Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HỆ ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KHẢ
NĂNG KÝ SINH TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp.
CỦA CÁC CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum
PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG TIÊU Ở VŨNG TÀU
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ MAI CHÂM
Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ NGỌC TRINH
MSSV: 1151110383 Lớp: 11DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2015

2. ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được xuất phát từ
yêu cầu trong công việc để hình thành hướng nghiên cứu. Các số liệu có nguồn gốc
rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc và kết quả trình bày trong đồ án được thu hoạch
trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa được từng được ai công bố trước đây.
Tp.HCM, ngày .... tháng ..... năm 2015
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Ngọc Trinh

3. iii
LỜI CẢM ƠN
Mọi sự nỗ lực đều được đền đáp bằng những thành quả tốt đẹp và mọi trái
ngọt đều do bàn tay con người vun xới. Để có thể đạt được những kết quả như ngày
hôm nay, em biết ơn vô cùng và xin được tỏ lòng biết ơn bằng những lời cầu chúc
tốt đẹp và lời cảm ơn sâu sắc nhất đến:
Xin được gửi đến BGH Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh
cùng toàn thể quý thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi
trường đã truyền dạy cho em những kiến thức cùng những bài học kinh nghiệm vô
cùng quý giá.
Xin gửi đến Ban Giám Đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ
Chí Minh nói chung và các anh chị trong Phòng Công nghệ vi sinh nói riêng. Đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị vật chất cũng như những sự quan tâm giúp
đỡ, giúp em hoàn thành tốt bài luận này.
Không thể không nhớ bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến Th.s Lê Thị
Mai Châm và kỹ sư Nguyễn Thùy Dương, những người đã tận tình hướng dẫn trong
quá trình tiến hành cũng như từng bước giúp em hoàn thiện hơn bản thân và những
bài học kinh nghiệm quan trọng trong bước đường tương lai. Nhờ sự động viên dìu
dắt của thạc sĩ đã tạo động lực cho em trong suốt quá trình thực hiện.
Cuối cùng, xin được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn cổ vũ và tạo những
điều kiện tốt nhất. Chính những kết quả này sẽ luôn là trang bài học quý giá với em
trong suốt quãng đường phía trước.
Tp.HCM ngày … tháng… năm 2015
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Ngọc Trinh

4. iv
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề............................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài .....................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ................................................................2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3
1.1 Sơ lược về đặc điểm rễ cây hồ tiêu....................................................................3
1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật ..........................................................4
Phân loại...............................................................................................................4
Hình thức ký sinh trên thực vật............................................................................5
1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp.....................................................................5
Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp.....................................................5
Vòng đời của tuyến trùng M. incognita ............................................................6
Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp. ............................6
Đặc điểm gây hại...............................................................................................8
Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. ..................................9
1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum.................................................9
1.3.1 Hệ thống phân loại ......................................................................................9
1.3.2 Phân bố......................................................................................................10
1.3.3 Đặc điểm hình thái ....................................................................................11
Hình thái đại thể..............................................................................................11
Hình thái vi thể................................................................................................11
1.3.4 Đặc điểm sinh hóa.....................................................................................12
Sơ lược về hệ enzyme ngoại bào ....................................................................12
Enzyme protease..........................................................................................12
Chitinase ......................................................................................................14
1.3.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng của P. liacinum ........15
Nhiệt độ...........................................................................................................15
pH....................................................................................................................16

5. v
Nguồn dinh dưỡng ..........................................................................................16
1.3.6 Khả năng kiểm soát và sự ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng
............................................................................................................................17
Cơ chế của quá trình xâm nhập và kí sinh tuyến trùng...................................18
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................19
2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ......................................................................19
2.2 Đối tượng nghiên cứu......................................................................................19
2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm ............................19
Vật liệu ...............................................................................................................19
Dụng cụ ..............................................................................................................19
Thiết bị ...............................................................................................................19
Các môi trường và thuốc thử sử dụng................................................................20
2.4 Nội dung nghiên cứu........................................................................................23
2.5 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................23
2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum -
Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch ........................23
2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của
nấm P. lilacinum.................................................................................................24
2.5.3. Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu.............................................................25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................27
3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum ......27
3.1.1. Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm P.
lilacinum.............................................................................................................27
3.1.2. Kết quả định tính hệ enzym ngoại bào chitinase của các chủng nấm P.
lilacinum.............................................................................................................32
3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng
Meloidogyne spp....................................................................................................38
3.2.1. Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái
Meloidogyne spp.................................................................................................38

6. vi
3.2.2 Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của P. lilacinum trên khối trứng tuyến
trùng Meloidogyne spp.......................................................................................41
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................45
4.1. Kết luận...........................................................................................................45
4.2. Kiến nghị.........................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................46
PHỤ LỤC...................................................................................................................1

7. vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
BR – VT : Bà Rịa – Vũng Tàu
BVTV : Bảo vệ thực vật
IJ2 : Infective Juvenile 2
M : Meloidogyne
MT : Môi trường
NN-PTNT : Nông nghiệp- phát triển nông thôn
PDA : Potato Dextrose Agar
P : Purpureocillium
TCA : Trichloroacetic
WA : Water Agar
CTV : cộng tác viên

8. viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu
ở Vũng Tàu................................................................................................................22
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh.............................................................................27
Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh...................................................................................30
Bảng 3.3. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme protease theo thời gian của các
chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau................................31
Bảng 3.4. Vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất
vùng rễ tiêu khỏe mạnh.............................................................................................33
Bảng 3.5. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh...................................................................................35
Bảng 3.6. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme chtinase theo thời gian của các
chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau.................................37
Bảng 3.7. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái Meloidogyne spp. theo
thời gian.....................................................................................................................38
Bảng 3.8. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh con cái Meloidogyne spp. của các
chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian..40
Bảng 3.9. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên khối trứng Meloidogyne spp.
theo thời gian.............................................................................................................41
Bảng 3.10. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. của các
chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian..........44

9. ix
DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH
Biểu đồ 3.1. Đường kính vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm
P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian. ....................31
Biểu đồ 3.2. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum
phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian..........................................36
Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của nấm
P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. ...................40
Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. trung bình của nấm
P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. ..................43
Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp.. ...................................8
Hình 1.2. Khuẩn lạc P. lilacinum trên môi trường PDA sau 15 ngày nuôi cấy ở 250
C ..11
Hình1.3. Cơ quan mang bào tử và bào tử nấm.........................................................12
Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ
vùng rễ tiêu khỏe. Nhóm 1(A), nhóm 2 (B), nhóm 3 (C), nhóm 4 (D). .....................28
Hình 3.2 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu bệnh. Chủng nấm nhóm 2 (A), nhóm 3 (B) và nhóm 4 (C). ............30
Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin sau 72h của các chủng nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu khỏe. Chủng nấm nhóm 1 (A) và nhóm 2 (B). ................................34
Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm HT1.1 sau 48h (A) và
72h (B).......................................................................................................................36
Hình 3.5 Con cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh khi chụp dưới kính
soi nổi ở độ phóng đại 4X. Con cái chưa bị ký sinh (A), nấm bắt đầu xâm nhập và
ký sinh con cái (B) và con cái bị nấm ký sinh hoàn toàn (C). ..................................39
Hình 3.6 Khối trứng Meloidogyne spp. bị nấm ký sinh. Khối trứng bắt đầu bị nấm
tiếp xúc (A), sợi nấm bao phủ xung quanh khối trứng sau 9 ngày (B), khối trứng bị
nấm ký sinh sau 14 ngày (C).....................................................................................42

10. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Theo báo cáo thống kê 6 tháng đầu năm của Bộ NN- PTNT Việt Nam năm
2014 sản lượng tiêu xuất khẩu đạt 111.000 tấn tăng 36% về lượng và 48% giá trị.
Có thể nói, cây hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực đẩy mạnh
phát triển kinh tế các địa phương, góp phần ổn định đời sống kinh tế của đất nước.
Cây hồ tiêu được phát triển với quy mô và tốc độ khá lớn tại các tỉnh miền Trung và
Khu vực Đông Nam Bộ. Đặc biệt là Bà Rịa- Vũng Tàu, theo thống kê của Sở NN-
PTNT năm 2013, BR-VT đứng thứ 4 cả nước về diện tích trồng tiêu với tổng diện
tích trồng gần 8.000ha đạt sản lượng hơn 12000 tấn, đứng thứ 4 cả nước (Hiệp hội
hồ tiêu Việt Nam). Tuy nhiên, việc sản xuất hồ tiêu trong những năm qua bị tổn thất
đáng kể do cây thường bị bệnh với những dấu hiệu như: rễ có nhiều nốt sưng, lá
vàng, cây khô chết dần mà một trong những nguyên nhân là do tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne spp. (Phạm Văn Biên, 1989 và Nguyễn Ngọc Châu, 1990). Đây được
coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất trong nông nghiệp. Nhóm tuyến
trùng này phân bố rộng khắp và ký sinh trên hầu hết các loại cây trồng ở các vùng
khí hậu khác nhau. Hiện nay, khoảng hơn 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó
có 4 loài ký sinh gây hại phổ biến là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M.
hapla (Vũ Triệu Mân, 2007).
Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng thuốc hóa học
nhưng vẫn chưa tiêu diệt triệt để. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc cũng đem lại
những lo ngại: tồn dư thuốc trong nông sản, làm mất cân bằng hệ vi sinh vật, ảnh
hưởng đến môi trường sinh thái, hiện tượng kháng thuốc gây phát sinh những dịch
bệnh khác nghiêm trọng hơn…Còn rất nhiều những mối nguy hại không thể kể hết.
Trong khi đó, việc áp dụng các tiến bộ trong công nghệ sinh học cũng như ứng dụng
công nghệ vi sinh còn rất hạn chế, những lo ngại cũng như tâm lý khi sử dụng các
sản phẩm vi sinh lại hoàn toàn rất lạ và mơ hồ với chính những người nông dân.
Trong tình hình đó, việc nghiên cứu và chọn lọc các vi sinh vật bản địa có khả
năng ký sinh tuyến trùng gây hại là vấn đề đáng quan tâm và như mở ra cánh cửa

11. Đồ án tốt nghiệp
2
mới trong việc chủ động phòng trừ tác nhân gây bệnh, nhằm giảm thiệt hại và nâng
cao chất lượng và sản lượng cây trồng. Một trong những giải pháp hữu hiệu góp
phần đảm bảo an toàn cho cây trồng cũng như người sử dụng, đáp ứng yêu cầu giữ
cân bằng hệ vi sinh vật và gìn giữ môi trường. Nấm Purpureocillium lilacinum đã
được chứng minh có khả năng kí sinh khối trứng và con cái của tuyến trùng (Jatalas
và cs, 1979). Ngoài ra, chúng còn có thể sống hoại sinh trong đất xung quanh vùng
rễ cây (Tigrano và cs, 1995). Do đó, năm 2014 Trung tâm Công nghệ sinh học đã
tiến hành xác định sự phân bố của nấm này ở vùng Đông Nam Bộ, trong đó có
Vũng Tàu. Việc phân lập, xác định hoạt tính enzyme ngoại bào hay khả năng kí
sinh tuyến trùng của các chủng nấm phân lập từ các hệ sinh thái đất trồng tiêu khác
nhau là rất cần thiết. Đó là lý do tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát hệ enzyme
ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng
nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở Vũng Tàu.”
2. Mục tiêu đề tài
Khảo sát, so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease, chitinase của các
chủng nấm Purpureocillium lilacinum (P. lilacinum) phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị
bệnh vàng lá (bị bệnh) và đất vùng rễ tiêu không bị bệnh vàng lá (khỏe mạnh).
So sánh khả năng xâm nhập vào khối trứng và con cái tuyến trùng
Meloidogyne spp. của một số chủng nấm P. liacinum đại diện từ đất vùng rễ tiêu bị
bệnh và khỏe mạnh.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Là một trong những nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính enzyme ngoại bào và khả
năng kí sinh tuyến trùng của nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở vũng Tàu.
Ý nghĩa thực tiễn
Từ nghiên cứu này có thể xác định được sự tồn tại của các chủng nấm
P. lilacinum có hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase cũng như khả
năng kí sinh tuyến trùng mạnh trong đất trồng tiêu góp phần vào việc định hướng sử
dụng chế phẩm vi sinh phòng trừ tuyến trùng hại tiêu trong tương lai.

