Nghiên cứu công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp shf (separate hydrolysis and fermentation)

New Text Document.txt
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHUYỂN HÓA GỖ (TRÀM BÔNG VÀNG) THÀNH BIOETHANOL BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SHF(SEPARATE HYDROLYSIS AND FERMENTATION)
VĂN BẢO HUY
NGUYỄN ĐÌNH QUÂN (giảng viên hướng dẫn)
TRẦN THỊ TƯỞNG AN (giảng viên hướng dẫn)
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017
Page 1

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do bản thân thực hiện và không sao
chép dưới bất kỳ hình thức nào. Nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm
Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh.
Các số liệu trong đề tài có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc. Kết quả
trình bày trong đề tài được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực và chưa
từng được công bố trước đây.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học đề tài nghiên cứu này.
Sinh viên thực hiện
Văn Bảo Huy

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, xin gửi đến TS. Nguyễn Đình Quân, ThS. Trần Thị Tưởng An cùng anh
Nguyễn Anh Duy và các bạn Nguyễn Minh Thiện, Võ Thị Thảo Trang, Trần Thị Ánh
Nguyệt đang nghiên cứu và làm đồ án tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và
Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh lời cảm tạ sâu sắc vì đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt trong suốt thời gian qua.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy cô của trường Đại học Công
Nghệ Tp. HCM nói chung, quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi
Trường nói riêng đã tận tình dạy dỗ, giúp em hoàn thiện kiến thức, các kỹ năng chuyên
môn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập.
Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã nuôi dạy con nên người.
Ba mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất để con bước đi trên con đường đời khi vấp ngã
luôn có ba mẹ động viên tinh thần cho con.
Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, chỉ dựa vào kiến thức hạn hẹp cùng với thời gian
ngắn ngủi nên chắc chắn không tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự góp
ý của quý thầy, cô để kiến thức của chúng em ngày càng hoàn thiện hơn, rút ra được
những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập, làm việc sau này.
Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô của trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM
dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý của mình. Đồng kính chúc
quý thầy cô, anh chị và các bạn của phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass,
ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh luôn dồi dào sức khỏe và đạt được
nhiều thành công tốt đẹp trong cuộc sống.
Sinh viên thực hiện
Văn Bảo Huy

i
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT..............................................................................iv
DANH MỤC BẢNG.......................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH.......................................................................................................vi
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................4
1.1. Sơ lược về cồn sinh học ..................................................................................4
1.1.1. Khái niệm .....................................................................................................4
1.1.2. Các thế hệ bioethanol...................................................................................4
1.1.3. Tình hình sản xuất bioethanol thế giới và trong nước.................................5
1.1.4. Quy trình sản xuất bioethanol......................................................................7
1.2. Nguyên liệu lignocellulose..............................................................................8
1.2.1. Khái niệm .....................................................................................................8
1.2.2. Thành phần cấu trúc lignocellulose.............................................................9
1.3. Cây tràm bông vàng ở Việt Nam (Acacia auriculiformis) ...........................11
1.3.1. Sơ lượt về cây tràm bông vàng...................................................................11
1.3.2. Phương pháp sản xuất bioethanol từ gỗ tràm bông vàng ........................13
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước...................................................23
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................27
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................................27
2.2. Nguyên vật liệu .............................................................................................27
2.2.1 Mùn cưa từ gỗ cây tràm bông vàng ............................................................27
2.2.2. Acremonium cellulase................................................................................27
2.2.3. Saccharomyces cerevisiae..........................................................................28
2.2.4. Hóa chất sử dụng........................................................................................28
2.3. Các thiết bị sử dụng.......................................................................................29
2.4. Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................31

ii
2.4.1. Sơ đồ quy trình...........................................................................................32
2.4.2. Trình tự và Bố trí thí nghiệm .....................................................................33
2.5. Các phương pháp phân tích...........................................................................41
2.5.1. Phương pháp phân tích hàm lượng ẩm......................................................41
2.5.2. Phương pháp phân tích thành phần cellulose, lignocellulose, lignin và
hàm lượng tro trong nguyên liệu biomass ...........................................................42
2.5.3. Phương pháp cấy và giữ giống nấm men...................................................46
2.5.4. Phương pháp nhân giống và hoạt hóa giống nấm men.............................46
2.5.5. Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ..................47
2.5.6. Phương pháp xác định hai loại đường và ethanol bằng máy HPLC.........47
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................48
3.1. Khảo sát chủng nấm men S.cerevisiae sử dụng trong đề tài.........................48
3.1.1. Đặc điểm hình thái của nấm men...............................................................48
3.1.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae.................................................48
3.2. Phân tích mẫu nguyên liệu ban đầu ..............................................................50
3.3. Tiền xử lý ......................................................................................................50
3.3.1. Khảo sát kích thước nguyên liệu................................................................50
3.3.2. Chọn tác chất tiền xử lý .............................................................................51
3.3.3. Thành phần mẫu sau tiền xử lý với NaOH.................................................53
3.3.4. Thời gian tiền xử lý và tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối lượng dung dịch..........54
3.4. Quá trình thủy phân.......................................................................................55
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân.....................55
3.4.2. Khảo sát tác động của tỷ lệ enzyme bổ sung đến quá trình thủy phân......56
3.4.3. Khảo sát pH ảnh hưởng đến quá trình thủy phân......................................58
3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân.......................59
3.5. Khảo sát lên men...........................................................................................60
3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men ........................60
3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đối với hiệu quả của quá
trình lên men.........................................................................................................61

iii
3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men..........................63
3.5.4. Khảo sát tỷ lệ nấm men bổ sung trong quá trình lên men .........................63
3.5.5. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần chất dinh dưỡng bổ sung................64
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................66
4.1. Kết luận .........................................................................................................66
4.2. Đề nghị..........................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................68
PHỤ LỤC

iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
- CSL: Corn steep liquor
- HPLC: High Performance Liquid Chromatography
- KHV: Kính hiển vi
- STT: Số thứ tự
- SHF: Separate Hydrolysis and Fermentation
- SSF: Simultaneous Saccharification Fermentation
- SSCF: Simultaneous Saccharification and Cofermentation
- UV-VIS: Ultraviolet–visible spectroscopy
- VSV: Vi sinh vật

v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tình hình một số nhà máy bioethanol tại Việt Nam…………………..6
Bảng 1.2. Thành phần của vài loại lignocellulose……………………………….9
Bảng 1.3. Ưu, nhược điểm của một số phương pháp lên men………………….14
Bảng 1.4. Các phương pháp tiền xử lý hiện nay………………………………..17
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng……………………………………………...…28
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước hạt thích hợp………...………33
Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm lựa chọn tác nhân tiền xử lý………….……………35
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian tiền xử lý………………………36
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ bã/dung dịch………..………………37
Bảng 3.1. thành phần phần trăm các chất có trong mẫu mùn cưa gỗ ban đầu….50
Bảng 3.2. Thành phần phần trăm các chất có trong mẫu mùn cưa gỗ tràm bông
vàng sau khi tiền xử lý với NaOH 4%.................................................................53

vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Quy trình sản xuất bioethanol………………………………………….8
Hình 1.2. Công thức hóa học của cellulose………………………………………9
Hình 1.3. Các dạng cấu trúc của hemicellulose …….………………………….10
Hình 1.4. Các đơn vị cơ bản của lignin…………………………………………11
Hình 1.5. Gỗ và cây tràm bông vàng…………..……………………………….12
Hình 1.6. Nguồn cung dăm gỗ của Việt Nam và các nước trên thế giới…...….13
Hình 1.7. Sơ đồ quy trình sản xuất bioethanol………………...………………..16
Hình 1.8. Sơ đồ đường phân……………………………...…………………….22
Hình 1.9. Sự tạo thành ethanol từ glucose…………………………...…………23
Hình 2.1. Mùn cưa gỗ tràm bông vàng…………………………………………27
Hình 2.2. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)…………………………30
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm……………………….………………………32
Hình 3.1. Đặc điểm đại thể (a) và vi thể (b) của S.cerevisiae…………………..48
Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae theo thời gian trên môi
trường SDB………………………………………………………………..……49
Hình 3.3. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất tách lignin.…..51
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các tác chất tiền xử lý đối với hiệu suất lignin tách ra.
……………………………………………………………………...….………..52
Hình 3.5. Sự thay đổi của hiệu suất tách lignin theo thời gian…………………54
Hình 3.6. Sự phụ thuộc của lượng lignin tách ra vào tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối
lượng dung dịch……...………………………………………………………….54
Hình 3.7. Nồng độ glucose và xylose được khảo sát theo thời gian……………56
Hình 3.8. Hàm lượng glucose và xylose thay đổi khi khảo sát các tỷ lệ enzyme
khác nhau từ 1% đến 9%......................................................................................57

vii
Hình 3.9. Hàm lượng đường thay đổi khi khảo sát các giá trị của pH….………58
Hình 3.10. Hàm lượng glucose, xylose theo nhiệt độ thủy phân……...………..59
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men…...……………….60
Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu với quá trình lên men….…62
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ với quá trình lên men…………….……….63
Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ bổ sung nấm men đến quá trình SHF…………64
Hình 3.15. Hàm lượng glucose, xylose và ethanol theo chất dinh dưỡng bổ
sung………………………………………………………………………..……65

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, thế giới đang đứng trước nguy cơ khủng hoảng năng lượng trầm trọng,
Theo dự báo của các nhà khoa học trên thế giới, nguồn năng lượng từ các sản phẩm
hoá thạch dầu mỏ sẽ bị cạn kiệt trong vòng 40 - 50 năm nữa. Để ổn định và đảm bảo an
ninh năng lượng đáp ứng cho nhu cầu con người cũng như các ngành công nghiệp, các
nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm ra những nguồn nhiên liệu mới. Trong đó,
nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối động, thực vật là
một hướng đi có thể tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế phần nào nguồn nhiên liệu hoá
thạch đang cạn kiệt; đảm bảo an ninh năng lượng cho từng quốc gia.
Theo báo cáo của tổ chức Forest Trends, mỗi năm Việt Nam xuất khẩu dăm gỗ
sang Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan để làm bột giấy lên đến gần 10 triệu tấn khô,
trong đó chiếm 70 % là dăm gỗ tràm bông vàng. Từ năm 2011 đến nay, Việt Nam là
quốc gia xuất khẩu dăm gỗ lớn trên thế giới và có diện tích trồng tăng từ 150.000 đến
200.000 hecta/năm. Dăm gỗ và đặc biệt là mùn cưa tràm thải ra trong quá trình sản
xuất là rất lớn gần 1 triệu tấn khô tập trung dễ thu gom hơn rơm rạ và các nguyên liệu
tinh bột. Vùng nguyên liệu dăm gỗ cụ thể là tràm bông vàng và keo lai (một loài tương
tự như tràm bông vàng) lớn nhất tập trung tại miền Trung. Đây cũng là nơi có các nhà
máy sản xuất cồn sinh học có quy mô lớn nhất cả nước như Dung Quất (Quảng Ngãi),
nhưng các nhà máy này chỉ sử dụng nguồn nguyên liệu tinh bột khó thu mua.
Dựa vào thành phần chủ yếu của tràm bông vàng là cellulose và hemicellulose,
qua quá trình thủy phân và lên men, chuyển hoá cellulose trong gỗ thành Bioethanol.
Với những ưu điểm như rẻ tiền, phổ biến, mùn cưa gỗ tràm sẽ là một nguồn nguyên
liệu tiềm năng trong quá trình nghiên cứu sản xuất Bioethanol.
Vậy nên chúng ta có thể kết hợp nguyên liệu ở các vùng có cơ sở sản xuất để phát
triển bioethanol thế hệ thứ 2 sẽ mang đến các ý nghĩa thiết thực sau:

