Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
: https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
GIÁO TRÌNH KHỐI NGUỒN CÁC LOẠI - ĐIỆN LẠNH BÁCH KHOA HÀ NỘI
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel từ chủng nấm mốc trichoderma spp.
1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
Đ
Đ
ĐỒ
Ồ
Ồ Á
Á
ÁN
N
N T
T
TỐ
Ố
ỐT
T
T N
N
NG
G
GH
H
HI
I
IỆ
Ệ
ỆP
P
P
Ngành: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : KS. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện : LÊ NGỌC MỸ
MSSV: 1191111028 Lớp: 11HSH02
TP. Hồ Chí Minh, 2013
K
K
KH
H
HẢ
Ả
ẢO
O
O S
S
SÁ
Á
ÁT
T
T K
K
KH
H
HẢ
Ả
Ả N
N
NĂ
Ă
ĂN
N
NG
G
G S
S
SI
I
IN
N
NH
H
H T
T
TỔ
Ổ
ỔN
N
NG
G
G H
H
HỢ
Ợ
ỢP
P
P
E
E
EN
N
NZ
Z
ZY
Y
YM
M
ME
E
E X
X
XY
Y
YL
L
LA
A
AN
N
NA
A
AS
S
SE
E
E V
V
VÀ
À
À T
T
TI
I
IN
N
NH
H
H S
S
SẠ
Ạ
ẠC
C
CH
H
H B
B
BẰ
Ằ
ẰN
N
NG
G
G
S
S
SẮ
Ắ
ẮC
C
C K
K
KÝ
Ý
Ý L
L
LỌ
Ọ
ỌC
C
C G
G
GE
E
EL
L
L T
T
TỪ
Ừ
Ừ C
C
CH
H
HỦ
Ủ
ỦN
N
NG
G
G N
N
NẤ
Ấ
ẤM
M
M M
M
MỐ
Ố
ỐC
C
C
T
T
TR
R
RI
I
IC
C
CH
H
HO
O
OD
D
DE
E
ER
R
RM
M
MA
A
A S
S
SP
P
PP
P
P.
.
.
2. LỜI CAM ĐOAN
Tôi là sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không sao chép đồ
án/khóa luận tốt nghiệp của người khác dưới mọi hình thức nào. Đây là nghiên cứu
hoàn toàn của riêng tôi, những số liệu trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực và
chưa được công bố bởi tác giả nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên.
3. LỜI CÁM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp em đã được áp dụng những lý thuyết
đã học vào thực tế và thêm được những kinh nghiệm bổ ích cho công việc sau này. Em
xin chân thành cảm ơn :
Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đã cho phép em làm đồ án tốt nghiệp tại Viện,
cung cấp những thiết bị, máy móc hiện đại giúp ích rất nhiều cho việc thực hiện đồ án.
Ks. Đỗ Thị Tuyến đã hướng dẫn, giúp đỡ cho em rất tận tình, giải thích những
thắc mắc trong khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ các tài liệu để em hoàn
thành đồ án một cách tốt nhất.
Các thầy cô trong khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ
Thuật Công nghệ TP.HCM đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho
em trong những năm học vừa qua.
Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn đồng hành, chia sẽ, động
viên. Các bạn trên Viện và bạn Nguyễn Thị Hoài An đã giúp đỡ em thực hiện tốt đồ án
tốt nghiệp.
4. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
Đ
Đ
ĐỒ
Ồ
Ồ Á
Á
ÁN
N
N T
T
TỐ
Ố
ỐT
T
T N
N
NG
G
GH
H
HI
I
IỆ
Ệ
ỆP
P
P
Ngành: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : KS. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện : LÊ NGỌC MỸ
MSSV: 1191111028 Lớp: 11HSH02
TP. Hồ Chí Minh, 2013
K
K
KH
H
HẢ
Ả
ẢO
O
O S
S
SÁ
Á
ÁT
T
T K
K
KH
H
HẢ
Ả
Ả N
N
NĂ
Ă
ĂN
N
NG
G
G S
S
SI
I
IN
N
NH
H
H T
T
TỔ
Ổ
ỔN
N
NG
G
G H
H
HỢ
Ợ
ỢP
P
P
E
E
EN
N
NZ
Z
ZY
Y
YM
M
ME
E
E X
X
XY
Y
YL
L
LA
A
AN
N
NA
A
AS
S
SE
E
E V
V
VÀ
À
À T
T
TI
I
IN
N
NH
H
H S
S
SẠ
Ạ
ẠC
C
CH
H
H B
B
BẰ
Ằ
ẰN
N
NG
G
G
S
S
SẮ
Ắ
ẮC
C
C K
K
KÝ
Ý
Ý L
L
LỌ
Ọ
ỌC
C
C G
G
GE
E
EL
L
L T
T
TỪ
Ừ
Ừ C
C
CH
H
HỦ
Ủ
ỦN
N
NG
G
G N
N
NẤ
Ấ
ẤM
M
M M
M
MỐ
Ố
ỐC
C
C
T
T
TR
R
RI
I
IC
C
CH
H
HO
O
OD
D
DE
E
ER
R
RM
M
MA
A
A S
S
SP
P
PP
P
P.
.
.
5. LỜI CAM ĐOAN
Tôi là sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không sao chép đồ
án/khóa luận tốt nghiệp của người khác dưới mọi hình thức nào. Đây là nghiên cứu hoàn
toàn của riêng tôi, những số liệu trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực và chưa
được công bố bởi tác giả nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên.
6. LỜI CÁM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp em đã được áp dụng những lý thuyết
đã học vào thực tế và thêm được những kinh nghiệm bổ ích cho công việc sau này.
Em xin chân thành cảm ơn :
Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đã cho phép em làm đồ án tốt nghiệp tại
Viện, cung cấp những thiết bị, máy móc hiện đại giúp ích rất nhiều cho việc thực hiện
đồ án.
Ks. Đỗ Thị Tuyến đã hướng dẫn, giúp đỡ cho em rất tận tình, giải thích những
thắc mắc trong khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ các tài liệu để em hoàn
thành đồ án một cách tốt nhất.
Các thầy cô trong khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ
Thuật Công nghệ TP.HCM đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm
cho em trong những năm học vừa qua.
Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn đồng hành, chia sẽ, động
viên. Các bạn trên Viện và bạn Nguyễn Thị Hoài An đã giúp đỡ em thực hiện tốt đồ
án tốt nghiệp.
7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................v
DANH MỤC BẢNG................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ........................................................................... viii
LỜI MỞ ĐẦU.............................................................................................................1
1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu.........................................................................................3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu........................................................................................3
4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................3
5. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp...........................................................................3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................4
1.1. Giới thiệu chung về cơ chất xylan, enzyme xylanase.......................................4
1.1.1. Cơ chất xylan..............................................................................................4
1.1.2. Hệ enzyme xylanase....................................................................................5
1.1.3. Hệ xylanase của Trichoderma spp.............................................................5
1.1.4. Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan.......................................6
1.2. Giới thiệu chung về nấm sợi Trichoderma spp. ...............................................6
1.2.1. Phân loại Trichoderma spp........................................................................6
1.2.2. Đặc điểm sinh học của Trichoderma spp...................................................7
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma spp......................................7
1.2.4. Một số ứng dụng của Trichoderma ............................................................8
1.3. Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzyme ....................................9
1.4. Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme....................................10
8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
ii
1.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase ....................................11
1.5.1. Bã mía......................................................................................................11
1.5.2. Cám mì ....................................................................................................11
1.6. Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme và các yếu tố ảnh hƣởng
đến sinh tổng hợp xylanase trong điều kiện nuôi cấy bán rắn...............................12
1.6.1. Độ ẩm của môi trường nuôi cấy ...........................................................12
1.6.2. Sự thông khí ..........................................................................................13
1.6.3. Nguồn carbon .......................................................................................13
1.6.4. Nguồn nitrogen .....................................................................................13
1.6.5. pH..........................................................................................................14
1.6.6. Các nguyên tố khoáng...........................................................................14
1.7. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch chế phẩm enzyme .............................15
1.8. Sợ lƣợc về sắc ký lọc gel.............................................................................16
1.8.1. Bản chất của phương pháp ......................................................................16
1.8.2. Đặc tính của gel .......................................................................................17
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP......................................................18
2.1. Nguyên liệu..................................................................................................18
2.2. Hóa chất và thiết bị......................................................................................18
2.2.1. Hóa chất................................................................................................18
2.2.2. Thiết bị ..................................................................................................18
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase từ nấm
mốc Trichoderma spp............................................................................................19
2.3.1. Phương pháp mô tả hình thái Trichoderma .........................................19
2.3.2. Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu...........19
2.3.3. Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải...................................20
9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
iii
2.3.4. Quy trình khảo sát một số yếu tố..............................................................21
2.3.5. Thuyết minh quy trình...............................................................................22
2.4. Bố trí thí nghiệm..........................................................................................24
2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase..