12. Đồ án tốt nghiệp
3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Sơ lƣợc về đặc điểm rễ cây hồ tiêu
Hệ thống rễ hồ tiêu thường gồm 3 -6 rễ cái và một chùm rễ phụ nằm dưới mặt
đất, trên đốt thân có rễ bám (rễ thằn lằn). Chỉ có những cây tiêu trồng bằng hạt mới
có rễ cọc. Rễ này đâm sâu xuống đất khoảng 2,5m và giữ nhiệm vụ hút nước. Các rễ
cái cũng làm nhiệm vụ chính là hút nước. Đối với những cây trồng bằng giâm cành,
sau khi trồng ra ngoài nọc được 1 năm các rễ cái này có thể đâm sâu khoảng 2m.
Các rễ phụ mọc thành chùm, phát triển theo chiều ngang, rất dày đặc. Phân bố ở độ
sâu 15 – 40cm, làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng trong đất để nuôi cây.
Rễ bám mọc ra từ các đốt phần thân dây tiêu, giúp cho dây bám vào choái, vách
tường, …để vươn lên cao. Khả năng hút nước và chất dinh dưỡng của rễ bám là rất
hạn chế và hầu như là không đáng kể.
Rễ cây tiêu thuộc loại háo khí, không chịu được ngập úng, do đó để tạo cho rễ
cái ăn sâu, cây chịu hạn tốt và rễ phụ phát triển tốt hút được nhiều chất dinh dưỡng
thì phải thường xuyên có nhiều phương pháp cải tạo làm cho đất được tơi xốp và
tăng hàm lượng mùn. Chỉ cần ngập úng trong nước từ 12 – 24 giờ thì bộ rễ tiêu sẽ bị
tổn thương đáng kể, có thể dẫn tới thối rễ và dây tiêu sẽ bị chết.
Một số sâu bệnh phát triển trên cây tiêu
Trên rễ cây hồ tiêu thường xuất hiện một số bệnh:
Mối hại tiêu: mối xông đất tạo thành đường di chuyển trên trụ, dây và rễ tiêu.
Mối gây hại phần non của rễ, phần vỏ của thân và tạo vết thương trên các bộ phận
này tạo điều kiện cho nấm và tuyến trùng có hại xâm nhập và gây bệnh cho tiêu.
Rệp sáp giả (Pseudococidae) : gây hại trên đọt non, lá non, chùm quả, dây tiêu
trên mặt đất hoặc gốc tiêu, rễ tiêu trong lòng đất.
Bệnh chết nhanh: nguyên nhân do nấm Phytophthora, do tác động của tuyến
trùng, côn trùng, chăm sóc, xới xáo, ngập úng… làm tổn thương rễ, sau đó nấm xâm
nhập và gây hại. Bệnh gây hại trên tất cả bộ phận của cây.
Bệnh chết chậm: do nhiều loại nấm gây hại: Fusarium sp., Rhizoctonia sp.,
Pythium sp., … Các loại nấm này tồn tại trong đất, trên tàn dư của cây trồng trước,

13. Đồ án tốt nghiệp
4
cây giống… Cây bị bệnh sinh trưởng chậm, lá nhạt, màu vàng hoặc biến dạng. Hoa
quả rụng dần từ gốc đến ngọn. Các đốt cũng rụng dần, gốc thối, bó mạch thân cây
hóa nâu.
Bên cạnh đó bệnh tiêu cũng bị nhiều loài tuyến trùng gây hại, trong đó có hai
loài gây hại nặng nề nhất là tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne và tuyến trùng đục
hang Radopholus (Michel Luc, 2005). Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật
không xương sống, thích nghi với đời sống ký sinh trên thực vật. Nhóm tuyến trùng
này có một số đặc trưng quan trọng phân biệt rõ ràng với nhóm ký sinh trên động
vật và các nhóm sinh thái khác: có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim
hút chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước
trứng lớn so với kích thước cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực
tiếp với thực vật đang phát triển. Trong đó, cấu tạo kim hút chuyển hóa là khác biệt
quan trọng nhất (Nguyễn Bảo Vệ và ctv 2005).
1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật
Phân loại
Dựa vào các đặc điểm về hình thái, tập quán sinh sống, đặc tính sinh vật học,
mối quan hệ giữa các nhóm tuyến trùng thực vật đối với cây trồng mà chúng được
chia làm 4 bộ :
Bộ Tylenchida: gồm hầu hết các loài tuyến trùng là đại diện cho các nhóm ký
sinh ở các phần khác nhau của thực vật.
Bộ Aphelenchida: gồm các loài tuyến trùng ký sinh ở các phần trên mặt đất
của cây như lá, hoa.
Bộ Dorylaimida: gồm các loài thuộc họ Longidoridae là nhóm tuyến trùng
ngoại ký sinh thực vật, một số loài có khả năng mang truyền virus.
Bộ Triplonchida: gồm các loài của 2 họ Trichodoridae và Diphterophoridae là
nhóm ngoại thực vật, nhiều loài có khả năng mang truyền virus.
Trong đó bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng đông đảo nhất và có tầm quan
trọng nhất trên phạm vi toàn thế giới.

14. Đồ án tốt nghiệp
5
Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh trên tất cả các cơ quan của cây đang phát
triển hoa, lá, thân, rễ…trong đó rễ là nơi chịu ảnh hưởng nhiều nhất những tác động
của tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000).
Hình thức ký sinh trên thực vật
Có thể chia thành 3 nhóm: Ngoại ký sinh, bán nội ký sinh và nội ký sinh di
chuyển. Ngoại ký sinh là tuyến trùng không xâm nhập vào bên trong cơ thể thực vật
mà bám vào bên ngoài bề mặt rễ, chúng dùng kim hút để châm chích và hút dinh
dưỡng bên trong cây. Bán nội ký sinh: chỉ phần đầu của tuyến trùng xâm nhập vào
trong rễ, còn phần sau tuyến trùng vẫn ở ngoài đất. Nội ký sinh: toàn bộ phần cơ thể
tuyến trùng xâm nhập vào rễ. Nội ký sinh di chuyển : tuyến trùng có khả năng di
chuyển trong mô thực vật, chúng di chuyển từ mô này đến mô khác để dinh dưỡng.
Nội ký sinh cố định: sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng dinh dưỡng tại một nơi
cố định (tạo nên các tế bào dinh dưỡng) chúng mất khả năng di chuyển và trở lên
phình to (béo phì).
Các kiểu ký sinh này không loại trừ lẫn nhau vì một số giống tuyến trùng có
thể là nội ký sinh hay ngoại ký sinh di chuyển phụ thuộc vào vật chủ. Ở tuyến trùng
sần rễ (Meloidogyne spp.) và tuyến trùng bào nang (Heterodera/ Globora), ấu trùng
tuổi 2 là giai đoạn xâm nhập vào rễ. Nhưng ở các tuyến trùng ngoại ký sinh và hầu
hết tuyến trùng nội ký sinh di chuyển thì hầu như tất cả các giai đoạn đều có thể
dinh dưỡng và xâm nhập vào rễ (Vũ Triệu Mẫn, 2007).
1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp.
Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp.
Tuyến trùng sần rễ (root knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký
sinh quan trọng nhất. Chúng gây hại hơn 3000 loài thực vật trên toàn thế giới, bao
gồm hầu hết các cây trồng quan trọng: rau màu, đậu, ngũ cốc, cây ăn quả, thảo mộc
và nhiều cây cảnh thân gỗ khác (Malcolm & Charles, 2000).
Tuyến trùng làm giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng cây trồng.
Theo thống kê có khoảng 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó có 4 loại ký sinh
gây nên ảnh hưởng nghiêm trọng: M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M.

15. Đồ án tốt nghiệp
6
halpha (Vũ Triệu Mân, 2007). Một số loài Meloidogyne gây hại khá phổ biến và
quan trọng đối với thực vật hiện nay:
M. incognita là loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại trên nhiều cây trồng khác
nhau và phân bố trên vùng địa lý rộng trên phạm vi toàn thế giới. Đây cũng là loài
gây hại phổ biến trên cây trồng Việt Nam, trong đó chúng gây nhiều nhất trên : hồ
tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, các cây họ cà, cây họ đậu…
M. javanica là loài phổ biến thứ 2 sau M. incognita và có dải phân bố rộng
tương tự. Đây là loài có khả năng chịu đựng qua mùa khô hạn trong thời gian 3 – 6
tháng. Ở Việt Nam, loài này cũng ký sinh khá phổ biến trên các cây họ đậu, chuối…
M. arenaria là loài phổ biến thứ 3 sau 2 loài trên, phân bố khắp thế giới. Đây
là loài gây hại phổ biến trên các cây họ đậu ở Việt Nam.
M. graminicola ký sinh gây hại trên cây lúa ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới là chủ yếu (Đông Nam Á, Nam Phi, Mỹ…) Ở nước ta, loài này ký sinh trên
tương đối nhiều trên cây lúa ( giai đoạn lúa non, khi chưa ngập nước ) ở vùng đồng
bằng sông Cửu Long.
Tuyến trùng Meloidogyne spp. (Kofoid & White, 1919; Chitwood, 1949) là
tuyến trùng nội ký sinh rễ: giống Meloidogyne, Họ Meloidogynedae, Bộ Tylenchida.
Vòng đời của tuyến trùng M. incognita
Vòng đời tuyến trùng M. incognita phát triển qua 5 giai đoạn chính : trứng (ấu
trùng tuổi 1), ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm), ấu trùng tuổi 3, ấu trùng tuổi 4
và tuyến trùng trưởng thành. Giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm ở trong đất, các giai
đoạn khác hình thành và phát triển trong rễ cây. Trong chu kỳ vòng đời này ở tuyến
trùng Meloidogyne spp. thì giai đoạn ấu trùng tuổi 2 và tuyến trùng trưởng thành
giúp xác định loài (Nguyễn Vũ Thanh, Nguyễn Ngọc Châu, 1993)
Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp.
Cơ thể tuyến trùng gồm 3 phần: đầu, giữa và đuôi. Phần đầu còn được gọi là
vùng môi. Phần đầu ở chính giữa có miệng chích hút có khi có mấu nhỏ nhô lên, hai
đầu hơi nhọn hoặc hình tròn dẹt. Phần thân ở giữa chứa ruột giữa và cơ quan sinh

