Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens sh4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA
XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN
SERRATIA MARCESCENS SH4
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Ngành học: Công Nghệ Sinh Học
Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện : TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN
MSSV: 1311100520 Lớp: 13DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2017

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn
khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hương ( Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM).
Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của
mình.
TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện
TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ
con trong 23 năm qua, người đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong cuộc
sống và luôn qua tâm con, chăm sóc cho con. Người luôn bên con những lúc khó khăn
nhất. Em cũng xin cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hướng và ủng hộ em trên con
đường học tập.
Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường
đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm đại học.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Hoài
Hương, người luôn nhiệt tình với học trò, luôn định hướng và cung cấp những kiến thức
bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em xuyên suốt quá trình thực hiện tốt
khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai người đã cho em lời khuyên trong
quá trình nuôi sâu tơ thí nghiệm và cung cấp cho em giống nấm thí nghiệm.
Em cũng xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh,
anh Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí
nghiệm.
Đồng thời, xin cảm ơn đến bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, Cao Thị Thanh Thúy đã hổ trợ
mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất cả các bạn cùng thực hiện đồ án
trong thời gian mình thực hiện đồ án ở phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt
quá trình làm thí nghiệm. Cảm ơn em Hồ Trung Lộc lớp 14DSH, em Trần Nguyễn Tuấn
Minh 14DSH, em Bùi Nhật Minh 14DSH đã phụ giúp anh trong quá trình thực hiện đồ
án tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn !
TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017
TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN

1
MỤC LỤC
MỤC LỤC...................................................................................................................1
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................4
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..........................................................................................5
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................6
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................9
1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học .................................................................9
1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học ..............................................................9
1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay ............9
1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học...........................10
1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin......................................10
1.1.4.1 Ưu điểm.............................................................................................11
1.1.4.2 Nhược điểm .......................................................................................11
1.1.4.3 Cơ chế tác động ................................................................................12
1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens........................................................12
1.2.1 Lịch sử phát hiện......................................................................................12
1.2.2 Phân loại ..................................................................................................13
1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens..........................................................13
1.2.4 Đặc điểm sinh lí .......................................................................................14
1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa.............................................................................15
1.1.3.2 Đặc điểm phân bố .............................................................................16
1.2 Giới thiệu về Prodigiosin ................................................................................17
1.3.1 Khái niệm về prodigiosin .........................................................................17
1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin.....................................................17
1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin..........................................................20
1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens...........................20
1.4 Enzyme............................................................................................................25
1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens.........................................................25
1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới ......................................................................26
1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens..............................................26

2
1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin ...........................................................27
1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh........................................................27
1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp ...................................................................27
1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp........................................................................28
1.6.3.3 Nấm Trichoderma .............................................................................28
1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus .....................................................................29
1.7 Khái quát về sâu tơ Plutella xylostella............................................................29
1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học ...................................................................29
1.7.2 Tập quán sinh sống và cách gây hại........................................................30
1.7.3 Biện pháp phòng trừ.................................................................................30
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................32
2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu ......................................................................32
2.1.1 Thời gian ..................................................................................................32
2.1.2 Địa điểm...................................................................................................32
2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị ...............................................................................32
2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens.......................................................32
2.2.2 Nguồn nấm ...............................................................................................32
2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii ..............................................................32
2.2.4 Nguồn cải ngọt Brassica integrifolia.......................................................32
2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate.....................................................32
2.2.6 Môi trường nuôi cấy và hóa chất.............................................................32
2.2.7 Dụng cụ, thiết bị.......................................................................................33
2.3 Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................34
2.4 Nội dung nghiên cứu.......................................................................................34
2.5 Phương pháp thí nghiệm .................................................................................34
2.5.1 Phương pháp luận....................................................................................34
2.5.2 Bố trí thí nghiệm.......................................................................................35
2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm..................................................36
2.6.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm ......................................36
2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens .........................37
2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học................................................37
2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme.............................................................37

3
2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm........................................42
2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá .........................44
2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii
...........................................................................................................................45
2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica
integrifolia.........................................................................................................47
2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu...................48
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN...................................................................51
3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào.....................................................................51
3.2 Hoạt tính kháng nấm.......................................................................................52
3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm.........................................................................55
3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii ........57
3.5 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cải ngọt Brassica integrifolia ...............58
3.6 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata.............61
1.Kết luận ..............................................................................................................65
2. Kiến nghị...........................................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................67
PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG..............................................71
PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH ........................................................................................74
PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ............................................................................................86
PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ .......................................................................89

4
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Artemia nauplii : A.nauplii
Brassica integrifolia : B. integrifolia
Serratia mascescens : S.mascescens
Plutella xylostella : P.xylostella
Pepton glycerol : PG
QCVN : Quy chuẩn Việt Nam.
BNNVPTNT : Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn.

5
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và
Gibbs, 2011)..............................................................................................................14
Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens........14
Hình 1.3 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008) .................................................18
Hình 1.4 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) .........................................18
Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC
39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ
Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001)..................................21
Hình 1.6 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin..........24
Hình 1.7 Vòng đời của sâu tơ Plutella xylostella.....................................................30
Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của chế
phẩm..........................................................................................................................36
Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Casein .........38
Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit.........................40
Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Chitin .........41
Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA............................43
Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương pháp quét
lá (Maureen và cộng sự, 2012)..................................................................................45
Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella của chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925)......................................................56
Hình 3.2 Tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin
(mg/ml)......................................................................................................................58
Hình 3.3. Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm chế phẩm........59
Hình 3.4. Tỉ lệ nảy chết của cải ngọt B. integrifolia sau khi phun chế phẩm ..........60
Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serrastia
marcescens SH4........................................................................................................63

6
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens .................................15
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)
...................................................................................................................................19
Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid. ............52
Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1 ...............................................52
Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp...................................................................53
Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp..............................................................54
Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. ...........................................................54
Bảng 3.5 Tỉ lệ chết của sâu tơ tuổi 3. .......................................................................56
Bảng 3.6 Độc tính của chế phẩm đối với cây cải ngọt sau 9 ngày thử nghiệm........61
Bảng 3.7 Tỉ lệ chết của cá sau 5 ngày thử nghiệm. ..................................................62

7
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Theo thống kê của tổ chức Lương – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng
hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài
vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực lượng
hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết vấn đề
trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại.
Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm bệnh cho cây
trồng. Tuy nhiên, người nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lượng quá mức cho
phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở
nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, sâu tơ Plutella xylostella là
loài sâu đa thực và gây hại nặng đến màu màng, chúng gây hại trên hầu hết các loại
rau cải, đặc biệt có nhiều trên cây cải ngọt . Chúng có khả năng kháng thuốc hóa học
nếu người dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học không đúng cách. Vì vậy,
xu hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đã và đang trở nên rất hữu ích vì
tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, an toàn cho sức khỏe con người, đồng
thời không gây ô nhiễm môi trường.
Những năm gần đây, việc trích ly được hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn
Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo
chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt
Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chưa có
nghiên cứu nào về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên
cứu nhưng vẫn chưa hoàn thiện được sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Dựa trên cơ
sở đó mà người thực hiện đề tài đã chọn hướng cho Đồ ÁN tốt nghiệp là: “Thử
nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia
marcescens SH4”
2. Mục đích nghiên cứu

8
Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcescens SH4.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH4
Thử nghiệm tính an toàn sinh học của chế phẩm lên cây cải ngọt để đánh giá an toàn
sinh học của chế phẩm.
Thử nghiệm độc tính của chế phẩm lên ấu trùng Artemia nauplii và thủy sinh đại diện
là cá bảy màu
4. Kết quả cần đạt được
Khảo sát được ảnh hưởng của việc xử lý acid lên enzyme ngoại bào của vi
khuẩn S.marcesscens trong dịch nuôi cấy.
Khảo sát được hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: kháng nấm, kháng sâu
tơ.
Khảo sát được độc học của vi khuẩn tác động lên ấu trùng A.nauplii.
Khẳng định tính an toàn của chế phẩm trong việc ứng dụng chế phẩm ngoài
thực tế.

