TẢI FREE ZALO: 093 457 3149 (NHẬN BÀI NGAY 5 GIÂY). PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
s
NGUYỄN VĂN BỐN
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH
CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
NGUYỄN VĂN BỐN
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH
CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 604230
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng
BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

3. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào
khác.
Người cam ñoan
Nguyễn Văn Bốn

4. LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:
Thầy PGS.TS Nguyễn Anh Dũng ñã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn tôi
trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn này.
Cô TS. Võ Thị Phương Khanh, thầy TS. Ngô Đại Nghiệp ñã có nhiều ý kiến quý
báu ñóng góp, giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Quý thầy cô giáo trường Đại học Tây Nguyên, khoa KHTN và CN, Phòng Đào
tạo Sau ñại học, ban giám hiệu nhà trường ñã tận tình giảng dạy và tạo ñiều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian khoá học.
Các bạn sinh viên: Hạnh, Vui, Cương, Cường, Lữ lớp CN Sinh K07 và Được,
Thảo, Hoài, Danh, Lựu, Ana, Oánh, Luận lớp CN Sinh K08 ñã tham gia tích cực trong
quá trình tôi thực hiện ñề tài này.
Các thầy cô trong bộ môn Sinh học thực nghiệm ñã tạo mọi ñiều kiện về thời
gian, ñộng viên tinh thần cho tôi trong suốt khóa học.
Các anh chị em trong lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K3 ñã ñoàn kết giúp ñỡ,
chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt 3 năm học cao học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc những người thân trong gia ñình: Bố, mẹ, Các
anh trai, các chị dâu, các cháu, vợ và con trai, gia ñình bố mẹ vợ ñã là chỗ dựa vững
chắc cho tôi về tình cảm cũng như vật chất cần thiết giúp tôi có nghị lực ñể công tác,
và phấn ñấu.
Nguyễn Văn Bốn

5. CÁC CHỮ VIẾT TẮT
- HTch: Hoạt tính chung chitinase
- HTr: Hoạt tính riêng chitinase
- [chitin]: Nồng ñộ chitin
- ĐC: Đối chứng
- GlcNAc: N-acetyl glucosamine
- DNS: Acid 3,5 dinitrosalicylic
- UI: ñơn vị hoạt ñộ

6. MỤC LỤC
Mở ñầu
1. Đặt vấn ñề 1
2. Mục tiêu của ñề tài 1
3. Ý nghĩa khoa học 2
4. Ý nghĩa thực tiễn 2
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Tổng quan về chitin và chitinase 3
1.1.1. Chitin 3
1.1.1.1. Cấu tạo chitin 3
1.1.1.2. Phân bố và số lượng 3
1.1.1.3. Đặc ñiểm khác 4
1.1.1.4. Ứng dụng 5
1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) 6
1.2.1. Khái niệm 6
1.2.2. Phân loại chitinase 7
1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử 7
1.2.2.2. Dựa vào trình tự amino acid 7
1.2.2.3. Dựa vào phản ứng phân cắt 9
1.2.3. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 9
1.2.3.1. Chitinase vi khuẩn 9
1.2.3.2. Chitinase nấm 10
1.2.3.3. Chitinase thực vật 10
1.2.3.4. Chitinase ñộng vật 11
1.2.4. Các ñặc tính cơ bản của enzyme chitinase 11
1.2.4.1. Khối lượng phân tử 11
1.2.4.2. Điểm ñẳng ñiện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis 11
1.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ 12

7. 1.2.4.4. Ảnh hưởng của pH 12
1.2.4.5. Chất tăng hoạt, chất ức chế 12
1.2.4.6. Sự ổn ñịnh 14
1.2.5. Các loại cơ chất của enzyme chitinase 14
1.2.5.1. Chitin 14
1.2.5.2. Các dẫn xuất của chitin 14
1.2.6. Cơ chế tác ñộng của các loại enzyme chitinase 15
1.3. Tổng quan về nấm mốc 15
1.3.1. Khái niệm 15
1.3.2. Hình dạng và kích thước 16
1.3.3. Cấu tạo tế bào sợi nấm 17
1.3.4. Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc 17
1.3.5. Vị trí và vai trò của nấm mốc 18
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 19
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nội dung nghiên cứu 23
2.2. Vật liệu và thiết bị 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu 23
2.3.1. Địa ñiểm thu thập mẫu 23
2.3.2. Các loại môi trường 23
2.3.3. Phương pháp phân lập 24
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 24
2.3.5. Xác ñịnh hoạt ñộ chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử
với thuốc thử DNS
25
2.3.6. Phương pháp ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 28
2.3.7. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
28
2.3.8. Nghiên cứu xác ñịnh tác nhân tủa phù hợp 29
2.3.9. Xác ñịnh tính chất cơ bản của chitinase 30
2.3.9. Xử lý số liệu 33
Chương 3. Kết quả và thảo luận

8. 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase tại Đăk Lăk 34
3.2. Tuyển chọn và ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.2. Định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 40
3.3. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
42
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy 42
3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy 43
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy 45
3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 46
3.3.5. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc 48
3.3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 49
3.4. Tác nhân tủa phù hợp cho quá tình tách chiết chitinase từ nấm mốc
Penicillium janthinellum
50
3.5. Xác ñịnh một số tính chất cơ bản của chitinase từ nấm mốc
Penicillium janthinell
52
3.5.1. Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt tính chitinase 52
3.5.2. Xác ñịnh pH tối ưu cho hoạt tính chitinase 53
3.5.3. Xác ñịnh nồng ñộ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase 54
3.5.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 56
3.5.5. Xác ñịnh thời gian phản ứng tối ưu 57
3.5. Tinh sạch chitinase 58
Kết luận và kiến nghị 61
Tài liệu tham khảo 62
Phụ lục 67

9. DANH MỤC BẢNG
Bảng 3 .1. Đặc ñiểm khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk .....34
Bảng 3.2. Hàm lượng ñường khử trong dịch nuôi cấy và hoạt tính chitinase của các
chủng nấm mốc ....................................................................................................37
Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
nồng ñộ chitin khác nhau......................................................................................43
Bảng 3.4. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy bổ sung
các nguồn nitơ khác nhau .....................................................................................44
Bảng 3.5. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
nhiệt ñộ khác nhau ...............................................................................................46
Bảng 3.6. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
pH khác nhau .......................................................................................................47
Bảng 3.7. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
tốc ñộ lắc khác nhau.............................................................................................48
Bảng 3.8. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy trong
các khoảng thời gian khác nhau............................................................................49
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi và hoạt tính chitinase của
nấm mốc Penicillium janthinellum .......................................................................51
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase ..............55
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase.................57
Bảng 3.12. Hàm lượng protein, HTch, HTr trước và sau khi lọc gel.....................59

10. DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của chitin .................................................................................3
Hình 2.1. Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase...............................................25
Hình 2.2. Phản ứng của ñường khử với thuốc thử DNS .......................................25
Hình 3.1. Hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk...............39
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase .........................43
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ ñến hoạt tính chitinase..............................44
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase.....................46
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase ..........47
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến hoạt tính chitinase.................................49
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase.....................49
Hình 3.8. Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi protein và hoạt tính
chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum....................................52
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ phản ứng ñến hoạt tính chitinase....................53
Hình 3.10 . Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính chitinase ........................................54
Hình 3.11 . Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase.......................55
Hình 3.12 . Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase...............56
Hình 3.13 . Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase................57
Hình 3.14 . Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau lọc gel Sephadex..............59
Hình 3.15 . Ảnh hưởng của phương pháp lọc gel tới hàm lượng protein, HTch, HTr
của chitinase ..........................................................................................60
Hình 3.16 . Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau tinh sạch bằng cột chitin ..60
Hình 3.17 . Hình 3.17. Vòng phân giải chitin.......................................................60

11. DANH MỤC ẢNH
Ảnh 3.1 Khuẩn lạc của 34 chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk.........................37
Ảnh 3.2 Hình thái của 3 chủng nấm mốc D4, D9, D31 ........................................41

