Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI TÁCH
CHIẾT ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY
ELEPHANTOPUS SP.
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt
TS. Lương Tấn Trung
Sinh viên thực hiện : Dương Minh Trí
MSSV: 1151110379 Lớp: 11DSH04
TP. Hồ Chí Minh, 2015

2. Đồ án tốt nghiệp
i
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………

3. Đồ án tốt nghiệp
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên
cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm
Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về
lời cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Sinh viên
Dương Minh Trí

4. Đồ án tốt nghiệp
iii
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại
học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ Sinh
học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến
thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.
Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt,
người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở
Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các
anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn
thành tốt đề tài của mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên
con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng
như trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Sinh viên
Dương Minh Trí

5. Đồ án tốt nghiệp
iv
MỤC LỤC
TRANG BÌA
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................ii
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................... iii
MỤC LỤC.................................................................................................................iv
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT........................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG......................................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH........................................................................................x
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ..............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu..............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................2
4. Phạm vi nghiên cứu...............................................................................................3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................4
1.1 Giới thiệu về Elephantopus sp............................................................................4
1.1.1 Nguồn gốc của cây Elephantopus sp. .............................................................4
1.1.2 Phân loại ...........................................................................................................4
1.1.3 Đặc điểm thực vật học......................................................................................4
1.1.4 Một số thành phần hóa học trong cây Elephantopus sp. .............................6
1.1.5 Tính chất dược lý..............................................................................................6
1.2 Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ....................................8
1.2.1 Khái niệm và phân loại....................................................................................8

6. Đồ án tốt nghiệp
v
1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật ......................................8
1.2.3 Một số hợp chất kháng khuẩn trong thực vật...............................................9
1.2.4 Tình hình nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật trên thế giới
và tại Việt Nam........................................................................................................16
1.3. Phương pháp tách chiết các hợp chất kháng khuẩn.....................................18
1.3.1 Nguyên lý của quá trình tách chiết...............................................................18
1.3.2 Cơ sở của quá trình tách chiết. ....................................................................18
1.3.3 Các phương pháp tách chiết một số hợp chất kháng khuẩn .....................18
1.4 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh ................................................22
1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy............................................................22
1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da ...................................................26
1.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) .....................................................................30
1.5.1. Khái niệm.......................................................................................................30
1.5.2. Ý nghĩa ...........................................................................................................30
1.5.3. Cách xác định chỉ số MIC ...........................................................................31
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................32
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu...................................................................32
2.1.1. Địa điểm .......................................................................................................32
2.1.2. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................32
2.2. Vật liệu ..............................................................................................................32
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................32
2.2.2. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................32
2.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất.................................................................33

7. Đồ án tốt nghiệp
vi
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................33
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................34
2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật ....................................34
2.3.2. Phương pháp tăng sinh.................................................................................34
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật .......................................35
2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào .........................................................36
2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu ......................................................................36
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết...................36
2.3.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ...........................37
2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học ..............................................37
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................38
2.4. Bố trí thí nghiệm ..............................................................................................38
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu
hồi cao từ Elephantopus sp. .....................................................................................39
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính
kháng khuẩn của cao chiết Elephantopus sp. ...........................................................43
2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết
ethanol 70% từ cây Elephantopus sp. ....................................................................44
2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ
cây Elephantopus sp..................................................................................................45
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................53
3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi
cao từ cây Elephantopus sp.....................................................................................53

8. Đồ án tốt nghiệp
vii
3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng
khuẩn của cao chiết từ cây Elephantopus sp. .......................................................54
3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với
nhóm vi khuẩn Escherichia coli .............................................................................55
3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với
nhóm vi khuẩn Salmonella spp. .............................................................................56
3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với
nhóm vi khuẩn Shigella spp ...................................................................................58
3.2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với
nhóm vi khuẩn Vibrio spp ......................................................................................60
3.2.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với
nhóm vi sinh vật còn lại ..........................................................................................63
3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol
70% từ cây Elephantopus sp...................................................................................68
3.4. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ cây
Elephantopus sp.......................................................................................................69
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................70
4.1. Kết luận ............................................................................................................70
4.2. Đề nghị ..............................................................................................................70
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................73
PHỤ LỤC

9. Đồ án tốt nghiệp
viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TSB: Trypton Soya Broth
TSA: Trypticase Soya Agar
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
MIC: Minimum Inhibitory Concentration

10. Đồ án tốt nghiệp
ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi cao từ các loại dung môi khác nhau...............................53
Bảng 3.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ cây
Elephantopus sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị ..................................................64
Bảng 3.3. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ dung môi ethanol 70%
trên các chủng vi sinh vật đối kháng.........................................................................66
Bảng 3.4 Kết quả định tính một số thành phần hóa học trong cây Elephantopus sp. .
...................................................................................................................................68

11. Đồ án tốt nghiệp
x
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cây Elephantopus sp. và hoa...................................................................5
Hình 1.2: Hình thái E. coli trên kính hiển vi điện tử .............................................22
Hình 1.3: Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử......................................23
Hình 1.4: Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử .............................................24
Hình 1.5: Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử...........................................25
Hình 1.6: Hình thái Pseudomonas trên kính hiển vi điện tử .................................26
Hình 1.7: Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử ....................27
Hình 1.8: Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử...............................29
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ..........................................................39
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu hồi cao .......................................................40
Hình 2.3: Dịch chiết mẫu bằng nước.....................................................................41
Hình 2.4: Dịch chiết mẫu bằng ethanol 50%.........................................................42
Hình 2.5: Dịch chiết mẫu bằng ethanol 70%.........................................................42
Hình 2.6: Dịch chiết mẫu bằng ethanol 90%.........................................................43
Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát hoạt tính cao chiết .........................................................44
Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát MIC ..................................................46
Hình 2.9: Sơ đồ tiến trình định tính thành phần hóa học.......................................47
Hình 2.10: Thử nghiệm Molisch..............................................................................48
Hình 2.11: Thử nghiệm Fehling ..............................................................................49
Hình 2.12: Thử nghiệm Dragendroff.......................................................................50
Hình 2.13: Thử nghiệm tạo bọt................................................................................50
Hình 2.14: Thử nghiệm tannin ................................................................................51
Hình 2.15: Định tính thành phần steroid .................................................................52
Hình 3.1: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn
Escherichia coli.........................................................................................................56
Hình 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn
Salmonella spp. ........................................................................................................56
Hình 3.3: Vòng ức chế S. dublin – cao chiết ethanol 50% và 90% .......................56

12. Đồ án tốt nghiệp
xi
Hình 3.4: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn
Shigella spp. .............................................................................................................58
Hình 3.5: Vòng ức chế Shi. flexneri – cao chiết nước và ethanol 70% .................58
Hình 3.6: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn
Vibrio spp. ...............................................................................................................60
Hình 3.7: Vòng ức chế V. alginolyticus – cao chiết ethanol 70% .........................60
Vòng ức chế V. cholere– cao chiết ethanol 70%...................................61
Hình 3.8: Vòng ức chế V. harveyi – cao chiết ethanol 70%..................................62
Vòng ức chế V. harveyi – cao chiết ethanol 90%..................................62
Hình 3.9: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn
còn lại ...............................................................................................................63
Hình 3.10: Vòng ức chế Lis. innocua – cao chiết ethanol 70%...............................64
Và Pseudomonas ...................................................................................64

13. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nhiều thế kỉ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn
carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn
cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông
nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực
phẩm có giá trị. Những nghiên cứu về các hợp chất có nguồn gốc thực vật đã phát
triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX đến nay và đã có khoảng hơn 80.000 hợp
chất khác nhau ở thực vật được công bố.
Trong thiên nhiên, có rất nhiều cây cỏ có chất kháng khuẩn. Nguồn dược liệu
của nước ta vô cùng phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc kháng sinh được Y học
dân tộc dùng làm thuốc từ lâu. Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc
hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm
đại hành, lá Móng tay… được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát
khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm
phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác. Nhiều cây thuốc được nhân dân ta dùng
chữa vết thương có kết quả tốt như Mỏ quạ, Nọc sởi, lá Vối, lá Bòng bong, Sắn
thuyền, Lô hội, lá Trầu không, Sài đất…
Trong điều trị các vết thương phần mềm, nhiều tác giả trong và ngoài nước
cũng đã công nhận dùng chất kháng khuẩn thực vật chữa vết thương chóng sạch,
các đám hoại tử dễ bong, tổ chức hạt non phát triển mạnh, vết thương mau lành hơn
chữa bằng kháng sinh tân dược vì trong nước sắc cây thuốc không phải chỉ có
kháng sinh mà còn có những chất kích thích giúp vết thương chóng đầy miệng, có
các loại men, vitamin và các nguyên tố vi lượng tạo điều kiện cho vết thương chóng
khỏi.