9
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học
1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học
Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học.
Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn,
virus) và các hợp chất thứ cấp do vi sinh vật tiết ra ( thường là các chất kháng sinh),
các chất có trong cây cỏ (chất độc hoặc dầu thực vật).
1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay
1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc
chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên
các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV
có nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tương đối dễ dàng: chỉ
cần hoà thuốc vào bình và phun bình thường với liều lượng 1,0- 1,2 kg/ha.
2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000
IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu
thuộc họ Leptidopera.
3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium
anisopliae 1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên
đạt hiệu quả tới 86,5%. Dạng nấm xanh được dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa
và cây ăn quả đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria
chuyên dùng để trị sâu róm thông và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu
diệt sâu tới gần 87%. TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này có thể
sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thông đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”.
4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá,
đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã được
đưa vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung
hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hoá).

10
5. Chế phẩm hoá sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu
đạt 45- 50%.
6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn
quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004)
1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học
Ưu điểm
 Không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân
bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình
trạng bùng phát dịch côn trùng.
 Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dư lượng độc trên
nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông
sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè…
 Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thường có sẵn và rất
phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc như ớt, tỏi, hành, rừng... Chi phí sản xuất khi tự
làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học, do vậy sẽ
tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao.
Hạn chế
 Các thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu tương đối chậm hơn so với
thuốc hóa học.
 Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều
kiện cũng chặt chẽ hơn.
1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin
Abamectin là thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới, là hỗn hợp của Avermectin
B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) được phân lập từ quá trình lên men của vi
khuẩn Streptomycin avermitilis được sử dụng phổ biến để phòng trừ sâu hại trên nhiều
loại cây trồng đặc biệt là rau, hoa, chè, lúa.
Hoạt chất Abamectin được 97 công ty đăng ký với 534 loại thuốc thương
phẩm, gồm 294 thuốc thương phẩm đơn chất Abamectin (Abatin 1.8 EC; Alfatin 1.8
EC; Binhtox 1.8 EC; Reasgant 1.8EC; Tervigo 020SC…) và 240 thuốc thương phẩm

11
dạng hỗn hợp với các hoạt chất khác như Emamectin benzoate (Sieufatoc 36EC),
Azadirachtin (Goldmectin 36EC), Alpha – cypermethrin (Shepatin 18EC),
Acetamiprid (Acelant 4EC) dầu khoáng (Đầu trâu Bihopper
24.5EC), Bacillus thuringiensis var.kurstaki (Kuraba WP …)
1.1.4.1 Ưu điểm
- Hoạt chất Abamectin có hiệu lực diệt sâu nhanh, mạnh, kéo dài và ít chịu tác
động của điều kiện thời tiết.
- Thuốc ít hình thành tính kháng của dịch hại, ít gây độc cho người sử dụng.
- Phổ tác động rộng, trừ được nhiều loài sâu miệng nhai, miệng chích hút thuộc
bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh đều như ruồi đục lá, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ,
nhện ở liều lượng 5,4 -25gai/ha trên nhiều loại cây trồng như rau họ thập tự,
họ cà, cây ăn quả (cam, quýt, chè…), lúa.
1.1.4.2 Nhược điểm
- Các loại thuốc hoạt chất Abamectin thuộc nhóm độc II, LD50 qua miệng 300
mg/kg, LD50 qua da > 1800 mg/kg, dễ kích thích da và mắt. Thời gian cách
ly ngắn nhất là 3 ngày, phổ biến là 7 ngày.
- Hoạt chất Abamectin có chỉ số tác động môi trường (EIQ 36,68) cao hơn so
với nhiều hoạt chất khác, kể cả một số thuốc thuộc nhóm lân hữu cơ như
Acephate (EIQ 24,88), Chlopyriphos( EIQ 26,85).
- Thuốc thuộc nhóm độc II, thời gian cách ly tương đối dài (7 ngày), mức độ
ảnh hưởng của thuốc đối với người phun thuốc, người tiêu dùng không lớn
nhưng độc đối với cá và ong.
Vì vậy, mặc dù đã được đăng ký phòng trừ sâu hại trên cây rau nhưng Abamectin
không có trong Danh mục các hoạt chất thuốc BVTV khuyến cáo lựa chọn để sử
dụng trên rau an toàn khi cần thiết (Ban hành kèm theo văn bản số 580/BVTV-
QLT ngày 17/4/2014 của Cục Bảo vệ thực vật).

12
1.1.4.3 Cơ chế tác động
Thuốc ngăn chặn chất truyền luồng thần kinh gamma aminobutyric acid (GABA)
tại chỗ nối cơ thần kinh của côn trùng. Thuốc làm côn trùng ngừng ăn hoặc ngừng đẻ
trứng ngay, chúng có thể chết sau vài ngày.
1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens
1.2.1 Lịch sử phát hiện
Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ
6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh
mì. Sau đó, vào năm 332 trước công nguyên, những người lính trong quân đội
Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dường như có
“máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tượng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy
máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng.
Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ
diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã
phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố như vậy
được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch.
Trong bóng tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh được sử
dụng trong Thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên, điều
này lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép
lạ (Gillen và Gibbs, 2011).
Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya), là người đầu tiên phát hiện và đặt tên
Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang
màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở
nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều được bao phủ bởi một lớp vi sinh
vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo
tên nhà vật lý nổi tiếng người Italya đã phát minh ra tàu hơi nước là Serrati, tên loài
marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân
hủy rất nhanh bánh mì và polenta.

13
Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens như một loại nấm, do ông nhìn thấy những
đốm đỏ dưới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học
đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn.
1.2.2 Phân loại
Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan
với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là
Serratia marcescens.
Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens được phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gramma proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Serratia
Loài: Serratia marcescens
1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia
marcescens có hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 –
2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40o
C và có
thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).

14
1.2.4 Đặc điểm sinh lí
Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar được mô tả
là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính
là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thường
bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012).
Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường thạch,
tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 –
30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.
Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn
Serratia marcescens
Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được
dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011)

15
1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa
Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường hiếu khí và kỵ khí. Chủ
yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng và nhờ có các
enzyme như superoxide dismutase, calatas, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi các phản
ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ
Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri
và cộng sự, 2004).
Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di
động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi
và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia
marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat
và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá
vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein.
Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens
STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả
1 Di động +
2 Indole -
3 Methyl Red -
4 Voges Proskauer +
5 Citrate +
6 Dnase +
7 Catalase +
8 Oxidase -
9 Urease -
10 Gelatinase +
11 Chitinase +

16
12 Triple sugar iron Môi trường chuyển sang
không sinh khí và không
sinh H2S
13 Hydrogen sulphide -
14 Lysine decarboxylase +
15 Ornithine decarboxylase +
16 Lên men glucose +
17 Lên men sucrose +
18 Lên men sorbitol +
19 Lên men fructose -
20 Lên men xylose -
21 Lên men rhaminose -
22 Lên men lactose -
23 Lên men arabinose -
1.1.3.2 Đặc điểm phân bố
Trong nước và đất: đã có 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông
và Serratia marcescens chiếm 75%.
Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn
trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế.
Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối
với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau
khi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006).
Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm,
nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng
của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).
Gần đây, người ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các
loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới

17
nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia
marcescens với Steinernema carpocapsae.
1.2 Giới thiệu về Prodigiosin
1.3.1 Khái niệm về prodigiosin
Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc
trưng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ
“prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin được tìm thấy ở dạng
túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào
(Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin được tổng hợp từ vi khuẩn
Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm:
prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochlodride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin,
metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn
dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin
hydrochloride (cPrG–HCI).
1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin
Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-
methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng
lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006;
Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole
tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp
với nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và

18
Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được
miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).
Các sắc tố màu đỏ của S. marcescens đã được phân lập là đặt tên là
“prodigiosine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của
prodigiosin tổng hợp bởi S. marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden,
1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những
năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều
mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau
(Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thường gắn trở lại để tạo thành vòng
tròn hoặc macrocycles. Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù
hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Được phân lập là đặt
tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902).
Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước. Prodigiosin
có thể tan tương đối trong alcohol và ether. Bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform,
methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự,
2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số bước sóng nhất định và sự
biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ.
Hình 1.4 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008)
Hình 1.3 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)