...............................................................................................................24
2.4.2. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme xylanase.........................................26
2.4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase ..........30
2.5. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả .................34
2.5.1. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu....................................34
2.5.2. Xử lý số liệu..........................................................................................37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..............................................................38
3.1. Quan sát hình thái Trichoderma spp. trên môi trƣờng PGA .......................38
3.1.1. Quan sát đại thể....................................................................................38
3.1.2. Quan sát vi thể ......................................................................................39
3.2. Định tính enzyme xylanase của Trichoderma spp. .....................................40
3.3. Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp. ...................................................41
3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase của
Trichoderma spp....................................................................................................41
3.5.1. Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase .....51
3.5.2. Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme xylanase từ dịch chiết bằng
phương pháp kết tủa...........................................................................................53
3.5.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase .........58
3.6. Tinh sạch enzyme xyalanse bằng phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel...........60
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................62
4.1. Kết luận...........................................................................................................62
10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
iv
4.2. Đề nghị............................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................64
PHỤ LỤC A................................................................................................................1
PHỤ LỤC B ................................................................................................................2
PHỤ LỤC C ................................................................................................................4
11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BM Bã mía
CM Cám mì
DNS Acid 2-hydroxyl-3,5-dinitrobenzoic
DC Dịch chiết
HT Hoạt tính
HL Hàm lƣợng
HTR Hoạt tính riêng
IU (UI) Unit Internation, đơn vị quốc tế
12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
vi
DANH MỤC BẢNG
STT Bảng Nội dung Trang
1 1.1 Thành phần hóa học của bã mía 11
2 1.2 Thành phần hóa học của cám mì 11
3 1.3
Nồng độ chất khoáng cần thiết cho sinh trƣởng nấm
mốc và xạ khuẩn
14
4 2.1 Bảng số liệu dựng đƣờng chuẩn Bradford 35
5 2.2 Tỷ lệ pha loãng dung dịch Xylose chuẩn 36
6 3.1
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau
42
7 3.2
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có độ ẩm môi turờng khác nhau
44
8 3.3
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có pH khác nhau
45
9 3.4
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau
47
10 3.5
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau
48
11 3.6
Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau
50
12 3.7
Kết quả khảo sát các dung môi để tách chiết enzyme
xylanase
51
13 3.8 Kết quả tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase 52
14 3.9
Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzyme
xylanase
53
15 3.10
Kết quả khảo sát tỷ lệ acetone dùng để tủa enzyme
xylanase
55
16 3.11 Kết quả khảo sát tỷ lệ nồng độ muối dùng để tủa 56
13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
vii
enzyme xylanase
17 3.12 So sánh kết quả tủa enzyme xylanase 57
18 3.13
Kết quả ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme
xylanase
58
19 3.14
Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ đến chế phẩm
enzyme xylanase
59
20 3.15 Hiệu suất tinh sạch 61
14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
viii
DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
DANH MỤC HÌNH
STT Hình Nội dung Trang
1 1.1 Sơ đồ cấu trúc cách tế bào thực vật 4
2 1.2 Trichoderma spp. 6
3 3.1 Hình thái đại thể của Trichoderma spp. 38
4 3.2 Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 24h 39
5 3.3 Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 36h 39
6 3.4 Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 48h 39
7 3.5 Kết quả vành phân giải Xylanase của Trichoderma spp. 40
DANH MỤC ĐỒ THỊ
STT Đồ thị Nội dung Trang
1 3.1
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có
tỷ lệ cơ chất khác nhau
42
2 3.2
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có
độ ẩm khác nhau
44
3 3.3
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có
độ ẩm khác nhau
46
4 3.4
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có
độ ẩm khác nhau
47
5 3.5
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có
49
15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
ix
độ ẩm khác nhau
6 3.6
Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính
Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có
độ ẩm khác nhau
50
7 3.7
Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của
các dung môi tách chiết enzyme xylanase
51
8 3.8 Biểu diễn tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase 52
9 3.9
Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme
xylanase từ các phân đoạn tủa bằng cồn
54
10 3.10
Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme
xylanase từ các phân đoạn tủa bằng acetone
55
11 3.11
Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme
xylanase từ các phân đoạn tủa bằng muối
56
12 3.12
Biểu diễn kết quả so sánh tủa enzyme xylanase từ các
tác nhân tủa
57
13 3.13
Biểu diễn hoạt tính xylanase theo pH của chế
phẩm enzyme xylanase
58
14 3.14
Biểu diễn hoạt tính xylanase theo nhiệt độ của
chế phẩm enzyme xylanase
59
15 3.15 Sắc ký đồ trên excel khi chạy sắc ký enzyme xylanase 60
16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
1
LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, công nghệ vi sinh – hóa sinh phát triển nhanh chóng tạo điều kiện
cho nghiên cứu phát triển, giúp ứng dụng vào thực tế nông nghiệp cũng nhƣ công
nghiệp thực phẩm rất có hiệu quả. Việc sử dụng các chế phẩm enzyme trong nông
nghiệp và công nghiệp thực phẩm đƣợc sử dụng nhiều trong thực tế sản xuất nhằm
nâng cao chất lƣợng cũng nhƣ năng suất của sản phẩm, đồng thời tiết kiệm chi phí
sản xuất. Vì vậy, việc nghiên cứu và sản xuất ra enzyme và các chế phẩm enzyme
ngày càng đƣợc quan tâm nhiều hơn.
Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới có nền nông nghiệp khá phát triển, phong
phú và đa dạng trên đà phát triển mạnh. Lƣợng phế phẩm và phụ phẩm của nông
nghiệp, công nghiệp cũng rất dồi dào nhƣng lại không đƣợc xử lý đúng mức. Theo
đó các chất thải hữu cơ cũng gia tăng lên không ngừng. Trong đó phụ liệu của nhà
máy mía đƣờng là một ví dụ điển hình và chiếm khoảng 20% mía nguyên liệu. Theo
đánh giá của ngành mía đƣờng, nếu công suất nhà máy là 1000 tấn/ngày thì mỗi
ngày nhà máy thải ra môi trƣờng khoảng 25 tấn bã mía gây ô nhiễm nghiêm trọng.
Chính vì thế, đang có nhiều hƣớng giải quyết lƣợng bã mía sau sản xuất trên
một số nhà máy sử dụng bã mía làm nhiên liệu đốt lò hơi, cách này rất lãng phí mà
lại ô nhiễm môi trƣờng sống. Còn các nhà máy khác lại cố gắng tận dụng bã mía
vào các mục đích tốt hơn nhƣ làm ván ép, thức ăn gia súc…Nhƣng những biện pháp
trên chƣa khả thi vì thành phần ván ép từ bã mía chƣa tốt và chắc bền nhƣ ván ép từ
gỗ, còn thức ăn gia súc không thực sự đảm bảo nguồn dinh dƣỡng cho vật nuôi
cũng nhƣ tốn nhiều chi phí cho sản xuất. Nếu để lâu bã mía sẽ bị vi sinh vật mùn
hóa, lúc này có thể làm phân bón cho cây trồng nhƣng phải mất một thời gian rất
lâu để vi sinh vật phân hủy vì thế không có khả năng giải quyết đƣợc thực trạng
lƣợng bã mía tồn đọng ngày càng nhiều, hao tốn diện tích.
Enzyme là một protein đặc biệt đƣợc sinh vật tổng hợp và tham gia các phản
ứng sinh hóa, là thành phần không thể thiếu trong mọi tế bào sinh vật. Chúng đóng
vai trò quyết định mối quan hệ giữa cơ thể sống và môi trƣờng.
17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
2
Cuối thế kỷ 19 và suốt thế kỷ 20, ngành công nghệ enzyme rất phát triển và
phát triển thành ngành công nghiệp sản xuất enzyme dựa vào hoạt động sống của vi
sinh vật. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những thuận lợi to lớn cho nhiều
nƣớc.
Từ lâu, xylanase đã đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm nhƣ:
làm bánh mỳ, nƣớc hoa quả, rƣợu vang, bia, thu nhận đƣờng xylose. Xylanase đã,
đang và ngày càng đƣợc bổ sung nhiều hơn vào thức ăn chăn nuôi. Kết quả cho
thấy, bổ sung xylanase một cách độc lập hay kết hợp với các enzyme khác vào thức
ăn làm tăng đáng kể khối lƣợng và giảm thiểu bệnh tật ở vật nuôi. Xylanase có tác
dụng phân giải xylan, một thành phần quan trọng của hemicellulose có nhiều trong
thức ăn của vật nuôi, giải phóng đƣờng xylose và xylooligosaccharide dẫn đến làm
giảm độ nhớt của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dƣỡng tốt
hơn, cải thiện hệ vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi.
Ở Việt Nam, nguồn vi sinh vật sinh enzyme trong đó có Xylanase khá phong
phú, phần lớn có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn. Đây là một thuận lợi lớn cho sự
phát triển lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất Xylanase từ vi sinh vật. Mặt khác, nƣớc
ta là một nƣớc nông nghiệp nên hàng năm các phế phụ phẩm nông nghiệp nhƣ rơm,
lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ lạc... rất lớn, đây là nguồn cung cấp chất lên men rẻ tiền
và dễ kiếm.
Muốn thu đƣợc enzyme có hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và
chọn giống vi sinh vật để chọn những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải lựa
chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trƣờng tối ƣu cũng nhƣ tiêu chuẩn hóa
điều kiện nuôi cấy.
Ở Việt Nam hiện nay, công nghệ enzyme vẫn chƣa phát triển, nguồn enzyme
còn hạn chế phụ thuộc vào enzyme nhập khẩu từ nƣớc ngoài. Vì vậy, việc nghiên
cứu và phát triển công nghệ enzyme để ứng dụng vào công nghiệp, đời sống là rất
cần thiết.
18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
3
Từ những lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài: “Khảo sát một số yếu tố ảnh
hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký
lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp.”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm ra môi trƣờng tốt nhất để chủng nấm mốc Trichoderma spp. thực hiện
tối ƣu hóa môi trƣờng
Tinh sạch enzyme xylanase đƣợc thu nhận từ nấm mốc Trichoderma spp.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Khảo sát thành phần môi trƣờng cảm ứng để chủng nấm mốc Trichoderma
spp. cho hoạt lực enzyme cao nhất. Các thành phần của môi trƣờng ảnh hƣởng đến
hoạt lực enzyme bao gồm: tỷ lệ cám mì : bã mía, độ ẩm, nồng độ dinh dƣỡng, pH,
thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống.
Tách chiết và tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phƣơng pháp Bradford dùng để xác định hàm lƣợng protein.
Phƣơng pháp Xylose dùng để xác định hoạt tính enzyme xylanase.
Phƣơng pháp tủa enzyme bằng các tác nhân khác nhau.
Phƣơng pháp tinh sạch enzyme xylanase bằng sắc ký lọc gel.
5. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp
Chƣơng 3: Kết quả và biện luận
Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị
19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cơ chất xylan, enzyme xylanase
1.1.1. Cơ chất xylan
Xylan là thành phần chính của hemicelluloses thực vật, đứng thứ hai sau
cellulose và chiếm khoảng một phần ba nguồn carbon hữu cơ có thể phục hồi trên
trái đất (Prade, 1995). Trong đó, hemicelluloses là phức hợp polysaccharide gồm
xylan, xyloglucan, glucomannan và arabinogalactan (Shallom, D và Shoham, Y ,
2003). Phức hợp này cùng với cellulose, pectin và một lƣợng nhỏ glycoprotein và
các hợp chất phenolic hình thành vách tế bào sơ cấp. Sau đó, vách tế bào sơ cấp
đƣợc phát triển thành vách thứ cấp.
Ngoài thành phần chính là cellulose và hemicelluloses, trong vách thứ cấp
còn có thêm lignin – đƣợc hình thành bởi quá trình đồng hóa các dẫn xuất
phenylpropan nhƣ cumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol tạo nên
thành phần polymer của vách tế bào thực vật (Kulkarni, N et al, 1999). Ba thành
phần chính trong cấu trúc vách tế bào thực vật kết hợp với nhau nhờ các liên kết
cộng hóa trị và không cộng hóa trị. Xylan đƣợc tìm thấy ở điểm giao giữa lignin và
cellulose, đây là giao điểm quan trọng của sự gắn kết và toàn vẹn của vách tế bào
thực vật (Beg, Q.K., et al. 2001).
Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc vách tế bào thực vật
20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
5
Xylan đƣợc tìm thấy trong một lƣợng lớn trong gỗ cứng của thực vật hạt kín
(15 – 30%) và gỗ mềm của thực vật hạt trần (7 – 10%), cũng nhƣ trong cây hàng
năm (< 30%) (Singh, S, et al., 2003). Xylan là polysaccharide phức, có cấu trúc thay
đổi giữa các loài thực vật khác nhau. Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylose
đƣợc nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside, tảo biển tổng hợp xylan với cấu
trúc khác là D-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,3-glucoside. Nhìn chung,
xylan là polysaccharide có cấu trúc gồm các đơn vị xylose liên kết với liên kết β-
1,4-glucoside (Whistler và Richards, 1970). Phần lớn xylan là heteropolysacharide,
có các nhóm thế khác nhau trong khung sƣờn và chuỗi bên (Biely, 1995). Các nhóm
thế phổ biến trên khung sƣờn xylan là acetyl, arabinofuranosyl và glucuronysyl
(Whitsler và Richards, 1970). Với các nhóm thế khác nhau nhƣ vậy, xylan đƣợc
phân loại thành homoxylan thẳng, arabinoxylan, acetyxylan, glucuronoxylan và
glucu-arabinoxylan.
1.1.2. Hệ enzyme xylanase
Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 trong khung sƣờn xylan. Xylanase đƣợc
biết thuộc họ 10 và 11 (hơn 300 trình tự gen đã đƣợc biết) và khoảng hơn 20 gen
xylanase đƣợc xếp vào họ 5, 8, 43 (Shallom, Shoham, 2003).
