Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ THÔNG SỐ
CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN BIOETHANOL
TỪ VỎ CHUỐI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SSCF
SỬ DỤNG SACCHAROMYCES CEREVISIAE
KẾT HỢP VỚI PICHIA ANOMALA
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: Th.S Trần Thị Tưởng An
Sinh viên thực hiện: Đoàn Thị Diễm Phương
MSSV: 1151110026 Lớp: 11DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2015

2. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp “Khảo sát tối ưu hóa một số thông số
quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối bằng phương pháp SSCF sử dụng
Saccharomyces cerevisiae kết hợp với Pichia anomala.”là công trình nghiên cứu
thực sự của cá nhân tôi, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức
và dựa trên sự hướng dẫn của Th.S Trần Thị Tưởng An.
Các số liệu sử dụng trong đồ án là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng.
Nội dung đồ án có kham khảo và sử dụng các tài liệu thông tin được đăng tải trên
các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của đồ án.

3. LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công Nghệ
Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực
Phẩm- Môi Trường đã tạo điều kiện cho em được thực hiện bài khóa luận này. Em
xin cảm ơn toàn thể thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt các
kiến thức và kỹ năng chuyên sâu để em có thể hoàn thành bài khóa luận này.
Trong suốt khoảng thời gian làm khóa luận tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm
Năng Lượng Sinh Học – Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh. Em xin chân thành
gửi lời cảm ơn đến:
Th.S Trần Thị Tưởng An, trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh. Cô
luôn luôn theo sát, tận tình chỉ bảo, truyền đạt các kiến thức, kinh nghiệm chuyên
môn, hướng dẫn, động viên em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh, các chị làm việc trong phòng thí nghiệm
đã nhiệt tình hỗ trợ em trong suốt thời gian làm việc ở đây.
Cảm ơn bố mẹ, người đã luôn luôn bên cạnh động viên tinh thần em trong những
lúc em cảm thấy khó khăn nhất.
Cuối cùng, cảm ơn tất cả các bạn trong phòng thí nghiệm những người bạn đã
luôn bên cạnh và giúp đỡ em trong mọi việc.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn.
Đoàn Thị Diễm Phương

4. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................2
MỤC LỤC................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ vi
LỜI MỞ ĐẦU.............................................................................................................8
1. Đặt vấn đề......................................................................................................8
2. Mục tiêu đề tài. ..............................................................................................9
3. Nội dung nghiên cứu. ....................................................................................9
4. ..............................................................................9
5. Bố cụ ..........................................................................................10
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................11
1.1. Giới thiệu về bioethanol. .............................................................................11
1.1.1. Các thế hệ của bioethanol..................................................................14
1.1.2. Khái niệm. .........................................................................................11
1.1.3. Nguồn nguyên liệu lignocellulose để sản xuất bioethanol................15
1.1.4. Ứng dụng lợi ích và hạn chế của Bioethanol ....................................17
1.1.5. Quy trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose.....................18
1.1.6. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Bioethanol ở tại Việt Nam và trên thế
giới. 26
1.1.7. Tình hình nghiên cứu bioethanol tại Việt Nam và trên thế giới........30
1.2. Giới thiệu về cây chuối sứ.............................................................................1

5. Đồ án tốt nghiệp
ii
1.2.1 ối....................................................................1
1.2.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái chuối .................1
1.2.3 Tình hình sản xuất, diện tích và sản lượng chuối tại Việt Nam .............2
1.2.4 Tình hình sản xuất và sản lượng chuối trên thế giới...............................4
1.3. Giới thiệu chủng nấm men lên men bioethanol.............................................5
1.3.1 Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae...........................................5
1.3.2 Chủng nấm men Pichia anomala. ..........................................................7
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.................................................................9
2.3 Vật liệu. .........................................................................................................9
2.3.1 Nguyên vật liệu.......................................................................................9
2.3.2 Hóa chất sử dụng. ...................................................................................9
2.3.3 Thiết bị ứu..........................................10
2.4 Phương pháp...............................................................................................11
2.4.1 Bố trí thí nghiệm...................................................................................11
2.4.2 Tiến hành thực hiện. .............................................................................12
2.5 Phương pháp phân tích. ...............................................................................15
2.5.1 Phương pháp vi sinh. ............................................................................15
2.5.2 Phương pháp hóa lý. .............................................................................17
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................24
3.1Khảo sát giống nấm men. .............................................................................24
3.1.1.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae. ...............................................24
3.1.1.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae. ...............................................25
3.2 Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối khô ..............................27
3.3 Khảo sát tiền xử lý nguyên liệu bằng acid acetic 4%..................................28

6. Đồ án tốt nghiệp
iii
3.4 Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời (SSCF). .....................................29
3.4.1 Khảo sát thời gian lên men. ..................................................................30
3.4.2 Khảo sát nhiệt độ lên men. ...................................................................34
3.4.3 Khảo sát tỷ lệ nấm men.........................................................................37
3.4.4 Khảo sát tỷ lệ enzyme...........................................................................40
3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH..................................................................42
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................48

7. Đồ án tốt nghiệp
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
PL Phụ lục
SSF Simultaneous saccharification and
fermentation
SSCF Simultaneous sacchrification and co-
fermentation
CT Công thức
PT Phương trình
SHF Separate hydrolysis and fermentation
SC Saccharomyces cerevisiae
PA Pichia anomala
DNS 3,5 – dinitrosalycylic acid
SA Đường hóa các thành phần của cellulose
HF Lên men hexose
PF Lên men pentose
HPLC High-performance liquid
chromatography
SDA Sabouraud Dextroe Broth
SDB Sabouraud Dextroe Agar

8. Đồ án tốt nghiệp
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.. Thông số của bioethanol so với xăng......................................................12
Bảng 1.2. Ước tính chi phí sản xuất bioethanol so với xăng....................................12
Bảng 1.3. Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp tiền xử lý........................20
Bảng 1.4. Một số nhà máy sản xuất bioethanol đang hoạt động ở Việt Nam [34]. 28
Bảng 1.5. Một số công trình nghiên cứu bioethanol từ phụ phẩm trái cây trên thế
giới.............................................................................................................................30
Bảng 1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ chuối..............................1
Bảng 3.1. Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm...........................................................14
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của vỏ chuối............................................................27
Bảng 3.2. Một số thành phần hóa học của vỏ chuối khô sau khi tiền xử lý với acid
acetic 4% ...................................................................................................................29

9. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol.....................................................11
Hình 1.2 Giá dầu năm năm gần đây..........................................................................13
Hình 1.3 Quy trình chuyển đổi sinh khối lignocellulose thành bioethanol. .............19
Hình 1.4 Tiền xử lý lignocellulose giải phóng cellulose. .........................................20
Hình 1.5 Chuối sứ. ......................................................................................................1
Hình 1.6 Saccharomyces cerevisiae............................................................................5
Hình 1.7 Pichia anomala. ............................................................................................8
Hình 3.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae .........................................................24
Hình 3.2 Nấm men Pichia anomala...........................................................................24
Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae trong môi trường SDB
...................................................................................................................................25
Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng Pichia anomala trong môi trường SDB .............26
Hình 3.6a. Thay đổi độ cồn theo thời gian lên men..................................................32
Hình 3.6c. Sự thay đổi đường khử theo thời gian lên men. ......................................32
Hình 3.6d. Sự thay đổi hàm lượng cellulose theo thời gian lên men........................33
Hình 3.7a. Sự thay đổi nồng độ cồn theo nhiệt độ lên men......................................35
Hình 3.7b.Sự thay đổi mật độ tế bào theo nhiệt độ lên men.....................................35
Hình 3.7c. Thay đổi hàm lượng đường khử và cellulose theo nhiệt độ lên men.....36
Hình 3.8a. Thay đổi độ cồn theo tỷ lệ nấm men. ......................................................38
Hình 3.8b. Thay đổi mật độ tế bào theo tỷ lệ nấm men............................................38
Hình 3.8c. Sự thay đổi đường khử và cellulose theo tỷ lệ nấm men. .......................39
Hình 3.9b. Thay đổi mật độ tế bào theo tỷ lệ enzyme. .............................................41
Hình 3.9c. Sự thay đổi đường khử và cellulose theo tỷ lệ enzyme...........................41
Hình 3.10a. Sự thay đổi độ cồn theo pH...................................................................43
Hình 3.10b. Thay đổi mật độ tế bào theo pH............................................................43
Hình 3.10c.Sự thay đổi đường khử và cellulose theo pH. ........................................44
Hình 3.11a. Sự thay đổi độ cồn theo tốc độ khuấy đảo. ...........................................45

10. Đồ án tốt nghiệp
vii
Hình 3.11b. Sự thay đổi mật độ tế bào theo tốc độ khuấy đảo. ................................45
Hình 3.11c Sự thay đổi hàm lượng đường khử và cellulose theo tốc độ khuấy đảo.
...................................................................................................................................46

11. Đồ án tốt nghiệp
8
LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hiện nay, thế giới đang đứng trước nguy cơ khủng hoảng năng lượng trầm
trọng. Như chúng ta đã biết, dầu mỏ và khí đốt hiện chiếm 60 – 80 % nguồn năng
lượng thế giới. Theo dự báo của các nhà khoa học trên thế giới, với tốc độ tiêu thụ
như hiện nay và trừ lượng dầu mỏ hiện có, nguồn năng lượng này sẽ bị cạn kiệt
trong vòng 40 – 50 năm nữa. Để ổn định và đảm bảo an ninh năng lượng đáp ứng
cho nhu cầu con người cũng như các ngành công nghiệp, các nhà khoa học đang tập
trung nghiên cứu tìm ra những nguồn nhiên liệu mới, trong đó nghiên cứu phát triển
nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối động, thực vật là một hướng đi có thể
tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế phần nào nguồn nhiên liệu hoá thạch đang cạn kiệt,
đảm bảo an ninh năng lượng cho từng quốc gia.
Sử dụng nhiên liệu sinh học mang lại các lợi ích như giảm thiểu ô nhiễm môi
trường vì nguyên liệu sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học không chứa các hợp
chất thơm, hàm lượng lưu huỳnh thấp, không chứa chất độc hại, mặt khác nhiên liệu
sinh học khi thải vào đất có tốc độ phân hủy sinh học cao nhanh hơn gấp 4 lần so
với nhiên liệu dầu mỏ và do đó giảm được rất nhiều tình trạng ô nhiễm nước ngầm.
Bioethanol là nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tương lai thay thế cho nguồn
nhiên liệu hóa thạch, bởi nó là nguồn nhiên liệu có thể tái tạo. Bioethanol tồn tại ở
dạng lỏng có thể được sử dụng thích nghi như nguồn nhiên liệu mới cho tương lai.
Tuy nhiên, những sản phẩm bioethanol có nguồn gốc từ tinh bột dễ bị biến động do
tinh bột là nguồn lương thực của con người. Việc sử dụng tinh bột hoặc nguyên liệu
giàu đường sẽ lập tức đẩy giá của lương thực và bioethanol tăng cao hơn so với sản
xuất bằng con đường hóa học. Trong khi đó, giá của vật liệu phải chi trả 40 – 75 %
tổng chi phí của sản xuất ethanol. Vì vậy, việc thay thế nguồn nguyên liệu là yêu
cầu cho việc sản xuất bioethanol. Như các nguồn nguyên liệu là các phụ phẩm của
ngành nông nghiệp: rơm rạ, bã mía, vỏ cacao, vỏ chuối.
Vỏ chuối là nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose nên có thể sử
dụng để lên men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng được nguồn vỏ phế phẩm.