14. Đồ án tốt nghiệp
2
Một trong những vấn đề nan giải đối với thuốc kháng sinh tân dược hiện nay
là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn do tình hình lạm dụng kháng
sinh trong điều trị ngày càng phát triển ở nhiều nước trên thế giới.
Elephantopus sp. hay còn gọi là Cúc chỉ thiên mềm, là một loài phân bố
rộng, dễ tìm kiếm. Một số nghiên cứu cho thấy thành phần chính trong cây là
phenolic: caffeic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, 1,4-dicaffeoylquinic acid, và 3,4-
dihydroxy-cinamic acid methyl ester. Theo y học cổ truyền, các bộ phận của cây
Elephatopus sp. đều được sử dụng để làm thuốc trị viêm nhiễm, tiêu chảy... Các
hợp chất sinh học chỉ chiếm một phần nhỏ nhưng lại có vai trò quan trọng trong
việc cung cấp nguồn dược liệu quý, vấn đề trích ly những hợp chất này sao cho giữ
được hiệu quả của chúng cũng rất quan trọng.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh
hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây
Elephantopus sp. ”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây
Elephatopus sp.
- Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của các loại cao chiết từ cây Elephantopus
sp.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng
khuẩn của cây Elephantopus sp.
- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Elephantopus sp. đối
với các chủng vi khuẩn.
- Định tính thành phần hóa học của cao chiết các loại dung môi từ cây
Elephantopus sp.

15. Đồ án tốt nghiệp
3
4. Phạm vi nghiên cứu
- Khảo sát trên các loại dung môi: ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90%, nước
cất.
- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.
- Chỉ tiến hành định tính một số thành phần hóa học.

16. Đồ án tốt nghiệp
4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về Elephantopus sp.
1.1.1. Nguồn gốc của cây Elephantopus sp.
Elephantopus sp. hay còn gọi là Cúc chỉ thiên mềm, cúc chỉ thiên hoa trắng,
chân voi nhám, cỏ lưỡi mèo là một loài thực vật có hoa trong họ Cúc. Theo những
hồ sơ nghiên cứu ban đầu, Elephantopus sp. được phát hiện ở Senegal vào năm
1900 và ở Sierra Leone năm 1914 (GBIF, 2013) thuộc Tây Phi. Các mẫu vật từ cây
được ghi nhận lần đầu từ Cameroon vào năm 1952, Togo vào năm 1981, Seychelles
vào năm 1982, Australia vào năm 1989 và Tanzania vào năm 1991 (GBIF, 2013).
Sự phát tán của loài cây này không rõ ràng; trong tự nhiên nó được coi là một
loại cây dại, nhưng trong các trường hợp khác dường như nó đã được giới thiệu như
một loại cây thuốc có ích. Elephantopus sp. đã trở thành loài cây quan trọng ở
Cameroon và ở Đài Loan, cùng với các loài châu Á như E. scaber.
1.1.2. Phân loại
 Giới: Plantae
 Ngành: Spermatophyta
 Ngành phụ: Angiospermae
 Lớp: Dicotyledonae
 Bộ: Asterales
 Họ: Asteraceae
 Chi: Elephantopus
1.1.3. Đặc điểm thực vật học
1.1.3.1. Mô tả
Cúc chỉ thiên mềm là loại cây thân thảo cao 0,5 - 1m, thân và lá có nhiều lông.
Lá mọc dài theo thân, không cuống; phiến thon dạng bay, dài 10-15cm, gốc ôm
thân, mép khía lượn, có lông mềm ngắn ở mặt dưới; các lá trên rất tiêu giảm. Cụm
hoa dài theo thân, nhánh mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung; các hoa đầu

17. Đồ án tốt nghiệp
5
phụ cao 8mm, mang 4-5 hoa trắng. Quả bế cao 3mm, có rãnh; mào lông có 5 tơ
(Empinotti và Duarte, 2008).
Hình 1.1 Cây Elephantopus sp. và hoa.
1.1.3.2. Sinh sản
Ở Queensland (Australia), cây có thể ra hoa quanh năm nhưng thường ra hoa
vào tháng 6 - 7 (Chính phủ Queensland, 2013). Tại Brazil, Ferreira và ctv (2001)
báo cáo sự nảy mầm nhanh chóng của những hạt giống của Elephantopus sp.. Tuổi
thọ của các hạt giống trong đất là khá ngắn - 90% các hạt có thể bị mất đi trong một
năm và 100% trong 2 năm (North Queensland, 2009).
1.1.3.3. Phân bố
Elephantopus sp. có nguồn gốc ở Trung và Nam Mỹ, từ Argentina đến
Mexico, bao gồm cả vùng biển Caribbean, nhưng đã được lan truyền rất rộng rãi
vào châu Phi, Đông Nam Á và Thái Bình Dương.
Ở nước ta, cây mọc ở rừng thưa, rừng thông, dọc đường đi ở nhiều nơi, nhất là
ở các tỉnh Tây Nguyên.

18. Đồ án tốt nghiệp
6
Elephantopus sp. sinh trưởng phù hợp với điều kiện nhiệt đới ẩm. Chúng cần
ánh sáng và lượng nước đầy đủ cho sự tăng trưởng. Do đó các đồng cỏ, các đồn
điền, ven rừng, ven đường và đầm lầy phù hợp cho sự phát triển của Elephantopus
sp..
1.1.4. Một số thành phần hóa học trong cây Elephantopus sp.
Một số nghiên cứu cho thấy thành phần chính trong cây là phenolic, caffeic
acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, 1,4-dicaffeoylquinic acid, và 3,4-dihydroxy-cinamic
acid methyl ester.
- Trong lá sấy khô có chứa molephantin (1), molephantinin (2), 2-deethoxy-2-
hydroxyphantomolin (3), stigmasterol (4), acid béo α-amyrin ester (5a), và acid béo
lupeol ester (5b).
- Nghiên cứu thành phẩn hóa học tìm thấy 9 hợp chất: 2beta-deethoxy-2-
hydroxyphantomolin (1), 2beta-methoxy-2-deethoxyphantomolin (2), 2beta-
methoxy-2-deethoxy-8-O-deacylphantomolin-8-O-tigli-nate (3), molephantinin (4),
betulinic acid (5), magnolol (6), honokiol (7), dibutly phthalate (8) and tricin (9).
- Cao chiết methanol của cây mang lại sesquiterpene lactone mới, 2-de-
ethoxy-2-hydroxyphantomolin, cùng với lupeol, lupeol acetate, epifriedelinol,
molephantin, và 2-de-ethoxy-2-methoxyphantomolin (9).
1.1.5. Tính chất dược lý
1.1.5.1. Theo kinh nghiệm dân gian
Theo y học cổ truyền, các bộ phận của cây Elephantopus sp. đều được sử
dụng để làm thuốc. Thuốc có vị đắng, se, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt giải độc,
lợi thuỷ tiêu thũng. Lá trừ giun, lợi tiểu. Thường dùng trị (1) Cảm mạo, viêm hạch
hạnh nhân cấp, viêm hầu họng, viêm kết mạc; (2) Viêm gan vàng da cấp, xơ gan cổ
trướng; (3) Viêm thận cấp và mạn; (4) Cước khí thuỷ thũng, lỵ, tiêu chảy; (5) Cụm
nhọt, eczema, rắn cắn. Ngày dùng 15-30g, dạng thuốc sắc. Dùng ngoài giã cây lá
tươi lấy nước uống, bã đắp trừ rắn cắn (dùng riêng hoặc phối hợp với Bồ cu vẽ, lá