Cho đến nay, đã có 87 xylanase đƣợc xác định cấu trúc lập thể. Hầu hết
xylanase của vi sinh vật là protein đơn phân tử. Ngày nay, xylanase đa phân tử ngày
càng đƣợc miêu tả nhiều hơn. Những enzyme này chứa những cấu trúc đƣợc coi là
vùng xúc tác (catalytic domain) hoặc một số vị trí gắn với carbohydrate. Những
enzyme xylanase chứa CBDs có hiệu quả thủy phân cao trên cơ chất kết tinh và
nồng độ cao trên bề mặt cơ chất lỏng.
1.1.3. Hệ xylanase của Trichoderma spp.
Vi sinh vật sinh ra nhiều loại endoxylanase với các đặc tính lý hóa, cấu trúc,
hoạt tính và hiệu suất rất đa dạng và phức tạp. Các chủng Trichoderma sản xuất ra
tất cả các enzyme thủy phân xylan. Nhiều loài đã đƣợc phân tách và giải trình tự.
21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
6
Hệ enzyme thủy phân xylan đƣợc sản xuất bởi chủng Trichoderma, chủ yếu là
T.reesei, là những enzyme đƣợc xác định rõ trong nhóm thủy phân vách tế bào.
1.1.4. Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan
Xylanase là enzyme cảm ứng đƣợc vi sinh vật tiết vào môi trƣờng nuôi cấy
có mặt xylan hoặc cơ chất giàu xylan (Balakrishnan và cộng sự, 1997). Xylan là
polymer cao phân tử không thể xâm nhập vào tế bào. Do vậy, sự sinh tổng hợp
xylanase đƣợc cảm ứng chủ yếu bởi các phân đoạn của xylan nhƣ xylose, xylobiose,
xylooligosacharide của xylose, có trọng lƣợng phân tử thấp đƣợc tạo ra trong môi
trƣờng nhờ một lƣợng nhỏ enzyme xúc tác (Bastawde 1992, Kulkarni và cộng sự,
1999).
Nhiều nghiên cứu cho rằng, ligocellulose có trong cám mì, trấu, bã mía…là
yếu tố cảm ứng vi sinh vật sinh xylanase (Beg và cộng sƣ, 1998, Puchart và cộng
sự, 1999). Các loại nấm sợi sử dụng xylan nhƣ nguồn carbon để cảm ứng sinh tổng
hợp xylanase.
1.2. Giới thiệu chung về nấm sợi Trichoderma spp.
1.2.1. Phân loại Trichoderma spp
Lớp: Euascomycetes
Bộ: Hypoceales
Họ: Hypocreaceae
Giống: Trichoderma
Hình 1.2. Trichoderma spp.
Có 5 loài chính: Trichoderma Harzianum, Trichoderma koningii,
Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma viride.
22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
7
1.2.2. Đặc điểm sinh học của Trichoderma spp.
Trichoderma là nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng cách đính bào tử từ
khuẩn ty. Khuẩn lạc có màu trắng hoặc từ lúc trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến
lục đậm.
Khuẩn ty không màu, cuống sinh bào tử phân nhiều nhánh, ở cuối nhánh
phát triển thành khối tròn mang các bào tử không có vách ngăn, không màu, liên kết
nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc
hình thuôn, có thành trơn hoặc nhám. Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển
nhanh, đƣờng kính khuẩn lạc lớn hơn 9cm sau 5 ngày trên môi trƣờng thạch đĩa OA
(oatmeal agaro) ở 20ºC.
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma spp.
Trichoderma phân bố chủ yếu ở trong đất và phân hủy gỗ, xác thực vật. Các
loài Trichoderma là thành phần chiếm ƣu thế trong hệ vi sinh vật đất với môi
trƣờng sống biến đổi đa dạng. Trichoderma rất khó tìm thấy trên thực vật sống và
không sống nội kí sinh thực vật (Gary J Samuels, 2000). Các chủng Trichoderma
spp. đƣợc tìm thấy rất nhiều trong môi trƣờng tự nhiên, đặc biệt trong môi trƣờng
đất, chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác, …),
chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%) và sống đƣợc ở đất acid và
base (pH 3 – 8). Hầu hết các loài Trichoderma sống hoại sinh, thƣờng gặp trên xác
bã thực vật, ở những nơi ẩm ƣớt… Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức
ăn khác nhau từ carbonhydrate, amino acid đến ammonia.
Theo Garrett (1956), khả năng cạnh tranh dinh dƣỡng cao của Trichoderma
spp. Do các đặc tính sau:
- Sinh trƣởng mạnh và bào tử nảy mầm rất nhanh.
- Có khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cao.
- Có khả năng tạo chất kháng sinh.
- Chịu đƣợc chất kháng sinh.
23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
8
Các loài Trichoderma spp. khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng
khác nhau. Chẳng hạn nhƣ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có
khả năng sống trong môi trƣờng có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và
Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum phân
bố ở vùng có khí hậu ấm áp.
1.2.4. Một số ứng dụng của Trichoderma
1.2.4.1. Bảo vệ thực vật
Trichoderma đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học. Chúng có
khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm gây bệnh thực vật, đồng thời kích
thích sự tăng trƣởng của cây trồng. Quá trình kiểm soát sinh học bởi Trichoderma
theo các cơ chế sau:
Sự kí sinh nấm: Trichoderma có khả năng cảm ứng tiết ra một lƣợng lớn các
enzyme chitinase, glucanase, cellulose, protease… thủy phân vách tế bào sợi nấm
gây bệnh làm cho chúng không phát triển đƣợc và bị tiêu diệt.
Khả năng tiết kháng sinh: Trichoderma còn có khả năng tiết một số chất
kháng sinh dễ bay hơi hoặc không bay hơi và một số hợp chất ức chế tăng trƣởng.
Ngoài ra, Trichoderma có khả năng cạnh tranh chất dinh dƣỡng và không
gian, làm bất hoạt hệ enzyme ở nấm gây bệnh.
1.2.4.2. Cải thiện năng suất cây trồng
Ngày nay, các nƣớc có nền công nghiệp phát triển có xu hƣớng sử dụng phân
bón hữu cơ sinh học thế hệ mới, thực chất là sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và
thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học để khắc phục những hạn
chế khi sử dụng phân bón hóa học, thuốc trừ sâu mà vẫn cho năng xuất cây trồng.
Khi khảo sát các loài Trichoderma ở các lớp đất sâu, ngƣời ta thấy rằng
Trichoderma làm tăng số lƣợng các rễ nằm sâu trong đất, điều này góp phần giúp
các cây lƣơng thực nhƣ ngô có khả năng chống chịu hạn tốt.
Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa. Đã
có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và
24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
9
Trichoderma koningii kích thích sự nẩy mầm và tăng trƣởng của cây. Đối với các
hoa đƣợc trồng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy mạnh sự ra hoa bằng
cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lƣợng hoa.
1.2.4.3. Xử lý ô nhiễm môi trường
Trichoderma harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp
chất tự do 2, 4, 6-trichlorophenol; 4,5-dichloroguaiacol và alcohol oxidase trong
môi trƣờng chứa muối khoáng.
Trichoderma harzianum CCT – 4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion
trong đất trong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô
nhiễm trong đất và trong đầm lầy.
Trichoderma reesei Rut-30 có thể xử lý chất thải sinh hoạt đô thị, hứa hẹn
một nguồn sản xuất enzyme cellulose rẻ tiền, đồng thời giảm lƣợng rác thải.
1.2.4.4. Các lĩnh vực khác
Các enzyme ngoại bào đƣợc tổng hợp từ Trichoderma bao gồm cellulase,
hemicellulase, đƣợc ứng dụng rỗng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: sản xuất
thức ăn gia súc, sản phẩm thực phẩm và đồ uống, công nghiệp dệt và sản xuất
giấy…
1.3. Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzyme
Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định:
- Giống vi sinh vật quyết định đến năng suất của enzyme.
- Giống vi sinh vật ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm sinh học (hay là
hoạt tính enzyme).
- Giống vi sinh vật quyết định vốn đầu tƣ cho sản xuất.
- Giống vi sinh vật quyết định giá thành cho sản phẩm. Nhƣ vậy giống vi
sinh vật có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật.
25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
10
1.4. Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và đƣợc
sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó giống vi sinh vật ứng dụng trong công
nghệ enzyme cần có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:
Giống vi sinh vật phải tạo ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này
phải có số lƣợng và chất lƣợng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì vậy trong quá
trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lƣợng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng
nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể vi sinh vật
cần tổng hợp nhiều chất và tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau. Chính vì thế
giống vi sinh vật dùng cho sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải
trội hơn các sản phẩm khác cả về số lƣợng và chất lƣợng.
Cho năng suất sinh học cao. Có khả năng thích nghi nhanh và phát triển
mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp.
Có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phƣơng nơi
nhà máy hoạt động.
Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật
thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
Có tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo ra sản phẩm mong muốn, dễ tách sản
phẩm ra khỏi tạp chất.
Ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản.
Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên
men công nghiệp ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.
26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
11
1.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase
1.5.1. Bã mía
Thành phần hóa học của bã mía
Bã mía (sản phẩm của quá trình ép mía) là phế liệu chiếm nhiều nhất trong
sản xuất đƣờng. Từ 100 tấn mía cây đƣa vào nhà máy, ta có 10 – 12 tấn đƣờng, 23 –
28 tấn bã mía, 3 – 4 tấn mất rỉ, 1,5 – 3 tấn bùn lọc. Bã mía sau khi ép thƣờng ngậm
45 – 50 % nƣớc.
Ngoài nƣớc bã mía còn chứa thành phần chất xơ chủ yếu là cellolose. Các
chất hòa tan trong nƣớc (nƣớc này là nƣớc thẩm thấu và nƣớc mía nguyên chất)
gồm đƣờng và các chất tạp khác, các chất hòa tan chiếm số lƣợng nhỏ từ 2 đến 4%.
Thành phần
Bã mía (toàn
bộ)
Xơ bã mía (%) Tủy mía (%)
Cellulose
Hemicelluloses
Lipid và sáp
Chất khoáng
Lignin
Silic
46,00
24,50
3,45
2,40
19,95
2,22
56,50
26,11
2,25
1,30
19,15
0,46
55,40
29,30
3,55
3,02
22,30
2,42
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của bã mía (A.G.Keller, 1964).
1.5.2. Cám mì
Cám mì là sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến bột mì.
Thành phần Cám mì
Protein thô
Chất xơ thô
Chất béo thô
Độ ẩm
14 – 15,5%
8 – 10%
4,5 – 6%
11 – 14%
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cám mì
27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
12
Cám mì là loại thức ăn tốt cho gia súc. So với cám gạo, cám mì có hàm
lƣợng protein cao hơn (bình quân 15,5%), ít hơn dầu (bình quân 4%), 8 – 10% xơ
thô với độ ẩm 11 – 14%, năng lƣợng trao đổi là 2420 Kcal/g. Cám mì thƣờng có hai
loại: loại có màu vàng nâu nhạt, hoàn toàn là cám; loại màu ngà trắng, ngoài vỏ cám
còn lẫn cả tinh bột.
1.6. Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme và các yếu tố ảnh
hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase trong điều kiện nuôi cấy bán
rắn
Ngày nay, nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng bán rắn đƣợc quan tâm và sử
dụng rộng rãi nhằm tăng giá trị cho các sản phẩm từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền,
các phế liệu nông nghiệp và chất thải công nghiệp. Canh trƣờng bán rắn sau khi
ngừng nuôi cấy có thể đem nghiền nhỏ, sấy khô, đông khô đến độ ẩm 8 – 12% để sử
dụng nhƣ chế phẩm enzyme thô.