2
- Phù hợp với xu hướng phát triển của sản xuất bioethanol nói riêng và ngành năng
lượng nói chung.
- Nếu thành công thì sẽ tận dụng được nguồn mùn cưa, phế phụ phẩm lâm nghiệp
khổng lồ hiện nay.
- Phù hợp với an ninh lương thực thế giới thay thế nguyên liệu tinh bột và đường bằng
lignocellulose trong công nghiệp sản xuất bioethanol.
2. Mục đích nghiên cứu
Mục đích của đề tài là nghiên cứu khảo sát thực nghiệm hướng đến xây dựng
công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp thủy
phân và lên men không đồng thời (SHF) sử dụng Acremomium cellulase và
Saccharomyces cerevisiae ở quy mô phòng thí nghiệm.
3. Nội dung nghiên cứu
Để tối ưu khả năng chuyển hóa bioethanol từ mùn cưa tràm cần nghiên cứu:
 Đối với quá trình tiền xử lý:
- Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu.
- Khảo sát thành phần mùn cưa gỗ ban đầu và sau tiền xử lý.
- Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng NaOH và H2SO4.
- Khảo sát thời gian tiền xử lý và tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối lượng dung dịch
 Đối với quá trình thủy phân và lên men không đồng thời (SHF):
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến từng giai đoạn thủy phân và lên men.
- Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hai giai đoạn thủy phân và lên men.
- Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme bổ sung vào giai đoạn thủy phân.
- Khảo sát ảnh hưởng của mật độ nấm men đến giai đoạn lên men.
- Khảo sát ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến giai đoạn lên men.

3
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đồ án được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH
Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 03/04/2017 đến
tháng 16/07/2017.
5. Hạn chế của đề tài
Do quỹ thời gian không cho phép đồ án chỉ tiến hành các thí nghiệm tiền xử lý
với NaOH và H2SO4 nhằm thu nhận được cellulose, chưa đa dạng được các phương
pháp tiền xử lý ảnh hưởng trực tiếp đến các quá trình sau.

4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về cồn sinh học
1.1.1. Khái niệm
Bioethanol (ethanol sinh học) là một loại nhiên liệu sinh học dạng cồn, được sản
xuất bằng con đường sinh học, chủ yếu bằng phương pháp lên men và chưng cất các
loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển hóa thành đường đơn, thường được sản xuất
từ các loại cây nông nghiệp hàm lượng đường cao như bắp, lúa mì, lúa mạch, mía.
Ngoài ra, bioethanol còn được sản xuất từ các loại cây có chứa hợp chất cellulose.
Hiện nay, các nguồn nguyên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, ước tính trữ lượng
dầu mỏ của thế giới đến năm 2050 sẽ cạn. Trong khi đó, hoạt động sống của con người
rất cần năng lượng. Mặt khác, nguồn năng lượng hóa thạch khi sử dụng đã gây ra các
vấn đề nghiêm trọng về ô nhiễm môi trường, hiệu ứng nhà kính. Chính vì vậy, nhu cầu
về nguồn nguyên liệu thay thế cho xăng dầu đang là vấn đề cấp thiết cho toàn thế giới
nói chung và Việt Nam nói riêng. Việc đầu tư nghiên cứu “nhiên liệu sạch”- nhiên liệu
sinh học bioethanol đang trở thành đề tài được quan tâm hàng đầu trên thế giới [26].
1.1.2. Các thế hệ bioethanol
Dựa vào nguyên liệu sản xuất, bioethanol được chia làm 3 thế hệ:
 Bioethanol thế hệ thứ nhất
Bioethanol thế hệ thứ nhất là nguồn nguyên liệu chứa nhiều tinh bột và đường.
Nói chung bioethanol có thể được tạo thành từ những nguyên liệu carbonhydrate có
công thức chung là (CH2O)N và nó có thể được chia thành 3 nhóm : đường, tinh bột và
sinh khối lignocellulosic.Bioethanol thế hệ thứ nhất là khái niệm đề cập tới nguồn cây
trồng, đây cũng chính là nguồn dinh dưỡng cho con người và động vật như: các loại
cây ngũ cốc, cây lấy đường [17].
 Bioethanol thế hệ thứ hai
Nguyên liệu thô sử dụng để sản xuất bioethanol thế hệ thứ 2 được đề cập ở đây
là các sản phẩm không phải là nguồn thực phẩm, thường là sinh khối lignocellulosic.

5
Các nguyên liệu này đại diện cho các hình thể chứa nhiều cacbon trên trái đất như các
loại phế phẩm nông nghiệp ( rơm, bã bắp (vỏ bắp, râu bắp, cùi bắp), gỗ thải, mùn cưa,
phế phẩm lâm nghiệp, bã mía, các loại cỏ… )[17].
 Bioethanol thế hệ thứ ba
Tảo biển là nguyên liệu tốt nhất trong nhóm này đòi hỏi ít đất đai canh tác và
nguồn nước sạch cho trồng trọt, tiêu biểu cho nguồn sinh khối rất đáng quan tâm để sản
xuất ra bioethanol [17].
1.1.3. Tình hình sản xuất bioethanol thế giới và trong nước
 Thế giới
Brazil là nước đi đầu trong việc sản xuất và ứng dụng bioethanol trên thế giới.
Brazil đã thành công trong việc sản xuất bioethanol theo quy mô công nghiệp từ những
năm 1970 khi nước này phụ thuộc nặng nề vào dầu nhập khẩu. Ngày nay, toàn bộ xe
hơi ở Brazil sử dụng xăng có pha ít nhất 25% ethanol, và 60% số xe có khả năng “linh
động về nhiên liệu” (có thể sử dụng 100% ethanol làm nhiên liệu). Brazil sản xuất
bioethanol hầu như chỉ từ cây mía. Trong mô hình này, mỗi tấn mía cho năng suất 72
lít ethanol. Loại ethanol này có thể được tinh lọc thêm để pha vào xăng, hoặc dùng làm
ethanol nhiên liệu tinh. Rõ ràng con số này cho thấy có rất nhiều thành phần không
được sử dụng trong quá trình chuyển hóa biomass thành ethanol. Hầu hết những thành
phần này là hemicellulose và cellulose.
Nước Mỹ đang bám theo Brazil và đầu tư mạnh vào sản xuất nhiên liệu sinh học.
Hiện tại Mỹ đang sử dụng toàn bộ xăng có pha 10% ethanol, với những cải tiến nhằm
tăng tỉ số này. Trong tương lai, Colombia bắt buộc những thành phố có dân số trên
500.000 dân phải bán xăng có pha 10% ethanol. Ở Venezuela, công ty dầu Quốc gia
đang hỗ trợ dự án xây dựng 15 nhà máy chế cồn từ mía trong 5 năm tới khi chính phủ
sắp ban hành đạo luật bắt buộc sử dụng xăng E10 (pha 10% ethanol). Ở Đông Nam Á,
Thái Lan đã ban hành luật cho sử dụng xăng pha 10% ethanol bắt đầu từ 2007 [20].

6
 Việt Nam
Ở Việt Nam, công nghiệp sản xuất ethanol đã được hình thành. Phần đông các
nhà máy ethanol sản xuất từ rỉ đường mía, tinh bột dùng làm ethanol cho thực phẩm và
công nghiệp (bảng 1.1). Tổng cộng năng suất là 25 triệu lít/năm, trong đó có 3 nhà máy
sản xuất 15000 – 30000 lít/ngày là nhà máy đường Lam Sơn, nhà máy đường Hiệp
Hoà và nhà máy rượu Bình Tây và hàng trăm cơ sở sản xuất 3000 – 5000 lít/ngày.
Tập Đoàn Dầu Khí Việt Nam (PetroVietNam) đã giao cho Tổng công ty Dầu Khí
Việt Nam (Petrosetco), đơn vị thành viên của PetroVietnam việc phát triển năng lượng
sinh học. Ngày 09/03/2007, Petrosetco ký kết với tập đoàn Itochu Nhật Bản hợp tác
thành lập liên doanh xây dựng nhà máy sản xuất bioethanol đầu tiên tại Việt Nam phục
vụ cho hoạt động công nghiệp và giao thông vận tải với công suất 100 triệu lít/năm.
Xăng sinh học E5 do PetroVietnam pha chế chính thức có mặt trên thị trường từ ngày
01/08/2010 và được bán tại hơn 153 điểm kinh doanh xăng dầu của PetroVietnam cũng
như các đại lý tại một số tỉnh, thành phố lớn trên cả nước.
Bảng 1.1. Tình hình một số nhà máy bioethanol tại Việt Nam
STT Tên nhà máy Công suất Địa điểm Tình trạng
1 Nhà máy ethanol nhiên
liệu - Cty Đồng Xanh
130 triệu
lít/năm
Đại Lộc, Quảng
Ngãi
Đang sản xuất
2 Nhà máy sản xuất ethanol
nhiên liệu Cty Tùng Lâm
70 triệu
lít/ năm
Đồng Nai Dừng hoạt
động
nhiên liệu – Cty TNHH
Đại Việt
70 triệu
lít/ năm
Lô CN5 khu CN
Tâm Thắng, Đắc
Nông
Đang sản xuất
sinh học Dung Quốc (Cty
Nhiên liệu miền Trung )
100 triệu
lít/ năm
Khu CN Dung
Quốc, Quảng Ngãi
Dừng hoạt
động
Nguồn: Khoa học và công nghệ, số 9 -08/2012.

7
Ngày 20/11/2007, "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm
nhìn đến năm 2025" đã được Thủ tướng Chính phủ ký quyết định số177/2007/QĐ-
TTG với mục tiêu phát triển năng lượng, một dạng năng lượng mới, tái tạo được
thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần bảo đảm an ninh năng
lượng và bảo vệ môi trường.
Nhà máy Ethanol Đại Tân có công suất 125 triệu lít/năm.. Ngày 05/08/2010, công
ty Đồng Xanh tổ chức lễ công bố xăng sinh học sản xuất ở Việt Nam với tỷ lệ cồn
lên tới 99.8%. Sản phẩm đã bán ra trên thị trường Việt Nam và sử dụng cho động cơ
với tên thương mại xăng E5.
Hiện nay nhà máy ethanol Đại Tân đã tạm dừng hoạt động kể từ tháng 6/2012,
đến quý I/2013 nhà máy sản xuất ethanol Bình Phước có công suất 100 triệu lít/năm
cũng đã phải tạm ngừng sản xuất do giá nguyên liệu đầu vào cao trong khi nhu cầu tiêu
thụ ethanol nhiên liệu nội địa không đáng kể.
1.1.4. Quy trình sản xuất bioethanol
Bioethanol có thể được sản xuất từ ba loại nguyên liệu: đường (từ mía đường, củ
cải đường, mật đường và trái cây), tinh bột ( từ ngô, sắn, khoai tây) và cellulose (từ gỗ,
phế thải nông nghiệp, chất thải từ bột giấy và giấy nhà máy) (hình 1.1). Trong số ba
loại nguyên liệu chính, cellulose chứa trong sinh khối lignocellulosic là nguồn sinh
khối toàn cầu phổ biến nhất có thể sử dụng cho sản xuất ethanol sinh học.
Quá trình lên men sản xuất ethanol gồm các khâu: tiền xử lý nguyên liệu và 2 giai
đoạn: Thủy phân nguyên liệu (đường hóa) và lên men.
Thủy phân (đường hóa) là quá trình chuyển hoá nguyên liệu thành các đường
đơn chủ yếu như glucose, xylose. Lên men là quá trình chuyển hoá các phân tử đường
thành ethanol. Sản xuất ethanol từ mùn cưa tràm có thể thực hiện bằng phương pháp
“Thủy phân và Lên men riêng biệt” (separate hydrolysis and fermentation – SHF) hoặc
bằng phương pháp “Đường hóa và Lên men đồng thời” (simultaneous saccharification
and fermentation - SSF) hay phương pháp đồng đường hóa và đồng lên men (SSCF)