12. MỞ ĐẦU

13. 1

14. 2

15. 1
1. Đặt vấn ñề
Oligo N – acetyl – Glucosamine (một sản phẩm của quá trình thủy phân chitin)
ñã ñược biết ñến như một loại thuốc quý, một loại thuốc ña hiệu ñược sử dụng ñể
chữa trị nhiều bệnh như: bệnh khớp, bệnh viêm phổi, bệnh viêm dạ dày,...Ngoài ra,
Oligo N- acetyl – Glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và
kháng vi khuẩn [1]. Chính vì có ñặc tính quý như vậy mà việc sản xuất Oligo N –
acetyl – Glucosamine ñang ñược quan tâm.
Oligo N – acetyl – Glucosamine ñược thu nhận bằng cách thủy phân chitin dưới
sự xúc tác của enzyme chitinase. Trong tự nhiên, chitinase có thể ñược tách chiết
từ nhiều nguồn khác nhau: ñộng vật (tuyến tuỵ, và dịch dạ dày cá; dịch ruột của ốc
sên;...), thực vật (mủ cao su, thuốc lá, lúa mì, cà rốt,...), các loài chân khớp
(arthropods) [17]...Tuy nhiên, quy trình thu nhận chitinase từ các nguồn này khá
phức tạp, không thể tiến hành tự ñộng hoá [25][26], do ñó giá thành chế phẩm cao
và cũng không thể ñáp ứng ñủ nhu cầu thực tế .
Trong tự nhiên, còn có một nguồn quý giá và vô tận ñể thu nhận enzyme. Đó
chính là vi sinh vật. Trong số các ñối tượng vi sinh vật, nấm mốc là một nguồn khá
phổ biến ñể thu nhận nhiều loại enzyme, trong ñó có chitinase [25].
Trong nước cũng như trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về
chitinase [13]. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào về phân lập và
sàng lọc các chủng nấm mốc ñể thu nhận chitinase mang tính hệ thống ở khu vực
Tây Nguyên, cụ thể là ở Đắk Lắk ñược công bố trên các tạp chí trong và ngoài
nước. Để góp phần tham gia vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh vật
tại Tây Nguyên, chúng tôi ñề xuất ñề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng
nấm mốc có hoạt tính chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk”.
2. Mục tiêu của ñề tài
- Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải chitin.
- Xây dựng quy trình tách chiết chitinase và xác ñịnh một số tính chất cơ bản
của chitinase tách chiết từ môi trường nuôi cấy nấm mốc.

16. 2
3. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của ñề tài góp phần vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh
vật cụ thể là từ nấm mốc trên ñịa bàn tỉnh Đắk Lắk.
4. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của ñề tài là một số chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao ñược
tuyển chọn. Từ các chủng này, có thể ñưa vào sản xuất chitinase thương phẩm
dùng cho nhiều mục ñích khác nhau hoặc sử dụng trực tiếp các chủng này ñể khảo
sát khả năng ñối kháng với một số nấm bệnh hướng tới tạo chế phẩm sinh học có
hoạt tính kháng bệnh cho cây trồng.

17. 3

18. Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

19. 2

20. 3
Hình 1.1. Cấu trúc của chitin
1.1. Tổng quan về chitin và chitinase
1.1.1. Chitin [17][23]
1.1.1.1. Cấu tạo chitin
Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong ñó C chiếm 47,29%, H
chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Ở dạng tự nhiên, chitin là một
chất rắn màu trắng vô ñịnh hình, dai, có sợi, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương
pháp thu nhận.
Về cấu trúc, chitin (còn gọi là poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)])
là một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D-glucosamine [GlcNAc],
còn gọi là (1->4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose] gắn với nhau bằng liên
kết β-1,4-O-glycoside.
Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, δ. Sự khác nhau này biểu
hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Ở α-chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau, ở β-
chitin thì cùng hướng và ở δ-chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược. Dạng
chiếm nhiều nhất là α-chitin.
1.1.1.2. Phân bố và số lượng
Chitin có mặt ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau. Ở nấm, chitin là thành phần
chính yếu và kết hợp với các hợp chất khác tạo ra thành của khuẩn ty và bào tử
nấm sợi như: Chytridiaceae, Blastodiaceae, Ascomycetes, Basidiomycetes. Ở
những loài ñộng vật không xương sống như: Crustacea (giáp xác), Onychophora
(nhóm có móng), Myriapoda (ña túc) và Arachnida (nhện), chitin ñóng vai trò là

21. 4
bộ xương ngoài dưới dạng phức hợp chitin-protein. Tỉ lệ chitin : protein thông
thường khoảng 55 : 45 và tỉ lệ này thay ñổi trong suốt quá trình phát triển và khác
nhau giữa các loài. Ở Insecta (côn trùng), chitin là vỏ bọc cơ thể và màng bao chất
dinh dưỡng. Ngoài ra, chitin còn có ở tảo lục và nhuyễn thể (Mollusca), trùng ñốt
(Annelida), ruột khoang (Coelenterata-Cnidaria). Ở các loài thực vật, chitin và
ñường amin ñóng vai trò không quan trọng trong quá trình trao ñổi chất hay về cấu
trúc hình thái.
Về số lượng, chitin là một trong ba loại polysaccharide phong phú nhất
trong thiên nhiên (cellulose, tinh bột và chitin). Chitin ñứng ở vị trí thứ hai sau
cellulose. Chitin và cellulose tương ứng với nhau về nhiều ñiểm về cấu tạo và chức
năng. Về chức năng, chúng ñều là những polysaccharide cấu trúc. Về cấu trúc
phân tử, chitin có cấu trúc tương tự cellulose ngoại trừ nhóm -OH ở C2 ñược thay
thế bằng một nhóm acetylamine. Chitin có thể thay thế một phần hay toàn bộ
cellulose hoặc glucan trong thành tế bào nấm và vài loại tảo.
1.1.1.3. Đặc ñiểm khác
Chitin không tan trong nước, dung dịch kiềm loãng và thuốc thử Schweitzer.
Chitin có thể tan trong một số dung dịch như HCl ñậm ñặc, HNO3, acid fomic khan
và một số muối trung tính. Nếu ñun nóng chitin trong dung dịch kiềm mạnh, một
phần nhóm N-acetyl bị khử (deacetyl hóa) tạo thành chitosan. Ngược lại, trong
dung dịch HCl ñậm ñặc, quá trình thủy phân chitin xảy ra ở các nối β-1,4-
glycoside làm [α]D từ -14o
dần ñổi sang +56o
, sau ñó là sự thay ñổi ở các nhóm
acetyl. Độ nhớt của chitin trong dung dịch acid nitric là 14,3.10-3
ñối với chitin
nguyên chất từ vỏ cua, 13,1.10-3
ñối với chitin từ nấm. Các giá trị này xấp xỉ như
nhau chứng tỏ khối lượng của chúng gần như nhau.
Trong việc ñịnh tính cũng như so sánh chitin từ những nguồn thực vật, ñộng
vật khác nhau, phương pháp nhiễu xạ tia X có lẽ là phương pháp vật lý duy nhất có
ý nghĩa và có giá trị. Trong khi ñó, các phương pháp ñịnh lượng chitin ñều có ñộ
chính xác giới hạn, những ñiều kiện cần thiết cho việc tinh chế chitin có khả năng
làm thay ñổi polysaccharide này, vì vậy khó ñạt ñược chitin tinh khiết. Ngoài ra,

22. 5
người ta có thể tạo thành chitin từ Uridin-diphosphate-N-acetyl-D-Glucosamine
nhờ enzyme chitin synthetase (EC 2.4.1.16) ly trích từ nấm.
1.1.1.4. Ứng dụng
Với kỹ thuật chế biến hiện ñại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một tiềm
năng to lớn ñặc biệt là trong các lĩnh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế biến
thực phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm.
Chitin có thể ứng dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm, tạo ñộ bền dai cho
thực phẩm thay thế một số chất không cho phép (như hàn the…). Chitin làm chất
mang trong cố ñịnh enzyme hay cố ñịnh tế bào, làm chất mang tạo các giá thể
trồng cây cảnh. Còn chitosan, dẫn xuất của chitin, có ñộ bền dai, ñàn hồi, có thể tạo
thành các màng mỏng gần như trong suốt, sử dụng các màng chitosan ñể bảo quản
các loại trái cây, làm màng bao thuốc, màng bao thực phẩm (thịt nguội, lạp
xưởng…) còn làm nguyên liệu ñể cố ñịnh enzyme hay cố ñịnh tế bào vi sinh vật.
Chitosan ñược ñánh giá cao trong hàng loạt những ứng dụng trong y học như: băng
bó và làm lành vết thương, màng thẩm tích, chỉ khâu vết thương tự tiêu huỷ, nhân
tố ổn ñịnh liposome, diệt vi khuẩn, diệt virus, chống ung thư, chất làm giảm lượng
cholesterol trong máu, chất kích thích của hệ thống miễn dịch.
Sự phân hủy tự nhiên của chitin rất quan trọng không chỉ trong chu trình
tuần hoàn của carbon và nitơ mà còn tạo ra các chất phản ứng hóa học quan trọng.
Các ñơn phân của chitin và chitosan là N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) và
glucosamine, là những tác nhân chữa bệnh viêm khớp xương mãn tính, viêm ruột
và viêm dạ dày. Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng có hoạt tính kháng khối
u, kháng nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên glycolipid và glycoprotein có
vai trò quan trọng trong sinh học và nhiều ứng dụng khác.
Hàng ngàn bài báo về chitin và các dẫn xuất của chúng ñã ñược xuất bản
cùng với khoảng gần 200 bằng sáng chế ñã ñược lưu hành tại Mỹ. Các công trình
nghiên cứu và bằng sáng chế về các chế phẩm này cũng ñã xuất hiện ở nhiều nước
trên thế giới. Các nhà khoa học từ hàng chục nước trên thế giới trong ñó có Mỹ và
Nga ñã tập trung lại 3 năm một lần ñể trao ñổi các bài báo, nghiên cứu khoa học
mới nhất về chitin và các dẫn xuất của chúng. Những ñiều ñó cho thấy chitin và