Lên men bán rắn là sự sinh trƣởng của vi sinh vật trên cơ chất ẩm. Ở đây, vi
sinh vật phát triển và bao phủ bề mặt môi trƣờng rắn, các nguồn dinh dƣỡng (cám
mì, bã mía…) đƣợc làm ẩm và dùng làm môi trƣờng. Vi sinh vật sử dụng chất dinh
dƣỡng trong môi trƣờng và oxy trong không khí để tạo hệ sợi nấm phát triển, sự
tổng hợp enzyme sẽ hoàn thành say khoảng 36 – 40 giờ, có khi lâu hơn tùy chủng.
Để tăng sự tổng hợp một số enzyme ngƣời ta thêm vào canh trƣờng một số
chất cảm ứng cần thiết. Ngoài ra, để cấu trúc đƣợc thoáng, ngƣời ta bổ sung thêm
trấu, mùn cƣa… Song, nếu thêm nhiều hơn 15 – 20%, chúng sẽ làm nghèo dinh
dƣỡng của môi trƣờng. Vậy cần bổ sung nguồn nitrogen vô cơ, phosphor…
1.6.1. Độ ẩm của môi trường nuôi cấy
Độ ẩm không những ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và trao đổi chất của vi
sinh vật mà còn ảnh hƣởng đáng kể đến đặc tính lý hóa của cơ chất. Độ ẩm trong
môi trƣờng lên men bán rắn đƣợc thể hiện qua hàm lƣợng nƣớc của cơ chất rắn, ảnh
hƣởng đến áp suất thẩm thấu do các chất tan trong cơ chất.
28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
13
Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nƣớc khác nhau. Do đó, quá trình lên
men bán rắn đƣợc thực hiện với hàm lƣợng nƣớc trong cơ chất khác nhau từ 30 –
80%.
Độ ẩm thích hợp để thu canh trƣờng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao là
53 – 70% tùy thuộc đặc điểm sinh lý của chủng giống, thành phần, cấu trúc cơ học
của môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy. Trong nuôi cấy bán rắn, độ ẩm quá cao cản
trở sự thoáng khí, làm giảm hoạt động sống của vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu cho
thấy, nấm mốc và xạ khuẩn đều phát triển tốt trong môi trƣờng xốp có độ ẩm từ 60
– 65%.
1.6.2. Sự thông khí
Vi sinh vật tổng hợp xylanase thƣờng hiếu khí, do đó độ thông khí của môi
trƣờng ảnh hƣởng lớn đến quá trình tổng hợp enzyme của chúng. Trong nuôi cấy
bán rắn, việc cung cấp oxy thƣờng rất thuận lợi, phụ thuộc độ xốp của cơ chất, độ
dày của môi trƣờng, nhiệt độ và độ thoáng khí của phòng nuôi cấy. Trong các yếu
tố trên, độ xốp của cơ chất và độ dày của lớp môi trƣờng là chủ yếu quan trọng hơn
cả.
1.6.3. Nguồn carbon
Nguồn carbon là thành phần dinh dƣỡng cơ bản đối với sự sinh trƣởng và
phát triển của vi sinh vật. Khi nuôi cấy bán rắn theo hƣớng tận dụng phế phụ liệu thì
nên lựa chọn cơ chất vừa là nguồn carbon vừa là cơ chất cảm ứng.
1.6.4. Nguồn nitrogen
Nguồn nitrogen cũng là một trong những nguồn dinh dƣỡng cơ bản, thiết yếu
đối với vi sinh vật và ảnh hƣởng rất rõ đến sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật.
Nitrogen vô cơ có thể ở dạng các muối nitrat và amonium. Đối với nấm sợi,
muối nitrat là nguồn nitrogen thích hợp để sinh tổng hợp enzyme. Muối này làm
kiềm hóa môi trƣờng, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành enzyme. Muối
amonium, khi đƣợc đồng hóa tạo nên các aniom vô cơ làm thấp pH của môi trƣờng.
Điều này không những ức chế vi sinh vật mà còn làm mất hoạt tính enzyme sau khi
tạo thành.
29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
14
Nguồn nitrogen hữu cơ có thể là các hợp chất hữu cơ phức tạp nhƣ dịch nấm
men, nƣớc chiết đậu nành…
1.6.5. pH
pH của môi trƣờng cũng có ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng
sinh tổng hợp xylanase của vi sinh vật, đối với những loài vi sinh vật khác nhau có
sự ảnh hƣởng khác nhau. Sự sinh trƣởng của vi sinh vật có thể làm thay đổi đáng kể
pH trong cơ chất.
Sự thay đổi này phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật và khả năng đệm của cơ chất rắn. Tuy nhiên, pH rất khó kiểm soát trong môi
trƣờng lên men bán rắn. Ngƣỡng pH thích hợp cho các loại nấm mốc từ 3 – 8.
1.6.6. Các nguyên tố khoáng
Nhu cầu chất khoáng ở vi sinh vật là rất ít, nhƣng không thể thiếu. Nhu cầu
này không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển của vi sinh vật.
theo nghiên cứu, Nguyễn Lân Dũng, 2007 nhận thấy nồng độ cần thiết về chất
khoáng đối với vi nấm thƣờng thay đổi trong phạm vi nhƣ ở bảng 1.3.
Chất khoáng Nồng độ cần thiết (g/l)
K2HPO4
KH2PO4
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
FeSO4.7H2O
Na2MoO4
ZnSO4.7H2O
CoCl2
CaCl2
CaSO4.5H2O
1 – 2
1 – 2
0,2 – 0,5
0,02 – 0,1
0,02 – 0,05
0,01 – 0,02
0,02 – 0,1
< 0,06
0,02 – 0,1
0,01 – 0,05
Bảng 1.3. Nồng độ chất khoáng cần thiết cho sinh trƣởng nấm mốc và xạ
khuẩn.
30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
15
1.7. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch chế phẩm enzyme
Trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào chất của tế bào. Các phân tử
enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào. Do đó để có thể chiết rút
enzyme nội bào trƣớc hết cần phá vỡ cấu trúc của tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của
tế bào bằng biện pháp cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóa bằng các thiết
bị đồng hóa) bằng tác dụng của các dung môi hữu cơ (rƣợu butylic, aceton,
glycerin…) của sóng siêu âm.
Việc tách enzyme ra khỏi tế bào gặp nhiều khó khăn, do đó khi tách chúng
phải hết sức lƣu ý:
- Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lƣợng không lớn so với các thành
phần khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất
khó khăn. Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi
chịu các tác động bên ngoài.
- Enzyme là protein mà protein enzyme luôn đi cùng với những loại
protein không phải enzyme nhƣng lại có tính chất lý hóa rất giống nhau.
Do đó việc tách protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc
nào cũng đạt đƣợc kết quả tốt và không phải gặp những khó khăn nhất
định.
- Đa số các ngành sản xuất thực phẩm cũng nhƣ công nghiệp nhẹ thì lại đòi
hỏi phải dùng enzyme sạch. Để tách chiết enzyme từ môi trƣờng rắn
ngƣời ta thƣờng dùng nƣớc, các dung môi trung tính và các dung dịch
đệm thích hơp. Trong đó, nƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi và cho kết quả tốt
nhất. Các enzyme đƣợc chuyển từ tế bào vào nƣớc do sự chênh lệch nồng
độ. Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzyme đƣợc cô đặc dƣới áp suất thấp
sao cho hàm lƣợng chất khô không nhỏ hơn 50 – 55%.
Theo phƣơng pháp khuếch tán bằng nƣớc, có thể chiết đƣợc lƣợng enzyme
trên 90 – 95% và trong dịch chiết không chứa các tạp chất không tan. Nƣớc thƣờng
dùng để chiết có nhiệt độ 25 – 28o
C. Dịch chiết thu đƣợc có màu nâu sẫm, khá
trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và đƣợc làm lạnh kịp thời xuống còn 10 –
31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
16
12o
C. Trong dịch chiết ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác,
để loại bỏ chúng cần thực hiện nhiều phƣơng pháp khác nhau.
Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lƣợng thấp ngƣời ta thƣờng dùng
biện pháp thẩm tích đối với nƣớc hay các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc
qua gel.
Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lƣợng cao khác, thƣờng
dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau. Phƣơng pháp biến tính chọn lọc nhờ các
tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trƣờng, phƣơng pháp kết tủa phân đoạn
bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phƣơng pháp sắc ký, điện di,
phƣơng pháp lọc gel.
1.8. Sợ lƣợc về sắc ký lọc gel
1.8.1. Bản chất của phương pháp
Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lƣợng phân
tử và phân tích tƣơng tác phân tử.
Một số thông số vật lý của phƣơng pháp
- Giới hạn tách (exclution limit): là trọng lƣợng phân tử (MW) của phân tử
nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel. Ví dụ: giới hạn tách của G –
50 có FR từ 1.500 – 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn đều
không chui vào hạt gel.
- Phạm vi tách (Fructionation range): ví dụ: sephadex G – 50 có FR từ
1.500 – 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW
nói trên sẽ đƣợc tách dễ dàng bởi G – 50.
- Độ ngậm nƣớc (water regain): là trong lƣợng nƣớc mà 1 gam bột gel khô
hút nƣớc. Ví dụ: G – 50 có WR là 0,5 ± 0,3g. Giá trị này chƣa tính đến
lƣợng nƣớc bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích
của cột.
- Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp
thu khi trƣơng nở trong nƣớc. G – 50 có thể tích nền 9 – 11ml/g gel khô.
32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
17
- Hạt gel (gel particle): hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác
định bằng mesh hoặc đƣờng kính hạt (bead diameter) tính theo µm. Hạt
có kích thƣớc lớn (50 – 100 mesh, 100 – 300 µm) cho tốc độ dòng chảy
qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400
mesh, 10 – 40 µm) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không
tốt. Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100 – 200 mesh, 50 - 150
µm.
- Thể tích trống (void volume): là tổng thể tích không gian bao quanh hạt
gel trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000
Daltons.
- Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần
tách ra khỏi cột.
1.8.2. Đặc tính của gel
Có 4 loại gel thƣờng đƣợc sử dụng.
- Dextran có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB
(Thụy Điển) cung cấp với tên thƣơng mại là Sephadex. Giới hạn tách của gel
dextran là 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang nên khó giữ
nguyên vẹn hạt nếu kích thƣớc lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran đƣợc bổ sung thêm
các liên kết ngang bởi N,N’ – methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách
gia tăng.
- Gel polyacrylamide: tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và
N,N’ – methylene bisacrylamide (Bio – Rad cung cấp – Biogel – P là tên thƣơng
mại).
- Gel agarose: là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ
galactose và anhydrogalactose. Mạng gel đƣợc ổn định nhờ liên kết hydro nhiều
hơn 1 do các liên kết ngang. Hãng Bio – Rad cung cấp agarose với tên thƣơng mại
là Bio – gel A, còn Pharmacia – cung cấp tên thƣơng mại là sepharose và seperose.
- Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thƣơng mại là ultragel, nó
cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng.