19. Đồ án tốt nghiệp
7
Ớt). Có thể lấy lá tươi giã với mẻ và giấm đắp trị nhọt độc hoặc nấu nước rửa bệnh
ngoài da. Ở Dominica, người ta dùng lá Cúc chỉ thiên mềm và lá Cỏ lào hãm uống
để trị bệnh tiêu chảy (Võ Văn Chi, 2012).
1.1.5.2. Tác dụng sinh học
Tại Brazil, lá cây Elephantopus sp. được sử dụng như tác nhân làm lành
thương và điều trị viêm phế quản, ho và cúm trong y học dân gian (Empinotti và
Duarte. 2008). Một loạt các ứng dụng truyền thống khác được liệt kê theo Lorenzi
(1982).
Cao chiết ethanol của Elephantopus sp. đẩy nhanh việc chữa gãy xương ở
chuột thông qua tác dụng kích thích sự biệt hóa nguyên bào xương và khoáng, điều
đó chứng minh cho việc sử dụng cây thuốc này đã có từ lâu tại Cameroon
(Ngueguim và ctv, 2012.).
Ooi và ctv (2011) đã chứng minh vai trò chính của 3,4-di-O -caffeoyl
quinic acid trong khả năng chống oxy hóa của cao chiết Elephantopus sp.. Các hợp
chất này cũng gây độc tế bào và α-glucosidase tác dụng ức chế sự chết của tế bào
qua trung gian và do đó là một chất không độc hại đầy hứa hẹn để điều trị ung thư
và bệnh tiểu đường loại 2.
Tabopda và ctv (2008) đã xác định một sesquiterpene lactone mới trong đó
Elephantopus sp. thể hiện các hoạt động gây độc tế bào quan trọng chống lại u
nguyên bào thần kinh B104 ở chuột.
Kết quả khác cho rằng cao chiết Elephantopus sp. làm giảm sự hình thành
hắc tố, dẫn tới giảm biểu hiện của Tyr và Trp. Ngoài ra, biểu hiện của melanocortin-
1 receptor (MC1R) đã được điều chỉnh bởi cao chiết, giải mẫn cảm với α-
melanocyte-stimulating hormone (α-MSH) của các tế bào được điều trị với các cao
chiết (Hasegawa và ctv, 2010.).
Ở Ecuador, Elephantopus sp. là một trong 10 đơn vị phân loại thường gặp
nhất trong điều trị leishmaniasis (một bệnh do nhiễm ký sinh trùng Leishmania)
(Gachet và ctv, 2010).

20. Đồ án tốt nghiệp
8
Elephantopus sp. được chứng minh có tác dụng bảo vệ chống lại nhiễm độc
gan do β-D-galactosamine và acetaminophen, bằng cách giảm nồng độ trong huyết
thanh glutamate-oxalate-transaminase [aspartate aminotransferase] và huyết thanh
glutamate-pyruvate-transaminase [alanine aminotransferase]. Các tiểu thùy trung
tâm bị hoại tử được cải thiện rõ bằng cách xử lý với cao chiết từ cây Elephantopus
sp. (Lin và ctv, 1995).
1.2. Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật
1.2.1. Khái niệm và phân loại
Các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc
thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus.
Các hợp chất kháng khuẩn thường có tác dụng khá đặc hiệu lên các loài vi khuẩn
khác nhau ở một nồng độ thường là rất nhỏ. Những chất này có thể thuộc nhiều cấu
trúc hóa học khác nhau như alkaloid, các hợp chất quinone, flavonoid, tinh dầu
v.v…
Ngày nay người ta chia các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ra làm 2 nhóm
sau:
- Nhóm bay hơi: gồm những chất do thực vật tiết ra có khả năng khuếch
tán vào không khí và có tác dụng ức chế sự sinh trưởng, phát triển của virus, vi
khuẩn.
- Nhóm không bay hơi: gồm những chất ở sâu trong các tế bào thực vật,
không có khả năng khuếch tán vào không khí. Muốn sử dụng nó, phải dựa vào đặc
điểm, tính chất của từng loại kháng sinh thực vật. Thường người ta hay sử dụng
chúng dưới các dạng: Giã nát lấy nước cốt, ngâm, sắc hoặc chiết bằng các dung môi
thích hợp.
1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật
Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao
gồm việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình

21. Đồ án tốt nghiệp
9
tổng hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian
tế bào, gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền
thông tin của tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả
PSMs (Plant secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng
tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động
tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv, 2013).
1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn trong thực vật
1.2.3.1. Alkaloid
a. Khái niệm về alkaloid
Năm 1819, Wilhelm Meissner đề nghị xếp các chất có tính kiềm lấy từ thực
vật ra thành một nhóm riêng và gọi tên là alkaloid. Ông là người đầu tiên đưa ra
khái niệm về alkaloid: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản
ứng kiềm và lấy từ thực vật.
Theo Polonopski: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có
nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong
động vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số
thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid.
b. Tính chất chung của alkaloid
Đặc điểm lý học:
- Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy nghĩa là
trong công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ
thường. Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin
(C21H22N2O2), quinin (C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2)… Những alkaloid thành
phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng. Ví dụ như: Coniin (C8H17N), nicotin
(C10H14N2), spartein (C15H26N2 ). Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có
điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân
hủy ở nhiệt độ trước khi chảy. Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường

22. Đồ án tốt nghiệp
10
vững bền, không bị phân hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy
ra khỏi dược liệu.
- Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như
capsaixin, piperin…
- Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít alkaloid có màu vàng
như berberin, palmatin, chelidonin,
- Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung
môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen.. trái lại các muối
alkaloid thì dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít
phân cực.
Đặc điểm hóa học:
- Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base
mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất yếu
như cafein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng
kiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid
yếu như arecaidin, guvacin.
Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng
những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi
định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để
lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp.
- Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng.
- Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức.
- Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của
alkaloid.

23. Đồ án tốt nghiệp
11
c. Vai trò của alkaloid
Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc.
Tác dụng của alkaloid thường khác nhau. Nhiều alkaloid có tác dụng lên hệ thần
kinh trung ương gây ức chế như morphin, codein, scopolamin, reserpin hoặc gây
kích thích như strychnin, cafein, lobelin. Nhiều chất tác dụng lên hệ thần kinh giao
cảm gây kích thích: Ephedrin, hordenin, làm liệt giao cảm, ergotamin, yohimbin
hoặc kích thích phó giao cảm: pilocarpin, eserin; có chất gây liệt phó giao cảm:
hyoscyamin, atropin; có chất phong bế hạch giao cảm: nicotin, spartein, coniin.
Trong số alkaloid có chất gây tê tại chỗ, có chất làm giãn cơ trơn, chống co
thắt. Có alkaloid làm tăng huyết áp (ephedrin, hydrastin), có chất làm hạ huyết áp
trên tim như ajmalin, quinidin và α-fagarin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp
tim. Có alkaloid diệt ký sinh trùng: Quinin độc đối với ký sinh trùng sốt rét; emetin
và conexin độc đối với amip dùng để chữa lỵ. Isopelletierin, arecolin dùng để trị
sán.
1.2.3.2. Flavonoid
a. Khái niệm chung về flavonoid
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nửa
rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp
trong dược liệu nguồn gốc thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác
định cấu trúc. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (Flavonoid do từ flavus có
nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh, tím đỏ, một số khác lại không
có màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất
khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid,
xanthon, cần chú ý để khỏi nhầm lẫn.
b. Tính chất chung của flavonoid
Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các
nhóm OH đã methyl hoá), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm

24. Đồ án tốt nghiệp
12
đến đỏ cam. Các chất thuôc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol,
leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với
nhóm carbonyl nên không màu.
Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tuỳ theo pH của môi trường.
Tuy nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn
hợp với các sắc tố khác.
Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycoside và flavonoid sulfat là
những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan
được trong nước tốt nhất là cồn nước. Các aglycon flavonoid thì tan được trong
dung môi hữu cơ, không tan trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7-
hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng.
c. Vai trò của flavonoid
+ Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO.
, ROO.
.
Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra
cạnh DNA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế
bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hoá.
+ Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của
enzyme oxy hoá - khử. Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức
năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, các bệnh trong nhãn khoa.
Các dẫn chất anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc.
+ Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ
được chức năng gan. Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ
nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Flavonoid còn có tác
dụng thông tiểu, chống loét chữa đau dạ dày, chống viêm điều trị ban đỏ, viêm da,
tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị, điều hòa nhịp tim.
+ Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất
như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của

25. Đồ án tốt nghiệp
13
một số dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O-b-D-
galactopyranosid.
1.2.3.3. Tinh dầu
a. Khái niệm về tinh dầu
Tinh dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không
tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi được ở nhiệt độ thường và
có thể điều chế từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước.
b. Tính chất chung của tinh dầu
* Thể chất: Đa số là chất lỏng ở nhiệt độ thường, một số thành phần ở thể rắn:
Menthol, borneol, camphor, vanilin, heliotropin.
* Màu sắc: Không màu hoặc vàng nhạt. Do hiện tượng oxy hóa màu có thể
sẫm lại. Một số có màu đặc biệt: Các hợp chất azulen có màu xanh mực
* Mùi: Đặc biệt, đa số có mùi thơm dễ chịu, một só có mùi hắc, khó chịu (tinh
dầu giun).
* Vị: cay, một số có vị ngọt: Tinh dầu quế, hồi.
* Bay hơi được ở nhiệt độ thường.
* Tỷ trọng: Đa số nhỏ hơn 1. Một số lớn hơn 1: Quế, đinh hương, hương nhu.
c. Vai trò của tinh dầu
Tinh dầu đóng vai trò quyến rũ côn trùng giúp cho sự thụ phấn của hoa. Một
số nghiên cứu khác cho rằng tinh dầu bài tiết ra có nhiệm vụ bảo vệ cây, chống lại
sự xâm nhập của nấm và các vi sinh vật khác.
Tinh dầu và các dược liệu chứa tinh dầu có một phạm vi sử dụng rất rộng lớn
trong đời sống hàng ngày của con người, trong nhiều ngành khác nhau thể hiện qua
những tác dụng:
- Tác dụng trên đường tiêu hoá: Kích thích tiêu hoá, lợi mật, thông mật.