16. Đồ án tốt nghiệp
7
dục. Phần đuôi có nhiều dạng khác nhau: hình kim nhọn, hình thoi thon dài, có mấu
gai hoặc không.
Con cái trưởng thành hình cầu, nằm sâu trong mô rễ. Đường kính cơ thể 0,5–
0,7 mm với cổ cân đối. Vỏ cutin màu trắng nhạt, mỏng và phân đốt. Lớp vỏ cutin
tương đối bền và có thể co giãn được. Vỏ cutin về cơ bản được chia thành 3 lớp :
epidocutin, exocutin và endocutin (Bird, 1984). Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các
cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa. Ngoài ra năm 1986, Reddigari cũng đã tách được
thành phần protein collagen từ 3 lớp của vỏ cutin của M. incognita với một lượng
khác nhau ở mỗi lớp. Trên vỏ cutin có các lỗ của hệ tiêu hóa, hệ sinh dục, hệ bài
tiết, và một số các lỗ khác của các cơ quan tiết hoặc thụ cảm khác nhau. Phía trong
gắn với vỏ cutin là hạ bì và hệ cơ soma. Bên trong thành cơ thể là xoang cơ thể mà
thực chất là giả xoang, không được bao bọc bằng cấu trúc biểu mô. Nó được tạo áp
lực thường xuyên làm cho cơ thể tuyến trùng luôn ở trạng thái căng phồng lên. Áp
lực này cũng có tác dụng làm giảm tác động lên cơ soma và cho phép tuyến trùng
vận động được. Xoang cơ thể chứa các tế bào tuyến khác nhau hệ tiêu hóa và hệ
sinh sản. Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa, là
cấu trúc cutin dày lên hoặc đậm nét khi quan sát dưới kính hiển vi quang học
(Nguyễn Ngọc Châu, 2003).
Trứng được con cái đẻ ra bên ngoài cơ thể vào khối gelatin nằm trên bề mặt
của sần rễ. Đôi khi các bọc trứng này cũng nằm bên trong nốt sần. Có hình bầu
dục dài hay hình quả thận, cũng có loại trứng hình tròn và tương đối lớn. Vỏ trứng
là phần cứng bên ngoài của trứng tuyến trùng, giúp bảo vệ khỏi các tác nhân hóa
học và vi sinh vật tấn công. Lớp vỏ trứng có thể có từ 1 – 5 lớp tùy thuộc vào từng
loài tuyến trùng. Các cấu trúc phổ biến nhất có lớp nội lipid, một lớp chitin ở giữa
(thành phần chính) và một lớp vitelline ngoài (Bird và McClure, 1976).. Lớp bên
ngoài bao gồm các vitellin protein. Lớp rào cản đầu tiên bên ngoài giúp ngăn cản sự
xâm nhập của nấm lên trứng. Trong Bộ Tylenchida, tuyến trùng M. javanica, lớp
vitelline là rất mỏng (10-40 nm) và chứa lipoprotein. Vỏ trứng của tuyến trùng sần
rễ M. hapla có hơn 40% protein (Wharton, 1980). Dày 400 nm là lớp chitin lớn

17. Đồ án tốt nghiệp
8
được kết hợp với protein để tạo thành một phức tạp chitin-protein. Vỏ trứng M.
javanica chứa 50% protein và 30% chitin (Bird và Bird, 1991). Vai trò chính của
lớp chitin có thể đảm bảo độ bền cấu trúc vỏ trứng và để bảo vệ lớp lipid. Các lớp
lipid bao gồm một loạt các màng lipoprotein (Wharton, 1980) và dày nhất ở các
đầu (0.02- 0.04 µm). Các lớp lipid chịu trách nhiệm chống thấm của một số vỏ
trứng, và nó bảo vệ trứng hạn chế chất độc hại (Wharton, 1980). Nếu các lớp chitin
được loại bỏ, lớp lipid là dễ dàng bị hư hỏng …(Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ
Thanh, 2000)
Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp..
Đặc điểm gây hại
Quan sát mô học chỉ ra rằng sự xâm nhập của ấu trùng tuổi 2 xuất hiện nhiều
nhất tại vùng mô phân sinh rễ. Tuyến trùng ở đất xâm nhập vào rễ tiêu ở giai đoạn
ấu trùng cảm nhiễm IJ2. Sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng khu trú tại một chỗ
và dùng kim hút chọc thủng tế bào mô trụ của rễ, tiết men tiêu hóa vào mô để thực
hiện dinh dưỡng. Tại đây, tuyến trùng nhanh chóng phát triển qua các giai đoạn để
phát triển thành tuyến trùng trưởng thành (tuyến trùng đực dạng chỉ dài, tuyến trùng
cái hình quả lê). Dưới tác dụng của men tiêu hóa do tuyến trùng tiết ra, các tế bào
xung quanh tuyến trùng phát triển bất thường, tạo thành các tế bào khổng lồ có
nhiều nhân. Rễ phình to ra tạo thành u hay nốt sần, hệ rễ bị biến dạng. Những nốt

18. Đồ án tốt nghiệp
9
sần này có thể nhỏ, riêng biệt hay to và xếp thành chuỗi, phụ thuộc vào mức độ
nhiễm của cây ký chủ ( Nguyễn Ngọc Châu và ctv.,1990).
Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp.
Trên thực tế, chỉ có thể phát hiện tình trạng của bệnh khi cây bắt đầu xuất hiện
các triệu chứng bộ lá bắt đầu suy giảm nên việc khống chế và phòng trừ sẽ rơi vào
tình trạng bị động và gặp rất nhiều khó khăn, kém hiệu quả dẫn đến cây chết, dịch
bệnh lây lan trên diện rộng. Vì vậy, để phòng trừ có hiệu quả cần có các biện pháp
phòng trừ tích cực, hiệu quả, chủ động. Một số biện pháp phòng trừ: biện pháp chọn
giống, biện pháp canh tác, biện pháp hóa học, biện pháp sinh học.
Có 2 dạng phòng trừ sinh học:
Phòng trừ sinh học nhân tạo bằng cách nhân nuôi các tác nhân sinh học để
đưa ra đồng ruộng.
Phòng trừ sinh học tự nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch sẵn có trong
tự nhiên để hạn chế mật độ tuyến trùng.
Hiện tại biện pháp phòng trừ sinh học vẫn chưa thể thay thế biện pháp hóa học
do tác động chậm, giá thành các chế phẩm sinh học còn cao và không đáp ứng đầy
đủ nhu cầu sản xuất. Tuy nhiên, phòng trừ sinh học rất phù hợp trong hệ thống quản
lý tuyến trùng. Trong đó, việc nghiên cứu, tìm tòi về khả năng đối kháng, ký sinh là
những bước tiến quan trọng đang được quan tâm và phát triển.
1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum
1.3.1 Hệ thống phân loại
Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae. Chi này chỉ
có một đại diện duy nhất là Purpureocillium lilacinum (hay còn được biết đến với
tên phổ biến Peacilomyces lilacinus). Nấm sợi Purpureocillium lilacinum là loài
hoại sinh khá phổ biến và đang được chú trọng vì có tiềm năng trong việc kiểm soát
mật độ của tuyến trùng gây hại trên cây trồng. Phân loại theo Jennifer và cs năm
2011 như sau:
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota

19. Đồ án tốt nghiệp
10
Lớp: Sordariomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Ophiocordycipitaceae
Chi: Purpureocillium
Loài: Pupureocillium lilacinum
Loài Purpureocillium lilacinum được miêu tả đầu tiên bởi nghiên cứu của
Charles Thomas vào năm 1910, dưới tên Penicillium lilacinum. Một số tên gọi khác
của nó Penicillium amethystinum (Wehmer,1923), Spicaria rubidopurpurea (Aoki,
1941). Năm 1974, Samon đổi tên thành Paecilomyces. Những công bố trong thập
niên 20 chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là đơn ngành (Inglis và Tigano,
2006). Nấm này đã từng được phân loại thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes).
Người ta đã phân lập được nhiều chủng nấm này từ khắp nơi trên thế giới và nó
được chấp nhận như biến thể của chi Paecilomyces. Paecilomyces có mối quan hệ
gần với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola
(Sung và ctv, 2007).
Loài nấm Paecilimyces lilacinus được nghiên cứu nhiều nhất trong việc phòng
trừ tuyến trùng. Năm 2011, Jennifer và cs đã đổi tên Paecilomyces lilacinus thành
Purpureocillium lilacinum và sử dụng cho tới hiện tại. Những kết quả khi phân tích
quan hệ phát sinh loài của các chủng Purpureocillium lilacinum chỉ ra rằng nó có
liên quan chặt chẽ với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài ký sinh
thuộc chi Paecilomyces, họ Hypocreales (Inglis và Tigano, 2006).
1.3.2 Phân bố
P. lilacinum đã được phân lập từ các môi trường sống bao gồm đất (canh tác
và không canh tác, rừng, đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông), nước thải và côn
trùng, tuyến trùng. P. lilacinum cũng đã được tìm thấy trong trứng và con cái của
tuyến trùng sần rễ và tuyến trùng bào nang. Ngoài ra, P. lilacinum cũng được tìm
thấy trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng (Samson, 1974; Anderson và ctv, 1995).

20. Đồ án tốt nghiệp
11
1.3.3 Đặc điểm hình thái
Hình thái đại thể
Bào tử nấm P. lilacinum nảy mầm khi độ ẩm và chất dinh dưỡng đầy đủ.
Khuẩn lạc trên môi trường thạch PDA tăng trưởng khá nhanh, đường kính đạt 5-7
cm trong vòng 14 ngày ở 280
C ± 20
C, có bề mặt dạng len hoặc xốp bông, ban đầu
có màu trắng nhưng khi bắt đầu phát sinh bào tử chuyển thành màu tím, hoặc màu
nâu khi đưa lên ánh sáng. Một số trường hợp, bào tử không màu nhưng đa số là màu
tím (Samson, 1975).
Hình1.2. Khuẩn lạc P. lilacinum trên môi trường PDA
sau 15 ngày nuôi cấy ở 250
C (http://www.pf.chibau.
ac.jp/gallery/fungi/p/Paecilomyces_lilacinus_colony.htm).
Hình thái vi thể
Các sợi nấm sinh dưỡng có thành trơn láng trong suốt và rộng khoảng 2,5 - 4,0
µm (Samson, 1974). Cuống bào tử đính phát sinh từ các sợi nấm cơ chất và sợi nấm
dinh dưỡng, dài khoảng 400 - 600 µm. Cuống bào tử phình ra ở phía gốc và thon
gọn ở phía ngọn gọi là thể bình. Bào tử đính phát sinh từ thể bình có dạng hình tròn
hay bầu dục, ban đầu có vách trơn láng, sau đó trở nên hơi gồ ghề (Samson, 1974).