33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
18
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP
2.1. Nguyên liệu
- Lúa
- Cám mì
- Bã mía
- Giống mốc Trichoderma
2.2. Hóa chất và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Thuốc thử Coomassie
- Thuốc thử DNS
- Thuốc thử lugol
- Dung dịch đệm Citrate
- Acetone, acetate pH5, NaCl
2.2.2. Thiết bị
Tủ hút
Kính hiển vi
Máy đo quang phổ
Máy vortex
Microwave
Tủ ủ
Autoclave
Cân phân tích
Buồng đếm hồng cầu
Máy khuấy
Đo pH
Máy ly tâm
34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase
từ nấm mốc Trichoderma spp.
2.3.1. Phương pháp mô tả hình thái Trichoderma
2.3.1.1. Quan sát đại thể
- Dùng que cấy móc vô trùng gạt nhẹ lên bào tử đính của sợi nấm,
chuyển sang đĩa petri chứ môi trƣờng PGA, cắm đầu móc xuống giữa
mặt thạch.
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 – 3 ngày.
- Quan sát hình dạng và màu sắc khuẩn lạc của sợi nấm ở mặt trên và
mặt dƣới của khuẩn lạc.
2.3.1.2. Quan sát vi thể
- Lót giấy thấm ở mặt đáy đĩa petri, đặt vào một miếng lame, gói giấy
và đem khử trùng.
- Nhỏ 3 giọt môi trƣờng PGA vào lame và chờ đông lại, cấy 1 điểm vào
giữa môi trƣờng PGA rồi đậy miếng lamen lên.
- Làm ẩm 4 góc giấy bằng nƣớc cất vô trùng.
- Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng.
- Sau 2, 3 ngày lấy miếng lame ra khỏi đĩa petri, nhỏ vài giọt cồn thấm
bằng giấy sau đó nhỏ tiếp NaOH 10% thấm khô.
- Quan sát kính hiển vi với độ phóng đại x40.
2.3.2. Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu
Cách tiến hành
Cân 1g giống bào tử ống nghiệm chứa 9ml nƣớc cất bổ sung Tween 80
0,1% vortex độ pha loãng 10-1
tiếp tục pha loãng cho đến 10-4
cho vào
buồng đếm hồng cầu quan sát X40 và đếm bào tử.
Công thức tính số bào tử trong 1g cơ chất
35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
20
Trong đó :
- N: số lƣợng bào tử trong 1ml dịch huyền phù
- a: số lƣợng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con)
- b: số ô con trong 5 ô lớn (16 x 5 = 80)
- 103
: số chuyển mm3
thành ml (1000 mm3
= 1ml)
- n: độ pha loãng của mẫu
2.3.3. Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải
Nguyên tắc
Khi cho enzyme tác dụng với cơ chất trong môi trƣờng thạch, các hợp chất
này đƣợc phân giải thành các hợp chất đơn giản hơn. Có thể định tính và định lƣợng
sơ bộ hoạt tính xylanase dựa vào vòng phân giải xylan do các hợp chất không phản
ứng màu với thuốc thử.
Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ
- Môi trƣờng định tính hoạt tính xylanase của dịch enzyme theo phƣơng pháp
cấy điểm: PGA bổ sung xylan.
- Thuốc thử glugol.
- Đĩa petri hấp khử trùng ở 121o
C, 1 atm, 15 phút.
Cách tiến hành
Đổ đĩa môi trƣờng định tính hoạt tính xylanase dùng que cấy điểm
Trichoderma vào giữa môi trƣờng cho thuốc thử glugol vào sau khi khảo sát ở 8h
; 16h ; 24h ; 32h ; 40h ; 48h ; 56h ; 64h ; 72h đo vòng phân giải.
36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
21
2.3.4. Quy trình khảo sát một số yếu tố
Giống Trichoderma
Cấy chuyền (môi trƣờng
thạch nghiêng PGA)
Khảo sát sinh tổng
hợp enzyme (môi
trƣờng bán rắn)
Khảo sát độ ẩm
môi trƣờng
Khảo sát tỷ lệ
cơ chất
Cất giữ giống (môi
trƣờng lúa)
Khảo sát pH Khảo sát thời
gian nuôi cấy
Khảo sát nồng
độ dinh dƣỡng
Khảo sát tỷ lệ
giống
37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
22
2.3.5. Thuyết minh quy trình
2.3.5.1. Giống mốc Trichoderma
Viện Sinh học Nhiệt Đới cung cấp đƣợc nuôi trong môi trƣờng PGA thạch
nghiêng ở nhiệt độ thƣờng trong thời gian là 36h, khi bào tử đƣợc hình thành
đem bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
2.3.5.2. Cấy chuyền
Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ
- Môi trƣờng PGA: khoai tây 200g, agar 20g, glucose 20g, nƣớc cất
1000ml, hấp khử trùng ở 121o
C, 1 atm, 15 phút.
- Que cấy mốc, ống nghiệm.
Cách tiến hành
- Cho môi trƣờng vào 1/3 ống nghiệm hấp khử trùng ở 121o
C, 1 atm, 15
phút, lấy ra và để nghiêng sao cho thạch không bị dính lên trên nút
bông, chờ cho thạch đông lại.
- Dùng que cấy đã hấp khử trùng cấy ria trên bề mặt thạch
- Giống sau khi cấy nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
2.3.5.3. Cất giữ giống
Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ
- Môi trƣờng lúa bổ sung (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCl2,
UREA, pepton, hấp khử trùng ở 121o
C, 1 atm, 15 phút.
- Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, que cấy vòng tất cả đều đƣợc thanh
trùng.
Cách tiến hành
- Cho 1ml nƣớc cất vào trong ống giống, dùng que cấy mài nhẹ trên bề
mặt thạch để tách bào tử, cho chúng hoàn toàn nằm trong pha nƣớc
nhƣ các dịch huyền phù.
- Sau đó đổ toàn bộ nƣớc chứa bào tử vào trong môi trƣờng nhân giống
và trộn kỹ.
38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
23
2.3.5.4. Khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase từ Trichoderma spp.
Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ
- Môi trƣờng khoáng Czapeck: KNO3, KH2PO4, MgSO4, FeSO4, KCl
- Môi trƣờng bán rắn: 20g cám mì – bã mía bổ sung khoáng Czapeck.
- Thuốc thử Coomassie
- Thuốc thử DNS
- Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, nƣớc tinh khiết, bình định mức 50ml,
tất cả đều đƣợc thanh trùng.
Cách tiến hành
- Cho vào môi trƣờng lúa nhân giống 20ml nƣớc tinh khiết, dùng đũa
thủy tinh khuấy để bào tử hòa lẫn vào nƣớc.
- Dùng pipetman hút 2 ml cho vào môi trƣờng bán rắn.
- Sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ phòng ở 48h.
- Đo hàm lƣợng protein: sử dụng thuốc thử Coomassie và đo ở bƣớc
sóng 595 nm.
- Đo hoạt tính enzyme: sử dụng thuốc thử DNS, cơ chất xylan và đo ở
bƣớc sóng 540 nm.
Thí nghiệm 1: Khảo sát tỷ lệ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
xylanase ở tỷ lệ cám mì – bã mía
Tỷ lệ 4:6 6:4 5:5 3:7 7:3
Thí nghiệm 2: Khảo sát độ ẩm môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme xylanase
Độ ẩm
(%)
45 50 55 60 65 70
Thí nghiệm 3: Khảo sát pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase
pH 4,5 5 5,5 6 6,5
39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
24
Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme xylanase
Thời
gian
8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h 64h 72h 80h
Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ dinh dƣỡng đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme xylanase
Nồng độ x1 x2 x3 x4 x5
Thí nghiệm 6: Khảo sát tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
xylanase
Tỷ lệ
giống
1.12×1011
2.24×1011
3.36×1011
4.48×1011
5.6×1011
2.4. Bố trí thí nghiệm
Sau khi thu nhận kết quả khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase ta tiến hành
thu chế phẩm enzyme nhằm phục vụ cho các thí nghiệm khảo sát enzyme về sau.
Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát từng thông số kỹ thuật ảnh hƣởng
đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và quá trình tách chiết, tinh sạch sơ bộ
enzyme.
2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase
Mục đích nhằm chọn tỷ lệ dung dịch đệm tối ƣu để tách chiết enzyme cho
các thí nghiệm sau. Chọn ra tỷ lệ dung môi tốt nhất để thu nhận dịch chiết enzyme
xylanase.
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi để tách chiết enzyme
Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, các dung môi (nƣớc cất, đệm Citrate, đệm
Acetate, muối sinh lý NaCl).
40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
25
Cách tiến hành
Thí nghiệm 2: Khảo sát các tỷ lệ của dung môi tốt nhất để tách chiết thu
nhận enzyme.
Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, dung môi tốt nhất (kết quả của thí nghiệm 1).
Cân chế phẩm
enzyme
Bổ sung dung môi (tỷ lệ chế
phẩm : dung môi là 1:8)
Khuấy trong 30 phút
Lọc
Đo hàm lƣợng Protein và
Hoạt tính enzyme
Dịch chiết
41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
26
Cách tiến hành
2.4.2. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme xylanase
Mục đích khảo sát: Khảo sát các tỷ lệ các tác nhân với dịch chiết để chọn tỷ
lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất.
Tỷ lệ 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10
Chế phẩm
enzyme (g)
3 3 3 3 3 3 3 3
Dung môi
(ml)
9 12 15 18 21 24 27 30
Cân chế phẩm
enzyme
Khuấy trong 30 phút
Lọc
Đo hàm lƣợng protein và
Hoạt tính enzyme
Dịch chiết
42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
27
Thí nghiệm 3. Khảo sát tủa bằng cồn 96o
Chuẩn bị: Dịch chiết protein, cồn 96o
.
Cách tiến hành:
Để tránh làm biến tính protein, cồn 960
phải đƣợc làm lạnh trƣớc khi tiến
hành tủa. Thể tích dịch chiết protein và thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ 1:1, 1:2,
1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 4o
C trong 1 giờ. Sau đó ly tâm
10.000 vòng/phút trong thời gian là 5 phút. Thu tủa rồi đem đi xác định hoạt tính và
hàm lƣợng. Chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất.
Dịch chiết protein
(NH4)2SO4 Acetone
Cồn 960
Xác định hoạt tính và hàm luợng
1:1 1:2 1:3
3
1:4 1:5 1:6
50% 55% 60% 65% 70%
1:1 1:2 1:3
3
1:4 1:5 1:6
Chọn lấy tỷ lệ, nồng độ tốt nhất
43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
28
Thí nghiệm 4. Khảo sát tủa bằng muối (NH4)2SO4
Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát các nồng độ muối (NH4)2SO4 với dịch chiết để
chọn nồng độ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất.
Vật liệu: Dịch chiết protein, dung dịch muối (NH4)2SO4 (50%, 55%, 60%,
65%, 70%).
Cách tiến hành
Để tránh làm biến tính protein, dịch chiết protein thô đƣợc cho vào
ống ly tâm 5ml đặt trong chậu nhỏ chứa đá lạnh vụn xung quanh. Thể tích
dịch chiết protein và muối tƣơng ứng với các nồng độ 50%, 55%, 60%, 65%,
70%. Khuấy hỗn hợp bảo quản lạnh ở 40
C trong 30 phút. Sau đó ly tâm
10.000 vòng/phút trong thời gian là 5 phút. Thu tủa rồi đem đi xác định hoạt
tính và hàm lƣợng. Chọn nồng độ cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất.