23. 6
các dẫn xuất của chúng rất ñược quan tâm trên thế giới vì khả năng ứng dụng rất
rộng cùng với những ñặc tính ñặc biệt của chúng.
Hàng năm chitin ñược sản xuất ra khoảng 5.11 triệu tấn trên toàn thế giới.
Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chitin lớn nhất. Ở Việt Nam, chitin chủ yếu là
phế phụ liệu dạng rắn với số lượng khổng lồ ñược thải ra hằng ngày từ ngành công
nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản. Vỏ của tôm (tôm hùm, tôm thẻ), cua và
các loài giáp xác trên biển là nguồn cung cấp chitin tốt nhất. Trong vỏ tôm cua,
chitin chiếm từ 20-50% khối lượng khô, khoảng 12% trong tôm nước ngọt, còn lại
là các chất vô cơ, chủ yếu là carbonate calci. Nếu tận dụng ñược nguồn cung cấp
chitin này thì vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường, vừa tạo thành các sản phẩm thực
sự có giá trị [4].
1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) [17][23][25][26]
1.2.1. Khái niệm
Chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các N-acetylglucosamine,
chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy phân liên kết β-1,4-glycoside
giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên kết với nhau trong chitin.
Enzyme này có ở nhiều loài khác nhau như thực vật, ñộng vật không xương
sống, côn trùng, chân khớp, nấm, vi khuẩn và virus. Chân khớp và nấm cần
chitinase trong sự phân chia tế bào ñể tăng trưởng. Chitinase ñược tạo thành trong
suốt quá trình sinh trưởng của nấm. Đối với nấm mốc, chitinase tham gia nhiều
chức năng như phân giải thành tế bào, nảy mầm bào tử, phát triển khuẩn ty và tự
phân khuẩn ty, biệt hóa bào tử, ñồng hóa chitin và ký sinh.
Ở vi khuẩn, chitinase ñược tạo ra ñể sử dụng chitin làm nguồn carbon và
năng lượng. Ở thực vật, chitinase là một thành phần của phản ứng chống lại sự
xâm nhiễm và stress, phối hợp hoạt ñộng với các protein phòng vệ khác.
Chitinase thương phẩm có giá rất ñắt, ñặc biệt là chitinase tinh sạch. Vì vậy
việc sử dụng chitinase thô trở nên phổ biến, thú vị hơn trong việc sản xuất GluNAc
và các oligomer có nguồn gốc từ chitin.

24. 7
1.2.2. Phân loại chitinase
1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử
Chitinase ñược sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme thủy phân ñường):
- Họ glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu
trúc xác ñịnh gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, ñược tìm thấy ở nhiều loại sinh vật như vi
khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là
enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase
và N-acetylglucosamineidase. Trong họ này, chitinase từ các prokaryote chỉ có 2
motif trình tự ngắn ñược bảo tồn cao (bao gồm 1 gốc acid glutamic ñược bảo tồn)
giống với enzyme của eukaryote (10% của toàn bộ các gốc giống nhau). Tuy
nhiên, cả 2 loại chitinase ñều có cùng domain xúc tác barrel (βα)8. Trong cả 2
enzyme, rãnh gắn cơ chất ñều nằm ở ñầu C của sợi trong cấu trúc barrel (βα)8 và
gốc acid glutamic cho proton xúc tác có 1 vị trí tương ñương. Không giống với các
glycoside hydrolase khác, chitinase họ 18 có cơ chế phản ứng bất thường bao gồm
việc tác ñộng lên nhóm N-acetyl của cơ chất trên nguyên tử C anomer. Việc này
dẫn ñến việc tạo ra chất trung gian bao gồm vòng pyranose của glucosamine kết
hợp với vòng 5 oxazoline.
- Họ glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở
thực vật như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), ñậu Hà Lan
(Pisum sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn
Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme
(EC 3.2.1.17) của ñộng vật và phage, bao gồm motif cuộn α+β và hoạt ñộng thông
qua cơ chế nghịch chuyển.
Thực vật và vi sinh vật như Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong khi
côn trùng và hầu hết sinh vật khác chỉ tạo chitinase thuộc họ glycohydrolase 18.
1.2.2.2. Dựa vào trình tự amino acid
Dựa vào trình tự ñầu amin (N), sự ñịnh vị của enzyme, ñiểm ñẳng ñiện, peptid
nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:
- Nhóm I: là những ñồng phân enzyme trong phân tử có vùng ñầu N giàu
cysteine chứa khoảng 40 amino acid (giống với vùng ñầu N ở hevein và các

25. 8
enzyme khác có ái lực ñối với chitin hay N-acetylglucosamine) nối với tâm xúc tác
thông qua một ñoạn giàu glycin hoặc prolin ở ñầu carboxyl (C)(peptid nhận biết).
Vùng giàu cysteine có vai trò quan trọng ñối với sự gắn kết enzyme và cơ chất
chitin nhưng không cần cho hoạt ñộng xúc tác. Các vùng gắn chitin này không phải
luôn ñóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường hoạt tính xúc tác enzyme mà
chúng cần ñể tạo các ñặc tính sinh học riêng biệt cho chitinase ở nhiều loài khác
nhau. Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở ñầu C giúp ñịnh vị chitinase trên thành tế
bào nấm men, ñóng vai trò trong việc phân tách tế bào mẹ khỏi các tế bào chị em.
Ở thuốc lá và nhiều loài thực vật khác, các chitinase này nằm trong không bào và
ñược cảm ứng từ sự nhiễm nấm, vi khuẩn hay virus. Chitinase nhóm I của thuốc lá
có vùng ñầu C giàu cystein ñóng vai trò là vùng gắn chitin.
- Nhóm II: là những ñồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác có
trình tự amino acid tương tự ở chitinase nhóm I, thiếu ñoạn giàu cysteine ở ñầu N
và peptid nhận biết ở ñầu C. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn.
Chúng ñược cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Ở thực vật, các protein nhóm II
thuộc loại protein kháng bệnh và ñược tế bào tiết ra dưới nhiều ñiều kiện stress
khác nhau.
- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II,
nhưng rất giống về trình tự với lysozyme ở Hevea brasiliensis, vì thế chúng mang
hoạt tính lysozyme. Ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein kháng bệnh
và ñược tiết ra ngoại bào.
- Nhóm IV: là những ñồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-
47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I và
khá giống với chitinase vi khuẩn. Trong phân tử cũng có ñoạn giàu cysteine nhưng
kích thước phân tử nhỏ hơn ñáng kể so với chitinase nhóm I.
- Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cysteine) có thể ñã giảm ñi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao.

26. 9
1.2.2.3. Dựa vào phản ứng phân cắt
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-
chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosamineidase (exochitinase) và chitobiase.
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo
các ñoạn oligosaccharide, ñã ñược nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy
nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1=36kDa, pI1=5,3±0,2
và M2=40kDa, pI2=3,9), Gliocladium virens (M=41kDa, pI=7,8).
Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin (exochitinase) từ ñầu
không khử tạo thành các sản phẩm chính là các chitobiose, cụ thể enzyme này
ñược thu từ Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2).
N-acetyl-β-D-glucosamineidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) là enzyme
phân cắt chitin từ một ñầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-
glucosamine.
Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 ñơn phân N-acetyl-D-
glucosamine.
Ngoài ra, ñối với chitosan - dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, chitosanase (EC
3.2.2.132) xúc tác thủy phân chitosan tạo thành các oligosaccharide tương ứng.
1.2.3. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase
1.2.3.1. Chitinase vi khuẩn
Vi khuẩn sản sinh enzyme chitinase nhằm ñáp ứng nhu cầu dinh dưỡng.
Chúng thường tổng hợp nhiều loại chitinase ñể có thể phân cắt ñược các loại chitin
ña dạng trong tự nhiên. Như vậy, chitinase vi khuẩn ñóng vai trò quan trọng trong
chu trình chitin trong tự nhiên.
Enzyme chitinase ñược tìm thấy trong vi khuẩn: Chromobacterium,
Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và ñặc biệt là ở nhóm
Streptomycetes.
Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy
nhiên trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta ñều cho thêm chitin-cơ
chất của enzyme chitinase ñể làm tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase, ñồng
thời ổn ñịnh hoạt tính enzyme chitinase sau quá trình chiết tách. Vi khuẩn tổng hợp

