SlideShare a Scribd company logo

Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic

•
•
https://www.facebook.com/garmentspace
https://www.facebook.com/garmentspace

Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

Education
1 of 92
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN CÓ LỢI TẠI MỘT SỐ VÙNG ĐẤT NÔNG NGHIỆP HUYỆN GÒ DẦU, TỈNH TÂY NINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Lê Thị Mỹ Hạnh MSSV: 1051110011 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
Đồ án tốt nghiệp ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày ....... tháng ....... năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mỹ Hạnh
Đồ án tốt nghiệp iii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày ...... tháng ...... năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mỹ Hạnh
Đồ án tốt nghiệp iv MỤC LỤC Trang Trang bìa .................................................................................................................. i Lời cam đoan ..........................................................................................................ii Lời cảm ơn .............................................................................................................iii Mục lục .................................................................................................................. iv Danh sách các chữ viết tắt ....................................................................................vii Danh sách các bảng .............................................................................................viii Danh sách các hình ................................................................................................ ix Mở đầu.................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề............................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu........................................................................................... 2 4. Phạm vi nghiên cứu............................................................................................. 2 Chương 1. Tổng quan ........................................................................................... 3 1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp.... 3 1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất.................................................................... 3 1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất............................................................. 3 1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất................................................... 5 1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật ....................................... 9 1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào........................................................................ 9 1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào.......................................................................... 9 1.2.3. Đặc điểm – tính chất.................................................................................... 10 1.2.4. Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ..................................................... 13 1.3. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay .................................... 23 Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu........................................... 24 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................................... 24 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 24 2.1.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 24
Đồ án tốt nghiệp v 2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 24 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập ................................................................................... 24 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị........................................................................................... 24 2.2.3. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị....................................................................... 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 25 2.3.1. Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu.............................................................. 25 2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu....................................................................... 26 2.3.3. Phương pháp tăng sinh................................................................................ 27 2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ........................................ 27 2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật............................................................. 28 2.3.6. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn .... 30 2.3.7. Phương pháp xác định mật độ tế bào.......................................................... 31 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................... 31 2.4. Bố trí thí nghiệm........................................................................................... 31 2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn ................................ 32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................................................ 33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh ............................................................. 36 Chương 3. Kết quả và thảo luận........................................................................ 38 3.1. Kết quả đánh giá nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu.................. 38 3.2. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ ........................................................ 40 3.2.1. Kết quả phân lập.......................................................................................... 40 3.2.2. Kết quả định danh sơ bộ.............................................................................. 41 3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................... 43 3.2.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase ................................................... 43 3.2.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase .................................................. 44 3.3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease................................................... 46 3.3.4. Đánh giá khả năng sinh enzyme lipase....................................................... 47
Đồ án tốt nghiệp vi 3.3.5. Đánh giá khả năng sinh enzyme catalase ................................................... 49 3.3.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme oxidase.................................................... 49 3.4. Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với vi khuẩn gây bệnh.................................................................................. 51 3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp................................................................... 52 3.4.2. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli.............................................................................. 53 3.4.3. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella ............................................................................ 55 3.4.4. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio ............................................................................... 57 3.4.5. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus ........ 59 3.5. Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập ................... 63 Chương 4. Kết luận và đề nghị .......................................................................... 68 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 68 4.2. Đề nghị........................................................................................................... 68 Tài liệu tham khảo............................................................................................... 69
Đồ án tốt nghiệp vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC: carboxymethyl cellulose HEC: hydroxyethyl cellulose EG: endoglucanase CBH: exoglucanase CBD: cellulose binding domain Ser: Serine His: Histidine Asp: Acid aspartic TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar
Đồ án tốt nghiệp viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sách mẫu phân lập....................................................................... 24 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập.......................... 40 Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ của các chủng vi khuẩn phân lập ................. 41 Bảng 3.3. Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập ..... 43 Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập .... 45 Bảng 3.5. Khả năng phân huỷ gelatin và casein của các chủng vi khuẩn phân lập.................................................................................................................. 46 Bảng 3.6. Khả năng sinh enzyme lipase của các chủng vi khuẩn phân lập ......... 48 Bảng 3.7. Khả năng sinh enzyme catalase của các chủng vi khuẩn phân lập...... 49 Bảng 3.8. Khả năng sinh enzyme oxidase của các chủng vi khuẩn phân lập ...... 50 Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp................................................................... 52 Bảng 3.10. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli............................................................................. 54 Bảng 3.11. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella ............................................................................ 56 Bảng 3.12. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio .............................................................................. 58 Bảng 3.13. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus ............................................................................................. 60 Bảng 3.14. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................................... 64 Bảng 3.15.A. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................... 65 Bảng 3.15.B. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................... 66
Đồ án tốt nghiệp ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật ...................... 3 Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn............................................................. 6 Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn............................................................................ 7 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase .............................. 14 Hình 1.5. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein ........... 15 Hình 1.6. Cấu trúc không gian của enzyme protease ........................................... 17 Hình 1.7. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase........................................... 19 Hình 1.8. Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa................ 21 Hình 1.9. Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước.............................................................................................................. 22 Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu................................................................. 26 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.......................................................................... 31 Hình 2.3. Quy trình phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp............... 32 Hình 2.4. Vòng phân giải tinh bột của vi khuẩn trên môi trường Starch Agar............................................................................................................ 34 Hình 2.5. Vòng phân giải casein của vi khuẩn trên môi trường Skim Milk Agar..................................................................................................... 34 Hình 2.6. Vòng phân giải Tween của vi khuẩn trên môi trường Tween Peptone Agar ............................................................................................. 35 Hình 2.7. Vòng phân giải cellulose của vi khuẩn trên môi trường CMC Agar ... 35 Hình 2.8. Kết quả âm tính và dương tính của thử nghiệm gelatinase .................. 36 Hình 3.1. Các nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu..................................... 39 Hình 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn phân lập....................... 42 Hình 3.3. Vòng phân giải tinh bột của các chủng ĐTL101, ĐTL102, ĐTT112 trên môi trường Starch Agar .................................................................. 44 Hình 3.4. Vòng phân giải cellulose của các chủng ĐMT701, ĐRD801, ĐTQ901 và ĐTT111 trên môi trường CMC Agar ............................................... 46
Đồ án tốt nghiệp x Hình 3.5. Kết quả dương tính của cáic chủng vi khuẩn phân lập so với mẫu đối chứng trong thử nghiệm gelatinase......................................................... 47 Hình 3.6. Kết qảu kiểm tra khả năng sinh enzyme lipase của các chủng ĐTL201, ĐTL301, ĐTL502 và ĐTB601 trên môi trường Tween Peptone Agar ............................................................................................. 48 Hình 3.7. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL501, ĐRD801 và ĐTT111 đối với vi khuẩn S. dublin.................................................................. 53 Hình 3.8. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL401 và ĐTL501 đối với nhóm vi khuẩn E. Coli .......................................................... 55 Hình 3.9. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL501, ĐRD801 đối với vi khuẩn Shi. sonnei .................................................................. 57 Hình 3.10. Vòng kháng khuẩn của sinh khối chủng ĐTT112 đối với các vi khuẩn chỉ thị nhóm Vibrio.......................................................................... 59 Hình 3.11. Vòng kháng khuẩn của các chủng ĐTL501, ĐTT112, ĐRD801 đối với các vi khuẩn chỉ thị L. monocytogenes, L. innocua ................................. 61
Đồ án tốt nghiệp 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong giai đoạn hiện nay, nước ta đang trên đà phát triển theo hướng công nghiệp hóa - hiện đại hóa nhưng nông nghiệp vẫn đóng vai trò quan trọng, trong đó ngành trồng trọt vẫn là nền tảng với diện tích đất canh tác chiếm 17% tổng diện tích đất. Theo báo cáo Tổng điều tra đất đai năm 2010, tổng diện tích nhóm đất nông nghiệp của nước ta năm 2010 là 26.100.160 ha, tăng 5.179.385 ha (gấp 1,25 lần) so với năm 2000. Trong canh tác nông nghiệp, ngoài trồng lúa nước, người dân còn sử dụng để trồng trọt các loại hoa màu để tăng thêm thu nhập. Do đó, để có được mùa vụ trồng trọt tốt thì chất lượng đất đóng vai trò quyết định, trong đó có sự đóng góp quan trọng của các vi sinh vật. Đất là nơi diễn ra hàng loạt các quá trình chuyển hoá vật chất, trao đổi dinh dưỡng và năng lượng để hình thành và phát triển độ phì nhiêu của đất mà trong đó vi sinh vật đất đóng vai trò quan trọng. Ngoài chức năng tham gia vào các quá trình chuyển hoá vật chất, vi sinh vật đất sau chu kỳ sống còn để lại cho đất sinh khối rất lớn tạo nên độ phì nhiêu của đất. Vì thế vi sinh vật đất là một trong các chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá độ phì nhiêu và chất lượng của đất. Với sự hiện diện thường xuyên của các vi sinh vật có lợi trong đất ngoài việc giúp cho đất tăng độ phì nhiêu, giúp người dân hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học thì đây cũng chính là nguồn cung cấp các nhóm vi sinh vật có lợi như có khả năng sinh enzyme ngoại bào cũng như có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Do đó, việc xác định sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi trong đất, nhất là trong các vùng đất nông nghiệp như đất trồng lúa, đất trồng hoa mùa sẽ phục vụ cho mục tiêu này. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh”. Đề tài này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
Đồ án tốt nghiệp 2 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi - sản sinh enzyme ngoại bào và đặc tính đối kháng, trong đất nông nghiệp tại huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn hiện diện trong một số vùng đất trồng lúa và đất trồng hoa màu. - Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập. - Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh. 4. Phạm vi nghiên cứu Chỉ khảo sát vùng đất canh tác nông nghiệp của ông Nguyễn Văn Hoàng, ngụ tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh.
Đồ án tốt nghiệp 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp 1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất Hầu hết vi sinh vật là sinh vật dị dưỡng, chỉ một số ít vi sinh vật là vi sinh vật tự dưỡng. Quan hệ sinh thái được biểu diễn bằng sơ đồ Hình 1.1. Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật Vai trò của vi sinh vật là khép kín vòng tuần hoàn trong hệ sinh thái, tái tạo thức ăn cho động vật, thực vật bằng cách phân huỷ để lấy lại chất dinh dưỡng cung cấp cho nhiều cơ thể dạng sống. Nó đem lại hai hiệu quả: - Tăng độ phì của đất. - Giải quyết nạn ứ đọng chất thải trong đất. Như vậy, vi sinh vật khép kín vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, P, S, K... thông qua các quá trình phân huỷ các nguyên tố này trong đất. 1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất Trong hệ vi sinh vật đất, vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn chiếm khoảng 8%, vi nấm 1%, còn lại 1% là tảo và nguyên sinh động vật. Tỉ lệ này thay đổi tuỳ theo các loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý, tầng đất, thời vụ, chế độ canh tác... Ở những đất có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng và thành phần. Sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu, màu mỡ. Chất vô cơ Chất hữu cơ Chất hữu cơ Ánh sáng SV sản xuất SV tiêu thụ SV phân huỷ
Đồ án tốt nghiệp 4 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất có thể chia ra như sau: • Phân bố theo chiều sâu Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác. Đó là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp nhất. Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càng xuống sâu càng ít vi sinh vật. Riêng đối với các đất bạc màu, do hiện tượng rửa trôi, tầng 0 - 20 cm ít chất hữu cơ hơn tầng 20 - 40 cm nên ở tầng này số lượng vi sinh vật nhiều hơn ở tầng trên, sau đó giảm dần ở các tầng dưới. Thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo tầng đất: vi khuẩn hiếu khí, vi nấm, xạ khuẩn thường tập trung ở tầng mặt vì tầng này có nhiều oxy. Càng xuống sâu, các nhóm vi sinh vật hiếu khí càng giảm mạnh. Ngược lại, các nhóm vi khuẩn kỵ khí như vi khuẩn phản nitrate hoá phát triển mạnh ở độ sâu 20 - 40 cm. Ở vùng khí hậu nhiêt đới nóng ẩm thường có quá trình rửa trôi, xói mòn nên tầng 0 - 20 cm dễ biến động, tầng 20 - 40 cm ổn định hơn. • Phân bố theo các loại đất Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoáng khí, pH khác nhau dẫn đến sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau. Ở đất lúa nước, tình trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt, chất dinh dưỡng,... Chỉ có một lớp mỏng ở trên khoảng 0 - 3 cm là có quá trình oxy hoá, ở tầng đất dưới quá trình khử oxy hoá chiếm ưu thế. Do đó trong đất lúa nước các loại vi sinh vật kỵ khí phát triển mạnh. Ví dụ như vi khuẩn amon hoá, vi khuẩn phản nitrate hoá. Ngược lại, các loại vi sinh vật hiếu khí như vi khuẩn nitrate hoá, vi khuẩn cố định nitrogen, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít. Tỷ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí luôn nhỏ hơn 1. Ở đất trồng hoa màu, không khí lưu thông tốt, quá trình oxy hoá chiếm ưu thế, bởi vậy các loài vi sinh vật hiếu khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát triển yếu. Tỷ lệ gữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí thường lớn hơn 1, có trường hợp
Đồ án tốt nghiệp 5 đạt tới 4 – 5. Ở đất giàu dinh dưỡng như đất phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật tổng số rất cao. Ngược lại, vùng đất bạc màu Hà Bắc có số lượng vi sinh vật rất ít. • Phân bố theo cây trồng Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển mạnh hơn so với vùng không có rễ do rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi nó chết đi. Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ ẩm. Tất cả những nhân tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát triển mạnh hơn vùng ngoài rễ. Tuy nhiên, mỗi loại cây trồng trong quá trình sống của nó thường tiết qua bộ rễ những chất khác nhau. Bộ rễ khi chết đi cũng có thành phần khác nhau. Thành phần và số lượng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lượng vi khuẩn cố định nitrogen cộng sinh còn ở vùng rễ lúa là nơi cư trú của các nhóm cố định nitrogen tự do hoặc hội sinh... Số lượng và thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo các giai đoạn phát triển của cây trồng. Đất vùng phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn lúa chồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là cây lúa sinh trưởng mạnh. Bởi vậy thành phần và số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ rễ càng lớn – đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật vùng rễ. Số lượng vi sinh vật đạt cực tiểu ở thời kỳ lúa chín. Thành phần vi sinh vật cũng biến động theo các giai đoạn phát triển của cây, phù hợp với hàm lượng các chất tiết qua bộ rễ. 1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất Theo nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố, hệ vi sinh vật trong đất rất phong phú với rất nhiều nhóm gồm: vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn, virus, tảo và nguyên sinh động vật (protozoa) (Lê Quốc Tuấn, 2009). 1.1.3.1. Vi khuẩn Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước hiển vi, có cấu trúc tế bào đơn giản gồm màng tế bào, tế bào chất và nhân (không có màng nhân) (prokaryote). Kích thước của vi khuẩn từ 0,1- 1,2 x 0,2- 6,0 µm. Peptidoglycan là chất đặc biệt ở vách tế bào prokaryote, dựa vào khả năng bắt màu của crystal violet
Đồ án tốt nghiệp 6 vi khuẩn được phân biệt hai loại là vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Một số vi khuẩn di chuyển bằng tiên mao. Vi khuẩn sinh sản bằng con đường vô tính. Hình thái vi khuẩn rất đa dạng, có thể chia thành 3 nhóm hình dạng chính: hình cầu, hình que và hình xoắn (Hình 1.1). Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998) Staphylococcus aureus (a); Bacillus subtilis (b); Spirillum (c). Các nhóm vi khuẩn rất đa dạng và giữ những vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá vật chất để khép kín vòng tuần hoàn các chất trong đất và trong tự nhiên. Vi khuẩn tham gia hình thành và cải tạo đất trồng trọt, phân huỷ, chuyển hoá hợp chất khó tan trong đất thành các chất dễ tiêu cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Một số vi khuẩn có khả năng đồng hoá nitơ trong không khí để làm giàu nitơ cho đất và cung cấp nitơ cho cây trồng. Ngoài ra, vi khuẩn còn có khả năng tiết ra các enzyme, các chất kích thích sinh trưởng, các acid hữu cơ trong đất ... Một số vi khuẩn quan trọng thường gặp trong đất: Bacillus subtilis, Chostridium, Lactobacillus, Rhizobium,... 1.1.3.2. Vi nấm Vi nấm là nhóm nấm có kích thước hiển vi. Vi nấm khác với vi khuẩn và xạ khuẩn, chúng có cấu tạo nhân điển hình, vì vậy chúng được xếp vào nhóm Eukaryote. Vi nấm gồm 2 nhóm lớn là nấm men (yeast) và nấm sợi (filamentous fungi). Trong đó, nấm men có cấu trúc đơn bào còn nấm sợi có cấu trúc đa bào. Nấm men (yeast) có khả năng sinh sản bằng vô tính theo hình thức nẩy chồi, một vài loài sinh bào tử và cũng có thể sinh sản hữu tính như chi Saccharomyces. Nấm sợi có quá trình sinh sản phức tạp hơn nấm men. Sinh sản vô tính có nhiều b) c) a)