Chọn lấy tỷ lệ tốt nhất
Dịch chiết protein
1:1 1:2 1:3
3
1:4 1:5 1:6
Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng
44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
29
Thí nghiệm 5. Khảo sát tủa bằng Acetone
Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát các tỷ lệ cồn với dịch chiết để chọn tỷ lệ cho hoạt
tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất.
Chuẩn bị: Dịch chiết protein, dung dịch Acetone.
Cách tiến hành:
Để tránh làm biến tính protein, Acetone phải đƣợc làm lạnh trƣớc khi
tiến hành tủa. Thể tích dịch chiết protein và thể tích dung dịch Acetone
tƣơng ứng với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6.
Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 40
C trong 30 phút. Sau đó ly tâm
10.000 vòng/phút trong thời gian là 5 phút. Thu tủa rồi đem đi xác định hoạt
tính và hàm lƣợng. Chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất.
Chọn lấy nồng độ tốt
nhất.
Dịch chiết protein
Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng
50% 55% 60%
3
65 % 70%
45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
30
Sau khi khảo sát các tác nhân tủa giữa dịch chiết với từng chất ta so sánh
xem tỷ lệ và nồng độ nào cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất thì chọn
2.4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase
Mục đích: Khảo sát nhiệt độ và pH cho hoạt tính enzyme tốt nhất.
Thí nghiệm 6. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzyme trong dịch
chiết
Vật liệu: Dịch tủa enzyme, các dụng cụ - thiết bị để chạy sắc ký.
Chọn lấy tỷ lệ tốt nhất
Dịch chiết protein
1:1 1:2 1:3
3
1:4 1:5 1:6
Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng
46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
31
Cách tiến hành
Sau khi khảo sát pH, ta có hoạt tính và hàm lƣợng protein ứng với từng pH.
Ta chọn pH cho kết quả hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất để thu nhận dịch tủa.
Thí nghiệm 7. Khảo sát ảnh hƣởng theo nhiệt độ
Chuẩn bị: Dịch tủa enzyme.
Cách tiến hành
Chọn lấy pH tốt nhất.
Dịch tủa protein
Xác định hoạt tính
pH 3 pH 4 pH 5
3
pH 6 pH 7
Chọn lấy nhiệt độ tốt
nhất.
Dịch tủa enzyme
Xác định hoạt tính
30o
C 40o
C 50o
C
3
60o
C 70o
C
47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
32
Sau khi khảo sát nhiệt độ, ta có hoạt tính và hàm lƣợng protein ứng với từng
nhiệt độ. Ta chọn nhiệt độ cho kết quả hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất.
2.4.4. Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký lọc gel
- Chuẩn bị cột sắc ký: sử dụng cột sắc ký Bio – Rad.
- Tốc độ dòng chảy: 1 ml/phút.
- Cột 50 x 1.5 cm.
- Phân đoạn: 2 ml.
- Thể tích: 2 ml.
Cách tiến hành
Bƣớc 1: Chuẩn bị gel
Cho 10 g bột gel Biogel P – 100 từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1 N,
pH 7 đựng trong cốc, không khuấy, để yên trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng cho quá
trình trƣơng nở xảy ra hoàn toàn tạo thể huyền phù đồng nhất của các hạt, sau khi
quá trình trƣơng nở xảy ra hoàn toàn gạn lớp nổi trên bề mặt bỏ đi, đổ thêm đệm
cho ngập phần gel và đuổi bọt khí bằng máy đuổi khí.
Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi
trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại
hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.
Bƣớc 2: Nhồi cột
Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm
đầy 20% thể tích cột. Rót đều, vừa rót vừa khuấy nhẹ để gel hấp phụ lắng từ từ theo
trọng trƣờng. Tránh không cho tạo thành bọt khí, phải rót liên tục. Dịch đệm thừa
cho chảy qua van dƣới cột. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở
khóa đầu ra của cột cho đến khi cột đƣợc nạp đầy gel. Khi cột đã đƣợc nạp đầy gel,
đặt một đĩa giấy lọc hoặc ít bông thủy tinh lên trên bề mặt nền cột để bảo vệ mặt cột
khi cho mẫu vào hoặc khi thay đổi dịch rửa trôi, khóa đầu ra của cột và gắn adaptor
vào.
48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
33
Cho chạy máy sắc ký để ổn định cột bằng đệm phosphate pH 7 với lƣợng
đệm chạy bằng 2 – 3 lần thể tích cột. Sau khi cột đã ổn định đóng đầu ra của cột và
điều chỉnh adaptor xuống sát lớp nền gel.
Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền gel qua adaptor.
Bƣớc 3: Nạp mẫu vào cột
Chuẩn bị mẫu: Mẫu chạy bằng sắc ký phải sạch, hòa tan mẫu trong NaOH
0.1 N. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0.45 micrometre) để làm gia tăng độ bền và
thời gian sử dụng cột.
Dùng xi lanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký.
Bƣớc 4: Thêm dung dịch đệm rửa
Sau khi mẫu thấm hết vào cột, bổ sung ngay vài ml dung dịch đệm rửa, để
cho mẫu còn đọng lại thấm hết vào nền cột. Mẫu và dung dịch đệm di chuyển qua
cột. Các phân tử di chuyển vào và ra ngoài lỗ hạt gel. Sau đó nối cột với bình chứa
dịch cột thổi.
Bƣớc 5: Thổi cột
Dịch thổi cột đƣợc giữ ổn định ở tốc độ thích hợp. Điều này rất quan trọng vì
tốc độ cột thổi cao cho kết quả tách mẫu thấp, ngƣợc lại nếu tốc độ thổi cột thấp kéo
dài thời gian tách mẫu, các peak bị loãng ra cho kết quả thấp. Thổi cột liên tục bằng
dung dịch đệm phosphate.
Bƣớc 6: Thu mẫu và xác định mẫu tách đƣợc
Dịch ra khỏi cột đƣợc đo hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng detector trong hệ
thống sắc ký và đƣợc thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP –
Data View trên máy tính. Dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu mẫu (collector).
Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các
peak sẽ đƣợc phân tích hàm lƣợng protein sau sắc ký theo phƣơng pháp Bradford.
+ Hiệu suất tinh sạch protein
Xác định hiệu suất quá trình tinh sạch bằng hệ thống sắc ký lọc gel
Hiệu suất tinh sạch =
ượ
ượ ư
x 100%.
+ Hiệu suất về hoạt tính enzyme:
49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
34
Hiệu suất về hoạt tính enzyme =
ư
+ Hoạt tính riêng của enzyme:
HTR của enzyme =
+ Độ tinh sạch enzyme
Độ tinh sạch enzyme =
ư
2.5. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả
2.5.1. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
2.5.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm
Trong đó:
- A: cơ chất nuôi cấy (g)
- B: độ ẩm muốn bổ sung vào môi trƣờng (%)
- C: độ ẩm trong cơ chất A (%)
- 100: độ ẩm 100%
- F: lƣợng nƣớc cần bổ sung vào môi trƣờng để đạt độ ẩm thích hợp
(ml)
2.5.1.2. Phương pháp Bradford xác định hàm lượng protein
Nguyên tắc
Phƣơng pháp này dựa trên những bƣớc sóng hấp thụ cực đại của thuốc
nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang
tính acid, khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bƣớc sóng
595nm. Độ hấp thu trực tiếp có liên hệ trực tiếp với nồng độ protein.
Chuẩn bị hóa chất
- Thuốc thử Bradford
50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
35
- Albumin: cân chính xác 10mg albumin, thêm 50 – 60 ml nƣớc cất
khuấy tan albumin cho vào bình định mức 100ml, dẫn nƣớc cho
đến vạch dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0,1 mg/ml
Cách tiến hành
Chuẩn bị 10 ống nghiệm đánh số 0 9, tiến hành thí nghiệm theo bảng sau:
Ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Nồng độ
albumin
(µg/ml)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Albumin
(0,1mg/ml)
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Nƣớc cất 10 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
Thuốc thử
Bradford
(ml)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Bảng 3.1. Bảng số liệu dựng đƣờng chuẩn Bradford
Tính toán kết quả
Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn và mật độ quang của mẫu khảo sát ta suy ra
đƣợc nồng độ protein của mẫu là X (µg/ml) có trong mg nguyên liệu.
Vậy hàm lƣợng protein có trong 1g nguyên liệu là:
HL (mg/ml)
Trong đó:
- X (µg/ml): nồng độ protein trong mẫu khảo sát dựa vào phƣơng trình
đƣờng chuẩn
- n: hệ số pha loãng mẫu từ 1g chế phẩm protein thô ban đầu
2.5.1.3. Xây dựng đường chuẩn xylose
51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
36
Chuẩn bị dung dịch xylose nồng độ 10mM: hòa tan 150mg xylose trong đệm
Na-citrate 0,05M pH 5,3 chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch
đệm đến vạch. Dung dịch này tiếp tục đƣợc pha loãng với dung dịch đệm
Na-citrate 0,05M pH 5,3 theo bảng sau:
Độ pha loãng Xylose (µMol/ml) BXU
1:1 (0,15g/100ml) 10,0 33,3
1:2 (25ml/50ml) 5,0 16,7
1:3 (16ml/50ml) 3,2 10,7
1:5 (10ml/50ml) 2 6,7
Bảng 3.2. Tỷ lệ pha loãng dung dịch Xylose chuẩn
+ Hút vào mỗi ống nghiệm 1,8 ml dung dịch xylan 1%
+ Thêm 3 ml dung dịch DNS và 200 µl dung dịch xylose chuẩn.
+ Chuẩn bị ống đối chứng với 200 µl dung dịch đệm Na-citrate 0,05M pH 3,5 thay
cho dung dịch xylose chuẩn.
+ Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm trên máy quang phổ.
Tiến hành phản ứng
+ Hút 1,8 ml dung dịch cơ chất cho vào 3 ống nghiệm có dung tích 25ml (hai ống
nghiệm cho mỗi lần xác định) và một ống đối chứng.
+ Đặt vào bể ổn định nhiệt có nhiệt độ 50º trong 5phút.
+ Tại thời điểm 0, bắt đầu tính giờ, thêm 200µl dung dịch enzyme đã pha loãng vào
ống nghiệm thứ nhất, và trộn bằng máy vortex, tiếp tục thêm enzyme vào khoảng
trên mỗi ống nghiệm ngoài trừ ống đối chứng.
+ Sau 5 phút phản ứng, thêm 3 ml dung dịch DNS vào mỗi ống và lắc đều.
+ Thêm 3 ml thuốc thử DNS, sau đó thêm 200µl dung dịch enzyme vào ống đối
chứng.
+ Đun sôi cách thủy các ống nghiệm trong thời gian 5 phút, sau đó làm mát trong
nƣớc lạnh cho đến nhiệt độ phòng.
+ Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm và tính theo đƣờng chuẩn xylose trên máy
quang phổ.
52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
37
Tính toán kết quả
Một đơn vị hoạt tính xylanase (BXU) là lƣợng enzyme thủy phân xylan sinh ra
lƣợng đƣờng khử tƣơng ứng với 1 nmol xylose trong 1 giây ở các điều kiện phản
ứng.
Một đơn vị hoạt tính xylanase (UI) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme thủy phân
xylan sinh ra đƣờng khử tƣơng ứng với 1µmol xylose trong 1 phút ở các điều kiện
phản ứng.