27. 10
enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường tạo nguồn carbon cho vi
khuẩn sinh trưởng, phát triển.
1.2.3.2. Chitinase nấm
Chitinase cũng ñược tạo ra bởi các loài nấm sợi. Các chủng nấm mốc cho
enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, … ñặc biệt là ở
các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus …
Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng ñóng vai trò quan
trọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt ñộng của chúng rất linh hoạt trong
quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành
phần chính của vách tế bào nấm.
1.2.3.3. Chitinase thực vật
Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enzyme chitinase như: cao su (Hevea
brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa, lúa mì, lúa mạch (Hordeum vulgare), lúa
mạch ñen, cà rốt, bắp cải, bắp, khoai tây, ñậu Hà Lan, ñậu nành, củ từ … và ñặc
biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase. Chitinase thực
vật tồn tại chủ yếu ở các mô nhất ñịnh hoặc cơ quan sinh sản như hạt giống, củ,
hoa và ñược cảm ứng bởi côn trùng và các tác nhân gây hại trên thực vật. Bên
trong tế bào thực vật, chitinase nằm trong không bào cùng với các enzyme chống
bệnh khác. Ví dụ các endochitinase mang tính base trong lá ñậu tập trung trong
không bào và có chứa hầu hết các hoạt tính chitinase nội bào. Nhờ vậy, không bào
thực vật ñược xem tương tự như tiêu thể ở ñộng vật. Bởi vì bản thân thực vật
không có chứa cơ chất của những enzyme phân giải như chitinase và β-1,3-
glucanase, sự tồn tại của những enzyme này cho thấy chúng có vai trò kháng
khuẩn, kháng nấm ký sinh gây bệnh và cả côn trùng.
Các protein kháng khuẩn (pathogenesis-related protein) khác nhau ñược
phân lập từ thực vật bao gồm thionin, protein bất hoạt ribosome, defensin, nsLTP
và các enzyme phân giải như β-1,3-glucanase và chitinase. Nhiều chitinase, giống
như các protein khác ñóng vai trò bảo vệ, có thể chịu ñược các protease ngoại bào,
hoặc mang tính acid hoặc mang tính base (thông thường các protein mang tính acid
ñược tiết vào apoplast hoặc môi trường ngoại bào, trong khi dạng base thường tập

28. 11
trung nội bào trong các không bào). Trình tự của các chitinase acid giống với các
chitinase base, chỉ khác ở chỗ chúng không có vùng ñầu N hevein.
Xét về ñặc tính phân cắt, chitinase thực vật thường là endochitinase phân cắt
ngẫu nhiên. Một số chitinase thực vật có hoạt tính lysozyme cắt liên kết β-1,4 giữa
acid N-acetylmuramic và các gốc N-acetylglucosamine trong peptidoglycan. Ví dụ
như chitinase phân lập từ ñu ñủ, Rubus hispidus và Parthenocissus quinquefolia.
1.2.3.4. Chitinase ñộng vật
Từ một số ñộng vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu
hóa của nhiều loài ñộng vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân
ñốt (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận ñược
enzyme chitinase. Đối với ñộng vật có xương sống, enzyme chitinase ñược tiết ra
từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dung
dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ.
Ngoài ra, enzyme chitinase còn ñược thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn
trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân ñốt vào thời
ñiểm thay vỏ, lột da. Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài
(cuticle) trong quá trình biến thái hay lột xác.
1.2.4. Các ñặc tính cơ bản của enzyme chitinase
1.2.4.1. Khối lượng phân tử
Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có khối lượng
phân tử khoảng 25-40kDa [23]. Một số chitinase có khối lượng phân tử khoảng 40-
90kDa. Enzyme chitinase của các loài thân mềm, chân ñốt, ñộng vật có xương (cá,
lưỡng cư, thú) có khối lượng phân tử cao hơn, khoảng 120kDa. Khối lượng phân tử
của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến ñổi rộng, từ 30
ñến 120kDa. Một số enzyme chitinase có khối lượng phân tử thấp có thể ñược tạo
ra từ một enzyme lớn hơn bằng cách phân cắt một phần protein.
1.2.4.2. Điểm ñẳng ñiện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis
Enzyme chitinase có giá trị pI thay ñổi rộng: 3,0-10,0 ở thực vật bậc cao và
tảo, 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá, 3,5-8,8 ở vi sinh vật.
Hệ số hấp thu E280mg/ml=1,24; phổ hấp thu chỉ là bước sóng ñơn 280nm.

29. 12
Hằng số Michaelis: 0,010-0,011 (g/100ml).
1.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ
Nhìn chung, nhiệt ñộ tối ưu cho enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt ñộng là
40o
C, ngoại trừ Aspergillus niger tổng hợp enzyme chitinase hoạt ñộng trên cơ chất
là glycol chitin có nhiệt ñộ tối thích là 50o
C. Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu
nhận mà enzyme chitinase có thể có những nhiệt ñộ tối ưu khác nhau. Thí dụ, nhiệt
ñộ tối ưu của chitinase từ khoai tây ngọt là 25o
C [12]. Ở các enzyme từ củ từ
Diosscorea opposita THUNB nhiệt ñộ tối ưu là 45-70o
C [5].
Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và các chitinase từ Bacillus
licheniformis phân lập trong suối nước nóng cho thấy có khả năng chịu ñựng nhiệt
ñộ cao ñến 80o
C. Mặt khác, chitinase từ côn trùng (tằm…) không ổn ñịnh ở nhiệt
ñộ 40o
C vì côn trùng phát triển ở nhiệt ñộ 25o
C. Do ñó, nhiệt ñộ tối ưu của enzyme
chitinase côn trùng không cao.
1.2.4.4. Ảnh hưởng của pH
pH tối ưu của enzyme chitinase từ 4-9 ñối với các chitinase ở thực vật bậc
cao và tảo, enzyme chitinase ở ñộng vật có vú là 4,8-7,5 và ở vi sinh vật là 3,5-8,0.
Theo các nhà khoa học, pH tối thích của enzyme chitinase có thể có sự phụ
thuộc vào cơ chất ñược sử dụng. Đa số các enzyme chitinase ñã ñược nghiên cứu
có pH tối thích khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin, enzyme chitinase của
Streptomyces grieus có pH tối thích khoảng 6,3, giá trị này ở khoai tây ngọt
Ipomoea batatas là 5,0. Ở các enzyme từ củ từ Diosscorea opposita THUNB pH
tối ưu là 3,5-4,0. Tùy mục ñích phân tích, những cơ chất hòa tan như glycol chitin
và N-acetyl-chitooligosaccharide ñược sử dụng thay thế cho chitin. pH tối ưu của
enzyme chitinase khi cơ chất là glycol chitin thuộc khoảng pH kiềm yếu. Hoạt tính
enzyme chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH<4,5, ngoại trừ chitinase trong dạ
dày của ñộng vật có xương sống vẫn hoạt ñộng ở pH 3,0.
1.2.4.5. Chất tăng hoạt, chất ức chế
- Allosamidin
Allosamidin là một pseudotrisaccharide gồm 2 ñơn vị N-acetylallosamin gắn
với nhau nhờ liên kết β-1,4 và một nhóm allosamizoline. Nhóm allosamizoline

30. 13
tương tự như chất trung gian phản ứng oxocarbonium, cấu tạo bao gồm 1
cyclopentane và một vòng aminooxazoline. Về cấu tạo, allose chỉ khác glucose ở
C3 trong ñó nhóm hydroxyl nằm thẳng trong allose và nằm ngang trong glucose.
Allosamidin là chất ức chế chitinase ñầu tiên ñược phân lập từ khuẩn ty của
Streptomyces sp. No.1713. Allosamidin và những dẫn xuất của nó ức chế enzyme
chitinase ñược tổng hợp từ tằm, tôm he và một số vi sinh vật (Piromyces
communis, Streptomyces sp và Streptomyces olivaceoviridis). Ngoài ra,
allosamidin cũng ñược phát hiện có khả năng gắn kết với các enzyme chitinase
thực vật như hevamine và ức chế các enzyme chitinase thực vật (ña số thuộc họ
Glycohydrolase 18). Điển hình nó ức chế chitinase H ở cây củ cải với ID 50 (liều
lượng 50% chất ức chế là 44,7µM). Nói chung, allosamidin ức chế mạnh chitinase
họ 18 và không ức chế protein lòng trắng trứng gà hay lysozyme người.
Về cơ chế ức chế, allosamidine ức chế chitinase theo cơ chế cạnh tranh
nhóm allosamizoline gắn vào tâm của trung tâm hoạt ñộng chitinase, giả làm chất
trung gian phản ứng oxocarbonium nằm giữa C1 của N-acetyl-D-glucosamine và
oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2 trong quá trình thủy giải. Trong ñó ñiện tích
dương ở C1 ñược ổn ñịnh bằng oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2.
Allosamidin khá ñắt và khó tổng hợp. Mặc dù các oligomer carbohydrate và
những dẫn xuất của chúng có thể dùng ñể thiết kế chất ức chế glycoside hydrolase,
chúng thường khó tổng hợp và quá lớn ñể ñi qua màng tế bào.
- Các ion kim loại
Các ion kim loại Hg2+
, Ag+
là những chất ức chế. Đối với ion Cu+
, có 2 dạng
enzyme chitinase: một bị ức chế và một ñược tăng cường nhờ Cu2+
ñược tìm thấy ở
một số loài cá và vi sinh vật như Pseudomonas aeruginosa.
- Các chất khác
Dipeptide CI-4 [cyclo-(L-Arg-D-Pro)] là một sản phẩm tự nhiên ñược tổng
hợp từ vi khuẩn nước mặn Pseudomonas IZ208. CI-4 ức chế việc phân tách tế bào
Saccharomyces cerevisiae và ngăn cản sự tạo khuẩn ty của nấm bệnh Candida
albicans ở người. Về cơ chế, CI-4 ức chế chitinase họ 18 vì chúng có cấu trúc
giống chất trung gian phản ứng. Các chất ức chế chitinase họ 18 có ảnh hưởng ñến