8
đường hóa và lên men đồng thời bởi nhiều giống vi sinh vật khác nhau. Phương pháp
này có nhiều đặc điểm giống SSF.
Hình 1.1 Quy trình sản xuất bioethanol [4].
1.2. Nguyên liệu lignocellulose
1.2.1. Khái niệm
Lignocellulose là nguyên liệu biomass phổ biến nhất trên trái đất. Lignocellulose
dùng trong sản xuất bioethanol có trong phế phẩm nông nghiệp, trong sản phẩm phụ
của công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy; có trong rác thải rắn của thành phố... Với
thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu to lớn cho việc
sản xuất bioethanol (bảng 1.2). Về cơ bản, trong lignocellulose, cellulose tạo thành
khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như
hemicellulose và kết dính như lignin. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần
nhau bằng liên kết cộng hóa trị [8]. Gỗ tràm bông vàng là một dạng vật liệu
lignocellulose.
Bioethanol
và đồng
sản phẩm
Đường
Cellulose
Thủy phân
Lên men
Lên men
Lên men
Thủy phân
Tiền xử lý
Chưng
cất
Tinh bột

9
Bảng 1.2. Thành phần của vài loại lignocellulose.
Nguồn Cellulose Xylose Mannose Galactose Arabinose Lignin
Chất
trích
ly
Gỗ vân
sam
41.9 6.1 14.3 - 1.2 27.1 9.6
Gỗ thông 37.7 4.6 7.0 - - 27.5 10.8
Gỗ bu lô 38.2 18.5 1.2 - - 22.8 4.8
Gỗ
dương
49.9 17.4 4.7 1.2 1.8 18.1 -
cây bắp 36.4 18.0 0.6 1.0 3.0 16.6 7.3
lúa mì 38.2 21.2 0.3 0.7 2.5 23.4 13
Theo Hetti Palonen [8].
1.2.2. Thành phần cấu trúc lignocellulose
1.2.2.1 Cellulose
Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi này được gắn lại với nhau
nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm. Các vi sợi
này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công
của ezyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân. Cellulose là một polymer
mạch thẳng của D-glucose ( hình 1.2 ), các D-glucose được liên kết với nhau bằng liên
kết β-1,4 glucoside [5]. Cellulose là loại polymer phổ biến nhất trên trái đất,độ trùng
hợp đạt được 3.500 – 10.000 DP [3] .
Hình 1.2. Công thức hóa học của cellulose

10
1.2.2.2 Hemicellulose
Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng
70 - 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường C6 gồm glucose, mannose, galactose và
đường C5 gồm xylose và arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-D
xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4) [5].
H nh 1.3. Các dạng cấu trúc của hemicellulose
1.2.2.3 Lignin
Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở (hình 1.4). Trong tự nhiên, lignin chủ
yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng
cellulose và hemicellulose, rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn [5].

11
Hình 1.4. Các đơn vị cơ bản của lignin
Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của
nó trong gỗ. Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin
có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringly lignin.
Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Nghiên cứu
chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu
đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin.
Do sự liên kết chặt chẽ của lignin với mạng cellulose và hemicellulose nên yêu
cầu cần một quá trình tiền xử lý nguyên liệu ban đầu để phá vỡ cấu trúc giữa lignin –
cacbohydrate giải phóng cellulose, giúp cho quá trình thủy phân bằng enzyme hay acid
diễn ra dễ dàng hơn.
1.3. Cây tràm bông vàng ở Việt Nam (Acacia auriculiformis)
1.3.1. Sơ lượt về cây tràm bông vàng
Gỗ tràm bông vàng là một dạng nguyên liệu lignocellulose . Tràm bông vàng có
danh pháp khoa học là Acacia auriculiformis là một loài cây thuộc họ Fabaceae chi
Keo (Acacia). Loài này trong tiếng Việt còn có tên gọi khác là keo lưỡi liềm, tên này
được sử dụng nhiều khi loài này mới nhập nội vào Việt Nam (thập kỷ 1960-1970), sau
này người ta sử dụng rộng rãi tên gọi keo lá tràm. Keo lá tràm được phân bố tự nhiên ở
vùng Indonesia và Papua New Guinea. Hiện tại được trồng rộng rãi tại nhiều Quốc gia
ở vùng nhiệt đới trong đó có Việt Nam.

12
H nh 1.5. Gỗ và cây tràm bông vàng
Tràm bông vàng được trồng rất nhiều trên khắp cả nước và là nguồn dăm gỗ, làm
giấy xuất khẩu hàng đầu của Việt Nam (hình 1.5). Từ năm 2011 đến nay, Việt Nam là
quốc gia xuất khẩu dăm gỗ lớn trên thế giới và có diện tích rừng trồng tăng từ 150,000
đến 200,000 hecta/năm. Hàm lượng cellulose trong tràm bông vàng cao, lên đến 42%
khối lượng với sợi cellulose dài và bền, nên được sử dụng làm nguyên liệu chế biến bột
giấy. Mỗi năm Việt Nam xuất khẩu dăm gỗ sang Nhật Bản, Trung Quốc và Đài Loan
để làm bột giấy lên đến gần 10 triệu tấn khô (Hình 1.6), trong đó chiếm 70% là gỗ tràm
bông vàng [19]. Để chế biến dăm gỗ, cây được vát bỏ cành, nhánh rồi bóc vỏ trước khi
băm thành những miếng gỗ dăm domino. Phần cành, nhánh, vỏ cây … là phụ phẩm của
quá trình sản xuất lâm nghiệm này, ước tính chiếm 20% khối lượng tổng thể của cá thể

13
cây. Phần phụ phẩm này được băm nghiền thành mùn cưa để bán làm chất đốt với giá
thành tương đối thấp nhưng vẫn còn lãng phí rất nhiều vì không sử dụng hết. Nguồn
lignocellulose này chính là nguyên liệu rất tiềm năng để chuyển hóa thành cồn sinh
học. Qua kết quả thống kê và thực tế, ước tính phụ phẩm mùn cưa gỗ tràm và gỗ xấu,
gỗ vụn tại Việt Nam hằng năm sẽ tối thiểu 36 tấn/hecta x 50,000 hecta/năm =
1,800,000 tấn/năm. Đây là một con số rất lớn nên được tận dụng để sản xuất ethanol.
Hình 1. 6. Nguồn cung dăm gỗ của Việt Nam và các nước trên thế giới.
1.3.2. Phương pháp sản xuất bioethanol từ gỗ tràm bông vàng
 Một số phương pháp lên men
Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử diễn ra trong cơ thể sinh
vật dưới tác động của hệ thống enzyme là quá trình oxy hóa sinh học. Có rất nhiều
phương pháp lên men để tạo bioethanol, bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose
thành ethanol là thủy phân và lên men có thể được thực hiện một cách độc lập (SHF),
đồng thời (SSF) hay đồng thời kết hợp nhiều chủng vi sinh vật (SSCF). Ưu, nhược
điềm của các phương pháp này được trình bày trong bảng 1.3.

14
Bảng 1.3. Ưu, nhược điểm của một số phương pháp lên men
TT
Phương
pháp lên
men
Ưu điểm Nhược điểm
1
Đường hóa
và lên men
riêng rẽ
(SHF)
Cả hai quá trình
đường hóa và lên
men được thực hiện
trong điều kiện tối ưu
của mỗi quá trình.
Tốc độ đường hóa bị ảnh hưởng mạnh bởi
sự ức chế sản phẩm cuối đối với enzyme.
Sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt
động của enzyme thủy phân cellulose làm
cho quá trình biến đổi kém hiệu quả và
gây tốn kém (phải bổ sung một lượng lớn
enzyme).
Dễ nhiễm các vi sinh vật khác do thời
gian ủ dài ở quá trình thủy phân.
2
Đường hóa
và lên men
đồng thời
(SSF)
Tăng tỷ lệ thủy phân
và giảm ức chế
ngược khi sản phẩm
tạo thành.
Giảm lượng enzyme
dùng cho quá trình.
Cho hiệu suất ethanol
cao.
Đòi hỏi điều kiện vô
trùng thấp.
Thời gian lên men
ngắn.
Nhiệt độ tối ưu cho enzyme thủy phân và
nấm men chuyển hóa đường thành
ethanol hoàn toàn khác nhau.
Cần phải lựa chọn được điều kiện nhiệt
độ và pH gắn với điều kiện tối ưu của mỗi
quá trình riêng.
Ethanol tạo thành sẽ quay lại ức chế
enzyme cellulose làm cho lượng ethanol
thu được không cao.
Cơ chế thủy phân không hoàn toàn nên
lượng glucose do enzyme cellulase tạo ra
chỉ đủ để cho nấm men tăng trưởng hơn là
việc lên men đường thành ethanol.

15
3
Đường hóa
và lên men
đồng thời
hexoses và
pentoses
bởi nhiều
giống vi
sinh vật
khác nhau
(SSCF)
Cải tiến của phương
pháp SSF.
Chi phí thấp.
Thời gian xử lý ngắn,
giảm nguy cơ ô
nhiễm và tác dụng ức
chế ít.
Hiệu suất lên men
bioethanol cao và lên
men cả đường 5 và 6
carbon.
Nhiệt độ của quá trình thủy phân enzyme
và lên men ethanol khác nhau đáng kể,
làm cho quá trình tối ưu hóa đồng thời hai
hoạt động rất khó.
Quá trình SSCF phải được vận hành ở
nhiệt độ thấp hơn để phù hợp tăng trưởng
của vi khuẩn và lên men ethanol.
[2].
Trong đề tài này sẽ sử dụng phương pháp SHF để thu bioethanol từ mùn cưa gỗ.
 Phương pháp đường hóa và lên men riêng rẽ (SHF):
Thuận lợi chính của SHF là cả hai quá trình đường hóa và lên men được thực hiện
trong điều kiện tối ưu của mỗi quá trình. Tuy nhiên sự tích tụ các chất ức chế cản trở
hoạt động của enzyme thủy phân cellulose và glucose. Điều này làm cho quá trình biến
đổi kém hiệu quả và gây tốn kém (phải bổ sung một lượng lớn enzyme). Dễ nhiễm các
vi sinh vật khác do thời gian ủ dài ở quá trình thủy phân.
Về nguyên tắc, quá trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellulose
cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm các bước cơ bản (hình 1.7):
- Xử lý thô bằng các phương pháp cơ học để loại bỏ bụi, đất, đá và làm giảm kích
thước.

