1. Chương I:Tách và tinh chế Enzym
Câu 1: Enzym
E là chất xúc tác sinh học có bản chất là pr hoặc là pro có hoạt tính xúc tác.
Tính chất chung: E có bản chất là protein, nên có đủ tính chất của protein (M cao, không qua màng bán
thấm, biến tính bởi nhiệt, tính sinh học đặc trưng, thích ứng sự thay đổi môi trường, tan trong nước…)
T/c ưu việt của E khiến E khác với các chất x.tác hóa học khác:
-Cường lực xúc tác lớn: ở đk thích hợp, hầu hết các p/ứng đc xúc tác E xảy ra vs vận tốc gấp 10 8-1011 lần
p/ứng k có chất xúc tác. Vd: 1 phân tử β-Amylase có thể phân giải 4000 lk glucoside (tinh bột)/ 1s.
- Tính đặc hiệu cao: mỗi E chỉ xúc tác chuyển hóa một hoặc một số cơ chất nhất định theo 1 kiểu phản ứng
nhất định. Hiệu suất thu sản phẩm chính cao, không tạo sản phẩm phụ.
Vd: Urease phân giải ure, saccharase phân giải saccharose, Maltase phân giải maltose.
Các dạng đặc hiệu:
1....Đặc hiệu cơ chất
• Đặc hiệu tương đối : E có khả năng phân cắt 1 lk hóa học of 2 cấu tử tạo lk đó. Vd: lipase phân cắt
lk este, peptidase phân cắt lk peptit
• Đặc hiệu nhóm: E xúc tác lên 1 kiểu lk hóa học nhất định vs đk 1 trong 2 cấu tử tạo lk phải có cấu
tạo xác định
Vd:
+ Carboxyl – Peptidase; lk phân giải phải là lk peptide (-CO-NH); lk này phải cạnh nhóm –
COOH tự do.
+ Amino – peptidase: cắt lk peptid (-CO- NH- ); lk này có nhóm amin (NH3) tự do bên cạnh
gần lk
• Đặc hiệu tuyệt đối: Điều kiện E : cả 2 cấu tử tạo lk phải có cấu tạo nhất định
• Ngoài ra, còn có đăc hiệu đồng phân quang học: xúc tác cho 1 trong 2 dạng D hay L. Vd:
Fumarat_hydrotase xtac thủy phân dạng L_ax Malic
• Đặc hiệu đồng phân hình học: xúc tác cho 1 trong 2 dạng đphh (cis-trans). Vd: Fumarat_hydrotase
xtac thủy phân dạng trans ax fumaric
2...Đặc hiệu kiểu phản ứng: Mỗi E chỉ xúc tác chuyển hóa cho 1 trong các kiểu phản ứng nhất định
- E t/d trog đ.kiện êm dịu.E thg tác dụng thích hợp ở 20-45C, P thường, pH acid yếu, kiềm yếu or trung
tính.
- Các chế phẩm E đc sản xuất từ nguồn nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền: dạ dày,lục phủ ngũ tạng ĐV, tv,vsv...
- Vì khi có E, giảm đáng kể năng lượng hoạt hóa của phản ứng (năng lượng hoạt hóa là năng lượng cần thiết
cung cấp cho phản ứng xảy ra)
Vd: phản ứng phân giải H2O2 è H2O + O2; Khi không có xúc tác thì Qhh = 18000 calo/ ptg; Xúc tác vô cơ
(platin) Qhh = 11700 calo/ ptg; E catalase Qhh = 5500 calo / ptg.
Câu 2 Các Bước cơ bản thu một chế phẩm E từ:
A. VSV:
B1: Phân lập, tuyển chọn, định tên:
-Phân lập: từ đất, nc , kk, nc thải, từ một số sản phẩm hoặc từ bộ sưu tập giống có sẵn của đơn vị.
Vd: Muốn thu đc E xenllulase, ta phân lập VSV từ : gỗ mục, nc thải nhà máy giấy, nc thải SH...
____________ Protease, ________________: sp thải các nhà máy sx thịt, cá...
-Tuyển chọn: Chọn ra các chủng VSV có khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh, khả năng sth E mong
muốn cao và ổn định.
-Định tên vsv: Có 3 pp: +Theo đặc điểm hình thái
+ Đặc điểm sinh lý,sinh hóa
+ Sinh học phân tử
B2: Cải tạo giống vsv: Có thể dùng các tác nhân đột biến tác động nên bộ máy di truyền của tế bào vsv để
tạo ra các dạng biến chủng có khả năng sinh tổng hợp đặc biệt cao. Các phương pháp cải tạo giống:

2. -Đột biến bằng các tác nhân vật lý, hóa học:
+Các tác nhân vật lí: tia tử ngoại(UV), tia X, tia ɤ...
+ Tác nhân hóa học: Các hợp chất chứa Nitơ như: nitrozometylguanidin, metyldicloroetyl...
-Đột biến bằng pp SHPT:
+ Phương pháp biến nạp: là sự truyền ADN từ TB cho sang TB nhận, có thể xảy ra trong ống nghiệm khi
cho TB nhận txuc trực tiếp vs dịch chiết TB cho mà k cần sự txuc trực tiếp giữa các TB.
TB nhận có thể nhận bất kì AND nào, k đòi hỏi phải là AND từ các nòi có quan hệ họ hàng. Tuy nhiên, 1
TB chỉ có thể nhận 1 số đoạn ADN nhất định (thường là k quá 10 đoạn).Các đoạn ADN truyền đi trong biến
nạp có phân tử lượng 106 – 107 và phải có cấu trúc xoắn kép.
+ Phương pháp tiếp hợp: Vật liệu di truyền ADN chỉ đc truyền từ TB cho đến TB nhận khi 2 TB txuc vs
nhau, do vậy những sinh vật có k/nag biến nạp thì k có k/nag tham gia tiếp hợp.
Hiện tg tiếp hợp mới chỉ đc nghiên cứu ở một số loài VK như E .coli, salmonella...
+ Phương pháp tải nạp: Vật liệu di truyền ADN đc truyền từ TB cho đến TB nhận nhờ vai trò trung gian của
thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn ADN dc chuyển từ TB cho sang TB nhận txuc vs
ADN của TB nhận, do đó làm biến đổi t/c di truyền của TB nhận.
B3: Nuôi vsv: Có 2 pp:
• PP nuôi cấy bề mặt: VSV phát triển tên b.mặt mt dd ở thể rắn đã đc làm ẩm và vô trùng. Mt dd bao gồm
các nguyên liệu tự nhiên: cơm gạo, khô cám, cám mì, tấm gạo, ngô (chiếm 90-95%) có bổ sung trấu nhỏ
hoặc mùn cưa (5-10%) để làm xốp canh trường, oxy kk dễ xâm nhập, tạo ĐK cho vsv phát triển tốt.
MT: Cám + trấu + nc làm ẩm đến 55-65%hấp thanh trùng ở : tº =121 ºC , 1at, 1hđể nguôi ở tº=3040ºCB/sung VSV Trải khay (3-5cm)Nuôi ở tº=28-32 ºC, t/g: 36-48hSấy khô canh trường.
-Ư/đ:
+ Đơn giản, nồng độ E cao
+ Canh trường sau khi sấy khô dễ vận chuyển, tránh đc nhiễm trùng toàn bộ khối canh
trường
+ It tốn điện năng
-Nhc điểm:
+ Chiếm nhiều dtich nuôi cấy
+Khó cơ giới hóa và tự động hóanăng suất thấp, tốn nhiều lao động thủ công.
• Phương pháp nuôi cấy bề sâu:
-VSV phát triển trong mt lỏng, có sục khí l/tục
-Tp mt dd:
+ Nguồn C: glucose, mantose, rỉ đường or tinh bột đã phân hủy sơ bộ. Ngoài ra có thể use nguồn phi gluxit:
glycerol. Các ax béo...
+Nguồn N: Nitơ vô cơ: (NH4)2SO4, NaNO3,NH4NO3, ure...
Nitơ hữu cơ: nc chiết malt, nc chiết ngô, cao ngô, cao n.men, pepton, khô dầu...
+Muối khoáng và VTM: MgSO4,K2HPO4, KH2SO4, K2SO4, FeSO4.. VTM: B1,B12, B8 (biotin)
MT lên men đc dưa vào thùng LM đưa trực hơi nóng vào thanh trùng ở tº 118-125 trong 45-60p hạ tº
xg và bổ sung VSV, nuôi ở đk tº, p, pH và thời gian thích hợp. Quá trình nuôi cấy đc thực hiện trong đk sục
khí l/tục và vô trùng tuyệt đối
-Ư/đ: + Có tính l/tục, tiết kiệm đc d/tích sx
+ Dễ cơ giới hóa và tự động hóa, do đó năng suất cao
+ Sử dụng hợp lí các chất dinh dưỡng của môi trường
Nhc điểm: + Nồng độ E trong mt thấpphải cô đặcgiá thành cao
+ Tốn nhiều điện năng do sục khí l/tục
+ Dẽ bị nhiễm trùng toàn bộ khối
Bước 4: Tách và tinh chế E:
*Các dạng chế phẩm E:

3. 1, Chế phẩm thô: Có thể sử dụng trong một số lĩnh vực mà k làm ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị của sản
phẩm như: công nghiệp sẩn xuất cồn, công nghiệp thuộc da, công nghiệp giấy, xử lý môi trường...
-Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt: Canh trường rắn sau khi nuôi cấy vsv đc sấy ở tº =40 ºC đến độ ẩm
còn khoảng 12% sẽ thu đc chế phẩm dạng thô.
-Chế phẩm thô từ canh trường lỏng: mt nuôi cấy vsv sau khi lọc, nồng độ E rất thấp nên bc đầu ng ta phải
cô đặc. Dịch lọc từ canh trường có nồng độ chất khô từ 4-6g/l đc cô đặc chân không (hoặc cô đặc lạnh
đông) để đạt tới nông độ chất khô là 30-50g/l. Sau đó bổ sung chất bảo quản: NaCl, glyxerol, sorbitol,
natribenzoat... thu đc chế phẩm thô dạng lỏng. Hoặc có thể bổ sung chất ổn định, sau đó sấy phun ở thiết bị
có nhiệt độ đầu vào 120 ºC và đầu ra 40 ºC để thu chế phẩm thô dạng bột.
2, Chế phẩm kĩ thuật: là chế phẩm đã đc tinh chế sơ bộ, trong đó một số pro và E đã đc loại bỏ. Chế phẩm
kĩ thuật thường đc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để giữ màu sắc, hương vi và chất lượng sản
phẩm.
3,Chế phẩm tinh khiết: dùng các biện pháp để loại bỏ hết các tạp chất, thu đc 1 E duy nhất.
*Khu trú của E trong tế bào: 3 nhóm chính:
-E ngoại bào: E đc tổng hợp ra ở bên trong tế bào rồi sau đó mới tiết ra ngoài mt trong mt nuôi cấy chìm.
Chủ yếu là E hydrolase
-E nội bào: E đc sth và sử dụng ở beeb trong tế bào dưới dạng liên hợp, lk hoặc bị nhốt trong các bào quan
của cơ thể.
-Các E periplamic:là những E nằm ở xoang ngoài màng sinh chất nhưng trong màng tế bào
* Quá trình tách một E: phân ra làm 3 giai đoạn lớn:
-Trích ly: cho một hỗn hợp các phân tử hòa tan
-Phân đoạn hỗn hợp: dựa vào độ hòa tan, thu đc 1 họ các phân tử.
-Tinh sạch bằng các phương pháp hóa lí, sinh học để thu đc một phân tử E sạch
1, Trích ly: thực tế việc trích ly E chủ yeeua dàng cho E nội bào và E periplamic
Các phương pháp trích ly:
-Phương pháp cơ học:
+Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm: thường dùng trong phòng thí nghiệm, dựa theo nguyên tắc sóng siêu âm
cđ theo đường hình sin với tần suất cao tạo nên vi bọt (18KHz-1MHz). Các vi bọt lớn lên trong pha dãn và
xẹp đi trong pha dãn của sóng âm.
+Phá hủy bằng mấy đồng hóa cao áp: Thiết bị phá vỡ tế bào phổ biến là dạng Manton-Gaulin APV. Loại
này gồm 1 bơm đẩy để đưa dịch huyền phù tế bào (khoảng 12w/v) qua 1 van kiểm tra tới xilanh bơm. Tế
bào đc đẩy vs áp suất tới 150Mpa và với vận tốc dòng tới 10000l/h qua một van xả có miệng hẹp. Các tế
bào bị va chạm, nén lại, vỡ ra giải phóng ra các chất chứa bên trong tế bào khi làm giảm áp đột ngột qua
van kiểm tra. Các E nội bào tự do có thể đc giải phóng chỉ cần 1 lượt qua máy đồng hóa, nhưng các E lk vs
màng cần nhiều lượt để có thêt thu đc hiệu quả mong muốn
+ Nghiền với chất có ma sát: sử dụng trên quy mô công nghiệp: Dịch huyền phù tế bào đc lắc cùng vs các
hạt thủy tinh hoặc các hạt thép nhỏ thì TB sẽ bị phá vỡ do lực cắt của chất lỏng và
do va chạm với các hạt này.
+Phá vỡ TB bằng phương pháp lạnh đông: Huyền phù TB dưới dạng bột nhão được làm lạnh đông ở -20 ºC
rồi nén dưới áp suất cao qua các lỗ hẹp của máu nén, các TB sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể
tích cũng như do lực cắt của các tinh thể đá. Phương pháp này đắt tiền và thường đc use cho quy mô fong
TN
-Phá vỡ TB = các phương pháp k fai cơ học:
+Sốc thẩm thấu: Dịch huyền phù TB đc đưa vào 1 mt nhược trương (20% saccarose) trong nc ở nhiệt độ
40ºC thì sẽ làm giải phóng ra 1 số hợp phần của TB.
+Sử lí kiềm: pH 11.5-12.5 sẽ làm phân hủy màng TB, giải phóng E, áp dụng cho các E kiềm tính.
+Sử dụng chất tẩy rửa:Các chất tẩy rửa ở dạng ion: laurysulfat, Tween, trion trong đk pH, lực ion và tº xđ sẽ
tổ hợp vs lipoprotein màng tạo ra các mixen do đó làm màng TB trở lên có tính thấm.