21. Đồ án tốt nghiệp
12
Hình1.3. Cơ quan mang bào tử và bào tử nấm
P. lilacinum khi chụp từ kính hiển vi huỳnh quang
độ phóng đại 460X (http://en.wikipedia.org/wiki/Purpureocillium).
1.3.4 Đặc điểm sinh hóa
Có rất nhiều nghiên cứu về enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum, đặc biệt
là enzyme protease. Enzyme này có khả năng phá hủy vỏ trứng của tuyến trùng
Meloidogyne hapla (Bonants và cs, 1995). Ngoài ra enzyme ngoại bào chitinase
được tiết ra từ P. lilacinum cũng góp phần vào việc thủy phân thành phần của vỏ
trứng tuyến trùng (Khan và cs, 2004).
Các độc tố của nấm cũng được nghiên cứu, đáng chú ý là Peacilotoxin. Tuy
nhiên việc tiết độc tố cũng tùy thuộc vào nguồn gốc phân lập của chủng nấm (Khan
và cs, 2003; Park và cs, 2004). Năm 2003, Khan và cs đã thử nghiệm một chủng P.
lilacinum để sản xuất Paecilotoxin và chủng này không hề sinh độc tố.
Sơ lược về hệ enzyme ngoại bào
Enzyme protease
Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit
ngắn và cuối cùng tạo các acid amin và NH3. Protease cần thiết cho các sinh vật
sống và enzym này có trong nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus)
đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật
và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ
protease VSV là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau

22. Đồ án tốt nghiệp
13
về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể
đồng nhất (Võ Thị Bích Vân, 2010)
Phân loại protease: Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3
(E.C.3.4). Protease được chia ra làm một số loại dựa trên những đặc điểm riêng của
chúng cũng như cấu tạo của tâm hoạt động của enzyme. Protease được phân chia
thành hai loại: endopeptidase (E.C.3.4.11-17) và exopeptidase(E.C.3.4.21-99). Dựa
vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin
protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt
động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các
serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu
cơ chất tương đối rộng. Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trong
trung tâm hoạt động. Các cystein protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính,
có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc
nhóm pepsin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo protease: Metallo
protease là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm sợi cũng như các vi sinh
vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính.
Cơ chế hoạt động của protease: Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn
nhất. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân
thông qua hai bước chính (Barrett, 1994): Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết
cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử C trong nhóm cacboxyl của
phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Bước 2, khử acyl
hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của
bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho
nhóm amine để tái sinh lại enzyme (Võ Thị Bích Vân, 2010).
P. lilacinum có khả năng tiết ra serine protease. Năm 2004, Khan đã chứng
minh rằng serine protease được tiết ra bởi chủng nấm P. lilacinum 251 làm ngừng
sự phát triển của trứng M. javanica và làm giảm sự nở của ấu trùng hay có thể giết
chết một lượng lớn ấu trùng tuổi 2 đã nở. Đồng thời nghiên cứu này còn chỉ ra rằng

23. Đồ án tốt nghiệp
14
enzyme này kết hợp với enzyme chitinase có thể gây tổn thương đến phôi trứng
tuyến trùng và làm thay đổi cấu trúc vỏ trứng do lớp vitelline bị tan ra và thay đổi
tính thấm ảnh hưởng đến lớp lipid trong cùng gây ra những thay đổi như trứng bị
phồng lên.
Chitinase
Chitinase [Poly-Beta-1-4- (2-acetalmido-2-deoxy) -D-glucoside glucanohydrolase]
thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose
hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai
phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin.
Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.
3 → Hydrolase
2→ Glycosylase
1 → Glycosidase
14 → Chitinase
Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ. Họ
Glycohydrolase 18 là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, họ này bao gồm chủ yếu là
enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase
và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có
cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua một cơ chế
kiểm soát mà trong đó các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer.
Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như
Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum,
Aphanocladium album, Serratia marcescens…Họ Glycohydrolase 19 gồm hơn 130
chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces
griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae…Chúng có cấu trúc hình cầu với một
vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển. Họ Glycohydrolase 19
bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV. Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-
acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người.

24. Đồ án tốt nghiệp
15
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-f-chitobiosidase,
N-acetyl-f-D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase,
chitobiosidase và β–N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch
huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin
thô thu từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp
cho endochitinase hơn là chitobiosidase và f-N-acetylhexosaminidase.
Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại
enzyme trên nhưng f-N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc
làm giảm độ đục của huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của f-N-
acetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase.
Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase,
chitobiosidase và f-N- acetylhexosaminidase. Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là
N-acetyl glucosamine (Đinh Minh Hiệp, 2007).
Theo đó, P. lilacinum làm thay đổi phần nhiều cấu trúc của vỏ trứng dưới sự
tác động của chitinase tạo không gian cho nấm trong suốt quá trình xâm nhập
(Morgan-Jones và ctv, 1984). Đồng thời tiết ra enzyme chitinase làm mỏng đi lớp
chitin của vỏ tuyến trùng và gây chia tách với lớp lipd trong cùng.
Như vậy, việc sản sinh enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum cũng có ý
nghĩa và vai trò quan trọng trong việc phá hủy vỏ trứng tuyến trùng với 3 lớp bảo
vệ cơ bản: protein, chitin và lipid và lớp biểu bì cutin bên ngoài của con cái cùng
các lỗ mở tự tiên trên cơ thể chúng là những nơi dễ bị xâm nhiễm. Nơi đầu tiên để
nấm xâm nhập và là cơ sở để kiểm soát sinh học. Protease, chitinase, và lysozyme là
các enzyme thường được tổng hợp và tiết ra bởi nấm làm bào mòn vỏ trứng và lớp
biểu bì con cái tuyến trùng (Bonants và ctv, 1995; Dackman và ctv, 1989; Gupta và
ctv, 1993).
1.3.5 Các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của P. liacinum
Nhiệt độ
Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển của nấm sợi là từ 20
C đến 50
C, tối ưu
từ 220
C đến 270
C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35o
C đến

25. Đồ án tốt nghiệp
16
40o
C, cá biệt có một số loài có thể sống sót ở 00
C và ở 600
C (Trần Thị Nhã Uyên,
2010). Nấm P. lilacinum có thể tăng trưởng được trong một khoảng nhiệt độ khá
rộng, từ 8- 38°C (46 đến 100°F), nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển khoảng 26-30°C
(79-86°F) .
pH
Nói chung, nấm sợi có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH=6) nhưng pH
tối ưu là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9
(Ingold, 1967). Theo đó, loài P .lilacinus này cũng thích nghi với khoảng pH khá
rộng 4 – 8 (Trần Thị Nhã Uyên, 2010) và có thể tăng trưởng được trên môi trường
có sự thay đổi nhiều cơ chất (Samson, 1974; Anderson và ctv, 1995).
Nguồn dinh dưỡng
Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho
nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và
Ca. Nếu các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản thì sẽ
được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh
và tiết ra bên ngoài các loại enzyme ngoại bào thích hợp để cắt các đại phân tử này
thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào (Trần Thị Nhã Uyên, 2010).
Ảnh hưởng của nguồn C: Nguồn C có vai trò quan trọng đối với vi sinh vật và
là cơ chất cần thiết cho quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp. Nấm sợi có khả
năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau: các hidrat cacbon, các acid hữu cơ,
lipit…Nhiều loại nấm sợi còn có khả năng đồng hóa các chất hữu cơ rất bền hoặc
chất độc đối với nhiều sinh vật khác. Các loài nấm sợi thường không có những đòi
hỏi nghiêm ngặt về các loại thức ăn cacbon. Tuy nhiên, có thể là loại hợp chất này
đồng hóa tốt hơn loại hợp chất khác.
Ảnh hưởng của nguồn N: Nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh
trưởng. Có thể sử dụng cả nguồn N vô cơ và hữu cơ. Các nguồn N hữu cơ thường
dùng là pepton, casein, bột đậu nành, cao nấm men… Dễ tiêu nhất là nguồn N từ
casein.(Trần Thị Nhã Uyên, 2010). P. lilacinum rất dễ thích nghi với điều kiện sống,
tùy thuộc vào sự sẵn có của các chất dinh dưỡng trong môi trường xung quanh.

26. Đồ án tốt nghiệp
17
Chúng có thể vừa sống hoại sinh trong đất, vừa ký sinh côn trùng (Rombach và ctv,
1986; Marti và ctv, 2006; Fiedler và Sosnowska, 2007), vừa ký sinh tuyến trùng
(Tigrano và ctv, 1995).
1.3.6 Khả năng kiểm soát và sự ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến
trùng
Tuyến trùng ký sinh thực vật gây ra thiệt hại đáng kể về kinh tế đối với nhiều
loại cây trồng. Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng
thuốc hóa học. Tuy nhiên, các chất hóa học diệt tuyến trùng hiện đang được coi là
mối nguy hiểm đối với môi trường, đe dọa sức khỏe con người và động vật, chi phí
cao, và làm xuất hiện các loại tuyến trùng có khả năng kháng thuốc. P. lilacinum
được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học đối với một số loài tuyến trùng,
như M. incognita. Một số loài nấm có khả năng ký sinh như Exophiala pisciphila;
Scytalidium fulvum ký sinh trên trứng tuyến trùng; Scytalidium fulvum ký sinh bọc
trứng bằng các sợi nấm ăn sâu vào bên trong; Paraphoma radicina ký sinh bọc
trứng; Sợi nấm Phoma terrestris ăn sâu vào bên trong trứng; Phytophthora
cinnamomi; F. solani; Paecilomyces lilacinus; Paecilomyces variotii ký sinh trên
trứng tuyến trùng, Heterodera glycines; F.oxysporum ký sinh bọc trứng…(Ownley
Gintin và ctv, 1983).. . Liên quan đến việc phá vỡ hay làm thủng lớp vỏ của tuyến
trùng hay tuyến trùng còn chịu tác động dưới lực cơ học và tiêu hóa các enzyme từ
nấm Verticillium suchlasporium (Lopez-Llorca and Robertson,1992;
Stirling, 1991).
Vào năm 1979, Jatala và ctv phát hiện rằng P. lilacinum ký sinh lên trứng của
loài Meloidogyne incognita ở Peru và nhiều thử nghiệm dùng nó diệt tuyến trùng
gây hại được thực hiện ở đây đã thành công. P. lilacinum được quan sát ký sinh lên
trứng tuyến trùng lần đầu tiên bởi Lysek vào năm 1996. Đến năm 1991, Stirling và
West đã phân lập được P. lilacinum từ nhiều loài tuyến trùng sần rễ, tuyến trùng
bào nang và từ mẫu đất ở nhiều địa điểm.

27. Đồ án tốt nghiệp
18
Cơ chế của quá trình xâm nhập và kí sinh tuyến trùng
Trước khi lây nhiễm vào trứng tuyến trùng, P. lilacinum sẽ tiết enzyme phân
hủy và áp chặt vào vỏ trứng. Nó tạo ra đĩa áp khắp vỏ trứng tuyến trùng sau đó một
vài sợi nấm phát triển dọc theo bề mặt trứng tạo thành mạng lưới các sợi nấm trên
trứng. Sự hiện diện của đĩa áp quanh trứng là dấu hiệu trứng này sẽ bị lây nhiễm
(Money, 1998). Khi có mặt của protease cùng với chitinase của P. lilacinum làm tan
rã lớp vitelline, sự phân tách chitin và lipid của vỏ trứng M. javanica tạo điều kiện
vật lý cho sự xâm nhâp (Khan, 2004). Khi sợi nấm đã xâm nhập vào trứng, nó
nhanh chóng phá hủy các thành phần bên trong trứng, lúc này vỏ trứng trở nên rỗng,
bào tử tiếp tục sinh trưởng và xâm nhiễm trứng gần đó .