16
- Tiền xử lý.
- Thủy phân cellulose (enzyme cellulase tấn công vào cellulose kết tinh để giải
phóng ra glucose).
- Lên men (chuyển hóa đường xylose và đường glucose thành ethanol).
Hình 1.7. Sơ đồ quy trình sản xuất bioethanol
1.3.2.1 Tiền xử lý
Tiền xử lý để chuyển hóa các carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong
lignocellulose thành ethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường
nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa. Tuy nhiên, bản chất
Tiền xử lý
Thủy phân
Lên men
Nguyên liệu
Ethanol

17
của cellulose lại là rất bền vững trước sự tấn công của enzyme, nên bước tiền xử lý là
bắt buộc để quá trình đường hóa glucose có thể diễn ra tốt. Cellulose ban đầu có thể bị
phá hủy bởi acid mà không cần được tiền xử lý. Tuy nhiên, trong đồ án này chỉ đề cập
đến việc thủy phân lignocellulose bằng enzyme.
Bảng 1.4. Các phương pháp tiền xử lý hiện nay
Các
phương
pháp
tiền
xử
lý
Tiền xử
lý hóa
học
Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng. Trong
đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất vì nó rẻ và
hiệu quả. Tuy nhiên, thiết bị phải chịu được ăn mòn cao và
lượng thạch cao (Na2SO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung
hòa acid với NaOH.
• Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan. Tuy nhiên,
nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hóa chất, thì vôi
tôi là hóa chất thích hợp.
• Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi
hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa
tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2,NH3
Tiền xử
lý cơ
học
Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ
năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi. Trong đó phương
pháp nổ hơi là phương pháp quan trọng nhất, đã được phát
triển, áp dụng trên quy mô pilot và được sử dụng trong đề tài
nghiên cứu này.
Tiền xử
lý nổ
hơi
Nổ hơi nước được phát triển vào năm 1925 bởi W. H. Mason
trong sản xuất gỗ ép [25]. Tiền xử lý biomass bằng nổ hơi
nước được giới thiệu từ năm 1980. Công ty Iotech Corporation
đã tiến hành một vài thí nghiệm tiên phong để tìm hiểu ảnh
hưởng của nổ hơi nước lên gỗ cây dương [25].

18
Mục đích của quá trình tiền xử lý lignocellulose là để làm tăng khả năng xâm
nhập của enzyme vào cấu trúc nguyên liệu lignocellulose với chi phí xử lý phù hợp.
Qua quá trình tiền xử lý làm giảm hàm lượng lignin, tăng diện tích bề mặt và mức độ
cấu trúc vô định hình của nguyên liệu lignocellulose, làm tăng tốc độ thủy phân của
enzyme vào cấu trúc cellulose và làm tăng hàm lượng đường [10].
1.3.2.2 Thủy phân
 Quá trình thủy phân
Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các
đường đơn. Ở đây, ta quan tâm nhiều đến sự thủy phân cellulose, do nó là thành phần
chính trong sinh khối lignocellulose. Phương trình PT1 phản ứng tổng quát :
(PT1)
Quá trình thủy phân cellulose được thực hiện bởi axit thủy phân hoặc enzyme
thủy phân.
Thủy phân bằng acid: vào cuối thế kỉ XIX và đầu thế kỉ XX, quá trình thủy phân
được thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với acid. Acid loãng được sử dụng dưới
điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp
và áp suất khí quyển. Quá trình thủy phân bằng acid loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ
và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến
quá trình lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và
các hợp chất vô cơ [11].
Thủy phân bằng enzyme: Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các
phân tử đường glucose riêng lẻ bằng enzyme cellulase. Enzyme cellulase là một phức
hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-

19
glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose. Nguồn thu enzyme cellulase lớn
nhất hiện nay là vi sinh vật (nấm, vi khuẩn). Nhiều loài nấm như Trichoderma,
Penicillium, Aspergillus, và T. Emersonii có thể sản sinh ra một số lượng lớn cellulase
và hemicellulase ngoại bào. Vật liệu lignocellulose bị thủy phân bằng enzyme ở điều
kiện ôn hòa (50°C và pH ~ 5), cho phép phân cắt cellulose và hemicellulose một cách
hiệu quả mà không hình thành nên các sản phẩm phụ có thể ức chế hoạt động của
enzyme [11].
 Cellulase
 Khái niệm
Cellulase là hệ enzyme có thể sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hay vi sinh vật đơn
bào và có khả năng thủy phân cellulose và hemicellulose.
 Cơ chế xúc tác enzyme
Cơ chế xúc tác enzyme thường trải qua 3 giai đoạn theo phương trình PT2:
E + S ES P + E (PT2)
Trong đó: E là enzyme, S là cơ chất, ES là phức hợp enzyme – cơ chất, P là sản
phẩm.
Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức
hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng
lượng hoạt hóa thấp.
Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các
liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng dạng tự do.
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là tương
tác tĩnh điện, liên kết hydro và liên kết Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những
điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.

20
 Phản ứng thủy phân cellulose
Cellulose là có cấu trúc rất bền vững và khó bị phá vỡ vì cellulose có độ kết tinh
cao, không tan trong nước, có khả năng chống lại các quá trình đề polymer hóa. Quá
trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng cùng một
lúc của 3 enzyme khác nhau:
“Endo-1,4,β-D-glucanases” (EG) hay 1,2-β-D-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4),
enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả tan và không tan.
“Exo-1,4-β-D-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4),
enzyme này có tác dụng giải phóng D – glucose từ 1,4-β-D-glucancellobiohydrolase
(EC 3.2.1.91, enzyme này có giải phóng cellobiose từ 1,4-β-glucan.
“β-D-glucosidase” hay còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có
tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng như các oligomer của
glucose.
Quá trình thủy phân nguyên liệu lignocellulose trong tự nhiên rất chậm, bởi vì
cấu trúc vững chắc của cellulose. Vì vậy cần qua quá trình tiền xử lý nguyên liệu bằng
phương pháp vật lý, hóa học hay sinh học để nâng cao khả năng xâm nhập của enzyme
vào cấu trúc cellulose, làm tăng tốc độ thủy phân và đạt được nồng độ đường glucose
và xylose cao. Quá trình thủy phân bằng enzyme được chia thành 3 giai đoạn:
Enzyme endo – cellulase tấn công ngẫu nhiên vào mạch cellulose nhờ tạo liên kết
bằng tương tác giữa CBD với cellulose tạo thành oligosaccharide.
Enzyme exo – cellulase tấn công vào cellulose và cả oligomer từ đầu đường khử
và không khử thông qua tương tác của CBD với cellulose tạo thành cellobiose và
glucose.
β – glucoside tấn công cellobiose và oligosaccharide tạo glucose.

21
1.3.2.3 Lên men
Lý thuyết quá trình lên men đã được nhiều nhà sinh học nghiên cứu từ rất lâu.
Năm 1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy khi lên men,
đường không chỉ tạo thành ethanol và CO2 mà còn tạo ra acid acetic.
Năm 1810, Gay-Lussac nhận thấy rằng cứ 45 phần khối lượng đường sẽ chuyển
thành 23 phần ethanol và 22 phần khí carbonic. Trên cơ sở đó ông đưa ra phương trình
tổng quát như phương trình 3:
(PT3)
Năm 1857, Louis Pasteur tiếp tục nghiên cứu và thu nhận kết quả sau: cứ 100
phần đường saccharose khi lên men sẽ tạo ra 51,1 phần ethanol, 48,4 phần CO2, 32,0
phần glycerin, 0,7 phần acid succinic và hai phần các sản phẩm khác. Từ đó suy ra cứ
45 phần khối lượng glucose khi lên men sẽ tạo ra 21,8 phần ethanol chứ không phải 23
phần như Gay-Lussac đã tính. Tuy nhiên phương trình lên men do Gay-Lussac đưa ra
vẫn đúng và dùng làm cơ sở lý thuyết để tính hiệu suất thu hồi rượu theo lý thuyết.
Gay-Lussac còn kết luận sự lên men là quá trình sinh học có liên hệ mật thiết đến sự
hoạt động của tế bào nấm men.
Vào khoảng 1871-1872 Manaxemi đem nghiền tế bào nấm men với cát thạch anh
rồi mới cho vào lên men dịch đường thì hiện tượng lên men vẫn xảy ra. Năm 1879,
Buchuer tiến hành nghiền nát tế bào nấm men rồi chiết lấy dịch trong không chứa xác
nấm men rồi cho vào dịch đường thì thấy dịch chiết vẫn có khả năng lên men. Từ đó
người ta gọi các chất trong dịch tế bào nấm men là zymase. Đây chính là hợp chất của
nhiều enzyme cùng tham gia chuyển hóa đường thành ethanol và khí carbonic [25].

22
Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử. Quá trình oxy hóa này
lại xảy ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme, cho nên người ta
gọi quá trình lên men là quá trình oxy hóa sinh học.
Quá trình đường phân thể hiện một cách chi tiết được minh họa như hình 1.8.
Hình 1.8. Sơ đồ đường phân

23
Sự tạo thành bioethanol từ glucose phải trải qua nhiều giai đoạn, sơ đồ hình thành
bioethanol từ glucose thể hiện ở hình 1.9.
Hình 1.9. Sự tạo thành ethanol từ glucose
- Giai đoạn 1 (giai đoạn đường phân): Phân tử đường glucose trải qua một loạt
phản ứng phức tạp dưới xúc tác của một loạt hệ thống enzyme, phân tử glucose
ban đầu được chuyển hóa thành 2 phân tử acid pyruvic (CH3 – CO – COOH).
- Giai đoạn 2: Acid pyruvic bị decacboxyl để tạo thành acetaldehyde
- Giai đoạn 3: Acetaldehyde bị khử bởi NAD.H2 tạo thành ethanol.
Nấm men thường được dùng là S.cerevisiae là loại vi sinh vật phổ biến được sử
dụng trong quá trình lên men truyền thống ở quy mô công nghiệp để sản xuất ethanol
từ đường sucrose, bột và cellulose. Nấm men S.cerevisiae được công nhận là loại nấm
men an toàn và có thể lên men hiệu quả các loại đường hexose, D – glucose, D –
mannose, D – galactose và các disaccharide như: sucrose và mantose và nồng độ
ethanol đạt 20 % (v/v) [6]. Hơn nữa, nấm men S.cerevisiae có khả năng chịu đựng
tương đối tốt dưới sự tác động của chất ức chế có nguồn gốc từ sự phân hủy các hợp
chất trong lignocellulose. Điểm bất lợi chính trong việc sử dụng nấm men S.cerevisiae
là không có khả năng lên men đường pentose (D – xylose và L – arabinose).
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
Tình hình trên thế giới, công nghệ sản xuất ethanol sinh học đã được nghiên cứu
và ứng dụng thành công ở nhiều Quốc gia, trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, nguyên