19
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)
Loài Tên sắc tố Danh pháp
prodigiosin
Trọng
lượng phân
tử và công
thức
Serratia
marcescens
Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6-
methoxy-prodigiosene
323,4 Da
C20H25N3O
Serratia
marcescens
Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6-
hydroxy-prodigiosene
309,4 Da
C10H23N3O
Serratia
marcescens
Dipyrrolyldipyrromelh
enr prodigiosin
2-(2-pyrryl)-4,6-
dimethoxypyprodigiosen
e
334,4 Da
C19H18N4O2
Nocardia
(Actinomadura)
Nonylprodigiosin 2-Nonly-6-
methoxyprodigiosene
363,5 Da
C23H31N3O
Nocardia
(Actinomadura)
Cyclononylprodigiosin 2,10-Nonano-6-
melhoxy-prodigiosene
265,5 Da
C23H33N3O
Nocardia
(Actinomadura)
Methylcyclode
cylprodigiosin
2,10-Nonano-6-
Methoxy-prodigiosene
391,5 Da
C25H33N3O
Streptomyces
Longisporusr
uber
Undccyl- prodigiosin 2-Undecyl-6-
Rnethoxyprodigiosene
393,6 Da
C25H35N3
O
Streplonlyces
longisporusr
uber
Metacycloprodigiosin 2,4-(9-Ethylnonano) -6-
methoxyprodigiosene
391,6 Da
C25H33N3
O

20
1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin
Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi khuẩn
(Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng
thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme như DNA gyrase,
topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi khuẩn
(Ramina và Samira,2009).
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể
kháng một số loài vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,
Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus
mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni
và cộng sự, 2012).
Theo nghiên cứu của Chandni và cộng sự (2012) về khả năng kháng nấm của
hợp chất màu thu nhận từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens cho thấy hợp chất màu
có khả năng kháng một số loài nấm men như Candida albicans, Candida parapsilosis
và Cryptococcus sp.
Prodigiosin khi được đưa vào cơ thể sâu sẽ thấm vào tế bào và ức chế quá trình
phát triển của tế bào, từ đó, dẫn đến sự từ vong của sâu Spodoptera litura (Nguyễn
Hiếu Dân, 2013)
Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả năng chống ung thư (Pandey và
cộng sự 2009; Pérez – Tomás và Vi ̃as, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng
sự 2007)
1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens
Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn.
Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006
(Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã được
báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serratia marcescens sản xuất sắc
tố thông qua con đường ngưng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme
4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5- carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole,

21
được gọi là 2-methyl-3-amyl-6- methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và
Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập được một chủng Serratia
marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên,
không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này được báo cáo.
Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện
trong Erwinia carotovora subsp. carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử
nghiệm). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định bởi nhiều
yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và
SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản
xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy
thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu
khác đã được thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000).
Nhóm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và
Streptomyces coelicolor và được bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng
hợp MBC (màu đỏ) và bốm gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mô tả ở hình 2.18.
Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia
ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu
đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001)

22
Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL)
tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự gene
của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thước và
trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001).
Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí tương
đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ được hiển thị trong màu đen, chịu trách
nhiệm tổng hợp phân nửa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa
monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp được thể hiện
qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng hợp được thể hiện
qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu đỏ.
Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là
PigO. RT-PCR với primer extension sẽ nhận thấy có sự phiên mã qua lại giữa hai
gene pigN và pigO (Slater và cộng sự, 2003), điều này phù hợp với pigO là một pig
operon trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đƣợc sao chép
dưới dạng polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater et al.,
2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 247 cũng đƣợc sao chép dưới dạng
polycistronic thông tin. Có một khoảng cách đáng kể giữa hai cụm sắc tố pigC và
pigD. Khoảng cách 184 bp giữa pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy
khả năng chứa hai đơn vị phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai
bên của khoảng cách này đã chứng minh là tương tự như trong nghiên cứu dùng lacZ
hợp với pigA và pigH (Crow, 2001). Cụm pig trong Sma 274 có khoảng cách 64 bp
giữa pigC và pigD, nhỏ hơn so với Serratia ATCC 39.006, khoảng cách này không
có ý nghĩa. Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14 – 15 gene), có thể phản
ánh sự phức tạp hơn về các sản phẩm undecylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi
Streptomyces coelicolor (Harris và cộng sự, 2004).
Mười hai gene được lưu giữ giữa ba cụm, có thể mong đợi con đường tổng
hợp cho ra các sản phẩm tương tự. Tuy nhiên, định hướng và điều tiết của nó có sự
thay đổi rõ rệt (Slater và cộng sự, 2003). Việc bố trí không giống nhau của các gene
tương đồng trong cụm sản xuất các sản phẩm hóa học tương tự đặt ra câu hỏi về

23
nguồn gốc và sự tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn
Gram dương và Gram âm. Vẫn chưa rõ liệu các loài trong cùng một họ có vai trò
quan trọng ảnh hưởng đến sự sắp xếp không giống nhau của các gene hay sự khác
biệt đã phát sinh một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Sự khác biệt ở các gene hiện diện trong những operon có thể giải thích sự khác
biệt trong phương thức sản xuất và con đường tổng hợp sinh hóa. PigD và pigE là hai
pig gene không có sự tương đồng trong cụm màu đỏ. Tương tự như vậy, pdtorfL và
pdtorf thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng hợp các chất khử clo (carbon
tetrachloride) như pyridine-2,6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri
(Lewis và cộng sự, 2000). PdtorfL và pdtorfM nằm cạnh nhau, giống như pigD và
pigE trong cụm pig. PigE tương tự aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ
Streptomyces coelicolor A3(2), được mã hóa bởi một gene không liên kết với cụm
màu đỏ (38% giống với PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống với PigE từ
Sma 274; cả hai đều là 50% tương đương 460 aa). Thật vậy, nó có thể là gene mã hóa
protein tham gia vào quá trình tổng hợp prodigiosin và undecylprodigiosin có thể
không được liên kết với các cụm gene. RedR, RedQ và RedP không được mã hóa
tương đồng bởi cụm pig, nhưng chúng được cho là chỉ đạo tổng hợp acetate từ ba
nguyên tử carbon của vòng pyrrolr và chuổi bên undecyl của undecylprodigiosin
(Cerdeno và cộng sự, 2001). Các gene mã hóa tương đồng tương ứng có thể có mặt
tại một vị trí trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác có thể thực hiện vai
trò xúc tác cần thiết trong sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia.
Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia
coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tương ứng của Escherichia
coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme được mã hóa bởi
các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004)

24
Đề xuất này cũng tương tự như đề xuất đối với undecylprodigiosin (Cerdeno
cộng sự, 2001) Mười hai
Red protein với sự mã hóa trong cụm pig (“lõi” là enzyme prodigiosin) có kích
thước tương tự nhau trong bản sao của Pig. Một ngoại lệ là PigB (670 aa) tương đồng
với RedS (Sc3f7.05c), là một protein nhỏ hơn nhiều (146 aa) và tương tự gắn vào
cuối đầu N của PigB. Phần còn lại của PigB gắn với các amine oxidase. Các protein
PigI và PigJ đều nhỏ hơn RedM và tương đồng với RedX (Harris và cộng sự, 2004).
PigA là trình tự tổng hợp một loạt các acyl-CoA dehydrogenases. Chuỗi liên kết với
human isovaleryl-CoA dehydrogenases, cấu trúc tinh thể trong đó đã được xác định,
cho thấy rằng phần lớn các acid amin xung quanh flavin và phosphopantetheinyl
moiety của CoA được bảo vệ nhưng các acid amin tham gia vào liên kết các nhóm
adenisyl của CoA không được bảo vệ (Tiffany và cộng sự, 1997). Điều này hỗ trợ
cho ý kiến cho rằng PigA là một PCP prolyl hơn là prolyl-CoA .
Hình 1.6 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin.

25
1.4 Enzyme
Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease, chitinase,
DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,...
Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa
chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soát sinh học
đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước,… (Joshi và cộng sự, 1989).
Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase
(ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding (CBP21)
(Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự, 1988;
Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996;
Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998), chúng
có khối lượng phân tử lần lượt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt động
chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986).
1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens
Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các
tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh
sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trưởng phát triển, gây ảnh hưởng đến vật chủ, mà
phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và
Hewlett, 1986).
Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã được nghiên cứu, bao gồm
sự bám dính, tính kị nước, mannose - resistant, mannose - sensitive,
LipoPolySaccharide (LPS). Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình
tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính.
Các yếu tố bám dính của vi sinh vật được gọi là các adhesion, chúng có thể
có bản chất polypeptide hoặc polysaccharide. Đối với các adhesin có bản chất
polypeptide thì được chia thành hai nhóm là nhóm có khuẩn mao và nhóm không
có khuẩn mao. Mà các vi khuẩn Gram âm, như là Serratia marcescens, thường
bám dính nhờ các khuẩn mao này.