Đồ án tốt nghiệp 7 cách: bào tử trần, bào tử kín. Sinh sản hữu tính của nấm sợi cũng có vài hình thức khác nhau. Thường gặp là các chi Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Chaetomium, Alternaria, Rhizoctonia, Verticillium,... Có vai trò quan trọng trong quá trình mùn hoá và phân giải xác hữu cơ cho đất (phân giải cellulose, tinh bột, nhựa, lignin,...). 1.1.3.3. Xạ khuẩn Xạ khuẩn là những vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm prokaryote, hình sợi, phân bố rộng rãi trong đất, trong nước và trong các cơ chất hữu cơ. Kích thước của xạ khuẩn nằm trong khoảng 0,2 – 0,5 x 0,4 – 100 µm. Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998) Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu của đất. Tham gia vào các quá trình chuyển hoá và phân giải nhiều hợp chất
Đồ án tốt nghiệp 8 hữu cơ phức tạp (cellulose, mùn, kitin, lignin,...). Hầu hết các xạ khuẩn thuộc giống Actinomyces có khả năng hình thành chất kháng sinh. Đây là đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn. Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), một số acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic và nhiều acid amin như acid glutamic, tryptophan,... Một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme như: protease, amylase, chitinase, cellulase... Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số xạ khuẩn lại sinh ra các chất độc kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật. Một số khác lại là nguyên nhân gây ra một số bệnh khó chữa ở người và gia súc. Các bệnh này gọi chung là Actynomycose. Một số giống xạ khuẩn quan trọng trong đất: Actinomyces, Bacterionema, Pseudonocardia, Streptomyces... 1.1.3.4. Tảo Tảo là sinh vật tự dưỡng không bắt buộc (nhờ quá trình quang hợp), phát triển mạnh ở lớp đất mặt. Tảo có tác dụng làm tăng khả năng hoà tan của khoáng vật đặc biệt là carbonate, làm tăng tốc độ phong hoá, cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ cho đất. Một số tảo lục, lam có khả năng cố định nitơ tự do. Bên cạnh đó tảo còn giúp hạn chế xói mòn đất do gió. 1.1.3.5. Nguyên sinh động vật (protozoa) Nguyên sinh động vật có kích thước hiển vi, cấu tạo và hoạt động của tế bào nguyên sinh động vật giống tế bào của sinh vật đa bào. Nhưng chính tế bào này là tế bào biệt hoá đa năng, đảm nhận mọi chức năng sống của một cơ thể độc lập. Nguyên sinh động vật có vai trò quan trọng ở mức sản xuất sơ cấp và phân huỷ, chúng có thể làm nguồn thức ăn chủ yếu cho nhiều loài không xương sống và gián tiếp cho nhiều loài động vật có xương sống. Một số nguyên sinh động vật thường gặp là: trùng chân giả (Amoeba), trùng roi (Flagellata), ...
Đồ án tốt nghiệp 9 1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật 1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các quá trình dị hóa bên ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào vi khuẩn. Vì các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật là các hợp chất cao phân tử nên vi sinh vật không thể vận chuyển qua màng tế bào, cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng thuỷ phân các hợp chất cao phân tử này thành các hợp chất có trọng lượng thấp hơn để vi sinh vật có thể vận chuyển qua màng tế bào. Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản ứng bên ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ có ở vi sinh vật. 1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm phụ: - Nhóm 1: Oxidoreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. - Nhóm 2: Transferase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị. - Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia). - Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi. - Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa. - Nhóm 6: Ligase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác.
Đồ án tốt nghiệp 10 Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase. Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O R1OH + R2H Tinh bột + H2O Dextrin + Maltose + Glucose Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme: amylase, cellulase, protease và lipase… 1.2.3. Đặc điểm – tính chất Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa: - Về bản chất, enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của một protein, có trọng lượng phân tử từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do có trọng lượng phân tử lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào. - Vì có bản chất là protein nên enzyme cũng có tính lưỡng tính (do có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị phân ly như sau: Protein - COOH Protein - COO- + H+ Protein - NH2 Protein - NH+ + H+ - Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ hữu cực khác. - Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 1100C như: α-amylase từ vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis có thể chịu được nhiệt độ 110oC. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt α-amylase Kiềm Acid Acid Kiềm
Đồ án tốt nghiệp 11 còn có khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid 2,1… - Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme. Trong trung tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme (trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca2+. - Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo quy luật cảm ứng cơ chất. Khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không có cơ chất để phân hủy cơ chất đó. Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp này gọi là enzyme cảm ứng. Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng được gọi là cơ chất cảm ứng. Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng tăng dần. Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu cơ chất gây ra. - Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau. - Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi hỏi năng lượng rất lớn. Ví dụ: Trong quá trình thủy phân saccharose thành fructose và glucose:
Đồ án tốt nghiệp 12 + Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân tử gam. + Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử gam. Phương trình phản ứng: Saccharose Fructose + Glucose + Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000 cal/phân tử gam. Phương trình phản ứng: Saccharose Fructose + Glucose - Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một hoặc một số phản ứng sinh hóa. - Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản ứng. Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme. - Enzyme vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, môi trường lên men rẻ tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme dễ dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm enzyme của động vật và thực vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động vật hay thực vật là mỗi loài chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ như từ malt có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ vi sinh vật thì ngược lại; từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng enzyme rất lớn. Chúng có hoạt tính rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn. Nuôi cấy vi sinh Saccharase Acid
Đồ án tốt nghiệp 13 vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật. Có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất. 1.2.4. Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng. Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp. 1.2.4.1. Enzyme amylase a) Đặc điểm Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: RR’ + H-OH → RH + R’OH Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. b) Phân loại Hiện nay, có sáu loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (amylase nội bào) và Exoamylase (amylase ngoại bào). - Endoamylase: gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là oligo-1,6- glucosidase hay còn gọi là dextrinase tới hạn (EC 3.2.1.10) và amylo-1,6- glucosidase (EC 3.2.1.20). Các enzyme này thuỷ phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. - Exoamylase: gồm có β-Amylase (EC 3.2.1.2) và Amyloglucosidase (glucoamylase hay 𝛾-Amylase) (EC 3.2.1.3). Đây là những enzyme thuỷ phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. c) Cấu trúc Enzyme amylase thuộc loại hydrolase chỉ là những phân tử protein thuần, trung tâm hoạt động thường là những nhóm chức như: -NH2, -COOH, -SH ...
Đồ án tốt nghiệp 14 α-Amylase (EC 3.2.1.1) β-Amylase (EC 3.2.1.2) oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Amyloglucosidase (EC 3.2.1.3) amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.20) Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase d) Cơ chế tác dụng Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thuỷ phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thuỷ phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức
Đồ án tốt nghiệp 15 độ: dịch hoá và đường hoá. Kết quả của sự dịch hoá là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hoá thì sản phẩm là maltose và glucose. - α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glycoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. Thông thường α-amylase chỉ thuỷ phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. - β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. - R-enzyme còn gọi là α-1,6-glucosidase cắt các liên kết α-1,6-glycoside tại điểm xuất phát mạch nhánh. - Ngoài ra enzyme amyloglucosidase lại có khả năng cắt từng đơn vị đường đơn (glucose) từ đầu của mạch carbohydrate. e) Một số vi sinh vật sinh enzyme amylase hiện diện trong đất Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Bacillus megaterium là một trong số những sinh vật hiện diện trong đất có khả năng sinh enzyme amylase cao (Verma và ctv, 2011). 1.2.4.2. Enzyme protease a) Đặc điểm Nhóm enzyme protease (peptide – hydrolase, EC 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Hình 1.5. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein
Đồ án tốt nghiệp 16 Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết ester và vận chuyển acid amin. b) Phân loại Protease được chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành 2 loại: - Aminopeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc tripeptide. - Carboxypeptide: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm: - Serine protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. - Cysteine protease: là những protease có chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động. Các cysteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. - Aspartic protease: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở vùng pH trung tính. - Metalloprotease: là những protease trong trung tâm hoạt động của chúng có các ion kim loại. Các metallo protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. c) Cấu trúc Trung tâm hoạt động của protease vi sinh vật ngoài gốc amin acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc amino acid khác.
Đồ án tốt nghiệp 17 - Serine protease: chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. - Cysteine protease: chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động. - Aspartic protease: chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật bao gồm một số gốc amino acid và trong một số trường hợp còn có cả cofactor kim loại. Đối với các protease không chứa cystein, trung tâm hoạt động của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu nối disulphide. Hình 1.6. Cấu trúc không gian của enzyme protease d) Cơ chế tác dụng Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S E – S E – S* + P1 E + P2 Trong đó: E: enzyme. S: cơ chất (substance). E – S: phức chất enzyme - cơ chất. E – S*: phức chất trung gian enzyme - cơ chất hóa (axilenzyme). P1: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amino tự do mới được tạo thành).
Đồ án tốt nghiệp 18 P2: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do được tạo thành). e) Các vi sinh vật sản sinh enzyme protease hiện diện trong đất Trong số các vi sinh vật hiện diện trong đất, Bacillus sp. là một trong những nhóm vi khuẩn điển hình sản sinh ra enzyme protease ngoại bào. Theo kết quả nghiên cứu của Sethi và ctv (2012), vi khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh enzyme protease là Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilus, E. Coli và Serratia marscens. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của các vi sinh vật hiện diện trong đất của Nadrendra và ctv (2012) cũng cho thấy rằng đó chính là Bacillus sp. 1.2.4.3. Enzyme cellulase a) Đặc điểm Cellulase thuỷ phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucoside trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc. Cơ chất của enzyme cellulase là cellulose. b) Phân loại Dựa vào đặc điểm của cơ chất (cellulose) và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành ba loại: - 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase hay còn gọi là exoglucanase (EC 3.2.1.91). - 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase hay còn gọi là endoglucanase (EC 3.2.1.4). - β-D-glucoside glucohydrolase hay còn gọi là β-glucosidase (EC 3.2.1.21). Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong dạ dày cỏ bò, mối và trong một số nấm như Trichoderma, Aspergillus,... c) Cấu trúc Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là acid amin, các acid amin được nối với nhau bởi liên kết peptide -CO-NH-. Ngoài ra, trong cấu trúc
Đồ án tốt nghiệp 19 còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hoá, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể. Trong quá trình phân huỷ cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose. Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose. Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosyl hoá có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Hình 1.7. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase d) Cơ chế tác dụng Sự thuỷ phân cellulose nhờ hệ enzyme cellulase gồm 4 enzyme, gồm: - Cellobiose dehydrolase: cắt các liên kết hydro biến cellulose có cấu trúc không gian thành cellulose vô định hình. - Endoglucanase: cắt các liên kết β - 1, 4 - glucoside tạo thành các chuỗi dài. - Exoglucanase: Cắt các chuỗi thành cellobiose. - β – glucosidase: thuỷ phân cellobiose thành glucose. e) Vi sinh vật sản sinh enzyme cellulase hiện diện trong đất Theo kết quả nghiên cứu của Sethi và ctv (2012), vi khuẩn được phân lập từ đất và có khả năng sinh enzyme cellulase là Pseudomonas fluorescens, Bacillus
Đồ án tốt nghiệp 20 subtilis, E. Coli và Serratia marescens. Nghiên cứu của Pandey và ctv (2005) cho thấy nhiều loài nấm cũng có khả năng sinh enzyme cellulase cao, điển hình là Trichoderma reesei, Humicola, Penicillium, Aspergillus. 1.2.4.4. Enzyme lipase a) Đặc điểm Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành glyceryl và acid béo tương ứng. Lipase tan trong nước và các dung môi phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực. Lipase rất cần thiết cho việc tiêu hoá, vận chuyển và xử lý các chất béo như triglyceride, dầu, mỡ trong hầu hết các sinh vật sống. b) Phân loại Theo nguồn gốc, enzyme lipase được chia làm 3 loại: - Lipase từ động vật: thu nhận thường khó và hiệu quả kinh tế không cao. - Lipase từ thực vật. - Lipase từ vi sinh vật: vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với quy mô công nghiệp lớn, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng và có thể thoả mãn trong 1 mức độ lớn về nhu cầu của các ngành công nghiệp khác nhau. Theo tính chất: - Lipase có tính đặc hiệu vị trí. - Lipase có tính đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hoá dưới tác dụng của enzyme. c) Cấu trúc Lipase là enzyme lưỡng cấu tử, trong thành phần có 2 phần: Protein (apoenzyme) và không phải protein (coenzyme). Tham gia vào thành phần nhóm ngoại gồm có: coenzyme, vitamin, ion kim loại.
Đồ án tốt nghiệp 21 Hình 1.8. Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa Nhóm quan trọng nhất tạo thành trung tâm hoạt động của lipase là bộ ba aspartic, histidine và serine. Lipase tham gia vào vị trí xúc tác với proteinase và esterase. Đối lập với proteinase, trung tâm xúc tác của nó không phân bố ở bề mặt ngoài mà nằm dưới chuỗi xoắn bề mặt. Vị trí hoạt động của mọi lipase đều có Ser, His và Asp (hoặc Glu) và hoàn toàn bị che khuất bởi một đoạn nắp cấu tạo bởi một hoặc hai chuỗi xoắn. Bề mặt mang Trypsin hoàn toàn không phân cực và tác động qua lại với đầu kỵ nước bao quanh trung tâm hoạt động. Trong hầu hết cấu trúc lipase, đầu serine hoạt động trong chuỗi pentapeptide có trình tự Gly-X1-Ser-X2- Gly cấu trúc đó cũng được tìm thấy ở protease serine (Boel và ctv, 1998). d) Cơ chế động học xúc tác của lipase Lipase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành glyceryl và acid béo tương ứng. Chúng xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt từng liên kết chứ không cắt đứt cả 3 liên kết ester cùng một lúc. Quá trình xúc tác của lipase thường chậm hơn so với quá trình xúc tác của các enzyme khác như protease hay amylase. Với các cơ chất không tan trong nước, hoạt tính của lipase đạt cực đại chỉ khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu nước. Quá trình đó được gọi là quá trình hoạt hoá phân pha.
Đồ án tốt nghiệp 22 Hình 1.9. Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước. Sự thay đổi hình thể của lipase trong quá trình hoạt động xúc tác. Mô hình này do Verger đề xuất (1980) Trong đó: E: Lipase hoà tan không hoạt động. E*: Lipase hoà tan dạng hoạt động. Es*: Lipase hoạt động có hấp phụ. Eis*: Lipase không hoạt động được hấp phụ. Sw: Cơ chất tan trong nước. S: Cơ chất không tan trong nước. E*Sw và Es*S: Phức hợp lipase - cơ chất. Khi không có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ, phản ứng este hoá và phản ứng este được ưu tiên. Trong trường hợp này, những đặc tính như tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng và bản chất cơ chất (Woolley & Petersen, 1992). e) Vi sinh vật sản sinh enzyme lipase hiện diện trong đất Nhiều sinh vật như thực vật, nấm và vi khuẩn có khả năng sản sinh enzyme lipase. Theo nghiên cứu của Prasad (2014) về việc cô lập enzyme lipase của các vi sinh vật hiện diện trong các mẫu đất khác nhau gần các nhà máy sản xuất dầu giàu hàm lượng lipid đã xác định được đó chính là Pseudomonas aeruginosa. Kết quả nghiên cứu của Veerapagu và ctv (2013) cũng cho thấy rằng Pseudomonas gessardii được phân lập từ đất ở những vùng bị tràn dầu từ các nhà máy chế biến dầu thực vật là vi khuẩn lý tưởng cho việc sản sinh enzyme lipase ngoại bào ở mức độ công nghiệp.
Đồ án tốt nghiệp 23 1.3. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay Tất cả các sinh vật trong sinh quyển đều phụ thuộc vào hoạt động của vi sinh vật (Pace, 1997). Vi sinh vật hiện diện trong đất đóng vai trò quan trọng trong các chu trình chuyển hóa chất dinh dưỡng và trong hệ sinh thái trên mặt đất. Do đó vi sinh vật đất đã sớm được các nhà khoa học chú ý nghiên cứu. Điều quan trọng để nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật không chỉ để nghiên cứu khoa học cơ bản, mà còn để hiểu mối liên hệ giữa sự đa dạng, cấu trúc và chức năng của quần thể vi sinh vật cũng như sự tiến hoá của chúng. Những tác động của con người như sự ô nhiễm, hoạt động nông nghiệp và việc sử dụng hoá chất có thể ảnh hưởng bất lợi đến sự đa dạng vi sinh vật, ảnh hưởng đến hệ sinh thái trên và dưới mặt đất. Theo nghiên cứu của Buckley và Schmidt (2001) đã tìm thấy một lượng 16S rRNA cao ở tất cả các nhóm vi sinh vật trong các cánh đồng chưa được canh tác so với các cánh đồng đã được canh tác. Điều này cho thấy hoạt động canh tác của con người có tác động đến vi sinh vật hiện diện trong đất. Trevors và ctv (2003) đã ước tính trong 1 g đất có 4000 đơn vị gen vi khuẩn khác nhau dựa trên DNA-DNA ghép đôi. Ước tính có khoảng 5000 loài vi khuẩn đã được mô tả. Khoảng 1 % quần thể vi khuẩn đất có thể được nuôi cấy invitro nhưng không thể biết được 1 % quần thể vi khuẩn này có là đại diện của quần thể vi khuẩn hay không. Ước tính có khoảng 1,500,000 loài nấm tồn tại trong thế giới (Giller và ctv, 1997). Không giống như vi khuẩn, nhiều loại nấm không thể được nuôi cấy invitro. Mặc dù phương pháp phân tử đã được sử dụng để nghiên cứu các cộng đồng vi khuẩn đất nhưng rất ít nghiên cứu về nấm đất được thực hiện (Van Elsas và ctv, 2000). Dựa vào kết quả của các nghiên cứu đã đạt được, các chuyên gia sẽ đưa ra các biện pháp khai thác đầy đủ theo hướng có lợi các loài sinh vật hữu ích và ngăn chặn những tác hại của các loài sinh vật có hại nhằm nâng cao độ phì của đất, tăng năng suất và chất lượng nông phẩm của các loại cây trồng.
Đồ án tốt nghiệp 24 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 02/2014 đến 07/2014. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập Nguồn mẫu phân lập được thu tại vùng đất canh tác của ông Nguyễn Văn Hoàng gồm có đất trồng lúa và đất trồng hoa màu tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. Bảng 2.1. Danh sách mẫu phân lập Nguồn phân lập Địa điểm thu mẫu Đất trồng lúa Đất trồng bông Đất trồng mồng tơi Đất trồng rau dền Đất trồng quế Đất trồng tía tô Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 19 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Y tế công cộng (V), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh (K) và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm: - Nhóm vi khuẩn Salmonella: S. enteritidis, S. typhii (K), S.ntyphii (V), S. typhimurium, S. dublin. - Nhóm vi khuẩn E. Coli: E. Coli (K), E. Coli (V), TEC, EC. 02. 08. - Nhóm vi khuẩn Shigella: Shi. sonnei, Shi. boydii, Shi. flexneri.
Đồ án tốt nghiệp 25 - Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi. - Các vi khuẩn: L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus. 2.2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy và phân lập - Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị a) Dụng cụ - Đĩa petri - Ống nghiệm - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Ống đong 100 ml - Pipet 1ml, 10 ml - Ống ly tâm ependoff 2 ml - Bình môi trường 250 ml, 500 ml, 1000 ml - Dây cấy ria, que cấy trang - Đèn cồn - Dụng cụ đục lỗ - Thước đo - Bông thấm và bông không thấm nước - Đũa thuỷ tinh - Các loại đầu típ - Micropipette 100 µl, 1000 µl - Các loại dụng cụ khác như: bao chịu nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp, muỗng, dao, thun,... b) Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Tủ ấm 300C, 370C (Memmert mermany) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy đo pH (Hach – Germany) - Máy đo UV – VIS (Hach) - Cân phân tích (Orbital Germany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy nước cất (Branstead USA) 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu Đối với đất trồng lúa: Sử dụng muỗng lấy đất ở lớp đất mặt cho vào túi nylon (khối lượng mẫu lấy tối thiểu là 200 gam).