12. Đồ án tốt nghiệp
9
Hiện nay, một phần vỏ chuối phế thải sau khi bóc ruột từ các nhà máy sản xuất các
sản phẩm từ chuối, các quán xá, các khu chợ được thải loại đi như rác là tác nhân
gây hại cho môi trường, hoặc chỉ 1 phần được sử dụng làm thức ăn gia súc mang lại
hiệu quả kinh tế không cao. Với tình hình phế phẩm vỏ chuối như vậy, và qua
nghiên cứu những công trình liên quan của các tác giả đi trước về bioethanol, vỏ
chuối chứa hàm lượng glucid cao nên việc sử dụng để chuyển hóa thành đường
glucose để lên men tạo rượu ethanol là rất có hiệu quả. Và những ưu điểm như rẻ
tiền, phổ biế ối sẽ là một nguồn nguyên liệu tiềm năng trong quá trình
nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học.
Chính vì ý nghĩa thực tế trên đề tài tiến hành khảo sát tối ưu hóa một số thông
số quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối bằng phương pháp SSCF lên men và
thủy phân đồng thời sử dụng kết hợp hai chủng nấm men Saccharomyces
cerevisiace và Pichia anomala.
2. Mục tiêu đề tài
Khảo sát tối ưu hóa một số thông số quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối sử
dụng phương pháp SSCF lên men nguồn phế phẩm vỏ chuối để thu bioethanol có
hiệu quả.
3. Nội dung nghiên cứu.
Đề tài: “Khảo sát tối ưu hóa một số thông số quá trình lên men bioethanol từ vỏ
chuối bằng phương pháp SSCF sử dụng Saccharomyces cerevisiae kết hợp với
Pichia anomala” với nội dung nghiên cứu sau:
- Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối.
- Khảo sát điều kiện tối ưu tiền xử lý vỏ chuối bằng acid acetic.
- Khảo sát tối ưu hóa một số thông số cho quá trình lên men SSCF sử dụng
kết hợp Saccharomyces cerevisiace và Pichia anomala.
4.
-

13. Đồ án tốt nghiệp
10
- Saccharomyces cerevisiae
và Pichia anomala.
- Phương pháp phân tích sinh hóa.
- Xác định độ ẩm bằ .
- Định lượng đường khử bằng phương pháp Miller.
- Định lượ -Hofft.
- Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm.
- -
- Trích ly bằng nước nóng và định lượng pectin bằng cách tạo tủa calcium
pectate.
-
- Dùng phương pháp đếm mậ ờng chuyên biệt cho
từng nhóm vi sinh vật.
-
- Các số được xử lý bằng chương trình StatGraphics Centurion XV.
5. Bố cụ
Kết cấu đồ án gồm 4 chương:
- C
- .
-
- .
6. Các kết quả đạt được
- Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối.
- Khảo sát thành phần hóa học của vỏ chuối sau khi tiền xử lý.
- Tìm ra thông số tối ưu nhất cho quá trình lên men SSCF đạt nồng độ cồn
cao nhất: thời gian 45 giờ, nhiệt độ 350
C, tỷ lệ nấm men (SC:PA): (1:4). Tỷ
lệ enzyme 0,7%. pH 5,5 ,tốc độ khuấy đảo 150 vòng/phút.

14. Đồ án tốt nghiệp
11
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về bioethanol
1.1.1. Khái niệm
Bioethanol là rượu ethanol sinh học thu được từ quá trình lên men vi sinh các
loại nguyên liệu chứa đường hoặc từ tinh bột, cellulose nhờ vào phản ứng trung
gian thủy phân thành đường của vi sinh. Bioethanol được tổng hợp thông qua quá
trình sinh học, vi sinh sử dụng nguồn nguyên liệu đường làm thức ăn để thực hiện
hô hấp kỵ khí và thải ra ethanol và khí CO2. Trong khi đó, ethanol có nguồn gốc dầu
mỏ thì được tổng hợp thông qua quá trình hoá học, không có mặt tham gia của cơ
thể sống trong quá trình tạo ethanol.
Bioethanol được tạo ra từ rất nhiều nguyên liệu nông nghiệp khác nhau được
thể hiện qua hình 1.1
Hình 1.1: Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol.
Quá trình lên men đường tạo thành ethanol và carbon dioxide thể hiện qua PT1:
C6H12O6  2C2H6O + 2CO2 (PT1)
Ethanol dùng làm nhiên liệu cho động cơ đốt trong sẽ bị đốt cháy hòa trộn với
oxygen trong động cơ tạo ra carbon dioxide, nước và nhiệt lượng dựa vào PT2:

15. Đồ án tốt nghiệp
12
C2H6O + 3O2  2CO2 + 3H2O + nhiệt lượng (PT2)
Tổng hợp 2 phương trình PT1 và PT2 trên ta có:
C6H12O6 + 6O2  6CO2 + 6H2O + nhiệt (PT3)
Nhiệt lượng sinh ra trong quá trình dùng để chạy máy. CO2 được sinh ra trong
quá trình này là carbon trung tính khác với loại khí carbon được tạo thành sau khi
đốt các nhiên liệu hóa thạch. Carbon được tạo ra sau khi đốt các nhiên liệu hóa
thạch không nằm trong chu trình carbon nên việc đốt chúng sẽ làm tăng hàm lượng
carbon trong không khí gây hiệu ứng nhà kính.
Bioethanol có thể được sử dụng như một nhiên liệu lỏng trong động cơ đốt
trong do nó có chỉ số octane cao (129), chỉ số octane càng cao thì chỉ số chống gõ
tránh được những tiếng gõ làm tổn thương lòng máy. Có thể sử dụng bioethanol
nguyên chất hoặc pha chung với xăng dầu. Thông số của bioethanol so với xăng
được thể hiện qua bảng 1.1
Bảng 1.1.. Thông số của bioethanol so với xăng.
Tỷ
trọng
(kg/L)
Độ nhớt
(mm2
/s)
Điểm
chớp
cháy
Năng
lượng
(20O
C)
Năng
lượng
(MJ/L)
Chỉ số
octane
Nhiên
liệu
tương
đương
Xăng 0,76 0,6 <21 42,7 32,45 92 1
Bioethanol 0,79 1,5 <21 26,8 21,17 129 0,65
( Nguồn: Paul & Kemnitz 2)
Bảng 1.2. Ước tính chi phí sản xuất bioethanol so với xăng
Nguồn sinh khối Chi phí sản xuất (€/L)
Xăng 0,25
Bắp Mỹ 0,42
Rơm từ bắp 0,45 – 0,58

16. Đồ án tốt nghiệp
13
Lúa mì Châu Âu 0,27 – 0,43
Củ cải đường Châu Âu 0,32 – 0,54
Mía Brazil 0,16 – 0,28
Mật rỉ đường (Trung Quốc) 0,24
Lúa miến ngọt (Trung Quốc) 0,22
Rơm từ lúa mì (Mỹ) 0,44
Gỗ Vân Sam (gỗ mềm) 0,44 – 0,63
Cây liễu (gỗ cứng) 0,48 – 0,71
Lignocellulose (rác thải sinh
học)
0,11 – 0,32
(Nguồn: www.eubia.org; Sassner et al, 2008; Abbas, personal communicatio)
Để Bioethanol có thể cạnh tranh về kinh tế với nhiên liệu hóa thạch thì chi phí
sản xuất phải không lớn hơn 0,2 €/L so với xăng. Theo bảng 1.2 cho thấy nguồn
sinh khối lignocellulose có tiềm năng rất lớn trong sản xuất nguồn năng lượng thay
thế.
(Nguồn: http://oil-price.net/dashboard.php?lang=en)
Hình 1.2. Giá dầu năm năm gần đây.

17. Đồ án tốt nghiệp
14
1.1.2. Các thế hệ của bioethanol
Bioethanol được chia thành 3 thế hệ chính:
1.1.2.1. Bioethanol thế hệ thứ nhất
Bioethanol ban đầu được sản xuất từ ngũ cốc hay mía đường – các sản phẩm
giàu tinh bột và các loại đường đơn giản và dễ được lên men thành ethanol. Nhiên
liệu sinh học được sản xuất nhờ những nguồn nguyên liệu như trên được gọi là
nhiên liệu sinh học thế hệ một.
Việc sản xuất từ những nguồn nguyên liệu này dễ thực hiện do các phân tử tinh
bột dễ được phân cắt và lên men. Tuy nhiên những nguồn nguyên liệu kể trên cũng
đồng thời là thức ăn cho người và vật nuôi. Do những lo ngại xung quanh vấn đề về
an ninh lương thực, đặc biệt sự thiếu hụt lương thực còn dai dẳng ở nhiều nước trên
thế giới, nhất là các quốc gia Châu Phi, việc sản xuất ethanol từ các nguyên liệu này
vấp phải sự phản đối gay gắt của dư luận ở nhiều nơi.
Hạn chế tiếp theo của việc sản xuất bioethanol thế hệ thứ nhất là tạo gánh nặng
cho sản xuất nông nghiệp. Đất nông nghiệp ngày một giảm, không thể cung cấp đủ
cho việc sản xuất bioethanol mà không ảnh hưởng đến nguồn cung cấp thực phẩm
trong nước và việc cạnh tranh chi phí với các nguồn năng lượng hóa thạch.
1.1.2.2. Thế hệ thứ hai
Để khắc phục nhược điểm của bioethanol thế hệ thứ nhất, người ta đã sử dụng
nguồn nguyên liệu phế thải hay các loại nguồn nguyên liệu không phải là thực phẩm
với khả năng cung cấp bền vững, chi phí thấp và có lợi ích cho môi trường.
Bioethanol thế hệ thứ hai được sản xuất từ sinh khối lignocellulose (bộ khung tạo
nên tính chất “gỗ” của thực vật) đang trở thành xu hướng hiện nay.
Nguồn cung cấp chủ yếu là than cây, rơm rạ cũng như các loại cây trồng không
phải cây lương thực như cỏ, jatropha… hay các phế phẩm trong sản xuất nông
nghiệp như vỏ chuối, vỏ cacao… với hàm lượng lignocellulose cao.

18. Đồ án tốt nghiệp
15
Tuy nhiên, loại nhiên liệu này cung cấp nguồn năng lượng hiệu suất thấp so với
dầu mỏ. Tiết kiệm được chi phí nguyên liệu ban đầu nhưng lại tiêu tốn chi phí cho
quá trình tiền xử lý.
1.1.2.3. Bioethanol thế hệ thứ ba
Từ rong biển hay còn gọi là tảo người ta có thể sản xuất ra 19000 lít cồn, tức là
gấp 5 lần sản xuất cồn từ ngô, và gấp 2 lần năng suất sản xuất cồn từ mía đường.
Trong khi ngô hay mía đều đòi hỏi những diện tích canh tác và nguồn nước ngọt
lớn, cạnh tranh với các nguồn lực trong nông nghiệp. Tảo mặt khác có thể sinh
trưởng trong nước mặn, có hàm lượng đường cao. Chỉ cần sử dụng chưa tới 3 %
diện tích mặt nước ở vùng ven biển là có thể sản xuất đủ lượng tảo để sản xuất cồn.
Đặc điểm nổi bật của nhiên liệu từ tảo là không ảnh hưởng đến nguồn nước
ngọt, có thể sản xuất bằng cách sử dụng nước biển và nước thải, tương đối vô hại
cho môi trường. Nhưng chi phí cho các dự án sản xuất rất cao nên chỉ dừng ở mức
thử nghiệm.
1.1.3. Nguồn nguyên liệu lignocellulose để sản xuất bioethanol
Xuất phát từ điều kiện Việt Nam là một nước nông nghiệp có sản phẩm nông
nghiệp rất phong phú nên có thể sản xuất ethanol từ các nguồn nguyên liệu khác
nhau trong đó lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú nhất.
Các loại cây trồng quay vòng ngắ ạch dương, bạch đàn), các chất thải
nông nghiệp (rơm, bã mía, fruit watse..), các phế thả ệp gỗ, gỗ thả
ợp để làm nguyên liệu sản xuất bioethanol.
Cứ khoảng 2 - 4 tấn vật liệu gỗ khô hoặ ể cho 1 tấn bioethanol
[1]. Nguyên nhân khiến người ta chuyển sang sản xuất bioethanol từ sinh khối
lignocellulose là vì các loại này sẵn có và rẻ ới các loại tinh bột ngũ
cốc hoặc cây trồng khác, đặc biệt là vớ ồn chất thải hầ
ế thì vấ ển hóa các vật
liệu này sẽ khó khăn hơn.
Nguyên liệu chứa lignocellulose khác nhau có thành phần cấu tạo chất không
giống nhau nhưng về cơ bản chúng được cấu tạo từ 3 hợp chất cellulose,