26. Đồ án tốt nghiệp
14
- Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn: Tác dụng trên đường hô hấp như tinh
dầu bạch đàn, bạc hà. Tác dụng trên đường tiết niệu như tinh dầu hoa cây Barosma
betulina.
- Một số có tác dụng kích thích thần kinh trung ương: Dược liệu chứa tinh dầu
giàu anethol: Đại hồi...
- Một số có tác dụng diệt ký sinh trùng.
- Rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ
v.v.. khi sử dụng ngoài da.
1.2.3.4. Saponin
a. Khái niệm saponin
Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo = xà phòng (vì tạo bọt như xà
phòng), là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng phân
lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao.
b. Tính chất chung của saponin
- Saponin có một số tính chất đặc biệt: làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi
lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch; làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng
độ rất loãng; có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b -hydroxysteroid
khác.
- Saponin gây độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp
nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm
như giun, sán, ốc sên.
- Saponin đa số có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan
do đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin khó bị thẩm tích,
người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất.

27. Đồ án tốt nghiệp
15
c. Vai trò của saponin
- Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Một số dược liệu chứa saponin có tác
dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn,... Saponin làm tăng sự
thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và
hấp thu
- Một số saponin có tác dụng chống viêm. Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng
nấm, ức chế virus. Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm. Nhiều
saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). Sapogenin steroid dùng
làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid.
1.2.3.5. Tannin
a. Khái niệm chung về tannin
Từ "Tanin" được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt
trong dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật
làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tanin được định nghĩa là
những hợp chất polyphenol có trong thực vật có vị chát được phát hiện dương tính
với "thí nghiệm thuộc da" và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da
sống chuẩn.
b. Tính chất chung của tannin
- Tanin có vị chát, làm săn da, tan được trong nước, kiềm loãng, cồn,
glycerin và aceton, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ.
- Kết tủa với gelatin. Dung dịch tanin (0,5-1%) khi thêm vào dung dịch
gelatin 1% có chứa 10% natrichlorid thì sẽ có tủa. Acid gallic và các pseudotanin
khác cũng làm kết tủa gelatin nhưng với dung dịch tương đối đậm đặc.
- Kết tủa với các alkaloid. Tanin tạo tủa với các alcaloid hoặc một số dẫn
chất hữu cơ có chứa nitơ khác như hexamethylen tetramin, dibazol...

28. Đồ án tốt nghiệp
16
- Kết tủa với muối kim loại. Tanin cho tủa với các các muối kim loại nặng
như chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt.
- Phát hiện acid chlorogenic. Dịch chiết có acid chlorogenic khi thêm dung
dịch ammoniac rồi để tiếp xúc không khí dần dần sẽ có màu xanh lục.
c. Vai trò của tannin
Ở trong cây, tanin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy
hoá khử. Là những chất đa phenol, tanin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo vệ
cho cây.
Dung dịch tanin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên ứng
dụng làm thuốc săn da. Tanin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc
miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc chỗ loét khi nằm lâu. Tanin có
thể dùng trong để chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy.
Tanin kết tủa với kim loại nặng và với alkaloid nên dùng chữa ngộ độc
đường tiêu hoá. Tanin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để
cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn.
1.2.4. Tình hình nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật trên thế giới
và tại Việt Nam
 Tình hình nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật trên thế giới
- Vào năm 2010 tại Trung Quốc, Hao Liu và ctv bằng phương pháp hóa lý và phân
tích quang phổ đã phân lập được 7 flavonoid từ các bộ phận của cây
Halostachyscaspica và xác định các hợp chất này có một phổ kháng khuẩn rộng
hoạt động trên các vi sinh vật cũng như các khả năng chống oxy hóa.
- Năm 2011, Naveed Ahmad và cộng sự đã nghiên cứu về sự chống oxi hóa và
kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại
dung môi khác nhau.
- Năm 2013 tại Hàn Quốc, Suk-Nam Kang và ctv nghiên cứu xác định hàm lượng
phenolic và flavonoid, hoạt động chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của chiết

29. Đồ án tốt nghiệp
17
xuất ethanol từ thân và lá của Impatiens balsamina L. (họ bóng nước) thu hoạch vào
các thời điềm khác nhau, các chất chiết từ lá I. balsamina L. có thể ứng dụng như là
một chất chống oxy hóa tự nhiên trong bảo quản thực phẩm.
- Năm 2014, Andrei Mocan và ctv đánh giá các hoạt động chống oxy hóa và kháng
khuẩn và hàm lượng polyphenolic của lá và quả Schisandra chinensis (Turcz.)
Baill. và đưa ra kết luận lá cây là một nguồn giàu flavonoid, một nguồn có giá trị
của các hợp chất chống oxy hóa.
 Tình hình nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam
- Năm 2011, Nguyễn Thị Thúy Anh đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn sâu răng
gây ra bởi vi khuẩn Streptococcus mutans của một số loài thực vật (cau, xoài, lược
vàng, húng quế…)
- Tại hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5 năm
2013, Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong đã công bố nghiên cứu khả năng
chống oxy hóa và khả năng kháng khuẩn của dịch chiết quả Nhàu (Morinda
citrifolia L.)
- Năm 2012, Đặng Thúy Nhung và cộng sự đã đưa ra phương pháp xử lí nước thải
bằng hạt cây chùm ngây bước đầu cho kết quả khả quan về khả năng diệt vi khuẩn
hiếu khí và yếm khí trong nước thải chuồng nuôi lợn. Cũng trong năm đó, Nguyễn
Thị Bích Thuyền và ctv đã trình bày kết quả khảo sát thành phần hóa học và khả
năng kháng tốt trên các vi sinh vật thử nghiệm của tinh dầu lá húng chanh.
- Năm 2015, Nguyễn Thị Hoàng Lan và ctv tiến hành nghiên cứu nhằm xác định
khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô đối với 8 chủng vi khuẩn gây hư
hỏng và ngộ độc thực phẩm.

30. Đồ án tốt nghiệp
18
1.3. Phương pháp tách chiết các hợp chất kháng khuẩn
1.3.1. Nguyên lý của quá trình tách chiết
Chiết xuất là quá trình dùng dung dịch thích hợp để hoà tạn các chất tan có
trong dược liệu, chủ yếu là các chất có tác dụng điều trị, sau đó tách chúng ra khỏi
phần không tan của dược liệu. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một
dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch
chiết.
Các chất có tác dụng diều trị trong dược liệu (alkaloid, glycoside, vitamin,
tinh dầu…)
Các chất không có tác dụng điều trị, các chất gây khó khăn trong quá trình
bảo quản ( đường tinh bột, pectin, chất nhầy, nhựa…) được gọi là tạp chất.
1.3.2. Cơ sở của quá trình tách chiết
Quá trình chiết xuất hoạt chất trong dược liệu bằng dung môi là quá trình di
chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng, trong đó dung môi là pha lỏng còn
dược liệu là pha rắn. Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất
là:
- Sự hòa tan của chất tan vào dung môi.
- Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi.
- Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật.
Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi,
nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu...) sẽ
quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất.
1.3.3. Các phương pháp tách chiết một số hợp chất kháng khuẩn
Các phương pháp tách chiết gồm có ngâm và chiết kiệt. Trong phương pháp
ngâm dược liệu được ngâm trong 1 lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất
định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được

31. Đồ án tốt nghiệp
19
rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm - chiết được lập lại
cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu. Trong phương pháp chiết kiệt, dung mội
được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với 1 tốc độ nhất
định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và
nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối dược liệu. Như
vậy, chiết kiệt là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ
đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt
chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn.
Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại họat chất mà chọn cho thích hợp. Về
nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các
hợp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất
kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do...) thì
phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác
nhau là dung môi hay được dùng. Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất,
không độc, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ
từ trong cồn sôi vừa để diệt enzyme vừa để hòa tan hoạt chất.
Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với
sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất
cao v.v... đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất.
1.3.3.1. Tách chiết hợp chất alkaloid
Quá trình chiết xuất alkaloid dựa vào tính chất chung sau:
- Alkaloid thường là những base yếu, tồn tại trong cây dưới dạng muối của
acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin; nên phải tán nhỏ dược
liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những
kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh.
- Hầu hết các alkaloid base không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung
môi hữu cơ ít phân cực (hydrocacbon thơm, chloroform, ether). Trái lại, các muối
alkaloid thường tan trong nước, cồn và không tan trong các dung môi ít phân cực.