Đồ án tốt nghiệp 26 Đối với đất trồng hoa màu: Sử dụng muỗng gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 - 3 cm, lấy lớp đất ở dưới cho vào túi nylon (khối lượng mẫu lấy tối thiểu là 200 gam). Các mẫu đất được bảo quản trong túi nylon vận chuyển về phòng thí nghiệm. Cân 10 gam mẫu (sai số ± 0,1) cho vào erlen có chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều, khi đó sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. 2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng. (Phạm Minh Nhựt, 2013). Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu
Đồ án tốt nghiệp 27 2.3.3. Phương pháp tăng sinh Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bước đầu giúp thu sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). 2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 50C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.4.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ
Đồ án tốt nghiệp 28 trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40 % cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật 2.3.5.1. Phương pháp nhuộn gram Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của lớp peptidoglycan với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod, vi khuẩn được phân làm hai loại là vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày bắt màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi tẩy cồn nên bắt màu tím khi nhuộm. Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng không bắt màu thuốc nhuộm nên mất màu khi tẩy cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng khi nhuộm (Prescott và ctv, 2005). Các bước tiến hành: - Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame. - Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong erlen chứa 10ml môi trường TSB ủ ở 300C trong 24 giờ. Dùng que cấy lấy sinh khối hòa vào giọt nước để làm vết bôi. - Cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản: - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh (Gentian violet) trong 45 giây, rửa nước và để khô. - Nhuộm lugol trong 1 phút, rửa nước. - Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước.
Đồ án tốt nghiệp 29 - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch fuchsin hoặc safranin từ 10 – 30 giây, rửa lại bằng nước cất, để khô và soi tiêu bản với vật kính dầu 100X. 2.3.5.2. Phương pháp thử nghiệm catalase Nguyên tắc: Phương pháp này nhằm xác định vi sinh vật có enzyme catalase hay không. Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy nghi chứa chuỗi chuyển điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus spp.). Enzyme catalase có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy trong tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxi là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2. Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.Vi sinh vật có enzyme catalase sẽ có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2010). Cách tiến hành: - Dùng que cấy lấy một ít sinh khối làm vết bôi trên lame. - Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vết bôi và quan sát hiện tượng sủi bọt. Kết quả: - Có hiện tượng sủi bọt → vi sinh vật có khả năng phân huỷ H2O2 → có enzyme catalase. - Không có hiện tượng sủi bọt → vi sinh vật không có khả năng phân huỷ H2O2 → không có enzyme catalase. 2.3.5.3. Phương pháp thử nghiệm oxidase Nguyên tắc: Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật. Thành phần quan trọng nhất là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine. Nếu có sự hiện diện của cytochrome trong tế bào thì thuốc thử sẽ bị oxy hoá thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương.
Đồ án tốt nghiệp 30 Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn bôi lên miếng giấy thử chứa thuốc thử p -phenylenediamine và quan sát hiện tượng đổi màu trong vòng vài phút. Kết quả: Thử nghiệm oxidase là (+) khi giấy thử xuất hiện màu xanh dương đậm, nếu không có xuất hiện màu xanh dương đậm thì phản ứng là âm tính (-) (Trần Linh Thước, 2010). 2.3.5.4. Phương pháp thử nghiệm gelatinase Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có thể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự thuỷ phân của gelatin thành polypeptide và acid amin. Để nhận biết khả năng làm tan gelatin của vi sinh vật, cơ chất này được bổ sung làm đông đặc môi trường nuôi cấy. Sau khi cấy chủng, chủng vi sinh vật có khả năng tiết gelatinase sẽ làm môi trường tan chảy thành dạng lỏng. Tiến hành: Môi trường sử dụng là môi trường Nutrient Gelatin được chứa trong ống nghiệm. Tiến hành cấy đâm sâu một lượng sinh khối của vi khuẩn khảo sát vào trong ống môi trường Nutrient Gelatin, ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Thực hiện ủ song song một ống đối chứng không cấy vi sinh vật. Kết quả: Trong ống thạch sâu, thử nghiệm là (+) khi môi trường ở ống có cấy vi khuẩn bị tan chảy trong khi ở ống đối chứng môi trường vẫn ở trạng thái đông đặc. Thử nghiệm (-) là khi môi trường trong ống có cấy vi khuẩn vẫn ở trạng thái đông đặc giống ống đối chứng (Trần Linh Thước, 2010) 2.3.6. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn Nguyên tắc: Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị vi khuẩn phân huỷ sẽ không tạo màu mà tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc (Phan Thanh Phương, 2007).
Đồ án tốt nghiệp 31 Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh và cấy trang trên môi trường TSA và ủ ở 300C trong 24 giờ. Chuẩn bị các đĩa môi trường tương ứng với từng loại enzyme cần khảo sát. Dùng khuyên đục lỗ (đường kính 7 mm) tiến hành đục lỗ, gắp thạch chứa sinh khối vi khuẩn sang lỗ thạch đã đục trên đĩa môi trường đã được chuẩn bị, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng và đo đường kính vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. 2.3.7. Phương pháp xác định mật độ tế bào Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): Mật độ = OD600 x 1,02 x 109 (cfu/ml) 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. 2.4. Bố trí thí nghiệm Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Nguồn mẫu Phân lập Định danh sơ bộ Xác định các đặc điểm có lợi của vi sinh vật Tổng hợp kết quả Khả năng sinh một số enzyme ngoại bào Đối kháng vi khuẩn gây bệnh
Đồ án tốt nghiệp 32 2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn 2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp Hình 2.3. Quy trình phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp Các mẫu sau khi được thu về tiến hành cân 10 gam mẫu cho vào erlen chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng khi đó được nồng độ pha loãng là 10-1. Sau đó, tiến hành đồng nhất mẫu trong 2 phút rồi đun ở 600C trong 60 phút và tiến hành pha loãng đến độ pha loãng 10-6. Mẫu sau khi được pha loãng, tiến hành hút 0,1 ml dịch sau pha loãng ở mỗi nồng độ pha loãng 10-4, 10-5,10-6 rồi cấy trang trên môi trường TSA. Ủ ở 300C trong 24 giờ. Nguồn mẫu 10 gam mẫu + 90 ml nước muối sinh lý → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10-1 Đun ở 600C trong 60 phút Pha loãng bằng nước muối sinh lý đến độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Hút 0,1 ml ở mỗi nồng độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 cấy trang trên đĩa chứa môi trường TSA Chọn những khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường TSA làm thuần Giữ giống trong ống thạch nghiêng và trong glycerol 40%.
Đồ án tốt nghiệp 33 Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường TSA và cấy làm thuần. Sau đó bảo quản các chủng này trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và trong glycerol 40% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.1.2. Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập, tiến hành định danh sơ bộ thông qua các phương pháp: nhuộm gram, thử nghiệm catalase, thử nghiệm oxidase. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập và định danh sơ bộ được tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào. Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá khả năng sinh các enzyme amylase trên môi trường Starch Agar, caseinase trên môi trường Skim Milk Agar, lipase trên môi trường Tween Peptone Agar, cellulase trên môi trường CMC Agar bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và đánh giá khả năng sinh enzyme gelatinase trên môi trường Nutrient Gelatin. 2.4.2.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase, caseinase, lipase và cellulase trên các môi trường khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch Đầu tiên, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường TSB trong 24 giờ ở 300C. Sau đó, hút 100µl dịch nuôi cấy cho vào môi trường TSA và cấy trang rồi đem ủ ở 300C trong 24 giờ. Trên các đĩa môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme, tiến hành đục các lỗ có đường kính 7mm. Sau đó, chuyển các khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn cần xác định khả năng sinh enzyme vào các lỗ trên đĩa môi trường khảo sát. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Tiến hành đọc kết quả như sau: - Trên môi trường Starch Agar: cho thuốc thử lugol vào → nếu xung quanh giếng thạch không xuất hiện màu xanh đen → vi khuẩn phân giải tinh bột → vi khuẩn có sinh enzyme amylase.
Đồ án tốt nghiệp 34 Hình 2.4. Vòng phân giải tinh bột của vi khuẩn trên môi trường Starch Agar - Trên môi trường Skim Milk Agar: nếu xung quanh giếng thạch xuất hiện vòng phân giải trong suốt → vi khuẩn phân giải casein trong Skim Milk → vi khuẩn có sinh enzyme caseinase. Hình 2.5. Vòng phân giải casein của vi khuẩn trên môi trường Skim Milk Agar - Trên môi trường Tween Peptone Agar: nếu xung quanh giếng thạch xuất hiện quầng sáng màu hồng → vi khuẩn phân giải dầu → vi khuẩn có sinh enzyme lipase.
Đồ án tốt nghiệp 35 Hình 2.6. Vòng phân giải Tween của vi khuẩn trên môi trường Tween Peptone Agar - Trên môi trường CMC: cho thuốc thử lugol vào → nếu xung quanh giếng thạch không bắt màu của thuốc thử → vi khuẩn phân giải cellulose → vi khuẩn có sinh enzyme cellulase. Hình 2.7. Vòng phân giải cellulose của vi khuẩn trên môi trường CMC
Đồ án tốt nghiệp 36 2.4.2.2. Đánh giá khả năng sinh gelatinase bằng thử nghiệm gelatinase Tăng sinh các chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường TSB và ủ ở 300C trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành cấy đâm sâu một lượng sinh khối của vi khuẩn khảo sát vào trong ống môi trường Nutrient Gelatin, ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Thực hiện ủ song song một ống đối chứng không cấy vi sinh vật. Tiến hành đọc kết quả như sau: Trong ống thạch sâu, thử nghiệm là (+) khi môi trường ở ống có cấy vi khuẩn bị tan chảy trong khi ở ống đối chứng môi trường vẫn ở trạng thái đông đặc. Thử nghiệm (-) là khi môi trường trong ống có cấy vi khuẩn vẫn ở trạng thái đông đặc giống ống đối chứng (Trần Linh Thước, 2010) Hình 2.8. Kết quả âm tính và dương tính của thử nghiệm gelatinase 2.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh Các chủng vi khuẩn phân lập được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành cấy trang trên các đĩa chứa môi trường TSA ủ ở 300C trong 24 giờ. Chờ dịch mẫu khô rồi đục lỗ thạch (đường kính 7 mm) trên các đĩa TSA vừa được trang. Đối với 19 chủng vi khuẩn chỉ thị gây bệnh đường ruột, chúng được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB, riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5 % NaCl rồi đem đi lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt
Đồ án tốt nghiệp 37 độ phòng. Sau đó, dịch nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị được đo OD600nm để xác định mật độ. Tiến hành pha loãng để đạt được mật độ 106 cfu/ml rồi cấy trang trên các đĩa chứa môi trường TSA (riêng các chủng Vibrio spp. tiến hành cấy trang trên môi trường TSA có bổ sung 1,5 % NaCl). Chờ dịch mẫu khô rồi đục lỗ thạch (đường kính 7 mm) trên các đĩa TSA vừa được trang. Đối với các đĩa thạch được cấy trang các chủng vi khuẩn phân lập được sau khi ủ 24 giờ, chọn những vùng vi khuẩn phát triển dày đặc, tiến hành đục lỗ thạch chứa sinh khối vi khuẩn. Sau đó, dùng kẹp vô trùng gắp khối thạch đặt vào trong các giếng thạch trên đĩa TSA đã cấy trang các chủng vi khuẩn chỉ thị và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Chủng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu đất nông nghiệp có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn chỉ thị có sự xuất hiện của quầng trong bao quanh các lỗ thạch chứa sinh khối của chủng vi khuẩn phân lập được. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Đồ án tốt nghiệp 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu Nguồn đất được sử dụng trong nghiên cứu được thu từ vùng đất canh tác nông nghiệp của ông Nguyễn Văn Hoàng, ngụ tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. Nguồn đất này được thu từ 5 vùng đất ruộng trồng lúa và 5 vùng đất gò trồng hoa màu. Các nguồn mẫu được trình bày ở Hình 3.1. Ruộng lúa 1 Ruộng lúa 2 Ruộng lúa 3 Ruộng lúa 4 Ruộng lúa 5 Đất trồng bông
Đồ án tốt nghiệp 39 Đất trồng mồng tơi Đất trồng rau dền Đất trồng quế Đất trồng tía tô Hình 3.1. Các nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu Đối với các ruộng trồng lúa, các ruộng này được trồng lúa thâm canh, tức là các ruộng này chỉ được sử dụng để canh tác lúa nước. Mỗi năm ruộng được canh tác 2 vụ, mỗi vụ kéo dài 3 tháng. Sau khi sạ giống, tiến hành bón phân thành 3 đợt: 15 ngày sau khi sạ, 25 ngày sau khi sạ và bón trước khi lúa lên đòng. Phân được sử dụng khi bón thành phần chủ yếu là N, P, K. Do đó, các loại phân này chủ yếu là phân vô cơ nên vai trò của các vi sinh vật trong đất đóng vai trò hết sức quan trọng giúp chuyển hóa các hợp chất nitơ vô cơ, phospho, kali thành dạng dễ hấp thu giúp cây lúa phát triển tốt hơn. Do đó, trong các vùng đất trồng lúa có sự hiện diện rất phong phú của loại vi sinh vật có khả năng sinh các enzyme ngoại bào. Tuy nhiên, đặc trưng của các vùng đất trồng lúa là đất luôn trong tình trạng ngập nước nên các vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào hiện diện trong lớp đất khoảng 0 – 3 mm và các chủng này phần lớn là các chủng vi khuẩn kỵ khí tùy nghi (Lê Quốc Tuấn, 2009).
Đồ án tốt nghiệp 40 Đối với đất trồng hoa màu được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm đất trồng hoa vạn thọ, đất trồng rau dền, đất trồng tía tô, đất trồng mồng tơi. Đặc điểm của đất trồng hoa màu là vùng đất khô ráo, đồng thời, trước mỗi vụ trồng hoa màu, lượng tro, phân được sử dụng để bón lót khá nhiều. Chính điều này là nơi tập trung rất nhiều nhóm vi sinh vật hiếu khí có khả năng sản sinh các enzyme ngoại bào giúp phân hủy cơ chất giúp cho quá trình hấp thu của hoa màu tốt hơn. Do đó, việc đánh giá sự hiện diện của các vi sinh vật có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào trong các vùng đất nông nghiệp có ý nghĩa to lớn. Sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi trong đất nông nghiệp ngoài việc giúp cho việc chuyển hóa phân bón thành những dạng dễ hấp thu đối với cây trồng còn chứng minh sự màu mỡ của vùng đất đó. Đây cũng chính là mục tiêu của nghiên cứu. 3.2. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ 3.2.1. Kết quả phân lập Từ 10 mẫu đất nông nghiệp gồm: 5 mẫu đất trồng lúa, 1 mẫu đất trồng bông, 1 mẫu đất trồng mồng tơi, 1 mẫu đất trồng rau dền, 1 mẫu đất trồng quế và 1 mẫu đất trồng tía tô đã phân lập được các chủng vi khuẩn trên môi trường TSA. Kết quả phân lập được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập Nguồn mẫu Ký hiệu Hình dạng khuẩn lạc Đất trồng lúa 1 Đất trồng lúa 2 Đất trồng lúa 3 Đất trồng lúa 4 Đất trồng lúa 5 Đất trồng bông Đất trồng mồng tơi Đất trồng rau dền Đất trồng quế Đất trồng tía tô ĐTL101 ĐTL102 ĐTL201 ĐTL301 ĐTL302 ĐTL401 ĐTL402 ĐTL501 ĐTL502 ĐTB601 ĐMT701 ĐRD801 ĐTQ901 ĐTT111 ĐTT112 Tròn, lồi, bờ đều, vàng, d = 2mm Tròn, dẹt, bờ đều, vàng, d= 3mm Tròn, lồi, nhăn, bờ răng cưa, trắng đục Tròn, lồi, ướt, bờ đều, trong suốt, d< 1mm Tròn, lồi, nhăn, bờ đều, tâm trắng đục, d> 2mm Tròn, lồi, bờ đều, trong suốt, d= 1mm Tròn, lồi, bóng, bờ đều, vàng Tròn, lồi, nhăn, nhớt, bờ răng cưa, trắng đục Tròn, lồi, bờ đều, trong suốt, d> 1mm Tròn, lồi, bóng, ướt, bờ đều, vàng, d= 1mm Tròn, lồi, nhăn, bờ răng cưa, vàng Tròn, lồi, nhăn, nhớt, bờ răng cưa, trắng đục, d= 2mm Tròn, lồi, bóng, bờ răng cưa, tâm vàng, d= 2mm Tròn, lồi, bờ đều, lõm ở giữa, nhăn, trắng đục Tròn, lồi, bóng, bờ đều, trong suốt, d< 1mm
Đồ án tốt nghiệp 41 Các khuẩn lạc từ các nguồn mẫu được cấy làm thuần và bảo quản giống ở nhiệt độ -40C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Kết quả định danh sơ bộ Từ 15 chủng vi khuẩn phân lập, tiến hành nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào. Kết quả định danh sơ bộ được trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập Nguồn phân lập Ký hiệu mẫu Gram Hình dạng tế bào Đất trồng lúa 1 Đất trồng lúa 2 Đất trồng lúa 3 Đất trồng lúa 4 Đất trồng lúa 5 Đất trồng bông Đất trồng mồng tơi Đất trồng rau dền Đất trồng quế Đất trồng tía tô ĐTL101 ĐTL102 ĐTL201 ĐTL301 ĐTL302 ĐTL401 ĐTL402 ĐTL501 ĐTL502 ĐTB601 ĐMT701 ĐRD801 ĐTQ901 ĐTT111 ĐTT112 + + + - + + - - + - + - + - + Que ngắn Que ngắn Que dài Que ngắn Que dài Que dài Que dài Que ngắn Que ngắn Que ngắn Hình cầu Hình cầu Que ngắn Hình cầu Hình cầu Từ 10 mẫu đất, đã phân lập được 15 chủng vi khuẩn, trong đó có 9 chủng phân lập từ đất trồng lúa và 6 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu. Khi quan sát đặc điểm tế bào, trong 15 chủng vi khuẩn phân lập có 9 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) và 6 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-). Về hình dạng, có 11 chủng thuộc nhóm trực khuẩn và 4 chủng thuộc nhóm cầu khuẩn (Hình 3.2).
Đồ án tốt nghiệp 42 Hình 3.2. Kết quả nhuộm Gram của các chủng vi khuẩn phân lập a) ĐTL201, b) ĐTL402, c) ĐTB601 Kết quả phân lập cho thấy ở đất trồng lúa, mỗi mẫu phân lập được một đến hai chủng vi khuẩn trong khi ở đất trồng hoa màu mỗi mẫu chỉ phân lập được một chủng vi khuẩn. Kết quả này cho thấy sự phân bố của vi khuẩn trong đất trồng lúa đa dạng hơn về số lượng so với trong đất trồng hoa màu. Trong số 15 chủng vi khuẩn phân lập, 9 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa đều thuộc nhóm trực khuẩn trong khi 6 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng hoa màu có 4 chủng thuộc nhóm cầu khuẩn và 2 chủng là trực khuẩn. Kết quả này cho thấy, ở các vùng đất trồng lúa có sự phân bố chủ yếu của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm trực khuẩn, còn trong các vùng đất trồng hoa màu thì có sự phân bố của nhiều dạng vi khuẩn hơn. Theo nghiên cứu của Ntabo và ctv (2010) khi tiến hành phân lập và nghiên cứu đặc điểm chung của các chủng vi khuẩn phân lập từ gò mối và một số vùng đất, sau khi giải trình tự rRNA 16S, đã xác định trong các chủng vi khuẩn phân lập có sự hiện diện của vi khuẩn Gram (+) là Bacillus sp. và Brachybacterium sp.; vi khuẩn Gram (-) là Pseudomonas sp.. Còn kết quả nghiên cứu của Aslim và ctv (2002) khi tiến hành xác định một số tính chất của các chủng vi khuẩn phân lập từ đất cũng cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được là Bacillus. Các vi khuẩn này đều thuộc nhóm trực khuẩn. Kết quả này có sự tương đồng với nghiên cứu hiện tại đối với nhóm vi khuẩn phân lập từ đất. Từ các kết quả này có thể thấy rằng trong các vùng đất, đặc biệt là các vùng đất nông nghiệp có sự hiện diện chủ yếu các nhóm vi khuẩn Gram (+). a) b) c)
Đồ án tốt nghiệp 43 Với mục tiêu nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có lợi từ một số vùng đất nông nghiệp, tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng với vi khuẩn chỉ thị của 15 chủng vi khuẩn phân lập. 3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào Các chủng vi khuẩn phân lập sau khi định danh sơ bộ được tiến hành đánh giá khả năng sinh các enzyme ngoại bào, đó là enzyme amylase, cellulase, protease, lipase và một số enzyme khác (catalase, oxidase). Từ đó, đánh giá chung về khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn hiện diện trong đất canh tác nông nghiệp tại huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. 3.3.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase Khả năng sinh enzyme amylase của vi khuẩn được đánh giá dựa trên sự phân hủy tinh bột trong môi trường Starch Agar. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme amylase của 15 chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3. Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập STT Chủng vi khuẩn Hoạt tính amylase STT Chủng vi khuẩn Hoạt tính Amylase 1 ĐTL101 + 8 ĐTL501 ++ 2 ĐTL102 +++ 9 ĐTL502 + 3 ĐTL201 - 10 ĐTB601 ++ 4 ĐTL301 ++ 11 ĐMT701 ++ 5 ĐTL302 - 12 ĐRD801 ++ 6 ĐTL401 - 13 ĐTQ901 ++ 7 ĐTL402 - 14 ĐTT111 ++ 15 ĐTT112 ++ (-): không có khả năng phân giải hoặc đường kính vòng phân giải < 8 mm. (+): Đường kính vòng phân giải từ 8 mm đến 14 mm. (++): Đường kính vòng phân giải từ 15 mm đến 25 mm. (+++): Đường kính vòng phân giải ≥ 25 mm. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 3.3. Dựa vào kết quả này có thể nhận thấy rằng, trong 15 chủng vi khuẩn phân lập, 11 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme
Đồ án tốt nghiệp 44 amylase thuỷ phân cơ chất là tinh bột trong môi trường tạo vòng phân giải xung quanh giếng thạch (Hình 3.3). Trong 11 chủng này, có 5 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa (55,55%) và 6 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng hoa màu (100%). Các chủng vi khuẩn ĐTL201, ĐTL302, ĐTL401, ĐTL402 không có khả năng phân giải tinh bột. Trong số 11 chủng vi khuẩn phân hủy tinh bột, chủng ĐTL102 có khả năng phân giải tinh bột mạnh nhất so với các chủng vi khuẩn phân lập còn lại. Chủng ĐTL101 và ĐTL502 có khả năng phân giải tinh bột ở mức trung bình (đường kính vòng phân giải từ 8 – 14 mm). Các chủng còn lại có khả năng phân hủy tinh bột mạnh (cho kết quả vòng phân giải từ 15 mm đến 25 mm). Đặc biệt trong 11 chủng này, 6 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu đều thể hiện khả năng phân hủy tinh bột mạnh thông qua sản xuất enzyme amylase. Kết quả trên cho thấy rằng, các chủng vi khuẩn hiện diện trong đất trồng lúa và đất trồng hoa màu đều có khả năng sinh enzyme amylase nhưng mức độ phân bố của các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme amylase trong đất trồng hoa màu lại phong phú hơn so với trong đất trồng lúa. Hình 3.3. Vòng phân giải tinh bột của các chủng ĐTL101, ĐTL102 và ĐTT112 trên môi trường Starch Agar 3.3.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase Tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase dựa vào sự thuỷ phân cellulose trong môi trường CMC Agar. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase được trình bày ở Bảng 3.4.
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic

Recommended

Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdfThu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdfMan_Ebook
 
Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống
Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thốngPhân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống
Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thốngTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAYLuận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYĐề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nướcĐề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nướcDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...https://www.facebook.com/garmentspace
 

Recommended

Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...
Nghiên cứu chế tạo vật liệu hấp phụ từ phế phẩm lõi ngô xử lý nước phục vụ si...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdfThu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdf
Thu hồi và hoàn thiện sản phẩm lên men.pdfMan_Ebook
 
Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống
Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thốngPhân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống
Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thốngTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAYLuận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYĐề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nướcĐề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nước
Đề tài: Sử dụng lõi ngô làm chất hấp phụ để lọc amoni ra khỏi nướcDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Chuong1
Chuong1Chuong1
Chuong1Lanh Nguyen
 
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả NhàuĐánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàunhuphung96
 
Khảo sát quy trình chế biến mứt vỏ bưởi mật ong
Khảo sát quy trình chế biến mứt vỏ bưởi mật ongKhảo sát quy trình chế biến mứt vỏ bưởi mật ong
Khảo sát quy trình chế biến mứt vỏ bưởi mật onghttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Đề tài: Xác định hàm lượng sắt hoà tan trong nước, HOT, 9đ
Đề tài: Xác định hàm lượng sắt hoà tan trong nước, HOT, 9đĐề tài: Xác định hàm lượng sắt hoà tan trong nước, HOT, 9đ
Đề tài: Xác định hàm lượng sắt hoà tan trong nước, HOT, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Lên men
Lên menLên men
Lên menKristen Trần
 
Tách dòng gene
Tách dòng gene Tách dòng gene
Tách dòng gene Hạnh Hiền
 
Đề tài: Chế tạo than hoạt tính từ vỏ trấu bằng phương pháp oxi hóa
Đề tài: Chế tạo than hoạt tính từ vỏ trấu bằng phương pháp oxi hóaĐề tài: Chế tạo than hoạt tính từ vỏ trấu bằng phương pháp oxi hóa
Đề tài: Chế tạo than hoạt tính từ vỏ trấu bằng phương pháp oxi hóaDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Báo cáo tổng 2
Báo cáo tổng 2Báo cáo tổng 2
Báo cáo tổng 2quocanhsmith
 
Chuong7
Chuong7Chuong7
Chuong7Lanh Nguyen
 
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm menTài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm menvisinh11012
 
Gioi thieu mot so phuong phap phan tich sac ky
Gioi thieu mot so phuong phap phan tich sac kyGioi thieu mot so phuong phap phan tich sac ky
Gioi thieu mot so phuong phap phan tich sac kyNguyen Thanh Tu Collection
 
Chương 6 phân tích glucis
Chương 6 phân tích glucisChương 6 phân tích glucis
Chương 6 phân tích glucisNhat Tam Nhat Tam
 
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
chưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 prochưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 protrietav
 
Báo Cáo Thực Tập Tìm Hiểu Về Sắc Ký Khí Ghép Khối Phổ.docx
Báo Cáo Thực Tập Tìm Hiểu Về Sắc Ký Khí Ghép Khối Phổ.docxBáo Cáo Thực Tập Tìm Hiểu Về Sắc Ký Khí Ghép Khối Phổ.docx
Báo Cáo Thực Tập Tìm Hiểu Về Sắc Ký Khí Ghép Khối Phổ.docxDV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...
Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...
Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuHoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuhttps://www.facebook.com/garmentspace
 

More Related Content

What's hot

Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả NhàuĐánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàunhuphung96
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Báo cáo tổng 2
Báo cáo tổng 2Báo cáo tổng 2
Báo cáo tổng 2quocanhsmith
 
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm menTài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm menvisinh11012
 
Gioi thieu mot so phuong phap phan tich sac ky
Gioi thieu mot so phuong phap phan tich sac kyGioi thieu mot so phuong phap phan tich sac ky
Gioi thieu mot so phuong phap phan tich sac kyNguyen Thanh Tu Collection
 
Chương 6 phân tích glucis
Chương 6 phân tích glucisChương 6 phân tích glucis
Chương 6 phân tích glucisNhat Tam Nhat Tam
 
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
chưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 prochưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 protrietav
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...
Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...
Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 

What's hot (20)

Chuong1
Chuong1Chuong1
Chuong1
 
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả NhàuĐánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
 
Khảo sát quy trình chế biến mứt vỏ bưởi mật ong
Khảo sát quy trình chế biến mứt vỏ bưởi mật ongKhảo sát quy trình chế biến mứt vỏ bưởi mật ong
Khảo sát quy trình chế biến mứt vỏ bưởi mật ong
 
Đề tài: Xác định hàm lượng sắt hoà tan trong nước, HOT, 9đ
Đề tài: Xác định hàm lượng sắt hoà tan trong nước, HOT, 9đĐề tài: Xác định hàm lượng sắt hoà tan trong nước, HOT, 9đ
Đề tài: Xác định hàm lượng sắt hoà tan trong nước, HOT, 9đ
 
Lên men
Lên menLên men
Lên men
 
Tách dòng gene
Tách dòng gene Tách dòng gene
Tách dòng gene
 
Đề tài: Chế tạo than hoạt tính từ vỏ trấu bằng phương pháp oxi hóa
Đề tài: Chế tạo than hoạt tính từ vỏ trấu bằng phương pháp oxi hóaĐề tài: Chế tạo than hoạt tính từ vỏ trấu bằng phương pháp oxi hóa
Đề tài: Chế tạo than hoạt tính từ vỏ trấu bằng phương pháp oxi hóa
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
 
Báo cáo tổng 2
Báo cáo tổng 2Báo cáo tổng 2
Báo cáo tổng 2
 
Chuong7
Chuong7Chuong7
Chuong7
 
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa para...
 
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
 
Tài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm menTài liệu Nấm men
Tài liệu Nấm men
 
Gioi thieu mot so phuong phap phan tich sac ky
Gioi thieu mot so phuong phap phan tich sac kyGioi thieu mot so phuong phap phan tich sac ky
Gioi thieu mot so phuong phap phan tich sac ky
 
Chương 6 phân tích glucis
Chương 6 phân tích glucisChương 6 phân tích glucis
Chương 6 phân tích glucis
 
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
 
chưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 prochưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 pro
 
Báo Cáo Thực Tập Tìm Hiểu Về Sắc Ký Khí Ghép Khối Phổ.docx
Báo Cáo Thực Tập Tìm Hiểu Về Sắc Ký Khí Ghép Khối Phổ.docxBáo Cáo Thực Tập Tìm Hiểu Về Sắc Ký Khí Ghép Khối Phổ.docx
Báo Cáo Thực Tập Tìm Hiểu Về Sắc Ký Khí Ghép Khối Phổ.docx
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
 
Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...
Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...
Xác định cấu trúc của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ, HAY - Gửi miễn ph...
 

Similar to Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic

Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuHoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồngKhảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồngTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...https://www.facebook.com/garmentspace
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcNghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêngNghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riênghttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

Similar to Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic (20)

Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
 
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuHoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Hoàn thiện quy trình sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
 
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi k...
 
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồngKhảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
Khảo sát khả năng kháng nấm bệnh trên cây trồng của nano đồng
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
Nghiên cứu xây dựng quy trình chế biến bánh gạo từ gạo đen hữu cơ dùng cho ng...
 
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
 
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
 
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
 
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
 
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
đáNh giá chất lượng và độc tính nguồn nước của một số lưu vực tiếp nhận nước ...
 