4. +Dung giải = E: Lysozim thường thủy phân lk β_1,4 glusosid của các peptidoglycan màng TB VK gram(+)
và (-). Lysozym lk vs EDTA để tạo phức vs Ca làm phá hủy TB, đặc biệt là vỏ VK gram(-).
2, Phân đoạn hỗn hợp: bằng các phương pháp kết tủa:
-Kết tủa đẳng điện: pro là chất lưỡng cực, chúng có cả nhóm acid và nhóm base. Mức độ hòa tan của
enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, các Pro_E sẽ kết hợp vs
nhau tạo ra kết tủa. Lọc hay ly tâm để thu lại hoặc loại bỏ phần kết tủa. Phần lớn protein có điểm đẳng điện
ở
khoảng
acid,
vì
thế
quá
trình
này
gọi
là
kết
tủa
acid.
Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô
công nghiệp. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi
hoạt tính enzyme. Như vậy thiết bị phản ứng càng lớn. Khi đó, thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết
tủa càng dài, enzyme càng dễ bị biến tính.
-Kết tủa đẳng điện = muối trung tính (pp điện tích):
+Phân tử protein bền nhờ 2 lớp vỏ: vỏ nc và vỏ điện tích. Khi phá vỡ 2 lớp vỏ, các phân tử pro lk lại tạo
thành kết tủa.
+Mỗi pro_E sẽ có một khoảng nồng độ muối mà pro_E đó bị kết tủa hoàn toàn
+Sau khi kết tủa phải loại muối: Có 2 cách loại muối: (1)Lọc qua sephatex G.25 (2)Thẩm tích (bán thấm)
-Kết tủa E bằng dung môi hữu cơ:
+Nguyên lý: Khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch E là giảm hằng số điện môi và tăng lực hút tĩnh điện
giữa các phân tử E tạo thành kết tủa. Dung môi hữu cơ thường dùng phổ biến nhất là: etanol; isopropanol;
axeton. Mỗi E kết tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau.
Vd: Protease kết tủa = etanol (76-78% v/v)
Glucoamylase kết tủa =etanol (45% v/v)
+Ưu điểm: E đc làm sạch cao hơn kết tủa bằng muối do cách loại dung môi h/c dễ dàng hơn loại muối
+Nhc điểm: Dễ làm biến tính protein, kết tủa bằng dung môi phải xảy ra ở nhiệt độ thấp <0 ºC. Chỉ thực
hiện trong phòng thí nghiệm,k use dụng cho quy mô công nghiệp do rất dễ gây cháy.
3, Tinh chế E:
<>Phương pháp sắc kí:
-Sắc kí là sự di chuyển của các chất hòa tan khác nhau trong một pha động đã đc gắn trên 1 pha tĩnh trạng
thái rắn ở các vị trí khác nhau.
-Dựa trên sự tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh: tương tác hấp phụ, tương tác ion, tương tác kỵ nc,
tương tác kiểu rây phân tử hoặ c tưpng tác đặc hiệu sinh học.
-Có 4 loại sắc kí:
1 Sắc kí trao đổi ion:
-Nguyên lý: Dựa vào sự trao đổi ion giữa pro tích điện và các ion của chất nhựa trao đổi ion. Pro trái dấu đc
giữ lại cột, pro cùng dấu bị rửa trôi khỏi cột. Sau đó sử dụng dung dịch đệm thích hợp và NaCl có nồng độ
tăng dần để đẩy pro_E ra khỏi cột. Pro_E nào có ái lực vs nhựa cột yếu nhất sẽ bị đẩy ra ngoài cột trc.
-D/dịch đệm thường dùng: đệm phosphate, borat, xitrat, axetat...
-Các E khác nhau sẽ đc chiết khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đó mỗi phần chiết chứa E cần
thu có nồng độ cao nhất.
-Các loại nhựa: DEAE_X (Dietyl amino etyl_X)
CM_X ( Cacboxyl metyl_X)
Vd: DEAE_cellulose: nhựa trao đổi anion
CM_cellulose: nhựa trao đổi cation.
2 Sắc kí loại trừ phân tử ( sắc kí lọc gel):
-Nguyên lí: Sắc kí lọc gel là sự tách các phân tử có kích thước khác nhau, đc tiến hành dựa trên cơ sở có
khả năng chui vào bên trong lỗ các hạt gel.
-Gel đc use rộng rãi nhất là: sephadex và polyacrylamide:
+Sephadex:

5. Là một loại dextran có lk ngang, trung hòa điện tích nên k có tương tác vs anion và cation, k tan trong nc
nhưg khi cho vào nc sẽ ngậm nc trương nở tạo thành gel.
Các hạt gel sephadex chứa nhiều mắt lưới to, nhỏ tùy theo mức độ lk, dựa vào độ lk ng ta chia ra làm 5
loại: G_25, 50, 70, 100, 200
Khi cho một hỗn hợp chất chảy qua cột cí chứa gel sephadex đã trương nc, những p/tử có kích thước lớn di
chuyển phía ngoài hạt gel, do đó sẽ ra khỏi cột. Những phân tử nhỏ hơn mắt lưới của hạt gel sẽ đi vào trong
lỗ hạt gel vả ra khỏi cột sau cùng ( tùy theo kích thước)
+Polyaccrylamide: cấu trúc có nhiều lk ngang tạo ra 1 màng xốp. Các chất phải chui qua gel mới ra đc, vì
vậy những chất nào có phân tử lượng nhỏ ra trc, lớn ra sau.
3 Sắc kí ái lực:
-Nguyên lý: Dựa vào khả năng lk đặc hiệu và thuận nghịch của 1 E và 1 phối tử đã đc gắn bằng lk đồng
hóa trị vào 1 chất mang k hòa tan chứa trong mỗi cột. Khi cho 1 hỗn hợp chứa E muốn làm sạch đi qua thì
chỉ có E quan tâm đc giữ lại, còn tất cả các E k tg tác vs phối tử sẽ bị trôi ra khỏi cột. Tiếp đó E sẽ đc rửa
giải ra bằng các phương pháp khác nhau
-Chất mang (pha tĩnh): phải có một số đặc điểm sau:
+Khog tan trong pha động, bền về mặt hóa học và sinh học
+Có độ cứng cơ học, tính háo nc, tính thấm
+Có tương tác đặc hiệu
+Chứa nhiều nhóm chức có khả năng thay đổi khi hoạt hóa trong các đk nhẹ nhàng
Các chất mang điển hình: agarose, các dẫn xuất của cellulose, dextran, thủy tinh xốp, polyacrylamide...
-Phối tử là những chất tương tự cơ chất, có ái lực đặc hiệu vs E
4 Sắc kí đẳng điện: Pro_E chạy trong điện trường trên một miếng gel.Mỗi pro_E sẽ di chuyển ch đến khi
nó đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của nó. Tại điểm này, tinh di động trong điện trường của pro_E bằng 0,
pro_E dừng lại, ng ta thu lại dưới dạng băng.
<>Phân tích lỏng-lỏng:
-Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố khác nhau của các protein trong 1dd 2 polyme k trộn lẫn nhau. Hai
polyme này tự phân thành 2 pha riêng biệt, mỗi pha hòa tan đc 1 trong các loại pro. Sự phân tách sẽ phụ
thuộc vào khối lg phân tử và nồng độ các polyme.
-Các polyme thường use: polyetylenglycol/dextran hoặc polyetylenglycol/sulfatamon
<> Phương pháp lọc màng siêu lọc (pp lọc dòng ngang):
-Nguyên tắc:+Dựa vào khối lg phân tử of protein
+Sử dụng màng có kích thước lỗ lớn để loại bỏ các tạp chất có M>M pro
+Sau đó, dùng màng lọc có kích thước nhỏ loại tạp chất có M<M pro.
Vd: ɤ_amylase có M=45kDa cần loại các chất có M=60 và 30kDa
-Phương pháp này: dd E vừa đc tinh sạch, vừa đc cô đặc nên hoat độ E/ml sẽ cao hơn (nhưng hoạt độ tổng
sẽ thấp hơn ban đầu)
-Ưu điểm: Sử dụng đc trên quy mô lớn, có thể cô đặc đc E
Bước 5: Kiểm tra độ tinh khiết của E bằng phương pháp điện di trên gel
-Điện di là quá trình dịch chuyển của các phân tử điện tích trong điện trường. Tốc độ dịch chuyển của các
phân tử E phụ thuộc điện tích, khối lượng phân tử và kích thước.
-Một lượng nhỏ các mẫu pro_E đc đưa lên chất mang là một khối gel xốp. Dưới tác dụng của 1 hiệu điện
thế, các phân tử khác nhau của hỗn hợp mẫu sẽ chuyển động qua khối gel vs vận tốc khác nhau nên có vị
trí các băng khác nhau khi nhuộm màu gel hoặc chụp phản xạ.
-Các gel thường use:
+Gel poluacrylamide: đc tạo ra bằng đồng trùng hợp từ đơn phân acrylamit và tác nhân tạo lk ngang
biarylamit.
+Gel tinh bột
+Gel argarose

6. +Gel axetacellulose
Trong đó gel polyacrylamit và gel tinh bột thường đc use để tách pro và pro_E còn gel argarose có kích
thước lỗ gel lớn hơn nên đc dùng để tách DNA.
-Điện di trên gel polyacrylamit có mặt SDS_PAGE
+Nguyên lý: β_mercaptoetanol khử các cầu disulfua và natri dodecyl sulfat làm cho pro bị biến tính, các
chuỗi polypeptit dãn ra và đc phủ kín bằng p/tử SDS tạo ra một polyanion có mật đọ điện tích trên 1 đơn vị
chiều dài hầu như k đổi, và k phụ thuộc vào trình tự của các chuỗi polypeptit.
Dưới tác dụng của 1 điện trường, các pro đã đc SDS phủ kín (polyanion) sẽ di chuyển tren gel
polyacrylamit về phía cực (+), do các mắt lưới của gel, mạch polypeptit càng dài di chuyển càng chậm
+Điện di thường đc tiến hành trên một bản gel có kích thước 10cm x 10cm x (0.7-1)mm. Bản gel gồm 2
lớp: (1)gel cô: có t/d làm đậm đặc mẫu và làm tăng sự tách các băng, gel cô có các giếng để mẫu. Gel cô
thường ít lk ngang và có pH thấp hơn gel tách. (2) Gel tách: có tác dụng tách băng rõ rệt hơn, nhất
lafkhicacs chất có vận tốc dịch chuyển gần nhau
-Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình điện di:
+pH và dung dịch đệm:
+Nhiệt độ:
+Mạng gel:
Bước 6: Đánh giá chế phẩm E:thông qua xác định hoạt độ E:
-Hàm lượng pro tổng: lượng pro có trong một phân đoạn, bằng tích nồng độ một phần của phân đoạn vs
tổng thể tích của phân đoạn đó
-Mức độ tinh sạch T giữa 2 giai đoạn: là tỷ lệ giữa hoạt độ riêng của 2 giai đoạn đó
-Hoạt độ tổng: hoạt độ của E trong phân đoạn đó, bằng tích hoạt độ cuả E có trong lượng mẫu đc xét
nghiệm vs tổng thể tích của phân đoạn đó.
-Hoạt độ riêng: Lượng E đc biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ/một đơn vị khối lượng E (UI/mg; UI/g). Được
xđ bằng cách chia hoạt độ tổng cho pro tổng. Hoạt độ riêng tăng trong quá trình tinh sạch và k đổi khi một
E đã hoàn toàn sạch.
Câu 3: Ứng dụng của E
1_Ứng dụng trong công nghiệp
1.1 Công nghiệp thực phẩm
*Protease:
-Renin: đông tụ sữa trong sản xuất phomat, tạo màu và hương vị cho phomat
-protease: làm mềm thịt trong công nghệ đồ hộp, thịt cá.
-protease+amylase: ứng dụng trong sx bánh mỳ, bánh quy
-Protease trung tính: ứng dụng tạo màu và hương trong sx bia...
-Ứng dụng trong sx nc mắm, tương, nc chấm.
*Amylase:
-Sx glusose, maltose
-Công nghiệp sx rượu, bia, dung môi hữu cơ, ax hữu cơ, kháng sinh...
-SX tương, các loại bánh
*Pectinase:
-Nâng cao hiệu suất chiết dịch quả=polygalacturonase
-Làm trong rượu vang và rượu champanh
-Loại bỏ lớp vỏ pectin của cafe và ca cao
1.2 Công nghiệp thuộc da:
-Protease kiềm tẩy trắng lông, vết máu
-Lipase loại mỡ
-Protease ax tính: làm mềm da trc khi thuộc da
1.3 Công nghiệp xà phòng:

7. -Protease trung tính: sx xà phòng tắm
-Protease kiềm tính+lipase: sx xà phòng giặt, rửa
-Amylase,mannase: sx xà phòng giặt
-Cellulase làm xốp, mềm b.mặt vải: sx xà phòng xả
1.4 Công nghiệp giấy:
1.5 Công nghiệp dệt:
-α_amylase: tẩy hồ tinh bột của vải trc khi nhuộm, in hoa
-protease: tẩy keo lụa tơ tằm
1.6 Công nghiệp khai thác dầu khí:
-Mananase sử dụng làm giảm độ nhớt của galactomanan, làm cho mũi khoan k bị đứt gãy do t/d của áp
suất thủy tĩnh
-Dextran_saccarase: sx dextran từ saccarase có t/d làm loãng bùn trong khai thác dầu khí
1.7 Công nghiệp dược: Penicillin acrylase: LM sx penicillin bán tổng hợp 6_aminopenicillin axit (6APA)
và 7ADCA từ đó tổng hợp các kháng sinh thế hệ thứ 2,3,4,5 trong đó hiệu quả nhất là Ampycillin và
armoxylin
1.8 Y tế:
-Chẩn đoán bệnh: Aldolase trong huyết thanh tăng-> viêm gan
Greatin kinase trong huyết thanh tăng->nhồi máu cơ tim
-Chữa bệnh: pepsin. Trypsin, chimotrypsin->men tiêu hóa
Lumbro kinase, treptokinase: làm tan máu đông
Bromelin, papain: làm lành vết thương nhanh
1.9 Chăn nuôi: Amylase, protease, phytase, mananase là tp có trong thức ăn bổ sung cho lợn gà,
cellulase: TĂ cho trâu, bò..
1.10
Xử lí môi trường:
-Xử lí chất thải rắn giàu cellulose
-Xử lí nc thải giàu hợp chất hữu cơ
Chương 2: E tái tổ hợp
Câu 4 Enzym tái tổ hợp là gì? Các bước thu enzym tái tổ hợp
*Enzym tái tổ hợp là enzym do một sinh vật có ADN biến đổi sản xuất ra nhờ thêm vào hệ gen của vsv đó
đoạn ADN mã hoá cho protein quan tâm
-AND tái tổ hợp là một đoạn AND nhân tạo được tạo thành nhờ việc kết hợp 2 trình tự AND khác nhau
trong 1 phasmid

8. -Plasmid là một phân tử ADN xoắn kép, khép vòng, không nằm trong nhân thường có mặt ở vkuẩn đôi khi
cũng ở 1 số sinh vật có nhân hoàn chỉnh
*công nghệ protein tái tổ hợp
-Là kĩ thuật quan trọng trong CNSH, ở đó gen quan tâm được tách dòng và chuyển vào tế bào chủ thích
hợp, kĩ thuật này đảm bảo sx 1 lượng lớn protein
-Để sx được protein tái tổ hợp cần biết gen mã hoá cho nó, thiết kế được vector chọn tế bào chủ thích hợp
-Tìm điều kiện tối ưu cho sự phát triển của hệ thống sống tái tổ hợp đảm bảo năng suất biểu hiện gen tái tổ
hợp cao
-Lựa chọn phương pháp để thu protein tái tổ hợp với hiệu suất cao.
Ưu điểm
-Sản xuất qui mô công nghiệp không phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu là động vật, thực vật, tạo năng suất
cao.
-Qui trình sản xuất an toàn (do sử dụng chủng vsv không độc hại) tinh sạch dễ dàng, giá thành hạ
-Có thể nâng cao chất lượng protein bằng cách tạo ra các protein bền hơn với nhiệt độ, pH, có tính đặc hiệu
cao hơn
*Các bc sx enzym tái tổ hợp
Bước 1:tuyển chọn vsv có khả năng tổng hợp E mình mong muốn
Bước 2: tách và tinh sạch AND tổng số (nếu là từ vk thì gắn vào vk; ARNm tổng số(từ nấm men, nấm mốc
thì gắn vào nấm men, nấm mốc)
Bước 3; nhân AND tổng số bằng kĩ thuật PCR. Nhân cADN bằng RT-PCR
Bước 4: biến nạp AND mã hoá protein E vào vector tách dòng phù hợp.
Bước 5: biến nạp vector tách dòng đã mang gen mã hoá E vào vector biểu hiện
Bước 6: biến nạp vector biểu hiện vào tế bào vật chủ
B3,4,5,6 tạo vsv tái tổ hợp
Bước 7: tìm điều kiện nuôi thích hợp để sinh tổng hợp ra protein E
Cần bổ sung chất cảm ứng(với Vk thường dùng IPIG, nấm men: metanol, nấm mốc: glucoza)
Bước 8: tách, tinh sạch E
Bước 9: kiểm tra độ sạch bằng phương pháp điện li
Bước 10: đánh giá chế phẩm E
Chương 3: E cố định
Câu 5: E cố định là e đc gắn lên chất mang không hòa tan hoặc đc gắn vs nhau bằng lk đồng hóa trị
tạo thành đại phân tử k hòa tan
Ưu điểm của E cố định:
-Có khả năng tái sử dụng, lặp đi lặp lại nhiều lần Hiệu suất kinh tế cao
- Không tan lẫn vào sản phẩm k a/h đến màu sắc, mùi vị sản phẩm

9. -Làm ngừng phản ứng nhanh chóng theo ý muốn
-Bền vs nhiệt, pH, dung môi hữu cơ hơn E tự do.
Nhược điểm của E cố định:
-Khả năng chuyển khối chậm, cơ chất có phân tử khối lớn chuyển sang thể lỏng ở chất mang chậm
-Có thể mất hoạt tính sau khi cố định
-Mất tính thích nghi hình thể: cơ chất muốn kết hợp vs E thì phải kết hợp vào trung tâm hoạt động, khi E
kết hợp vs chất mang có thể làm TTHĐ của E quay vào trongkhó kết hợp vs cơ chất
-Kém hiệu quả đối vs những chất có phân tử khối lớn.
Tính chất của E cố định:
(1) E cố định có hoạt độ riêng thấp hơn E tự do, Vì:
-Khi gắn E vào chất mang dưới ảnh hưởng của điện tích ở chất mang có thể làm cho hình thể E thay đổi, do
đó khả năng xúc tác cũng thay đổi theo.
-Các E đc “gói” trong khuôn gel, một số cơ chất có kích thước phân tử lớn không tiếp xúc đc vs E, do đó
giảm hoạt lực.
-Hoặc do tương tác giữa pro_pro giữa các phân tử E đã cố định làm biến đổi 1 phần cấu trúc không gian của
phân tử E
(2) E cố định có tính bền nhiệt cao hơn so vs E tự do.
(3) pH tối ưu của E cố định thường chuyển sang vùng kiềm hoặc vùng axit so vs pH tối ưu cuả E tự do: do
ảnh hưởng của trường tĩnh điện chất mang, làm nồng độ H+ ở gần chất mang và trong dung dịch khác nhau
Vd : Chymotripsin khi gắn trên chất mang là polyme của axit etilenmaleic thì pH tối ưu bị dịch chuyển về
phía kiềm gần 2 đơn vị pH, nhưng khi gắn trên chất mang polyornitin thì pH tối ưu chuyển về phía axit 2
đơn vị pH
(4) E cố định có thời gian bảo hành lâu hơn, bền vs các chất kìm hãm cug như các chất gây biến tính hơn.
Vd: Tripsin lk đồng hóa trị vs sephadex bằng brom cyanua giữ trong dung dịch ure sau 24h vẫn giữ đc 75%
hoạt độ so vs ban đầu.
Câu 6:CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH EZYME
1 . Phương pháp gắn bằng liên kết đồng hóa trị
a ) Phương pháp gắn E lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị
* Các loại chất mang thường sử dụng
- Chất mang hữu cơ : polypeptit, polysaccarit, chitosan, agarose, destran
- Dẫn xuất cellulose : Caboxyl metyl cellulose , DEAE – cellulose
- Các polyme tổng hợp : polyvinyl , polyamit
- Các chất vô cơ : Silicagel , Bentonit , nhôm hydroxyt
* ĐK chất mang
- Độ hòa tan thấp và bền với các tác động cơ hoc, hóa học , sinh học
- Không kìm hãm E
- Hấp phụ chọn lọc với các Pr khác nhau ( tính đặc hiệu )
- Chất mang có bản chất háo nước
- Chứa điện tích trái dấu với E
* 2 phương pháp gắn
- Gắn 1 giai đoạn : nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm NH2 của
Protein Enzym. Vd: chất đồng trùng hợp của aldehyt maleic và etylen có chứa gốc alhydrit maleic có khả
năng lk trự tiếp vs nhóm ἐ-amin của lysin ở phân tử E
- Gắn 2 giai đoạn
+ Gđ 1 : Hoạt hóa chất mang bằng cách đưa vào các nhóm có khả năng p/ứ hơn
+ Gđ 2 : Kết hợp E vào chất mang đã hoạt hóa

10. Các phương pháp hoạt hóa :
-- Chất mang chứa nhóm amin có thể được hoạt hóa bằng p/ứ diazo
-- Chất mang chứa nhóm amin cũng có thể được hoạt hóa bằng cách cho tác dụng với phosgen hoặc
tiophosgen để tạo thành dẫn xuất izonianat hoặc izotioxianat . Các nhóm izoxianat hoặc izotioxianat ở pH
trung tính sẽ liên kết dễ dàng với nhóm
- amin của E .
-- Chất mang có chứa nhóm COOH như CM – cellulose hoặc nhựa tổng hợp cần dược hoạt hóa trước khi
cho gắn với E bằng các phương pháp azit , cacbodiimit , anhydrit kép .
-- Chất mang là polysaccarit : được hoạt hóa sơ bộ bằng halogen cyanua
Cyanua thường là CNBr trong môi trường kiềm , polysaccarit đã được hoạt hóa có khả năng tạo liên kết
đồng hóa trị với Pr – E qua nhóm amin bậc nhất
Porath và Bareli lần đầu tiên đã hoạt hóa cellulose , dextran và agarose bằng phương pháp này .
* Ưu nhược điểm
- ƯĐ : + E gắn lên chất mang có độ bề cao
+ Thích hợp cho cho các p/ứ liên tục ( dạng cột )
- NĐ : + Số lượng E cố định thấp
+ Hoạt tính E có thể bị giảm do thay đổi cấu trúc hình thể
VD : Sơ đồ cố định Lipase trên nylon – 6 ( polyamid )
Nylon – 6 (hạt)  Hoạt hóa bằng HCl 3,5N ,45⁰C ,lắc 200 vòng/ph  Rửa bằng nước cất  Glutaraldehyt
10% ( 30⁰C , 30ph , lắc 200 vòng/ph )  Lọc bỏ dịch  Lipase 550 U/ml ( đệm phosphat)Rửa bằng nc
cất Lipase cố định
b ) Phương pháp gắn các E với nhau bằng liên kết đồng hóa trị
- Nguyên tắc : liên kết chéo đồng hóa trị các phân tử E lại với nhau tạo thành cấu trúc đại phân tử không tan
nhờ các tác nhân lưỡng hoặc đa chức mà không cần đến các chất mang .
- Tác nhân gắn kết thường là glutaraldehyt với tỷ lệ tác nhân – E khoảng 1 – 10% (w/w)
-Phương pháp này chi phí cao, kém hiệu quả do đk tiến hành phản ứng khắc khe,mhoatj tính E giảm do tg
tác giữa các phân tử E. Nhưng lk tạo ra rất bền vs nhiệt độ, pH
2 . Phương pháp gói E trong khuôn gel
* Nguyên tắc : Phân tử E đc giữ trong mạng lưới không gian của 1 polyme k tan trong nc.
* Các gel thường sd : polyacrylamit , polyvinyl , collagen, N-alginat và caraghenan từ rong biển.
* Ưu điểm:
+ Không đòi hỏi phải có các nhóm phản ứng của Pr nên thích hợp với nhiều E
+ Toàn bộ lượng E đều được gói trong khuôn hay microcapsul và nhận được bề mặt tiếp xúc giữa E và cơ
chất lớn trên một thể tích nhỏ .
+ Có thể gói đồng thời nhiều E trong cùng một khuôn (các E này phải có điều kiện hoạt động tối ưu gần
nhau)
+ E loại này không độc
* Nhược điểm
+ Loại E này chỉ thích hợp cho những phản ứng mà cơ chất có khối lượng phân tử nhỏ .
+ Các điều kiện để tiến hành polyme hóa , đặc biệt là sự tạo gốc tự do thường làm biến tính E
+ Gel kém bền với các tác nhân hóa học
a ) E được gói vào khuôn gel dạng hạt: E đc hòa tan trong dung dịch monome , monome này trùng hợp
tạo các polyme , các phân tử E được giữ trong mạng lưới khuôn gel của polyme
Cho dung dịch E vào dung dịch Alginat – Na , Caraghenan , Chitosan . Sau đó cho hỗn hợp E- gel vào
tinh bột tạo hạt ( đường kính 0,5 – 4 mm) , các hạt chứa E và Alginat – Na cho vào dung dịch giàu CaCl 2 .
Chú ý : - Kích thước hạt rất quan trọng vì nếu hạt bị teo thì khó tái sd và hiệu suất thấp
- Nồng độ CaCl2 : CaCl2 làm bền hạt , nếu không có hạt sẽ dễ bị hòa tan