31. 14
chu trình sống của nhiều loại nấm và ngăn cản sự truyền ký sinh trùng sốt rét
(Plasmodium falciparum) từ vật chủ ñến côn trùng.
2 peptide ức chế glycoside hydrolase khác là argifin và argadin có thể ức
chế chitinase ở nồng ñộ nano hay micro mole. Các peptide này gắn trực tiếp lên
các gốc ở tâm hoạt ñộng của enzyme và chiếm các vị trí -1, +1 và +2. mặc dù
những chất ức chế này là peptide nhưng chúng có nhiều nhánh bên bất thường như
acetyl hay vòng thơm.
Ngược lại, huyết thanh albumin có vai trò làm tăng hoạt ñộng của enzyme
chitinase nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ ñầu của phản ứng.
1.2.4.6. Sự ổn ñịnh
Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn ñịnh trong trạng thái ñông lạnh
khoảng 2 năm. Sự ổn ñịnh của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ chất
là chitin. Chúng bị khử hoạt tính nhanh chóng ở 37o
C trong trường hợp không có
mặt chitin. Chu kỳ bán hủy ở 37o
C là 40 ngày và ở 5o
C là 230 ngày. Enzyme
chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 20o
C là k=0,145/h.
1.2.5. Các loại cơ chất của enzyme chitinase
1.2.5.1. Chitin
Cơ chất chủ yếu của enzyme chitinase là chitin. Ở lớp vỏ côn trùng và giáp
xác, chitin ñược gắn kết với protein. Trong một vài trường hợp, lớp biểu bì này
ñược làm cứng bởi các liên kết chéo với polysaccharide khác (cellulose, mannan,
glucan…). Ngoài ra, chitin cũng có cấu trúc liên hệ với murein, cấu trúc polymer
hiện diện ở vách tế bào vi khuẩn.
1.2.5.2. Các dẫn xuất của chitin
Enzyme chitinase có thể tác ñộng lên một số dẫn xuất của chitin như glycol-
chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfate, 4-methylumbellferyl-tri N-
acetylchitotrioside (MUC-phát huỳnh quang).
Enzyme chitinase không hoạt ñộng trên các cơ chất: chitin nitrat, cellulose,
hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin.

32. 15
1.2.6. Cơ chế tác ñộng của các loại enzyme chitinase
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và
chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có khối lượng phân
tử khác nhau, nhưng chiếm ña số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính
endochitinase không thể phân cắt thêm ñược nữa. Hầu hết chitinase thuộc loại này.
Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp
lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n≥3] từ ñầu không khử và chỉ phóng thích
diacetylchitobiose (GlcNAc)2.
β-N-acetylhexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách
liên tục từ ñầu không khử và chỉ phóng thích các ñơn phân N-acetylglucosamine.
Ngoài ra, ñể khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-
chitooligosaccharide làm cơ chất. Các oligosaccharide thường ñược thủy phân bên
trong trên một vài vị trí xác ñịnh hoặc một cách ngẫu nhiên. Một số enzyme
chitinase có khả năng thủy phân trisaccharide, một số khác thì không. Cũng có 2
dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharide
và trisaccharide, một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharide và
tetrasaccharide. Tóm lại, chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên.
1.3. Tổng quan về nấm mốc [4]
1.3.1. Khái niệm
Nấm mốc (fungus) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế bào
không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu
tạo chủ yếu là chitin, có hay không có celuloza và một số thành phần khác có hàm
lượng thấp. Nấm học (Mycology) ñược khai sinh bởi nhà thực vật học người Ý tên
là Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova
Plantarum Genera) nhưng theo Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên
cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794 - 1874). Theo Elizabeth Tootyll (1984)
nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài ñược mô tả, tuy nhiên, ước tính có
trên 100.000 ñến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái ñất. Nhiều loài nấm mốc có
khả năng ký sinh trên nhiều ký chủ như ñộng vật, thực vật, ñặc biệt trên con người,
cây trồng, vật nuôi, sản phẩm sau thu hoạch chưa hoặc ñã qua chế biến, bảo quản.

33. 16
Một số là tác nhân gây bệnh, làm hư các thiết bị thủy tinh bảo quản không tốt nhưng
cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp ra acit hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin,
kích thích tố tăng trưởng thực vật ñã ñược ñưa vào sản xuất công nghiệp và có một
số nấm ñược dùng làm ñối tượng nghiên cứu về di truyền học. Nấm nói chung và vi
sinh vật thuộc một giới riêng biệt. Nấm mốc có chung 7 ñặc ñiểm sau ñây:
+ Cơ thể nấm là một tản (thalus) tức là một cơ thể có bộ máy dinh dưỡng chưa
phân hóa thành các cơ quan riêng biệt. Tản có thể ñơn bào hoặc ña bào , ña số có
dạng sợi gọi là sợi nấm hay khuẩn ty, sợi nấm có thể có hoặc không có vách ngăn.
+ Các vách ngang ở sợi nấm ngăn vách ñều có lỗ thông. Tùy loại nấm mà lỗ
thông có thể là 1 lỗ thông khá lớn ở chính giữa hoặc là có nhiều lỗ thông tương
ñối nhỏ.
+ Nấm có rất nhiều ñiểm chung với các sinh vật có nhân thật nhất là về cấu
tạo của nhân. Nấm khác hẳn cấu tạo với các vi sinh vật thuộc nhóm nhân nguyên
thủy như vi khuẩn và vi khuẩn lam.
+ Nấm có những ñặc ñiểm riêng biệt về mặt hóa học tế bào. Nấm không có
cấu trúc thống nhất giữa các nhóm về thành phần thành tế bào. Chỉ có một số ít
nấm chứa cellulose trong thành tế bào. Chất dự trữ của nấm không phải là tinh bột
mà là glycogen như ở ñộng vật.
+ Nấm không chứa diệp lục vì thế chúng chỉ có thể sống hoại sinh, kí sinh
hoặc cộng sinh.
+ Nấm sinh sản bằng bào tử vô tính và bào tử hữu tính.
+ Nấm không có một chu trình phát triển chung.
1.3.2. Hình dạng và kích thước
Đa số nấm có hình sợi (filamentous fungi - nấm sợi), sợi có ngăn vách (ña
bào) hay không có ngăn vách (ñơn bào). Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có
kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm,
có khi ñến 10µm, thậm chí ñến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục
centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi
nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ
sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông. Trên môi trường ñặc và trên một số

34. 17
cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một ñoạn sợi nấm có thể phát
triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất ñịnh gọi là khuẩn lạc nấm.
1.3.3. Cấu tạo tế bào sợi nấm
Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạch khác.
Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có celluloz. Chitin là
thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina.
Những vi sợi chitin ñược hình thành nhờ vào enzim chitin synthase.
Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nội chất (endoplasmic reticulum),
không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid),
ñặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực
vật. Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribô thể (ribosomes) và những thể khác chưa rỏ
chức năng.
Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một
loại sắc tố ñặc trưng mà Matsueda (1978) ñầu tiên ly trích ñược và gọi là
neocercosporin (C2H26O10) có màu tím ñỏ ở nấm Cercosporina kikuchi.
Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân. Nhân của
tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng ñôi, bên trong màng nhân chứa
RNA, phospholipid và protein dầy 0,02µm.
1.3.4. Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc
Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng. Tuy
nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950).
Nhiệt ñộ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 20o
C ñến 50o
C, tối hảo từ 22o
C ñến
27o
C và nhiệt ñộ tối ña mà chúng có thể chịu ñựng ñược là 35o
C ñến 40o
C, cá biệt
có một số ít loài có thể sống sót ở 0o
C và ở 60o
C. Nói chung, nấm mốc có thể phát
triển tốt ở môi trường acid (pH 6) nhưng pH tối ưu là 5 – 6.5, một số loài phát triển
tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967).
Oxy cũng cần cho sự phát triển của nấm mốc vì chúng là nhóm hiếu khí bắt
buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và dĩ nhiên nước là yếu tố cần
thiết cho sự phát triển.