32. Đồ án tốt nghiệp
20
Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid như loại bay hơi hoặc không bay hơi
mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp.
1.3.3.2. Tách chiết hợp chất flavonoid
Không có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng
rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ. Các flavonoid
glycoside thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon dễ tan
trong dung môi kém phân cực. Thông thường để chiết các flavonoid glycoside,
người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng
hoặc methanol hoặc ethanol hay hỗn hợp CHCl3 và ethanol. Cồn ở các nồng độ
khác nhau và nước thường chiết được phần lớn các flavonoid. Hỗn hợp CHCl3 và
cồn hay dùng để chiết các dẫn chất methoxy flavonoid. Các
chất anthocyanin thường kém bền vững nhất là các acyl anthocyanin được acyl hoá
với các acid aliphatic do đó người ta thường chiết bằng methanol có mặt của các
acid yếu như acid acetic, tartric hoặc citric thay vì HCl. Đối với những chất dễ bị
biến đổi thuộc các nhóm flavan-3-ol, anthocyanin, flavanon, chalcon glycosid thì
nên làm đông khô.
Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết tủa.
Sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid thì flavonoid được
giải phóng.
1.3.3.3. Tách chiết tinh dầu
Có 4 phương pháp được áp dụng để tách chiết tinh dầu:
1. Phương pháp cất kéo hơi nước.
2. Phương pháp chiết xuất bằng dung môi.
3. Phương pháp ướp.
4. Phương pháp ép.
Nguyên tắc của sự lựa chọn trong sản xuất là: Yêu cầu về chất lượng trong sử dụng,
bản chất của dược liệu và giá thành. Phương pháp 1 được áp dụng rộng rãi nhất.

33. Đồ án tốt nghiệp
21
Nguyên tắc phương pháp cất kéo hơi nước:
Dựa trên nguyên tắc cất một hỗn hợp 2 chất lỏng bay hơi được không trộn lẫn
vào nhau (nước và tinh dầu). Khi áp suất hơi bão hoà bằng áp suất khí quyển, hỗn
hợp bắt đầu sôi và hơi nước kéo theo hơi tinh dầu. Hơi nước có thể đưa từ bên
ngoài do các nồi hơi cung cấp hoặc tự tạo trong nồi cất.
Một số lưu ý khi chế tạo tinh dầu bằng phương pháp cất:
o Độ chia nhỏ dược liệu phải phù hợp với bản chất dược liệu. Những dược liệu
chứa tinh dầu nằm trong tế bào ở sâu trong các mô, cần chia nhỏ đến tỷ lệ
thích hợp.
o Thời gian cất tuỳ theo bản chất của dược liệu và tính chất của tinh dầu. Với
tinh dầu giun cần cất nhanh, nếu không tinh dầu sẽ bị phân huỷ (30 phút).
o Tinh dầu sau khi thu được cần phải loại nước triệt để bằng phương pháp ly
tâm.
1.3.3.4. Tách chiết hợp chất tannin
Tanin hầu như không tan trong các dung môi kém phân cực, tan được trong
cồn loãng, tốt nhất là nước nóng. Hiệu suất chiết được nâng cao nếu được tác động
bằng siêu âm. Sau khi chiết bằng nước, có thể tủa tanin bằng (NH4)2SO4, lọc, lấy
tủa, hoà lại trong aceton nước (6:1), cất đến khô rồi rửa bằng ether. Trong quá trình
chiết xuất, muốn tránh sự oxy hoá thì có thể cho thêm vào dịch chiết một ít acid
ascorbic hoặc metabisulfit. Muốn tách tanin người ta thường chiết từng phân đoạn
theo độ phân cực của dung môi rồi sắc ký qua gel với Sephadex hoặc sắc ký điều
chế với chất hấp phụ là polyamid, triển khai bằng cồn nước với các độ cồn khác
nhau, cũng có thể tách bằng sắc ký giấy.

34. Đồ án tốt nghiệp
22
1.4. Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh
1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy
1.4.1.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli
a) Đặc điểm
Escherichia là trực khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không sinh bào
tử. Nhiệt độ thích hợp 370
C, pH 7.2 - 7.4. Sống chủ yếu hội sinh trong đường ruột
của người và động vật. Chúng được biết đến như là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm
trùng đường tiết niệu và các bệnh đường tiêu hóa (Trần Văn Cường, 2009).
Đặc điểm sinh hóa của Escherichia: do chúng có phản ứng lên men đường nên
dòng Escherichia cụ thể là E. coli lên men sinh hơi các loại đường lactose, fructose,
glucose, levulose, galactose, xylose, manitol; lên men không chắc chắn các loại
đường dulcitol, saccharose và salicin. Ngoài ra chúng còn có một số phản ứng sinh
hoá khác như phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính
(Trần Văn Cường, 2009).
b) Khả năng gây bệnh
Escherichia sản sinh nhiều loại độc tố: enterotoxin, vertoxin, neurotoxin. Mỗi
loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra (Trần Văn Cường, 2009).
Hình 1.2. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử

35. Đồ án tốt nghiệp
23
1.4.1.2. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella
a) Đặc điểm
Salmonella là trực khuẩn Gram âm kị khí tùy nghi, hình que, có khả năng di
động, kích thước 0.4 – 0.6 x 1 – 3 μm thích hợp phát triển tốt ở nhiệt độ 370
C, pH
7.2-7.6 (Trần Văn Cường, 2009).
b) Khả năng gây bệnh
Salmonella cũng có khả năng sản sinh ra độc tố enterotoxin, ngoài việc phá
hủy lớp niêm mạc ruột, độc tố này cũng có tác động gây tiêu chảy, độc tố thẩm xuất
chậm (DPF - Delayed Permeability Factor – độc tố không chịu nhiệt) và độc tố
thẩm xuất nhanh (RPF - Rapid Permeability Factor - độc tố chịu nhiệt) (Trần Văn
Cường, 2009).
1.4.1.3. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp.
a) Đặc điểm
Vibrio là phẩy khuẩn Gram âm, hình cong, kích thước 0.3-0.5 x 1.4-2.6 μm.
Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên
mao mảnh, kỵ khí tùy nghi. Chúng phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng
thường và môi trường kiềm (pH >7) Vibrio có thể sống được vài ngày đến 2-3 tuần.
Dễ bị diệt bởi nhiệt độ (80°C/5 phút), bởi hoá chất thông thường và môi trường axit.
Hình 1.3. Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử

36. Đồ án tốt nghiệp
24
nhiệt độ thích hợp là 370
C, có thể phát triển tốt trong môi trường kiềm (pH 8,5-
9,5), có nồng độ NaCl cao (3%) (Triệu Anh Tuấn, 2013).
Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và
catalase dương tính (Triệu Anh Tuấn, 2013).
b) Khả năng gây bệnh
Vibrio cholearae gây bệnh bằng độc tố ruột (choleragen). Đây là nội độc tố có
cấu trúc gồm đơn nguyên A (trọng lượng phân tử là 27 000 dalton, mang độc tính
cao) và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác
dụng kích thích tăng cAMP (Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat). Độc tố ruột gắn
vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng cAMP, làm
giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl- và nước gây tiêu chảy cấp tính theo (Triệu Anh
Tuấn, 2013).
1.4.1.4. Nhóm vi khuẩn Shigella spp.
a) Đặc điểm
Shigella là trực khuẩn Gram âm mảnh dài 1-3 µm, rộng 0,5-0,6 µm, không có
tiên mao, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ không sinh bào tử,
Shigella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí,
phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là
370
C (Chang Tran, 2014).
Hình 1.4. Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử

37. Đồ án tốt nghiệp
25
Trong môi trường lỏng làm đục đều. Trên môi trường đặc SS (Salmonella-
Shigella) sau 24h khuẩn lạc có đường kính khoảng 2mm, tròn lồi mặt nhẵn bờ đều.
Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella
dysenteriae không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có
Shigella sonnei lên men lactose nhưng chậm, không sinh H2S, Urease âm tính, phản
ứng Indol thay đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng
citrate âm tính (Chang Tran, 2014).
b) Khả năng gây bệnh
Các chủng Shigella đều có độc tố ruột (enterotoxin) là ShET-1 và ShET-2
chúng làm thay đổi sự vận chuyển điện giải ở các tế bào niêm mạc đại tràng, gây
tăng tiết dịch. Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh
nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại
ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio
cholerae và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là
tác dụng độc đối với tế bào. Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người, đây là một
bệnh truyền nhiễm có thể gây thành các vụ dịch địa phương. Thương tổn đặc hiệu
khu trú ở ruột già, trên lâm sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng:
đau bụng quặn, đi ngoài nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và thường có máu.
Shigella gây bệnh bằng cơ chế xâm nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và
nhân lên với số lượng lớn trong tổ chức ruột. Các Shigella đều có nội độc tố. Riêng
Hình 1.5. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử

38. Đồ án tốt nghiệp
26
trực khuẩn Shiga còn có thêm ngoại độc tố bản chất là protein. Nội độc tố Shigella
cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu.
Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn
Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae và ETEC, hoạt tính sinh học
chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào (Chang
Tran, 2014).
1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da
1.4.2.1. Nhóm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
a) Đặc điểm
Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự
biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều
môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Đặc điểm hình
thái học chung của Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động
nhờ roi ở đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men,
linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen.
Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông
thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 370
C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 -
420
C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0. Trên môi trường
đặc: khuẩn lạc thường to giống như quả trứng ốp (fried eggs), nhẵn, dẹt, trung tâm
Hình 1.6. Hình thái Pseudomonas trên kính hiển vi điện tử

39. Đồ án tốt nghiệp
27
lồi, có màu xanh ánh kim và có xu hướng mọc lan. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên
môi trường thạch máu, khuẩn lạc mọc gây tan máu hoàn toàn (β).
Một số đặc điểm sinh hóa chính của Pseudomonas aeruginosa: không lên men
glucose, có khả năng thủy giải gelatin, khử nitrate (+) oxidase (+), sản xuất
hydrogensulphide từ thiosulphate, sản xuất 2-keto-D-gluconateacid từ D-gluconate,
sử dụng glycerol, succinate, L-arabinose, formate, acetate, lactose, xylose,
mannitol, rhamnose, P-arabinose, trehalose, cellobiose, inositol, sucrose (Nguyễn
Thị Như Yến và ctv, 2011).
b) Khả năng gây bệnh
Độc tính của Pseudomonas aeruginosa chủ yếu là exotoxin của vi sinh vật bao
gồm loài Pseudomonas aeruginosa đuợc biết là gây độc trên ấu trùng của loài muỗi
cũng như lòai sâu bọ cánh phấn. Pseudomonas aeruginosa gây chết loài muỗi ở giai
đọan ấu trùng, nhộng, và theo nghiên cứu loài này cũng gây độc tố đối với họ nhà
bay. Mặc dù phuơng thức hoạt động của độc tố này chưa đuợc hiểu rõ, những loại
độc tố như của P. aeruginosa đuợc hấp thụ hấp thụ qua biểu bì của loài côn trùng và
họat động trên protein tan huyết. Dịch formulation (VCRC B426) từ sự trao đổi chất
của P. aeruginosa tiết ra như là phuơng pháp đuợc sử dụng để chống lại loài muỗi
(Nguyễn Thị Như Yến và ctv, 2011).
1.4.2.2. Nhóm vi khuẩn Enterococcus faecalis
Hình 1.7. Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử

40. Đồ án tốt nghiệp
28
Enterococcus faecalis là vi khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn phát
triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-10% CO2 và thường đòi hỏi môi
trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường. Nhiệt độ
nuôi cấy thích hợp là 370
C, một số phát triển được ở 10 tới 400
C (Dương Văn Sĩ,
2010).
Khuẩn lạc có màu hồng tới đỏ đậm khi nuôi cấy trong môi trường azide
tetrazolium chứa triphenyl tetrazolium chloride (TTC), trên môi trường thạch máu
thì khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, có màu hơi xám trong. Có phản ứng catalase và
oxidase âm tính, có khả năng lên men đường glucose, sinh acid làm giảm pH môi
trường (Dương Văn Sĩ, 2010).
b) Khả năng gây bệnh
Viêm họng, viêm hạch có mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm các van
tim. Gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng.
1.4.2.3. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus
Staphylococcus là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường
kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành
cụm (tụ) trông giống như chùm nho. Staphylococcus chủ yếu phân thành 2 nhóm:
Staphylococcus có enzyme coagulase: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
intermedius và Staphylococcus không có enzyme coagulase: Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus,
Staphylococcus capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis,
Staphylococcus warneri.
a) Đặc điểm
Staphylococcus thuộc loại vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên các
môi trường nuôi cấy thông thường. Staphylococcus có khả năng phát triển được ở
khoảng nhiệt độ dao động từ 10 tới 450
C và môi trường có nồng độ muối cao tới
10%.

41. Đồ án tốt nghiệp
29
Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau 24
giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với Staphylococcus aureus) hoặc có màu trắng
(đối với các loại Staphylococcus khác).
Trên môi trường thạch máu Staphylococcus phát triển nhanh: Khuẩn lạc
Staphylococcus aureus dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có
màu vàng. Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, có màu
trắng và thường không gây tan máu, khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 –
1,5mm, có màu đen bóng,lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 –
4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng
sáng quanh khuẩn lạc (Trần Quang Cảnh, 2012).
b) Khả năng gây bệnh
Một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với
protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Ngoài ra
phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào.
Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi
khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc.
Tụ cầu còn sản xuất một số enzyme có khả năng phá hủy mô liên kết của tổ
chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong cơ thể, phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây
chết các tế bào bạch cầu hạt cũng như đại thực bào, phá hủy lớp thượng bì. Enzyme
Hình 1.8. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử

42. Đồ án tốt nghiệp
30
này gây tổn thương da tạo các bọng nước. Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ
cầu. Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt. Các độc tố ruột
này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm. Hầu hết các chủng tụ cầu đều
sản xuất được men penicillinase (beta- lactamase). Enzyme này phá hủy vòng beta-
lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và
Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng.
1.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
1.5.1. Khái niệm
Nồng độ ức chế tối thiểu Minimum inhibitory concentration (MIC) là nồng độ thấp
nhất của chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật sau
khoảng 24 giờ nuôi cấy.
1.5.2. Ý nghĩa
Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn có thể áp dụng cho các phòng
thí nghiệm vi sinh trong các bệnh viện tuyến tỉnh, bệnh viện khu vực, bệnh viện
tuyến trung ương, các viện vệ sinh dịch tễ và các cơ sở nghiên cứu.
Phương pháp chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng độ chất diệt khuẩn nhỏ
nhất ức chế được sự phát triển của vi khuẩn giúp cho việc nghiên cứu lựa chọn và
tính toán liều dùng khi áp dụng trên người. Phương pháp này giúp cho con người
biết được nồng độ ức chế và tiêu diệt đối với từng loại vi khuẩn với nồng độ chất
diệt khuẩn thích hợp để chế tạo ra sản phẩm thương mại hoặc sử dụng trong y học
Chỉ số MIC có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất diệt khuẩn phù hợp
với từng loại vi sinh vật...Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự đoán dựa vào dữ liệu
MIC chọn được nồng độ tối ưu để làm chậm sự chọn lọc vi khuẩn kháng thuốc.