28. Đồ án tốt nghiệp
19
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: 04/2015 – 08/2015
Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh thuộc phòng Công nghệ vi sinh (Trung
tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM)
2.2 Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu trồng ở Vũng
Tàu. Trong đó, có 16 chủng được phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và 13 chủng
từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh.(Bảng 2.1).
2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm
Vật liệu
Con cái và khối trứng tuyến trùng Meloidogyne.spp được tách từ sần rễ tiêu và
được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý (NaOCl 0.5%) đến khi sử dụng.
Dụng cụ
Ống nghiệm 5ml, 10ml.
Đĩa Petri 5cm, 9cm
Pipep các loại
Ống đong các loại
Thước đo điện tử
Nồi nấu môi trường
Đèn cồn, diêm, dao cấy, que cấy, bông thấm, bông không thấm, giấy báo cũ,
đũa khuấy, giấy lọc, phễu, vải lọc…
Thiết bị
Nồi hấp vô trùng
Tủ cấy vô trùng
Tủ sấy (300
C – 1800
C)
Tủ ấm
Máy đo pH
Máy li tâm

29. Đồ án tốt nghiệp
20
Cân phân tích điện tử
Máy chụp ảnh kỹ thuật số
Tủ lạnh
Các môi trƣờng và thuốc thử sử dụng
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
Potato dextrose agar 39g
Nước cất 1000ml
pH = 6.1 – 6.5
Môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease dựa theo Gradisar và ctv, 2005 có
cải tiến
KH2PO4 1,5 g/l
K2HPO4.3H2O 1,4 g/l
CaCl2 .2H2O 0,4 g/l
MgSO4 .7H2O 0,41 g/l
NaCl 0,2 g/l
Casein 1%
Agar 16 g/l
Cách pha casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorence đến tan
hoàn toàn ( pha trong 100ml môi trường).
Dung dịch đệm Sorensen: hoà tan 5,96g Na2HPO4 trong nước thành 250ml
dung dịch Na2HPO4 1/15M. Hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml
dung dịch KH2PO4 1/15M. Trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung
dịch KH2PO4 1/15M, đo và chỉnh lại pH 7,6 thành dung dịch đệm sorensen 1/15 M.
Thuốc thử Trichloroecetic acid (TCA) 10%: 10g TCA hòa tan với nước cất
cho đủ 100ml ( thuốc thử dùng cho khả năng phân giải casein).
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase dựa theo Gradisar và ctv,
2005 có cải tiến
KH2PO4 1,5 g/l

30. Đồ án tốt nghiệp
21
K2HPO4.3H2O 1,4 g/l
NaNO3 3,5g/l
CaCl2 .2H2O 0,4 g/l
MgSO4 .7H2O 0,41 g/l
NaCl 0,2 g/l
Chitin huyền phù 1%
Agar 16 g/l
Chuẩn bị huyền phù chitin 1%: Cân 5g vỏ tôm xay nhuyễn hòa tan trong 50ml
dung dịch HCL đậm đặc. Khuấy đều trong 3 phút; sau đó thêm vào đó từ từ nước
cất lạnh 50
C cho tới 500ml, tạo huyền phù chitin màu trắng sữa. Huyền phù chitin
được lọc qua giấy lọc. Rửa lại với nước cất nhiều lần cho đến khi đạt pH trung tính
(pH=7). Bảo quản huyền phù trong tủ lạnh ( 20
C – 60
C ) (Dai và ctv, 2011).
Lugol (thuốc thử dùng để xác định khả năng phân giải chitin)
Iod tinh thể 1 g
KI 2 g
Nước cất 300 ml
Nghiền KI trong cối với 5 – 10 ml nước cất. Thêm Iod tinh thể vào và nghiền
cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Cho dung dịch nghiền vào cốc đong và thêm nước
cất đến 300 ml. Bảo quản trong lọ màu và sử dụng trong 30 ngày (Nguyễn Đức
Lượng, 2003)
Môi trường Water agar (WA)
Nước cất 1000ml
Agar 16 g/l
Môi trường khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng - Môi trường Water Agar
(WA) mềm
Nước cất 1000ml
Agar 14 g/l

31. Đồ án tốt nghiệp
22
Bảng 2.1. Danh sách các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu
ở Vũng Tàu
STT Ký hiệu chủng Nguồn gốc phân lập
1 KL 1.4
Đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh (lá
xanh)
2 KL 5.2
3 KL 5.3
4 HT 1.2
5 HT 2.2
6 HT 3.1
7 HT 4.1
8 HT 4.3
9 HT 5.1
10 HT 6.1
11 HT 6.3
12 HT 7.2
13 HT 7.3
14 KL 1.2
Đất vùng rễ cây tiêu bị bệnh vàng
lá
15 KL 1.3
16 KL 3.1
17 KL 4.1
18 KL 5.1
19 KL 6.1
20 KL 6.2
21 KL 8.2
22 HT 1.1
23 HT 1.3
24 HT 2.1
25 HT 2.3
26 HT 3.2
27 HT 3.3
28 HT 4.2
29 HT 5.2

32. Đồ án tốt nghiệp
23
2.4 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và
chitinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập ở các hệ sinh thái đất trồng tiêu
thuộc tỉnh Vũng Tàu.
Nội dung 2: Khảo sát và so sánh khả năng kí sinh khối trứng và con cái tuyến
trùng Meloidogyne spp. của một số chủng P. lilacinum đại diện từ đất vùng rễ cây
tiêu khỏe mạnh và bị bệnh ở Vũng Tàu.
2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1 Phƣơng pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum -
Phƣơng pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trƣờng thạch
Nguyên tắc
Khi nuôi cấy nấm trên môi trường có chứa cơ chất thích hợp (casein, chitin),
nấm P. lilacinum sẽ tiết ra enzyme tương ứng (protease,chitinase). Cơ chất sẽ bị
phân giải dưới tác động của enzyme tạo ra vòng trong suốt quanh khuẩn lạc khi nhỏ
thuốc thử vào, kích thước vòng trong suốt đó phản ánh hoạt động của enzyme (Lê
Thị Huệ, 2010).
Chuẩn bị
Giống: nấm P. lilacinum từ ống giống (bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 40
C)
được cấy chuyền sang môi trường PDA, ủ ở nhiệt độ 280
C ± 20
C trong 5 – 7 ngày
rồi cấy chuyền sang môi trường WA, ủ nhiệt độ 280
C ± 20
C trong 5 ngày.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, WA và môi trường cảm ứng
enzyme ngoại bào được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri.
Thực hiện
Dùng khoan thạch có đường kính 5 mm đã khử trùng, khoan lấy phần thạch có
tơ nấm trên môi trường WA sau đó dùng dao đã khử trùng lấy khoanh thạch đặt vào
tâm đĩa chứa 10ml môi trường cảm ứng enzyme. Mỗi chủng nấm khảo sát sẽ được
cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường. Dùng parafilm quấn đĩa lại trước khi đưa ra
khỏi tủ cấy. Ghi lại tên giống và ngày, giờ cấy để theo dõi.

33. Đồ án tốt nghiệp
24
Chỉ tiêu theo dõi
Đường kính vòng phân giải cơ chất (D, mm) và đường kính khuẩn lạc (d, mm)
được đo sau khi nhuộm thuốc thử ở thời điểm 24h, 48 và 72 h nuôi cấy. Đánh giá
mức độ phân giải cơ chất của nấm dựa vào hiệu D – d (mm). Hiệu D – d của nấm
càng lớn thì khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng nấm đó càng mạnh.
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme protease:
Chủng có khả năng tiết enzyme mạnh là chủng có D – d ≥ 9 mm.
Chủng có khả năng tiết enzyme khá là chủng có 9 mm > (D – d) ≥ 7 mm.
Chủng có khả năng tiết enzyme trung bình là chủng có 7 mm > (D – d) ≥ 5 mm.
+ Chủng có khả năng tiết enzyme yếu là chủng có (D – d) < 5mm
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme chitinase:
Chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh: D – d >5 mm.
Chủng có khả năng phân hủy chitin khá: 5 mm > (D – d) ≥ 4 mm.
Chủng có khả năng phân hủy chitin trung bình : 4 mm > (D – d) ≥ 3 mm.
Chủng có khả năng phân hủy chitin yếu : (D – d) < 3 mm
2.5.2 Phƣơng pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp.
của nấm P. lilacinum
Chuẩn bị
Giống: nấm P. lilacinum từ ống giống (bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 40
C)
được cấy chuyền sang môi trường PDA, ủ ở nhiệt độ 280
C ± 20
C. Sau 5 – 7 ngày,
cấy chuyển sang đĩa Petri chứa 10 ml môi trường WA mềm
Khối trứng và con cái tuyến trùng được rửa nhiều lần bằng nước cất đã được
hấp khử trùng để loại bỏ tạp chất nhằm hạn chế bị nhiễm trong quá trình theo dõi
khi thử khả năng ký sinh. Sau khi rửa sạch, cho chúng vào các đĩa Petri có đặt 1 lớp
giấy mỏng đã được làm ẩm và vô trùng.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, Môi trường WA mềm được
chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri.

34. Đồ án tốt nghiệp
25
Thực hiện
Dùng khoan thạch có đường kính 5 mm đã khử trùng khoan lấy phần thạch có
tơ nấm trên môi trường PDA rồi dùng dao đã khử trùng lấy khoanh thạch đặt vào
tâm đĩa môi trường WA mềm. Ngay sau đó, đặt vào mỗi đĩa 4 trứng hoặc con cái
tuyến trùng tại 4 điểm xung quanh và cách khoanh nấm 0.5cm. Mỗi chủng nấm
khảo sát sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường WA mềm. Ủ ở nhiệt độ
phòng (280
– 300
) theo dõi sự ký sinh của nấm.
Chỉ tiêu theo dõi
Theo dõi sự kí sinh sau mỗi 24 giờ đến khi có chủng nấm khảo sát kí sinh
hoàn toàn số khối trứng hay con cái ở 1 lần lặp lại. Tính số con cái hay khối trứng bị
nấm kí sinh (sợi nấm xâm nhập, sử dụng chất dinh dưỡng của kí chủ tạo thành một
cụm sợi nấm mang cả thể bình và bào tử xung quanh khối trứng hay con cái). Mức
độ ký sinh của tuyến trùng được tính theo phần trăm (%) và chia làm 4 cấp:
- Ký sinh mạnh: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trên 75%
- Ký sinh khá: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trong khoảng 50 -75%
- Ký sinh trung bình: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh từ 25 - 50%
- Tỷ lệ ký sinh yếu: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh dưới 25%
2.5.3. Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Thí nghiệm khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của P. lilacinum
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu CRD, gồm 2 yếu tố:
các chủng nấm Purpureocillium spp. (29 chủng) và thời gian khảo sát (3 mức thời
gian 24, 48, 72 giờ). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa Petri chứa môi
trường cảm ứng enzyme tương ứng.
Sau khi lấy chỉ tiêu, tính hiệu D-d bằng chương trình Excel. Phân tích
ANOVA hiệu D-d bằng phần mềm SAS 9.0. So sánh sự khác biệt giữa các nghiệm
thức theo LSD với mức ý nghĩa 0.05.
Thí nghiệm khảo sát khả năng ký sinh của P. lilacinum trên tuyến trùng
Meloidogyne spp.