35. 18
Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cần ñược cung cấp dinh dưỡng từ
bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh
(sống ký sinh trong cơ thể ñộng vật hay thực vật) hay hoại sinh (saprophytes) trên
xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay ñịa y sống cộng sinh với nhóm thực vật
nhất ñịnh.
Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho
nấm ñược xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, Bo, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và
Ca. Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ ñơn giản như
muối ammonium... sẽ ñược nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ
phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp ñể cắt các
ñại phân tử này thành những phân tử nhỏ ñể dễ hấp thu vào trong tế bào.
1.3.5. Vị trí và vai trò của nấm mốc
Nấm mốc có ảnh hưởng xấu ñến cuộc sống con người một cách trực tiếp
bằng cách làm hư hỏng, giảm phẩm chất lương thực, thực phẩm trước và sau thu
hoạch, trong chế biến, bảo quản. Nấm mốc còn gây hư hại vật dụng, quần áo... hay
gây bệnh cho người, ñộng vật khác và cây trồng. Tuy nhiên, các qui trình chế biến
thực phẩm có liên quan ñến lên men ñều cần ñến sự có mặt của vi sinh vật trong ñó có
nấm mốc. Nấm mốc cũng giúp tổng hợp những loại kháng sinh (penicillin,
griseofulvin), acid hữu cơ (oxalic acid, citric acid, gluconic acid...), vitamin nhóm B,
kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), một số enzyme và các hoạt chất khác
dùng trong công nghiệp thực phẩm và y dược,... ñã ñược sử dụng rộng rãi trên thế
giới. Ngoài ra, nấm còn giữ vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơ trả lại
ñộ mầu mỡ cho ñất trồng.
Một số loài thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh trên người,
Microsporum gây bệnh trên chó, Aspergillus fumigatus gây bệnh trên chim;
Saprolegnia và Achlya gây bệnh nấm ký sinh trên cá. Những loài nấm gây bệnh trên
cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora.... ñặc biệt nấm Aspergilus flavus
và Aspergillus fumigatus phát triển trên ngũ cốc trong ñiều kiện thuận lợi sinh ra ñộc
tố aflatoxin.

36. 19
Bên cạnh tác ñộng gây hại, một số loài nấm mốc rất hữu ích trong sản xuất và
ñời sống như nấm ăn, nấm dược phẩm (nấm linh chi, Penicillium notatum tổng hợp
nên penicillin, Penicillium griseofulvum tổng hợp nên griseofulvin...), nấm
Aspergillus niger tổng hợp các acit hữu cơ như acit citric, acit gluconic, nấm
Gibberella fujikuroi tổng hợp kích thích tố gibberellin và một số loài nấm thuộc nhóm
Phycomycetina hay deuteromycetina có thể ký sinh trên côn trùng gây hại qua ñó có
thể dùng làm thiên ñịch diệt côn trùng. Ngoài ra, những loài nấm sống cộng sinh với
thực vật như Nấm rễ (Mycorrhizae), giúp cho rễ cây hút ñược nhiều hơn lượng phân
vô cơ khó tan và cung cấp cho nhu cầu phát triển của cây trồng.
Nấm còn là ñối tượng nghiên cứu về di truyền học như nấm Neurospora crassa,
nấm Physarum polycephalum dùng ñể tổng hợp DNA và những nghiên cứu khác.
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Trên thế giới ñã có rất nhiều công trình nghiêng cứu về chitinase với nhiều
mức ñộ và lĩnh vực ứng dụng:
Nhiều công trình nghiên cứu về tách chiết và tinh sạch chitinase từ nhiều
nguồn khác nhau ñã ñược công bố như Izabela S. Santos và cộng sự (2004) ñã
tách chiết, tinh sạch và xác ñịnh tính chất của chitinase thu nhận từ hạt
Adenanthera pavonina. L [29]; Wen-Chi Hou và cộng sự (1998) ñã nghiên nghiên
cứu hoạt tính chitinase của khoai lang Ipomoea batatas [L.] Lam var. Tainong57
[30]; Xiuyun Ye, Tzi Bun Ng (2005) nghiên cứu chitinase tách chiết từ ñậu (mung
bean) với hoạt tính kháng nấm [31]; Woo-Jin Jung và cộng sự (2006) nghiên cứu
tinh sạch và xác ñịnh tính chất của exo-B-glucosaminidase từ Aspergillus
fumigatus S-26 [32]; Jayme A. Souza-Neto và cộng sự (2003) cũng ñã nghiên cứu
hoạt tính chitinase trong ấu trùng muỗi [33],...
Vấn ñề tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính chitinase cao và tối ưu
môi trường cũng như ñiều kiện nuôi cấy chúng ñể thu nhận chitinase ñã ñược nhiều
nhà khoa học quan tâm nghiên cứu: El-Katatny và cộng sự (2000) ñã nghiên cứu
sản xuất chitinase và B-1,3-glucanase từ Trichoderma harzianum ñể kiểm soát nấm
Sclerotium rolfsii [34]; N.N. Nawani, B.P. Kapadnis (2005) ñã nghiên cứu tối ưu
sản xuất chitinase bằng phương pháp dùng thống kê dựa trên thiết kế thực nghiệm

37. 20
[35]; Parameswaran Binod và cộng sự (2005) ñã tối ưu sản xuất và tinh sạch
chitinase từ Pennicillum aculeatum NRRL 2129 bằng phương pháp lên men lỏng
[36]. Gần ñây, Yano, S. NopakRNA Rattanakit ñã nghiên cứu thu nhận, tinh sạch
và xác ñịnh tính chất chitinase của Streptomyces cyaneus SP-27,...
Những nghiên cứu sâu hơn như phân lập tạo dòng và biểu hiện gen cũng ñã
ñược thực hiện nhằm tăng khả năng tổng hợp chitinase của sinh vật: Chien-Jui
Huang và Chao-Ying Chen (2005) nghiên cứu biểu hiện gen ở mức cao và xác
ñịnh tính chất của hai chitinase: ChiCH và ChiCW của Bacillus cereus 28-9 trong
Escherichia coli [37]; Yong-Seok Lee và cộng sự (2006) cũng ñã nghiên cứu tạo
dòng, tinh sạch và xác ñịnh tính chất của chitinase từ Bacillus sp. DAU101,...
Bên cạnh những nghiên cứu trên, một loạt các nghiên cứu về chitinase ñịnh
hướng ứng dụng công nghệ sinh học trong nông, lâm, ngư, y....ñã ñược công bố:
Wen-Teish Chang và cộng sự (2007) nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ môi trường
(có chứa bột vỏ tôm, cua sản xuất từ chất thải biển) nuôi cấy Bacillus cereus
QQ308 ñể ức chế nấm bệnh Fusarium oxysporum, Fusarium solani và Pythium
ultimum làm tăng sự phát triển của cây [28]; Pernille H.B. Poulsen và cộng sự
(2007) ñã bổ sung chitin vào phân compost ñể xử lý chất thải (hữu cơ) hộ gia ñình,
kết quả ñã làm tăng hoạt tính chitinase trong ñống ủ, tăng sự ña dạng di truyền của
vi sinh vật ñồng thời tăng khả năng khoáng hóa chất thải hữu cơ so với ñối chứng
[27]; Laura Ramı´rez-Coutin’o, Marı´a del Carmen Marı´n-Cervantes và cộng sự
(2006) ñã sử dụng chitinases từ Lecanicillium fungicola ñể thủy phân chitin nhằm
sản xuất oligosaccharides [18]; năm 2002 có một nghiên cứu khá thú vị: Mongkol
Sukwattanasinitt và cộng sự ñã thử nghiệm ứng dụng enzyme thương mại không
có chitinase từ nấm sợi thủy giải B-chitin ñể thu nhận 2-acetamido-2-deoxy-D-
glucose [38],.....
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về chitinase phát triển mạnh trong những năm
gần ñây. Có hai hướng nghiên cứu chủ ñạo:
Hướng nghiên cứu khá phổ biến là tách chiết, tinh sạch, xác ñịnh ñiều kiện
tối ưu cho sinh tổng hợp và phản ứng của chitinase từ nhiều nguồn khác nhau dựa
trên sự ña dạng về chủng loại sinh vật bản ñịa:

38. 21
Chitinase từ thực vật: có nghiên cứu của Đặng Trung Thành (2008) về thu
nhận enzyme chitinase trong cây khoai lang (Ipomoea batatas) tại Khánh Hòa
[15]; Tại Đăk Lăk, Nguyễn Quang Nhân và cộng sự (2009) ñã nghiên cứu thu
nhận, tinh sạch và xác ñịnh tính chất của chitinase từ mủ cao su (Hevea
brasilliensis) [13].
Có khá nhiều nghiên cứu hướng tới việc thu nhận chitinase từ vi sinh vật:
Đinh Minh Hiệp và cộng sự (2007) ñã khảo sát hoạt tính các enzyme chitinase, B-
glucanase, cellulase, pectinase, amylase, protease của các chủng Trichoderma phân
lập tại việt Nam [6]; Nguyễn Bảo Hưng và cộng sự (2010) cũng ñã phân lập và
ñánh giá một số ñặc tính của chitinase từ Trichoderma Asperellum [7]; Nguyễn
Phương Nhuệ và cộng sự (2010), ñã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tối khả
năng sinh tổng hợp chitinase của chủng vi khuẩn Bacillus Circulans HT11 [14];
Phạm Thị Ngọc Lan và Hoàng Quốc Anh (2010), tiến hành nghiên cứu tuyển chọn
chủng vi khuẩn phân hủy chitin và khảo sát ñiều kiện sinh tổng hợp chitinase [8];
Cũng trong năm 2010, Nguyễn Văn Bốn ñã nghiên cứu tách chiết và xác ñịnh tính
chất chitinase từ môi trường nuôi cấy nấm mốc phân lập tại Buôn Ma Thuột,...
Một hướng nghiên cứu mới mang tính ñịnh hướng cho việc ứng dụng các vi
sinh vật có hoạt tính chitinase hoặc chế phẩm chitinase trong việc khống chế dịch
hại cho cây trồng: Nguyễn Văn Nam (Đại học Tây Nguyên) và cộng sự ñã nghiên
cứu sâu về cơ chế ñối kháng của các dòng nấm Trichoderma với nấm bệnh hại cây
trồng: Năm 2009 nhóm tác giả ñã công bố hai công trình nghiên cứu về Cơ chế
thủy phân của enzyme Chi32 và Chi46 tinh sạch từ nấm Paecilomyces variotii lên
chitin cấu thành trong sợi nấm Fusarium solani [11] và Vai trò của các enzyme này
trong quá trình ký sinh trứng tuyến trùng Meloidogyme incognita [12]; Năm 2010,
nhóm tác giả tiếp tục ñăng tải một nghiên cứu về chức năng chitinase của nấm
Trichoderma harzianum T1 trong quá trình ñối kháng với nấm bệnh Fusarium
solani [10]. Gần ñây (2011), Trần Thị Thu Hà (Đại học Nông Lâm Huế), cũng ñã
nghiên cứu vai trò của chitinase tái tổ hợp từ Trichoderma trong phòng trừ bệnh
hại cây trồng.

39. 22
Hiện nay, vẫn chưa có một nghiên cứu nào về phân lập và sàng lọc các
chủng nấm mốc ñể thu nhận chitinase mang tính hệ thống ở khu vực Tây Nguyên,
cụ thể là ở Đắk Lắk ñược công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước. Để góp
phần tham gia vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh vật tại Tây Nguyên,
chúng tôi ñề xuất ñề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng chủng nấm mốc có
hoạt tính chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk”.

40. 23

41. Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

42. 23
2.1. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân
giải chitin.
- Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc tuyển
chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao.
- Nghiên cứu lựa chọn tác nhân tủa phù hợp cho quá tình tách chiết enzyme
chitinase từ chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao nhất ñược tuyển chọn.
- Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của chitinase từ chủng nấm mốc có hoạt
tính chitinase cao nhất ñược tuyển chọn.
- Tinh sạch chitinase.
2.2. Vật liệu và thiết bị
- Đề tài có sử dụng các hoá chất: NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, FeSO4,
Chitin, Agar, Glucose, thuốc thử DNS, thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue, N-
Acetylglucosamine (GlcNAc), NaOH, Albumine huyết thanh bò, Gel Sephadex
G50, Acrylamide (FW 71,08), Bis - Acrylamide (FW 154,2), Tris (FW 121,1),
SDS, Amoniumpersulfate (APS), TEMED, Glacial acetic acid, methanol tuyệt ñối.
- Đĩa peptri, micropipette, que cấy, que gạt, ống nghiệm, bình tam giác 50, 100,
250 ml, bình ñịnh mức 50, 100ml,...
- Nồi hấp áp lực, tủ sấy, tử ấm, máy quang phổ 6405 UV/Vis spectrophotometer
(Jenway), cân ñiện tử, bộ ñiện di, kính hiển vi, máy lắc ổn nhiệt, box cấy vô
trùng,...
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Địa ñiểm thu thập mẫu
Các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase ñược phân lập từ ñất ñỏ bazan và ñất
xám tại Dăk lăk.
2.3.2. Các loại môi trường [16]
+ Môi trường Czapek - chitin: dùng ñể phân lập, cấy chuyền
NaNO3: 3,5g
K2HPO4: 1,5 g
MgSO4: 0,5g

43. 24
KCl: 0,5g
FeSO4: 0,1g
Bổ sung huyền phù chitin 1%: 50ml
Agar: 20 g
Bổ sung nước cho ñủ 1000ml
+ Môi trường PGA: dùng ñể quan sát và mô tả hình thái
Khoai tây: 200 g
Glucose: 20 g
Agar: 20 g
Nước cất: 1000ml
+ Môi trường nuôi cấy nấm mốc thu nhận chitinase: dùng môi trường
Czapek – chitin nhưng không bổ sung agar.
Các môi trường ñược hấp khử trùng ở 1210
C trong 30 phút, ñể nguội ñến
400
C – 500
C thì bổ sung 50mg kháng sinh Streptomycine (kháng sinh phải ñược
pha và bổ sung trong ñiều kiện vô trùng) và ñổ ra ñĩa petri vô trùng.
2.3.3. Phương pháp phân lập[2]
+ Cân 1 gam ñất cho vào cối sứ thêm vào 10ml nước cất vô trùng, nghiền nhỏ.
Pha loãng dung dịch ñất ở các ñộ pha loãng 10-1
, 10-2
, 10-3
.
+ Dùng pipet man vô trùng hút 0,5ml dung dịch ñất ñã pha loãng lên ñĩa peptri chứa
môi trường phân lập. Ủ 2-3 ngày ở nhiệt ñộ phòng, lấy ra quan sát các chủng nấm mốc
phân lập ñược rồi cấy chuyền nhiều lần ñể làm thuần các chủng nấm mốc.
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao [36]
+ Tiến hành: chuẩn bị môi trường Czapek (không có agar) ñã thay thế glucose
bằng huyền phù chitin 1%. Cho vào mỗi ống nhiệm 10 ml môi trường ñem hấp
khử trùng ở 121o
C sau 30 phút. Cấy các chủng nấm mốc (phân lập ñươc) vào ống
nghiệm. Nuôi cấy lắc 150 vòng / phút ở nhiệt ñộ phòng sau 14 ngày ñem ly tâm loại
bỏ hệ sợi và bào tử, thu nhận dịch môi trường nuôi cấy lỏng.
+ Chỉ tiêu theo dõi: ñể tuyển chọn ñược các chủng nấm mốc có hoạt tính
chitinase cao chúng tôi dựa vào hai chỉ tiêu: hàm lượng ñường khử trong dịch nuôi
cấy và hoạt tính chitinase của từng chủng.

44. 25
2.3.5. Xác ñịnh hoạt ñộ chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử với
thuốc thử DNS [9]
• Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân chitin bởi chitinase thành N-
acetylglucosamine (GlcNAc).
GlcNAc là một loại ñường khử. Đường khử trong môi trường kiềm nóng sẽ
khử thuốc thử DNS (acid 3,5-dinitrosalicylic) màu vàng thành acid 3-amino-5-
nitrosalicylic màu ñỏ da cam. Cường ñộ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với
ñộ hấp thụ (OD) tại bước sóng 540nm và tỉ lệ thuận với hàm lượng ñường khử
trong mẫu.
Dựa vào ñồ thị chuẩn với nồng ñộ của N-acetylglucosamine tinh khiết và
∆OD ở 540nm sẽ tính ñược hàm lượng ñường khử của mẫu nghiên cứu, qua ñó
biết ñược hoạt tính chitinase của enzyme
Hình 2.1. Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase
Hình 2.2. Phản ứng của ñường khử với thuốc thử DNS
Acid 3,5-dinitrosalicylic (màu vàng) Acid 3-amino-5-nitrosalicylic (màu da cam)
Đường khử trong môi
trường kiềm nóng