19. Đồ án tốt nghiệp
16
hemicellulose, lignin. Các thành phần cấu tạo nên lignocellulose (cellulose,
hemicellulose, lignin) là các đối tượng khó bị phân hủy. Tính khó phân hủy gia tăng
lên nhiều lần khi liên kết với nhau và với các thành phần khác nữa tạo thành một thể
cấu trúc chặt chẽ và phức tạp.
Các vi sợi cellulose, lignin, hemicellulose được sắp xếp theo những nguyên tắc
nhất định để hình thành nên cấu trúc vi sợi. Với cấu trúc nhiều lớp, gồm nhiều thành
phần có bản chất hóa học khác nhau như vậy, lignocellulose có độ bền vật lý cao,
rất khó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme. Hơn nữa để phân hủy bất cứ
thành phần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến
nhiều thành phần khác. Ví dụ, để phân giải lignocellulose thì cần đồng thời tác động
của lignin, cellulose và hemicellulose.
Cellulose chiếm 40-60% trọng lượng khô. Công thức phân tử (C6H10O5)n. Là
thành phần cấu tạo chủ yếu của màng tế bào thực vật và là hợp chất chính của
nguyên liệu chứa cellulose để sản xuất ethanol. Nguyên liệu càng giàu cellulose thì
sản xuất ethanol càng đạt hiệu quả cao.
Hemicellulose chiếm 20-40% trọng lượng khô, dễ bị thủy phân hơn so với
cellulose. Khi thủy phân đến cùng, hemicellulose tạo ra các monosaccaride chủ yếu
là hexose, pentose. Trong đó hexose có khả năng lên men tạo ethanol còn pentose
không có khả năng này.
Lignin chiếm 10-25% trọng lượng khô, lignin là một polyphenol có cấ
ự ếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực
vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể tách
lignin ra hoàn toàn trong quá trình sản xuất ethanol từ cellulose thì nó hoàn toàn
không bị thủy phân để tạo các hợp chất có khả năng lên men tạo ethanol. Vì vậy
lignin là thành phần không mong muốn trong quá trình sản xuất ethanol từ
cellulose.[2]

20. Đồ án tốt nghiệp
17
1.1.4. Ứng dụng lợi ích và hạn chế của Bioethanol
1.1.4.1. Ứng dụng và lợi ích của bioethanol
Bioethanol được sử dụng làm nhiên liệu do khi đốt cháy bioethanol cho nhiệt
lượng tương đối cao mà không sản sinh ra các chất độc hại. Ngày nay, vấn đề môi
trường đang là vấn đề cấp bách, do đó cần có nguồn nhiên liệu sạch để hạn chế vấn
đề ô nhiễm.Trong đó xăng sinh học là nguồn nhiên liệu đầy triển vọng trong tương
lai.
ếu được nghiên cứu sử ệu, có thể được sử
ới dạng nguyên chất (E100), hoặc có thể pha trộn với xăng để tạo ra xăng
sinh học. Nế ệ pha trộn dưới 10% ethanol thì không cần thay đổi các động cơ
xe thông thường . Xăng sinh học đượ ự “E” kèm theo một con
số ố phầ ọc được pha trộn trong xăng đó, các loại xăng
sinh học như E5, E20, E95… tức là xăng sinh học chứa 5%, 20%, 95% ethanol.
Trộ ệu, tức là thêm
oxy vào hỗn hợp nhiên liệu, làm nó cháy hoàn thiện hơn, cải thiện được quá trình
cháy và giảm đượ o môi trường. Khi đốt cháy xăng có pha ethanol,
dướ ệ ế 2 và H2O, nhưng thực tế thì CO
cũng được sinh ra, tuy nhiên lượng CO thường thấp hơn đối với xăng. Nguyên nhân
ethanol có chứa 6% oxygen theo thể tích cho phép động cơ tự đốt cháy nhiên liệu
hoàn toàn, kết quả là làm giảm sự
Bioethanol là nguồn nhiên liệu có khả năng tái sinh vì được sản xuất từ cây
nông nghiệp thu hoạch hàng năm, sử ợng mặt trời là chính. Bioethanol
có nguồn gốc thực vật nên CO2 sinh ra khi đốt được cây cối hấ ại tạo nên sự
ợng CO2, do đó không gây nên hiệu ứng nhà kính.
1.1.4.2. Hạn chế của bioethanol
Bên cạnh những ưu điểm đã biết, quá trình sản xuất bioethanol cũng có một số
hạn chế

21. Đồ án tốt nghiệp
18
- Vấn đề kinh tế: bioethanol cho hiệu quả về năng lượng thấp hơn xăng (đạt
70% so với năng lượng khi xử dụng xăng), vì vậy sẽ cần một lượng
bioethanol lớn hơn để đạt hiệu quả ngang bằng với xăng. [3]
- Vấn đề kỹ thuật : Quá trình sản xuất bioethanol từ nguồn biomass đòi hỏi kỹ
thuật cao và đầu tư lớn.
- Vấn đề nguồn nguyên liệu: sản xuất bioethanol phải đảm bảo không cạnh
tranh lương thực, cũng như bình ổn giá cả. Bên cạnh đó hạn chế cơ bản của
Bioethanol chính là khả năng hút ẩm cao nên cần phải được tồn trữ và bảo
quản đặc biệt.
Tuy việc sử dụng Bioethanol cũng gây ra nhiều tranh cãi giữa mặt lợi và mặt
hại, nhưng mặt lợi có phần lớn hơn nên thế giới vẫn tiếp nghiên cứu để tìm ra
phương thức sản xuất nào tối ưu nhất trong sản xuất bioethanol.
1.1.5. Quy trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose
Có rất nhiều nguồn nguyên liệu để sản xuất bioethanol trong đó nguồn nguyên
liệu lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú để sản xuất bioethanol. Sau đây
là quy trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose được thể hiện qua sơ đồ
hình 1.3

22. Đồ án tốt nghiệp
19
Hình 1.3. Quy trình chuyển đổi sinh khối lignocellulose thành bioethanol.
Quá trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu lignocellulose cũng giống
như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm bốn bước cơ bản:
- Tiền xử lý nguyên liệu.
- Thủy phân nguyên liệu.
- Lên men.
- Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy vào
nồng độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau. Quá trình này phụ
thuộc nhiều vào công nghệ hóa học nên trong giới hạn của đề tài xin được
không trình bày.
1.1.5.1 Phương pháp tiền xử lý
Do cấu trúc phân tử lớn, có độ kết tinh cao lại liên kết chặt chẽ với lignin và
hemicelluloses, phân tử cellulose rất khó bị tác động bởi enzyme thủy phân. Vì vậy,

23. Đồ án tốt nghiệp
20
việc tiền xử lý là rất cần thiết.
Mục đích của quá trình tiền xử lý là để loại bỏ lignin và hemicellulose, giảm
kích thước vi sợi cellulose và tăng độ xốp của vật liệu lignocellulose (hình 1.4).
Tiền xử lý cũng giúp cho cellulose dễ tiếp cận hơn với enzyme cellulase trong quá
trình thủy phân tiếp sau đó, do đó yêu cầu enzyme sử dụng sẽ giảm, dẫn tới chi phí
cũng sẽ giảm [4]. Quá trình tiền xử lý phải trong sinh khối Lignocellulose thì
cellulose là thành phần chính để lên men đáp ứng những yêu cầu:
- Nâng cao được hiệu quả của quá trình thủy phân tiếp theo.
- Hạn chế sự mất mát hydrocarbon.
- Tránh sự tạo thành các sản phẩm phụ làm ức chế quá trình thủy phân và quá
trình lên men.
- Tiết kiệm được chi phí.
Hình 1.4. Tiền xử lý lignocellulose giải phóng cellulose.
Có nhiều phương pháp tiền xử lý lignocellulose khác nhau, ưu và nhược điểm
của chúng được tóm tắt trong bảng 1.3. Lựa chọn phương pháp tiền xử lý phù hợp
phụ thuộc vào thành phần cấu tạo của sinh khối lignocellulose và sản phẩm phụ sinh
ra trong quá trình tiền xử lý.
Bảng 1.3. Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp tiền xử lý
Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm
Chia nhỏ vật liệu (xay,
nghiền)
Giảm kích thước vi sợi
cellulose, tăng bề mặt tiếp
Tiêu tốn nhiều năng lượng

24. Đồ án tốt nghiệp
21
xúc
Nổ hơi nước (tăng
giảm
áp lực đột ngột)
Loại bỏ hemicellulose,
biến đổi lignin; chi phí
thấp
Phân hủy và biến đổi cấu
trúc các hydro carbon;
tạo
ra các hợp chất ức chế
Nổ amoniac (AFEX) Tăng độ xốp, không tạo
ra hợp chất ức chế
Việc loại bỏ lignin và
hemicellulose bị giới
hạn,
không thích hợp cho vật
liệu
chứa nhiều lignin.
Nổ CO2 Tăng độ xốp, chi phí thấp,
không tạo ra hợp chất ức
chế
Hemicellulose và lignin ít
bị
biến đổi
Ozon (O3) Giảm hàm lượng lignin,
không tạo ra chất ức chế
Cần lượng lớn ozon, tốn
nhiều chi phí
Acid thủy phân Thủy phân hemicellulose
thành Xylose, thay đổi cấu
trúc lignin
Chi phí cao; ăn mòn thiết
bị;
tạo ra các hợp chất ức chế
Kiềm thủy phân Loại bỏ lignin và
hemicellulose; tăng độ xốp
Thời gian phản ứng dài;
muối sinh ra sẽ liên kết
chặt
chẽ với vật liệu
Dung môi hữu cơ Lignin và hemicellulose
được thủy phân
Khó loại bỏ và thu hồi
dung
môi; chi phí cao
Nhiệt phân Tạo sản phẩm ở dạng khí
và dạng lỏng
Nhiệt độ cao; tạo thành tro

25. Đồ án tốt nghiệp
22
Điện từ trường Thiết bi đơn giản; phá hủy
được tế bào thực vật
Phương pháp đang trong
quá trình nghiên cứu
Sinh học Loại bỏ lignin; tiêu tốn ít
năng lượng; thân thiện với
môi trường
Hiệu quả còn thấp
Có rất nhiều phương pháp tiền xử lý, thường dùng nhất là phương pháp hóa học
, acid vô cơ này sử dụng phương pháp hóa
học, thay thế acid vô cơ như H2SO4, HCl, bằng acid hữu cơ như acid acetic. Do
acid acetic khả năng hòa tan tốt lignin tạo
ra cellulose , không tạo ra các chất ức chế quá trình lên men sau
đó,
1.1.5.2 Phương pháp thủy phân
Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các
đường đơn (hexose và pentose). Ở đây, quan tâm nhiều đến sự thủy phân cellulose,
do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulose. Quá trình thủy phân
cellulose được thực hiện bởi acid thủy phân hoặc enzyme thủy phân.
 Quá trình thủy phân bằng acid
Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực hiện bởi
phản ứng giữa cellulose với acid. Acid loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ
cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí
quyển. Quá trình thủy phân bằng acid loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất
cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình
lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furfuran và các
hợp chất vô cơ.
 Quá trình thủy phân bằng enzyme

26. Đồ án tốt nghiệp
23
Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose
riêng lẻ bằng cellulase. Vì cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân
cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra
sản phẩm glucose.
1.1.5.3 Phương pháp lên men
Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm đường
hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ được
lên men thành ethanol nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, tổ hợp nhiều loại
nấm men hoặc vi khuẩn (vi khuẩn Zymomonas spp).
Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử diễn ra trong cơ thể
sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme là quá trình oxy hóa sinh học.
Có rất nhiều phương pháp lên men để tạo bioethanol, bước cuối để biến đổi sinh
khối lignocellulose thành ethanol là thủy phân và lên men có thể được thực hiện
một cách độc lập (SHF), đồng thời (SSF), hay đồng thời kết hợp nhiều chủng vi
sinh vật (SSCF).
 Phương pháp thủy phân và lên men riêng lẻ (SHF).
 Ưu điểm :
- Thủy phân và lên men được thục hiện trong điều kiện tối ưu của mỗi quá
trình, không phụ thuộc vào nhau. [5]
 Nhược điểm:
- Sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt động của enzyme thủy phân cellulose
và glucose. Điều này làm cho quá trình biến đổi kém hiệu quả, và gây tốn
kém (phải bổ sung một lượng lớn enzyme).
- Dễ nhiễm các vi sinh vật khác do thời gian ủ dài ở quá trình thủy phân.
 Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF).
Các sản phẩm cuối của quá trình thủy phân sẽ được trực tiếp chuyển đổi thành
ethanol ngay nhờ vi sinh vật. [6]
 Ưu điểm:
- Tăng tỉ lệ thủy phân và giảm ức chế ngược khi sản phẩm tạo thành.