24
liệu phục vụ cho công nghệ sản xuất ethanol sinh học chủ yếu từ các cây lương thực,
rơm rạ. Đối với Việt Nam vấn đề này vẫn còn rất mới mẻ và đang thu hút sự quan tâm
của nhiều nhà khoa học.
Năm 1995, Sun đã nghiên cứu điều kiện tối ưu để tiền xử lý rơm lúa mì là 1,5 %
NaOH, trong 144 giờ ở 20o
C, kết quả thu được lượng lignin tác ra đạt 60 % và lượng
hemicellulose tách ra đạt 80 % [16].
Năm 2007, Aizawa của trường Đại học Tokai Nhật Bản đã công bố kết quả
nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học của Nhật Bản do Tokyo Fisheries Promotion
Foundation đầu tư trên tạp chí Oceans 2007. Dự án sản xuất ethanol từ rong biển
Sargassum horneri là một loại rong nâu, có hàm lượng carbohydratee 5,8 %, kết quả
thu được 29,6 kg ethanol hoặc 38 lít ethanol trên 1 tấn rong tươi có độ ẩm 90 % [30].
Năm 2008, Zhao và các đồng nghiệp cho thấy tính hiệu quả khi dụng NaOH là
chất tiền xử lý hiệu quả đối với các nguyên liệu có hàm lượng lignin nhỏ hơn 26 % như
rơm, lúa mì và gỗ cứng [14].
Năm 2009, Rishi Gupta và các cộng sự đã nghiên cứu sử dụng Saccharomyces
cerevisiae và Pichia stipites để chuyển hóa gỗ loài Prosopis juliflora thành bioethanol
bằng phương pháp SHF với thủy phân bằng H2SO4 3 %, pH tối ưu giai đoạn lên men là
5,0 cho ra hàm lượng ethanol thu được đạt 7,13 g/L [33].
Năm 2009, Sorahi Abedinifar và các cộng sự nghiên cứu dùng Mucor indicus and
Rhizopus oryzae để tạo ethanol từ các nguyên liệu rơm rạ bằng phương pháp SHF, với
quá trình thủy phân ở 45 °C và pH 5,0. Tỷ lệ mẫu nguyên liệu với lượng nước bổ sung
ảnh hưởng tương đối tới hiệu suất len men. Tuy nhiên, R. oryzae tạo ra axit lactic là sản
phẩm phụ của quá trình này [34].
Năm 2009, Parveen Kumar đã nghiên cứu tiền xử lý gỗ cứng bằng NaOH giúp
tăng khả năng thủy phân từ 14 % lên 55 % bằng việc loại bỏ hàm lượng lignin từ (24 –
55) % xuống còn 20 % [13]. Nói chung, ở nồng độ NaOH cao làm tăng khả năng loại

25
bỏ lignin, mặc dù ở nồng độ NaOH (6 – 20) % (w/w) làm hòa tan cellulose và giảm
khả năng loại bỏ lignin [9].
Năm 2011, Lincai Peng đã nghiên cứu công nghệ chuyển đổi bùn giấy thành
ethanol bằng quá trình thủy phân và lên men riêng biệt (SHF) sử dụng Saccharomyces
cerevisiae. Thời gian tối ưu của quá trình thủy phân là 82,7 giờ, tỷ lệ chuyển đổi đường
thành ethanol là 34,2 % và sản lượng ethanol tạo thành là 190 g/kg bùn giấy khô, tương
ứng với năng suất chuyển đổi tổng thể 56,3 % Carbohydrate ban đầu [31].
Năm 2013, Mathiyazhakan Kuttiraja chuyển hóa nguồn tre phế phẩm thành
ethanol. Pha loãng mẫu trước xử lý có hiệu quả với 63.1 % cellulose thu được. Hiệu
suất xử lý 43 %, khả năng tạo ra 143 lít ethanol/tấn tre[29].
Năm 2014, Raveendran Sindhu và các cộng sự đã nghiên cứu tạo bioethanol từ
tre nứa Ấn Độ bằng phương pháp SHF. Đây là báo cáo đầu tiên được công bố về tạo
bioethanol từ tre nứa Ấn Độ. Năng suất đường tối đa là 0.651 g/sinh khối, ethanol được
tạo ra với hiệu quả lên men là 41,72 % [32].
Các nghiên cứu trong nước hiện nay cũng đã và đang quan tâm sản xuất ethanol
nhiên liệu sinh học thế hệ II từ sinh khối (phế thải). Theo hướng này, đã có một số
công trình, nhưng trong quá trình thực hiện đang còn gặp những khó khăn rất lớn. Về
nghiên cứu sử dụng nguồn phế thải nông nghiệp thành nhiên liệu sinh học theo 2
hướng: - Sử dụng nguồn phế thải để sản xuất ethanol sinh học - Sử dụng nguồn phế
thải để sản xuất diesel - sinh học. Theo hướng sử dụng nguồn phế thải nông, lâm
nghiệp để sản xuất ethanol sinh học đã có một số đề tài, công trình sau:
Ethanol sinh học được sản xuất bằng phương pháp lên men và chưng cất từ các
loại ngũ cốc chứa tinh bột (bắp) và đường (mía). Ngoài ra, ethanol có thể được sản
xuất từ lignocellulose, từ những phụ phẩm có chứa hợp chất cellulose cao.
Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới. Chính vì vậy, sản xuất
ethanol từ biomass cụ thể là lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp là một giải pháp
thích hợp trong bối cảnh giá nhiên liệu tăng cao, ô nhiễm môi trường ngày càng trầm

26
trọng và vấn đề an ninh lượng thực… lại càng được chú ý và tiếp tục nghiên cứu hoàn
thiên trên thế giới [21].
“Sản xuất ethanol sinh học từ phế thải nông nghiệp”, Chủ nhiệm đề tài PGS. TS
Vũ Nguyên Thành, Viện Công nghiệp thực phẩm, Bộ Bông Thương, (2009-2011).
“Nghiên cứu công nghệ hiện đại để sản xuất ethanol nhiên liệu từ gỗ phế liệu
nguyên liệu giấy”, Thuộc Đề án thuộc Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm
2015, tầm nhìn đến năm 2025 của Bộ Bông Thương. Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Doãn
Thái Hòa, ĐHBK Hà Nội. (2009 - 2010).
Năm 2009, Trần Diệu Lý với đề tài “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ
rơm rạ. Đã kết luận dùng enzyme để thủy phân phế thải để tạo đường tan nhìn chung
đạt hiệu quả thấp, chưa tìm được enzyme thích hợp cho hiệu suất cao.
Năm 2009, Nguyễn Thị Hẳng Nga với đề tài “ Nghiên cứu khả năng sản xuất
ethanol từ phụ phẩm nông nghiệp ” đã kết luận: hiệu suất chuyển hóa của quá trình
đường khử từ 70 - 75 % đối với dịch lên men có hàm lượng đường khử từ 3,0 - 5,0 g/L.
Hàm lượng ethanol không cao từ 1,9 - 4,2 % v/v nhưng cũng chứng tỏ là than cây ngô
là nguyên liệu tiềm năng sản xuất bioethanol [22].
Năm 2013, Võ Thị Thúy Huệ đã nghiên cứu “ sản xuất ethanol sinh học từ vỏ
cacao”, quá trình tiền xử lý với HCL 1M ở 100 o
C trong 4 giờ thu hồi được 21,93 %
lượng đường khử, quá trình lên men đạt hiệu quả cao từ 28-30 o
C, thời gian lên men 72
giờ [18].
Năm 2013, Võ Thị Thanh Kiều đã nghiên cứu sản xuất bioethanol từ rong biển
thu được 20,92 g/L cồn, hiệu suất chuyển hóa đạt 90 % [20].

27
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đồ án được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH
Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh trong thời gian từ 03/04/2017 đến
16/07/2017.
2.2. Nguyên vật liệu
2.2.1 Mùn cưa từ gỗ cây tràm bông vàng
Nguyên liệu được sử dụng trong đồ án này là loại mùn cưa gỗ của cây tràm bông
vàng được lấy từ nhà máy sản xuất dăm gỗ và viên gỗ nén tỉnh Bình Dương. Đây là
loại mùn cưa thương mại được nhà sản xuất dùng máy nghiền từ hỗn hợp cành, nhánh,
dăm vụn để trồng nấm và làm chất đốt với giá thành rẽ từ 200.000 đồng/tấn tươi (độ
ẩm 40%).
Hình 2.1. Mùn cưa gỗ tràm bông vàng
2.2.2. Acremonium cellulase
Acremonium cellulase được cung cấp bởi Meiji Seika Co, (Japan) với các thông
số bao gồm:
- Nhiệt độ hoạt động tối ưu : (45 – 50)°C
- PH hoạt động tối ưu : 4,8.

28
- Là enzyme chuyên dùng để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều cellulose
thuộc nhóm cellulase.
2.2.3. Saccharomyces cerevisiae
- Chủng nấm men Ethanol RedTM
(Dry yeast, S.cerevisiae, Ementics, France).
- Mật độ tế bào nấm men 109
cfu/ml.
2.2.4. Hóa chất sử dụng
Các hóa chất sử dụng được liệt kê trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng
Tên hóa chất
Xuất xứ
(nguồn gốc)
Mục đích sử dụng
NaOH Trung Quốc
Tiền xử lý
Trung hòa
H2SO4 Trung Quốc
Phá mẫu
Tiền xử lý
Làm blank UV-Vis
Nước đề ion
Sản xuất từ máy
Themo – Stat.
Pha động HPLC
Nước cất
Sản xuất từ máy
cất nước 2 lần
Pha mẫu
Tạo môi trường
HCl Trung Quốc Trung hòa
Peptone Việt Nam Môi trường SDB
Glucose Sigma Aldrich Dựng đường chuẩn
Glucose Trung Quốc
Môi trường SDA
Môi trường SDB
Xylose Sigma Aldrich Dựng đường chuẩn
Dextrose Agar Việt Nam Môi trường SDA
Ethanol Sigma Aldrich Dựng đường chuẩn

29
Thành phần môi trường hoạt hóa và nhân giống nấm men Sabouraud Dextrose
Broth. (SDB):
o D – Glucose: 20 g
o Peptone: 10 g
o Nước cất: 1000 mL.
Thành phần Môi trường nuôi cấy nấm men Sabouraud Dextrose Agar (SDA):
o D – Glucose: 40 g
o Peptone: 10 g
o Agar: 20 g
o Nước cất: 1000 mL
2.3. Các thiết bị sử dụng
Tất cả các thiết bị sử dụng được đặt tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học
và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh.
- Máy lắc ngang HY-4A, Trung Quốc.
- Máy đo độ pH Schott Lab850 của hảng SI Analytics, Đức.
- Bếp khấy từ gia nhiệt C-MAG HS 7 của hãng IKA, Đức.
- Cân điện tử TE 612 của hãng Sartorius, Đức.
- Cân phân tích PA 214 của hãng Ohaus, Mỹ.
- Kính hiển vi điện tử MT4200H của hãng Meiji, Nhật Bản.
- Hệ thống bơm hút chân không Gast, Mỹ.
- Lò nung nhiệt độ cao của hãng Nabertherm, Đức.
- Tủ sấy HN101-1A, Trung Quốc.
- Tủ ủ của hãng Memmert, Đức.
- Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2.
- Nồi hấp tiệt trùng tự động của hãng ALP, Nhật Bản.
- Máy ly tâm lạnh Z32HK của hãng Hermle, Đức.

30
 Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC -Liquid Chromatography High
Performance) của hãng Shimadzu, Nhật Bản.
Gồm các bộ phận:
- Đầu dò RID – 10A
- Bơm cao áp LC – 20AD
- Bộ phận tách khí DGU – 20 A3
- Bộ phận lò cột CTO – 20A
- Cột sử dụng phân tích là SUGAR SH101, H312039., kích thước cột:
8mmID×300mmL.
- Bộ xử lý và máy in C – R8A
Hình 2.2. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).
 Thiết bị máy đo quang phổ UV-VIS-NIR V770 của hãng Jasco, Nhật Bản bao
gồm các bộ phận:
- Hệ thống quang học đơn sắc: Hệ Czerny – Turner, 2 chùm tia sáng.
- Cách tử: Halographic, 27,5x35mm, 1.200 vạch/ mm, góc tia sáng 8,6° tại
bước sóng 240 mm.
- Dải bước sóng: 180 – 1100 nm.
- Giới hạn độ phân giải: < = 1,5 nm.
- Khe sáng: 1,5 nm.

31
- Đầu dò: 02 đầu dò Silicon Photodiode.
- Cuvette thạch anh 10 mm, 2 cái.
- Ngõ giao tiếp với máy tính.
2.4. Bố trí thí nghiệm
Trên thực tế ngày nay đã có nghiên cứu lên men và thủy phân đồng thời một số
loại nguyên liệu tương tự, tuy nhiên nghiên cứu này muốn sử dụng thủy phân và lên
men không đồng thời (SHF) với một nguyên liệu mới đó là tràm bông vàng.