Nhƣ vậy 1 UI = BXU ; 1UI = 1 µmol xylose/ml/phút
HT (UI) =
Trong đó:
- X: số µmol xylose suy ra từ đƣờng chuẩn
- K: hệ số pha loãng
- v: thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme
- t: thời gian phản ứng
2.5.2. Xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel.
53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
38
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Quan sát hình thái Trichoderma spp. trên môi trƣờng PGA
3.1.1. Quan sát đại thể
Mặt dư i khẩn lạc Mặt trên khuẩn lạc
Bào tử
Hình 3.1. Hình thái đại thể của Trichoderma spp.
Hình thái đại thể sau khi quan sát ở thời gian 24h thì tơ có dạng bông, khi
còn non khuẩn lạc có màu trắng, khi già thì khuẩn lạc có màu xanh lục, đây là màu
54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
39
của bào tử đính. Trichoderma spp. này không tiết sắc tố màu vàng ra môi trƣờng
thạch.
3.1.2. Quan sát vi thể
Hình 3.2. Hình thái vi thể của Trichoderma spp. nuôi ủ ở 24h
Hình 3.3. Hình thái vi thể của Trichoderma spp. nuôi ủ ở 36h
Hình 3.4. Hình thái vi thể của Trichoderma spp. nuôi ủ ở 48h
Sau khi nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong
thời gian 24h thì khuẩn ty có vách ngăn,
cuống sinh bào tử có dạng phân nhánh
giống nhƣ cành cây.
Sau khi nuôi ủ trong thời gian là 36h thì
khuẩn lạc lên tơ già, mỗi nhánh mang
nhiều tế bào sinh ra bào tử đính, mang
bào tử đính riêng rẽ, bào tử đính dính
nhau thành cụm.
Sau 48h nuôi cấy, bào tử phát triển
mạnh, đính dính nhau thành nút thắt bào
tử.
55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
40
3.2. Định tính enzyme xylanase của Trichoderma spp.
16h
11mm
32h
31mm
40h
34mm
48h
49mm
56h
58mm
64h
59mm
Hình 3.5. Kết quả vành phân giải xylanase của Trichoderma spp.
56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
41
Khi nuôi ủ ở thời gian 8h thì vi sinh vật chƣa phát triển nên chƣa thấy đƣợc
vòng phân giải enzyme.
Bắt đầu từ 16h đến 40h nấm mốc phát triển enzyme xylanase thủy phân cơ
chất xylan tạo vòng phân giải lớn dần (11mm đến 34mm). Thời điểm từ 48h đến
56h tơ non phát triển mạnh và đạt kích thƣớc 49mm.
Thời gian sau nuôi ủ 56h và 64h là giai đoạn nấm mốc phát triển tiếp tục bắt
đầu sinh bào tử.
Nhƣng ở thời gian nuôi cấy 56h và 64h thì nấm mốc sinh bào tử cho nên sinh
ra enzyme xylanase không tốt bằng thời gian 48h nấm mốc phát triển tơ non.
3.3. Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp.
Nhằm xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật có trong giống mốc Trichoderma
spp. sau khi nuôi cấy ở thời gian là 48h, ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Kết quả số tế bào đếm đƣợc trong 1g mốc giống ở nồng độ pha loãng 10-4
là
4.48×1011
.
Sau đó ta tiến hành cấy vào môi trƣờng lên men bán rắn.
3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase của
Trichoderma spp.
Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát tỷ lệ cơ chất đến sinh tổng hợp xylanase
Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein
và xác định hoạt tính xylanase. Ta có kết quả ở bảng 3.1 nhƣ sau:
57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
42
Bảng 3.1. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma
spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau
Đồ thị 3.1. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi
trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau
Kết quả đồ thị cho thấy hoạt tính xylanase ở tỷ lệ 6:4 là 78,96 UI/g tăng dần
lên và đạt cao nhất ở môi trƣờng có tỷ lệ 4:6 là 139,48 UI/g. Hàm lƣợng protein ở
môi trƣờng 4:6 cao nhất là 35,47mg, và giảm dần xuống thấp nhất ở 6:4 là 21,87
mg.
Tỷ lệ
CM:BM
Độ ẩm
Nồng độ
dinh
dƣỡng
Thời gian
nuôi cấy
(h)
HL
protein
(mg/g)
HT
xylanase
(IU/g)
6:4
50 x1 48
21,87 78,96
7:3 25,33 94,16
5:5 26,40 100,70
3:7 26,77 101,34
4:6 35,47 139,48
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
5
10
15
20
25
30
35
40
6:4 7:3 5:5 3:7 4:6
Hoạt
tính
Xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein
(mg/g)
Tỷ lệ cơ chất
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
43
Kết quả này giải thích nhƣ sau: bã mía có khả năng giữ nƣớc cao và có cấu
trúc phức tạp hơn cám mì, khi pha chế môi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía khác
nhau cùng với một lƣợng nƣớc, thì môi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía là 6:4 có độ
ẩm và lƣợng bã mía thấp hơn các môi trƣờng khác. Còn môi trƣờng có tỷ lệ cám mì
– bã mía là 4:6 có độ ẩm và hàm lƣợng bã mía cao hơn nên có độ xốp và độ thoáng
khí cũng cao hơn, thích hợp hơn cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp xylanase của
Trichoderma. Nhƣng khi ở tỷ lệ 6:4 thì hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein
giảm xuống còn 78,96 UI/g và 21,87 mg do hàm lƣợng bã mía ít không tạo đƣợc độ
thông thoáng cho nấm mốc phát triển.
Dựa vào kết quả trên cho thấy môi trƣờng có tỷ lệ 4:6 là tốt nhất nhƣng còn
phụ thuộc vào các yếu tố khác nhƣ độ ẩm, pH… nên cần phải tiếp tục khảo sát.
Chúng tôi chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía là môi trƣờng nuôi cấy cho các thí nghiệm
tiếp theo.
Thí nghiệm 2. Kết quả khảo sát độ ẩm môi trƣờng đến sinh tổng hợp
xylanase
Độ ẩm vừa ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng vừa ảnh hƣởng đến sự trao đổi
chất của vi sinh vật trong quá trình lên men bán rắn. Trong thí nghiệm này chọn tỷ
lệ 4 cám mì : 6 bã mía để khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm. Thêm nƣớc cất vào môi
trƣờng bán rắn điều chỉnh độ ẩm 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. Sau đó cấy dịch
huyền phù từ môi trƣờng nhân giống cấp 1 (môi trƣờng lúa).
Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein
và xác định hoạt tính xylanase. Ta có kết quả ở bảng 3.2 nhƣ sau:
59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
44
Bảng 3.2. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma
spp. có độ ẩm môi trƣờng khác nhau
Độ ẩm
Tỷ lệ
CM:BM
pH
Thời gian
nuôi cấy
(h)
HL protein
(mg/g)
HT xylanase
(IU/g)
45%
4:6 5 48
32,53 93,10
50% 34,13 99,22
55% 39,73 149,68
60% 38,67 119,07
65% 36,27 114,21
70% 34,40 108,09
Đồ thị 3.2. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi
trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có độ ẩm khác nhau
Trong thí nghiệm này ta chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía để khảo sát độ ẩm.
Theo kết quả ở bảng 3.2 và đồ thị 3.2. Cho ta thấy hoạt tính xylanase và hàm lƣợng
protein tăng dần từ môi trƣờng có độ ẩm từ 45 – 55% và đạt cao nhất tại độ ẩm 55%
là 149,68 UI/g và 39,73 mg, sau đó giảm xuống khi độ ẩm đạt 60%.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
45% 50% 55% 60% 65% 70%
Hoạt
tính
Xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein(mg/g)
Độ ẩm
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
45
Điều này có thể do tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm phồng cơ chất, tăng
độ xốp tạo điều kiện cho Trichoderma tiếp xúc với cơ chất dễ dàng hơn. Còn ở môi
trƣờng có độ ẩm càng thấp thì hoạt lực xylan và hàm lƣợng protein cũng thấp do cơ
chất bị khô làm bất lợi cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp xylanase của
Trichoderma spp. Đối với môi trƣờng có độ ẩm cao hơn 55% thì hoạt lực xylan và
hàm lƣợng protein cũng giảm. Có thể do môi trƣờng này quá ẩm, độ xốp giảm cản
trở sự khuếch tán oxy từ bên ngoài vào môi trƣờng.
Thí nghiệm 3. Kết quả khảo sát pH môi trƣờng đến sinh tổng hợp xylanase
Bảng 3.3. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi
cấy Trichoderma spp. có pH khác nhau
pH
Tỷ lệ
CM:BM
Độ ẩm
Nồng độ
dinh
dƣỡng
Thời gian
nuôi cấy
(h)
HL protein
(mg/g)
HT xylanase
(IU/g)
4.5
4:6 55% x1 48
29,33 110,20
5 32,80 135,75
5.5 41,60 150,74
6 37,07 141,45
6.5 36,27 136,38
61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
46
Đồ thị 3.3. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi
trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có pH khác nhau
Theo kết quả bảng 3.3 và đồ thị 3.3 ta thấy hoạt tính xylanase và hàm lƣợng
protein ở môi trƣờng pH 4.5 là thấp nhất (110,20 UI/g và 29,33 mg/g), tăng dần pH
lên đến 5.5 hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein đạt cao nhất là 150,74 UI/g và
41,60 mg/g, ở pH 6.0 và 6.5 thì hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein giảm dần.
Hiện tƣợng này có thể do môi trƣờng quá kiềm hoặc quá acid, do đó ảnh
hƣởng đến sự ion hóa của cơ chất, độ bền bên trong cơ chất làm ảnh hƣởng đến sự
sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme của Trichoderma hoạt động trong môi trƣờng
pH thích hợp thì hoạt tính enzyme cũng tăng theo thời gian nuôi cấy.
Thí nghiệm 4. Kết quả khảo sát nồng độ dinh duỡng đến sinh tổng hợp
xylanase
Cơ chất mà tất cả chất dinh dƣỡng cho vi sinh vật là cơ chất lý tƣởng. Tuy
nhiên, nhiều cơ chất nghèo dinh dƣỡng, vì vậy cần phải bổ sung thêm các chất dinh
dƣỡng từ bên ngoài khi pha chế môi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x1, x2,….,x5,
chỉnh độ ẩm đến 55% và pH 5,5 với tỷ lệ cám mì – bã mía là 4:6.