35. Đồ án tốt nghiệp
26
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu CRD, gồm 2 yếu tố:
các chủng nấm Purpureocillium spp. tối ưu về khả năng tiết enzyme ngoại bào (10
chủng) và thời gian khảo sát (Đối với con cái: 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày; còn
đối với khối trứng: từ ngày 1 đến ngày thứ 14). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần
trên 3 đĩa Petri chứa môi trường WA mềm.
Sau khi lấy chỉ tiêu, tính tỷ lệ ký sinh bằng chương trình Excel. Phân tích
ANOVA tỷ lệ ký sinh bằng phần mềm SAS 9.0. So sánh sự khác biệt giữa các
nghiệm thức theo LSD với mức ý nghĩa 0.05.

36. Đồ án tốt nghiệp
27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum
3.1.1. Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm
P. lilacinum
Để kiểm tra khả năng tiết enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm
P. lilacinum, tiến hành theo phương pháp mục 2.5.1. Kết quả được ghi nhận trong
bảng 3.1, 3.2 và ANOVA (phụ lục).
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh
Chủng( A)
Vòng phân giải casein theo thời gian (D – d ( mm))
24h 48h 72h TB(A)
KL 1.4 6.910g-j
6.637h-m
9.410a-f
7.652BC
KL 5.2 7.413f-j
8.167c-j
6.583h-m
7.388BC
KL 5.3 7.480e-j
9.523a-e
11.233a
9.412A
HT 1.2 8.030c-j
8.777b-g
4.760lm
7.189BC
HT 2.2 6.197j-m
7.013g-k
7.530d-k
6.913CD
HT 3.1 7.507d-j
9.600a-d
6.967g-j
8.024BC
HT 4.1 6.680g-l
7.413f-j
10.467ab
8.187B
HT 4.3 7.077g-j
6.990g-k
6.520h-m
6.862CD
HT 5.1 6.713g-l
4.547m
5.860klm
5.707D
HT 6.1 5.553klm
7.163g-j
9.533a-e
7.417BC
HT 6.3 6.927g-j
8.593b-h
7.570d-k
7.697BC
HT 7.2 6.447i-m
6.470i-m
8.480b-i
7.132BC
HT 7.3 6.343j-m
7.180g-j
9.820abc
7.781BC
TB(B) 6.867B
7.544A
8.056A
CV(%)=17.296 F(A)=6.751 F(B)=13.871 F(A*B)=5.876
Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm
khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); **
khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).
Dựa vào bảng 3.1 có thể thấy tất cả 13 chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu
khỏe mạnh đều có khả năng tiết enzyme protease. Tuy nhiên, các chủng nấm
P. lilacinum tiết enzyme yếu nhất sau 24h nuôi cấy, 48h và 72h sau đó chúng tiết
enzyme tốt hơn nhưng đường kính vòng phân giải cơ chất không có sự khác biệt có
ý nghĩa về mặt thống kê. Sự khác nhau về lượng enzyme được tiết ra có sự thay đổi

37. Đồ án tốt nghiệp
28
như vậy là do trong 24h đầu nấm phải thích nghi với môi trường nên khả năng phân
giải cơ chất còn thấp. Trong 2 mốc thời gian kế tiếp nấm tiến hành dinh dưỡng và
phân giải cơ chất casein mạnh hơn để tận dụng nguồn cơ chất cho việc dinh dưỡng.
Khi xét riêng từng chủng, KL5.3 có khả năng tiết enzyme phân hủy casein tốt nhất
(đường kính vòng phân giải casein là 9.412 mm), chủng tiết enzyme yếu nhất là
HT5.1 (5.707 mm). Khi xét khả năng phân giải casein của các chủng nấm khảo sát
theo thời gian, thấy rằng khả năng phân giải cơ chất của các chủng nấm khác nhau
là khác nhau. Nhìn chung được chia thành 4 nhóm: Nhóm 1 là nhóm có khả năng
phân hủy cơ chất tối ưu ở ngay 24h đầu và giảm dần sau đó (KL5.2, HT4.3); nhóm
2 có sự khác biệt hẳn khi đột ngột giảm khả năng phân giải tại 48h và tăng lên sau
đó ở thời điểm 72h (HT5.1); nhóm 3 là nhóm các chủng có khả năng phân giải cơ
chất tối ưu ở 48h (HT1.2, HT3.1, HT6.3) và nhóm còn lại là nhóm có đường kính
vòng phân giải cơ chất tăng dần sau thời gian khảo sát (KL4.1, Kl5.3, HT2.2, HT4.1,
HT6.1, HT7.2, HT7.3). Nhìn chung, chủng KL5.3 có khả năng phân giải casein
mạnh nhất tại thời điểm 72h sau cấy, cũng tại thời điểm đó chủng HT4.1 cũng phân
giải casein tương đối mạnh. Chủng HT5.1 có khả năng phân giải casein yếu nhất ở
48h sau cấy (4.547 mm).
Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ
vùng rễ tiêu khỏe. Nhóm 1(A), nhóm 2 (B), nhóm 3 (C), nhóm 4 (D).
A B
C D

38. Đồ án tốt nghiệp
29
Từ kết quả ở bảng 3.2, cả 16 chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ
tiêu của cây tiêu bị bệnh đều có khả năng tiết protease. Thời gian có sự ảnh hưởng
trực tiếp đến khả năng tiết enzyme của các chủng, 72h là thời gian mà các chủng có
khả năng tiết enzyme mạnh nhất (đường kính vòng phân giải casein trung bình
8.112 mm) và có sự khác biệt rõ ràng so với thời điểm 24h và 48h. Khả năng tiết
enzyme protease của các chủng nấm không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống
kê ở 24h và 48h.
Ở bảng 3.2, khi xét riêng theo chủng, KL6.2 có khả năng phân giải casein tốt
nhất (9.398 mm) và KL1.3 là chủng thể hiện khả năng phân giải casein yếu nhất
(5.698 mm). Đồng thời, khi xét theo thời gian 24, 48 và 72h sau cấy, tương tự như
nhóm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh, các chủng nấm phân
lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh được chia thành 3 nhóm (đặc điểm tương tự như đối
với nhóm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh): Nhóm 2 bao
gồm các chủng: KL54.1, Kl5.2, KL6.2, KL8.2, HT2.3 và HT3.3. Nhóm 3: KL6.1,
HT1.1 và HT1.3. Nhóm 4: KL1.2, KL1.3, KL3.1, HT2.1, HT4.2, HT 5.2. Nhìn
chung, HT5.2 có khả năng tiết enzyme phân giải casein mạnh nhất tại thời điểm 72h
(10.557 mm), tiếp theo là chủng HT2.3. Chủng có khả năng phân giải casein yếu
nhất là HT3.2 tại thời điểm 48h sau cấy (4.323 mm).

39. Đồ án tốt nghiệp
30
Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh
Chủng( A)
Vòng phân giải casein theo thời gian (D - d (mm))
24h 48h 72h TB(A)
KL 1.2 6.940h-q
7.917e-m
8.173d-l
7.677CDE
KL 1.3 5.017rs
5.397p-s
6.680k-r
5.698H
KL 3.1 6.643k-r
6.753j-r
8.930a-g
7.442DEF
KL 4.1 6.883i-q
5.893o-s
8.213d-l
6.997EFG
KL 5.1 8.000e-m
7.247g-o
8.770a-h
8.001CDE
KL 6.1 6.953h-q
9.343a-e
6.227m-r
7.508DEF
KL 6.2 9.950a-d
8.093e-l
10.150abc
9.398A
KL 8.2 6.730j-r
5.130qrs
7.830e-n
6.563FGH
HT 1.1 7.993e-m
9.347a-e
7.350f-o
8.230BCD
HT 1.3 7.687e-o
10.290ab
7.333f-o
8.437A-D
HT 2.1 5.370qrs
6.067n-s
6.790i-r
6.076GH
HT 2.3 8.373c-k
7.223g-o
10.363ab
8.653ABC
HT 3.2 6.943h-q
4.323s
6.847i-r
6.038GH
HT 3.3 8.553b-j
10.370ab
6.950h-q
8.624ABC
HT 4.2 6.443l-r
7.807e-n
8.633b-i
7.628C-F
HT 5.2 7.767e-n
9.147a-f
10.557a
9.157AB
TB(B) 7.265B
7.522B
8.112A
CV(%)=14.933 F*A=11.352 F*B=9.054 F**AB=4.506
Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm
khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); **
khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).
Hình 3.2 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu bệnh. Chủng nấm nhóm 2 (A), nhóm 3 (B) và nhóm 4 (C).
A B C

40. Đồ án tốt nghiệp
31
So sánh khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm P. lilacinum
phân lập ở hai hệ sinh thái đất trồng tiêu khác nhau
Biểu đồ 3.1. Đường kính vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm
P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian.
Nhìn chung, cả hai nhóm nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu được
khảo sát có khả năng tiết enzyme protease không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt
thống kê, do khả năng phân giải casein của các chủng nấm trong cùng 1 nhóm sinh
thái đất trồng có mức chênh lệch rất khác nhau (biểu đồ 3.1).
Bảng 3.3. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme protease theo thời gian của các
chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau
Mạnh Khá Trung bình Yếu Mạnh Khá Trung bình Yếu
24h 0 38.462 61.538 0 6.25 37.5 56.25 0
48h 15.385 53.846 23.077 7.692 31.25 31.25 31.25 6.25
72h 7.692 69.231 23.077 0 18.75 50 31.25 0
Thời gian
Mức độ tiết enzyme của nấm phân lập
từ đất vùng rễ tiêu khỏe (%)
Mức độ tiết enzyme của nấm phân lập
từ đất vùng rễ tiêu bệnh (%)
Tuy nhiên, dựa vào bảng 3.3 ta có thể thấy rõ ràng mức độ phân giải casein
của các chủng nấm được phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng có sự khác nhau theo

41. Đồ án tốt nghiệp
32
từng thời điểm khảo sát. Ở 24h, hầu hết các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu
khỏe có khả năng tiết enzyme ở mức trung bình – khá, trong khi có 6.25% chủng
nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh tiết enzyme mạnh và còn lại là trung bình –
khá. Ở 48h, các chủng phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng có khả năng phân giải
casein trong khoảng từ yếu đến mạnh. Các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu
khỏe phân hủy cơ chất chủ yếu ở mức độ khá và chiếm 15.385% mạnh, các chủng
nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh có mức độ tiết enzyme mạnh, khá và trung
bình tương đương nhau. Tại thời điểm 72h, sự tiết enzyme của các chủng tập trung
trong khoảng trung bình đến mạnh và chiếm đa số là ở mức khá, đặc biệt, có
18.75% nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh phân giải casein mạnh. Nhìn chung,
các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh có khả năng phân giải casein ở
mức độ mạnh cao hơn hơn các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe. Giải
thích cho sự khác biệt này có thể là do sự tồn tại của các hợp chất có bản chất
protein trong đất vùng rễ tiêu bị bệnh .
3.1.2. Kết quả định tính hệ enzym ngoại bào chitinase của các chủng nấm P.
lilacinum
Tiến hành khảo sát khả năng tiết enzyme chitinase của 29 chủng nấm P.
lilacium theo phương pháp khảo sát sơ bộ mục 2.21. Kết quả được thể hiện qua
bảng 3.4 và 3.5.