26
Các khuẩn mao là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng như sợi lông
trên bề mặt vi khuẩn. Các khuẩn mao được cấu tạo bởi nhiều protein xếp chặt với
nhau tạo nên hình dạng giống như trụ xoắn ốc. Thường thì chỉ có một loại protein
là cấu trúc chính của một phân nhóm khuẩn mao tuy nhiên các protein phụ trợ khác
cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc khuẩn mao. Đỉnh của các
khuẩn mao có chức năng gắn với tế bào vật chủ.
Bên cạnh đó, LPS hay còn được gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lưỡng
tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide
liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS được coi như nội độc tố, bảo vệ
màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O –
antigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần gây độc của
phân tử LPS, gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm.
Ngoài ra, các enzyme khác của Serratia marcescens tạo ra cũng được xem như
một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme lipase, chitinase, chloroperoxidase và cả
protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).
Theo Kenichi Ishii và cộng sự (2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào
cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm
lành vết thương, dẫn đến tổn thất lớn huyết tương từ ấu trùng tằm silkworm larvae.
1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới
1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens
Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của S.
marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của S. marcescens lên
thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh.
Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát Pyricularia
oryzae gây bệnh trên cây lúa bằng cách sử dụng S. marcescens.
Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm S.
marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria
mellonella và đạt được kết quả gây chết 100% ấu trùng.

27
1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin
Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất
prodigiosin bởi S. marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của
prodigiosin. Kết quả cho thấy prodigiosin thu nhận được có tác dụng ức chế tốt ở cả
vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.
Chandni và cộng sự. (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng
khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như Candida
albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp..
Nghiên cứu của San và cộng sự (2012) cho thấy prodigiosin có khả năng diệt
côn trùng.
Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận
từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn như Alteromonas
sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 g/ml và nồng
độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 g/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự
cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50
khoảng 50 g/ml.
1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh
1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp
Theo Claridge, Dawah, Wilson (1997) cũng đã chỉ ra rằng các dòng Fusarium
tìm thấy từ cây đại kích là nguyên nhân gây hại kinh tế (làm mất năng suất lên tới
92%) ở vùng cỏ ở Bắc Mỹ, bằng chứng chứng minh rằng các loài Fusarium có khả
năng xuất hiện và phát triển ở các vùng đất không canh tác.
Các loài Fusarium phân bố rộng khắp ở hầu hết các vùng địa lý khác nhau trên
thế giới. Chi nấm Fusarium bao gồm các loài hoại sinh, nội ký sinh và cả các loài ký
sinh gây hại thực vật. Cũng một nghiên cứu khác của Burgess et al (1994) cho thấy
chúng là nguyên nhân gây ra rất nhiều loại bệnh cây trong đó có thối rễ, cổ rễ, thân,
sẹo, cháy bông, thối bắp và các bệnh héo
Theo tác giả Moore et al (2001) thì các bệnh héo do các dạng chuyên hoá thuộc
loài Fusarium oxysporum gây ra trên rất nhiều loài thực vật thuộc nhiều họ khác nhau.

28
Ví dụ: Bệnh Panama trên chuối do Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. Cubense (E.
F. Smith) Snyd. & Hans và héo trên bông do Fusarium oxysporum f. sp vasinfectum
(Atk.) Snyd. & Hans đã gây thiệt hại to lớn cho ngành công nghiệp bông ở Australia.
1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp.
Nấm Paecilomyces sp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng, cả
ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Ngoài ra, có thể tìm thấy loài nấm
này ở các loại đất nông nghiệp (Brand et al., 2010). Chúng hiện diện ở những nơi khá
ẩm ướt, trong đất, không khí, trong phòng thí nghiệm hay ngoài tự nhiên.
Ở Mỹ, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu và sử dụng nấm
Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ nhiều loại sâu hại, bao gồm sâu hại khoai tây,
bông, lúa mì đậu đỗ và ngô (Campell và CS., 1985; Hajek và CS., 1987; Anderson
và CS., 1988; Quintela và CS., 1990; Bing, 1991) (theo Nguyễn Thị Lộc, 2009)
Ở Canada đã nghiên cứu ứng dụng nấm Paecilomyces farinosus để phòng trừ
châu chấu hại lúa (Khachatourians G. G., 1992)
Hiện nay trên thế giới đã sản xuất sử dụng thành công nhiều loại chế phẩm
sinh học có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ nhiều loại sâu hại cây
trồng quan trọng như sâu tơ (Plutella xyllostella) (Yin Fei và CS., 2010), sâu khoang
(Spodoptera litura) hại rau thập tự (Ma J. và CS., 2007; Hu Q. B. và CS.,2007) và các
loài bọ phấn (Bemisiamtabaci, Bemisia argentifolii) hại cây trồng (Wraight S. P. và
CS., 1998; Huang Zhen và CS., 2004).
1.6.3.3 Nấm Trichoderma
Nấm Trichoderma sp. có khu vực phân bố rất rộng chúng hiện diện khắp nơi
trong đất, trên bề mặt rễ, trên vỏ cây mục nát. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm
của nhiều loài nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và
Eveleigh, 1998). Các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất acid nhiều hơn ở vùng
đất trung tính hoặc kiềm (Papavizas, 1985).
Nấm Trichoderma có khả năng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào như
chitinase, 1-3-glucanse đây là 2 loại enzyme quan trọng trong quá trình ký sinh lên
nấm gây hại (Muhammad và Amusa, 2003).

29
Trichoderma sp ký sinh lên sợi nấm R. solani và làm chết sợi nấm là do tác
dụng của enzyme ngoại bào làm phá hủy màng tế bào của nấm bệnh (Phạm Văn Kim,
2000).
1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus
Nấm Aspergillus flavus tồn tại tự nhiên trong không khí và đất. Trong thời kỳ
hạn hán, nấm này mọc trên các cây trồng còn xanh như lạc, ngũ cốc, ngô và ớt.
Nấm CDP1 sinh độc tố Aflatoxin có phổ hoạt động rất rộng, lây nhiễm trên
nhiều loại nông sản.
Aspergillus flavus cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho thực vật và động vật,
trong đó có con người và vật nuôi. Nấm có thể nhiễm trên bắp, đậu phụng, cotton và
cây đậu. Nấm thường thấy dưới dạng các mảng nấm và có thể nhìn thấy được. Các
bệnh nhân nhiễm nấm A. flavus thường là suy giảm miễn dịch.
Những nghiên cứu của Ablas K và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm Aflatoxin
trên ngô do nấm A.flavus gây nên là một vấn đề quan trọng ở các vùng trồng ngô của
đồng bằng Missisipi của Mỹ.
1.7 Khái quát về sâu tơ Plutella xylostella
Sâu tơ (Plutella xylostella ) là loài bướm đêm có nguồn gốc từ Địa Trung Hải.
Có vòng đời ngắn khoảng 14 ngày, chúng có thể di cư với cự li khá xa. Sâu tơ là một
trong những loài gây hại nhiều nhất trên thực vật thuộc họ Cải, chủ yếu là những cây
sinh glucosinolat.
1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học
Sâu tơ trưởng thành dài 6 -7 mm, có hai cánh. Cánh trước có thể xòe rộng 13
– 16 mm, màu nâu có những sọc dọc màu sáng. Cánh sau có màu xám, mép ngoài có
lông.
Sâu tơ sinh trưởng từ trứng, mỗi con cái đẻ từ 50 – 400 trứng. Trứng sâu hình
bầu dục dài từ 0.3 – 0.5 mm, màu trắng ngà. Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân
chính và nở trong vòng 3 – 4 ngày.
Ấu trùng màu xanh lục, mình nở to chính giữa, 2 đầu nhọn, thân chia đốt rõ
ràng và có 3 cặp chân giả từ đốt bụng thứ 5.