Sau khi nuôi cấy 48h, xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme
xylanase.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
Hoạt
tính
Xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein
(mg/g)
pH
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
47
Bảng 3.4. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi
cấy Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau
Nồng độ
dinh
dƣỡng
Tỷ lệ
CM:BM
pH Độ ẩm
Thời gian
nuôi cấy
(h)
HL protein
(mg/g)
HT xylanase
(IU/g)
x1
4:6 5.5 55% 48
32,53 120,34
x2 34,40 128,57
x3 35,47 135,75
x4 42,40 170,80
x5 39,47 149,47
Đồ thị 3.4. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi
trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau
Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme xylanase và hàm lƣợng protein tăng dần
lên từ môi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x1 đến x3, Ở nồng độ dinh dƣỡng x4
(170,80 IU/g và 42,40 mg) là cao nhất, sau đó giảm dần xuống môi trƣờng có nồng
độ dinh dƣỡng x5 hoạt tính enzyme xylanase và hàm lƣợng protein là 149,47 UI/g
và 39,47 mg/g.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
x1 x2 x3 x4 x5
Hoạt
tính
Xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein
(mg/g)
Nồng độ dinh dƣỡng
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
48
Thí nghiệm 5. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp
xylanase
Bảng 3.5. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi
cấy Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau
Thời
gian
nuôi cấy
(h)
Tỷ lệ
CM:BM
pH Độ ẩm
Nồng độ
dinh dƣỡng
HL protein
(mg/g)
HT xylanase
(IU/g)
8h
4:6 5.5 55% x4
30,93 156,65
16h 32,80 162,77
24h 34,13 170,54
32h 36,27 177,76
40h 36,80 180,51
48h 44,93 199,72
56h 43,73 190,64
64h 42,13 185,58
72h 41,6 169,32
80h 39,73 160,87
64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
49
Đồ thị 3.5. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi
trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau
Theo kết quả bảng 3.5 và đồ thị 3.5 ta thấy hoạt tính xylanase và hàm lƣợng
protein tăng rõ rệt từ 8 – 48h, đạt giá trị cao nhất tại 48h, sau đó bắt đầu giảm dần
xuống. Điều này có thể giải thích, sau 48h nuôi cấy Trichoderma spp. thì chúng
phát triển mạnh và cơ chất bị thủy phân gần hết sau 48h nên hoạt tính và hàm lƣợng
bắt đầu giảm xuống.
0
50
100
150
200
250
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h 64h 72h 80h
Hoạt
tính
Xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein
(mg/g)
Thời gian nuôi cấy
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
50
Thí nghiệm 6. Kết quả khảo sát tỷ lệ giống đến sinh tổng hợp xylanase
Bảng 3.6. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi
cấy Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau
Tỷ lệ
giống
(bào
tử/g)
Tỷ lệ
CM:BM
Độ ẩm pH
Nồng độ
dinh
dƣỡng
Thời
gian nuôi
cấy (h)
HL
protein
(mg/g)
HT
xylanase
(UI/g)
1.12x1011
4:6 5.5 55% x4 64
42,40 135,97
2.24x1011
44,27 152,43
3.36x1011
45,33 165,52
4.48x1011
49,87 212,39
5.60x1011
46,40 173,54
Đồ thị 3.6. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng
nuôi cấy Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau
Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme và hàm lƣợng protein đạt cao nhất tại
4.48x1011
(212,39 UI/g và 49,87 mg/g). Kết quả mật độ bào tử phải là 4.48x1011
để
đảm bảo các tiểu phần cơ chất đƣợc bảo phủ bởi hệ sợi nấm nhằm hạn chế sự tạp
0
50
100
150
200
250
38
40
42
44
46
48
50
52
Hoạt
tính
Xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein
(mg/g)
Tỷ lệ giống
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
51
nhiễm. Nếu tỷ lệ giống quá cao dẫn đến sự cạnh tranh về dinh dƣỡng, oxy diễn ra
mạnh nên cơ chất bị phân hủy hết làm cho hoạt tính enzyme bị giảm xuống.
Từ các nghiệm thức khảo sát sinh tổng hợp enzyme chúng tôi chọn kết quả
tốt nhất để bố trí nghiệm tinh sạch protein enzyme.
3.5. Kết quả bố trí thí nghiệm
3.5.1. Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase
Thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hƣởng của các dung môi dung môi để tách
chiết enzyme xylanase theo tỷ lệ 1:4 ta có kết quả sau
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát các dung môi để tách chiết enzyme xylanase
Dung môi
HL Protein
(mg/g)
HT enzyme
(UI/g)
HTR
(UI/mg)
H2O 58,8 176,77 3,068
Acetate 57,6 160,16 2,780
Citrate 65,8 173,58 2,638
NaCl 50,03 151,43 3,029
Đồ thị 3.7. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của các dung
môi tách chiết enzyme xylanase
135
140
145
150
155
160
165
170
175
180
0
10
20
30
40
50
60
70
80
NaCl H2O CitrateAcetate
Hoạt
tính
xylanase(UI/g)
Hàm
lƣợng
protein
(mg/g)
Dung môi
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính xylanase
(UI/g)
67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
52
Chúng tôi nhận thấy trong quá trình tách chiết enzyme bằng các dung môi
cùng một tỉ lệ là 1:4 thì nƣớc cất thu đƣợc hoạt tính riêng cao nhất 3,006 (UI/mg).
Điều này đúng với lý thuyết, khi tách chiết enzyme bằng nƣớc thu đƣợc hàm lƣợng
protein enzyme chiếm vào khoảng 90% trở lên. Vậy dựa vào bảng kết quả chúng tôi
tiến hành tách chiết ezyme bằng nƣớc cất cho các thí nghiệm sau.
Thí nghiệm 2. Khảo sát tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase
Bảng 3.8. Kết quả tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase
Tỷ lệ
HL protein
(mg/g)
HT enzyme
(UI/g)
HTR
(UI/mg)
1:3 46,29 105,88 2,287
1:4 47,06 138,01 2,932
1:5 56,16 176,77 4,602
1:6 43,8 125,07 2,855
1:7 43,63 134,92 3,092
1:8 38,41 152,28 2,711
1:9 51,31 157,42 3,068
1:10 52,0 133,38 2,565
Đồ thị 3.8. Biểu diễn tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0
10
20
30
40
50
60
1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:091:10
Hoạt
tính
xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein(mg/g)
Tỷ lệ dung môi
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
53
Sau khi khảo sát quá trình tách chiết enzyme bằng nƣớc cất qua các tỷ lệ
chúng tôi thấy hoạt tính riêng cao nhất là 4,602 (UI/mg) tƣơng ứng với tỉ lệ 1:5.
Quá trình chiết là quá trình khuếch tán chất tan (enzyme) trong canh trƣờng vào
nƣớc. Quá trình khuếch tán tuân theo định luật Flick: “Lƣợng chất khuếch tán tỉ lệ
thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất tan với gradient nồng độ
và thời gian khuếch tán”. Khi tỉ lệ canh trƣờng : nƣớc cất tăng, diện tích bề mặt tiếp
xúc giữa nƣớc và canh trƣờng tăng. Lƣợng nƣớc cất làm chênh lệch nồng độ chất
tan giữa bề mặt tiếp xúc với các lớp nƣớc bên ngoài.
Cả hai yếu tố trên làm cho lƣợng chất tan chiết đƣợc tăng khi tỷ lệ nƣớc cất
tăng. Tuy nhiên, khi lƣợng nƣớc cất đạt đến một giới hạn nào đó thì nồng độ
enzyme trong dịch chiết giảm nhanh, dẫn đến hoạt tính của enzyme cũng giảm
nhanh. Qua kết quả trên chúng tôi quyết định chọn chiết enzyme bằng nƣớc cất với
tỉ lệ 1:5.
3.5.2. Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme xylanase từ dịch chiết bằng phương
pháp kết tủa
Thí nghiệm 3. Tủa cồn 96o
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzyme xylanase
DC : Cồn
HL Protein
(mg)
HT enzyme
(UI/g)
HTR
(UI/mg)
1:1 40,33 189,4 4,69
1:2 42,33 166,6 3,94
1:3 44,66 178 3,99
1:4 44,50 197 4,43
1:5 52,50 317,4 6,05
1:6 52 313,6 6,03
69. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
54
Đồ thị 3.9. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme xylanase từ các
phân đoạn tủa bằng cồn
Từ kết quả bảng 3.9 ta rút ra kết luận rằng tủa enzyme bằng cồn ở tỷ lệ 1:5 ta
sẽ thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao nhất 6,05 (UI/mg) nên chúng
tôi chọn tủa trong dung môi cồn ở tỉ lệ 1:5.
Khi thể tích dung môi tăng dần thì hoạt tính enzyme càng tăng, vì khi số
phân tử dung môi trong hỗn hợp tăng chúng sẽ tách triệt để hơn lớp phân tử nƣớc
bao xung quanh lớp phân tử protein, làm giảm tính tan của protein và làm tăng khả
năng kết tủa của chúng. Nếu ta tiếp tục tăng thể tích dung môi thì hằng số điện môi
giảm, các phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành không hoạt động, do đó
hoạt tính enzyme cũng giảm. Ngoài ra, càng về sau, khi enzyme bị tủa hết, nếu tiếp
tục tăng lƣợng dung môi thì sẽ có nhiều protein tạp khác bị tủa.
0
50
100
150
200
250
300
350
0
10
20
30
40
50
60
1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6
Hoạt
tính
xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein(mg/g)
Tỷ lệ dịch E/Cồn
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
70. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
55
Thí nghiệm 4: Acetone
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tỷ lệ acetone dùng để tủa enzyme xylanase
DC :
Acetone
HL Protein
(mg/g)
HT enzyme
(UI/g)
HTR
(UI/mg)
1:1 56,66 310 5,47
1:2 58,03 361,1 6,22
1:3 60,03 380,13 6,33
1:4 66,08 427,6 6,47
1:5 63,66 399,1 6,27
1:6 57,63 300,51 5,21
Đồ thị 3.10. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme xylanase từ các
phân đoạn tủa bằng acetone
Từ kết quả bảng 3.10 ta rút ra kết luận rằng tủa enzyme bằng acetone ở tỷ lệ
1:4 ta sẽ thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao nhất 6,47 (UI/g) nên
chúng tôi chọn tủa trong dung môi muối ở tỷ lệ 1:4.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0
10
20
30
40
50
60
70
1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6
Hoạt
tính
xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein(mg/g)
Tỷ lệ dịch E/Acetone
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
71. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
56
Thí nghiệm 5. Muối
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tỷ lệ muối (NH4)2SO4 dùng để tủa enzyme
xylanase
Nồng độ
muối (%)
HL Protein
(mg/g)
HT enzyme
(UI/g)
HTR
(UI/mg)
50 57,60 281,5 4,88
55 61,72 289 4,68
60 63,67 348,5 5,47
65 67,44 513,8 7,618
70 58,26 317,4 5,45
Đồ thị 3.11. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme xylanase từ các
phân đoạn tủa bằng muối
Từ kết quả bảng 3.11 ta rút ra kết luận rằng nếu có tủa enzyme bằng muối ở
nồng độ 65o
ta sẽ thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao nhất 7,618
(UI/mg) nên chúng tôi chọn tủa trong dung dịch muối ở nồng độ 65o
.
0
100
200
300
400
500
600
52
54
56
58
60
62
64
66
68
70
50 55 60 65 70
Hoạt
tính
xylanase
(IU/g)
Hàm
lƣợng
protein
(mg/g)
Nồng độ muối
Hàm lượng protein
(mg/g)
Hoạt tính Xylanase
(IU/g)
72. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013
57
Bảng 3.12. So sánh kết quả tủa enzyme xylanase
Tác nhân
tủa
HT enzyme
cao nhất (UI/g)
HL protein cao
nhất (mg)
HLR cao nhất
(UI/mg)
Cồn 317,4 52,50 6,05
Acetone 427,6 66,08 6,47
Muối 513,8 67,44 7,618
Đồ thị 3.12. Kết quả tủa enzyme xylanase từ các tác nhân tủa
Sau khi tiến hành tủa enzyme với 3 dung môi khác nhau cho đƣợc kết quả sử
dụng dung dịch muối (NH4)2SO4 bão hòa thu đƣợc enzyme có hoạt tính cao nhất
nên chúng tôi quyết định chọn muối là tác nhân tủa cho các thí nghiệm tiếp theo.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Cồn Acetone Muối
Hoạt
tính
enzyme
(UI/g)
Tác nhân tủa
HT enzyme