11. b ) E bị “ nhốt “ trong các lỗ nhỏ của sợi tổng hợp
Có 2 phương pháp :
- Cho hỗn hợp E – polyme (collagen) vào thiết bị ép đùn có áp suất để tạo sợi , các sợi được cho vào bể có
chứa toluol làm bền sợi
- Có thể “ nhốt “ E trong các lỗ nhỏ của sợi tổng hợp (cellulotriaxetat) bằng cách cho dòng lỏng Polyme – E
chảy tuần hoàn bên trong sợi . Phương pháp này hạn chế được sự phân cực bề mặt
c ) Gói E trong bao vi thể
+ Cho dung dịch Nước – E vào monome háo nước (glycol) để tạo thành nhũ tương . Sau đó thêm monome
kị nước để tạo màng
+ Bổ sung các tác nhân hoạt động bề mặt để làm bền nhũ tương và điều chỉnh kích thước lỗ (1 - 100
)
+ Màng này có kích thước lỗ xốp đủ nhỏ để ngăn chặn sự khuếch tán E ra ngoài nhưng cũng đủ lớn để cơ
chất đi vào , sản phẩm đi ra .
d ) Phương pháp tiền polyme
- Tạo liên kết chéo giữa các tiền polyme bằng chiếu quang để gói E : Khi chiếu tia cực tím gần (360nm) lên
dung dịch có chứa chất tiền polyme , E và chất nhạy quang sẽ tạo ra liên kết chéo giữa các gốc của tiền
polyme . Từ dó gel đc hình thành và bao lấy E .
- Các chất tiền polyme thường sử dụng : ENT , PEGM , ENTP
- Có thể tiến hành ở điều kiện nhẹ nhàng tránh được các thay đổi pH quá kiềm hoặc axit trong time ngắn (35 ph)
- Các tính chất hóa lý của gel có thể dịnh hướng trước bằng cách chọn các tiền polyme thích hợp
-Phương pháp tiền polyme uretan: Cho dd E vào tiền polyme uretan, các gốc chức năng ở 2 đầu uretan p/ư
vs nhau tạo thành lk chéo ure. Gel đc hình thành trong vài phút và bao lấy E
3, Hấp phụ vật lý lên chất mang:
-Nguyên tắc:
Chất mang k chứa điện tích: hấp phụ E lên các chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và pro_E
như: lực Vander-Valls, lk hidro,lk kị nc
Khi chất mang k có lỗ xốp, E bám trên bề mặt chất mang
Khi chất mang có lỗ xốp, E chui vào trong các lỗ xốp của chất mang
Nếu chất mang có chứa điện tích: lk giữa E và chất mang là lk ion.
-Phương pháp điều chế: cho chất mang và E t/xúc nhau, sau đó rửa để loại bỏ những phân tử gắn kết yếu
lên chất mang
- Ưu nhc điểm của phương pháp:
---Điều chế dẽ dàng trong đk nhẹ nhàng nên giữ đc hoạt tính E. Có thể use cho taatscar các reator sinh học,
có thể tái use chất mang
---Do lực tương tác giữa chất mang và E yếu nên E dẽ bị nhả hấp phụ khi khuấy trộn, hoặc khi thay đổi nhệt
độ, pH, lực ion môi trường vì vậy khó áp dụng trong sản xuất thực phẩm và dược phẩm
-Chất mang thường use:
+Chất mang hữu cơ: cellulose, than hoạt tính, tinh bột, dextran, agarose, collagen...
+Chất mang cô cơ: silic, thủy tinh vô cơ, oxit kim loại
+Chất trao đổi ion: DAEA_cellulose, CM_cellulose, DAEA_sephadex...
+Polyme tổng hợp: nilon, polyacrylamit, polylamit, polyvinyl, polystirol...
-Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng E cố định đc và độ bền của lk cố định:
--Nồngđộ pro_E
--pH
--Lực ion môi trường
--Nhiệt độ
--Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang

12. 4, Cố định E lên tb VSV: là một phương pháp mới, ng ta đã cố định đc amylase. Glucoamylase, cellulase
trên bề mặt tb n.men chuyển hóa tinh bột và cellulose thành đường glucose một cách dễ dàng. Hoặc cố định
lipase giúp chuyển hóa dầu thực vật và mỡ động vật tạo năng lượng
Câu 7: Ứng dụng cuả E cố định:
1 : TRONG Y HỌC: E cố định đc use để đều trị các bệnh thiếu hệ E, tích lũy các sản phẩm độc trong cơ
thể Ngoài ra còn đc sử dụng để chữa 1 số bệnh:
- L-asparaginase cố định trog microcapsule điều trị bệnh bách cầu và ức chế sự phát triển của khối u ác
tính do sự có mặt của L-asparagin
- Chymotrypsin , superoxide dismutase : chống viêm
- Urease gắn trog microcapsule đã đc s.dụng có hiệu quả để loại ure trog máu , trog chạy thận nhân tạo
- Steptokinase, lumbromkinase, nattokinase làm tan các cục máu đông gây tắc nghẽn động mạch, viêm tĩnh
mạch
2 : CN HH: use E cố định để tổng hợp các chất dinh dưỡng, dược liệu như: aa, axit h/c, kháng sinh,
hormon...
-Sx L_aa use E aminoacylase cố định trên DAEA_sephadex (bằng các lk ion): Aminoacylase chỉ thủy
phân acyl-L-isome cho phép nhận dạng L-ax amin, acyl-D-axit amin còn lại trong dung dịch sau đo đc
đun nóng chuyển về dạng acyl-D-L ax amin và quá trình thủy phân đc lặp lại. Phương pháp sx L-aa đặc
biệt phát huy ưu điểm đối vs các aa khó thu nhận bằng con đường LM
-Sx acrylamit: sử dụng E cố định nitrilase (nitril hydratase) thu đc từ Rhodococus thực hiện p/ư cộng nước
vào acrylonitril, E cố định này chứa ít hoạt tính amidase nên tránh tạo ra các acrylic k mong muốn. E đc
gói trong gel polyacrylamit/dimetylaminoetylmetacrylat 10%(w/w) lk chéo, dạng hạt.
-Sx kháng sinh: E penicillin amidase cố định đc use để thủy phân penicillin G hoặc penicillin V tạo ra một
chất kháng sinh quan trọng 6APA ( axit 6- aminopenicillin). E penicillin amidase từ E.Coli có thể cố định
trên một số chất mang như: sephadex hoặc đc hấp phụ trên chất mang DAEA_cellulose
E cố định cug đc sử dụng trong một số ngành hóa hóa học khác k phải là tổng hợp: nganh sx giấy: E cố
định có thể use để làm trắng bột giấy....
3 : CN TP
* SX Glucose : s.dụng α-amylase và glucoamylase cố định để sx dịch glucose nồng độ cao (90-92%) từ
tinh bột . Glucoamylase thu nhận từ n.mốc Aspergillus.Niger, ph tối ưu 4-4,5 , nhiệt độ tối ưu là 60 độ, và
có thể đc cố định bằng lk acetonic đồng thời tạo lk chéo bằng glutaraldehyt
* SX sữa k có lactoza (lactaid) : S.dụng B-galactosiase(lactase), thủy phân lactose thành glucose và
galactose là những đg dễ tiêu hóa ,độ ngọt cao hơn. Lactase từ n.men đc cố định bằng cách gói trog sợi
cellulose triaxetate có thể s.dụng thiết bị phản ứng gián đoạn(STR) . Lactase từ n.mốc đc cố định tren xốp
silic dioxit ,bổ sung glutaradehyl sử dụng thiết bị p.ứ dạng cột (PBR)
* SX siro ngô vs nồng độ fructose cao(HFCS) . S.dụng E gluco_isomerase cố định chuyển hóa glucose
fructose có độ ngọt cao gấp 2,5 lần so vs glucose. Nồng độ glucose 95%, ph=7,5-8,5 , t0 =55-60 độ C
,thu đc dịch 42% fructose,50% glucose, 8% oligosaccarit . Fructose có độ ngọt 170% so vs saccrose.
Fructose đc tao ra hút ẩm nhanh, khó bảo quản nên đc ứng dụng nhiều trong sx nc giải khát.
* SX đg nghịch đảo : s.dụng invertase để chuyển saccarose glucose + fructose. Nếu s.dụng invertase hòa
tan thì t/gian lưu trog t/bị p/ư dạng cột (PBR) là 1 ngày, trog khi dùng invertase cố định thì tg lưu chỉ là
15’. Đg nghịch đảo đc tạo ra có khả năng giữ ẩm tốt và k tạo màu như trong trường hợp thủy phân bằng
axit
* Chuyển hóa raffinose (k có tính khử, cơ thể khó hấp thụ): Raffinase (α_D _galactosidase) thu đc từ nấm
Mortierella vinaacca thủy phân raffinose thành galactose +đường đôi (saccarose) . Nấm phát triển dưới
dạng hạt, sấy khô và use trực tiếp như E cố định. Đc ứng dụng để loại bỏ raffinose và stachyose từ sữa đậu
nành
4 ) Công nghệ môi trường: E cố định đc usee một cách có hiệu quả trong công nghệ môi trường (xử lí nc
thaỉ...)bằng pp sinh học: NaR từ thực vật, NiR và NoR từ VK đc cố định bằng lk đồng hóa trị lên các chất

13. mang rẻ tiền và trơ hóa học, các p/tử chứa e cug đc cố định lên chất mang này. Sau đó toàn bộ đc nhồi giữa
các điện cực bằng thép k gỉ tron một buồng nhỏ tạo thành một reactor. Nhc điểm: chi phí E cao, vận
chuyên e đến tâm hoạt động của E khó khăn.
5) CN TẨY RỬA: sdung prosease cố định, lipase cố định , cellulose để sx các loại xà phòng
6 ) SX bio-diesal : lipase cố định chuyển hóa dầu và mỡ tạo bio-diesal
7 ) SX Viên nang dầu ăn: lipase cố định chuyển hóa dầu ăn tạo viên nang ( cho ng bị nhiễm mỡ máu)
Chương 4: Điện cực sinh học
Câu 8: Điện cực sinh học (Biosensor) thực chất là một thiết bị phân tích chuyển một tín hiệu sinh học
thành một tín hiệu điện. Đầu tiên, Biosensor sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thành một đặc tính có thể
định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổi thành một tín hiệu điện bởi một bộ biến
năng. Trong Biosensor, hiện tượng được nhận dạng bởi một hệ thống sinh học gọi là cơ quan thụ cảm sinh
học (bioreceptor). Hệ thống này sẽ tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây ra phản ứng và tạo thành hợp
chất nhạy cảm cho Biosensor. Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất phân tích
Các loại điện cực sinh học:

14. 1 Điện cực điện hóa (Electrochemical biosensor)
2 Điện cực đo nhiệt (Calorimetric biosensor)
3 Điện cực đo quang (Optical Biosensor)
4 Điện cực điện áp (Piezoelectric biosensor)
5 Điện cực miễn dịch (Immunobiosensor)
6 Điện cực vi sinh vật (microbial biosensor)
1 . Điện cực điện hóa
a ) Nguyên tắc
-- Điện cực E được chế tạo dưới dạng 1 màng E mà 1 mặt của màng tiếp xúc với môi trường nghiên cứu (cơ
chất) , còn mặt kia tiếp xúc với vùng đo
-- Phản ứng OXHK cơ chất do E xúc tác sẽ sảy ra trên lớp màng E
-- Kết quả sự thay đổi năng lượng tự do được điện cực thu nhận rồi truyền qua hệ thống đo dưới dạng dòng
điện hoặc điện thế
b) Điện cực đo điện áp ( điện cực đo khối)
Nguyên tắc
-- Xác định sự khác nhau về điện thế giữa điện cực đo và điện cực so sánh
-- Sự khác nhau về điện thế giữa 2 điện cực là hàm của hoạt độ ion trong dung dịch điện phân (còn gọi là
điện cực chọn lọc)
-- Điện cực này được xđ theo phương trình Nest
E = Eo +
. ln
Eo : Điện thế OXHK tiêu chuẩn
R : Hằng số khí
T : nhiệt độ tuyệt đối
F : hằng số Faraday
N : số điện tử trao đổi của cơ chất
a1 , a2 : hoạt độ trong dung dịch và trong lớp màng điện cực
* Điện cực đo pH
Xác định glucose :
Gucooxydase
D – glucose -----------------> D – gluconat + H+
Đo pH sau khi giải phóng H+ --> Lượng H+ tạo thành  Hàm lượng D - glucose
* Điện cực nhận biết khí :
Xác định lysin :
Lysin decacbocylase
Lysin
---------------------------- >
Cadalverin + CO 2
Xác định lysin qua CO2 thì điện cực E được kết hợp với điện cực CO2 .
H2O + CO2  H2CO3 … HCO3- + H+
* Điện cực ENFET
-- Hoạt động dựa trên cơ sở của điện cực chọn lọc ion có sử dụng transitor có hiệu ứng trường ISFET
-- Cấu tạo : 1 màng chọn lọc ion tiếp xúc với transitor , 1 điện cực so sánh , màng sinh học , màng bao
-- VD : Sử dụng ENFET để đo nồng độ penicillin
penicillinase
Penicillin + H2O ----------- > Axit penicilloic
Penicillinase là chất xúc tác cho p/ứ này . Cố định Penicillinase lên màng và ngâm nó vào trong dung dịch
có penicillin thì ion H+ sẽ được sinh ra , bởi penicillin là 1 axit mạnh . Thiết bị FET nhạy ion H+ đo sự thay
đổi pH  nồng độ penicillin
c) Điện cực đo dòng điện
* Nguyên tắc

15. -- Khi đặt 1 hiệu điện thế giữa 2 điện cực (650mV) , cường độ dòng điện chạy giữa 2 điện cực tỷ lệ với mật
độ các hạt điện tích
-- Các điện cực đo dòng điện : điện cực Oxy và điện cực Hydroperoxit . O 2 và H2O2 đều là những sản
phẩm được sinh ra trong p/ứ có E xúc tác cũng như trong p/ứ có các chất trung gian OXHK nhân tạo .
* Điện cực Hydroperoxit ( H2O2 )
Đo lượng glucose : Điện cực E gồm : 1 anot Pt , 1 catot bạc phủ AgCl tiếp xúc với màng đã cố định
glucooxydase ( GOD )
GOD
Glucose ---------- > Axit glucomic + H2O2
H2O2 ---- > O2 + 2H+ + 2eDưới tác dụng của điện áp phân cực , H2O2 được giải phóng ra sẽ bị OXH ở mặt phân cách giữa anod và
màng . Cường độ dòng điện tỷ lệ với mật độ các hạt tích điện và xác định được lượng H 2O2 bị OXH , từ đó
suy ra được lượng glucose có trong môi trường nghiên cứu .
* Điện cực Oxy ( điện cực Clank )
Đo hàm lượng đường glucose
GOD
Glucose + O2 --------- > axit gluconic + H2O2
Dưới tác dụng của điện áp phân cực ( 650 mV ) đặt vào giữa 2 điện cực , Oxy khuếch tán qua màng sẽ bị
khử theo p/ứ : O2 + 4e- + 4H+  2 H2O
Dòng điện chạy giữa 2 điện cực đo tỷ lệ với lượng Oxy bị khử , do đó tỷ lệ với hàm lượng Oxy và
glucose . Dòng điện đc đo sau khi khuếch đại và đc chỉ thị trực tiếp bằng số hoặc biểu diễn dưới dạng nồng
độ Oxy hay áp suất riêng phần của Oxy .
2.Điện cực đo nhiệt(điện cực nhiệt điện trở)
-Các phản ứng giữa cơ chất và chất xúc tác sinh học thường giải phóng ra nhiệt và người ta có thể đo lượng
nhiệt giải phóng ra đo bằng 1 thiết bị nhiệt(điện cực đo nhiệt) sẽ tính được lượng cơ chất ban đầu
-Khi nhiệt toả ra càng lớn thì độ nhạy cang lớn. Do đó để tăng nhiệt toả ra có thể cố định đồng thời 2 hoặc
3 E (có thể lên tới 4, 5 E)
VD sử dụng đồng thời glucooxydase oxy hoá glucose và catalase để oxy hoá hydroperoxyt. 2 phản úng xảy
ra cùng một lúc lượng nhiệt toả ra nhiều hơn
Glucose
gluconicaxit+ H2O2
H2O2
H2O+O2
Cứ 0.1 microM cơ chất chuyển hó hoàn toàn sản phẩm thì sẽ sinh ra 100kj/mol
3.Điện cực đo quang: Dựa vào các tính chất vật lý của a/s để phát hiện ra sự biến đổi nhỏ trong mẫu phân
tích
-Nguyên tắc: Dung dịch phân tích t/xúc vs màng sinh học và khi có phản ứng E xảy ra thì sẽ có hiện tg a/s
bị hấp thụ hoặc phát ra a/s màu. Đo độ hấp thụ( hoặc phát xạ quang) hoặc sự phát quang a/s của các chất tạo
thành ở bc song xđ sẽ biết đc nồng độ cácchất cần phân tích
*Điện cực đo phản xạ quang:Cơ chất pản ứng vs E tạo thành sp. Sp đó t/d vs chất màu để tạo màu Cho a/s
đi qua, đo a/s phản xạ lại sẽ biết đc a/s đc hấp thụ bởi cường độ màu sản phẩm. Từ đó xđ đc nồng độ chất
cần phân tích. Vd: Định lượng glusose trong máu nhờ thuốc hiện màu MBTH (3_metyl-2 bezotiazolinon)
và DMAB (3-dimetyl aminobenzoic axit). Hai E glucooxydase (GOD) và peroxydase đc cố định bằng cách
hấp thụ lên bề mặt tấm nền đã phủ thuốc nhuộm. Khi glusose t/xúc vs tấm nền thí xảy ra./
*Điện cực đo phát quang:
-Cơ chất tác dụng vs E cố định để tạo thành sản phẩm có khả năng phát ra ánh sáng màu. Đo ánh sáng màu
ở bc sóng nhất định sẽ suy ra đc nồng độ cơ chất. Dựa vào tính chất này, ng ta use để xác định các VK trong
thực phẩm. Khi các vi khuẩn tác dụng đặc hiệu vs ATP và D_luciferin dưới t/d của E luciferase sẽ tạo thành
oxyluciferin, AMP, pyrophosphat, và a/s vàng đo đc ở bc sóng 562nm. Từ đó xác định đc lượng VK có mặt
trong thực phẩm.

16. 4.Điện cực miễn dịch:
Nguyên lý: Điện cực miễn dịch hoạt động dựa trên khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên, kháng thể.
Tức là kháng thể phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên sinh ra nó.
Phản ứng kháng nguyên kháng thể đc xác định bằng nhiều cách, trong đó có kĩ thuật ELISA: Sử dụng điện
cực miễn dịch ELISA kết hợp vs sử dụng 1 điện cực điện hóa hoặc điện cực đo quang để định hướng sự
biến đổi nồng độ cơ chất trong phản ứng xúc tác vs các E đánh dấu. Vận tốc chuyển hóa cơ chất tỉ lệ thuận
vs kháng thể đã gắn E. Nhờ đó định lượng đc kháng nguyên cần phân tích.
-Nguyên lý hoạt động của điện cực miễn dịch: theo cách gắn, cố định KN, KT (thường đã đc đánh dấu
= E) trên bề mặt chất mang: chia ra 2 loại:
Trực tiếp:
+Giá thể đc phủ kháng thể (cố định) đặc hiệu vs kháng nguyên phân tích
Sau đó, đc ngâm trong một dung dịch chứa một hỗn hợp gồm 1 lượng đã biết phức E_kháng nguyên và nồng
độ chưa biết kháng nguyên cần phân tích.
+Sau một thời gian thích hợp, kháng nguyên và phức E_kháng nguyên đc gắn kết với kháng thể
+Những phân tử nào không đc gắn với kháng thể bị rửa trôi và loại bỏ. Lượng phức E_kháng nguyên gắn vs
kháng thể đc xác định trực tiếp từ tín hiệu chuyển đổi.
Gián tiếp:
+Giá thể đc phủ kháng nguyên cố định, một lượng dư phức E_kháng thể đc đặt vào ống và xảy ra sự gắn kết
+Sau một thời gian thích hợp, những phân tử nào k bị gắn kết sẽ bị rửa trôi
+Dung dịch chứa kháng nguyên phân tích đc đưa vào ống, phụ thuộc vào nồng độ kháng thể mà xảy ra sự
gắn kết mà loại ra một số phức kết E_kháng thể.
Lượng phức kêt E_kháng thể loại ra đc xác định bằng tín hiệu đáp ứng từ một điện cực sinh học (đo quang
hoặc điện hóa)
5, Điện cực VSV: đc chế tạo để phát hiện các chất hóa học, dựa vào sự hô hấp và TĐC của vsv. Có 2 loại:
-Điện cực dùng để đo sự thay đổi hoạt lực hô hấp của vsv cố định vs 1 thiết bị đo điện thế
-Điện cực dùng để do các chất sinh ra từ vsv và phản ứng dễ dàng vs điện cực.
Vd: Các vsv hiếu khí use oxy và sản sinh năng lượng. Đo lượng oxy tiêu thụ thông qua điện cực oxy, có thể
đánh giá đc hoạt lực hô hấp.
Các chất gây ô nhiễm môi trường có thể bị phân hủy bởi vsv nhờ tiêu thụ oxy. Vì vậy, mức độ ô nhiễm (chỉ
số BOD) có thể xđ thông qua việc đo lượng oxy
6, Điện cực ADN: Use bioreceptor là các nucleic ax nhằm phát hiện đặc hiệu ADN mục riêu
Đáp ứng sinh học đặc hiệu của DNA sensor là phản ứng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung giữa các trình tự
ADN sợi đơn của ADN mục tiêu và ADN mẫu dò bằng lk hidro
-Nguyên tắc chung:
Khi quá trình lai DNA mục tiêu và mẫu dò (prode) xảy ra, tín hiệu lai sẽ đc điện cực ADN thu nhận và
chuyển đổi
AND sensor gồm nhiều loại khác nhau ,đc phát triển dựa trên các kỹ thuật thu nhận và chuyển đổi tín hiệu
khác nhau: điện hóa, quang....
•
AND ĐIỆN HÓA: AND đc cấu tạo từ các base purine (A,G) và các pyrimidine (T,C) ở điện thế
phù hợp ,các bazo purine dễ dàng tham gia p.ứ OXH-K trực tiếp hay thông qua chất trung gian. Sự trao đổi
E chính là tín hiệu đáp ứng của p.ứ bắt cặp đặc hiệu AND . Lợi dụng tính chất này để phát hiện quá trình
lại AND
•
AND sensor ĐIỆN HÓA TRỰC TIẾP: Các AND mục tiêu lai với AND probe trên lớp nhận biết
ở đk điện thế phù hợp base( G) của AND mục tiêu bị OXH gây ra hiện tượng tích điện trên bề mặt điện
cực .Sự biến đổi điện tích đc ghi = đc đo dòng điện . Độ nhạy khá cao . Sử dụng điện cực C, vàng hay
indiumtin oxide ( ITO) , nhiễu nền lớn nên phải khử AND nhiễu bằng từ trường . Có thể bị phá hủy mẫu
khi phân tích
•
AND SENSOR ĐIỆN HÓA GIÁN TIẾP ( polypiridin) OXH AND mục tiêu gián tiếp thông qua
các phân tử điện hóa trung gian polypiridin của Ru . Các phần tử trung gian sẽ lấy E từ các base G trên