42. Đồ án tốt nghiệp
33
Bảng 3.4. Vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất
vùng rễ tiêu khỏe mạnh
Chủng( A)
Vòng phân giải chitin theo thời gian ((D - d) mm)
24h 48h 72h TB(A)
KL 1.4 1.680rs
3.813h-l
1.037st
2.177F
KL 5.2 2.527m-r
4.817fg
0.207st
2.538F
KL 5.3 3.877h-k
6.907bc
4,153ghi
4.979B
HT 1.2 2.950l-p
6.883bc
2.683m-q
4.172CD
HT 2.2 2.843m-q
6.977bc
5.710de
5.177B
HT 3.1 3.370i-m
7.183bc
1.783rs
4.112CD
HT 4.1 3.113j-o
6.577bcd
1.750rs
3.813D
HT 4.3 3.263j-n
6.303cd
2.180p-r
3.916CD
HT 5.1 6.300cd
6.937bc
9.150a
7.462A
HT 6.1 3.927hij
5.110ef
2.037q-r
3.691DE
HT 6.3 3.027k-p
7.377b
2.787m-q
4.397C
HT 7.2 2.323l-o
4.520fgh
5.207ef
4.017CD
HT 7.3 2.263m-o
5.040efg
2.447n-r
3.250E
TB(B) 3.190B
6.034A
3.169B
CV(%)=13.237 F*A=15.352 F*B=105.968 F**AB=4.810
Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm
khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); **
khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).
Các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ cây tiêu khỏe có khả năng
tiết enzyme chitinase mạnh nhất tại thời điểm 48h sau khi nuôi cấy (đường kính
vòng phân giải cơ chất trung bình 6.034 mm). Sự khác biệt về khả năng phân hủy
chitin ở thời điểm 24h và 72h không có ý nghĩa về mặt thống kê (bảng 3.4).
Khi xét riêng theo chủng nấm, HT5.1 tiết enzyme chitinase mạnh nhất (đường
kính vòng phân giải cơ chất 7.462 mm), yếu nhất là chủng KL1.4 và KL5.2. Từ
bảng 3.4 có thể thấy rằng khả năng phân giải cơ chất của các chủng nấm phân lập từ

43. Đồ án tốt nghiệp
34
đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh có sự khác nhau theo thời gian và có thể chia thành 2
nhóm: Nhóm 1 là nhóm các chủng có đường kính vòng phân giải chitin tăng dần
theo thời gian khảo sát (HT5.1 và HT7.2), nhóm các chủng còn lại có khả năng
phân giải chitin tối ưu ở 48h và giảm xuống ở 72h.
Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin sau 72h của các chủng nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu khỏe. Chủng nấm nhóm 1 (A) và nhóm 2 (B).
Dựa vào bảng kết quả thống kê bảng 3.5 ta thấy các chủng nấm P. lilacinum
phân lập từ đất vùng rễ cây tiêu bệnh có khả năng tiết enzyme chitinase tốt nhất sau
48h nuôi cấy (đường kính vòng phân giải cơ chất trung bình 5.534 mm) và yếu nhất
sau 72h (1.847 mm). Xét theo từng chủng, HT1.1 phân giải chitin mạnh nhất (4.600
mm), chủng tiết enzyme yếu nhất là KL6.1 và KL6.2. Các chủng nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu bị bệnh phân giải chitin không chia theo từng nhóm như các chủng
nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh, tất cả 16 chủng nấm phân lập từ vùng
này đều có khả năng phân giải chitin tối ưu ở 48h. Trong đó, HT1.1 phân giải chitin
mạnh nhất (8.213 mm), tiếp theo là các chủng HT4.2, HT2.1 và KL6.2, chủng phân
giải chtin yếu nhất là KL6.1 (0.640 mm).
A B

44. Đồ án tốt nghiệp
35
Bảng 3.5. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh
Chủng( A)
Vòng phân giải chitin theo thời gian (D - d (mm))
24h 48h 72h TB(A)
KL 1.2 2.537i-o
5.293cde
1.770p-s
3.200DEF
KL 1.3 2.447j-p
5.36b-e
0.883st
2.897EF
KL 3.1 3.593ghi
6.097bcd
1.307q-t
3.666BCD
KL 4.1 2.557i-o
4.597efg
3.230h-l
3.461CDE
KL 5.1 2.327k-q
3.457hij
2.137l-r
2.640F
KL 6.1 1.953n-s
5.443b-e
0.640t
2.677F
KL 6.2 2.600i-o
6.357bc
1.363p-t
3.440DE
KL 8.2 2.677i-o
5.017de
1.977n-s
3.223DEF
HT 1.1 3.333h-k
8.213a
2.253k-q
4.600A
HT 1.3 3.003h-n
4.710ef
1.800p-s
3.171DEF
HT 2.1 3.627f-i
6.170bc
2.753i-o
4.183AB
HT 2.3 3.890fgh
5.330b-e
3.557g-j
4.259AB
HT 3.2 3.237h-l
5.023de
1.087rst
3.116DEF
HT 3.3 2.693i-o
5.577b-e
1.070rst
3.113DEF
HT 4.2 3.173h-m
6.413b
2.693i-o
4.093ABC
HT 5.2 2.107m-r
5.480b-e
1.027rst
2.871EF
TB(B) 2.860B
5.534A
1.847C
CV(%)=20.072 F*A=3.157 F*B=174.153 F**AB=1.636
Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm
khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); **
khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

45. Đồ án tốt nghiệp
36
Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải chitin của
chủng nấm HT1.1 sau 48h (A) và 72h (B)
So sánh khả năng tiết enzyme chtinase của các chủng nấm P. lilacinum
phân lập ở hai hệ sinh thái đất trồng tiêu khác nhau
Biểu đồ 3.2. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum
phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian.
Nhìn chung, khả năng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ hai hệ
sinh thái đất trồng tiêu khác nhau không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê.
Do mức độ phân giải chitin của các chủng nấm trong cùng một nhóm có sự khác
biệt rất lớn (biểu đồ 3.2).
B
A

46. Đồ án tốt nghiệp
37
Bảng 3.6. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme chtinase theo thời gian của các
chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau
Mạnh Khá Trung bình Yếu Mạnh Khá Trung bình Yếu
24h 7.692 0 46.154 46.154 0 0 43.75 56.25
48h 76.923 15.385 7.692 0 81.25 12.5 6.25 0
72h 23.077 7.692 0 69.231 0 0 12.5 87.5
Thời gian
Mức độ tiết enzyme của nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu khỏe (%)
Mức độ tiết enzyme của nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu bị bệnh (%)
Mức độ phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất đất
trồng khác nhau là khác nhau theo thời gian. Ở 24h đầu, tất cả các chủng nấm phân
lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh phân hủy chitin ở mức trung bình yếu. Tương tự, nhưng
các chủng nấm phân lập đất vùng rễ tiêu khỏe ngoài mức trung bình và yếu thì có
7.692 % chủng phân hủy chitin mạnh. Ở 48h, hầu hết các chủng có mức phân hủy
chitin từ trung bình đến mạnh nhưng chiếm đa số là mạnh. Ở 72h, các chủng phân
hủy chitin ở mức yếu là chính, nhưng đối với nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ
tiêu khỏe có 23.077% chủng tiết enzyme mạnh. Qua thời gian khảo sát khả năng tiết
enzyme chitinase, các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe có số chủng
phân hủy chitin ở mức độ mạnh nhiều hơn so với nhóm phân lập từ đất vùng rễ tiêu
bệnh.
Tuyển chọn các chủng nấm có khả năng tiết enzyme ngoại bào tốt
Tiêu chí chọn chủng: Các chủng có khả năng tiết enzyme ngoại bào hoặc
protease mạnh nhất hoặc chitin mạnh nhất hoặc cả 2 loại enzyme ngoại bào đều
mạnh.
Đối với nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh, chọn ra 5 chủng
KL5.3, HT1.2, HT3.1, HT5.1, HT6.3. Còn đối với nhóm nấm phân lập từ đất vùng
rễ tiêu khỏe, thì các chủng được chọn là KL6.2, HT1.1, HT2.3, HT3.3, HT5.2. Vậy,
có tất cả 10 chủng nấm tối ưu về khả năng tiết enzyme ngoại bào được chọn.

47. Đồ án tốt nghiệp
38
3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng
Meloidogyne spp.
3.2.1. Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái
Meloidogyne spp.
Dựa vào bảng 3.7, thấy các chủng nấm ký sinh trên con cái Meloidogyne với tỷ
lệ trên 90% sau 4 ngày, hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Eapen và ctv
(2005).
Bảng 3.7. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái Meloidogyne spp. theo
thời gian
STT Chủng
Tỷ lệ ký sinh
NGÀY 1 NGÀY 2 NGÀY 3 NGÀY 4
1 KL 5.3 43.33bcd
75.67c
82.00cd
86.33cd
2 HT1.2 54.00a
84.33a
90.67ab
94.33ab
3 HT3.1 52.33ab
84.00a
94.67a
96.67a
4 HT5.1 52.33ab
82.00ab
88.33abc
91.00a-d
5 HT6.3 47.33a-d
76.67b
85.00bcd
88.33bcd
6 KL6.2 41.00d
72.00c
79.33d
85.33d
7 HT1.1 53.00ab
82.33a
87.67abc
92.00a-d
8 HT2.3 51.00abc
85.00a
93.33a
95.67a
9 HT3.3 46.00bcd
82.00ab
89.67ab
92.67abc
10 HT5.2 53.33ab
83.00a
89.33ab
92.67abc
CV (%) 9,253 3,983 4,763 4,632
F 64,181* 57.070* 68.296* 43,352*
Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm
khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); **
khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).
Khi quan sát dưới kính soi nổi Olympus (4X), sau 1 ngày sợi nấm P. lilacinum
đã tiếp xúc với con cái trên bề mặt môi trường. Trong đó, sợi nấm chủng HT1.2 có
khả năng bao quanh con cái tuyến trùng nhanh nhất, chủng yếu nhất là chủng KL6.2.
Sau đó, vào ngày thứ 2, sợi nấm bắt đầu phủ khắp cơ thể con cái một cách nhanh
chóng. Hầu hết các chủng đều có khả năng ký sinh rất tốt. Chủng có khả năng ký

48. Đồ án tốt nghiệp
39
sinh kém nhất là chủng KL5.3 và KL6.2 (cùng mức phân hạng c). Ngày thứ 3, các
sợi nấm bao quanh con cái dày hơn ( Hình3.1.B) và hầu hết các chủng nấm đều ký
sinh con cái ở mức độ mạnh. Và khả năng ký sinh của các chủng nấm tăng hơn ở
ngày thứ 4 trong đó chủng có tỷ lệ ký sinh tốt nhất là HT3.1 và HT1.1 (cùng mức
phân hạng a). KL6.1 có tỷ lệ ký sinh thấp nhất (mức phân hạng d). Nấm P.
lilacinum ký sinh con cái tuyến trùng mạnh bởi vì các sợi nấm có thể xâm nhập vào
qua các lỗ mở tự nhiên trên cơ thể như hậu môn, âm đạo..(Jatala, 1986). Tuy nhiên,
theo như báo cáo sau đó của Holland và ctv (1999), Khan và ctv (2006) cơ thể con
cái bị sợi nấm xâm nhiễm trực tiếp do sự vắng mặt của các liên kết của lớp chitin
trên cơ thể con cái. Khan và ctv (2006) giải thích về sự khác biệt đó là do thành
phần enzyme khác nhau của mỗi chủng giúp cho việc thâm nhập trực tiếp vào cơ
thể con cái.
Hình 3.5 Con cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh khi chụp dưới kính
soi nổi ở độ phóng đại 4X. Con cái chưa bị ký sinh (A), nấm bắt đầu xâm nhập và
ký sinh con cái (B) và con cái bị nấm ký sinh hoàn toàn (C).
Khả năng ký sinh con cái Meloidogyne spp. của cả hai nhóm nấm phân lập từ
hai hệ sinh thái đất trồng khác nhau hoàn toàn không có sự khác biệt có ý nghĩa về
mặt thống kê (biểu đồ 3.3) do khả năng ký sinh không đồng đều giữa các chủng
trong cùng một vùng. Từ đó có thể thấy việc ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm
không phụ thuộc vào nguồn gốc phân lập. Ở bảng 3.8, mức độ ký sinh của nhóm
nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe ngày đầu tiên hầu hết ở mức trung bình và
khá, còn đối với nhóm nấm còn lại có mức độ ký sinh tuyến trùng từ khá đến mạnh.
A B C