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
 
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
Xác định phương pháp tinh sạch npv (nuclera polyhedrosis virus)
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
 
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcNghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
 
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêngNghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
Nghiên cứu so sánh hiệu quả xử lý dầu khoáng của một số loại vỏ sầu riêng
 
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
 

More from https://www.facebook.com/garmentspace

Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfKhóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.docĐề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.dochttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...https://www.facebook.com/garmentspace
 

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
 
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfKhóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
 
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.docĐề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
 
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
 

Recently uploaded

What is Model Inheritance in Odoo 17 ERP
What is Model Inheritance in Odoo 17 ERPWhat is Model Inheritance in Odoo 17 ERP
What is Model Inheritance in Odoo 17 ERPCeline George
 
Grade 9 Q4-MELC1-Active and Passive Voice.pptx
Grade 9 Q4-MELC1-Active and Passive Voice.pptxGrade 9 Q4-MELC1-Active and Passive Voice.pptx
Grade 9 Q4-MELC1-Active and Passive Voice.pptxChelloAnnAsuncion2
 
ROOT CAUSE ANALYSIS PowerPoint Presentation
ROOT CAUSE ANALYSIS PowerPoint PresentationROOT CAUSE ANALYSIS PowerPoint Presentation
ROOT CAUSE ANALYSIS PowerPoint PresentationAadityaSharma884161
 
AmericanHighSchoolsprezentacijaoskolama.
AmericanHighSchoolsprezentacijaoskolama.AmericanHighSchoolsprezentacijaoskolama.
AmericanHighSchoolsprezentacijaoskolama.arsicmarija21
 
Quarter 4 Peace-education.pptx Catch Up Friday
Quarter 4 Peace-education.pptx Catch Up FridayQuarter 4 Peace-education.pptx Catch Up Friday
Quarter 4 Peace-education.pptx Catch Up FridayMakMakNepo
 
Types of Journalistic Writing Grade 8.pptx
Types of Journalistic Writing Grade 8.pptxTypes of Journalistic Writing Grade 8.pptx
Types of Journalistic Writing Grade 8.pptxEyham Joco
 
Introduction to ArtificiaI Intelligence in Higher Education
Introduction to ArtificiaI Intelligence in Higher EducationIntroduction to ArtificiaI Intelligence in Higher Education
Introduction to ArtificiaI Intelligence in Higher Educationpboyjonauth
 
MULTIDISCIPLINRY NATURE OF THE ENVIRONMENTAL STUDIES.pptx
MULTIDISCIPLINRY NATURE OF THE ENVIRONMENTAL STUDIES.pptxMULTIDISCIPLINRY NATURE OF THE ENVIRONMENTAL STUDIES.pptx
MULTIDISCIPLINRY NATURE OF THE ENVIRONMENTAL STUDIES.pptxAnupkumar Sharma
 
Difference Between Search & Browse Methods in Odoo 17
Difference Between Search & Browse Methods in Odoo 17Difference Between Search & Browse Methods in Odoo 17
Difference Between Search & Browse Methods in Odoo 17Celine George
 
DATA STRUCTURE AND ALGORITHM for beginners
DATA STRUCTURE AND ALGORITHM for beginnersDATA STRUCTURE AND ALGORITHM for beginners
DATA STRUCTURE AND ALGORITHM for beginnersSabitha Banu
 
Planning a health career 4th Quarter.pptx
Planning a health career 4th Quarter.pptxPlanning a health career 4th Quarter.pptx
Planning a health career 4th Quarter.pptxLigayaBacuel1
 
How to do quick user assign in kanban in Odoo 17 ERP
How to do quick user assign in kanban in Odoo 17 ERPHow to do quick user assign in kanban in Odoo 17 ERP
How to do quick user assign in kanban in Odoo 17 ERPCeline George
 
Introduction to AI in Higher Education_draft.pptx
Introduction to AI in Higher Education_draft.pptxIntroduction to AI in Higher Education_draft.pptx
Introduction to AI in Higher Education_draft.pptxpboyjonauth
 
How to Configure Email Server in Odoo 17
How to Configure Email Server in Odoo 17How to Configure Email Server in Odoo 17
How to Configure Email Server in Odoo 17Celine George
 
Alper Gobel In Media Res Media Component
Alper Gobel In Media Res Media ComponentAlper Gobel In Media Res Media Component
Alper Gobel In Media Res Media ComponentInMediaRes1
 
ECONOMIC CONTEXT - PAPER 1 Q3: NEWSPAPERS.pptx
ECONOMIC CONTEXT - PAPER 1 Q3: NEWSPAPERS.pptxECONOMIC CONTEXT - PAPER 1 Q3: NEWSPAPERS.pptx
ECONOMIC CONTEXT - PAPER 1 Q3: NEWSPAPERS.pptxiammrhaywood
 
Atmosphere science 7 quarter 4 .........
Atmosphere science 7 quarter 4 .........Atmosphere science 7 quarter 4 .........
Atmosphere science 7 quarter 4 .........LeaCamillePacle
 

Recently uploaded (20)

What is Model Inheritance in Odoo 17 ERP
What is Model Inheritance in Odoo 17 ERPWhat is Model Inheritance in Odoo 17 ERP
What is Model Inheritance in Odoo 17 ERP
 
Grade 9 Q4-MELC1-Active and Passive Voice.pptx
Grade 9 Q4-MELC1-Active and Passive Voice.pptxGrade 9 Q4-MELC1-Active and Passive Voice.pptx
Grade 9 Q4-MELC1-Active and Passive Voice.pptx
 
Model Call Girl in Tilak Nagar Delhi reach out to us at 🔝9953056974🔝
Model Call Girl in Tilak Nagar Delhi reach out to us at 🔝9953056974🔝Model Call Girl in Tilak Nagar Delhi reach out to us at 🔝9953056974🔝
Model Call Girl in Tilak Nagar Delhi reach out to us at 🔝9953056974🔝
 
Rapple "Scholarly Communications and the Sustainable Development Goals"
Rapple "Scholarly Communications and the Sustainable Development Goals"Rapple "Scholarly Communications and the Sustainable Development Goals"
Rapple "Scholarly Communications and the Sustainable Development Goals"
 
ROOT CAUSE ANALYSIS PowerPoint Presentation
ROOT CAUSE ANALYSIS PowerPoint PresentationROOT CAUSE ANALYSIS PowerPoint Presentation
ROOT CAUSE ANALYSIS PowerPoint Presentation
 
AmericanHighSchoolsprezentacijaoskolama.
AmericanHighSchoolsprezentacijaoskolama.AmericanHighSchoolsprezentacijaoskolama.
AmericanHighSchoolsprezentacijaoskolama.
 
Quarter 4 Peace-education.pptx Catch Up Friday
Quarter 4 Peace-education.pptx Catch Up FridayQuarter 4 Peace-education.pptx Catch Up Friday
Quarter 4 Peace-education.pptx Catch Up Friday
 
9953330565 Low Rate Call Girls In Rohini Delhi NCR
9953330565 Low Rate Call Girls In Rohini Delhi NCR9953330565 Low Rate Call Girls In Rohini Delhi NCR
9953330565 Low Rate Call Girls In Rohini Delhi NCR
 
Types of Journalistic Writing Grade 8.pptx
Types of Journalistic Writing Grade 8.pptxTypes of Journalistic Writing Grade 8.pptx
Types of Journalistic Writing Grade 8.pptx
 
Introduction to ArtificiaI Intelligence in Higher Education
Introduction to ArtificiaI Intelligence in Higher EducationIntroduction to ArtificiaI Intelligence in Higher Education
Introduction to ArtificiaI Intelligence in Higher Education
 
MULTIDISCIPLINRY NATURE OF THE ENVIRONMENTAL STUDIES.pptx
MULTIDISCIPLINRY NATURE OF THE ENVIRONMENTAL STUDIES.pptxMULTIDISCIPLINRY NATURE OF THE ENVIRONMENTAL STUDIES.pptx
MULTIDISCIPLINRY NATURE OF THE ENVIRONMENTAL STUDIES.pptx
 
Difference Between Search & Browse Methods in Odoo 17
Difference Between Search & Browse Methods in Odoo 17Difference Between Search & Browse Methods in Odoo 17
Difference Between Search & Browse Methods in Odoo 17
 
DATA STRUCTURE AND ALGORITHM for beginners
DATA STRUCTURE AND ALGORITHM for beginnersDATA STRUCTURE AND ALGORITHM for beginners
DATA STRUCTURE AND ALGORITHM for beginners
 
Planning a health career 4th Quarter.pptx
Planning a health career 4th Quarter.pptxPlanning a health career 4th Quarter.pptx
Planning a health career 4th Quarter.pptx
 
How to do quick user assign in kanban in Odoo 17 ERP
How to do quick user assign in kanban in Odoo 17 ERPHow to do quick user assign in kanban in Odoo 17 ERP
How to do quick user assign in kanban in Odoo 17 ERP
 
Introduction to AI in Higher Education_draft.pptx
Introduction to AI in Higher Education_draft.pptxIntroduction to AI in Higher Education_draft.pptx
Introduction to AI in Higher Education_draft.pptx
 
How to Configure Email Server in Odoo 17
How to Configure Email Server in Odoo 17How to Configure Email Server in Odoo 17
How to Configure Email Server in Odoo 17
 
Alper Gobel In Media Res Media Component
Alper Gobel In Media Res Media ComponentAlper Gobel In Media Res Media Component
Alper Gobel In Media Res Media Component
 
ECONOMIC CONTEXT - PAPER 1 Q3: NEWSPAPERS.pptx
ECONOMIC CONTEXT - PAPER 1 Q3: NEWSPAPERS.pptxECONOMIC CONTEXT - PAPER 1 Q3: NEWSPAPERS.pptx
ECONOMIC CONTEXT - PAPER 1 Q3: NEWSPAPERS.pptx
 
Atmosphere science 7 quarter 4 .........
Atmosphere science 7 quarter 4 .........Atmosphere science 7 quarter 4 .........
Atmosphere science 7 quarter 4 .........
 

Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic

  • 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN CÓ LỢI TẠI MỘT SỐ VÙNG ĐẤT NÔNG NGHIỆP HUYỆN GÒ DẦU, TỈNH TÂY NINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Lê Thị Mỹ Hạnh MSSV: 1051110011 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  • 2. Đồ án tốt nghiệp ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày ....... tháng ....... năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mỹ Hạnh
  • 3. Đồ án tốt nghiệp iii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày ...... tháng ...... năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mỹ Hạnh
  • 4. Đồ án tốt nghiệp iv MỤC LỤC Trang Trang bìa .................................................................................................................. i Lời cam đoan ..........................................................................................................ii Lời cảm ơn .............................................................................................................iii Mục lục .................................................................................................................. iv Danh sách các chữ viết tắt ....................................................................................vii Danh sách các bảng .............................................................................................viii Danh sách các hình ................................................................................................ ix Mở đầu.................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề............................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu........................................................................................... 2 4. Phạm vi nghiên cứu............................................................................................. 2 Chương 1. Tổng quan ........................................................................................... 3 1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp.... 3 1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất.................................................................... 3 1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất............................................................. 3 1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất................................................... 5 1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật ....................................... 9 1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào........................................................................ 9 1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào.......................................................................... 9 1.2.3. Đặc điểm – tính chất.................................................................................... 10 1.2.4. Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ..................................................... 13 1.3. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay .................................... 23 Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu........................................... 24 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................................... 24 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 24 2.1.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 24
  • 5. Đồ án tốt nghiệp v 2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 24 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập ................................................................................... 24 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị........................................................................................... 24 2.2.3. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị....................................................................... 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 25 2.3.1. Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu.............................................................. 25 2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu....................................................................... 26 2.3.3. Phương pháp tăng sinh................................................................................ 27 2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ........................................ 27 2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật............................................................. 28 2.3.6. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn .... 30 2.3.7. Phương pháp xác định mật độ tế bào.......................................................... 31 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................... 31 2.4. Bố trí thí nghiệm........................................................................................... 31 2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn ................................ 32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................................................ 33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh ............................................................. 36 Chương 3. Kết quả và thảo luận........................................................................ 38 3.1. Kết quả đánh giá nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu.................. 38 3.2. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ ........................................................ 40 3.2.1. Kết quả phân lập.......................................................................................... 40 3.2.2. Kết quả định danh sơ bộ.............................................................................. 41 3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................... 43 3.2.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase ................................................... 43 3.2.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase .................................................. 44 3.3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease................................................... 46 3.3.4. Đánh giá khả năng sinh enzyme lipase....................................................... 47
  • 6. Đồ án tốt nghiệp vi 3.3.5. Đánh giá khả năng sinh enzyme catalase ................................................... 49 3.3.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme oxidase.................................................... 49 3.4. Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với vi khuẩn gây bệnh.................................................................................. 51 3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp................................................................... 52 3.4.2. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli.............................................................................. 53 3.4.3. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella ............................................................................ 55 3.4.4. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio ............................................................................... 57 3.4.5. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus ........ 59 3.5. Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập ................... 63 Chương 4. Kết luận và đề nghị .......................................................................... 68 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 68 4.2. Đề nghị........................................................................................................... 68 Tài liệu tham khảo............................................................................................... 69
  • 7. Đồ án tốt nghiệp vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC: carboxymethyl cellulose HEC: hydroxyethyl cellulose EG: endoglucanase CBH: exoglucanase CBD: cellulose binding domain Ser: Serine His: Histidine Asp: Acid aspartic TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar
  • 8. Đồ án tốt nghiệp viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sách mẫu phân lập....................................................................... 24 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập.......................... 40 Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ của các chủng vi khuẩn phân lập ................. 41 Bảng 3.3. Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập ..... 43 Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập .... 45 Bảng 3.5. Khả năng phân huỷ gelatin và casein của các chủng vi khuẩn phân lập.................................................................................................................. 46 Bảng 3.6. Khả năng sinh enzyme lipase của các chủng vi khuẩn phân lập ......... 48 Bảng 3.7. Khả năng sinh enzyme catalase của các chủng vi khuẩn phân lập...... 49 Bảng 3.8. Khả năng sinh enzyme oxidase của các chủng vi khuẩn phân lập ...... 50 Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp................................................................... 52 Bảng 3.10. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli............................................................................. 54 Bảng 3.11. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella ............................................................................ 56 Bảng 3.12. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio .............................................................................. 58 Bảng 3.13. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus ............................................................................................. 60 Bảng 3.14. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................................... 64 Bảng 3.15.A. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................... 65 Bảng 3.15.B. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................... 66
  • 9. Đồ án tốt nghiệp ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật ...................... 3 Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn............................................................. 6 Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn............................................................................ 7 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase .............................. 14 Hình 1.5. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein ........... 15 Hình 1.6. Cấu trúc không gian của enzyme protease ........................................... 17 Hình 1.7. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase........................................... 19 Hình 1.8. Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa................ 21 Hình 1.9. Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước.............................................................................................................. 22 Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu................................................................. 26 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.......................................................................... 31 Hình 2.3. Quy trình phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp............... 32 Hình 2.4. Vòng phân giải tinh bột của vi khuẩn trên môi trường Starch Agar............................................................................................................ 34 Hình 2.5. Vòng phân giải casein của vi khuẩn trên môi trường Skim Milk Agar..................................................................................................... 34 Hình 2.6. Vòng phân giải Tween của vi khuẩn trên môi trường Tween Peptone Agar ............................................................................................. 35 Hình 2.7. Vòng phân giải cellulose của vi khuẩn trên môi trường CMC Agar ... 35 Hình 2.8. Kết quả âm tính và dương tính của thử nghiệm gelatinase .................. 36 Hình 3.1. Các nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu..................................... 39 Hình 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn phân lập....................... 42 Hình 3.3. Vòng phân giải tinh bột của các chủng ĐTL101, ĐTL102, ĐTT112 trên môi trường Starch Agar .................................................................. 44 Hình 3.4. Vòng phân giải cellulose của các chủng ĐMT701, ĐRD801, ĐTQ901 và ĐTT111 trên môi trường CMC Agar ............................................... 46
  • 10. Đồ án tốt nghiệp x Hình 3.5. Kết quả dương tính của cáic chủng vi khuẩn phân lập so với mẫu đối chứng trong thử nghiệm gelatinase......................................................... 47 Hình 3.6. Kết qảu kiểm tra khả năng sinh enzyme lipase của các chủng ĐTL201, ĐTL301, ĐTL502 và ĐTB601 trên môi trường Tween Peptone Agar ............................................................................................. 48 Hình 3.7. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL501, ĐRD801 và ĐTT111 đối với vi khuẩn S. dublin.................................................................. 53 Hình 3.8. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL401 và ĐTL501 đối với nhóm vi khuẩn E. Coli .......................................................... 55 Hình 3.9. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL501, ĐRD801 đối với vi khuẩn Shi. sonnei .................................................................. 57 Hình 3.10. Vòng kháng khuẩn của sinh khối chủng ĐTT112 đối với các vi khuẩn chỉ thị nhóm Vibrio.......................................................................... 59 Hình 3.11. Vòng kháng khuẩn của các chủng ĐTL501, ĐTT112, ĐRD801 đối với các vi khuẩn chỉ thị L. monocytogenes, L. innocua ................................. 61
  • 11. Đồ án tốt nghiệp 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong giai đoạn hiện nay, nước ta đang trên đà phát triển theo hướng công nghiệp hóa - hiện đại hóa nhưng nông nghiệp vẫn đóng vai trò quan trọng, trong đó ngành trồng trọt vẫn là nền tảng với diện tích đất canh tác chiếm 17% tổng diện tích đất. Theo báo cáo Tổng điều tra đất đai năm 2010, tổng diện tích nhóm đất nông nghiệp của nước ta năm 2010 là 26.100.160 ha, tăng 5.179.385 ha (gấp 1,25 lần) so với năm 2000. Trong canh tác nông nghiệp, ngoài trồng lúa nước, người dân còn sử dụng để trồng trọt các loại hoa màu để tăng thêm thu nhập. Do đó, để có được mùa vụ trồng trọt tốt thì chất lượng đất đóng vai trò quyết định, trong đó có sự đóng góp quan trọng của các vi sinh vật. Đất là nơi diễn ra hàng loạt các quá trình chuyển hoá vật chất, trao đổi dinh dưỡng và năng lượng để hình thành và phát triển độ phì nhiêu của đất mà trong đó vi sinh vật đất đóng vai trò quan trọng. Ngoài chức năng tham gia vào các quá trình chuyển hoá vật chất, vi sinh vật đất sau chu kỳ sống còn để lại cho đất sinh khối rất lớn tạo nên độ phì nhiêu của đất. Vì thế vi sinh vật đất là một trong các chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá độ phì nhiêu và chất lượng của đất. Với sự hiện diện thường xuyên của các vi sinh vật có lợi trong đất ngoài việc giúp cho đất tăng độ phì nhiêu, giúp người dân hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học thì đây cũng chính là nguồn cung cấp các nhóm vi sinh vật có lợi như có khả năng sinh enzyme ngoại bào cũng như có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Do đó, việc xác định sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi trong đất, nhất là trong các vùng đất nông nghiệp như đất trồng lúa, đất trồng hoa mùa sẽ phục vụ cho mục tiêu này. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh”. Đề tài này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
  • 12. Đồ án tốt nghiệp 2 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi - sản sinh enzyme ngoại bào và đặc tính đối kháng, trong đất nông nghiệp tại huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn hiện diện trong một số vùng đất trồng lúa và đất trồng hoa màu. - Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập. - Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh. 4. Phạm vi nghiên cứu Chỉ khảo sát vùng đất canh tác nông nghiệp của ông Nguyễn Văn Hoàng, ngụ tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh.
  • 13. Đồ án tốt nghiệp 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp 1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất Hầu hết vi sinh vật là sinh vật dị dưỡng, chỉ một số ít vi sinh vật là vi sinh vật tự dưỡng. Quan hệ sinh thái được biểu diễn bằng sơ đồ Hình 1.1. Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật Vai trò của vi sinh vật là khép kín vòng tuần hoàn trong hệ sinh thái, tái tạo thức ăn cho động vật, thực vật bằng cách phân huỷ để lấy lại chất dinh dưỡng cung cấp cho nhiều cơ thể dạng sống. Nó đem lại hai hiệu quả: - Tăng độ phì của đất. - Giải quyết nạn ứ đọng chất thải trong đất. Như vậy, vi sinh vật khép kín vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, P, S, K... thông qua các quá trình phân huỷ các nguyên tố này trong đất. 1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất Trong hệ vi sinh vật đất, vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn chiếm khoảng 8%, vi nấm 1%, còn lại 1% là tảo và nguyên sinh động vật. Tỉ lệ này thay đổi tuỳ theo các loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý, tầng đất, thời vụ, chế độ canh tác... Ở những đất có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng và thành phần. Sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu, màu mỡ. Chất vô cơ Chất hữu cơ Chất hữu cơ Ánh sáng SV sản xuất SV tiêu thụ SV phân huỷ
  • 14. Đồ án tốt nghiệp 4 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất có thể chia ra như sau: • Phân bố theo chiều sâu Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác. Đó là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp nhất. Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càng xuống sâu càng ít vi sinh vật. Riêng đối với các đất bạc màu, do hiện tượng rửa trôi, tầng 0 - 20 cm ít chất hữu cơ hơn tầng 20 - 40 cm nên ở tầng này số lượng vi sinh vật nhiều hơn ở tầng trên, sau đó giảm dần ở các tầng dưới. Thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo tầng đất: vi khuẩn hiếu khí, vi nấm, xạ khuẩn thường tập trung ở tầng mặt vì tầng này có nhiều oxy. Càng xuống sâu, các nhóm vi sinh vật hiếu khí càng giảm mạnh. Ngược lại, các nhóm vi khuẩn kỵ khí như vi khuẩn phản nitrate hoá phát triển mạnh ở độ sâu 20 - 40 cm. Ở vùng khí hậu nhiêt đới nóng ẩm thường có quá trình rửa trôi, xói mòn nên tầng 0 - 20 cm dễ biến động, tầng 20 - 40 cm ổn định hơn. • Phân bố theo các loại đất Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoáng khí, pH khác nhau dẫn đến sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau. Ở đất lúa nước, tình trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt, chất dinh dưỡng,... Chỉ có một lớp mỏng ở trên khoảng 0 - 3 cm là có quá trình oxy hoá, ở tầng đất dưới quá trình khử oxy hoá chiếm ưu thế. Do đó trong đất lúa nước các loại vi sinh vật kỵ khí phát triển mạnh. Ví dụ như vi khuẩn amon hoá, vi khuẩn phản nitrate hoá. Ngược lại, các loại vi sinh vật hiếu khí như vi khuẩn nitrate hoá, vi khuẩn cố định nitrogen, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít. Tỷ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí luôn nhỏ hơn 1. Ở đất trồng hoa màu, không khí lưu thông tốt, quá trình oxy hoá chiếm ưu thế, bởi vậy các loài vi sinh vật hiếu khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát triển yếu. Tỷ lệ gữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí thường lớn hơn 1, có trường hợp
  • 15. Đồ án tốt nghiệp 5 đạt tới 4 – 5. Ở đất giàu dinh dưỡng như đất phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật tổng số rất cao. Ngược lại, vùng đất bạc màu Hà Bắc có số lượng vi sinh vật rất ít. • Phân bố theo cây trồng Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển mạnh hơn so với vùng không có rễ do rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi nó chết đi. Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ ẩm. Tất cả những nhân tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát triển mạnh hơn vùng ngoài rễ. Tuy nhiên, mỗi loại cây trồng trong quá trình sống của nó thường tiết qua bộ rễ những chất khác nhau. Bộ rễ khi chết đi cũng có thành phần khác nhau. Thành phần và số lượng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lượng vi khuẩn cố định nitrogen cộng sinh còn ở vùng rễ lúa là nơi cư trú của các nhóm cố định nitrogen tự do hoặc hội sinh... Số lượng và thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo các giai đoạn phát triển của cây trồng. Đất vùng phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn lúa chồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là cây lúa sinh trưởng mạnh. Bởi vậy thành phần và số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ rễ càng lớn – đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật vùng rễ. Số lượng vi sinh vật đạt cực tiểu ở thời kỳ lúa chín. Thành phần vi sinh vật cũng biến động theo các giai đoạn phát triển của cây, phù hợp với hàm lượng các chất tiết qua bộ rễ. 1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất Theo nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố, hệ vi sinh vật trong đất rất phong phú với rất nhiều nhóm gồm: vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn, virus, tảo và nguyên sinh động vật (protozoa) (Lê Quốc Tuấn, 2009). 1.1.3.1. Vi khuẩn Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước hiển vi, có cấu trúc tế bào đơn giản gồm màng tế bào, tế bào chất và nhân (không có màng nhân) (prokaryote). Kích thước của vi khuẩn từ 0,1- 1,2 x 0,2- 6,0 µm. Peptidoglycan là chất đặc biệt ở vách tế bào prokaryote, dựa vào khả năng bắt màu của crystal violet
  • 16. Đồ án tốt nghiệp 6 vi khuẩn được phân biệt hai loại là vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Một số vi khuẩn di chuyển bằng tiên mao. Vi khuẩn sinh sản bằng con đường vô tính. Hình thái vi khuẩn rất đa dạng, có thể chia thành 3 nhóm hình dạng chính: hình cầu, hình que và hình xoắn (Hình 1.1). Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998) Staphylococcus aureus (a); Bacillus subtilis (b); Spirillum (c). Các nhóm vi khuẩn rất đa dạng và giữ những vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá vật chất để khép kín vòng tuần hoàn các chất trong đất và trong tự nhiên. Vi khuẩn tham gia hình thành và cải tạo đất trồng trọt, phân huỷ, chuyển hoá hợp chất khó tan trong đất thành các chất dễ tiêu cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Một số vi khuẩn có khả năng đồng hoá nitơ trong không khí để làm giàu nitơ cho đất và cung cấp nitơ cho cây trồng. Ngoài ra, vi khuẩn còn có khả năng tiết ra các enzyme, các chất kích thích sinh trưởng, các acid hữu cơ trong đất ... Một số vi khuẩn quan trọng thường gặp trong đất: Bacillus subtilis, Chostridium, Lactobacillus, Rhizobium,... 1.1.3.2. Vi nấm Vi nấm là nhóm nấm có kích thước hiển vi. Vi nấm khác với vi khuẩn và xạ khuẩn, chúng có cấu tạo nhân điển hình, vì vậy chúng được xếp vào nhóm Eukaryote. Vi nấm gồm 2 nhóm lớn là nấm men (yeast) và nấm sợi (filamentous fungi). Trong đó, nấm men có cấu trúc đơn bào còn nấm sợi có cấu trúc đa bào. Nấm men (yeast) có khả năng sinh sản bằng vô tính theo hình thức nẩy chồi, một vài loài sinh bào tử và cũng có thể sinh sản hữu tính như chi Saccharomyces. Nấm sợi có quá trình sinh sản phức tạp hơn nấm men. Sinh sản vô tính có nhiều b) c) a)