17. AND mục tiêu và chuyển tới điện cực gây nên hiện tượng tích điện ở điện cực  đo mật độ điện tích =
điện cực đo dòng điện
•
AND SENSOR S.DỤNG CHỈ THỊ OXH-K ĐẶC HIỆU : ng.lý : s.dung 2 loại probe có trình tự
bổ subg lai với 2 đầu của AND mục tiêu probe bắt giữ và probe tín hiệu . Probe bắt giữ đc cố định trên bề
mặt điện cực or tự do trog dd . Probe tín hiệu có thể cố định trên bề mặt điện cực . probe tín hiệu đc đánh
dấu = chất OXH-K or gắn với hạt nano --? AND mục tiêu lai với cả probe bắt giữ và tín hiệu trên bề mặt
điện cực . Dưới điện thế phù hợp probe tín hiệu trao đổi ion với bề mặt điện cực tạo tín hiệu lai
Câu 9: Ứng dụng của điện cực sinh học:
1,Công nghiệp thực phẩm: Kĩ thuật điện cực sinh học có thể mang đến cho ngành công nghiệp thực phẩm
một thiết bị theo dõi và đo lường nhanh, độ nhạy cao, sử dụng thuận lợi hơn so vs các phương pháp truyền
thống. Một số ứng dụng của ĐCSH trong phân tích thực phẩm:
ĐCSH
Chất xác định
Điện cực E
Glucose, sacharose,TB,etanol,glicerol...
Điện cực E
Độ tươi của cá (nucleotit)
Điện cực H2O2/ĐCSH dòng điện
Glucose
Cực dò DNA
Vi khuẩn trong tp (salmonella, chlamydia
• Đo nồng độ glutamin và nồng độ glutamat: Sử dụng điện cực đo dòng có gắn màng cố định
glutamat oxydase để đo nồng độ glutamat trong các sp thực phẩm: các loại đồ hộp, dầu giấm, nc
sốt... Lượng glutamat quá giới hạn cho phép có thể ảnh hưởng đến mùi vị thực phẩm và gây ra
những p/ư nghiêm trọng ở ng: tim đập nhanh, đau dạ dày...
• Đo hàm lượng cồn: Sử dụng điện cực H2O2, hàm lượng cồn đc xác định bằng cách sử dụng E
alcohol oxydase chuyển hóa cồn thành aldehyt:
Alcol + O2 -- H2O2 + aldehyt
E alcohol oxydase ở dạng khô k bền nên cần có biện pháp bảo quản để giữ đc tính ổn định của E
• Phát hiện sự có mặt của VK trong thực phẩm: Sử dụng điện cực sinh học phát quang, khi các VK
tác dụng đặc hiệu vs ATP và D_luciferin tạo ra a/s phát quang nhờ t/d của E luciferase
ATP + D_luciferin----luciferinase---oxy luciferin +AMP+CO2+a/s vàng
• Đo hàm lượng albumin, insulin: Sử dụng điện cưc miễn dịch kết hợp vs điện cực đo dòng hoặc đo
quang:
-Điện cực miễn dịch kết hợp vs ĐC đo dòng để xđ insulin, albumin: Cho kháng thể kháng Insulin đã biết
(từ lợn) lên trên 1 lớp màng đã gắn điện cưc oxy, sau đó cho insulin cần kiểm tra lên trên màng, cho tiếp
insulin có gắn catalase và bổ sung cơ chất là H2O2, lúc đó sẽ xảy ra p/ư: H 2O2 ---- > 1/2O2 + H2O . Hàm
lg O2 đc tạo thành đc đo nhờ điện cực oxy, từ đó xđ đc hàm lg insulin
-ĐCMD kết hợp vs ĐC đo quang: gồm 3 phần:1_hệ thống chiếu sáng và thu nhận a/s phản xạ bởi 1 bộ tách
sóng, 2_màng có gắn kháng thể, 3_ ống bơm mẫu. Khi mẫu kháng nguyên đi qua, phản ứng đặc hiệu vs
kháng thể trên bề mặt sensor chip làm thay đổi bước sóng và góc phản xạ của a/s chiếu vào mặt bên kia
của sensor chip. Các thông số quang học sẽ cho ta nồng độ kháng nguyên có trong mẫu.
• Kiểm tra lượng cloramphenicol trong sản phẩm thủy sản: Sử dụng điện cực miễn dịch ALISA kết
hợp vs điện cực đo quang: các giếng đc phủ cloramphenicol (một giếng là cloramphenicol chuẩn,
các giếng còn lai là mẫu chứa cloramphenicol đã pha loãng). B/sung cloramphenicol có gắn E đã
biết và kháng thể kháng cloramphenicol vào các giếng. Các cloramphenicol tự do và
cloramphenicol của mẫu chuẩn sẽ cạnh tranh vs cloramphenicol gắn kết E tại vị trí gắn kết của
kháng thể. Cloramphenicol gắn kết E thừa sẽ đc loại bỏ bằng cách rửa. Bổ sung cơ chất vào các
giếng (ure peroxyt) và chất tạo màu vào và ủ. E chuyển hóa cơ chất tạo màu, đo cường độ màu ở
bc sóng thích hợp. Cường độ màu tỷ lệ nghịch vs hàm lg cloramphenicol trong mẫu.
• Xác định hàm lg mycotoxin trong ngũ cốc và thực phẩm: Mycotoxin là độc tố sinh ra trong quá
trình sinh trưởng và phát triển của n.mốc có mặt trong các sp như: lạc, ngũ cốc, hoa quả...Phương
pháp này dựa trên nguyên tắc lk đặc hiệu của KN-KT. KT có nồng độ cố định đc trộn vs mẫu cần

18. p.tích có hàm lg mycotoxin chưa biết. KT và mycotoxin sẽ tạo thành phức. Điện cực sẽ xác định
nồng độ kháng thể k tạo phức, dựa vào đồ thị mycotoxin chuẩn xđ đc hàm lượng mycotoxin cần
phân tích.
2, Trong môi trường: Dựa vào đặc điểm của p/ư E,chia ĐCSH 3 nhóm:
-Các chất đc định lượng là cơ chất của phản ứng E
-Các chất đc định lượng là các chất kìm hãm hoạt tính xúc tác of E
-Nồng độ các ion KL đc phát hiện nhờ vào việc chúng lk vs phần apoenzym  phục hồi hoạt tính E
*Định lượng ion KL:
Câu10: Ý nghĩa của Km và Vmax
*Km có thể xác định như là giá trị của nồng độ cơ chất mà tại đó vận tốc đầu bằng một nửa vận tốc cực đại
Hằng số Km cũng liên quan với ái lự c của E đối với cơ chất
Km bằng nghịch đảo của hằng số ái lực nghĩa là
+Km nhỏ thì ái lực lớn suy ra vận tốc lớn
+ Km lớn thì ái lực nhỏ suy ra vận tốc nhỏ
Thường hiệu quả của E được đánh giá qua hằng số đặc hiệu tức là Km nhỏ của cơ chất
+Km >> [S] suy ra v=(Vmax*[S])/Km phụ thuộc S
+Km <<[S] suy ea v=Vmax không phụ thuộc S
+Km=[S] suy ra v=Vmax/2
*Nếu tất cả phân tử E đều ở trong phức với cơ chất thì nồng độ [ES]bằng nồng độ tônge của E ban đầu. Khi
đó vần tốc của phản ứng sẽ đạt cự đại. Tức là Vmax sẽ đạt khi nồng độ cơ chất là rất lớn so với nồng độ E
II.2.1.1. Thu nhận enzyme amylase
Hiện nay ta biết có 6 loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase, γ-amylase (hay glucose) thủy phân các
liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide đồng loại. Các amylase còn lại:
dextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside.
Sáu loại amylase này được xếp thành hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào), và exoamylase (enzyme
ngoại bào).
Enzyme amylase được thu nhận chủ yếu từ các hạt nảy mầm như: malt đại mạch, malt thóc và ngô.
Có hai phương pháp là tinh sạch enzyme amylase là phương pháp sắc ký và thu nhận bằng phương pháp
điện di trên gel polyacrylamide.
¬ Thu nhận enzyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)
Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn với đệm Tris-HCl
0,05M (pH 8,0). Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/thể tích). Hỗn hợp sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc

19. độ 10.000 rpm trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Phần nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và
được xem là dịch enzyme.
Gel được chuẩn bị sẵn sàng và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V. Sau khi hoàn tất việc
chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác định sự hiện diện của amylase.
¬ Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký
Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 300C trong 8 ngày. Hạt nảy mầm được đồng hóa trong một máy
trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl 50mM (pH 8,5) (dung dịch đệm A). Sản phẩm
đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong
20 phút. Phần ở trên được xem như dịch enzyme thô. Dịch enzyme thô được cho kết tủa với (NH4)2SO4
(25 – 60%). Phần kết tủa thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.000
vòng trong 20 phút.
Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thì sẽ được cho qua cột
DEAE cellulose, DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A; enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng
độ 0 – 0,5M. Dung dịch được thẩm tích và được lôi cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này đặc biệt
được sử dụng để lôi cuốn amylase. Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột
superpose. Những phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
II.2.1.2. Thu nhận enzyme bromelin
Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải
protein, được thu nhận từ họ
Bromeliaceae, đặc biệt ở cây dứa (thân và trái).
Enzym bromelin có thể thu nhận từ thân, thịt quả, hay chồi quả.
Để thu nhận Enzym đầu tiên người ta phải phá vở cấu trúc mô ( thân hoặc quả) chứa enzym bằng cách
nghiền mô để thu được dịch chiết có chứa enzym bằng quá trình nghiền, ép, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch
lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có
chứa bromelin.
• Quá trình nghiền xé:
Mục đích là tăng hiệu suất ép ( qua máy nghiền,hiệu suất ép dứa tăng 30% )
• Quá trình ép :
Dứa sau khi nghiền có kích thước khoảng 1-2 cm được chuyển sang thiết bị ép.
Trong công nghiệp hiện nay thường dùng loại máy ép trục vít , hiệu suất 50– 70%.
• Quá trình lọc:
Có thể lọc qua vải lọc để loại các tạp chất thô ra khỏi.
• Quá trình ly tâm:
Quả dứa thân xay nhuyễn, lọc bỏ bã và thu được dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000vòng/ phút trong
10 phút để loại bỏ chất sơ để thu được chiết có chứa Bromelin.
Các phương pháp tách Bromelin¬
Chủ yếu hiện nay sử dụng phương pháp thẩm tích và phương pháp kết tủa.
″ Phương pháp kết tủa
• Nguyên tắc:
Điểm đẳng điện của đa số Protein là pH < 7 nên đa số các Protein mang điện tích âm.Trong dung dịch các
đầu mang điện tích âm này kết hợp với các đầu mang điện tích dương của nước. Sự kết hợp này đã tạo nên
lớp áo bao xung quanh phân tử protein, điều này ngăn cản sự kết tủa của các enzym. Vì vậy để phá vở lớp
nước xung quanh phân tử Protein người ta bổ sung các dung môi, hóa chất có ái lực với nước mạnh hơn so
với Protein, để lôi kéo nước ra khỏi Protein để cho Protein tủa xuống
Các dung môi thường sử dụng để kết tủa Protein là acetone hoặc ethanol hay các muối trung tính có nồng
độ cao (Amoni sunfat).
• Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzyme:
Độ tinh khiết của các dung môi, nồng độ muối sử dụng.
pH của dịch chiết.
Nhiệt độ kết tủa.
Thời gian tiếp xúc của tác nhân và dịch chiết.
• Tiến hành:
Sử dụng (NH4)2SO4: Cho từ từ và khuấy đều (NH4)2SO4 vào dịch nước ép theo tỷ lệ (523g(NH4)2SO4 /