30
Sâu có 4 tuổi với thời gian phát triển lâu từ 7 – 10 ngày.
Thời gian làm nhộng từ 4 – 7 ngày. Khi mới hình thành nhộng có màu xanh
nhạt, khoảng 2 ngày sau thành màu vàng nhạt, chiều dài nhộng từ 5 – 7 mm, chung
quanh nhộng có kén bằng tơ bao phủ.
Hình 1.7 Vòng đời của sâu tơ Plutella xylostella
1.7.2 Tập quán sinh sống và cách gây hại
Sâu non mới nở bò lên bề mặt lá gặm biểu bì tạo thành những rảnh nhỏ ngoằn
ngoèo. Từ tuổi 2, sâu ăn thịt lá để lại lớp biểu bì tạo thành những vết trong mờ.
Sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì lá làm lá thủng lỗ, giảm năng suất và chất lượng
rau. Khi mật độ sâu cao, ruộng rau bị hại xơ xác, chỉ còn trơ lại gân lá.
Khi bị động đến sâu thường nhả tơ buông mình xuống đất nên còn được gọi là
“ sâu đù”.
1.7.3 Biện pháp phòng trừ
Thường xuyên vệ sinh đồng ruộng, tỉa bỏ các lá già, làm cỏ.

31
Bố trí mùa vụ thích hợp, vụ đông xuân ít sâu hơn vụ hè. Luân canh với cây
không cùng ký chủ, dùng bẫy dính màu vàng theo dõi bướm sâu tơ, trồng xen với cây
họ cà sẽ đuổi được bướm của sâu tơ.
Dùng lưới cao 2m bao xung quanh để hạn chế bướm sâu tơ từ bên ngoài bay
vào đẻ trứng.
Kết hợp thuốc BT với thuốc hóa học như MATCH 050EC, SUCCESS 25EC
và tạo điều kiện cho thiên địch phát triển.
Sử dụng chế phẩm nấm diệt bướm của sâu tơ.

32
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1 Thời gian
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 21/12/2016 đến ngày 31/07/2017.
2.1.2 Địa điểm
Phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học, trường Đại học
Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị
2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens
Giống vi khuẩn Serratia mascescens SH4 được phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Lê
Quốc Vũ (2015), lưu trữ tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.2 Nguồn nấm
Nấm Trichoderma sp, Paecilomyces sp, Aspergillus flavus CDP1, Fusarium sp. do
cô Nguyễn Thị Hai cung cấp tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii
Trứng bào xác A.nauplii được cung cấp tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ
Chí Minh.
2.2.4 Nguồn cải ngọt Brassica integrifolia.
Hạt cải ngọt thương phẩm được cung cấp bởi công ty TNHH Hạt giống Thuận Điền
địa chỉ 588/50A tỉnh lộ 10, phường Bình Trị Đông quận Bình Tân TP.HCM.
2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate
Cá được thu mua ở cửa hàng cá cảnh số 217 Lê Văn Quới phường Bình Trị Đông
quận Bình Tân thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.6 Môi trường nuôi cấy và hóa chất
a. Môi trường (Thành phần môi trường xem phụ lục 1)
 Môi trường Peptone glycerone agar (PGA)
 Môi trường Peptone glycerone broth (PG)
 Môi trường lipid
 Môi trường Casein

33
 Môi trường huyền phù Chitin
b. Hóa chất sử dụng
 Cồn 70, cồn 96
 NaCl
 HCl, NaOH
 Petroleum ether
 N- Hexan
 Nước muối bão hòa
 Ethyl acetate, Acetone
2.2.7 Dụng cụ, thiết bị
a. Dụng cụ
 Phễu chiết
 Ống nghiệm
 Đĩa petri
 Erlen 50ml, 100 ml, 250ml
 Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml
 Pipetman 100μl, 1000μl.
 Đầu típ
 Đũa thủy tinh
 Bao hấp, giấy gói, thun
 Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng
 Bông không thấm, bông thấm
 Chai syrum 100ml.
b. Thiết bị
 Tủ cấy vi sinh
 Tủ lạnh
 Cân phân tích
 Bếp từ

34
 Máy nước cất
 Autoclave
 Tủ hút
 Máy ly tâm
 Máy cô quay
 Bể điều nhiệt
2.3 Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát hoạt lực diệt sâu tơ của chế phẩm và ảnh hưởng của chế phẩm lên
cây cải ngọt, nấm gây bệnh, nấm có lợi và thủy sinh: A.nauplii, cá bảy màu.
2.4 Nội dung nghiên cứu
Định tính enzyme protease, lipase, chitinase của dịch nuôi cấy sau xử lý acid.
Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm lên các chế phẩm sinh học diệt sâu bệnh (
nấm Trichoderma sp., nấm Paecilomyces sp.) và nấm bệnh Aspergillus flavus CDP1
và nấm Fusarium sp.).
Khảo sát hoạt lực diệt sâu tơ Plutella xylostella của chế phẩm chứa
prodigiosin.
Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm lên cây cải ngọt Brassica integrifolia.
Thử nghiệm độc lực của chế phẩm lên ấu trùng Artemia nauplii, cá bảy màu
Poecilia reticulata.
2.5 Phương pháp thí nghiệm
2.5.1 Phương pháp luận
Các nghiên cứu trước đã chứng minh prodigiosin từ Serratia marcescens (phân
lập từ tuyến trùng EPN) có hiệu lực diệt sâu khá mạnh. Để phát triển một chế phẩm
diệt sâu cần đơn giản hóa tối đa các quá trình downtream processing đối với dịch nuôi
cấy lên men vi khuẩn. Vì vậy việc sử dụng phương pháp xử lý acid để tiêu diệt tế bào
S. marcescens SH4 và sau đó làm chế phẩm mang lại hiểu quả cao, giữ lại phần lớn
các hoạt tính từ dịch nuôi cấy vi khuẩn và không làm ảnh hưởng đến prodigiosin trong
dịch nuôi cấy vi khuẩn. (Lê Thị Ngọc Dung, Tạo chế phẩm diệt sâu khoang từ dịch
nuôi cấy vi khuẩn Serratia marces SH1 2016)

35
Khảo sát hoạt tính kháng nấm được sử dụng có ý nghĩa thăm dò khả năng kháng
nấm của dịch nuôi cấy S. marcescens SH4 có khả năng kháng nấm khi sử dụng chế
phẩm đồng thời với chế phẩm từ nấm trên đồng ruộng hay không. Hoạt tính diệt sâu
được thử nghiệm trên sâu tơ Plutella xylostella. Chế phẩm được sản xuất bằng cách
bổ sung Tween 80 phá vỡ màng nhốt prodigiosin, CMC là tác nhân tạo độ nhớt, độ
kết dính, rỉ đường kích thích sâu ăn tăng hiệu lực diệt sâu.
Bên cạnh đó đề tài khảo sát khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy lên tác nhân
diệt bệnh như Trichoderma sp. và diệt sâu hại như Paecilomyces sp. cũng được đề
cập. Qua đó khẳng định chế phẩm diệt sâu có khả năng sử dụng đồng thời với hai chế
phẩm sinh học diệt trừ bệnh và sâu hại cho cây khi sử dụng đồng thời hai loại chế
phẩm sinh học này cùng với chế phẩm diệt sâu tơ Plulella xylostella hay không.
Tính an toàn sinh học cũng được chú trọng và được khảo sát qua thí nghiệm thử
độc tính trên cây cải ngọt Brassica integrifolia, ấu trùng Artemia nauplii và thủy sinh
đại diện là cá bảy màu Poecilia reticulate cũng được quan tâm đến trong bài nghiên
cứu này.
2.5.2 Bố trí thí nghiệm
Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ

36
Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của
chế phẩm.
2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm
2.6.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm
Phòng nuôi sâu phải đảm bảo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sâu tơ phát triển
25 ± 2o
C, và ẩm độ 70 ± 5%.
Sâu tơ Plutella xylostella được thu mẫu từ vườn cải ngọt tại huyện hóc môn,
Tp.HCM, sâu tơ ngoài đồng mang về nuôi được tính là sâu thế hệ P.
Enzyme Kháng nấm
Tăng sinh 48 giờ, lắc 150
vòng /phút
Xử lý acid HCl pH 2, 4giờ
Khảo sát hoạt tính
Thử nghiệm khả năng diệt sâu
Chuẩn bị dịch
Thử độc tính
Khảo sát độc tính trên cá
bảy màu P.reticulata
Khảo sát độc tính trên cây
cải ngọt B.integrifolia
Khảo sát độc tính trên
ấu trùng A.nauplii
Giống vi khuẩn S.marcescens
Trung hòa NaOH về pH 7