43. Đồ án tốt nghiệp
31
1.5.3. Cách xác định chỉ số MIC
Tùy theo phương pháp áp dụng mà có cách xác định chỉ số MIC khác nhau
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi
trường thạch: Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi
khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn
lạc mọc.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp
pha loãng: Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong ống nghiệm
có nồng độ thuốc nhỏ nhất không có vi khuẩn phát triển.
Phương pháp đặt khoanh giấy: MIC được tính toán bằng cách đo các vùng
ức chế

44. Đồ án tốt nghiệp
32
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm
Địa điểm thu mẫu: Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà (thuộc huyện Lạc Dương
và Đam Rông, tỉnh Lâm Đồng).
Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực
phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Toàn bộ mẫu cây Elephantopus sp. gồm : lá, thân, cành, hoa.
2.2.2. Vật liệu nghiên cứu
Vi sinh vật chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn gây
bệnh được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Y tế công cộng, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên TP.HCM và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2, bao gồm:
Nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm: E. coli 0208, E. coli O157:H7 và
Enterotoxigenic E. coli - ETEC.
Nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm: Shi. boydii, Shi. flexneri và Shi. sonnei.
Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gồm: V. cholerae, V. harveyi, V. alginolyticus và
V. parahaemolyticus.
Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm: S. dublin, S. enteritidis, S. typhi và S.
typhimurium.
Nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm Lis. innocua và Lis. monocytogenes.
Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác bao gồm : Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Enterococcus feacalis.

45. Đồ án tốt nghiệp
33
2.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất
- Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ).
- Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ).
- Ethanol (Việt Nam)
- DMSO (Dimethy lsulfoxide) (Trung Quốc)
- Ciprofloxacin (Việt Nam)
- Các loại thuốc thử : Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer,
Dragendroff, Hager, Wagner, Ninhydrin, NaOH, NaCl, chì acetate, acetic
anhydride, gelatin, chloroform, ferric chlodride, H2SO4 đậm đặc.
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.2.4.1. Dụng cụ
- Đĩa petri
- Ống nghiệm
- Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml
- Ống đong 100 ml
- Giấy lọc
- Micropipette loại 100 µl, 1000 µl
- Các loại đầu típ
- Pipet 1 ml, 10 ml
- Ống ly tâm ependoff 2 ml
- Dây cấy ria, que cấy trang
- Bình môi trường 250 ml, 500 ml,
1000 ml
- Đèn cồn
- Dụng cụ đục lỗ
- Thước đo
- Bông thấm và bông không thấm
nước
- Đũa thủy tinh
- Các loại dụng cụ khác như: bao
chịu nhiệt, kéo, giấy báo, kẹp gấp,
muỗng, dao, thun…

46. Đồ án tốt nghiệp
34
2.2.4.2 Thiết bị
- Autoclave (Huxky Đài Loan).
- Tủ ấm 370
C (Memmert Đức).
- Máy ly tâm (Tuttligen Đức).
- Máy đo UV – VIS (Hach).
- Cân phân tích (Orbital Đức).
- Máy cất nước 1 lần (Branstead Mỹ).
- Máy lắc (IKA – Đức).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật
Mục đích: Tách chiết các hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật
nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau.
Nguyên tắc: Sử dụng các loại dụng môi để tách chiết các hợp chất có trong
cây thuốc nhờ lực liên kết hóa học từ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi
mẫu cây thuốc.
Mẫu tươi được rửa sạch loại bỏ bụi bẩn rồi đem đi phơi khô, sau đó xay
thành dạng bột. Bột cây thuốc sẽ được ngâm để trích ly hợp chất với dung môi
trong 24 giờ và lặp lại từ 3 đến 5 lần cho đến khi dịch chiết đã hoàn toàn trong suốt.
Dịch chiết sẽ được loại bỏ dung môi để giữ lại phần cao chiết bằng cách cô cách
thủy ở nhiệt độ 70o
C. Cao chiết thu được sẽ được chia vào trong chai và bảo quản ở
nhiệt độ 4o
C (Atta và Mouneir, 2004).
2.3.2. Phương pháp tăng sinh
Mục đích: Hoạt hóa các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường
vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bước đầu giúp thu
sinh khối nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh
dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh

47. Đồ án tốt nghiệp
35
dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh
vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi
chất giữa vi sinh vật và môi trường.
Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được
giữ trên môi trường hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối
vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ
150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục
môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013).
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật
2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật
Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật
được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh
vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 - 50
C) để bảo quản.
Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật
luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh
vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa
là 3 tháng cấy chuyển một lần.
Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong
ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40
C
(Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng,
có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ
trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là
việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước
trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn
chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol.

48. Đồ án tốt nghiệp
36
Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml
dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa
sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40 % cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ
lạnh -150
C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức MacFahrland):
Mật độ = OD600nm x 1,02 x 109
(CFU/ml)
2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu
Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có
vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở
các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân
tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi
sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu.
Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa
9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1
. Tiếp tục từ
ống nghiệm 10-1
hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha
loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được
nồng độ cần thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013).
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết
Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào
trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khà
năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.
Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính vòng
kháng khuẩn (mm).
Cách thực hiện: Hút 0.1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ thích
hợp cho vào môi trường TSA và tiến hành trang đều cho tới khô. Sau đó, dùng một
ống trụ kim loại có đường kính 6 mm tạo các giếng trên đĩa thạch và nhỏ 100µl dịch

49. Đồ án tốt nghiệp
37
cao chiết ở nồng độ khảo sát vào, giữ yên trong vòng 1 giờ để dịch cao chiết có thể
khuếch tán vào môi trường thạch. Ủ ở nhiệt độ 370
C trong 24 giờ và tiến hành đọc
kết quả thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm) ( Ramakrishnan, 2011).
2.3.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường lỏng
(broth dilution method) được dựa theo mô tả của Burt và ctv (2006) với một vài
thay đổi.
Nguyên tắc: Dựa trên sự thay đổi độ đục của dung dịch chứa dịch cao chiết
và dịch vi khuẩn phụ thuộc vào sự hoạt động của vi sinh vật.
Phương pháp: Chuẩn bị ống nghiệm vô trùng chứa môi trường TSB, thêm
dịch cao chiết pha loãng với nồng độ khảo sát và vi khuẩn đã được tăng sinh và pha
loãng (106
CFU/ml) vào. Sau đó đem các ống nghiệm ủ ở nhiệt độ 370
C trong 24
giờ cho vi sinh vật chỉ thị phát triển. Cuối cùng quan sát sự thay đổi độ đục được
đánh giá trực quan, bất kỳ thay đổi độ đục so với ống nghiệm đối chứng được ghi
nhận là dương tính với sự hoạt động của vi sinh vật trong ống nghiệm. Nồng độ
thấp nhất mà tại đó ống nghiệm không bị đục được xác định là nồng độ ức chế tối
thiểu (MIC).
2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học
Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp của Yadav
và ctv (2013)
Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ cây
Elephantopus sp. bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa
học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được
chuẩn hoá để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất.
Định tính thành phần carbohydrate bằng phản ứng với các loại thuốc thử
Molisch, Fehling và Barfoed.
Định tính thành phần alkaloid bằng phản ứng với các loại thuốc thử Mayer,
Dragendroff , Hager và Wagner.

50. Đồ án tốt nghiệp
38
Định tính thành phần saponin bằng phản ứng tạo bọt.
Định tính thành phần anthraquinone glycoside bằng phản ứng Bontrager.
Định tính thành phần flavonoid bằng phản ứng alkaline, phản ứng Shinoda,
phản ứng ferric chloride.
Định tính thành phần phenolic bằng phản ứng với chì acetate và phản ứng
với gelatin.
Định tính thành phần tannin bằng phản ứng với chì acetate và phản ứng với
ferric chloride.
Định tính thành phần steroid bằng phản ứng Salkowski và phản ứng
Libermann – Burchard.
Định tính thành phần amino acid bằng phản ứng với thuốc thử Ninhydrin.
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu ghi nhận ở các thí nghiệm được thống kê và xử lý bằng phần
mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm Statgraphics Centurion XV. Kết quả được
thể hiện bằng giá trị trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Dữ liệu được phân tích theo
phương sai Oneway ANOVA (P < 0.05) có ý nghĩa thống kê.
2.4. Bố trí thí nghiệm
Tiến trình thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn được trình bày ở Hình 2.1

51. Đồ án tốt nghiệp
39
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu
hồi cao từ Elephantopus sp. được tiến hành như hình 2.2
Mẫu cây Elephantopus sp.
Xử lý mẫu
Tách chiết cao bằng các dung môi
khác nhau
Đánh giá hiệu suất thu
hồi cao
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
Định tính một số thành
phần hóa học
Xác định chỉ số MIC