27. Đồ án tốt nghiệp
24
- Giảm lượng enzyme dùng cho quá trình.
- Cho hiệu suất ethanol cao.
- Đòi hỏi điều kiện vô trùng thấp.
- Thời gian ngắn.
 Nhược điểm:
- Cần phải lựa chọn được điều kiện nhiệt độ và pH gắn với điều kiện tối ưu
của mỗi quá trình riêng
- Ethanol tạo thành sẽ quay lại ức chế enzyme cellulase làm cho lượng ethanol
thu được không cao.
- Cơ chế thủy phân không hoàn toàn nên lượng đường do enzyme cellulase tạo
ra chỉ đủ để cho nấm men tăng trưởng hơn là việc lên men đường sinh
ethanol.
 Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời sử dụng kết hợp hai chủng vi sinh
vật (SSCF).
Việc sản xuất bioethanol từ nguồn cellulose bao gồm ba bước như đường hóa
các thành phần của cellulose (SA), lên men hexose (HF), và lên men pentose (PF).
Các quá trình này được kết hợp với nhau để đơn giản hóa các bước và tăng cường
sản lượng ethanol.[7]
SSF là quá trình đồng thời đồng thời đường hóa các thành phần của cellulose
(SA) và lên men hexose (HF) nhưng không diễn ra quá trình lên men pentose (PF)
SSCF là quá trình đồng thời của SA,HF Và PF.
Như vậy SSCF là quá trình cùng lúc đường hóa các thành phần của cellulose và
lên men đường 5 carbon và 6 carbon nhờ vi sinh vật.
Các vi sinh vật thường được áp dụng để sản xuất ethanol sinh học không thể sử
dụng tất cả các nguồn đường có nguồn gốc từ quá trình thủy phân. Ví dụ
S.cerevisiae không thể sử dụng đường pentose , và điều này sẽ làm lãng phí sinh
khối và làm giảm sản lượng ethanol sinh học. Do đó trong SSCF sẽ sử dụng kết hợp
các chủng vi sinh có khả năng sử dụng đường 5 carbon và chủng vi sinh có khả
năng sử dụng đường 6 carbon.

28. Đồ án tốt nghiệp
25
 Ưu điểm:
- Cải tiến của phương pháp SSF.
- Chi phí thấp, thời gian xử lý ngắn, giảm nguy cơ ô nhiễm và tác dụng ức chế
ít.
- Hiệu suất lên men bioethanol cao và lên men được cả đường 5 carbon và 6
carbon.
 Nhược điểm:
- Nhiệt độ của quá trình thủy phân enzyme và lên men ethanol khác nhau đáng
kể , làm cho việc tối ưu hóa đồng thời hai hoạt động rất khó.
- Quá trình SSCF phải được vận hành ở nhiệt độ thấp hơn để phù hợp tăng
trưởng của vi khuẩn và lên men ethanol.
- Đề tài này tiến hành phương pháp SSCF để thủy phân và lên men thu
bioethanol.
1.1.5.4 Các giống vi sinh vật trong lên men bioethanol
Nấm men là đối tượng lên men chủ yếu. Tế bào nấm men có dạng hình ovan,
sinh sản bằng cách nảy chồi hay tạo bào tử, sống k khí không bắt buộc, có khả
năng lên men các loại đường khác nhau. Trong điều kiện hiếu khí, nấm men oxy
hóa hoàn toàn đường thành CO2 và H2O, gia tăng sinh khối, ngược lại trong điều
kiện k khí, nấm men sẽ không tăng sinh khối vì không tổng hợp được sterol cần
cho cấu trúc tế bào, nấm men tiến hành lên men đường để thu năng lượng.
Không giố ệu tinh bộ ủy phân
sinh khố ố lượng đáng kể các loại đườ
ờ
Saccharomyces cerevisiae hoặc Zymomonas
mobilis, không thể lên men các loại đường pentose thành ethanol hiệu quả. Nếu chỉ
đường hexose từ sinh khối lignocellulose được lên men, với các loại đường pentose
bỏ lạ ụ nguyên liệu cho sản xuất ethanol sinh họ
 ử

29. Đồ án tốt nghiệp
26
Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có
trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì. Đây là một loại vi sinh vật thuộc chi
Saccharomyces, lớp nấm nang (Ascomycetes), ngành nấm. Loài này có thể xem là
loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay.
Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu và bia.
Trong quá trình thủy phân cellulose có tạo ra đường 5 carbon - xylose thì chủng
men Saccharomyces cerevisiae không thể sử dụng để lên men tạo ethanol nên hiệu
suất tạo ethanol không cao.
Zymomonas mobilis ể lên men
glucose thành ethanol và CO2. Ngoài ra, Z. mobilis có thể chịu được nồng độ cao
như 120 g / L ethanol, cao hơn nhiều so với các vi khuẩn khác, và sinh khối của nó
thường được công nhận là an toàn (GRAS) cho thức ăn gia súc, làm cho loài này
thích hợp cho kỹ thuật chuyển hóa với khả năng lên men pentose.
 ử
Pichia amomala sử dụng glucose
và xylose để chuyể
1.1.6. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Bioethanol ở tại Việt Nam và trên thế giới
1.1.6.1. Tại Việt Nam
Nhiên liệu sinh học đã được các nhà khoa học
ethanol sinh học
Từ sau năm 2000 đã có một số xí nghiệp, công ty, đơn vị nghiên cứu tổ chức
sản xuất nhiên liệu sinh học dưới dạng pilot như công ty Minh Tú (Cần Thơ), ĐH
Bách khoa TP Hồ Chí Minh, Viện Hóa Công Nghiệp Hà Nội, Viện khoa học
Ngày 20/11/2007, "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm
nhìn đến năm 2025" đã được Thủ tướng Chính phủ ký quyết định số177/2007/QĐ-

30. Đồ án tốt nghiệp
27
TTG với mục tiêu phát triển năng lượng, một dạng năng lượng mới, tái tạo được
thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần bảo đảm an ninh
năng lượng và bảo vệ môi trường. Đến năm 2015, sản lượng bioethanol sinh học và
dầu thực vật đạt 250 nghìn tấn, đáp ứng 1% nhu cầu xăng dầu của cả nước. Và tầm
nhìn đến năm 2025, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học ở nước ta đạt trình độ
tiên tiến trên thế giới. Sản lượng bioethanol và dầu thực vật đạt 1.8 triệu tấn, đáp
ứng khoảng 5% nhu cầu xăng dầu của cả nước.
Để thực hiện chiến lược này, PetroVietNam dự kiến từ 2011 đến 2015 sẽ đưa 3
nhà máy ethanol sinh học ở Quảng Ngãi, Phú Thọ, Bình Phước vào hoạt động với
tổng công suất 230.000 tấn/năm và từ sản phẩm này sẽ pha thành nhiên liệu E5-
E10, đáp ứng khoảng 20% tổng nhu cầu tiêu thụ xăng sinh học cả nước.[8]
Theo
n tháng 3/2012, cả nước có 5 nhà máy sản xuất ethanol nhiên liệu đi
vào hoạt động ổn định với công suất thiết kế đạt khoảng 435.000 triệu lít
ethanol/năm (bảng 1.4). Trong số 4 nhà máy đang hoạt động mới chỉ có 03 nhà máy
của Công ty CP Đồng Xanh, Cty TNHH Tùng Lâm và Công ty CP Nhiên liệu sinh
học miền Trung là sản xuất được ethanol nồng độ 99,5% đạt tiêu chuẩn để pha xăng
sinh học.
Sản phẩm được tiêu thụ trong nước khoảng 20% để phối trộn xăng E5 và bán
theo hệ thống phân phối của Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam (PVN). Phần còn
lại khoảng 80% sản lượng sản xuất trong năm 2011 được xuất khẩu cho các nước
như Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippine ở dạng 99,5% và 96% ethanol. [9]
Sản xuất nhiên liệu sinh học Bioethanol ở Việt Nam cũng được nhiều đối tác
nước ngoài rất quan tâm. Đáng chú ý trong số này là các Dự án JICA - Nhật Bản hỗ
trợ Việt Nam nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học sử dụng các loại phế phẩm bã
mía, rơm rạ; dự án do Chính phủ Hà Lan tài trợ sử dụng trấu, vỏ cà phê, trái điều,
vỏ điều, rong biển
sản xuất diesel sinh học và các hóa chất tinh khiết
thân thiện với môi trường từ dầu thực vật.

31. Đồ án tốt nghiệp
28
Bảng 1.4. Một số nhà máy sản xuất bioethanol đang hoạt động ở Việt Nam [10]
TT
1 –
Xanh
Nam
2 –
Lâm
3
–
Nông.
4
Đăk Tô – Kon Tum
Kon Tum
5
Trung)
(Nguồn: Khoa học và công nghệ, số 9 – 08/2012)
1.1.6.2. Trên thế giới
 Tình hình sản xuất
Theo báo cáo F.O. Licht thì bioethanol được sử dụng làm nhiên liệu đốt trong
từ năm 1860 do nhà khoa học Nicolas August Otto (Đức) khám phá.
Đến sau 1930 thì Mỹ, Brazil, Anh, Pháp, Đức, Ý, Thuỵ Điển… đã bắt đầu sử
dụng Bioethanol thay thế xăng. Nhưng trào lưu này thực sự bùng nổ vào những năm
1970 khi nguồn nhiên liệu chính là dầu mỏ bị khủng hoảng nguồn cung.

32. Đồ án tốt nghiệp
29
Cũng theo báo cáo trên thì 47 % bioethanol nhiên liệu trên thế giới được sản
xuất từ mía đường, 53% là từ cây có chứa tinh bột (bắp, sắn lát và lúa mì). Sản
lượng bioethanol sản xuất năm 2006 khoảng 50 tỷ lít. Nhu cầu Bio-Ethanol nhiên
liệu trên toàn thế giới vào năm 2015 sẽ cao gấp hơn 2 lần sản lượng năm 2006 (100
tỷ lít).
Trước đó, Brazil là quốc gia đứng đầu về sản xuất và tiêu thụ bioethanol. Đến
năm 2006, Mỹ vượt qua Braxin và trở thành nước sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn
nhất thế giới. Các quốc gia sản xuất bioethanol lớn như Braxin, Mỹ, Trung Quốc,
Ấn Độ và Pháp chiếm 84% sản lượng bioethanol nhiên liệu của toàn thế giới trong
năm 2005. [7]
Brazil: là nước đi đầu trên thế giới trong việc sản xuất bioethanol nhiên liệu từ
mật rỉ trong năm 2004 và đến cuối năm 2007, Braxin đã sản xuất được 20.5 tỷ lít,
chiếm 34 % sản lượng bioethanol toàn thế giới. Nhóm các nước nhập khẩu
bioethanol nhiên liệu từ Braxin là Mỹ, Ấn Độ, Hàn Quốc , Nhật Bản, Thụy Điển và
Hà Lan.
Hoa Kỳ: năm 2006, Mỹ đã vượt qua Braxin trở thành quốc gia lớn nhất thế giới
về sản xuất bioethanol nhiên liệu, chiếm 37 % sản lượng toàn thế giới. Theo chương
trình phát triển năng lượng quốc gia, Mỹ sẽ sản xuất 25.7 tỷ lít bioethanol vào năm
2010. Nguồn nhiên liệu chính để sản xuất bioethanol nhiên liệu tại Mỹ là ngô.
EU: năm 2006, sản lượng bioethanol của EU là 341.250.000 lít, trong đó Pháp
là quốc gia sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn nhất châu Âu (114 triệu lít, chiếm 33
%), Tây Ban Nha 47.8 triệu lít ( chiếm 14 %) và Đức 44.4 triệu lít ( chiếm 13 %).
Trung Quốc: là nước sản xuất bioethanol lớn nhất khu vực Châu Á. Năm 2005,
tổng sản lượng bioethanol của quốc gia này xấp xỉ 3.8 tỷ lít (trong đó 1.3 tỷ lít là
bioethanol nhiên liệu), chiếm gần 8 % sản lượng toàn thế giới.
Các quốc gia khác đã có những thành tựu đáng kể trong việc sản xuất
bioethanol đó là Ấn Độ, Thái Lan và một số quốc gia khác:

33. Đồ án tốt nghiệp
30
Ấn Độ: đây là quốc gia đứng thứ 2 ở châu Á về sản xuất bioethanol sau Trung
Quốc. Năm 2005 sản lượng bioethanol của Ấn Độ là 1.7 tỷ lít, trong đó 200 triệu lít
là bioethanol nhiên liệu.
 Tình hình tiêu thụ
Năm 2006, sản lượng Bioethanol được sử dụng trên thế giới là 50 tỷ lít, trong
đó bioethanol nhiên liệu là 38.5 tỷ lít (chiếm 77 %), Bioethanol công nghiệp là 4 tỷ
lít (chiếm 8 %) và Bio-Ethanol cho đồ uống là 7.5 tỷ lít (chiếm 15 %). [11]
1.1.7. Tình hình nghiên cứu bioethanol tại Việt Nam và trên thế giới
1.1.7.1. Tại Việt Nam
ệ đã nghiên cứu “sản xuất ethanol sinh học từ
ử lý vớ 0
C trong 4 giờ thu hồi được 21,93%
lượng đường khử, quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhấ -300
C, thời gian lên
men 72 giờ [12].
ứu sản xuất biethanol từ rong biể
ử 2SO4 1,5%, nhiệt độ ử 0
C, thờ ử
40 phút, nồng độ cơ chấ ử ử ồng độ
enzyme cellulase 12,18%, nồng độ enzyme β-glucosidase 4,8%, nhiệt độ
500
C, pH 5, tốc độ lắc 200 rpm, thờ ờ. Sau đó lên men vớ
ấm men được chuyển giao từ USDA (Bộ nông nghiệp Mỹ 0
C trong 72
giờ thu được 20,92 g/l cồn, hiệu suất quá trình đạt 90% [13]
1.1.7.2. Trên thế giới
Bảng 1.5. Một số công trình nghiên cứu bioethanol từ phụ phẩm trái cây trên thế
giới
Năm Tác giả Đối tượng
PP
lên
men
Kết quả
Tài liệu tham
khảo
2011
Pilanee
Vaithanom
sat SSF
Kasetsart
Journal. p: 159 –
164, 2011

34. Đồ án tốt nghiệp
31
khô.
Ethanol theo
SSF: 20.67 %.
2012 SSF
%
(v/v)
Cam 1.32
%(v/v)
Chanh
1.46%(v/v)
Journal of Yeast
and Fungal
Research Vol.
3(2), p: 12 - 17,
March 2012
2013 SSCF
4% (w/v)
ethanol
Biotechnology
for Biofuels,
2013.
2013 SSF
7.45 % (v/v)
International
Journal of
Environmental
Science and
Development,
Vol. 4, No. 2,
April 2013
2013 Melaleuca
leucadendron
SSF -
63.2 g/l
Bioesource
Technology, Vol
136, p: 213-22,
May 2013.
2014
Masahide
Yasuda Napie SSCF
SpringerPlus
journal, 2014
http://www.sprin
gerplus.com/cont
ent/3/1/333

35. Đồ án tốt nghiệp
1
Bảng 1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ chuối
Năm Tác giả Đối tượng
Pp lên
men
Kết quả
Tài liệu tham
khảo
2011
Đại học
Kansas
Vỏ chuối sấy
khô
SSF
Thu cồn có
nồng độ
28,2g/L
[14]
2011
Ahmed S. A
và cộng sự
Phế phẩm
chuối
SHF
Ethanol 4,1-
7,1%
[15]
2011
MohitSMishra
-SimanSheet
Phế phẩm
chuối
SHF Ethanol 8-9% [16]
1.2. Giới thiệu về cây chuối sứ
1.2.1 ối
Tên khoa học: Musa Paradisiaca
Giới (regnum): Plantae
Ngành (phylum): Magnoliophyta
Phân lớp (subfamilia): Zingiberiadae
Bộ(ordo): Zingiberales
Họ (familia): Musaceae
Chi (genus): Musa
Hình 1.5. Chuối sứ.
1.2.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái chuối
Những nghiên cứu khoa học đã và đang được thực hiện đều hướng đến sự phát
triển bền vững của xã hội. Một trong những sự phát triển bền vững đó là sử dụng
nguồn cung cấp đường từ vỏ chuối chuyển hóa vi sinh để tạo ra ethanol sinh học.
Điều đó sẽ giải quyết các vấn đề về ô nhiễm môi trường và chất thải nông nghiệp.

36. Đồ án tốt nghiệp
2
Bảng 1.7. Thành phần hóa học của vỏ chuối
Chỉ tiêu Vỏ chuối
Đường(%) 1.61 -1.97%
Chất béo(%) -
Protein(%) 1.40 -1.45%
Pectin(%) -
Lignin(%) -
Cellulose(%) 4.5 - 4.6%
Hemicellulose(%) -
(Nguồn: Luận văn Bước đầu khảo sát tiền xử lí và thủy phân ca cao làm nguyên
liệu cho lên men bioethanol bằng Saccharomyces cerevisiae_Nguyễn Văn Pháp)
Ghi chú: “-“: không có số liệu
1.2.3 Tình hình sản xuất, diện tích và sản lượng chuối tại Việt Nam
Chuối sứ thường được trồng ở các vùng trung du, miền núi, cây mọc khỏe, cao
to, lá dài rộng, cuống lá có phấn trắng. trái to, ngắn, mập, vỏ mỏng, khi chín có màu
vàng tươi, vị ngọt, kém thơm. Khả năng vận chuyển bảo quản kém.
Ở nước ta, chuối là loại cây lương thực có diện tích và sản lượng cao. Tuy
nhiên diện tích trồng chuối lại không tập trung. Do đặc điểm là loại cây ngắn ngày,
nhiều công dụng và ít tốn diện tích nên chuối được trồng ở rất nhiều nơi trong các
vườn cây ăn trái và hộ gia đình.
Một số tỉnh miền trung và miền nam có diện tích trồng chuối khá lớn (Thanh
Hóa, Nghệ An, Khánh Hòa, Đồng Nai, Sóc Trăng, Cà Mau có diện tích từ 3.000 ha
đến gần 8.000 ha) trong khi đó các tỉnh miền bắc có diện tích trồng chuối lớn nhất
như: Hải Phòng, Nam Định, Phú Thọ chưa đạt đến 3.000 ha.

37. Đồ án tốt nghiệp
3
Bảng 1.8. Diện tích trồng chuối theo các vùng (đơn vị: ha)
Vùng
Năm
2001
Năm
2002
Năm
2003
Năm
2004
Năm
2005
Đồng bằng sông Hồng 17900 18100 17407 17407 16400
Đông Bắc bộ 8900 6300 9021 8849 8700
Tây Bắc bộ 2300 2200 18100 17456 2600
Bắc Trung bộ 15400 15500 6300 9021 16400
Duyên hải Nam Trung bộ 10200 10500 10642 10713 11400
Tây Nguyên 2900 3400 3492 3630 3700
Đông Nam bộ 12100 12300 12689 12653 12800
Đồng bằng sông Cửu
Long
31600 27700 27706 30142 31303
(nguồn: luận văn nghiên cứu sản xuất nectar chuối)
Bảng 1.9. Sản lượng trồng chuối theo vùng (Đơn vị: tấn)
Vùng
Năm
2001
Năm
2002
Năm
2003
Năm
2004
Năm
2005
Đồng bằng sông
Hồng
359500 342700 426161 352181 403500
Đông Bắc bộ 95900 65200 100575 98517 96600
Tây Bắc bộ 19300 25400 27285 30691 30600
Bắc Trung bộ 80800 98300 102966 205666 110800
Duyên hải Nam
Trung bộ
66000 103500 99636 99504 111800
Tây Nguyên 33900 41400 44262 53027 58300
Đông Nam bộ 114800 146400 150717 165596 175800
Đồng bằng sông Cửu
Long
310200 274800 330203 351629 366900
(nguồn: luận văn nghiên cứu sản xuất nectar chuối)

38. Đồ án tốt nghiệp
4
1.2.4 Tình hình sản xuất và sản lượng chuối trên thế giới
Theo số liệu của FAO hàng năm toàn thế giới sản xuất trên 88 triệu tấn chuối.
Chuối được trồng chủ yếu ở các nước đang phát triển trên thế giới. Khoảng 98% sản
lượng chuối được trồng ở các nước đang phát triển và xuất khẩu tới các nước đang
phát triển. Năm 2004 tổng cộng có 130 nước xuất khẩu chuối. mười nước sản xuất
chính chiếm đến 75% sản lượng thế giới. Trong đó Ấn Độ, Equador, Brazil và
Trung Quốc chiếm 1 nửa của toàn thế giới.
Bảng 1.10. Sản lượng chuối hằng năm của các nước trên thế giới
Stt Quốc gia Sản lượng ( triệu tấn)
1 India 29,7
2 Uganda 11,1
3 China 10,7
4 Philippines 9,2
5 Equador 8,0
6 Brazil 7,3
7 Indonesia 6,1
8 Colombia 5,1
9 Cameroon 4,8
10 Nzania 3,9
(Nguồn: Theo bảng thống kê của tổ chức FAO năm 2011)
Như vậy, vỏ chuối chiếm 20-30% khối lượng trái nên ở Việt Nam trung bình
mỗi năm có tới ~ 350.000 tấn vỏ phế phẩm. Trên thế giới lượng vỏ chuối thải ra
hàng năm ~ 24 triệu tấn. Để giải quyết vấn đề môi trường các nước phải cấp chi phí
cho việc xử lí rác thải. Tuy nhiên, nếu lượng rác thải được tận dụng vào mục đích
hợp lí khác thì vừa giữ vệ sinh môi trường, vừa đỡ tốn kém, vừa tạo thêm sản phẩm
có thêm thu nhập. Và hiện nay xu hướng cho vấn đề này chính là lên men sản xuất
ethanol sinh học.

39. Đồ án tốt nghiệp
5
1.3. Giới thiệu chủng nấm men lên men bioethanol
1.3.1 Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae
1.3.1.1 Phân loại khoa học
Giới (regnum) Fungi
Ngành (phylum) Ascomycota
Phân ngành (subphylum) Saccharomycotina
Lớp (class) Saccharomycetes
Bộ (ordo) Saccharomycetales
Họ (familia) Saccharomycetaceae
Chi (genus) Saccharomyces
Loài (species) S. cerevisiae
1.3.1.2 Đặc điểm hình thái
Hình 1.6. Saccharomyces cerevisiae.
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có
kích thuớc từ 5-6µm đến 10-14µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử.
Nguồn dinh dưỡng carbon chủ yếu của chúng là đường glucose, galactose,

40. Đồ án tốt nghiệp
6
saccharose, maltose. Chúng sử dụng acid amin và muối amoni như nguồn nitơ
chính.
Saccharomyces cerevisiae thuộc loại nấm men chìm có đặc điểm:
- Nấm men chìm chỉ phát triển trong môi trường lên men, chúng không tạo
thành bọt dày trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc.
- Đặc điểm nổi bậc của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzyme α -
galactosidase nên lên men hoàn toàn đường rafinose, còn đối với nấm men
nổi thì một số ít chủng có khả năng chuyển hóa đường rafinose thành CO2 và
H2O.
1.3.1.3 Nguồn dinh dưỡng của nấm men
ờng thành cồn nhờ Saccharomyces
cerevisiae. Quá trình lên men cồn được tiến hành ở nhiệt độ 32 ÷ 34 0
C trong thờ
– ờ ồn được thực hiệ
kiện kị ờ ộc loại Saccharomyces cerevisae nguồn
dinh dưỡng củ
- Dinh dưỡng carbon các loại hợ ữu cơ nhờ mộ
ợu,
acid hữ ồn dinh dưỡng carbon củ men.
Tuy nhiên, S. cerevisiae ồ ờ tinh bột,
celluluse, dextrin.
- Dinh dưỡng nitơ s.cerevisiae: ồng hoá các hợ ữu cơ ở dạ
ữu cơ. Nguồn nitơ vô cơ được S. cerevisiae sử dụ
ặc biệt là amonium sulfate. Nguồn nitơ hữu cơ thường được S.
cerevisiae sử dụ
ợ
toàn không sử dụng được protein.
- Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ: ớn trong các
hoạt động trao đổ ợng của tế ồ