20. 1 lit dịch nước ép). Để yên ở nhiệt độ phòng trong 10-15 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 6000vòng/phút
trong 5 phút để thu nhận kết tủa.
Sử dụng Ethanol: làm lạnh dịch nước dứa sau ly tâm(khoảng 4oC ), cho ethanol 960 (làm lạnh khoảng
10oC) theo tỷ lệ 4:1( 4 dịch nước ép, 1 ethanol) ở nhiệt độ 00c, Để yên trong 3-4 giờ. Ly tâm hỗn hợp với
tốc độ 6000vòng/phút. Trong 5 phút, rữa tủa bằng acetone và thu nhận kết tủa.
Sử dụng Acetone : Thêm một thể tích Acetone lạnh(10oC) vào một thể tích dịch nước dứa sau ly tâm. Để
yên trong vòng 1giờ ở nhiệt độ 0 - 4oC. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000v/p, loại bỏ kết tủa.Thêm 2 lần thể
tích aceton lạnh vào để 0 – 4oC trong vòng 1 giờ, ly tâm thu được kết tủa.
Phương pháp hấp phụ:″
Có thể sử dụng nhiều chất làm chất hấp phụ enzym, thông thường trong sản xuất Bromelin người ta sử
dụng kaolin (Kaolin là một loại khoáng sản có kích thước hạt nhỏ khoảng 1µm, độ phân tán cao và có tính
hấp phụ tốt).
Trình tự thực hiện như sau : Cho Kaolin khô hoặc đã ngâm cho trương nở vào dịch nước dứa theo tỷ lệ
25mg Kaolin/1 ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều sau đó ly tâm để thu tủa, tủa thu được gọi là BromelinKaolin.
Phương pháp siêu lọc:″
Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách các thành phần trong
chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng
phân tử của chất thấm qua. Tùy theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ
thu được nước và những chất có phân tử nhỏ còn những các phân tử lớn sẽ bị giữ trên màng.
Cách thực hiện: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ 30.000, diện tích màng 336cm2. Dịch nước sau
khi ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung
dịch cô đặc. Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.
Tách chiết protein từ dịch chứa bằng CMC: CMC vải màng được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphate
0,005M, pH 6,1, sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng khuấy trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch
chất bẩn bám vào CMC. Rửa protein bằng đệm phosphate 0,05M, pH5,6. Sau đó, tiến hành phản ứng hấp
phụ lần thứ nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate 0,05M, pH 7,1 và NaCl 0,5M khuấy
trộn 3-4 lần. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc chứa bromelin. Tiếp tục phản ứng
hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất. Sau đó, góp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để
tách lấy enzyme.
¬ Phương pháp tinh sạch enzym bromelin
Phương pháp thẩm tích, lọc qua sepadex, phương pháp sắc ký.
Phương pháp thẩm tích :″
Pha enzym thô với dung dịch đệm Na3PO4 0.03M có pH=7.2. Sau khi tất cả các enzym hòa tan thì cho
hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào môi trường có chứa Na3PO4 0.03M(1g enzym thô hòa10ml
dung dịch đệm và 1 lít dung dịch môi trường )..Tiến hành thẩm tích trong 6h cứ sau 2 giờ thay dung dịch
đệm bên ngoài 1 lần . Khi nhiệt độ tăng thì tốc độ của quá trình thẩm tích tăng, nhưng khi sử dụng nhiệt độ
vượt quá giới hạn sẽ gây biến tính các enzyme. Để giảm sự biến tính của enzym do nhiệt người ta thường
tiến hành thẩm tích enzym ở nhiệt độ thấp.
″ Phương pháp tinh sạch bằng cách lọc qua Sephadex:
Sephađex là dẫn xuất của polysaccharide dextran trong đó các phân tử của chúng liên kết nhau bởi các liên
kết ngang tạo thành “rây phân tử “, có dạng hạt. Các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ khuếch tán vào các hạt
Sephadex, và bị giữ lại bên trong với một thời gian nhất định. Các chất có phân tử lượng lớn thì không
khuếch tán vào bên trong hạt nên thời gian di chuyển nhanh hơn.
Sephadex G-50 được đun sôi cách thủy 100oC trong vòng 1 giờ sau đó nhồi vào cột kích thước cột
(23.5*0.9cm).Khi nhồi cột phải chú ý sao cho mật độ hạt đồng nhất và không có bọt khí.
• Tiến hành:
Hòa tan enzym thô theo tỷ lệ 100mg enzym thô/1ml dịch đệm Na3PO4 0.03M. Cho dung môi phân ly
chảy qua cột với vận tốc 2ml/7phút. Căn cứ vào thời gian lưu của Bromelin để có thể thu nhận enzyme
theo từng phân đoạn. Quá trình này thường diễn ra ở nhiệt độ thấp.
″ Phương pháp tinh sạch bằng phương pháp sắc ký:
Bromelin thân cho chạy sắc ký trên Duolit CS101 ở pH 6.05 sẽ cho 2 phân đoạn khác nhau về diện tích
peak và hoạt tính xúc tác.
Bromelin thân cho chạy sắc ký trên Bio Rex ở pH 6.1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành phần

21. acid amin.
Bromelin thân khi chạy sắc ký trên sephadex G-75 ở pH bằng 7 cũng nhận được 5 thành phần có hoạt tính
enzym khác nhau.
¬ Hoạt tính của Enzym Bromelin:
″ Hoạt tính phân giải của enzym bromelin:
Bromelin có 3 hoạt tính phân giải khác nhau: peptidase, amidase,và esterase. Bromelin có thể thủy phân cả
cơ chất tự nhiên và cơ chất tổng hợp
¬ Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelin
″ Ảnh hưởng bởi cơ chất :
Trên các loại cơ chất khác nhau thì Bromelin có hoạt tính khác nhau: Nếu cơ chất là Hemoglobin thì khả
năng phân giải của Bromelin mạnh hơn papain gấp 4 lần. Nếu cơ chất là Casein thì hoạt tính của Bromelin
tương tự như Papain. Còn đối với cơ chất tổng hợp như BAA thì khả năng thủy giải của Bromelin yếu hơn
Papain.
″ Ảnh hưởng bởi nhiệt độ :
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzym có liên quan chặt chẽ đến các yếu tố khác như: Độ tinh
khiết, thời gian tác dụng, Ph, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym…. Ở dịch chiết quả (pH= 3.5) khi tăng nhiệt
độ lên 60oC thì Bromelin vẫn còn hoạt tính. Nhưng đối với enzym tinh khiết thì bị vô hoạt ở 50oC, pH 410 thì enzym vẫn giữ hoạt tính tối đa trên Casein.
″ Ảnh Hưởng của pH:
pH là yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến hoạt tính của enzyme. pH tối thích của enzym không ổn định
mà phụ thuộc vào các yếu tố khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh
sạch của enzyme.
″ Ảnh hưởng của các ion kim loại :
Các ion kim loại gắn vào tâm hoạt động của enzyme, muối thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt
tính của enzym Bromelin và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ muối.
Ngoài ra còn có những chất tác dụng với nhóm SH của trung tâm hoạt động của Enzym gây ức chế hoạt
động của Enzym.
II.2.1.3. Thu nhận enzyme papain
Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S. Papain là một protease thiol, là một chuỗi popeptit
gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 dalton.
Papain được tách ra từ trái đu đủ xanh, papain thuộc nhóm enzym thủy phân được tách từ nhựa đu đủ.
Nhựa cây đu đủ nằm trong ống dẫn nhựa trải khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. Quả xanh 10 tuần tuổi là có
nhựa nhiều nhất.
Cây đang sinh trưởng tốt, thân cây mập mạp cho nhựa nhiều.
Quả: lấy những quả đang còn xanh, vỏ quả căng mọng, có trọng lượng từ 0.3-1 kg là tốt nhất. Quả non quá
hoặc quả già đều cho ít nhựa. Nên lấy nhựa ở độ đang 10 tuần tuổi.
Thời gian lấy nhựa thường lấy vào sáng sớm, độ ẩm không khí cao
Một số phương pháp thu nhận Papain bán tinh khiết:
Nhựa đu đủ sau khi lấy về được chiết rửa 2-3 lần bằng cồn 90o, lọc lấy cặn và sau đó làm bay hơi cồn. Cặn
được hòa tan trong nước cất sau đó cho tủa lại trong cồn, sấy ở 37-40o C sau đó thu được Papain.
Ngâm papain trong thể tích nước nhất định trong vài giờ, có thể bổ sung thêm Glycerin tạo thành dịch nhũ
tan đều, lọc qua lớp vải màn. Dùng Aceton lạnh theo tỷ lệ 2:1 so với dịch lọc. Sau đó ly tâm lạnh để thu
được kết tủa. Sấy Ở 45oC( thông thường sấy chân không), sau đó nghiền thành bột.
Tinh chế enzym có thể dùng phương pháp kết tủa phân đoạn sử dụng (NH4)2SO4 và NaCl.
Phương pháp thu nhận Papain tinh khiết :¬
Nhựa đu đủ ngoài Papain, chymopapain còn chứa một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất
béo,… còn có các tạp chất khác, nên phải dùng các phương pháp hòa tan nhựa đu đủ để loại các tạp chất.
Nhựa đu đủ khô được nghiền kỹ với celite và cát mịn sạch theo tỉ lệ 18:10:15 thì được trộn với dung dịch
Cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g Cysteine hydrocloride, 1000 NaOH(0.054M), pH khoảng 5.7). Dung dịch
sau đó được để lắng trong điều kiện thường và gạn những bọt nổi trên mặt. Sau đó, dung dịch chứa
enzyme được cho qua thiết bị lọc (có thể tiến hành trong điều kiện chân không nhẹ) và thu lấy dịch lọc.
Lúc này, dịch chứa enzyme thu được là một dung dịch có màu trắng sữa. Theo ý nghĩa vật lí, dịch lọc lúc
này đã được loại bỏ hết những cặn thô, rắn và những thành phần không tan trong nước.

22. Các quá trình xử lí tiếp theo sẽ loại bỏ gần như hoàn toàn các hợp chất có tính chất vật lí gần giống như
papain (protein, các thành phần gay ức chế hoạt tính enzyme,…)
″ Loại bỏ tạp chất bằng pH = 9:
Dịch chiết ở trên được điều chỉnh lên pH bằng 9 bừng dung dịch NaOH 1M.Tủa thu được có thể loại được
bằng lọc hoặc bằng ly tâm(2600rpm trong khoảng 1h). Lấy phần dịch nước trong. Quá trình này loại các
tủa gây biến tính protein đã bị loại bỏ và protein có điểm đẳng điện pI=9.
″ Quá trình phân đoạn bằng (NH4)2SO4 :
Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzym đến 40% độ bão hòa, khuấy nhẹ và để lắng .Sau đó, hỗn hợp được đưa
qua thiết bị ly tâm ở chế độ 2500rpm trong 1-2h. Dung dịch (NH4)2SO4 gây biến tính không thuận nghịch
với protein (papain). Thu nhận kết tủa, bỏ dịch lỏng. Tủa dược rửa 1 hoặc nhiều lần bằng dung dich
(NH4)2SO4 40% bão hòa.
″ Quá trình phân đoạn bằng NaCl :
Hòa tan tủa trong dung dịch Cystein 0.02 M ;tủa papain tạo thành khi thêm từ từ NaCl rắn và khuấy đều .
Sau đó, dịch được ly tâm 2500rpm trong 1h để thu kết tủa.
Lúc bấy giờ, chúng ta đã gần như thu được papain tinh khiết còn sót lại một số rất ít protein. Cho đến thời
điểm bay giờ, chế phẩm này có thể được sử dụng trong công nghệ, nhưng muốn có sản phẩm enzyme
thong mại, chúng ta cần thực hiện một số quá trình kết tinh enzyme nhằm nâng cao hoạt tính enzyme. Các
quá trình sau quá trình này có vai trò làm tinh khiết enzyme papain.
″ Kết tinh:
Tủa được chuyển thành dịch huyền phù trong dung dich Cystein 0.002 M (pH 6.5), giữ ở nhiệt độ phòng
trong 30 phút sau đó để tinh thể được tạo thành, sau đó duy trì ở 4oC qua đêm , sau đó ly tâm lạnh ở
2500rpmtrong 4-5 h để thu được tinh thể.
″ Tái kết tinh :
Hòa tan tinh thể thu được bằng lượng nước cất vừa đủ, sau đó cho thêm nước muối bão hòa vào, khi thể
tích đạt 75% nước muối thì có hiện tượng kết tinh. Sau đó để ở nhiệt độ phòng qua đêm rồi ly tâm thu
được kết tủa giống như trên.
Quá trình kết tinh này có thể được thực hiện nhiều lần để tăng cường mức độ tinh khiết cho sản phẩm
enzyme. Số lần tái kết tinh cũng không nên quá nhiều bởi khi kết tinh thì hoạt độ riêng của enzyme sẽ
giảm đồng thời khả năng chịu nhiệt của enzyme sẽ giảm đi nếu số lần kết tinh tăng lên.
″ Sấy chân không:
Tinh thể tạo được ở bước trên đem sấy chân không nhẹ ở nhiệt độ khoảng 40oC ta thu được papain tinh
khiết. Để tăng hoạt tính enzyme, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể enzyme trong dung dịch đệm
phosphate chứa cystein, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0. Đem kết tinh dịch lỏng thu được
sau siêu lọc.
Hoạt tính của papain:¬
Papain thủy phân Protein thành các Polypeptit và các Amino acid, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase,
vừa như exopeptidase.
Tính đặt hiệu cơ chất của papain rất rộng, papain có thể thủy phân hầu hết các peptide trừ liên kết của
Proline và glutamic acid có nhóm Cacboxyl tự do.
Ngoài ra Papain còn có hoạt tính Esterase, Transferase.
Papain cần các chất hoạt hóa để thể hiện hoạt tính, thông thường dùng cysteine. Khi có mặt chất này thì
nhóm SH của Casein được phục hồi làm tăng hoạt tính Papain.
Để thu được hoạt tính mạnh nhất của Papain người ta thường kết hợp dùng Cysteine và EDTA trong đó
EDTA đóng vai trò đóng vai trò liên kết với các kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
Thông thường Papain bị bất hoạt bởi các chất oxy hóa mạnh (như O2, O3, Cl2, H2O2…)và các ion kim
loại nặng : Cd+, Cu2+, Zn2+, và các tác nhân gây ức chế Papain.
Điều đáng chú ý là Papain bền với các dung môi hữu cơ
¬ Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme:
″ Nhiệt độ :
Papain chịu được nhiệt độ tương đối cao, dạng nhựa khô papain không bị biến tính sau 3h ở nhiệt độ
90oC , còn ở dạng dung dịch thì papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC.
Đáng chú ý là enzym ở dạng mủ, nhựa có độ bền nhiệt cao hơn enzym tinh sạch có lẽ là do các enzym
khác trong mủ nhựa có tác dụng bảo vệ nó.