32
2.4.1. Sơ đồ quy trình
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

33
2.4.2. Trình tự và Bố trí thí nghiệm
2.4.2.1 Thí nghiệm khảo một số đặc điểm của nấm men
Tiến hành giữ giống trên môi trường SDA và nhân giống trên môi trường SDB.
Đánh giá kết quả đường cong tăng trưởng dựa trên mật độ nấm men.
Thí nghiệm với loại nấm men là S.cerevisiae đo giá trị OD610. Tiến hành nhân
giống sau đó bổ sung vào môi trường SDB. Quan sát nấm men vi thể và đại thể. Xác
định mật độ tế bào nấm men theo thời gian từ 0 h đến 48 h, gồm : 0 h; 2 h; 4 h; 6 h; 8h;
10 h; 12 h; 14 h; 16 h; 18 h; 20 h; 22 h; 24 h; 26 h; 28 h; 30 h; 32 h; 34 h; 36 h; 38 h;
40 h; 42 h; 44 h; 46 h; 48 h.
2.4.2.2 Thí nghiệm khảo sát kích thước nguyên liệu
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước hạt thích hợp
STT cỡ hạt (mm) Lượng mẫu
(g)
Thể tích
NaOH
Thời gian
(h)
1 1.5 5 50 24
2 1 5 50 24
3 0.425 5 50 24
4 0.325 5 50 24
5 0.16 5 50 24
Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu
đến hiệu quả của quá trình tiền xử lý
Thực hiện các thí nghiệm với tác nhân cho các cỡ hạt khác nhau ở cùng
nhiệt độ phòng (30 o
C) và trong cùng 1 khoảng thời gian như nhau là 24 giờ.
Đánh giá kết quả thí nghiệm thông qua hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu nguyên
liệu ban đầu

34
Nội dung các thí nghiệm được trình bày trong bảng 2.2.
2.4.2.3 Thí nghiệm tiền xử lý
- Mùn cưa từ tràm bông vàng được lấy từ nhà máy ở Bình Dương rây bằng rây có
kích thước 1,5 mm để loại những hạt to không đồng nhất làm nguyên liệu để thực hiện
tiền xử lý. Thực hiện quá trình tiền xử lý bằng cả hai phương pháp là tiền xử lý bằng
acid H2SO4 và tiền xử lý bằng NaOH ở các nồng độ khác nhau để lựa chọn tác nhân
tiền xử lý thích hợp.
Tối ưu hóa các thông số tiền xử lý cho mẫu gỗ tràm bông vàng:
- Kích thước nguyên liệu
- Nồng độ tác nhân tiền xử lý
- Thời gian tiền xử lý
- Tỉ lệ khối lượng giữa nguyên liệu và dung dịch tác nhân tiền xử lý
 Thí nghiệm lựa chọn tác nhân tiền xử lý thích hợp
Mục đích là để lựa chọn ra tác nhân tiền xử lý thích hợp cho loại mùn cưa gỗ cây
tràm bông vàng.
Thực hiện các thí nghiệm với cả 2 tác nhân tiền xử lý là acid H2SO4 và NaOH với
các nồng độ khác nhau ở cùng nhiệt độ phòng (30 o
C) và trong cùng 1 khoảng thời gian
như nhau là 24 giờ
Đánh giá kết quả thí nghiệm thông qua các thông số sau đây:
o Hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu nguyên liệu ban đầu
o Nồng độ đường glucose trong dung dịch sau khi tiền xử lý
o Nồng độ đường xylose trong dung dịch sau khi tiền xử lý

35
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm lựa chọn tác nhân tiền xử lý
STT
Khối lượng
mẫu (g)
Nồng độ
H2SO4
Thể tích
dd sử dụng
Mẫu tiền xử lý
bằng
1 5 1 50
2 5 2 50
3 5 3 50
4 5 4 50
5 5 5 50
6 5 7 50
7 5 10 50
Mẫu tiền xử lý
bằng
8 5 1 50
9 5 2 50
10 5 3 50
11 5 4 50
12 5 5 50
13 5 10 50
14 5 15 50
15 5 20 50
16 5 25 50
 Thí nghiệm khảo sát thời gian tiền xử lý
Xác định khoảng thời gian thích hợp cho quá trình tiền xử lý.
Thực hiện các thí nghiệm với tác nhân NaOH ở nồng độ xác định 4% với các thời
gian khác nhau

36
liệu ban đầu.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian tiền xử lý
STT
Lượng cân
mẫu
(g)
Thể tích
NaOH 4%
(ml)
Thời gian
(h)
1 5 50 0
2 5 50 1
3 5 50 2
4 5 50 3
5 5 50 6
6 5 50 12
7 5 50 18
8 5 50 24
9 5 50 36
10 5 50 48
11 5 50 72
 Thí nghiệm khảo sát tỉ lệ bã rắn / dung dịch
Xác định tỉ lệ khối lượng bã rắn / dung dịch thích hợp.
Thực hiện các thí nghiệm với tác nhân NaOH ở nồng độ xác định ở thí nghiệm
lựa chọn tác nhân tiền xử lý và thời gian xác định là 24 giờ trong khi thay đỏi tỉ khối
lượng lệ bã rắn / dung dịch.
liệu ban đầu.

37
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ bã/dung dịch
STT
lượng cân
mẫu
(g)
Thể tích
NaOH 4%
(ml)
Thời gian
(h)
1 5 50 24
2 5 75 24
3 5 100 24
4 5 150 24
5 5 200 24
6 5 50 36
8 5 75 36
9 5 100 36
10 5 150 36
11 5 200 36
2.4.2.4 Thí nghiệm thủy phân
 Thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân
Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH, thí nghiệm được tiến hành
mẫu được lấy trong khoảng thời gian từ 0-72 h, cứ 6 giờ lấy 3 mẫu ra và đem đo bằng
máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành theo thời gian.
Các thông số của mẫu bao gồm:
- Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1 / 10
- nồng độ enzyme 5%
- 50 o
C
- pH 5,0
- Tốc độ lắc 120 vòng / phút.

38
 Thí nghiệm khảo sát pH thủy phân
Thí nghiệm được làm trên cơ sở kết quả của khảo xác thời gian, khảo sát pH ở
các mốc 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần lấy mẫu sau 24 giờ thủy
phân, tiến hành đo bằng máy HPLC. Các thông số của mẫu bao gồm:
- Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1/10
- Tỉ lệ enzyme bổ sung 5 %
- Thời gian thủy phân 24 giờ
- Tốc độ lắc 120 vòng/ phút
 Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thủy phân
Thí nghiệm khảo sát ở 4 mốc nhiệt độ là 45 o
C, 50 o
C, 55 o
C, 60 o
C, các ngiệm
thức lặp lại 3 lần lấy mẫu sau thủy phân 24h, đo mẫu bằng HPLC.
Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ enzyme 5%, pH 5,0. Tỉ lệ bã /dịch lên
men là 1/10. Mẫu lên men được đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng / phút.
 Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ enzyme bổ sung
Tỉ lệ enzyme bổ sung so với thể tích khảo sát ở các tỷ lệ 1%; 3%; 5%; 7%; 9%.
Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần lấy mẫu sau 24 giờ thủy phân, tiến hành đo bằng máy
HPLC. Các thông số của mẫu bao gồm:
- PH tối ưu ở thí nghiệm khảo sát pH.
- Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1/10
- Thời gian thủy phân 24 giờ
- Nhiệt độ tối ưu xác định ở thí nghiệm khảo sát nhiệt độ
2.4.2.5 Thí nghiệm lên men
 Thí nghiệm khảo sát thời gian lên men
Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH và thủy phân ở các điều kiện
tối ưu , thí nghiệm được tiến hành mẫu được lấy trong khoảng thời gian từ 0-72 h, cứ 6

39
giờ lấy 3 mẫu ra và đo bằng máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và
ethanol tạo thành theo thời gian. Các thông số của mẫu bao gồm:
- Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1/ 10.
- Tỷ lệ enzyme bổ sung 5%.
- Nhiệt độ thủy phân 50 o
C.
- pH 5,0.
- Tốc độ lắc 120 vòng /phút.
- Tỷ lệ Saccharomyces cerevisiae 5%.
- CSL 1%.
- Nhiệt độ lên men là 35 o
C.
 Thí nghiệm khảo sát pH lên men
tối ưu, thí nghiệm được tiến hành mẫu ở pH: 4,5; 5,0; 5.5; 6,0. Mỗi nghiệm thức 3 lần
lặp lại sau đó đo bằng máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol
tạo thành theo thời gian. Các thông số của mẫu bao gồm:
- Tỉ lệ bã / dịch lên men là 1/10.
- Tỉ lệ enzyme bổ sung 5%.
- Tỉ lệ nấm men bổ sung 5% mỗi loại.
- Tỉ lệ chất dinh dưỡng bổ sung CSL 1%.
- Thời gian lên men 48 giờ.
- Nhiệt độ lên men (32,5 o
C).
 Thí nghiệm khảo xác nhiệt độ lên men
tối ưu, thí nghiệm được tiến hành với:
- Tỷ lệ enzyme 5%
- Tỷ lệ Saccharomyces cerevisiae 5%

40
- CSL 1%
- pH 5,0.
Các giá trị nhiệt độ khảo sát gồm 30o
C; 32,5o
C; 35o
C; 37,5o
C và 40o
C. Mẫu lên
men được đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút và đo sau 48 giờ bằng máy HPLC
để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành ở những điều kiện nhiệt độ
được khảo sát.
 Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ Saccharomyces cerevisiae bổ sung khi lên men
Sau khi tiền xử lý với tác nhân thích hợp là NaOH và thủy phân ở các điều kiện tối
ưu, thí nghiệm được tiến hành với:
- enzyme 5%.
- CSL 1%.
- Nhiệt độ là 35o
C.
- pH là 5,0.
Tỉ lệ thể tích dịch nấm men/ thể tích dung dịch được khảo sát gồm 1%; 3%; 5%;
7%; 9%. Mẫu lên men được đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng /phút và đo sau 48
giờ bằng máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành ở
những nồng độ nấm men được khảo sát.
 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của CSL( bột bắp) đối với quá trình lên men
tối ưu, thí nghiệm được tiến hành với:
- Tỷ lệ enzyme 5 %.
- Tỷ lệ Saccharomyces cerevisiae 5 %.
- Nhiệt độ 350
C.
- pH 5,0.
Các chất dinh dưỡng bổ sung cần khảo sát gồm CSL 1 %; CSL 5 %; CSL 10 %;
peptone 1 %; peptone 3 %; peptone 5 %; hỗn hợp K2HPO4 (3 g/L) và MgSO4 (2,5 g/L).
Mẫu lên men được đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng /phút và đo sau 48 giờ bằng