41. Đồ án tốt nghiệp
7
diphosphate và monophosphate. Lưu huỳnh là thành phần của mộ
amin và mộ ế ậy, việ
ủ lưu huỳnh sẽ làm ngừng hoạt động tổng hợp protein. Nguồn lưu
huỳnh thường được sử dụ cho Saccharomyces cerevisiae
ợ ần cho các
hoạt động sinh lý củ
Saccharomyces cerevisiae là một trong những loại nấm quan trọng nhất trong
lịch sử thế giới. Loại nấm này có tác dụng cho việc sản xuất cồn ethanol. Nguồn
năng lượng chủ yếu là quá trình chuyển đổi đường glucose thành năng lượng.
1.3.2 Chủng nấm men Pichia anomala
1.3.3.1. Phân loại khoa học
Giới (regnum) Nấm
Ngành (phylum) Ascomycota
Phân ngành ( subphylum) Saccharomycotina
Lớp (class) Saccharomycetes
Bộ (ordo) Saccharomycetales
Họ (familia) Saccharomycetaca
Chi (genus) Pichi
Loài (species) Pichi anomala
1.3.3.2 Đặc điểm hình thái

42. Đồ án tốt nghiệp
8
Hình 1.7 Pichia anomala.
Tế bào nấm men có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ. Sinh sản bằng
cách nảy chồi, hình thành đơn lẻ, cặp, cụm nhỏ. Tăng trưởng lỏng: màng mỏng,
thay đổi từ mỏng ,dày mịn, gấp.
1.3.2.3 Nguồn dinh dưỡng của nấm men
Pichia anomala: là loại nấm men phổ biến nhất trong các chủng nấm men có
thể lên men đường 5 carbon (xylose). Pichia anomala có các ưu điểm như cho hiệu
suất tiêu thụ xylose cao, chịu được nhiệt độ và nồng độ cơ chất cao. Tuy nhiên lại bị
ức chế bởi ethanol nồng độ cao.
Ngày nay, thế giới có xu hướng sử dụng công nghệ gene để kết hợp các chủng
nấm men vừa có khả năng lên men đường 6 carbon, vừa có khả năng lên men
đường 5 carbon.
Trong nghiên cứu này, nghiên cứu quá trình lên men đường 6(glucose) và
đường 5 carbon (xylose) nên sử dụng kết hợp nấm men Saccharomyces cerevisiae
và Pichia anomala.

43. Đồ án tốt nghiệp
9
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian thực hiện đề tài : từ 25/05/2015 – 15/08/2015.
- Địa điểm: Phòng Thí nghiệm năng lượng sinh học – trường ĐH Bách Khoa
TP.HCM.
2.2 Đối tượng nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp Thủy phân và lên men sử
dụng kết hợp nhiều chủng vi sinh vật (SSCF) trên vỏ chuối sứ.
2.3 Vật liệu
2.3.1 Nguyên vật liệu
Vỏ chuối : thu gom từ các cơ sở sản xuất sản phẩm từ chuối tại TP.Hồ Chí
Minh.
- Enzyme: Enzyme thương mại Viscozyme do công ty Brenntag cung cấp là
enzyme cellulase.
- Nấm men:
 Saccharomyces cerevisiae (ATCC).
 Pichia anomala (VTCC).
Chủng này đã được hoạt hóa và cấy truyền trên thạch nghiêng, bảo quản ở 40C
và được cấy truyền hai tuần một lần để giữ giống.
2.3.2 Hóa chất sử dụng
- H2SO4, HCl.
- Acid acetic.
- NaOH.
- Thuốc thử DNS (3,5 dinitrosalicylic acid).
- Peptone.
- D- Glucose.
- Alcohol.
- Thuốc thử Anthrone.

44. Đồ án tốt nghiệp
10
Môi trường hoạt hóa và nhân giống nấm men Sabouraud Dextrose Broth (SDB).
- D-glucose: 20g .
- Pepton.
- Nước cất: 1000 ml.
Môi trường nuôi cấy nấm men Sabouraud Dextrose Agar (SDA).
- D-glucose: 40g.
- Peptone: 10g.
- Agar: 20g.
- Nước cất: 1000 ml.
2.3.3 Thiết bị ứu.
 Thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Nồi hấp tiệt trùng Autoclave Tomy ES 315.
- Lò nung Nabertherm 240398.
- Tủ sấy.
- Tủ lạnh.
- Cồn kế Portable refractometer.
- Máy khuấy từ IKA RH busis 2.
- Máy lắc Sino Sourc HY- 5A.
- Máy lắc ổn nhiệt Sluart SI 500.
- Máy đo quang phổ UV VIS.
- Máy đo độ ẩm Shimadzu MOC-30S.
- Máy lọc nước Eyela RP-2100.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – Shimadzu RID10A).
- Máy xay cầm tay Phillips.
- Cân kỹ thuật electronic KD- TBED
- Bể ổn nhiệt.
- Tủ ủ SanYo MIR -162.
- Tủ lạnh Sharp SJ-F75 PV- SL.

45. Đồ án tốt nghiệp
11
- Kính hiển vi Olympus CX21
- pH kế - Trans Instrument
 ứu
- Bình lên men 100ml.
- Erlen 100ml.
- Becher các loại.
- Ống nghiệm.
- Ống đong các loại.
- Pipet các loại.
- Đĩa petri.
- Cuvet.
- Đũa khuấy.
- Cốc sứ
2.4 Phương pháp
2.4.1 Bố trí thí nghiệm
Nghiên cứu này tập trung vào quá trình thủy phân và lên men (SSCF) kết hợp
đồng thời giống nấm men Sacharomyces cerevisiae và Pichia anomala.
Sơ đồ thực hiện thí nghiệm của đồ án được trình bày tóm tắt trong hình 2.1

46. Đồ án tốt nghiệp
12
Hình 2.1. thực hiện thí nghiệm của đồ án.
2.4.2 Tiến hành thực hiện
2.4.2.1 Thí nghiệm 1 - Khảo sát một số thành phần của nguyên liệu vỏ chuối
khô.
Nội dung 1: Xác định độ ẩm bằng máy đo độ ẩm (Shimadzu MOC-30S) đo độ
ẩm của vỏ chuối trong 25 phút ở 900
C.
Nội dung 2: Xác định độ tro toàn phần bằng cách nung ở nhiệt độ cao.
Nội dung 3: Xác định acid toàn phần bằng cách chuẩn độ với dung dịch NaOH
và thuốc thử phenolphthalein.
Nội dung 4: Phương pháp định lượng đường khử bằng phương pháp Miller.
Nội dung 5: Phương pháp định lượng hàm lượng cellulose theo phương pháp
Kiursher – Hofft.
Nội dung 6: Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm.
Nội dung 7: Xác định hàm lượng tinh bột bằng enzyme amylase.

47. Đồ án tốt nghiệp
13
Nội dung 8: Xác định hàm lượng pectin bằng cách trích ly bằng nước nóng và
định lượng pectin bằng cách tạo tủa calcium pectate.
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo.
2.4.2.2 Thí nghiệm 2 - Khảo sát tiền xử lý nguyên liệu vỏ chuối bằng acid
acetic 4%
Việc tiền xử lý vỏ chuối có ý nghĩa rất quan trọng. Điều này ảnh hưởng đến
hiệu suất quá trình lên men.
Nội dung: Tiền xử lý vỏ chuối bằng acid acetic 4%. Tỷ lệ (mẫu: tác chất) là
(1:15).
Thời gian (giờ) Nhiệt độ Tốc độ khuấy đảo
16 giờ Phòng 150 v/phút
Để có tỷ lệ (mẫu: tác chất) là (1:15) dựa vào đề tài “Khảo sát tiền xử lý vỏ chuối
(Musa paradisiaca) bằng dung môi hữu cơ và ứng dụng trong lên men bioethanol”,
Phạm Nữ Sơn Giang 2014. Sau khi tiền xử lý , tiến hành xác định hàm lượng
đường: đường khử (mg/mL), cellulose (mg/mL), lignin(%).
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo.
2.4.2.3 Thí nghiệm 3 - Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời
Nguyên liệu sau khi tiền xử lý sẽ được điều chỉnh pH, hấp khử trùng (1210
C,10
atm,10 phút) để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Cuối
cùng bổ sung enzyme Viscozyme và nấm men Sacharomyces serevisiae và Pichia
anomala tiến hành thủy phân và lên men đồng thời. Sau lên men thu dịch cồn.
Nhiệt độ tối thích của nấm men bình thường là 250
C – 300
C, enzyme là 450
C –
500
C. Nếu sử dụng nấm men bình thường thì nhiệt độ thì nhiệt độ nuôi cấy quá thấp
so với nhiệt của enzyme. Do đó, đề tài sử dụng nấm men chịu nhiệt để nâng cao
nhiệt độ cho phù hợp.
Đề tài khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và lên men đồng
thời được trình bày tóm tắt trong bảng 3.1

48. Đồ án tốt nghiệp
14
Bảng 3.1. Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm
Nghiệm
thức
Thời gian
(giờ)
Nhiệt độ
(0
C)
Tỷ lệ nấm
men (5%)
(SA:PA)
Tỷ lệ
enzyme
(%)
pH Tốc độ
khuấy
đảo
(V/p)
1->16 0,5,10…70,
75
Nhiệt độ
phòng (25-
350
C)
1:1 0,3 5 150
17->20 Thời gian
tối ưu (topt)
Room
300
C
350
C
400
C
1:1 0,3 5 150
21->25 Thời gian
tối ưu (topt)
Nhiệt độ tối
ưu (t0
opt)
1:1
1:4
4:1
2:3
3:2
0,3 5 150
26->31 Thời gian
tối ưu (topt)
Nhiệt độ tối
ưu (t0
opt)
Tỷ lệ nấm
men tối ưu
0,1%
0,3%
0,5%
0,7%
0,9%
5 150
32->34 Thời gian
tối ưu (topt)
Nhiệt độ tối
ưu (t0
opt)
Tỷ lệ nấm
men tối ưu
Tỷ lệ
enzyme
tối ưu
4,5
5
5,5
150
35->39 Thời gian
tối ưu (topt)
Nhiệt độ tối
ưu (t0
opt)
Tỷ lệ nấm
men tối ưu
Tỷ lệ
enzyme
tối ưu
pH
tối
ưu
50
100
150
200

49. Đồ án tốt nghiệp
15
Sau khi thủy phân và lên men các chỉ tiêu cần theo dõi : nồng độ cồn(%), hàm
lượng đường khử(mg/mL), hàm lượng cellulose (mg/mL),mật độ vi sinh (cfu/ml)
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo.
2.5 Phương pháp phân tích
2.5.1 Phương pháp vi sinh
2.5.1.1 Phương pháp giữ giống nấm men
Chuẩn bị môi trường SDA có chứa agar. Tiệt trùng, rót dung dịch vào ống
nghiệm và để yên đến khi agar đông lại.
Tiến hành cấy giống nấm men từ ống nghiệm gốc sang ống môi trường thạch
nghiêng đã chuẩn bị sẵn từ trước. Công việc này tiến hành trong tủ cấy vi sinh để
tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình
lên men sau này.
2.5.1.2 Phương pháp nhân giống và hoạt hóa giống nấm men
Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng
sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành nhân
giống qua các bước:
- Sau khi môi trường nấm men đã phát triển tốt trên môi trường thạch
nghiêng, cấy ria vào đĩa Petri chứa môi trường SDA, nuôi ở nhiệt độ phòng.
- Nhân giống cấp 1: lấy 1 khuẩn lạc rời cấy vào ống nghiệm chứa 10mL môi
trường SDB, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
- Nhân giống cấp 2: chuyển ống nghiệm sang chai chứa 90 mL môi trường
SDB nuôi ở nhiệt độ thường trong 24 giờ.
- Chia đôi bình nhân giống cấp 2 ở trên
 Chai 1: bảo quản trong tủ lạnh để ức chế không cho nấm men
phát triển.
 Chai 2: đo OD, mẫu trắng là môi trường SDB.