  • 17. Đồ án tốt nghiệp 7 cách: bào tử trần, bào tử kín. Sinh sản hữu tính của nấm sợi cũng có vài hình thức khác nhau. Thường gặp là các chi Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Chaetomium, Alternaria, Rhizoctonia, Verticillium,... Có vai trò quan trọng trong quá trình mùn hoá và phân giải xác hữu cơ cho đất (phân giải cellulose, tinh bột, nhựa, lignin,...). 1.1.3.3. Xạ khuẩn Xạ khuẩn là những vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm prokaryote, hình sợi, phân bố rộng rãi trong đất, trong nước và trong các cơ chất hữu cơ. Kích thước của xạ khuẩn nằm trong khoảng 0,2 – 0,5 x 0,4 – 100 µm. Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998) Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu của đất. Tham gia vào các quá trình chuyển hoá và phân giải nhiều hợp chất
  • 18. Đồ án tốt nghiệp 8 hữu cơ phức tạp (cellulose, mùn, kitin, lignin,...). Hầu hết các xạ khuẩn thuộc giống Actinomyces có khả năng hình thành chất kháng sinh. Đây là đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn. Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), một số acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic và nhiều acid amin như acid glutamic, tryptophan,... Một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme như: protease, amylase, chitinase, cellulase... Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số xạ khuẩn lại sinh ra các chất độc kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật. Một số khác lại là nguyên nhân gây ra một số bệnh khó chữa ở người và gia súc. Các bệnh này gọi chung là Actynomycose. Một số giống xạ khuẩn quan trọng trong đất: Actinomyces, Bacterionema, Pseudonocardia, Streptomyces... 1.1.3.4. Tảo Tảo là sinh vật tự dưỡng không bắt buộc (nhờ quá trình quang hợp), phát triển mạnh ở lớp đất mặt. Tảo có tác dụng làm tăng khả năng hoà tan của khoáng vật đặc biệt là carbonate, làm tăng tốc độ phong hoá, cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ cho đất. Một số tảo lục, lam có khả năng cố định nitơ tự do. Bên cạnh đó tảo còn giúp hạn chế xói mòn đất do gió. 1.1.3.5. Nguyên sinh động vật (protozoa) Nguyên sinh động vật có kích thước hiển vi, cấu tạo và hoạt động của tế bào nguyên sinh động vật giống tế bào của sinh vật đa bào. Nhưng chính tế bào này là tế bào biệt hoá đa năng, đảm nhận mọi chức năng sống của một cơ thể độc lập. Nguyên sinh động vật có vai trò quan trọng ở mức sản xuất sơ cấp và phân huỷ, chúng có thể làm nguồn thức ăn chủ yếu cho nhiều loài không xương sống và gián tiếp cho nhiều loài động vật có xương sống. Một số nguyên sinh động vật thường gặp là: trùng chân giả (Amoeba), trùng roi (Flagellata), ...
  • 19. Đồ án tốt nghiệp 9 1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật 1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các quá trình dị hóa bên ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào vi khuẩn. Vì các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật là các hợp chất cao phân tử nên vi sinh vật không thể vận chuyển qua màng tế bào, cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng thuỷ phân các hợp chất cao phân tử này thành các hợp chất có trọng lượng thấp hơn để vi sinh vật có thể vận chuyển qua màng tế bào. Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản ứng bên ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ có ở vi sinh vật. 1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm phụ: - Nhóm 1: Oxidoreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. - Nhóm 2: Transferase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị. - Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia). - Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi. - Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa. - Nhóm 6: Ligase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác.
  • 20. Đồ án tốt nghiệp 10 Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase. Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O R1OH + R2H Tinh bột + H2O Dextrin + Maltose + Glucose Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme: amylase, cellulase, protease và lipase… 1.2.3. Đặc điểm – tính chất Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa: - Về bản chất, enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của một protein, có trọng lượng phân tử từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do có trọng lượng phân tử lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào. - Vì có bản chất là protein nên enzyme cũng có tính lưỡng tính (do có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị phân ly như sau: Protein - COOH Protein - COO- + H+ Protein - NH2 Protein - NH+ + H+ - Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ hữu cực khác. - Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 1100C như: α-amylase từ vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis có thể chịu được nhiệt độ 110oC. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt α-amylase Kiềm Acid Acid Kiềm
  • 21. Đồ án tốt nghiệp 11 còn có khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid 2,1… - Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme. Trong trung tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme (trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca2+. - Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo quy luật cảm ứng cơ chất. Khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không có cơ chất để phân hủy cơ chất đó. Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp này gọi là enzyme cảm ứng. Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng được gọi là cơ chất cảm ứng. Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng tăng dần. Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu cơ chất gây ra. - Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau. - Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi hỏi năng lượng rất lớn. Ví dụ: Trong quá trình thủy phân saccharose thành fructose và glucose:
  • 22. Đồ án tốt nghiệp 12 + Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân tử gam. + Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử gam. Phương trình phản ứng: Saccharose Fructose + Glucose + Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000 cal/phân tử gam. Phương trình phản ứng: Saccharose Fructose + Glucose - Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một hoặc một số phản ứng sinh hóa. - Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản ứng. Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme. - Enzyme vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, môi trường lên men rẻ tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme dễ dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm enzyme của động vật và thực vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động vật hay thực vật là mỗi loài chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ như từ malt có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ vi sinh vật thì ngược lại; từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng enzyme rất lớn. Chúng có hoạt tính rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn. Nuôi cấy vi sinh Saccharase Acid
  • 23. Đồ án tốt nghiệp 13 vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật. Có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất. 1.2.4. Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng. Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp. 1.2.4.1. Enzyme amylase a) Đặc điểm Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: RR’ + H-OH → RH + R’OH Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. b) Phân loại Hiện nay, có sáu loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (amylase nội bào) và Exoamylase (amylase ngoại bào). - Endoamylase: gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là oligo-1,6- glucosidase hay còn gọi là dextrinase tới hạn (EC 3.2.1.10) và amylo-1,6- glucosidase (EC 3.2.1.20). Các enzyme này thuỷ phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. - Exoamylase: gồm có β-Amylase (EC 3.2.1.2) và Amyloglucosidase (glucoamylase hay 𝛾-Amylase) (EC 3.2.1.3). Đây là những enzyme thuỷ phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. c) Cấu trúc Enzyme amylase thuộc loại hydrolase chỉ là những phân tử protein thuần, trung tâm hoạt động thường là những nhóm chức như: -NH2, -COOH, -SH ...
  • 24. Đồ án tốt nghiệp 14 α-Amylase (EC 3.2.1.1) β-Amylase (EC 3.2.1.2) oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Amyloglucosidase (EC 3.2.1.3) amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.20) Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase d) Cơ chế tác dụng Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thuỷ phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thuỷ phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức
  • 25. Đồ án tốt nghiệp 15 độ: dịch hoá và đường hoá. Kết quả của sự dịch hoá là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hoá thì sản phẩm là maltose và glucose. - α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glycoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. Thông thường α-amylase chỉ thuỷ phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. - β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. - R-enzyme còn gọi là α-1,6-glucosidase cắt các liên kết α-1,6-glycoside tại điểm xuất phát mạch nhánh. - Ngoài ra enzyme amyloglucosidase lại có khả năng cắt từng đơn vị đường đơn (glucose) từ đầu của mạch carbohydrate. e) Một số vi sinh vật sinh enzyme amylase hiện diện trong đất Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Bacillus megaterium là một trong số những sinh vật hiện diện trong đất có khả năng sinh enzyme amylase cao (Verma và ctv, 2011). 1.2.4.2. Enzyme protease a) Đặc điểm Nhóm enzyme protease (peptide – hydrolase, EC 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Hình 1.5. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein
  • 26. Đồ án tốt nghiệp 16 Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết ester và vận chuyển acid amin. b) Phân loại Protease được chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành 2 loại: - Aminopeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc tripeptide. - Carboxypeptide: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm: - Serine protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. - Cysteine protease: là những protease có chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động. Các cysteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. - Aspartic protease: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở vùng pH trung tính. - Metalloprotease: là những protease trong trung tâm hoạt động của chúng có các ion kim loại. Các metallo protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. c) Cấu trúc Trung tâm hoạt động của protease vi sinh vật ngoài gốc amin acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc amino acid khác.
  • 27. Đồ án tốt nghiệp 17 - Serine protease: chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. - Cysteine protease: chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động. - Aspartic protease: chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật bao gồm một số gốc amino acid và trong một số trường hợp còn có cả cofactor kim loại. Đối với các protease không chứa cystein, trung tâm hoạt động của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu nối disulphide. Hình 1.6. Cấu trúc không gian của enzyme protease d) Cơ chế tác dụng Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S E – S E – S* + P1 E + P2 Trong đó: E: enzyme. S: cơ chất (substance). E – S: phức chất enzyme - cơ chất. E – S*: phức chất trung gian enzyme - cơ chất hóa (axilenzyme). P1: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amino tự do mới được tạo thành).
  • 28. Đồ án tốt nghiệp 18 P2: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do được tạo thành). e) Các vi sinh vật sản sinh enzyme protease hiện diện trong đất Trong số các vi sinh vật hiện diện trong đất, Bacillus sp. là một trong những nhóm vi khuẩn điển hình sản sinh ra enzyme protease ngoại bào. Theo kết quả nghiên cứu của Sethi và ctv (2012), vi khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh enzyme protease là Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilus, E. Coli và Serratia marscens. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của các vi sinh vật hiện diện trong đất của Nadrendra và ctv (2012) cũng cho thấy rằng đó chính là Bacillus sp. 1.2.4.3. Enzyme cellulase a) Đặc điểm Cellulase thuỷ phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucoside trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc. Cơ chất của enzyme cellulase là cellulose. b) Phân loại Dựa vào đặc điểm của cơ chất (cellulose) và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành ba loại: - 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase hay còn gọi là exoglucanase (EC 3.2.1.91). - 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase hay còn gọi là endoglucanase (EC 3.2.1.4). - β-D-glucoside glucohydrolase hay còn gọi là β-glucosidase (EC 3.2.1.21). Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong dạ dày cỏ bò, mối và trong một số nấm như Trichoderma, Aspergillus,... c) Cấu trúc Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là acid amin, các acid amin được nối với nhau bởi liên kết peptide -CO-NH-. Ngoài ra, trong cấu trúc
  • 29. Đồ án tốt nghiệp 19 còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hoá, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể. Trong quá trình phân huỷ cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose. Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose. Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosyl hoá có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Hình 1.7. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase d) Cơ chế tác dụng Sự thuỷ phân cellulose nhờ hệ enzyme cellulase gồm 4 enzyme, gồm: - Cellobiose dehydrolase: cắt các liên kết hydro biến cellulose có cấu trúc không gian thành cellulose vô định hình. - Endoglucanase: cắt các liên kết β - 1, 4 - glucoside tạo thành các chuỗi dài. - Exoglucanase: Cắt các chuỗi thành cellobiose. - β – glucosidase: thuỷ phân cellobiose thành glucose. e) Vi sinh vật sản sinh enzyme cellulase hiện diện trong đất Theo kết quả nghiên cứu của Sethi và ctv (2012), vi khuẩn được phân lập từ đất và có khả năng sinh enzyme cellulase là Pseudomonas fluorescens, Bacillus
  • 30. Đồ án tốt nghiệp 20 subtilis, E. Coli và Serratia marescens. Nghiên cứu của Pandey và ctv (2005) cho thấy nhiều loài nấm cũng có khả năng sinh enzyme cellulase cao, điển hình là Trichoderma reesei, Humicola, Penicillium, Aspergillus. 1.2.4.4. Enzyme lipase a) Đặc điểm Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành glyceryl và acid béo tương ứng. Lipase tan trong nước và các dung môi phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực. Lipase rất cần thiết cho việc tiêu hoá, vận chuyển và xử lý các chất béo như triglyceride, dầu, mỡ trong hầu hết các sinh vật sống. b) Phân loại Theo nguồn gốc, enzyme lipase được chia làm 3 loại: - Lipase từ động vật: thu nhận thường khó và hiệu quả kinh tế không cao. - Lipase từ thực vật. - Lipase từ vi sinh vật: vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với quy mô công nghiệp lớn, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng và có thể thoả mãn trong 1 mức độ lớn về nhu cầu của các ngành công nghiệp khác nhau. Theo tính chất: - Lipase có tính đặc hiệu vị trí. - Lipase có tính đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hoá dưới tác dụng của enzyme. c) Cấu trúc Lipase là enzyme lưỡng cấu tử, trong thành phần có 2 phần: Protein (apoenzyme) và không phải protein (coenzyme). Tham gia vào thành phần nhóm ngoại gồm có: coenzyme, vitamin, ion kim loại.
  • 31. Đồ án tốt nghiệp 21 Hình 1.8. Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa Nhóm quan trọng nhất tạo thành trung tâm hoạt động của lipase là bộ ba aspartic, histidine và serine. Lipase tham gia vào vị trí xúc tác với proteinase và esterase. Đối lập với proteinase, trung tâm xúc tác của nó không phân bố ở bề mặt ngoài mà nằm dưới chuỗi xoắn bề mặt. Vị trí hoạt động của mọi lipase đều có Ser, His và Asp (hoặc Glu) và hoàn toàn bị che khuất bởi một đoạn nắp cấu tạo bởi một hoặc hai chuỗi xoắn. Bề mặt mang Trypsin hoàn toàn không phân cực và tác động qua lại với đầu kỵ nước bao quanh trung tâm hoạt động. Trong hầu hết cấu trúc lipase, đầu serine hoạt động trong chuỗi pentapeptide có trình tự Gly-X1-Ser-X2- Gly cấu trúc đó cũng được tìm thấy ở protease serine (Boel và ctv, 1998). d) Cơ chế động học xúc tác của lipase Lipase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành glyceryl và acid béo tương ứng. Chúng xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt từng liên kết chứ không cắt đứt cả 3 liên kết ester cùng một lúc. Quá trình xúc tác của lipase thường chậm hơn so với quá trình xúc tác của các enzyme khác như protease hay amylase. Với các cơ chất không tan trong nước, hoạt tính của lipase đạt cực đại chỉ khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu nước. Quá trình đó được gọi là quá trình hoạt hoá phân pha.
  • 32. Đồ án tốt nghiệp 22 Hình 1.9. Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước. Sự thay đổi hình thể của lipase trong quá trình hoạt động xúc tác. Mô hình này do Verger đề xuất (1980) Trong đó: E: Lipase hoà tan không hoạt động. E*: Lipase hoà tan dạng hoạt động. Es*: Lipase hoạt động có hấp phụ. Eis*: Lipase không hoạt động được hấp phụ. Sw: Cơ chất tan trong nước. S: Cơ chất không tan trong nước. E*Sw và Es*S: Phức hợp lipase - cơ chất. Khi không có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ, phản ứng este hoá và phản ứng este được ưu tiên. Trong trường hợp này, những đặc tính như tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng và bản chất cơ chất (Woolley & Petersen, 1992). e) Vi sinh vật sản sinh enzyme lipase hiện diện trong đất Nhiều sinh vật như thực vật, nấm và vi khuẩn có khả năng sản sinh enzyme lipase. Theo nghiên cứu của Prasad (2014) về việc cô lập enzyme lipase của các vi sinh vật hiện diện trong các mẫu đất khác nhau gần các nhà máy sản xuất dầu giàu hàm lượng lipid đã xác định được đó chính là Pseudomonas aeruginosa. Kết quả nghiên cứu của Veerapagu và ctv (2013) cũng cho thấy rằng Pseudomonas gessardii được phân lập từ đất ở những vùng bị tràn dầu từ các nhà máy chế biến dầu thực vật là vi khuẩn lý tưởng cho việc sản sinh enzyme lipase ngoại bào ở mức độ công nghiệp.
  • 33. Đồ án tốt nghiệp 23 1.3. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay Tất cả các sinh vật trong sinh quyển đều phụ thuộc vào hoạt động của vi sinh vật (Pace, 1997). Vi sinh vật hiện diện trong đất đóng vai trò quan trọng trong các chu trình chuyển hóa chất dinh dưỡng và trong hệ sinh thái trên mặt đất. Do đó vi sinh vật đất đã sớm được các nhà khoa học chú ý nghiên cứu. Điều quan trọng để nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật không chỉ để nghiên cứu khoa học cơ bản, mà còn để hiểu mối liên hệ giữa sự đa dạng, cấu trúc và chức năng của quần thể vi sinh vật cũng như sự tiến hoá của chúng. Những tác động của con người như sự ô nhiễm, hoạt động nông nghiệp và việc sử dụng hoá chất có thể ảnh hưởng bất lợi đến sự đa dạng vi sinh vật, ảnh hưởng đến hệ sinh thái trên và dưới mặt đất. Theo nghiên cứu của Buckley và Schmidt (2001) đã tìm thấy một lượng 16S rRNA cao ở tất cả các nhóm vi sinh vật trong các cánh đồng chưa được canh tác so với các cánh đồng đã được canh tác. Điều này cho thấy hoạt động canh tác của con người có tác động đến vi sinh vật hiện diện trong đất. Trevors và ctv (2003) đã ước tính trong 1 g đất có 4000 đơn vị gen vi khuẩn khác nhau dựa trên DNA-DNA ghép đôi. Ước tính có khoảng 5000 loài vi khuẩn đã được mô tả. Khoảng 1 % quần thể vi khuẩn đất có thể được nuôi cấy invitro nhưng không thể biết được 1 % quần thể vi khuẩn này có là đại diện của quần thể vi khuẩn hay không. Ước tính có khoảng 1,500,000 loài nấm tồn tại trong thế giới (Giller và ctv, 1997). Không giống như vi khuẩn, nhiều loại nấm không thể được nuôi cấy invitro. Mặc dù phương pháp phân tử đã được sử dụng để nghiên cứu các cộng đồng vi khuẩn đất nhưng rất ít nghiên cứu về nấm đất được thực hiện (Van Elsas và ctv, 2000). Dựa vào kết quả của các nghiên cứu đã đạt được, các chuyên gia sẽ đưa ra các biện pháp khai thác đầy đủ theo hướng có lợi các loài sinh vật hữu ích và ngăn chặn những tác hại của các loài sinh vật có hại nhằm nâng cao độ phì của đất, tăng năng suất và chất lượng nông phẩm của các loại cây trồng.
  • 34. Đồ án tốt nghiệp 24 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 02/2014 đến 07/2014. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập Nguồn mẫu phân lập được thu tại vùng đất canh tác của ông Nguyễn Văn Hoàng gồm có đất trồng lúa và đất trồng hoa màu tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. Bảng 2.1. Danh sách mẫu phân lập Nguồn phân lập Địa điểm thu mẫu Đất trồng lúa Đất trồng bông Đất trồng mồng tơi Đất trồng rau dền Đất trồng quế Đất trồng tía tô Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 19 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Y tế công cộng (V), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh (K) và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm: - Nhóm vi khuẩn Salmonella: S. enteritidis, S. typhii (K), S.ntyphii (V), S. typhimurium, S. dublin. - Nhóm vi khuẩn E. Coli: E. Coli (K), E. Coli (V), TEC, EC. 02. 08. - Nhóm vi khuẩn Shigella: Shi. sonnei, Shi. boydii, Shi. flexneri.
  • 35. Đồ án tốt nghiệp 25 - Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi. - Các vi khuẩn: L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus. 2.2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy và phân lập - Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị a) Dụng cụ - Đĩa petri - Ống nghiệm - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Ống đong 100 ml - Pipet 1ml, 10 ml - Ống ly tâm ependoff 2 ml - Bình môi trường 250 ml, 500 ml, 1000 ml - Dây cấy ria, que cấy trang - Đèn cồn - Dụng cụ đục lỗ - Thước đo - Bông thấm và bông không thấm nước - Đũa thuỷ tinh - Các loại đầu típ - Micropipette 100 µl, 1000 µl - Các loại dụng cụ khác như: bao chịu nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp, muỗng, dao, thun,... b) Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Tủ ấm 300C, 370C (Memmert mermany) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy đo pH (Hach – Germany) - Máy đo UV – VIS (Hach) - Cân phân tích (Orbital Germany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy nước cất (Branstead USA) 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu Đối với đất trồng lúa: Sử dụng muỗng lấy đất ở lớp đất mặt cho vào túi nylon (khối lượng mẫu lấy tối thiểu là 200 gam).