41
máy HPLC để xác định hàm lượng glucose, xylose và ethanol tạo thành ở những thành
phần chất dinh dưỡng khác nhau.
2.5. Các phƣơng pháp phân tích
2.5.1. Phương pháp phân tích hàm lượng ẩm
Phương pháp xác định độ ẩm trong mẫu nguyên liệu là biomass dựa trên qui trình
của NREL - National Renewable Energy Laboratory, phòng thí nghiệm năng lượng
quốc gia Hoa Kỳ [20].
Trình tự các bước thực hiện thí nghiệm như sau:
- Đặt cốc sấy trong tủ sấy đối lưu ở trong ít nhất 4 giờ. Sau đó
mang cốc bỏ vào bình hút ẩm và để nguội (sử dụng găng tay hoặc kẹp để
di chuyển cốc). Cân chính xác khối lượng cốc đến 0,1 mg.
- Cho một lượng mẫu xác định vào trong cốc, cân và ghi lại chính xác khối
lượng mẫu đến 0,1 mg sau đó dùng bút đánh dấu mẫu. Lặp lại ít nhất 2
lần đối với từng mẫu.
- Đặt cốc đã chứa mẫu vào trong tủ sấy đối lưu ở ít nhất 4
giờ. Sau khi sấy xong, chuyển cốc từ tủ sấy sang bình hút ẩm và để nguội
đến nhiệt độ phòng. Cân và ghi lại cốc chứa mẫu chính xác đến 0,1 mg.
- Đặt cốc vào trở lại tủ sấy đối lưu ở 105 ± 3ºC và sấy đến khi khối lượng
không đổi. Khối lượng cốc và mẫu được xác định là không đổi khi sự
thay đổi khối lượng cốc và mẫu ít hơn 0,1 % khối lượng mẫu khô ban
đầu trong vòng 1 giờ.
Tính toán % ẩm:

42
2.5.2. Phương pháp phân tích thành phần cellulose, lignocellulose, lignin và hàm
lượng tro trong nguyên liệu biomass
Phương pháp xác định các thành phần carbohydrate, lignin và tro trong mẫu
nguyên liệu là biomass dựa trên qui trình của NREL - National Renewable Energy
Laboratory, phòng thí nghiệm năng lượng quốc gia Hoa Kỳ[1].
Trình tự các bước thực hiện thí nghiệm như sau:
 Chuẩn bị mẫu phân tích
- Nung cốc crucible trong lò nung ở ít nhất 4 giờ, sau đó
chuyển cốc trực tiếp từ lò nung sang bình hút ẩm và để nguội trong 1
khoảng thời gian xác định (khuyến nghị là 1 giờ). Cân chính xác cốc
crucible đến 0,1 mg và ghi lại giá trị ( .
- Đặt lại cốc crucible vào lò nung ở và nung cốc cho đến khi
khối lượng không đổi. Giá trị khối lượng được xác định là không đổi khi
biến thiên khối lượng đạt giá trị dưới 0,3 mg trong một giờ.
- Cân mẫu phân tích cho vào trong ống nghiệm. Ghi lại
chính xác giá trị cân mẫu đến 0,1 mg sau đó đánh dấu lại mẫu.
Thêm vào (hoặc ) acid sunfuric 72 % vào
mỗi ống nghiệm chứa mẫu, sử dụng cá từ để khuấy cho hỗn hợp đồng đều.
- Đặt các ống nghiệm chứa mẫu phân tích vào bể ổn nhiệt ở trong
1 giờ. Khấy mẫu bằng cá từ sau mỗi 5 hoặc 10 phút.
- Sau khi kết thúc sự thủy phân trong 60 phút, lấy các ống nghiệm ra khỏi bể
ổn nhiệt. Pha loãng nồng độ acid trong ống nghiệm xuống 4 % bằng cách
cho thêm nước đề ion bằng cách sử dụng burette.
- Đặt ống nghiệm vào trong nồi hấp và hấp ở121o
C trong 1h, sau khi hấp
xong để nồi hấp nguội từ từ về nhiệt độ phòng trước khi lấy mẫu ra khỏi nồi.

43
 Phân tích mẫu xác định hàm lượng lignin không hòa tan trong acid
- Lọc chân không dung dịch thủy phân thu được sau khi hấp bằng cốc đã
được chuẩn bị trước đó.
- Chuyển xấp xỉ 50 mL dịch cái vào một cái bình giữ mẫu, mẫu này được
dùng để xác định thành phần lignin hòa tan trong acid cũng như là thành
phần carbohydrate. Lưu ý rằng thành phần lignin hòa tan trong acid phải
được thực hiện trong vòng 6 giờ sau khi thủy phân. Nếu phải lưu mẫu lại thì
nên để trong tủ đông trong vòng 2 tuần,
- Sử dụng nước đề ion để chuyển toàn bộ lượng rắn còn lại ở ống nghiệm
vào trong cốc lọc. Rửa lại phần rắn trong cốc lọc với ít nhất nước đề
ion.
- Đem cốc có thành phần rắn không hòa tan trong acid đi sấy ở
cho đến khi khối lượng không đổi, thường ít nhất là 4 giờ.
- Chuyển cốc ngay vào bình hút ẩm khi đem ra khỏi lò sấy. Cân chính xác
khối lượng cốc và thành phần rắn chứa trong đó đến 0,1 mg.
- Đem cốc có chứa phần rắn đi nung trong lò nung ở trong
khoảng giờ.
Có thể cài đặt chương trình nung như sau:
 Gia nhiệt từ nhiệt độ phòng lên 105 o
C.
 Giữ nhiệt độ 105 o
C trong 12 phút.
 Gia nhiệt lên 250 o
C với tốc độ 10 o
C/ phút.
C trong 30 phút.
 Gia nhiệt lên 575 o
C với tốc độ 20 o
C/ phút.
C trong ít nhất 180 phút.
 Để lò nguội xuống còn 105 o
C.
 Giữ nhiệt độ lò ở 105 °C cho đến khi lấy cốc ra ngoài.

44
- Cẩn thận chuyển cốc từ lò nung vào ngay bình hút ẩm và để nguội trong một
khoảng thời gian nhất định bằng với thời gian để nguội trong khi chuẩn bị
cốc. Cân và ghi lại chính xác khối lượng cốc đến 0,1 mg. Đặt cốc trở lại lò
nung và nung tiếp đến khối lượng không đổi.
 Phân tích mẫu xác định hàm lượng lignin tan trong acid
- Chạy mẫu trắng là dung dịch 4 % H2SO4 trên máy đo quang phổ UV – Vis.
- Lấy dịch thủy phân được sau khi lọc qua cốc crucible đem đi đo độ hấp thu
tại bước sóng thích hợp. Mẫu được pha loãng nếu cần thiết để đưa giá trị đo
được của độ hấp thu về khoảng 0,7 – 1,0; ghi lại giá trị đo được và hệ số pha
loãng. Mẫu phải được phân tích trong khoảng thời gian không quá 6 giờ sau
khi thủy phân và thực hiện ít nhất 2 lần đối với mỗi mẫu.
 Phân tích mẫu xác định thành phần cellulose và lignocellulose
- Lấy khoảng 20 ml dịch thủy phân được sau khi lọc qua cốc crucible chuyển
vào erlen 50 ml.
- Sử dụng calcium carbonate để trung hòa mẫu đến pH 5,0 – 6,0. Sử dụng bút
đo độ pH để kiểm tra pH của mẫu và tránh để cho pH của mẫu vượt quá 6,0.
Khi pH đạt 4,0 cho rất từ từ calcium carbonate. Khuấy mẫu liên tục. Khi pH
đạt 5,0 – 6,0 thì ngừng trung hòa và để mẫu lắng, sau khi quá trình đạt cân
bằng thì pH của mẫu sẽ đạt giá trị xấp xỉ 7. Gạn lấy phần dung dịch trên bề
mặt
- Lọc phần dung dịch qua màng lọc rồi cho vào trong lọ đựng mẫu
để chuẩn bị cho phân tích HPLC
Tính toán:
- Khối lượng mẫu khô ODW (oven dry weight)

45
- Thành phần rắn không hòa tan trong acid AIR (acid insoluble
residue)
Trong đó:
: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy
: khối lượng cốc đã chuẩn bị lúc đầu
- Thành phần lignin không hòa tan trong acid AIL (acid insoluble
lignin)
Trong đó:
: khối lượng cốc và mẫu sau khi nung
- Thành phần lignin hòa tan trong acid ASL (acid soluble lignin)
Trong đó:
là giá trị độ hấp thu trung bình mẫu đo tại 240 nm
: Thể tích dung dịch sau lọc, 86,73 mL
: Hệ số pha loãng mẫu
( đo ở bước sóng )
- Hàm lượng lignin chứa trong mẫu
- Hàm lượng cellulose và hemicellulose: Nồng độ glucose và xylose: được phân
tích bởi máy HPLC.

46
2.5.3. Phương pháp cấy và giữ giống nấm men
 Phương pháp cấy nấm men gồm các bước:
- Chuẩn bị que cấy vòng hơ trên lửa đèn cồn để vô khuẩn.
- Tháo nút bông trên ống canh trường giống và tại ống môi trường, hơ
nóng hai ống.
- Dùng que cấy lấy một phần nấm men sau đó đưa que vào đáy ống môi
trường.
- Kéo đầu que cấy lên mặt thạch.
- Rút que cấy ra và khử trùng trên đèn cồn, đậy nút bông lại.
 Giữ giống nấm men
- Chuẩn bị môi trường SDA có chứa Agar, tiệt trùng, rót 10 ml dung dịch
vào ống nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại.
- Tiến hành cấy giống nấm men từ ống nghiệm gốc sang ống môi trường
thạch nghiêng đã chuẩn bị sẵn từ trước.
- Công việc này tiến hành trong tủ cấy vi sinh để tránh bị nhiễm các vi sinh
vật khác có ảnh hưởng đến men giống và quá trình lên men sau này.
2.5.4. Phương pháp nhân giống và hoạt hóa giống nấm men
Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh
khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành nhân giống qua
các bước:
Sau khi môi trường nấm men đã phát triển tốt trên môi trường thạch nghiêng, cấy
ria vào đĩa petri chứa môi trường SDA, ủ ở nhiệt độ phòng.
- Nhân giống cấp 1: lấy 1 khuẩn lạc rời cấy vào ống nghiệm chứa 10ml
môi trường SDB, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
- Nhân giống cấp 2: chuyển ống nghiệm sang chai chứa 90 ml môi trường
SDB nuôi cấy lắc ở nhiệt độ thường trong 24 giờ.

47
2.5.5. Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc: Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc mọc
trên môi trường thạch, qua đó xác định được số tế bào sống.
Tiến hành:
- Pha loãng mẫu: pha loãng mẫu theo các dãy số thấp phân thích hợp như:
10-1
, 10-2
, 10-3
, 10-4
, 10-5
.
- Trải mẫu: dùng micropipette hút 20 µl dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ
thích hợp vào môi trường đĩa thạch. Sử dụng que cấy gạt bằng thủy tinh
để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày.
- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đem tất cả khuẩn lạc
xuất hiện trên đĩa sau ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250 để tính
toán. Mật độ tổng của nấm men được tính theo công thức:
Trong đó:
A: mật độ tế bào (CFU/ml)
Ai: Số khuẩn lạc/đĩa
Di: Độ pha loãng
V: thể tích dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa (ml)
2.5.6. Phương pháp xác định hai loại đường và ethanol bằng máy HPLC
Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử trên cột sắc ký, khi dung
môi đi qua các cấu tử này sẽ lần lượt được rửa ra khỏi cột theo thứ tự tại các mốc thời
gian riêng đặc trưng tùy vào bản chất từng loại. Những cấu tử cùng thuộc một chất thì
sẽ có thời gian lưu như nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn nên HPLC
có độ phân tách cao.
Thời gian lưu peak của glucose là vào khoảng 7,558 phút, trong khi đó của xylose
và cồn lần lượt là 7,993 phút và 15,556 phút.