49. Đồ án tốt nghiệp
40
Đến ngày thứ 2, có sự thay đổi khi 100% số chủng của nhóm nấm phân lập từ đất
vùng rễ tiêu khỏe đạt mức ký sinh mạnh, nhóm nấm phân lập từ vùng rễ tiêu bị
bệnh chỉ 80% chủng có mức ký sinh mạnh. Ngày thứ 3 và 4 các chủng của cả hai
nhóm đều cho khả năng ký sinh mạnh đạt 100%. Sự khác nhau về khả năng ký sinh
của các chủng nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng khác nhau trong ngày đầu
tiên là do các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh thích nghi với môi
trường, nơi có mật độ tuyến trùng tồn tại nhiều hơn, nên khả năng ký sinh cũng
mạnh hơn.
Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của nấm P.
lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian.
Bảng 3.8. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh con cái Meloidogyne spp. của các
chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian
Mạnh Khá Trung bình Yếu. Mạnh Khá Trung bình Yếu.
NGÀY1 0 60 40 0 60 40 0 0
NGÀY2 100 0 0 0 80 20 0 0
NGÀY3 100 0 0 0 100 0 0 0
NGÀY4 100 0 0 0 100 0 0 0
Mức độ ký sinh của nấm phân lập từ đất
vùng rễ tiêu khỏe (%)
Mức độ ký sinh của nấm phân lập từ đất
vùng rễ tiêu bệnh (%)
Thời gian

50. Đồ án tốt nghiệp
41
3.2.2 Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của P. lilacinum trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp.
Tiến hành chọn các chủng nấm P. lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh trong 29 chủng, rồi thử khả năng ký sinh của
chúng lên khối trứng của tuyến trùng Meloidogyne spp. theo phương pháp mục 2.5.2. Kết quả hiển thị trong bảng 3.9, 3.10 và biểu đồ 3.6.
Bảng 3.9. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên khối trứng Meloidogyne spp. theo thời gian
STT Chủng nấm
Tỷ lệ ký sinh (%)
NGÀY 1 NGÀY 2 NGÀY 3 NGÀY 4 NGÀY 5 NGÀY 6 NGÀY 7 NGÀY 8 NGÀY 9 NGÀY 10 NGÀY 11 NGÀY 12 NGÀY 13 NGÀY 14
1 KL5.3 3.33b
4.33b
6.00b
7.67b
10.00b
12.33b
13.33b
14.67b
17.33c
19.67c
23.00c
24.67c
25.67c
27.00c
2 HT1.2 9.33b
12.67b
17.00ab
20.33ab
23.00ab
26.00ab
30.00ab
33.00ab
44.00ab
49.67ab
53.67ab
55.00ab
56.00ab
57.67ab
3 HT3.1 11.00ab
14.00ab
13.33b
16.00b
18.33b
20.67b
22.33b
24.00b
28.67bc
36.67bc
41.00abc
44.67abc
47.33bc
48.67bc
4 HT5.1 23.33 a
29.00a
33.33a
38.33a
44.00a
50.00a
54.00a
60.00a
67.67a
72.00a
76.00a
79.33a
82.00a
83.67a
5 HT6.3 2.67b
4.33b
5.00b
6.67b
8.00b
9.67b
11.33b
12.33b
17.00c
20.33c
23.00c
25.00c
26.33c
26.67c
6 KL6.2 4.00b
5.67b
8.67b
10.67b
12.67b
14.67b
17.67b
21.00b
24.33bc
35.00bc
37.33bc
39.67bc
41.33bc
43.00bc
7 HT1.1 2.00b
4.00b
5.33b
7.33b
8.67b
10.00b
12.67b
15.00b
23.67bc
28.00bc
32.33bc
34.33bc
36.00bc
37.67bc
8 HT2.3 6.33b
8.33b
10.67b
13.67b
16.33b
19.67b
23.33b
28.00b
33.67bc
37.33abc
40.67bc
43.67bc
48.67abc
50.33abc
9 HT3.3 2.67b
4.00b
7.00b
9.33b
11.33b
13.33b
17.00b
19.00b
27.00bc
33.00bc
35.00bc
37.33bc
39.00bc
41.00bc
10 HT5.2 2.33b
3.67b
5.33b
7.00b
8.00b
9.00b
9.67b
11.67b
21.00bc
23.67bc
26.00bc
27.67bc
29.00bc
31.00bc
CV (%) 47.928 46.291 39.557 36.546 39.557 34.939 33.293 31.888 26.463 25.717 23.529 22.171 21.212 20.41
F 3.328* 3.663* 3.87* 3.925* 3.870* 4.593* 4.755* 5.161* 4.966* 4.727* 4.553* 4.488* 4.592* 4.520*
Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có
ý nghĩa (mức α = 0,05); ** khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

51. Đồ án tốt nghiệp
42
Nhìn chung, tất cả 10 chủng được chọn đều có khả năng ký sinh trên khối
trứng Meloidogyne spp. và thử nghiệm ký sinh diễn ra trong 14 ngày. Trong 5 ngày
đầu tiên, sợi nấm chỉ mới bắt đầu tiếp xúc với bề mặt khối trứng chứ chưa đâm
xuyên vào chúng. Dựa vào bảng 3.9, các chủng thuộc nhóm nấm phân lập từ đất
vùng rễ cây khỏe có khả năng ký sinh tương đối tốt hơn các chủng nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu bệnh. Theo đó, trong 6 ngày đầu chủng HT5.1 có tỷ lệ ký sinh đạt
cao nhất khoảng 50%, tiếp theo là chủng HT1.2, đa số các chủng còn lại ký sinh yếu.
Ở ngày thứ 7 và thứ 8 kết quả cũng tương tự như vậy. Vào ngày thứ 9, chủng HT
5.1 vẫn duy trì khả năng ký sinh tốt nhất (50 – 75%); ngoài ra, còn có thêm chủng
HT2.1, HT2.3 và HT3.3 có mức độ xâm nhiễm tuyến trùng trong khoảng 25 - 50%.
Kết quả tương tự cho đến ngày thứ 11, HT5.1 có khả năng ký sinh khối trứng mạnh
nhất, tỷ lệ xâm nhiễm lớn hơn 75%. Ở ba ngày cuối, chỉ duy nhất HT 5.1 có khả
năng ký sinh khối trứng mạnh, còn lại hầu hết ở mức trung bình và ở mức độ khá là
chủng HT1.2 và HT2.3. Có thể thấy rằng, việc ký sinh lên khối trứng tuyến trùng
của các chủng phụ thuộc vào khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase mạnh, trong
đó chủng HT5.1 có khả năng tiết chitinase mạnh và tỷ lệ ký sinh đạt 83,67% ở ngày
thứ 14
Hình 3.6 Khối trứng Meloidogyne sp. bị nấm ký sinh. Khối trứng bắt đầu bị nấm
tiếp xúc (A), sợi nấm bao phủ xung quanh khối trứng sau 9 ngày (B), khối trứng bị
nấm ký sinh sau 14 ngày (C).
A B C

52. Đồ án tốt nghiệp
43
Nhìn chung, các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe có khả năng ký
sinh khối trứng cao hơn so với nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh ở tất cả
các khoảng thời gian khảo sát, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt
thống kê do khả năng ký sinh khối trứng của các chủng nấm trong cùng một vùng
không đồng đều. Điều này được thể hiện trong biểu đồ 3.4 và bảng 3.10. Theo bảng
3.10, trong 7 ngày đầu tiên các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh chỉ
đạt mức độ ký sinh yếu trên khối trứng tuyến trùng, trong khi các chủng phân lập từ
đất vùng rễ tiêu khỏe duy trì khả năng ký sinh yếu - trung bình đến hết ngày thứ 5
nhưng sang ngày thứ 6, 7, 8 có 20% số chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe
đạt mức ký sinh khá. Trong 4 ngày cuối có sự thay đổi đáng kể, các chủng nấm
phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh ký sinh khối trứng tuyến trùng chỉ ở mức độ trung
bình là chủ yếu. Trong khi các chủng phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe ký sinh
tuyến trùng ở mức độ từ trung bình đến mạnh (20% chủng ký sinh ở mức độ mạnh).
Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. trung bình của nấm P.
lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian.

53. Đồ án tốt nghiệp
44
Bảng 3.10. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. của các
chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian
Mạnh Khá Trung bình Yếu Mạnh Khá Trung bình Yếu
Ngày 1 0 0 0 100 0 0 0 100
Ngày 2 0 0 20 80 0 0 0 100
Ngày 3 0 0 20 80 0 0 0 100
Ngày 4 0 0 20 80 0 0 0 100
Ngày 5 0 0 20 80 0 0 0 100
Ngày 6 0 20 20 60 0 0 0 100
Ngày 7 0 20 20 60 0 0 0 100
Ngày 8 0 20 20 60 0 0 20 80
Ngày 9 0 20 40 40 0 0 40 60
Ngày 10 0 20 40 40 0 0 80 20
Ngày 11 20 20 20 40 0 0 100 0
Ngày 12 20 20 40 20 0 0 100 0
Ngày 13 20 20 60 0 0 0 100 0
Ngày 14 20 20 60 0 0 20 80 0
Mức độ ký sinh của nấm phân lập từ đất vùng rễ
tiêu khỏe (%)
Mức độ ký sinh của nấm phân lập từ đất vùng
rễ tiêu bệnh (%)
Thời gian
Vậy, khả năng ký sinh khối trứng hay con cái tuyến trùng Meloidogyne spp.
của các chủng nấm P. lilacinum không phụ thuộc vào nguồn gốc phân lập (hay hệ
sinh thái đất mà chúng tồn tại). Trong nghiên cứu này, việc ký sinh tuyến trùng phụ
thuộc vào hệ enzyme ngoại bào mà chúng tiết ra môi trường, chủng nấm tiết đồng
thời enzyme protease và chitinase mạnh thì có khả năng xâm nhập tuyến trùng
mạnh. Tuy nhiên, kết luận chỉ trong nội bộ của nghiên cứu với nhân lực và thiết bị
chưa đầy đủ nên cần phải có nhiều nghiên cứu nữa bởi vì sự ký sinh tuyến trùng là
một quá trình phức tạp.