23. Khi thủy phân các Protein khác nhau tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ phản ứng thích hợp cho Papain
cũng khác nhau .Đối với cơ chất Cáein thì nhiệt độ tối thích là 37oC.
″ pH :
Papain hoạt động trong khoảng pH khá rộng 4.5-8.5, đễ bị biến tính trong môi trường có pH<4.5 và pH
>12.
Tùy vào cơ chất mà Papain có các pH tối ưu khác nhau.
Ví dụ: với Casein pH tối thích là 7 - 7.5, với albumin là 4.5 - 7.1.
″ Dung môi:
Papain không thay đổi góc quay quang học trong methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong methanol
50%. Chất gây biến tính mạnh nhất với Papain là TCA (với nồng độ 10% đã làm biến tính bất thuận
nghịch enzyme.
II.2.1.4. Thu nhận enzyme ficin
Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulfhydryl (-SH). Trình tự các amino
acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và bromelin. Enzyme ficin dược thu nhận từ dịch
nhựa tươi từ cây sung. Quá trình sơ chế dịch nhựa tươi từ cây sung thành chế phẩm enzyme ficin gồm các
bước sau:
Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cất.
Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme ficin hòa tan hoàn toàn trong nước.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để cao su đông đặc lại và lắng xuống.
Loại bỏ phần lắng ở phía dưới, thu dịch nổi bên trên.
Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn và xác định hoạt
tính enzyme trong các phân đoạn.
Nhũng phân đoạn có hoạt tính enzyme được đưa qua lọc gel để loại bỏ các tạp chất trong các phân đoạn
enzyme.
Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt tính, trộn với tinh bột với tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô
ở nhiệt độ 400C. Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 0– 40C.
II.2.2. Thu nhận enzyme từ nguồn động vật:
Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhày dạ dày, tim,… những phế
liệu của công nghiệp thịt dùng để tách enzym rất tiện lợi. Dịch tụy có chứa amilase, lipase, protease,
ribonuclease và một số enzym khác.
Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê người ta thu chế phẩm rennin để làm đông sữa trong sản xuất phomat. Người
ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Khác với pepsin, rennin có khả năng đông tụ sữa cao mà không
thuỷ phân sâu sắc casein. Rennin là chế phẩm enzim có giá trị lớn trong công nghiệp.
Tuy vậy, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân, protease động vật ít thuận
lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và lượng nguyên liệu để thu enzim không lớn lắm. Các nguyên liệu này
có thể dùng trong nhiều lĩnh vực khác.
II.2.2.1. Enzim protease
Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hoá ở người và động vật, có nhiều ứng dụng và được quan
tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày
động vật (heo, bò, bê..). Ngoài ra có 3 protease kiềm quan trọng là: Pacreatin, Trypsin, Chymotrypsin.
II.2.2.2. Enzyme Pepsin
Pepsin là một protease thuộc nhóm hydrolase có khả năng phân cắt các liên kết peptide của protein. Pepsin
không có khả năng phân cắt triệt để protein thành các amino acid riêng lẻ, mà chỉ cắt khoảng 15% nối liên
kết peptide của protein tạo pepton có trọng lượng phân tử nhỏ.

24. ¬ Thành phần cấu tạo
Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá. Ở heo thì pepsin tập trung chủ yếu ở
phần đáy dạ dày.
Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin thô (heo) chứa một
pepsin chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin.
Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn lại làm thành hình cầu, là một protein vững chắc bởi
các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S. Pepsin chứa đặc biệt nhiều amino acid có tính
acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh. Số lượng các amino acid có mạch nhánh không kỵ nước phân cực
là lớn, làm cho enzim dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi
phân cực. Do đặc điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích âm ngay cả trong môi
trường HCl 0.1N.
Đặc tính¬
Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong
hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua, nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì có
vị ngọt (Dược điển Việt Nam).
Điểm đẳng điện của pepsin gần pH = 1. Pepsin thuỷ phân protein trong vùng acid khá rộng pH 1-4, pH
hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tuỳ theo bản chất và trạng thái của cơ chất thường pH 1.8 – 2.2.
Pepsin bền nhất ở pH 4-5, nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzim có phần thay đổi giảm đi. Từ pH =
5.5 trở lên pepsin không hoạt động.
¬ Sự hoạt hoá pepsinogen thành pepsin
Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức pesinogen bất hoạt. Khi tiếp xúc với môi trường acid tự
nhiên của bao tử hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hoá thành pepsin.
Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen có thể biểu diễn như sau:
¬ Tính đặc hiệu và khả năng thuỷ phân protein của pepsin
Pepsin là enzim quan trọng nhất của tuyến dịch vị được tiết vào dạ dày. Nhiệm vụ chủ yếu là phân cắt sơ
bộ protein thức ăn, chuyển sang dạng thích hợp để chuẩn bị cho những quá trình tiêu hoá triệt để tiếp theo.
Pepsin xúc tác sự thuỷ phân giải protein, tạo thành chủ yếu những pepton, có ít hay không có amino acid
tự do.
¬ Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin
• Ảnh hưởng của pH: Pepsin là một protease, hoạt động ở vùng pH 1- 4, pH thích hợp khoảng 1.5–2.4. Đối
với mỗi cơ chất thì pH có thể thay đổi.
• Ảnh hưởng của nhiệt độ: Pepsin hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khoảng 40 – 50oC. Ở 70oC mất khả năng
tiêu đạm.
• Ảnh hưởng của các loại muối và các dung môi hữu cơ: Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm
như NaHCO3 làm chậm sự pepton hoá của pepsin. Trong đó, HCl là acid gây ra sự thuỷ phân mạnh nhất,
kế đến là HNO3, HBr, H3PO4, các acid lactic, formic, gây tác động kém.
• Các muối lim loại nặng như Hb, Hg, Pt ở nồng độ thấp vẫn gây kết tủa và làm biến tính enzim.
• Các dung môi hữu cơ ít phân cực làm giảm hoạt tính của pepsin.
¬ Các phương pháp thu nhận pepsin
″ Thu nhận dung dịch pepsin
Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhầy dạ dày là sự phối hợp của ba quá trình: phá vỡ tế
bào, hoạt hóa và chiết tách enzyme.
Sản xuất pepsin hiện nay có hai phương pháp là phương pháp chiết và tự phân, đều dựa trên nguyên tắc:
pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày của động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng
(theo Konne và Muraviep, 1960; Covalines và cộng sự, 1966) hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid
(theo Covalenco, 1966).
Khi so sánh sự thu nhận pepsin của hai phương pháp cho thấy phương pháp tự phân cho hiệu suất thu
enzym cao hơn phương pháp chiết là 5 – 7 lần (theo Teply và cộng sự,1980). Nguyên nhân là do phương
pháp tự phân có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào. Mặt khác, phương pháp tự phân còn có ưu
điểm là cùng với pepsin, ta còn thu đựơc pepton, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu protein của dạ dày
trong sản xuất.
Muốn pepsin có hoạt tính cao thì phải cách ly từ niêm mạc dạ dày lấy từ động vật mới mổ hoặc có thể bảo
quản niêm mạc ở nhiệt độ lạnh 0-240C trong thời gian ngắn.
• Phương pháp chiết:

25. Dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghiền, ngâm vào nước có 5% butanol hay glyceryl, có cloroform để
tránh nhiễm khuẩn sau chế hóa bằng etanol để pepsin kết tủa. Thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ
thường.
• Phương pháp tự phân:
Niêm mạc dạ dày bảo quản ở nhiệt độ lạnh hay vừa tách ra khỏi heo mới mổ, xay nhỏ, dùng HCl hay
H3PO4, H2SO4 với nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin.
Theo nhiều thực nghiệm, việc dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường sẽ cho hoạt tính cao nhất. Nguyên
nhân là do HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật, trong cơ thể sống
pepsinogen được hoạt hóa thành pepsin nhờ HCl dịch vị.
Thời gian tự phân: 48 giờ ở 40 – 420C.
Ngoài ra một số tác giả đã sử dụng nguyên lý hấp thụ enzym trên một chất kết tủa. Cho hình thành chất kết
tủa phosphattricalci từ niêm mạc dạ dày heo (ngâm nước) có mặt H3PO4. Sau đó chất kết tủa được hòa tan
bằng HCl và dung dịch thu được mang đi thẩm tích (dialyz). Dung dịch pepsin thô thu được sau khi xử lý
bằng ester sẽ thu lại chất cặn có thành phần cấu tạo là pepsin sơ lọc (phương pháp Bruché)
″ Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết
• Phương pháp tủa.
Phương pháp tủa bằng muối (diêm tích): Các muối trung tính ở nồng độ cao có thể kết tủa thuận nghịch
các enzym mà không gây biến tính hay giảm hoạt tính enzym. Các protein khác nhau sẽ có tính hòa tan
khác nhau trong dung dịch. Do đó khi tăng dần nồng độ muối, các protein riêng biệt sẽ kết tủa theo các
trình tự khác nhau.
Người ta thường dùng các muối trung tính khác nhau như (NH¬4)2SO4, NaCl… ở nồng độ gần bão hòa để
làm tủa pepsin. Ly tâm lấy tủa, trộn với tá dược như lactose, glucose hay tinh bột là các chất phụ gia có
tính chất ổn định enzym, đồng thời rút ngắn thời gian sấy, hạn chế sự giảm hoạt tính enzym trong khi sấy,
thường sấy ở nhiệt độ ≤ 450C hay sấy kèm chân không.
Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ: Với dung dịch pepsin thô được cô dưới áp suất thấp, ở
nhiệt độ ≤ 450C đến khi chỉ còn lại 1/8 so với thể tích ban đầu thì đem tủa với cồn 950C hay aceton (tỷ lệ
1:3) (Có thể tủa bằng cồn cao độ hay các dung môi hữu cơ thích hợp như: metylic, etylic, aceton ở nhiệt độ
gần 0 – 30C). Sau đó ly tâm, sấy tủa ở nhiệt độ ≤ 450C. Phương pháp tủa cần đựơc tiến hành ở nhiệt độ
thấp 0 – 50C để đảm bảo hoạt tính của enzym.
Nguyên liệu: Dạ dày động vật tươi vừa mới giết mổ; bảo quản lạnh đông trước khi thực hiện (0 – 30C).
Tách màng nhầy: rửa sạch bên ngoài trứơc khi lộn ngược dạ dày, rửa thật nhẹ màng nhày bằng nước lạnh
chỉ để loại bỏ thức ăn thừa (rửa bằng tay) không làm tổn thất lớp màng nhầy chứa pepsin và tiến hành bóc
màng nhầy.
Xay nhuyễn: màng nhầy dạ dày sau khi tách cắt nhỏ và xay nhuyễn đồng nhất.
Tự phân: màng nhầy sau khi xay bổ sung dung dịch HCl 0.5% với tỷ lệ (theo khối lượng) 1: 2 và nhiệt độ
40- 500C, khuấy đều; thời gian 24 – 48 giờ.
Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn thu dung dịch.
Kết tủa: kết tủa bằng NaCl nồng độ bão hòa 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ cho đến khi dung dịch bão
hòa, để yên dịch thủy phân 30 phút. Có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulphat, cồn 85%, aceton,
izopropanol, polyetylenglycol – PEG 6000.
Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ sinh ra một nhiệt lượng lớn, có thể làm mất hoạt tính
enzym. Do đó, dung dịch sau tự phân đựơc lọc cùng dung môi đã làm lạnh và dung môi phải được cho từ
từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5 – 10 phút, nhiệt độ ≤
50C.
Tác nhân PEG 6000: (tương tự như muối vô cơ). Cho PEG dạng rắn cho từ từ vào dung dịch enzym và
khuấy liên tục cho tan hết.
Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm 10 - 15 phút với tốc độ 5000 – 6000
vòng/phút.
Sấy khô: sau khi ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô có thổi khí ở nhiệt độ 30 – 400C hoặc sấy chân
không hay thiết bị sấy đông khô. Để tránh bị mất hoạt tính ngừơi ta trộn thêm vào chế phẩm enzym các
chất độn như tinh bột hòa tan, maltose dextrin… trong quá trình sấy.
Bảo quản: chế phẩm pepsin thô cần đựơc bảo quản ở điều kiện khô, kín, lạnh, tránh tiếp xúc trực tiếp ánh
sáng và các tác nhân vật lý, hóa học có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym.
• Phương pháp hấp phụ
Có thể dùng một số chất hấp phụ đặc hiệu để hấp phụ enzym. Cơ sở khoa học của phương pháp này là cho