  • 36. Đồ án tốt nghiệp 26 Đối với đất trồng hoa màu: Sử dụng muỗng gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 - 3 cm, lấy lớp đất ở dưới cho vào túi nylon (khối lượng mẫu lấy tối thiểu là 200 gam). Các mẫu đất được bảo quản trong túi nylon vận chuyển về phòng thí nghiệm. Cân 10 gam mẫu (sai số ± 0,1) cho vào erlen có chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều, khi đó sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. 2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng. (Phạm Minh Nhựt, 2013). Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu
  • 37. Đồ án tốt nghiệp 27 2.3.3. Phương pháp tăng sinh Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bước đầu giúp thu sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). 2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 50C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.4.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ
  • 38. Đồ án tốt nghiệp 28 trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40 % cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật 2.3.5.1. Phương pháp nhuộn gram Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của lớp peptidoglycan với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod, vi khuẩn được phân làm hai loại là vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày bắt màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi tẩy cồn nên bắt màu tím khi nhuộm. Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng không bắt màu thuốc nhuộm nên mất màu khi tẩy cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng khi nhuộm (Prescott và ctv, 2005). Các bước tiến hành: - Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame. - Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong erlen chứa 10ml môi trường TSB ủ ở 300C trong 24 giờ. Dùng que cấy lấy sinh khối hòa vào giọt nước để làm vết bôi. - Cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản: - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh (Gentian violet) trong 45 giây, rửa nước và để khô. - Nhuộm lugol trong 1 phút, rửa nước. - Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước.
  • 39. Đồ án tốt nghiệp 29 - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch fuchsin hoặc safranin từ 10 – 30 giây, rửa lại bằng nước cất, để khô và soi tiêu bản với vật kính dầu 100X. 2.3.5.2. Phương pháp thử nghiệm catalase Nguyên tắc: Phương pháp này nhằm xác định vi sinh vật có enzyme catalase hay không. Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy nghi chứa chuỗi chuyển điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus spp.). Enzyme catalase có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy trong tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxi là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2. Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.Vi sinh vật có enzyme catalase sẽ có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2010). Cách tiến hành: - Dùng que cấy lấy một ít sinh khối làm vết bôi trên lame. - Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vết bôi và quan sát hiện tượng sủi bọt. Kết quả: - Có hiện tượng sủi bọt → vi sinh vật có khả năng phân huỷ H2O2 → có enzyme catalase. - Không có hiện tượng sủi bọt → vi sinh vật không có khả năng phân huỷ H2O2 → không có enzyme catalase. 2.3.5.3. Phương pháp thử nghiệm oxidase Nguyên tắc: Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật. Thành phần quan trọng nhất là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine. Nếu có sự hiện diện của cytochrome trong tế bào thì thuốc thử sẽ bị oxy hoá thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương.
  • 40. Đồ án tốt nghiệp 30 Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn bôi lên miếng giấy thử chứa thuốc thử p -phenylenediamine và quan sát hiện tượng đổi màu trong vòng vài phút. Kết quả: Thử nghiệm oxidase là (+) khi giấy thử xuất hiện màu xanh dương đậm, nếu không có xuất hiện màu xanh dương đậm thì phản ứng là âm tính (-) (Trần Linh Thước, 2010). 2.3.5.4. Phương pháp thử nghiệm gelatinase Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có thể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự thuỷ phân của gelatin thành polypeptide và acid amin. Để nhận biết khả năng làm tan gelatin của vi sinh vật, cơ chất này được bổ sung làm đông đặc môi trường nuôi cấy. Sau khi cấy chủng, chủng vi sinh vật có khả năng tiết gelatinase sẽ làm môi trường tan chảy thành dạng lỏng. Tiến hành: Môi trường sử dụng là môi trường Nutrient Gelatin được chứa trong ống nghiệm. Tiến hành cấy đâm sâu một lượng sinh khối của vi khuẩn khảo sát vào trong ống môi trường Nutrient Gelatin, ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Thực hiện ủ song song một ống đối chứng không cấy vi sinh vật. Kết quả: Trong ống thạch sâu, thử nghiệm là (+) khi môi trường ở ống có cấy vi khuẩn bị tan chảy trong khi ở ống đối chứng môi trường vẫn ở trạng thái đông đặc. Thử nghiệm (-) là khi môi trường trong ống có cấy vi khuẩn vẫn ở trạng thái đông đặc giống ống đối chứng (Trần Linh Thước, 2010) 2.3.6. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn Nguyên tắc: Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị vi khuẩn phân huỷ sẽ không tạo màu mà tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc (Phan Thanh Phương, 2007).
  • 41. Đồ án tốt nghiệp 31 Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh và cấy trang trên môi trường TSA và ủ ở 300C trong 24 giờ. Chuẩn bị các đĩa môi trường tương ứng với từng loại enzyme cần khảo sát. Dùng khuyên đục lỗ (đường kính 7 mm) tiến hành đục lỗ, gắp thạch chứa sinh khối vi khuẩn sang lỗ thạch đã đục trên đĩa môi trường đã được chuẩn bị, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng và đo đường kính vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. 2.3.7. Phương pháp xác định mật độ tế bào Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): Mật độ = OD600 x 1,02 x 109 (cfu/ml) 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. 2.4. Bố trí thí nghiệm Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Nguồn mẫu Phân lập Định danh sơ bộ Xác định các đặc điểm có lợi của vi sinh vật Tổng hợp kết quả Khả năng sinh một số enzyme ngoại bào Đối kháng vi khuẩn gây bệnh
  • 42. Đồ án tốt nghiệp 32 2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn 2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp Hình 2.3. Quy trình phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp Các mẫu sau khi được thu về tiến hành cân 10 gam mẫu cho vào erlen chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng khi đó được nồng độ pha loãng là 10-1. Sau đó, tiến hành đồng nhất mẫu trong 2 phút rồi đun ở 600C trong 60 phút và tiến hành pha loãng đến độ pha loãng 10-6. Mẫu sau khi được pha loãng, tiến hành hút 0,1 ml dịch sau pha loãng ở mỗi nồng độ pha loãng 10-4, 10-5,10-6 rồi cấy trang trên môi trường TSA. Ủ ở 300C trong 24 giờ. Nguồn mẫu 10 gam mẫu + 90 ml nước muối sinh lý → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10-1 Đun ở 600C trong 60 phút Pha loãng bằng nước muối sinh lý đến độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Hút 0,1 ml ở mỗi nồng độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 cấy trang trên đĩa chứa môi trường TSA Chọn những khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường TSA làm thuần Giữ giống trong ống thạch nghiêng và trong glycerol 40%.
  • 43. Đồ án tốt nghiệp 33 Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường TSA và cấy làm thuần. Sau đó bảo quản các chủng này trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và trong glycerol 40% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.1.2. Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập, tiến hành định danh sơ bộ thông qua các phương pháp: nhuộm gram, thử nghiệm catalase, thử nghiệm oxidase. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập và định danh sơ bộ được tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào. Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá khả năng sinh các enzyme amylase trên môi trường Starch Agar, caseinase trên môi trường Skim Milk Agar, lipase trên môi trường Tween Peptone Agar, cellulase trên môi trường CMC Agar bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và đánh giá khả năng sinh enzyme gelatinase trên môi trường Nutrient Gelatin. 2.4.2.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase, caseinase, lipase và cellulase trên các môi trường khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch Đầu tiên, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường TSB trong 24 giờ ở 300C. Sau đó, hút 100µl dịch nuôi cấy cho vào môi trường TSA và cấy trang rồi đem ủ ở 300C trong 24 giờ. Trên các đĩa môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme, tiến hành đục các lỗ có đường kính 7mm. Sau đó, chuyển các khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn cần xác định khả năng sinh enzyme vào các lỗ trên đĩa môi trường khảo sát. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Tiến hành đọc kết quả như sau: - Trên môi trường Starch Agar: cho thuốc thử lugol vào → nếu xung quanh giếng thạch không xuất hiện màu xanh đen → vi khuẩn phân giải tinh bột → vi khuẩn có sinh enzyme amylase.
  • 44. Đồ án tốt nghiệp 34 Hình 2.4. Vòng phân giải tinh bột của vi khuẩn trên môi trường Starch Agar - Trên môi trường Skim Milk Agar: nếu xung quanh giếng thạch xuất hiện vòng phân giải trong suốt → vi khuẩn phân giải casein trong Skim Milk → vi khuẩn có sinh enzyme caseinase. Hình 2.5. Vòng phân giải casein của vi khuẩn trên môi trường Skim Milk Agar - Trên môi trường Tween Peptone Agar: nếu xung quanh giếng thạch xuất hiện quầng sáng màu hồng → vi khuẩn phân giải dầu → vi khuẩn có sinh enzyme lipase.
  • 45. Đồ án tốt nghiệp 35 Hình 2.6. Vòng phân giải Tween của vi khuẩn trên môi trường Tween Peptone Agar - Trên môi trường CMC: cho thuốc thử lugol vào → nếu xung quanh giếng thạch không bắt màu của thuốc thử → vi khuẩn phân giải cellulose → vi khuẩn có sinh enzyme cellulase. Hình 2.7. Vòng phân giải cellulose của vi khuẩn trên môi trường CMC
  • 46. Đồ án tốt nghiệp 36 2.4.2.2. Đánh giá khả năng sinh gelatinase bằng thử nghiệm gelatinase Tăng sinh các chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường TSB và ủ ở 300C trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành cấy đâm sâu một lượng sinh khối của vi khuẩn khảo sát vào trong ống môi trường Nutrient Gelatin, ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Thực hiện ủ song song một ống đối chứng không cấy vi sinh vật. Tiến hành đọc kết quả như sau: Trong ống thạch sâu, thử nghiệm là (+) khi môi trường ở ống có cấy vi khuẩn bị tan chảy trong khi ở ống đối chứng môi trường vẫn ở trạng thái đông đặc. Thử nghiệm (-) là khi môi trường trong ống có cấy vi khuẩn vẫn ở trạng thái đông đặc giống ống đối chứng (Trần Linh Thước, 2010) Hình 2.8. Kết quả âm tính và dương tính của thử nghiệm gelatinase 2.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh Các chủng vi khuẩn phân lập được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành cấy trang trên các đĩa chứa môi trường TSA ủ ở 300C trong 24 giờ. Chờ dịch mẫu khô rồi đục lỗ thạch (đường kính 7 mm) trên các đĩa TSA vừa được trang. Đối với 19 chủng vi khuẩn chỉ thị gây bệnh đường ruột, chúng được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB, riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5 % NaCl rồi đem đi lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt
  • 47. Đồ án tốt nghiệp 37 độ phòng. Sau đó, dịch nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị được đo OD600nm để xác định mật độ. Tiến hành pha loãng để đạt được mật độ 106 cfu/ml rồi cấy trang trên các đĩa chứa môi trường TSA (riêng các chủng Vibrio spp. tiến hành cấy trang trên môi trường TSA có bổ sung 1,5 % NaCl). Chờ dịch mẫu khô rồi đục lỗ thạch (đường kính 7 mm) trên các đĩa TSA vừa được trang. Đối với các đĩa thạch được cấy trang các chủng vi khuẩn phân lập được sau khi ủ 24 giờ, chọn những vùng vi khuẩn phát triển dày đặc, tiến hành đục lỗ thạch chứa sinh khối vi khuẩn. Sau đó, dùng kẹp vô trùng gắp khối thạch đặt vào trong các giếng thạch trên đĩa TSA đã cấy trang các chủng vi khuẩn chỉ thị và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Chủng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu đất nông nghiệp có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn chỉ thị có sự xuất hiện của quầng trong bao quanh các lỗ thạch chứa sinh khối của chủng vi khuẩn phân lập được. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
  • 48. Đồ án tốt nghiệp 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu Nguồn đất được sử dụng trong nghiên cứu được thu từ vùng đất canh tác nông nghiệp của ông Nguyễn Văn Hoàng, ngụ tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. Nguồn đất này được thu từ 5 vùng đất ruộng trồng lúa và 5 vùng đất gò trồng hoa màu. Các nguồn mẫu được trình bày ở Hình 3.1. Ruộng lúa 1 Ruộng lúa 2 Ruộng lúa 3 Ruộng lúa 4 Ruộng lúa 5 Đất trồng bông
  • 49. Đồ án tốt nghiệp 39 Đất trồng mồng tơi Đất trồng rau dền Đất trồng quế Đất trồng tía tô Hình 3.1. Các nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu Đối với các ruộng trồng lúa, các ruộng này được trồng lúa thâm canh, tức là các ruộng này chỉ được sử dụng để canh tác lúa nước. Mỗi năm ruộng được canh tác 2 vụ, mỗi vụ kéo dài 3 tháng. Sau khi sạ giống, tiến hành bón phân thành 3 đợt: 15 ngày sau khi sạ, 25 ngày sau khi sạ và bón trước khi lúa lên đòng. Phân được sử dụng khi bón thành phần chủ yếu là N, P, K. Do đó, các loại phân này chủ yếu là phân vô cơ nên vai trò của các vi sinh vật trong đất đóng vai trò hết sức quan trọng giúp chuyển hóa các hợp chất nitơ vô cơ, phospho, kali thành dạng dễ hấp thu giúp cây lúa phát triển tốt hơn. Do đó, trong các vùng đất trồng lúa có sự hiện diện rất phong phú của loại vi sinh vật có khả năng sinh các enzyme ngoại bào. Tuy nhiên, đặc trưng của các vùng đất trồng lúa là đất luôn trong tình trạng ngập nước nên các vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào hiện diện trong lớp đất khoảng 0 – 3 mm và các chủng này phần lớn là các chủng vi khuẩn kỵ khí tùy nghi (Lê Quốc Tuấn, 2009).
  • 50. Đồ án tốt nghiệp 40 Đối với đất trồng hoa màu được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm đất trồng hoa vạn thọ, đất trồng rau dền, đất trồng tía tô, đất trồng mồng tơi. Đặc điểm của đất trồng hoa màu là vùng đất khô ráo, đồng thời, trước mỗi vụ trồng hoa màu, lượng tro, phân được sử dụng để bón lót khá nhiều. Chính điều này là nơi tập trung rất nhiều nhóm vi sinh vật hiếu khí có khả năng sản sinh các enzyme ngoại bào giúp phân hủy cơ chất giúp cho quá trình hấp thu của hoa màu tốt hơn. Do đó, việc đánh giá sự hiện diện của các vi sinh vật có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào trong các vùng đất nông nghiệp có ý nghĩa to lớn. Sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi trong đất nông nghiệp ngoài việc giúp cho việc chuyển hóa phân bón thành những dạng dễ hấp thu đối với cây trồng còn chứng minh sự màu mỡ của vùng đất đó. Đây cũng chính là mục tiêu của nghiên cứu. 3.2. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ 3.2.1. Kết quả phân lập Từ 10 mẫu đất nông nghiệp gồm: 5 mẫu đất trồng lúa, 1 mẫu đất trồng bông, 1 mẫu đất trồng mồng tơi, 1 mẫu đất trồng rau dền, 1 mẫu đất trồng quế và 1 mẫu đất trồng tía tô đã phân lập được các chủng vi khuẩn trên môi trường TSA. Kết quả phân lập được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập Nguồn mẫu Ký hiệu Hình dạng khuẩn lạc Đất trồng lúa 1 Đất trồng lúa 2 Đất trồng lúa 3 Đất trồng lúa 4 Đất trồng lúa 5 Đất trồng bông Đất trồng mồng tơi Đất trồng rau dền Đất trồng quế Đất trồng tía tô ĐTL101 ĐTL102 ĐTL201 ĐTL301 ĐTL302 ĐTL401 ĐTL402 ĐTL501 ĐTL502 ĐTB601 ĐMT701 ĐRD801 ĐTQ901 ĐTT111 ĐTT112 Tròn, lồi, bờ đều, vàng, d = 2mm Tròn, dẹt, bờ đều, vàng, d= 3mm Tròn, lồi, nhăn, bờ răng cưa, trắng đục Tròn, lồi, ướt, bờ đều, trong suốt, d< 1mm Tròn, lồi, nhăn, bờ đều, tâm trắng đục, d> 2mm Tròn, lồi, bờ đều, trong suốt, d= 1mm Tròn, lồi, bóng, bờ đều, vàng Tròn, lồi, nhăn, nhớt, bờ răng cưa, trắng đục Tròn, lồi, bờ đều, trong suốt, d> 1mm Tròn, lồi, bóng, ướt, bờ đều, vàng, d= 1mm Tròn, lồi, nhăn, bờ răng cưa, vàng Tròn, lồi, nhăn, nhớt, bờ răng cưa, trắng đục, d= 2mm Tròn, lồi, bóng, bờ răng cưa, tâm vàng, d= 2mm Tròn, lồi, bờ đều, lõm ở giữa, nhăn, trắng đục Tròn, lồi, bóng, bờ đều, trong suốt, d< 1mm
  • 51. Đồ án tốt nghiệp 41 Các khuẩn lạc từ các nguồn mẫu được cấy làm thuần và bảo quản giống ở nhiệt độ -40C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Kết quả định danh sơ bộ Từ 15 chủng vi khuẩn phân lập, tiến hành nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào. Kết quả định danh sơ bộ được trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập Nguồn phân lập Ký hiệu mẫu Gram Hình dạng tế bào Đất trồng lúa 1 Đất trồng lúa 2 Đất trồng lúa 3 Đất trồng lúa 4 Đất trồng lúa 5 Đất trồng bông Đất trồng mồng tơi Đất trồng rau dền Đất trồng quế Đất trồng tía tô ĐTL101 ĐTL102 ĐTL201 ĐTL301 ĐTL302 ĐTL401 ĐTL402 ĐTL501 ĐTL502 ĐTB601 ĐMT701 ĐRD801 ĐTQ901 ĐTT111 ĐTT112 + + + - + + - - + - + - + - + Que ngắn Que ngắn Que dài Que ngắn Que dài Que dài Que dài Que ngắn Que ngắn Que ngắn Hình cầu Hình cầu Que ngắn Hình cầu Hình cầu Từ 10 mẫu đất, đã phân lập được 15 chủng vi khuẩn, trong đó có 9 chủng phân lập từ đất trồng lúa và 6 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu. Khi quan sát đặc điểm tế bào, trong 15 chủng vi khuẩn phân lập có 9 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) và 6 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-). Về hình dạng, có 11 chủng thuộc nhóm trực khuẩn và 4 chủng thuộc nhóm cầu khuẩn (Hình 3.2).
  • 52. Đồ án tốt nghiệp 42 Hình 3.2. Kết quả nhuộm Gram của các chủng vi khuẩn phân lập a) ĐTL201, b) ĐTL402, c) ĐTB601 Kết quả phân lập cho thấy ở đất trồng lúa, mỗi mẫu phân lập được một đến hai chủng vi khuẩn trong khi ở đất trồng hoa màu mỗi mẫu chỉ phân lập được một chủng vi khuẩn. Kết quả này cho thấy sự phân bố của vi khuẩn trong đất trồng lúa đa dạng hơn về số lượng so với trong đất trồng hoa màu. Trong số 15 chủng vi khuẩn phân lập, 9 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa đều thuộc nhóm trực khuẩn trong khi 6 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng hoa màu có 4 chủng thuộc nhóm cầu khuẩn và 2 chủng là trực khuẩn. Kết quả này cho thấy, ở các vùng đất trồng lúa có sự phân bố chủ yếu của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm trực khuẩn, còn trong các vùng đất trồng hoa màu thì có sự phân bố của nhiều dạng vi khuẩn hơn. Theo nghiên cứu của Ntabo và ctv (2010) khi tiến hành phân lập và nghiên cứu đặc điểm chung của các chủng vi khuẩn phân lập từ gò mối và một số vùng đất, sau khi giải trình tự rRNA 16S, đã xác định trong các chủng vi khuẩn phân lập có sự hiện diện của vi khuẩn Gram (+) là Bacillus sp. và Brachybacterium sp.; vi khuẩn Gram (-) là Pseudomonas sp.. Còn kết quả nghiên cứu của Aslim và ctv (2002) khi tiến hành xác định một số tính chất của các chủng vi khuẩn phân lập từ đất cũng cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được là Bacillus. Các vi khuẩn này đều thuộc nhóm trực khuẩn. Kết quả này có sự tương đồng với nghiên cứu hiện tại đối với nhóm vi khuẩn phân lập từ đất. Từ các kết quả này có thể thấy rằng trong các vùng đất, đặc biệt là các vùng đất nông nghiệp có sự hiện diện chủ yếu các nhóm vi khuẩn Gram (+). a) b) c)
  • 53. Đồ án tốt nghiệp 43 Với mục tiêu nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có lợi từ một số vùng đất nông nghiệp, tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng với vi khuẩn chỉ thị của 15 chủng vi khuẩn phân lập. 3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào Các chủng vi khuẩn phân lập sau khi định danh sơ bộ được tiến hành đánh giá khả năng sinh các enzyme ngoại bào, đó là enzyme amylase, cellulase, protease, lipase và một số enzyme khác (catalase, oxidase). Từ đó, đánh giá chung về khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn hiện diện trong đất canh tác nông nghiệp tại huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. 3.3.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase Khả năng sinh enzyme amylase của vi khuẩn được đánh giá dựa trên sự phân hủy tinh bột trong môi trường Starch Agar. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme amylase của 15 chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3. Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập STT Chủng vi khuẩn Hoạt tính amylase STT Chủng vi khuẩn Hoạt tính Amylase 1 ĐTL101 + 8 ĐTL501 ++ 2 ĐTL102 +++ 9 ĐTL502 + 3 ĐTL201 - 10 ĐTB601 ++ 4 ĐTL301 ++ 11 ĐMT701 ++ 5 ĐTL302 - 12 ĐRD801 ++ 6 ĐTL401 - 13 ĐTQ901 ++ 7 ĐTL402 - 14 ĐTT111 ++ 15 ĐTT112 ++ (-): không có khả năng phân giải hoặc đường kính vòng phân giải < 8 mm. (+): Đường kính vòng phân giải từ 8 mm đến 14 mm. (++): Đường kính vòng phân giải từ 15 mm đến 25 mm. (+++): Đường kính vòng phân giải ≥ 25 mm. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 3.3. Dựa vào kết quả này có thể nhận thấy rằng, trong 15 chủng vi khuẩn phân lập, 11 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme
  • 54. Đồ án tốt nghiệp 44 amylase thuỷ phân cơ chất là tinh bột trong môi trường tạo vòng phân giải xung quanh giếng thạch (Hình 3.3). Trong 11 chủng này, có 5 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa (55,55%) và 6 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng hoa màu (100%). Các chủng vi khuẩn ĐTL201, ĐTL302, ĐTL401, ĐTL402 không có khả năng phân giải tinh bột. Trong số 11 chủng vi khuẩn phân hủy tinh bột, chủng ĐTL102 có khả năng phân giải tinh bột mạnh nhất so với các chủng vi khuẩn phân lập còn lại. Chủng ĐTL101 và ĐTL502 có khả năng phân giải tinh bột ở mức trung bình (đường kính vòng phân giải từ 8 – 14 mm). Các chủng còn lại có khả năng phân hủy tinh bột mạnh (cho kết quả vòng phân giải từ 15 mm đến 25 mm). Đặc biệt trong 11 chủng này, 6 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu đều thể hiện khả năng phân hủy tinh bột mạnh thông qua sản xuất enzyme amylase. Kết quả trên cho thấy rằng, các chủng vi khuẩn hiện diện trong đất trồng lúa và đất trồng hoa màu đều có khả năng sinh enzyme amylase nhưng mức độ phân bố của các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme amylase trong đất trồng hoa màu lại phong phú hơn so với trong đất trồng lúa. Hình 3.3. Vòng phân giải tinh bột của các chủng ĐTL101, ĐTL102 và ĐTT112 trên môi trường Starch Agar 3.3.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase Tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase dựa vào sự thuỷ phân cellulose trong môi trường CMC Agar. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase được trình bày ở Bảng 3.4.