50. Đồ án tốt nghiệp
16
2.5.1.3 Định lượng số tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
 Nguyên tắc: Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số
lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, qua đó xác định được số tế bào
sống.
 Tiến hành:
- Pha loãng mẫu: pha loãng mẫu theo các dãy số thập phân thích hợp như : 10-
1
, 10-2
, 10-3
, 10-4
, 10-5
.
- Cấy mẫu: Dùng micropipette hút 0,1mL dịch mẫu đã pha loãng cho vào mỗi
đĩa thạch. Khi tất cả các thể tích 0,1mL dịch mẫu ở các độ pha loãng khác
nhau đều đã được chuyển lên bề mặt thạch của đĩa Petri, sử dụng que cấy gạt
bằng thủy tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ phòng.
- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm tất cả khuẩn lạc xuất
hiện trên đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc đếm được từ 25 – 250
để tính toán. Mật độ tổng của nấm men được tính theo công thức 1:
A = (cfu/mL) (CT1)
Trong đó:
A: số tế bào (cfu) nấm men trong 1ml mẫu.
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i.
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.
fi: độ pha loãng tương ứng.
Làm tròn kết quả có được, ghi lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả
dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ).

-
7
cfu/mL.
-
3
cfu/mL.

51. Đồ án tốt nghiệp
17
2.5.2 Phương pháp hóa lý
2.5.2.1. Xác định độ ẩm
 Nguyên tắc: là dùng máy đo độ ẩm Shimadzu (1000
C, 20 phút) để xác định
hàm lượng ẩm trong mẫu. Dùng nhiệt nóng của tủ sấy làm bay hết nước trong
mẫu.

- .
- 1).
-
2).
- 0
3).

theo công thức 2: W = x 100% (CT2)
2.5.2.2 Xác định độ tro toàn phần bằng cách nung ở nhiệt độ cao
 Nguyên tắc: Đốt cháy các chất hữu cơ trong mẫu ở nhiệt độ cao (5500
C –
6500
C). Các chất vô cơ không bị đốt cháy chính là tro. Đem cân, tính hàm
lượng tro.
 Tiến hành:
- Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 5000
C – 6500
C đến trọng lượng không
đổi. Để nguội ở bình hút ẩm, cân xác định khối lượng chén sứ (G1), cân phân
tích độ chính xác đến 0,0001g.
- Cho vào chén 5-10g mẫu. Khối lượng chén sứ và khối lượng mẫu là G2, cân
phân tích với độ chính xác như trên.
- Cho vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ lên đến 5500
C – 6000
C, nung cho đến
tro trắng ( khoảng 8 giờ). Trường hợp tro còn đen, lấy ra để nguội, cho thêm
vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung đến cho trắng.

52. Đồ án tốt nghiệp
18
- Để nguội trong bình hút ẩm và cân lại lần nữa (G3), cân phân tích với độ
chính xác như trên.
 Tính kết quả:
Hàm lượng tro toàn phần theo phần trăm (X) tính bằng công thức 3:
X = X 100% (CT3)
Trong đó:
G1: Trọng lượng của chén (g).
G2: Trọng lượng của chén và trọng lượng mẫu thử (g).
G3: Trọng lượng của chén và tro trắng sau khi nung đến khối lượng
không đổi (g).
2.5.2.3 Xác định hàm lượng acid toàn phần
 Nguyên tắc: Dùng một dung dịch kiềm chuẩn ( NaOH) để trung hòa hết các
acid trong mẫu, với phenolphthalein làm chỉ thị màu.
 Tiến hành:
- Cân 10 gam mẫu cho vào một cốc nhỏ. Bổ sung 100ml nước. Trộn đều.
- Ngâm mẫu khoảng 30 – 45 phút.
- Hút 5 mL dịch cho vào erlen.
- Nhỏ 1 giọt phenolphthalein.
- Nhỏ từ từ dung dịch NaOH 0.1N từ buret xuống đến khi dịch mẫu có màu
hồng nhạt bền vững.
 Tính kết quả:
Độ acid toàn phần theo phần trăm (X) tính bằng công thức 4:
(CT4)
Trong đó:
n: số mL NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ V2 mL dịch thử.
V1: thể tích mẫu ngâm (mL)
m: trọng lượng mẫu thử (g)
K: hệ số của acid citric, K=0,006904.

53. Đồ án tốt nghiệp
19
2.5.2.4 Xác định hàm lượng đường khử bằng Miller
 Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3,
5 -dinitrosalycylic acid (DNS). DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử
thành acid 3 - amino - nitrosalycylic có màu đỏ cam khi đun nóng hỗn hợp phản
ứng.
Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong
một phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu UV VIS.
Dựa theo đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm
lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất
trong khoảng bước sóng 540 nm.

- Chiết xuất đường trong vỏ chuối (xác định đường khử trong vỏ tươi, khô).
 ố 30mL cồn
960
→ đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh →
để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần trong).
 Cho tiếp 10mL cồn 80o
vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên
nồi đun cách thủy → để nguội → lọc (lặp lại 2 lần).
 Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (80o
)
 Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy
đun nhẹ. Sau khi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút
ẩm.
 Cặn khô trong cốc được pha loãng thành thể tích V = 50mL với nước
cất ta được dung dịch đường gốc. Pha loãng dung dịch đường gốc với
một hệ số pha loãng n thích hợp.
-
 Cho 3mL dung dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào
ống nghiệm, thêm 1mL thuốc thử DNS.

54. Đồ án tốt nghiệp
20
 Đun cách thủy hỗn hợp trong 15-20 phút. Làm lạ
ồi đo OD ở bước sóng 540nm.
 Từ giá trị OD đo được, dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose suy ra
hàm lượng đường khử trong mẫu.
ức 5:
D = (mg/g) (CT5)
2.5.2.5 Định lượng cellulose -Hoff
 Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa cellulose với thuốc thử
anthrone có màu vàng trong dung dịch acid H2SO4 đặc sẽ tạo màu xanh từ nhạt đến
đậm đến nâu khi đun nóng hỗn hợp phản ứng. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng
tỉ lệ thuận với nồng độ cellulose trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy
quang phổ so màu UV VIS.
Dựa theo đồ thị chuẩn cellulose với thuốc thử, sẽ tính được hàm lượng cellulose
của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 630
nm.
 Cách tiến hành:
- Cho 0.5mL dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) và ống nghiệm,
thêm 5mL thuốc thử Anthrone.
- Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút. Làm lạnh nhanh rồi đo OD ở bước sóng
630nm.
- Từ giá trị OD thu được, dựa vào đồ thị đường chuẩn cellulose suy ra hàm
lượng cellulose trong mẫu.

55. Đồ án tốt nghiệp
21
2.5.2.6 Xác định hàm lượng lignin
 Chuẩn bị mẫu
- Cân chính xác 0.3g ± 0.01g mẫu bỏ vào chai 100mL có nắp vặn, thêm 3mL ±
0.01mL acid H2SO4 72%. Đặt chai nắp vặn vào bể ổn nhiệt ở 30O
C ± 3O
C
trong 60 ± 5 phút. Dung dịch phản ứng luôn luôn phải được khuấy từ.
- Sau 60 phút thủy phân, pha loãng acid tới nồng độ
- 4% bằng cách thêm 84mL ± 0.04mL nước cất. Trộn mẫu bằng cách đảo
ngược chai nhiều lần để loại bỏ sự tách pha giữa các lớp acid nồng độ cao và
thấp.
 Phân tích lignin không hòa tan trong acid
- Nung crucible (cốc lọc chân không) ở 600O
C trong ít nhất 4 tiếng, sau đó bỏ
vào hộp hút ẩm để nguội trong 2 tiếng rồi đem cân trọng lượng, ghi trọng
lượng tới 0.1mg.
- Lọc mẫu bằng phương pháp lọc chân không, chuyển 50mL dịch lọc vào bình
bảo quản mẫu, dịch này sẽ dùng để đo lignin hòa tan. Dịch này phải được đo
trong vòng 6 tiếng sau thủy phân, nếu không phải được bảo quản trong tủ
lạnh tối đa là 2 tuần.
- Rửa phần rắn còn lại bằng ít nhất 50 mL nước cất, chia làm 3 lần rửa.
- Đem phần rắn sấy ở 105O
C trong hơn 4 tiếng, sau đó bỏ vào hộp hút ẩm để
nguội 1 tiếng, cân và ghi lại khối lượng mẫu.
- Sau đó đem crucible nung ở 600O
C qua đêm, đem cân xác định hàm lượng
tro.
 Phân tích lignin hòa tan trong acid
- Sử dụng máy đo quang phổ UV-Visible, chạy mẫu trắng là acid H2SO4 4%.
- Sử dụng dịch thủy phân thu được (pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng
H2SO4 4%) đo ở bước sóng 240nm và 320nm.
- Tính hàm lượng lignin bằng đường chuẩn.

56. Đồ án tốt nghiệp
22
2.5.2.7 Phương pháp xác hàm lượng pectin
Quy trình chiết suất pectin như sau: Tiền xử lý nguyên liệu vỏ chuối tươi ->
trộn 3g vỏ chuối khô vào 60ml nước cất -> điều chỉnh pH bằng HCl 0,5N -> Đun
và khuấy đều -> lọc thu dịch lọc -> Bổ sung them nước cất đến thể tích 100ml ->Bổ
sung thêm 200ml cồn 960
để tủa pectin -> lọc thu tủa (dùng giấy lọc Whatman 41 ->
Rửa tủa 2 lần với ethanol 700
-> Sấy khô tủa pectin (ở 700
C) đến khối lượng không
đổi -> thu pectin thô.
Hàm lượng (HL) pectin được tính theo công thức
HL pectin (%) = (CT6)
2.5.2.8 Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột.
(1) xác định hàm lượng đường tổng theo phương pháp DNS như bình thường.
(2) cân mẫu nghiền nhỏ với nước, đun nóng khoảng 20 phút, để nguội xuống
khoảng <750
C thì bổ sung 1% amylase, dùng Iot thử cho đến khi thấy hết tinh bột
thì đem trích đường đo thep phương pháp DNS. Lấy kết quả (2) trừ đi hàm lượng
đường (1) do tinh bột tạo ra. Nhân kết quả với 0,9 thì được hàm lượng tinh bột trong
mẫu.
2.5.2.9 Phương pháp xác định pH
Dùng pH kế điện tử.
2.5.2.10 Phương pháp xác định độ cồn
Dùng cồn kế.
.
 Chuẩn bị pha động.
- 2SO4
-
ử ion.