37
Thế hệ P được nuôi trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá cải ngọt cho tới khi hóa
nhộng.
Khi sâu vào giai đoạn hóa nhộng, lót khăn giấy trong hộp nhựa và cho ăn bằng
lá cải ngọt cho tới khi 4 - 7 ngày hóa nhộng trong hộp.
Sau khi vũ hóa, ngài thuộc thế hệ P được ghép cặp với nhau trong các hộp
nhựa được lót lá cải ngọt và cung cấp thức ăn dưới dạng lỏng là nước đường pha loãng
(tỉ lệ 1:10). Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày.
Thu lá cải ngọt khoảng 2 ngày 1 lần để thu trứng từ thế hệ P đã được ghép cặp.
Tiếp tục cho lá cải ngọt mới vào hộp để tạo diều kiện cho ngài đẻ trứng.
Sau 2 ngày, trứng nở ra sâu non F1, sâu non được nuôi với thức ăn là lá cải
ngọt.
Nhân nuôi sâu tơ Plutella xylostella cho đến khi đủ số lượng để tiến hành thí
nghiệm.
2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens
Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh 48 giờ trong chai có chứa 20 ml môi trường
peptone glycerol broth vô trùng, với tỉ lệ cấy giống 1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ
phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng, trong 48 giờ.
Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lí với acid
HCl 1N. Với mục đích đưa môi trường về pH = 2, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng
pipetman hút 450 𝜇𝑙 dung dịch acid HCl 1N cho vào chai dịch nuôi cấy lên men. Lắc
150 vòng / phút, ủ trong tối trong 4 giờ. Sau đó, đưa môi trường về pH = 7 với 450
𝜇𝑙 dung dịch NaOH 1N. (Lê Thị Ngọc Dung, 2016 Tạo chế phẩm diệt sâu khoang
Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia mascescens SH1, Đồ án tốt
nghiệp, trường Đại học Công nghệ TP. HCM)
2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học
2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme
Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trong
môi trường PG ở nhiệt độ phòng, ủ tối trong 48 giờ.
Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lí:

38
Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường PG broth vô trùng, dùng pipetman
hút 450 𝜇𝑙 HCl 1N cho vào dịch nuôi cấy lên men, lắc 150 vòng/ phút, trong 4 giờ.
Tiến hành thêm 450 𝜇𝑙 NaOH 1N để đưa dịch nuôi cấy về pH = 7.
Hút 20 𝜇l Tween 80 vô trùng cho vào 10 ml dịch nuôi cấy đã được xử lý acid.
Chuẩn bị Tween 80 0,02%: Hút 20 𝜇l Tween 80 cho vào lần lượt các dịch pha
loãng với thể tích 10 ml.
Thử nghiệm hoạt tính protease
Pha môi trường casein agar, hấp 121o
C trong 15 phút. Để môi trường nguội đến
khoảng 65o
C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường,
đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d).
Đối chứng dương: Dùng pipetman hút 20 𝜇𝑙 dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn thử
nghiệm cho vào giếng thạch. Ủ 24 giờ, tráng TCA 10%, đo đường kính vòng phân giải.
Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh
10ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ
pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 𝜇𝑙 ở các nồng độ pha loãng cho
vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính casein, như hình 2.3
Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch
môi trường Casein
ĐC

39
Đọc kết quả:
Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng TCA 10% lên đĩa môi trường:
Nếu dịch nuôi cấy có enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh
giếng thạch.
Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng trong suốt
xung quanh giếng thạch.
Khả năng phân giải casein được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng
lớn, khả năng giữ lại enzyme protease sau xử lí acid càng lớn.
Trong đó :
D: đường kính vòng phân giải (mm)
d: đường kính giếng thạch (mm)
Thử nghiệm hoạt tính enzyme Lipase
Pha môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 1210
C trong 15 phút. Để môi
trường nguội đến khoảng 650
C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa
agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d).
Đối chứng dương: Hút 20 𝜇𝑙 sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào
giữa đĩa petri môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24
giờ. Đo đường kính vòng tủa trên bề mặt môi trường.
Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh
10 ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã qua xử lí acid thành dãy các nồng
độ pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipet man hút 20 𝜇𝑙 ở các nồng độ pha loãng
cho vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính lipit, như hình 2.2
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

40
Đọc kết quả:
Nếu dịch nuôi cấy có enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung quanh giếng
thạch.
Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng tủa xung
quanh giếng thạch
Khả năng phân giải lipit được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng
lớn, khả năng giữ lại enzyme lipit sau xử lí acid càng lớn.
Trong đó :
Thử nghiệm hoạt tính Chitinase
Pha môi trường thạch huyền phù chitin 1%, hấp 121o
C trong 15 phút. Để
môi trường nguội đến khoảng 65o
C, đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi
đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d).
Đối chứng dương: Dùng pipetman hút 20 sinh khối của chủng vi sinh vật thử
nghiệm vào đĩa petri môi trường thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phòng
trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đường kính vòng phân giải trên bề mặt môi trường.
Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit

41
Các thử nghiệm: Canh trường vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10
ml, tiến hành pha loãng canh trường lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ
phaloãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha loãng cho
vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính lipit, như hình 2.4
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Đọc kết quả:
Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa môi trường:
Nếu dịch nuôi cấy có enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh
giếng thạch.
Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong
suốt xung quanh giếng thạch.
Khả năng phân giải chitin được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng
lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid càng lớn.
Trong đó :
ĐC
Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường
Chitin

42
2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm
Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đục giếng thạch dựa vào khả
năng khuếch tán của các hợp chất có khả năng kháng khuẩn vào môi trường thạch.
Phương pháp này được thực hiện như sau:
Nấm thử nghiệm – Trichoderma sp., Paecilomyces sp., Aspergillus flavus
CDP1, Fusarium sp.
Pha môi trường PDA bổ sung thêm kháng sinh choramphenycol 0,25%, vô trùng
que cấy thẳng, tiến hành cấy điểm nấm bệnh từ môi trường thạch nghiêng sang môi
trường PDA có bổ sung kháng sinh, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó, đục
thạch có đường kính 5 mm cấy sinh khối nấm vào đĩa PDA không bổ sung kháng
sinh. Nuôi ủ tơ nấm trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng.
Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens
Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính
enzyme như mục 2.6.3.1.
Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy thành dãy các nồng độ pha loãng: 2, 4, 8, 16,
32 và 64. Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha loãng.
Pha loãng dịch nuôi cấy đã xử lý acid thêm 20 𝜇𝑙 Tween 80 vô trùng vào 10 ml
dịch. Chuẩn bị 10 ml môi trường PG vô trùng thêm 20 𝜇𝑙 Tween 80 vào các môi
trường PG pha loãng vô trùng để đạt nồng độ Tween 80 0,02% ở dãy các nồng độ
pha loãng: 2, 4, 8, 16, 32 và 64.
Đối chứng âm : chuẩn bị 20 ml PG vô trùng đã bổ sung Tween 80 0,02%.
Đối chứng dương : Chế phẩm Carbenzim hút 0,15 ml pha loãng với 100 ml
nước cất vô trùng.
Tiến hành kháng nấm:
Chuẩn bị môi trường PDA vô trùng. Tiến hành đục giếng thạch 5mm. Vô trùng
cây đục thạch và đục lấy khối thạch với đường kính 5mm có sinh khối nấm từ đĩa
PDA phía trên và đặt vào trung tâm đĩa PDA như hình 2.3
Hút 20 𝜇l dịch nuôi cấy đã xử lí acid ở các nồng độ pha loãng cho vào giếng
thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, từ 3 – 5 ngày.