48
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát chủng nấm men S.cerevisiae sử dụng trong đề tài
3.1.1. Đặc điểm hình thái của nấm men
a) Khuẩn lạc S.cerevisiae (mt SDA) b) Tế bào S.cerevisiae quan sát hiển vi
Hình 3.1. Đặc điểm đại thể (a) và vi thể (b) của S.cerevisiae
S.cerevisiae sau khi được hoạt hóa, nhân giống và nuôi cấy trên môi trường SDA
thu được khuẩn lạc có hình dạng tròn, lồi trơn có màu trắng đường kính từ 1 - 2 mm
(hình 3.1a). So với các VSV khác (vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có kích thước
tương đối lớn, đường kính khoảng 7 µm (hình 3.1b).
Những tế bào men hình tròn đến hơi ovan. Những tế bào chết bắt màu xanh khi
làm tiêu bản nhuộm với chất xanh metylen[23].
3.1.2. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae
Khảo sát đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae dựa vào phương pháp xác định
mật độ tế bào gián tiếp bằng đường tương quan OD – mật độ tế bào (phụ lục B). Đồ thị
biểu diễn sự sinh trưởng của VSV phụ thuộc vào logarit số tế bào với thời gian được
thể hiện trong hình 3.2.

49
Hình 3. 1. Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae theo thời gian
trên môi trường SDB
Khi tiếp giống vào môi trường lỏng, nồng độ giống tế bào ban đầu là 3,9x108
CFU/ml. Sau 8 giờ mật độ tế bào là 5,9 x108
CFU/ml, số lượng tế bào tăng không đáng
kể vì đây là pha tiềm phát VSV chưa sinh sản, còn làm quen với môi trường, nhưng sự
trao đổi chất của chúng lại xảy ra mạnh mẽ. Mật độ tế bào tăng lên 8,7x109
CFU/ml ở
thời điểm 18 giờ, đây là giai đoạn phát triển của nấm men, số lượng tế bào tăng theo
cấp số nhân với tốc độ sinh trưởng là cực đại. Trong pha này, chất dinh dưỡng trong
môi trường cạn dần, các sản phẩm sinh ra làm cho các điều kiện mất đi sự thuận lợi cho
sự sinh trưởng và quá trình chuyển sang pha ổn định kéo dài đến thời điểm 38 giờ với
mật độ là 1,1x1010
CFU/ml. Trong pha này tế bào sống là ổn định và mật độ quần thể là
tối đa, số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi. Ở thời điểm 48 giờ, mật độ tế bào là
3,3x109
CFU/ml. Tế bào chuyển sang giai đoạn suy vong, các tế bào sống giảm dần và
tế bào chết tăng dần do tế bào chất bị phân hủy bởi các enzyme nội bào. Tế bào sống
trở nên già đi và nhỏ lại.
Như vậy, nấm men sinh trưởng tốt nhất để lên men trong 18 giờ với mật độ
8,7x109
CFU/ml.
7.59
7.77
8.94
9.06
8.53
7
7.5
8
8.5
9
9.5
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
log
(CFU/ml)
thời gian khảo sát (giờ)

50
3.2. Phân tích mẫu nguyên liệu ban đầu
Các phương pháp phân tích thành phần các chất trong gỗ được trình bày mục
2.5.2. Sau khi phân tích thu được các thành phần trong gỗ được thể hiện chi tiết ở bảng
3.1.
Bảng 3.1. thành phần phần trăm các chất có trong mẫu mùn cưa gỗ ban đầu
Thành phần Cellulose Hemicellulose Lignin Ẩm
Protein và các thành
phần khác
Hàm lượng
(%)
45,28 11,08 32,46 5,09 6,19
Thành phần cellulose trong mẫu mùn cưa gỗ ban đầu cao (45,28 %), hàm lượng
lignin cũng ở mức cao (32,46 %). Trong thành phần lignin thì phần lignin không tan
trong acid lại chiếm tỉ lệ lớn (24,02 %), điều này được lý giải là do sự đồng kết tủa,
ngưng đọng của các chất chiết xuất, tannin, hay các sản phẩm biến tính từ đường
(furfural) tạo ra.
Ngoài ra do một phần cấu trúc polysaccharide bị bao bọc bởi tannin, chất chiết
xuất, protein và sản phẩm đường biến tính dẫn đến khả năng xâm nhập của acid vào
cấu trúc lignin bị khó khăn dẫn đến quá trình thủy phân không hiệu quả, dẫn đến đường
thủy phân không hoàn toàn [7].
3.3. Tiền xử lý
3.3.1. Khảo sát kích thước nguyên liệu
Kích thước của nguyên liệu là một trong những yếu tố quan trọng nhất mà quá
trình tiền xử lý nguyên liệu cần làm rõ.

51
H nh 3.3. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất tách lignin.
Với vùng kích thước của nguyên liệu ban đầu, tác nhân NaOH có ảnh hưởng rõ
rệt lên hiệu quả tách lignin. Mẫu có kích thước lớn nhất là 1,5 mm có có khả năng tách
được 8,6 % lignin. Mẫu có kích thước bé nhất là 0.16 mm có khả năng tách 9,7 %
lignin ( hình 3.3). Kết quả này là hợp lý vì kích thước nguyên liệu càng nhỏ, thì diện
tích bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với tác nhân tiền xử lý sẽ càng lớn, quá trình sẽ
diễn ra càng dễ dàng hơn. Với kích thước <1 mm thì lượng lignin tách ra được là xấp
xỉ nhau nên có thể chọn kích thước nguyên liệu <1 mm là tối ưu để tiến hành tiền xử
lý.
3.3.2. Chọn tác chất tiền xử lý
Thí nghiệm chọn tác chất tiền xử lý nguyên liệu mùn cưa gỗ với 2 tác chất là acid
và kiềm với các nồng độ khác nhau. Kết quả được trình bày trong hình 3.4.
9.24
9.31
9.18 9.17
8.53
8
8.2
8.4
8.6
8.8
9
9.2
9.4
0.16 0.375 0.425 1 1.5
Hiệu
suất
lignin
tách
ra
(%)
Kích thƣớc nguyên liệu (mm)

52
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các tác chất tiền xử lý đối với hiệu suất lignin tách ra.
Đối với mẫu tiền xử lý bằng dung dịch acid H2SO4, nồng độ đường glucose và
xylose trong các dịch tiền xử lý là rất thấp và gần như bằng 0. Khả năng tách lignin ra
khỏi mẫu của acid là yếu. Hàm lượng lignin tách ra tăng đều nhưng không đáng kể.
Ứng với 1 nồng độ acid khá cao là 10 % thì lượng lignin tách được khỏi mẫu chỉ là
1,63 %. Điều này chứng tỏ rằng đối với cấu trúc bền chắc như gỗ tràm bông vàng thì
khả năng xâm nhập và phá vỡ lignocellulose của acid là rất kém, cellulose và
hemicellulose hầu như không bị tác động gì.
Đối với mẫu tiền xử lý bằng dung dịch kiềm NaOH, nồng độ đường glucose và
xylose trong phần dịch là thấp. Tuy nhiên, với dung dịch kiềm, sau quá trình tiền xử lý
sẽ lọc rửa và loại bỏ phần dịch, chỉ giữ lại phần bã cho thủy phân và lên men. Vì vậy,
tác nhân NaOH không gây ảnh hưởng đến cellulose và hemicellulose trong mẫu
nguyên liệu. Lượng lignin tách ra đáng kể với tác nhân tiền xử lý NaOH.
Khi tăng nồng độ NaOH, hàm lượng lignin tách ra được khỏi mẫu cũng tăng theo,
cụ thể khi tăng nồng độ NaOH từ 1 % đến 10 % thì hàm lượng lignin cao tăng từ 6,00
% đến 9,52 %. Hàm lượng lignin tách ra bắt đầu tăng rất chậm từ NaOH 4 % (9,38 %)
0.86
1.63
6.00
9.38
9.79 9.78
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4 5 10 15 20 25
Hiệu
suất
lignin
tách
ra
(%)
Nồng độ tác chất tiền xử lý (%)
H2SO4
NaOH

53
đến NaOH 25 % (9,78 %). Tuy nồng độ NaOH 20 % cho kết quả tốt nhất hàm lượng
lignin tách ra đạt 9,79 % nhưng đó là nồng độ kiềm cao gây nên sự hình thành các hợp
chất ức chế như furfural hay HMF [15]. Sự hình thành hợp chất muối sau quá trình
trung hòa kiềm có thể gây ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol. Do đó, để chọn
nồng độ thích hợp vừa đạt được hiệu quả tách lignin tốt vừa hạn chế sự hình thành các
hợp chất ức chế nên chọn dung dịch kiềm nồng độ thấp và nồng độ NaOH 4 % là thích
hợp nhất.
So sánh hiệu quả giữa hai phương pháp tiền xử lý bằng acid và kiềm đối với
nguyên liệu gỗ tràm bông vàng, phương pháp xử lý kiềm cho ưu điểm vượt trội hơn:
hàm lượng lignin tách ra tương đối cao và không làm ảnh hưởng nhiều đến cellulose và
hemicellulose thuận lợi cho quá trình thủy phân và lên men. Ngoài ra do tiền xử lý
bằng kiềm có thể thực hiện ở nhiệt độ và áp suất thường nên hiệu quả tiền xử lý cao so
với các phương pháp tiền xử lý khác [23]. Nồng độ NaOH 4 % được chọn cho quá
trình tiền xử lý.
3.3.3. Thành phần mẫu sau tiền xử lý với NaOH
Bảng 3.2. Thành phần phần trăm các chất có trong mẫu mùn cưa gỗ tràm bông vàng
sau khi tiền xử lý với NaOH 4 %.
Hàm lượng cellulose trong mẫu đã qua tiền xử lý này ở mức cao (67,73 %), hàm
lượng lignin đã giảm xuống còn 18,87 % .So sánh kết quả trên với mẫu tiền xử lý ban
đầu có thể đưa ra những nhận xét sau:
Thành phần Cellulose Hemicellulose Lignin
Protein và các thành phần
khác
Hàm lượng
(%)
62,73 12,82 18,87 6,48

54
Quá trình tiền xử lý bằng NaOH với điều kiện như trên làm tăng đáng kể hàm
lượng cellulose từ 45,28 % lên 62,73 % và giảm đáng kể hàm lượng lignin từ 32.46 %
xuống 18,87 %.
Hàm lượng cellulose sẽ tăng và hàm lượng lignin sẽ giảm khi thực hiện quá trình
tiền xử lý với các nồng độ cao và thời gian tiền xử lý dài.
3.3.4. Thời gian tiền xử lý và tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối lượng dung dịch
Hình 3.5. Sự thay đổi của hiệu suất tách lignin theo thời gian.
H nh 3.6. Sự phụ thuộc của lượng lignin tách ra vào tỉ lệ khối lượng mẫu/ khối lượng
dung dịch
2.96
9.17
9.24
0
2
4
6
8
10
0 15 30 45 60 75
Hiệu
suất
lignin
tách
ra
(%)
Thời gian (h)
0
5
10
15
20
25
30
35
10 15 20 30 40
24h
36h
Lƣợng
lignin
tách
ra
(%)
Tỉ lệ khối lượng NaOH/ khối lượng
mẫu

Nghiên cứu công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp shf (separate hydrolysis and fermentation)

Nghiên cứu công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp shf (separate hydrolysis and fermentation)

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Nghiên cứu công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp shf (separate hydrolysis and fermentation)

Similar to Nghiên cứu công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp shf (separate hydrolysis and fermentation) (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (19)

Nghiên cứu công nghệ chuyển hóa gỗ (tràm bông vàng) thành bioethanol bằng phương pháp shf (separate hydrolysis and fermentation)