57. Đồ án tốt nghiệp
23
- 267µl H2SO4
-
-
- -
-
 Tính kết quả cồn.
Mẫu được lọc qua màng lọc vi sinh (NSX: Membrance solution, kích thước
0,22 µm) và đo bằng HPLC.
Từ diện tích peak thu được trên sắc kí đồ, tính được nồng độ cồn theo phương
trình: y=5,031*10-7
– 0.002

58. Đồ án tốt nghiệp
24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát giống nấm men
3.1.1 Khảo sát đại thể và vi thể giống nấm men
3.1.1.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae
a. Hình dạng khuẩn lạc b.Hình dạng tế bào
Hình 3.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae lúc đầu có màu trắng, khuẩn lạc
nhỏ. Sau 1-2 ngày khuẩn lạc chuyển sang màu trắng ngà, mịn màng, rìa tròn lồi, bề
mặt sáng, khuẩn lạc lớn hơn, đường kính khoảng 1 – 2 mm (hình 3.1a).
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng,
có kích thước nhỏ, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử.( hình 3.1b).
3.1.1.2 Nấm men Pichia anomala
a.Hình dạng khuẩn lạc b. Hình dạng tế bào
Hình 3.2. Nấm men Pichia anomala

59. Đồ án tốt nghiệp
25
Khuẩn lạc nấm men Pichia anomala có màu kem, rìa có hình rang cưa, bề mặt
lồi, trơn bóng. Ban đầu, khuẩn lạc có kích thước nhỏ. Sau 1-2 ngày khuẩn lạc có
đường kính khoảng 1 – 1,5mm.(hình 3.2a).
Tế bào nấm men Pichia anomala có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích
thước nhỏ. (hình 3.2b).
3.1.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng của nấm men trong môi trường SDB
3.1.1.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae trong môi trường
SDB
Từ hình 3.3, có thể thấy đường cong sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae
trong môi trường SDB được chia thành bốn pha khá rõ rệt.
- Pha tiềm phát : Trong 6 giờ đầu, nấm men phải thích ứng với môi trường mới
nên chưa có sự tăng sinh mạnh trong giai đoạn này.
- Pha lũy thừa: Từ thời điểm 6 đến 39 giờ, số lượng tế bào nấm men tăng
nhanh chóng.
- Pha cân bằng: Từ thời điểm 39 đến 51 giờ, có thể thấy số lượng tế bào nấm
men khá là cân bằ (7,75 – 8,28).
-Pha suy vong: Từ 51 -72 giờ số lượng tế bào chết nhiều hơn số tế bào sinh
ra, và trong giai đoạn này, chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, không đủ
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
Mật
độ
tế
bào
log
(cfu/mL)
Thời gian khảo sát (giờ)

60. Đồ án tốt nghiệp
26
cung cấp cho hoạt động sinh trưởng, phát triển của nấm men do đó tế bào già và
chết đi.
3.1.2.2 Nấm men Pichia anomala
Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng Pichia anomala trong môi trường SDB
Từ hình 3.4, có thể thấy đường cong sinh trưởng Pichia anomala trong môi
trường SDB được chia thành bốn pha khá rõ rệt.
- Pha tiềm phát : Trong khoảng 4 giờ đầu, nấm men phải thích ứng với môi
trường mới nên chưa có sự tăng sinh mạnh trong giai đoạn này (log(cfu/mL)
(7,58 – 7,66)).
- Pha lũy thừa: Từ thời điểm 6 đến 20 giờ, số lượng tế bào nấm men tăng
9,01).
- Pha cân bằng: Từ thời điểm 20 đến 36 giờ, có thể thấy số lượng tế bào nấm
men khá là cân bằ (9,01 – 9,07), số lượng tế bào chết cân
bằng với số tế bào được sinh ra.
- Pha suy vong: Từ 36 giờ trở về sau, số lượng tế bào chết nhiều hơn số tế bào
sinh ra, và trong giai đoạn này nên tổng số lượng tế bào giảm dần, chất dinh
dưỡng trong môi trường cạn kiệt, không đủ cung cấp cho hoạt động sinh
trưởng, phát triển của nấm men do đó tế bào già và chế
8,72).

61. Đồ án tốt nghiệp
27
3.2 Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối khô
Vỏ chuối sau khi sấy ở 700
C, độ ẩm vỏ chuối là 10.45 ± 0.08 (%) được đem đi
xay và rây ( kích thước lỗ sàn ~ 0,5 mm), thu được dạng bột như hình 3.1.
Hình 3.5. Bột vỏ chuối
Điều kiện bảo quản :
- Dụng cụ bảo quản trong hộp PE.
- Nhiệt độ bảo quản : nhiệt độ phòng.
Kết quả thành phần hóa học của vỏ chuối được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của vỏ chuối
Thành phần Hàm lượng
Độ ẩm (%) 10,45 ± 0,08
Pectin (%) 2,42 ± 0,15
Độ tro (%) 8,70 ± 0,20
Acid toàn phần (%) 3,64 ± 0,21
Lignin (%) 12,0 ± 0,10
Tinh bột (mg/g) 21,55 ± 0,11
Đường khử (mg/g) 24,69 ± 1,39
Cellulose (mg/g) 66,56 ± 0,98

62. Đồ án tốt nghiệp
28
Qua khảo sát một số thành phần của vỏ chuối khô được trình bày trong bảng 3.1
ta thấy sau khi sấy khô vỏ chuối đến độ ẩm 10,45 ± 0,08 %, cellulase lúc này chiếm
66,56 ± 0,98% thành phần chất khô, khi so sánh hàm lượng cellulose với các
nguyên liệu lignocellulose được sử dụng để sản xuất bioethanol khác như: rơm rạ
(34-38%), bã mía (50%),phế phẩm cây bắp (36,4%), rơm lúa mì (38,2%) có thể
thấy vỏ chuối khô có hàm lượng cellulose cao và là một nguồn nguyên liệu tiềm
năng cho sản xuất bioethanol.
Độ acid toàn phần của vỏ chuối (3,64 ± 0,21%) tương đối phù hợp với khả năng
lên men của nấm men. (với môi trường lên men có khối lượng gấp 10 lần nguyên
liệu thì từ độ acid toàn phần đổi ra nồng độ acid acetic là 0,011M tính pH của môi
trường đạt 4,77 nằm trong khoảng pH = 4 – 5 tối ưu).
Độ tro của vỏ chuối là 8,70 ± 0,20 % tương đối phù hợp với khả năng lên men
cung cấp khoáng tạo môi trường dinh dưỡng cho nấm men phát triển.
Tuy nhiên, hàm lượng đường cao 24,69 ± 1,39 mg/g trong vỏ chuối tươi rất dễ bị
nấm mốc phát triển và gây hư hỏng nguồn nguyên liệu sẽ ức chế hiệu suất tạo
ethanol của nấm men, tạo mùi hôi khó chịu gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy,
nguyên liệu phải có độ ẩm thích hợp nhằm ngăn cản hoạt động của nấm dại. Nên đề
tài tiến hành khảo sát quá trình tiền xử lý nguyên liệu được sấy khô đến độ ẩm thích
hợp.
3.3 Khảo sát tiền xử lý nguyên liệu bằng acid acetic 4%
Tiền xử lý nguyên liệu là giai đoạn quan trọng trong quá trình lên men
bioethanol từ lignocellulose. Vì nguyên liệu sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu suất tạo
ethanol. Do đó, việc lựa chọn nguyên liệu lên men phù hợp có ý nghĩa rất quan
trọng. Nguyên liệu sau khi sấy được xay nhuyễn đem tiền xử lý bằng acid acetic
4%.
Căn cứ vào kết quả của đề tài “ Khảo sát tiền xử lý vỏ chuối (Musa
paradisiaca) bằng dung môi hữu cơ và ứng dụng trong lên men bioethanol”, Phạm
Nữ Sơn Giang 2014.

63. Đồ án tốt nghiệp
29
Đề tài đã chọn phương pháp tiền xử lý bằng acid acetic 4% , tỷ lệ ( nguyên liệu
: tác chất) là (1:15) trong 16 giờ. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Một số thành phần hóa học của vỏ chuối khô sau khi tiền xử lý với acid
acetic 4%
Thành phần Hàm lượng
Tinh bột (mg/g) 34,37 ± 0,38
Đường khử (mg/g) 88,38±1,80
Cellulose(mg/g) 69,09±1,09
Lignin (%) “ – ”
Ghi chú: “-“: không có số liệu
Qua khảo sát tiền xử lý nguyên liệu bằng acid acetic 4% được trình bày trong
bảng 3.2 ta thấy hàm lượng cellulose sau khi tiền xử lý acid là (69,09±1.09 mg/g)
không chênh lệch nhiều so với hàm lượng cellulose trong nguyên liệu vỏ chuối khô
(66,56 ± 0,98 mg/g). Vì dung dịch acid loãng chỉ có tác động tới lớp vỏ lignin bao
bọc bên ngoài và hemicellulose do đó hàm lượng cellulose tăng nhưng không tăng
nhiều.
Hàm lượng đường khử được đóng góp do một số vị trí trong cấu trúc của mạch
cellulose có tính vô định hình cao nên tác nhân acid dễ dàng tấn công và thủy phân
một phần cellulose thành đường các hoạt lực cao bẻ gãy các liên kết trong phân tử
hemicellulose thành các phân tử đường, do đó hàm lượng đường khử sau khi tiền xử
lý tăng từ 24,69 ± 1,39 mg/g lên 88,38±1,80 mg/g.
3.4 Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời (SSCF)
Quá trình thủy phân và lên men đồng thời kết hợp nhiều giống nấm men có
nhiều ưu điểm so với quá trình thông thường như đỡ hao tốn thiết bị, thời gian, năng
lượng, hiệu suất toàn quá trình cao hơn. Thu nhận bioethanol từ quá trình này là
một hướng nghiên cứu mới, chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ ở Việt Nam.
Trên thế giới đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu và đã triển khai thử mô hình này.

64. Đồ án tốt nghiệp
30
Nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát các chất có trong dịch thủy phân và lên men
đồng thời, ảnh hưởng của thời gian lên men, nhiệt độ lên men, tỷ lệ nấm men bổ
sung, tỷ lệ enzyme bổ sung, pH và tốc độ khuấy đảo lên quá trình lên men.
3.4.1 Khảo sát thời gian lên men
Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm.
Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ
đường, chủng nấm men…Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng
nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng
môi trường lên men cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình
lên men. Nếu thời gian lên men quá ngắn, quá trình lên men chưa xảy ra hoàn toàn,
đường sót sẽ còn nhiều trong dịch lên men và độ cồn tạo ra thấp. Nếu thời gian lên
men quá dài, môi trường lên men sẽ dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật không mong
muốn, đồng thời nếu có sự hiện diện của oxy thì rượu sẽ bị oxy hóa thành acid
acetic, làm giảm độ cồn và gây hư hỏng rượu.
Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho dịch đường tiếp xúc với
oxy. Lúc này nấm men cần oxy để tích lũy một lượng sinh khối cần thiết cho quá
trình lên men. Tiếp theo, để chuyển hóa đường thành ethanol, nấm men phải được
phát triển trong điều kiện yếm khí hoàn toàn. Vì trong môi trường này, sự hô hấp
của nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng con đường lên
men. Để đáp ứng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân hủy một lượng đường
lớn và đường sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2. Đó là nguyên nhân muốn có
ethanol nhiều thì không được thoáng khí môi trường. Nếu có oxy thì trong giai đoạn
này rượu sẽ tiếp tục chuyển hóa thành acid acetic làm sản phẩm bị chua
Giống nấm men sau khi nhân giống đạt đủ sinh khối sẽ được dùng trong lên
men bioethanol. Trước khi giống này được sử dụng cho đợt sau lên men thì cần hoạt
hóa 8 – 24 giờ trong môi trường mới để nấm men phát triển sinh khối và có hoạt lực
trở lại.
Thông thường, người ta xác định thời điểm kết thúc lên men khi tổng số các
chất rắn hòa tan không đổi ít nhất sau 6 giờ liên tiếp. Khi đó nấm men không còn

65. Đồ án tốt nghiệp
31
chuyển hóa đường thành cồn nữa, do độ cồn tạo thành đã đủ gây ức chế quá trình
lên men rượu của nấm men. Do đó, việc chọn thời gian lên men phù hợp có ý nghĩa
rất quan trọng, chọn thời gian lên men sao cho có lợi nhất.
Đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men ở các
mức thời gian từ 0 giờ đến 75 giờ , mỗi nghiệm thức cách nhau 5 giờ.
Dịch thủy phân và lên men đồng thời đượxzc lọc qua phễu lọc vi sinh (NSX:
Membrane solutions, kích thước 0,22 µm) và đo bằng máy HPLC. Kết quả khảo sát
một số thành phần trong thời gian lên men được trình bày trong biểu đồ hình 3.6
a,b,c,d.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Nồng
độ
cồn
(%)
Thời gian lên men ( giờ)

66. Đồ án tốt nghiệp
32
Hình 3.6a. Thay đổi độ cồn theo thời gian lên men.
Hình 3.6b.Mật độ tế bào thay đổi theo thời gian lên men.
.
Hình 3.6c. Sự thay đổi đường khử theo thời gian lên men.
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
6.9
7
7.1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Mật
độ
tế
bào
log(cfu/ml)
Thời gian lên men (giờ)
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Hàm
lượng
đường
khử
(mg/ml)
Thời gian lên men (giờ)