43
Đọc kết quả thí nghiệm:
Nếu xảy ra hiện tượng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ
bị ức chế và đường kính nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đường kính của nấm ở đĩa
đối chứng
Nếu không xảy ra hiện tượng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí
nghiệm sẽ không bị ức chế, phát triển bình thường như nấm ở đĩa đối chứng.
Tỷ lệ ức chế được đánh giá theo công thức sau (Pander và cộng sự, 1982)
 Đo đường kính khuẩn lạc (cm) trong 3, 5 và 7 ngày sau cấy
 Tỷ lệ (%) ức chế được tính theo công thức:
U =
𝐷−𝑋
𝐷
x100
Trong đó:
 U: % khuẩn lạc bị ức chế.
 D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng.
 X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc.
Nấm
Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa
thạch PDA

44
Trong đó: đường kính khuẩn lạc bằng đường kính sau khi đo trừ đi đường kính
khối thạch
Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ
(Hassan, 1989):
 Cấp 1: không ảnh hưởng (<50% )
 Cấp 2: ảnh hưởng yếu (50 – 79%)
 Cấp 3: ảnh hưởng vừa (80 – 90%)
+ Cấp 4: ảnh hưởng cao (>90%)
2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá
Sâu thí nghiệm – sâu tơ Plutela xylostella
Sâu tơ đầu tuổi 3 được chọn ra 30 con, tiến hành cân trọng lượng cả 30 con rồi
cho vào hộp có thể tích 950ml. Các hộp nuôi sâu đã được thanh trùng. Lặp lại 24 hộp
Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn
bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây
là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1
, 10-2
, 10-3
,
10-4
, 10-5
và 10-6
. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử
lý acid pha loãng với 18 ml PG vô trùng. Hút 9 ml dịch pha loãng ở các nồng độ rồi
tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha loãng. Sau đó, hút 1 ml phụ gia có chứa Tween
80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% cho vào 9 ml dịch pha loãng còn lại.
Tiến hành thí nghiệm.
Phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012) phương pháp này mô phỏng
gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngoài đồng nhằm khảo sát khả năng
diệt sâu qua đường tiêu hoá của hợp chất prodigiosin của chủng SH4.
Lá cải ngọt được rửa sạch và để ráo nước, cắt với diện tích 15 × 10 (cm2
). Hút
100 𝜇l dịch pha loãng lên lá, vô trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng
độ pha loãng lên lá cải ngọt. Sau đó cho lá vào hộp nuôi sâu. Theo dõi số lượng sâu

45
chết và trọng lượng của sâu trong 5 ngày theo các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72
giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm được bố trí như hình 2.6
Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương
pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012).
Ở hộp đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá cải ngọt được trang đều
100 𝜇𝑙 PG vô trùng được bổ sung 450 𝜇𝑙 HCl 1N, 450 𝜇𝑙 NaOH 1N. Hút 1ml phụ gia
chứa Tween 80 0,02%, rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào 9ml dịch trên.
Ở hộp đối chứng dương: tiến hành cho sâu tơ ăn lá cải ngọt được trang đều
100 𝜇𝑙 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC (abamectin) đã được pha loãng đạt nồng độ 7.5
ng/cm2
.
Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần
Đọc kết quả kháng sâu:
Dựa vào số lượng sâu tơ P. xylostella chết ở từng mốc thời gian để đánh giá
hiệu quả diệt sâu của chế phẩm. Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott (1925).
2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii
Ấu trùng thử nghiệm: Artemia nauplii.

46
Trứng bào xác Artemia nauplii được ấp nở bằng nước biển có độ mặn 30‰, pH
7,5 – 8,5. Tỷ lệ trứng là 0,5g – 1g/ lít nước biển. Quá trình ấp nở trứng để nơi thoáng
mát, có ánh sáng, nhiệt độ 26 – 300
C sục khí liên tục. Trứng nở sau 20 - 35 giờ.
, 10-2
, 10-3
,
10-4
, 10-5
và 10-6
lý acid pha loãng với 18 ml nước muối 30‰ vô trùng thành dãy nồng độ 10-1
, 10-2
,
10-3
, 10-4
, 10-5
và 10-6
. Sau đó, hút 2 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường
1%, dịch CMC 1% cho vào các dịch pha loãng trên.
Tiến hành thí nghiệm
Đếm chính xác 30 ấu trùng A.nauplii cho vào cốc nhựa đã kẻ vạch 20 ml đã
chuẩn bị.
Cho dịch pha loãng ở các nồng độ vào các cốc có chứa ấu trùng A.nauplii, tiếp
tục cho các dịch pha loãng theo dãy các nồng độ.
Cốc đối chứng âm : chuẩn bị 20 ml PG vô trùng có bổ sung 450 𝜇𝑙 HCl 1N, 450
𝜇𝑙 NaOH 1N. Hút 2 ml dịch PG có bổ sung 450 𝜇𝑙 HCl 1N, 450 𝜇𝑙 NaOH 1N cho
vào 18 ml nước muối 30‰ vô trùng. Thêm 2 ml phụ gia vào dịch trên rồi cho vào
cốc chứa 30 ấu trùng A.nauplii.
Cốc đối chứng dương : hút 100 𝜇𝑙 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC đã được pha
loãng đạt nồng độ 7.5 ng/cm2
cho vào cốc chứa 30 ấu trùng A.nauplii. Định mức thể
tích ở cốc đối chứng dương sao cho đạt cốc đạt 20 ml.
Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần với thể tích thực của cốc là 20 ml.
Đọc kết quả thử độc tính từ ấu trùng A.nauplii
Đếm số lượng ấu trùng A.nauplii sống sau 4 giờ. Tính LC50, LC90

47
2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica integrifolia
Hạt cải ngọt - Brassica integrifolia
Hạt cải ngọt Brassica integrifolia thời vụ quanh năm, chu kì sinh trưởng từ 32
- 35 ngày sau khi gieo độ sạch ≥ 98%, độ nảy mầm ≥85%, độ ẩm ≤10%.
, 10-2
, 10-3
,
10-4
, 10-5
và 10-6
lý acid pha loãng với 36 ml nước cất vô trùng thành dãy nồng độ 10-1
, 10-2
, 10-3
, 10-
4
, 10-5
và 10-6
. Hút 4 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC
1% vào các dịch pha loãng.
Đối chứng âm : Chuẩn bị 40 ml PG vô trùng hút 900 𝜇𝑙 HCl 1N và 900 𝜇𝑙
NaOH 1N. Hút bỏ 4 ml PG dịch trên rồi thêm 4 ml phụ gia chứa Tween 80 0,02 % ,
rỉ đường 1%, dịch CMC 1%.
Đối chứng dương: Hút 0,75 m𝑙 Reagants 3.6EC pha loãng vào 100ml nước cất
vô trùng.
Đếm chính xác 40 hạt cải ngọt thương phẩm cho vào ống nghiệm. Hút 1 ml dịch
pha các nồng độ thí nghiệm ngâm hạt cải trong 2 giờ, pha nước ấm với tỉ lệ nước 3
sôi : 2 lạnh ở 20 – 350
C.
Cân 1 kg đất trồng cho vào các hộp nhựa diện tích 15 x 21cm. Dùng thun chia
hộp thành 3 lô với diện tích mỗi lô là 7 x 15 cm với mỗi lô gieo 40 hạt cải ngọt.
Dùng giấy thấm khô hạt và gieo hạt đã ngâm vào các hộp đất đã chuẩn bị.
Dùng bình xịt phun 1ml các nồng độ thí nghiệm khi cây ra lá sau 3 ngày ngâm.
Phun chế phẩm định kì sau 3, 6, 9 ngày theo dõi. Chỉ phun 1 lần trong các ngày theo
dõi.