52. Đồ án tốt nghiệp
40
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu hồi cao
Mẫu cây Elephantopus sp. tươi được rửa sạch và đem đi phơi khô. Cây khi
đã khô được đem xay thành bột. Sau đó, tiến hành cân 5 g bột cây và ngâm trong
100 ml các loại dung môi khảo sát (nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90%,
tỉ lệ 1 : 20 w/v) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Mẫu cây sau khi ngâm trong dung môi được đem lọc tinh qua giấy lọc bằng
máy lọc chân không thu được dịch lọc và bã. Bã được ngâm lại với dung môi từ 3-5
lần cho đến khi màu sắc dịch lọc không thay đổi.
Mẫu cây Elephantopus sp.
Xử lý mẫu
Ngâm dung môi (1:20) (w/v) trong
24h
Cô cách thủy 700
C
Lọc tinh
Cao chiết
Đánh giá hiệu suất thu hồi
Bã

53. Đồ án tốt nghiệp
41
Tất cả các dịch lọc thu được qua các lần ngâm được hòa trộn và đem đi cô
cách thủy ở 700
C cho đến khi đuổi hết dung môi, ta thu được cao chiết từ các loại
dung môi. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Hình 2.3. Dịch chiết mẫu bằng nước
Hình 2.4. Dịch chiết mẫu bằng ethanol 50%
Hình 2.5. Dịch chiết mẫu bằng ethanol 70%

54. Đồ án tốt nghiệp
42
Hình 2.6. Dịch chiết mẫu bằng ethanol 90%
Tiến hành đánh giá hiệu suất thu hồi cao ở mỗi nghiệm thức bằng công thức:
Hiệu suất thu hồi (%) = × 100
Trong đó: M’: khối lượng cốc sau khi cô mẫu (g)
M : khối lượng cốc ban đầu (g)
m: khối lượng mẫu ban đầu (g)
M’
− M
m

55. Đồ án tốt nghiệp
43
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính
kháng khuẩn của cao chiết Elephantopus sp.
Sau khi thu được cao chiết từ các loại dung môi khác nhau, tiến hành quy
trình khảo sát hoạt tính như hình 2.7
Hình 2.7 : Sơ đồ khảo sát hoạt tính của cao chiết
Cao chiết từ cây
Elephantopus sp.
Dịch cao chiết
(100 mg/ml)
Nhỏ 100 μl dịch chiết (100 mg/ml)
vào các giếng trên môi trường TSA
Vi sinh vật chỉ thị
Tăng sinh trong môi trường TSB
Lắc 150 vòng/phút trong 18 giờ
Đo quang phổ ở 600 nm và pha loãng
VSV trong nước muối sinh lý
VSV đạt nồng độ 10
6
CFU/ml
Cấy trang lên môi trường TSA
Ủ 37
0
C trong 24 giờ
Đọc kết quả

56. Đồ án tốt nghiệp
44
Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai thủy tinh chứa 10 ml môi
trường TSB hoặc TSB + 1,5% NaCl (đối với các chủng Vibrio spp.) Sau đó, chai
được lắc ở 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng trong 18 - 24 giờ. Tiến hành đo quang
phổ dịch tăng sinh ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ, sau đó dịch vi khuẩn
được pha loãng để đạt 106
CFU/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha loãng nhỏ lên mặt
đĩa môi trường thạch TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô
hoàn toàn. Các đĩa thạch sau đó được đục 3 lỗ đường kính với mỗi lỗ là 6 mm.
Cao chiết Elephantopus sp. được pha trong DMSO 1% ở nồng độ 100 mg/ml.
Hút 100 μl dịch cao chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa môi trường TSA đã được
đục lỗ trước đó. Để yên trong 1 giờ và đem ủ ở 370
C trong vòng 24 giờ. Đối chứng
âm sử dụng DMSO 1%, đối chứng dương sử dụng Ciprofoxacin ở nồng độ 500
µg/ml. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết
ethanol 70% từ cây Elephantopus sp.
Kết thúc thí nghiệm 2 xác định được cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao
nhất và cao chiết này được sử dụng để xác định chỉ số MIC đối với các chủng đối
kháng. Tiến trình khảo sát MIC được trình bày ở Hình 2.8

57. Đồ án tốt nghiệp
45
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát MIC
Thuyết minh quy trình:
Cao chiết ethanol 70% được hòa tan với DMSO 1% thành dãy nồng độ theo
cơ số 2 với nồng dộ thấp nhất là 12.5 mg/ml và nồng độ cao nhất là 100 mg/ml.
Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai thủy tinh chứa 10 ml môi
trường TSB hoặc TSB + 1,5% NaCl (đối với các chủng Vibrio spp.) Sau đó, chai
được lắc ở 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng trong 18 - 24 giờ. Tiến hành đo quang
phổ dịch tăng sinh ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ, sau đó dịch vi khuẩn
được pha loãng để đạt 106
CFU/ml.
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 3ml môi trường TSB, sau đó hút 1ml dịch cao
chiết các nồng độ và hút thể tích dịch vi khuẩn ở mật độ 106
CFU/ml vào các ống
nghiệm. Tiến hành ủ ở 370
C trong 24 giờ và quan sát kết quả. Đối chứng âm sử
dụng ống nghiệm chứa môi trường TSB và dịch vi khuẩn, đối chứng dương sử dụng
ống nghiệm chứa môi trường TSB và dịch cao chiết. Mỗi nghiệm thức được lặp lại
3 lần.
VSV chỉ thị
Tăng sinh
Pha loãng để đạt
nồng độ
10
6
CFU/ml
Ống nghiệm chứa
môi trường TSB
Ủ 37
0
C trong 24 giờ
Đọc kết quả
Cao ethanol 70%
Pha loãng thành dãy
nồng độ theo cơ số 2
Đo OD

58. Đồ án tốt nghiệp
46
2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ
cây Elephantopus sp.
Cao chiết của các loại dung môi thu được từ cây Elephantopus sp. được sử
dụng để xác định thành phần hóa học và tiến trình được thực hình theo Hình 2.9
Hình 2.9 Sơ đồ tiến trình định tính thành phần hóa học
Thuyết minh quy trình:
Cao chiết các loại dung môi từ cây Elephantopus sp. được chia làm 2 phần.
Phần thứ nhất được ngâm trong dung dịch H2SO4 10% trong khoảng 30- 60 phút
sau đó tiến hành lọc hết cặn dùng để thực hiện các thử nghiệm kiểm tra nhóm
alkaloid. Phần thứ hai sẽ pha trong DMSO 1% cho tan hoàn toàn sau đó tiến hành
pha loãng và lọc bỏ cặn thu dịch, dịch này đem phân tích, định tính một số thành
Ngâm trong H2SO4 10% Ngâm trong DMSO 1%
Lọc Lọc
Alkaloid
thử nghiệm thử nghiệm
Carbohydrate
Saponin
Anthraquinone
glycoside
Flavonoid
Phenolic
Tannin
Steroid
s
Amino acid
Cao chiết từ cây
Elephantopus sp.

59. Đồ án tốt nghiệp
47
phần hóa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, anthraquinone
glycoside, steroid, phenolic, tannin.
2.4.4.1. Định tính thành phần carbohydrate
- Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vào 5-6
giọt thuốc thử Molisch, nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm và
quan sát sự hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách.
Hình 2.10. Thử nghiệm Molisch
- Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml
thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào, đun cách thủy trong 5 phút và quan sát
sự xuất hiện kết tủa màu đỏ của CuO.

60. Đồ án tốt nghiệp
48
Hình 2.11. Thử nghiệm Fehling
- Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc
thử Barfoed, đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và quan sát sự hình
thành kết tủa màu đỏ gạch.
2.4.4.2. Định tính thành phần alkaloid
- Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho vài giọt
thuốc thử Mayer. Quan sát kết tủa màu đục tạo thành.
- Thử nghiệm Dragendroff : Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài
giọt thuốc thử Dragendroff và quan sát sự hình thành kết tủa màu vàng cam.
- Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử
Hager và quan sát hình thành kết tủa màu vàng.
- Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc
thử Wagner và quan sát sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ.

61. Đồ án tốt nghiệp
49
Hình 2.12. Thử nghiệm Dragendroff.
2.4.4.3. Định tính thành phần saponin
Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh và quan
sát sự hình thành bọt ổn định.
Hình 2.13. Thử nghiệm tạo bọt