cellulose có vùng kỵ nước là do sự sắp xếp chặt chẽ và
do liên kết hydrogen mạnh giữa các mạch cellulose, góp phần ngăn cản, không cho
các phân tử lớn như nước xâm nhập vào cấu trúc này. Chính tương tác giữa hai
22

35. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
vùng có tính chất kỵ nước của cellulose và CBD mà enzyme được liên kết với
cellulose.
• Cầu nối peptide: có tác dụng liên kết hai trung tâm này lại với nhau. Đối với
enzyme cellulase, cầu nối peptide là một vùng ái đường, được cấu tạo bởi các
amino acid serine, threonin và proline.
Serine Threonine Proline
Đối với T. reesei CBH II, lõi protein có tác dụng phá vỡ cấu trúc vi sợi của cellulose.
Sản phẩm thủy phân của CHB I giữ nguyên cấu trúc lập thể của C1(C chứa nhóm OH
hemiacetal), trong khi đó CBH II tạo sự nghịch đảo cấu hình của C1 thành đồng phân α.
Cellulase có nguồn gốc từ các giống nấm mốc khác cũng như từ vi khuẩn đều có cấu
trúc tương tự.
2.2.3.2 Cơ chế quá trình thủy phân
Quá trình tác dụng thủy phân của cellulase có thể chia thành những giai đoạn sau
a) Quá trình hấp phụ enzyme lên xơ sợi
Có hai yếu tố quyết định năng lượng hấp phụ của protein lên bề mặt phân pha
rắn/lỏng là bản chất của bề mặt và lực liên kết giữa các phân tử. Những tương tác này
thường không mang bản chất cộng hóa trị, nói cách khác, các tương tác này thường tạo
thành do liên kết hydro, lực tĩnh điện hoặc là tương tác giữa các nhóm kỵ nước. Các phân
tử protein hay các ion khối lượng phân tử thấp đã hấp phụ trước trên bề mặt sẽ có ảnh
hưởng đến sự hấp phụ mới. Lực tĩnh điện góp phần vào việc hấp phụ của protein (enzyme)
lên bề mặt phân pha, tuy nhiên không phải là yếu tố quyết định quá trình hấp phụ của
protein.
Protein là một polymer lưỡng cực, chứa cả điện tích dương và âm, điều này làm cho
protein có bản chất của một phân tử hoạt động bề mặt. Phần kỵ nước trong phân tử
protein là những nhóm chứa nhân thơm như trong tryptophane, phenylalanine và tyrosine.
23

36. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Thông thường, khi phân tử protein bị gấp khúc, các aminoacid mang nhóm kỵ nước sẽ
được giấu vào bên trong. Tuy nhiên, cũng có một vài phần kỵ nước được sắp xếp tại bề
mặt ngoài của phân tử protein. Chính các phần này tạo liên kết với các cơ chất mang bản
chất kỵ nước nhờ vào tương tác giữa các phần kỵ nước và liên kết hydro. Ái lực của
protein sẽ tăng khi bản chất kỵ nước trong phân tử protein tăng mặc dù điều này sẽ ảnh
hưởng tới tương tác tĩnh điện. Một cách tổng quát, sự hấp phụ của phân tử protein lên bề
mặt kỵ nước là bất thuận nghịch hơn sự hấp phụ lên bề mặt ưa nước. Điều này bởi vì phân
tử protein sẽ có một vài thay đổi một khi đã hấp phụ lên bề mặt kỵ nước.
Bề mặt cellulose mang bản chất kỵ nước do giữa các mạch tạo liên kết hydro (không
còn nhóm phân cực tự do). Cellulose tinh khiết không chứa nhóm mang điện. Trong thực
tế, điện tích bề mặt của các chất sẽ được tạo thành khi có sự phân bố các ion từ bề mặt đó.
Ví dụ các bề mặt tiếp xúc với nước thường mang điện âm. Các nghiên cứu về quá trình
tiền xử lý – nổ hơi cho thấy sau quá trình này, tính chất kỵ nước của cơ chất (được đo
bằng thời gian giọt nước thấm vào vật liệu Water drop penetration time WDPT) tăng.
Tùy thuộc vào tính chất của protein và bề mặt hấp phụ mà tương tác điện tích – địên
tích hay tương tác của các nhóm kỵ nước sẽ đóng vai trò quyết định cho quá trình . Ví dụ
trong một nghiên cứu về enzyme protease, khi thay đổi một nhóm ưa nước mang điện tích
dương - lysine bằng một amino acid kỵ nước, không mang điện – phenylalanine, người ta
nhận thấy khả năng hấp phụ của enzyme này lên bề mặt ưa nước cũng như kỵ nước đều
giảm. Điều này cho phép kết luận, trong trường hợp của protease, lực tương tác tĩnh điện
có tác dụng chủ yếu đối với quá trình hấp phụ của enzyme.
Điện tích của cellulase và sự hiện diện của nhóm không phân cực có thể dẫn đến sự
hấp phụ không chọn lọc lên cả cellulose và lignin. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng,
cellulase hấp phụ lên cả lignin trong vật liệu lignocellulose. Ngoài ra, đối với β-
glucosidase không giống các enzyme cellulase khác, không có trung tâm tạo liên kết CBD,
enzyme này hấp phụ khá mạnh lên lignin đã được tách riêng.
Rất cần thiết hạn chế tối đa việc hấp phụ không chọn lọc của cellulase lên lignin nếu
muốn ứng dụng quá trình thủy phân enzyme một cách kinh tế. Về mặt lý thuyết, công
nghệ protein có thể làm thay đổi cấu trúc của cellulase để làm cho enzyme này hấp phụ
chọn lọc hơn. Tuy nhiên, khả năng hấp phụ của cellulase lên vùng cellulose kết tinh là
yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân, vì vậy các tác động lên cấu trúc cần được
tránh. Hiện tại, vẫn chưa có nghiên cứu nào thành công trong việc thay đổi chuỗi amino
acid của cellulase để làm cho enzyme này thủy phân vật liệu lignocellulose hiệu quả hơn.
24

37. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
b) Quá trình tạo liên kết giữa cellulase và cellulose
Hình 2-18 Quá trình tác động của cellobiohydrolase lên đầu vùng kết tinh của cellulose.
Hình 2-18 mô tả liên kết của CBH với cellulose. Trung tâm tạo liên kết của cellulase
làm phá hủy một phần cấu trúc chặt chẽ của các mạch cellulose. Sau đó, các mạch này sẽ
được dẫn vào vùng trung tâm hoạt động của cellulase. Quá trình dẫn này xảy ra nhờ sự
hiện diện của mạch peptide ưa nước, khu vực này sẽ tạo các liên kết hydro bao bọc sợi
cellulose, nhằm tránh sự xâm nhập quá sâu của CBD vào bề mặt cellulose.
Cellulase tương tác với bề mặt cellulose thông qua trung tâm liên kết cellulose CBD
và trung tâm hoạt động chính CD. Cellulase tạo được liên kết với cellulose là nhờ vào
trung tâm tạo liên kết CBD. Đối với các chủng T. reesi, CBD là trung tâm gồm các phân
tử nhỏ, gồm 36 amino acid. Thông thường, trung tâm liên kết có 3 amino acid tyrosine,
chịu trách nhiệm cho việc liên kết với cellulose. Trong CBH I, một tyrosine bị thay bằng
tryptophane.
Khác biệt trong cấu trúc của các loại enzyme (CBH I, CBH II, EG …) sẽ dẫn đến ái
lực khác nhau trong quá trình hấp phụ của các enzyme này lên cơ chất. Đã có nhiều
nghiên cứu về cấu trúc của các enzyme và sự liên hệ đến khả năng tạo liên kết với
cellulose. Cụ thể số lượng các amino acid có tính không phân cực cao (tyrosine,
phenylalanine, tryptophan) nằm trong trung tâm hoạt động là bằng nhau đối với CBH I và
CBH II ( 5 và 6 nhóm). Trong khi đó, số lượng các amino acid không phân cực trong
trung tâm hoạt động của CBH II cao hơn. Điện tích bề mặt của các enzyme cũng rất khác
biệt. Ví dụ, đối với trung tâm tạo liên kết CBD, CBH II có thể có tương tác tĩnh điện vì có
25

38. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
aspartic acid ở vị trí 30, trong khi đó CBH I và EGII không có tính chất này vì ở vị trí 30
là proline
Tyrosine Phenylalanin Tryptophan Acid aspartic
Quá trình hấp phụ của CBH I không bị ảnh hưởng của liên kết tĩnh điện giữa bề mặt
cơ chất và enzyme. Ngược lại, CBH II có chịu ảnh hưởng của lực tĩnh điện.
c) Cơ chế tác động hiệp đồng của các enzyme.
Từ những năm 1954, Gilligan và Reese đã chỉ ra rằng việc pha trộn cellulose từ các
nguồn nấm mốc khác nhau có thể làm tăng lượng đường khử tạo thành trong quá trình
thủy phân. Từ lúc đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm mô tả quá trình tác động
hiệp đồng của các enzyme endo, exo cellulase.
Hình 2-19 Cơ chế tác động hiệp đồng của enzyme exo-endo và endo-endo. Enzyme
endoglucanase tấn công ngẫu nhiên vào cellulose và tạo cơ chất thích hợp cho enzyme
exoglucanase và sau đó khuếch tán nhanh ra khỏi bề mặt. Exoglucanse có thể tấn công từ
đầu đường khử và không khử.
26

39. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Nghiên cứu về tác động hiệp đồng của endo-exo công bố đầu tiên vào năm 1980.
Khái niệm endo-exo được mô tả trong hình 2-19. Sự tác động hiệp đồng của endo-exo có
thể nói là nhằm mục đích tạo bề mặt tấn công mới cho exoglucanse. Enzyme exo thường
tấn công vào những cellulose đã bị cắt mạch (cellodextrin) có đầu là nhóm khử (C chứa
OH hemiacetal) hoặc không khử. Trong khi đó, enzyme endo lại tấn công ngẫu nhiên vào
giữa mạch cellulose, tạo thành các cellodextrin, là các cơ chất thích hợp của enzyme exo.
Exoglucanase có những loại enzyme tấn công đặc trưng tùy theo tính chất khử được hay
không khử được của nhóm đầu mạch. Thật vậy, theo những nghiên cứu của Teeri và cộng
sự, nhóm khử đầu mạch của cellodextrin sẽ được định hướng vào trung tâm xúc tác của
CBH I. Trong khi đó, CBH II lại ưu tiên tấn công vào đầu không có nhóm khử của
cellodextrin.
Ngoài ra, cũng có nhiều nghiên cứu về sự tác động hiệp đồng của các enzyme endo,
exo có nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn. Dựa trên các nghiên cứu này, enzyme celluase
có thể được pha trộn với các thành phần từ các nguồn khác nhau nhằm tạo được một hệ
enzyme có tác động mong muốn.
TÓM TẮT Quá trình thủy phân có thể được tóm tắt trong hình sau
Hình 2-20 Cơ chế quá trình thủy phân
27

40. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• Enzyme endo-cellulase tấn công ngẫu nhiên vào mạch cellulose nhờ tạo liên kết
bằng tương tác giữa CBD với cellulose, tạo thành các oligosaccharide.
• Enzyme exo – cellulase tấn công vào cellulose và cả oligomer từ đầu đường khử và
không khử thông qua tường tác của CBD với cellulose, tạo thành cellobiose, cả
glucose.
• β-glucosidase tấn công cellobiose và oligosaccharide tan, tạo glucose.
2.2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân.
a) Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu
Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình tấn công của
các tác nhân thủy phân. Ngay cả quá trình thủy phân cellulose tinh khiết, tốc độ thủy phân
cũng giảm theo thời gian. Tốc độ phản ứng giảm dần theo thời gian vì một số lý do sau:
sự ức chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị
bất hoạt hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của cellulose.
Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên
liệu. Một cách tổng quát, gỗ mềm thường khó thủy phân hơn gỗ cứng. Cấu trúc của
nguyên liệu và cơ chế tác động của enxyme và cơ chất là hai yếu tố chính làm hạn chế
hiệu suất quá trình thủy phân.
Khả năng tiếp cận vật liệu lignocellulosic của cellulase đóng vai trò quan trọng trong
quá trình thủy phân. Cellulose có bề mặt trong và ngoài, bề mặt ngoài bao gồm bề mặt
bao quanh các xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các mao quản bên tron xơ sợi tạo thành.
Nếu cellulose không được tiền xử lý, hiệu quả thủy phân thấp. Xử lý loại bỏ hemicelluose
(bằng tiền xử lý acid) sẽ làm tăng khả năng thủy phân cellulose (theo nghiên cứu của
Grohmann). Grethlein đã giải thích rằng loại bỏ hemicellulose sẽ làm tăng cấu trúc xốp
đồng thời tăng bề mặt cellulose, làm cho enzyme dễ tấn công hơn. Kích thước của các lỗ
xốp lại liên quan đến độ trương nở của vật lịêu. Thật vậy, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng,
khi làm khô vật liệu lignocellulose, các mao quản sẽ bị mất đi, điều này làm giảm kích
thước lỗ xốp và vì vậy hiệu suất quá trình thủy phân giảm rõ rệt. Hàm lượng và sự phân
bố của lignin trong cấu trúc vật liệu có ảnh hưởng tới khả năng thủy phân của vật liệu đó.
Hiệu suất thủy phân thu được khá cao đối với các nguyên lịêu đã được loại bỏ gần hết
lignin.
28

41. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
b) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng
enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo
nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ giảm dần và đến mức
triệt tiêu.
Hình 2-21 Tốc độ phản ứng enzyme theo nhiệt độ
Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc
độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt
độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 50 oC. Riêng đối với
enzyme cellulase, nhiệt độ tối ưu là 50oC. Những enzyme khác nhau đều có nhiệt độ tối
ưu khác nhau.
Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó
enzyme không có khả năng phục hồi hoạt tính.
Ngược lại khi ở nhiệt độ 0oC, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa
nhiệt độ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu.
Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính. Phản ứng vô hoạt của
enzyme dưới tác dụng của nhiệt thường biểu diễn là phản ứng bậc một.
[E]
ln = = − kt
[ Eo ]
Trong đó – k – hằng số vận tốc phản ứng.
E – nồng độ enzyme hoạt động ở thời điểm t
Eo – nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động
29

42. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
c) Ảnh hưởng của pH
pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt
ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng
của enzyme. Ảnh hưởng đó được trình bày trong hình
Hình 2-22 Ảnh hưởng của pH
Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều
enzyme hoạt động ở môi trường acid yếu. Một số enzyme khác lại hoạt động mạnh ở pH
kiềm và cả pH acid. Đối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp là 4-5, trong đó tốt
nhất là 4.8.
d) Nồng độ enzyme
Hình 2-23 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng tăng theo đường thẳng. Tuy nhiên, khi
nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đó, nồng độ cơ chất sẽ trở thành yếu tố hạn chế
tốc độ phản ứng. Khi đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng nữa mà là một đường nằm ngang
như trong hình vẽ.
30

43. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
e) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Hình 2-24 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng, vì sẽ có nhiều cơ chất va
chạm với enzyme tiến hành phản ứng. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, các enzyme bị bão hòa
cơ chất, vì vậy, tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi đáng kể.
f) Ảnh hưởng của các chất kìm hãm
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản
ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính
chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng.
Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ,
các chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các
quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật.
Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận
nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất
kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được cân bằng.
k1
E + I ↔ EI
k2
trong đó E – enzyme, I – chất kìm hãm
k1, k2 hằng số vận tốc phản ứng thuận nghịch.
Trong trường hợp phản ứng ức chế là không thuận nghịch, hằng số k2 sẽ rất nhỏ và
không đáng kể. Ở đây, các chất kìm hãm kết hợp với enzyme bằng liên kết cộng hóa trị.
Ngoài ra các chất kìm hãm còn kết hợp với enzyme bằng một cơ chế khác mà đến nay các
31