48
Quan sát cây, tưới nước 2 ngày một lần vào buổi sáng sớm và lúc chiều tối cho
các nghiệm thức.
Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần.
Đọc kết quả thí nghiệm:
Đếm số lượng hạt nảy mầm sau khi gieo. Tỉ lệ nảy mầm được tính theo công
thức
(
Tổng số hạt nảy mầm sau khi gieo
Tổng số hạt ban đầu trước khi gieo
) × 100
Đọc kết quả thử độc tính ở cải ngọt sau 3 ngày phun. Tỉ lệ chết của cây được
tính theo công thức Abbott (1925), theo dõi biểu hiện của cây sau khi phun chế phẩm.
Nếu cây có biểu hiện ngộ độc như cháy, vàng lá, héo, chết cây… thì ước lượng
độ độc theo thang đánh giá như sau:
Phân cấp mức độ độc của thuốc khảo nghiệm đối với cây trồng
Cấp Triệu chứng nhiễm độc.
1 Cây chưa có biểu hiện ngộ độc.
2 Ngộ độc nhẹ, sinh trưởng của cây giảm nhẹ.
3 Có triệu chứng ngộ độc nhẹ nhìn thấy bằng mắt.
4 Triệu chứng ngộ độc như (mất diệp lục) nhưng chưa ảnh hưởng
đến năng suất.
5 Cành lá biến màu hoặc cháy, thuốc gây ảnh hưởng đến năng suất.
6 Thuốc làm giảm năng suất ít.
7 Thuốc gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất.
8 Triệu chứng ngộ độc tăng dần tới làm chết cây.
9 Cây bị chết hoàn toàn.
QCVN 01 – 143 : 2013/BNNVPTNT
2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu
Cá bảy màu - Poecilia reticulate

49
Tuyển chọn cá mái, chiều dài 2,0 ± 1,0 cm, bơi nhanh linh hoạt, không bị dị tật
ở vây, đuôi… Chọn cá hoàn toàn khỏe mạnh sạch bệnh.
Pha môi trường nước nuôi cá thử nghiệm theo tiêu chuẩn (ISO 6341 – 1982).
Nước có độ cứng với tổng nồng độ ion Ca và Mg trong nước là 2,5mmol/l. Tỉ lệ Ca :
Mg là 4 : 1 và ion Na : K là 10 : 1, chỉ số acid KS4.3 là 0,8mmol/l(Fish, Acute Toxicity
Test, 1992).
Thiết lập hệ thông bán tĩnh thay nước 2 ngày/lần, thay ¾ lượng nước. Tỉ lệ nước
và trọng lượng cá là 25 g/lít. Chiếu sáng liên tục 12 giờ/ngày.
Cá được nuôi trong môi trường nước thử nghiệm trong 7 ngày để cá thích nghi,
nhiệt độ duy trì ở 21 - 250
C, lượng oxi hòa tan ≥ 60%.
Cá được cho ăn mỗi ngày 1 lần, khối lượng thức ăn được cho ăn bằng 1% trọng
lượng cá thí nghiệm
, 10-2
, 10-3
,
10-4
, 10-5
và 10-6
lý acid pha loãng với 9 ml PG vô trùng thành dãy nồng độ 10-1
, 10-2
, 10-3
, 10-4
, 10-5
.
Hút 1 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào các
dịch pha loãng.
Ở các nồng độ thí nghiệm pha loãng: 10-1
, 10-2
, 10-3
, 10-4
, 10-5
hút 1,7 ml mẫu
cho vào 10g thức ăn cho cá, tiếp tục cho 3 ml nước cất vô trùng vào hỗn hợp. Dùng
thìa vô trùng tán mạnh, trộn đều hỗn hợp tới khi hỗn hợp hoàn toàn đồng nhất. Sấy
mẩu thức ăn cho cá ở 450
C trong 5 giờ.
Đối chứng âm : Chuẩn bị 20 ml PG vô trùng hút 450 𝜇𝑙 HCl 1N và 450 𝜇𝑙
NaOH 1N. Hút 9 ml PG rồi thêm 1 ml phụ gia chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%,
dịch CMC 1%. Hút 1,7 ml đối chứng âm cho vào 10g thức ăn cho cá, tiếp tục cho 3

50
ml nước cất vô trùng vào hỗn hợp. Dùng thìa vô trùng tán mạnh, trộn đều hỗn hợp
tới khi hỗn hợp hoàn toàn đồng nhất. Sấy mẩu thức ăn cho cá ở 450
C trong 5 giờ.
Thiết lập hệ thống thử nghiệm bán tĩnh, thay nước 2 ngày/lần, thay ¾ lượng
nước thí nghiệm cá. Tỉ lệ nước và trọng lượng cá là 25 g/lít. Chiếu sáng liên tục 12
giờ/ngày.
Đếm chính xác 10 con cá bảy màu mái, tuyển chọn cá không dị tật ở vây, đuôi,
mang… Cá có chiều dài 2,0 ± 1,0 cm cho vào các hộp chứa nước thử nghiệm chuẩn
bị sẳn.
Sục khí liên tục tạo lượng oxi hòa tan trong nước ≥ 60%. Nhiệt độ thích hợp thử
nghiệm cho cá trong khoảng 21 - 250
C
Cá được cho ăn mỗi ngày 1 lần, khối lượng thức ăn được cho ăn bằng 1% trọng
lượng cá thí nghiệm.
Theo dõi cá thí nghiệm theo các mốc thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ.
Đọc kết quả thí nghiệm :
Đọc kết quả thử nghiệm độc tính của chế phẩm trên cá sau 5 ngày theo dõi. Tỉ
lệ chết của cá thử nghiệm được tính theo công thức Abbott (1925).
Theo dõi biểu hiện của cá sau khi ăn thức ăn có chế phẩm theo dãy nồng độ thí
nghiệm. Quan sát tất cả biểu hiện trên cơ thể cá, dị tật, hành vi bơi.

51
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào
Ngoài prodigiosin là tác nhân gây chết côn trùng thì enzyme Serralysin
metalloprotease cũng được coi là yếu tố độc lực của S. marcescens trên sâu vì vậy
dịch nuôi cấy phải thể hiện hoạt tính này.
Thử nghiệm hoạt tính protease
Sau quá trình ủ, khả năng phân giải casein của vi sinh vật bằng trichloroacetic
acid (TCA). Casein sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục do
enzyme protease có mặt trong canh trường lên men vi khuẩn, enzyme này phân giải
casein trong môi trường nên TCA tạo phức với casein.Vùng có sự phân giải casein sẽ
trong suốt vì không có phức hợp tủa giữa casein với TCA 10%
Kết quả khi tiến hành trên môi trường casein thì tất cả các nồng độ đều có
khả năng phân giải casein. Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA 10% –
casein trắng đục dễ dàng nhận thấy.
Thử nghiệm hoạt tính Chitinase
Tiến hành thí nghiệm trên môi trường huyền phù Chitin 1%, kết quả cho thấy
khi hạ pH môi trường về pH 2 để diệt tế bào vi khuẩn đã làm ảnh hưởng đến enzyme
chitinase, làm enzyme này bị bất hoạt hoặc biến tính, mất khả năng phân giải chitin
trong môi trường.
Thử nghiệm hoạt tính lipase
Enzyme lipase xúc tác thủy phân các cầu nối ether của triacylglycerol để tạo
ra glycerol acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi
trường đĩa thạch chứa tween 80 và CaCl2. Lipase sẽ thủy phân tween 80 trong môi
trường tạo ra các acid béo, các acid béo được giải phóng sẽ kết tủa với muối calcium
trong môi trường. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trường xung quanh
điểm cấy. Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase không có thấy sự hiện
diện của enzyme lipase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm.

52
Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid.
Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm:
lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy việc hạ đột ngột pH môi trường từ
trung tính (pH 7) về acid pH 2 không gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme
protease. Enzyme chitinase và lipase của vi khuẩn bị bất hoạt. Tóm lại, enzyme ngoại
bào là protease đã giữ được hoạt tính trong suốt quá trình xử lí acid HCl 1N.
3.2 Hoạt tính kháng nấm
Nấm Aspergillus flavus CDP1 và nấm Fusarium sp được xem là loài nấm gây
bệnh, sinh ra độc tố gây hại cho cây trồng. Vì vậy thử nghiệm khảo sát khả năng
kháng nấm bệnh để đánh giá khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử
lý acid.
Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1
Khả năng kháng nấm Aspergillus flavus CDP1
Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%)
21
30,0 ± 2,6 17,1 ± 2,8bc
22
29,6 ± 4,1 10,8 ± 4,8cd
23
28,0 ± 1,0 19,0 ± 1,6bc
24
28,0 ± 3,6 19,0 ± 10,0bc
25
27,3 ± 2,5 24,4 ± 3,6b
Stt
Hệ số pha
loãng
Đường kính vòng phân giải (D-d) mm trên môi
trường tương ứng
Casein agar Tween 80 agar Chitin agar
1 21
12 ± 0,1b
0 0
2 22
11,3 ± 0,1b
0 0
3 23
11,3 ± 0,6b
0 0
4 24
10 ± 0,1bc
0 0
5 25
10,0 ± 0,2bc
0 0
6 26
7,3 ± 0,6c
0 0

Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens sh4

Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens sh4

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens sh4

Similar to Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens sh4 (20)

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens sh4