45. 26
• Định nghĩa ñơn vị hoạt ñộ chitinase:
Một ñơn vị hoạt ñộ (UI) chitinase ñược ñịnh nghĩa là lượng enzyme xúc tác
thủy phân chitin tạo các ñầu khử tương ứng với 1µg N-acetylglucosamine trong 1
phút dưới ñiều kiện phản ứng.
• Hoá chất
- Thuốc thử DNS.
- Dung dịch huyền phù chitin 1%: lấy 5g chitin hòa tan vào 50ml HCl ñậm ñặc.
Khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở 40o
C. Sau ñó, vừa khuấy vừa thêm từ từ
500ml nước lạnh (5o
C). Dịch huyền phù thu lại bằng cách ly tâm (3500 vòng/phút
trong 7 phút). Huyền phù ñược rửa với nước cất nhiều lần cho ñến pH thích hợp rồi
căn thể tích bằng ñệm citrate pH 5. Sau ñó bảo quản lạnh dịch huyền phù.
- Dung dịch N-acetylglucosamine chuẩn 500µg/ml pha trong nước cất.
• Tiến hành
Dựng ñường chuẩn N-acetylglucosamine:
- Từ dung dịch N-acetyl-glucosamine chuẩn pha các dung dịch N-acetyl-
glucosamine có nồng ñộ từ 0-250 g
µ /ml
Ống số 1 2 3 4 5 6
GlcNAc chuẩn (ml) 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
Nước cất (ml) 3,0 2,7 2,4 2,1 1,8 1,5
Nồng ñộ GlcNAc ( g
µ /ml ) 0,0 50 100 150 200 250
Thuốc thử DNS (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
- Lắc ñều, ñun sôi cách thủy trong 5 phút. Làm nguội, ño OD ở bước sóng
540nm. Vẽ ñường chuẩn theo nồng ñộ GlcNAc và ∆OD540.
Xác ñịnh hoạt ñộ chitinase của mẫu enzyme:
Hỗn hợp phản ứng gồm: trộn 1ml dịch huyền phù chitin 1% và 1ml dịch
enzyme thêm 2ml ñệm citrate pH 5, lắc ñều. Hỗn hợp phản ứng ñược ủ ở 35o
C
trong thời gian 7 giờ, phản ứng ñược ngừng lại bằng cách ñun sôi cách thủy trong 5
phút, ñể nguội tới nhiệt ñộ phòng.

46. 27
Sau ñó ly tâm dịch phản ứng rút ra 3ml dịch trong từ mỗi ống. Thêm 1ml
DNS, lắc ñều, ñun sôi cách thủy trong 5 phút, làm nguội ñến nhiệt ñộ phòng và ño
OD ở bước sóng 540nm. Tiến hành với mẫu kiểm chứng tương tự như mẫu thí
nghiệm chỉ khác là enzyme ñược bổ sung khi ñã ñược bất hoạt [13].
• Cách tính kết quả
Trong ñó: HTch: Hoạt tính chung chitinase (UI/ml).
X : Lượng ñường khử sinh ra (µg/ml).
K : Hệ số pha loãng.
V : Tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml).
v : Thể tích enzyme ñem phản ứng (ml).
T : Thời gian phản ứng (phút).
Công thức xác ñịnh hoạt ñộ riêng
Trong ñó: HTr: Hoạt tính riêng chitinase (UI/mg protein).
C: Nồng ñộ protein (mg/ml).
• Nồng ñộ protein ñược xác ñịnh theo phương pháp Bradford [9]
- Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie (Coomassie
Brilliant Blue- CBB) sẽ hình thành hợp chất có màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở
bước sóng 595 nm, cường ñộ màu tỉ lệ với nồng ñộ protein trong dung dịch. Phương
pháp có ñộ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài g
µ protein/ml, dễ thực hiện và tiết
kiệm thời gian.
- Tiến hành:
Chuẩn bị dung dich albumin chuẩn: cân chính xác 10mg Albumin pha trong 1ml
nước cất lắc ñều cho tan hết và giữ ở 200
C. Khi dùng pha loãng 100 lần ñể ñược dung
dịch Albumin 0,1mg/ml.
HTch =
X . K . V
v . t
(Công thức 1)
HTr =
C
HTch
(Công thức 2)

47. 28
Pha thuốc thử Bradford: cân 50mg Coomassie Brilliant Blue và 25ml Ethanol 990
và 50ml acid phosphoric 85%, ñịnh mức tới 500ml bằng nước cất. Đựng trong chai
nâu có nút ñậy kín.
Tiến hành lập ñồ thị chuẩn: lấy 6 ống nghiệm ñánh số từ 1 ñến 6 và cho vào ñó
các chất theo bảng sau:
Ống số
Dung dịch Albumin
0,1 mg/ml (ml)
Nước cất
(ml)
Nồng ñộ
Albumin
( g
µ /ml )
Thuốc thử
Bradford (ml)
1 0,0 1,0 0,0 5,0
2 0,2 0,8 20 5,0
3 0,4 0,6 40 5,0
4 0,6 0,4 60 5,0
5 0,8 0,2 80 5,0
6 1,0 0,0 100 5,0
Lắc ñều và ñể yên một lúc, sau ñó ñem ño ñộ hấp thu ở bước sóng 595 nm, từ ñó
xây dựng phương trình ñường protein.
Xác ñịnh protein trong mẫu dịch chiết: lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm,
rồi thêm vào ñó 5ml thuốc thử Bradford, ño OD595. Thế giá trị OD595 của mẫu vào
phương trình ñường chuẩn protein.
2.3.6. Phương pháp ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao
+ Định danh sơ bộ dựa vào mô tả hình thái các chủng nấm mốc [4].
+ Định danh theo phương pháp sinh học phân tử: giải trình tự gen 28S rRNA và tra
cứu trên BLAST SEARCH các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao nhất [10].
2.3.7. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
Môi trường Czapek lỏng ñược lựa chọn ñể tối ưu thành phần dinh dưỡng và
ñiều kiện nuôi cấy chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase mạnh nhất.
Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy: Khảo sát nồng ñộ chitin (từ
0,1 ñến 1%w/v), nguồn dinh dưỡng nitơ (peptone, amonium sulfate, natri nitrate và
urea 1%w/v) bổ sung vào môi trường nuôi cấy [34][22][36][40].

48. 29
Điều kiện nuôi cấy: Khảo sát các kiều kiện nuôi cấy như nhiệt ñộ (từ 28 -
55o
C); pH của môi trường nuôi cấy (pH từ 4 ñến 10) dùng HCl 5% và NaCO3 5%
ñể ñiều chỉnh pH; tốc ñộ lắc ñược khảo sát ở ba mức 0; 150 và 300 (vòng/phút);
ngưỡng thời gian nuôi cấy ñược khảo sát từ 5 ñến 20 ngày[19][34].
Chỉ tiêu theo dõi: HTch (UI/ml).
2.3.8. Nghiên cứu xác ñịnh tác nhân tủa phù hợp [13]
- Tiến hành: tủa dịch nuôi cấy với các tác nhân tủa: ethanol, acetone, và
amonium sulfate với tỷ lệ như sau:
Thể tích dịch nuôi cấy/thể tích ethanol = 1/2, 1/3, 1/4 và 1/5
Thể tích dịch nuôi cấy/thể tích acetone = 1/1, 1/2, 1/3 và 1/4
(NH4)2SO4 ở các nồng ñộ bão hòa: 70%, 80%, 90% và 95%
Cho tác nhân tủa từ từ vào dịch nuôi cấy, khuấy ñều, ñể yên ở nhiệt ñộ thấp
(2-6o
C) trong khoảng 2 giờ ñể enzyme tủa hết. Ly tâm hoặc lọc ñể thu tủa. Hoà tan
tủa trở lại với nước cất (thí nghiệm ñịnh lượng protein) hoặc ñệm citrate pH5 (thí
nghiệm xác ñịnh HTch) rồi xác ñịnh hàm lượng protein theo phương pháp
Bradford và xác ñịnh hoạt tính chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử
bằng thuốc thử DNS.
- Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất tủa protein và HTch, tác nhân tủa nào phù hợp sẽ
tủa ñược nhiều protein và cho enzyme có hoạt tính chitinase cao.
- Phương pháp thẩm tích: Söû duïng maøng thaåm tích cellophane, caét maøng theo
chieàu daøi mong muoán, ngaâm trong acid acetic 1% trong 1 giôø, sau ñoù chuyeån qua
nöôùc caát. Tieáp tuïc luoäc oáng trong dung dòch EDTA kieàm (1% sodium carbonate,
10-3
M EDTA) trong 1 giôø, sau ñoù thay baèng nöôùc caát. Maøng ñöôïc baûo quaûn trong
nöôùc caát ôû 4o
C coù boå sung moät ít sodium azide (NaN3). Coät chaët moät ñaàu tuùi, rót
dung dòch enzyme caàn loaïi muoái vaøo tuùi, chöøa laïi moät khoaûng khoâng khí (khoaûng
10% theå tích), buoäc chaët ñaàu coøn laïi. Tuùi thaåm tích ñöôïc ñaët vaøo dung dòch ñeäm
citrate pH 5,0 trong moät becher to, coät moät ñaàu tuùi vaøo ñuõa thuûy tinh gaùc ngang
mieäng becher. Duøng maùy khuaáy töø khuaáy nheï nhaøng lieân tuïc. Thay dòch ñeäm vaøi

49. 30
laàn ñeå loaïi muoái. Söû duïng phöông phaùp naøy ñoái vôùi caùc maãu tuûa baèng muoái
(NH4)2SO4.
2.3.9. Xác ñịnh tính chất cơ bản của chitinase
+ Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt tính chitinase: phản ứng xác ñịnh hoạt
tính chitinase ñược tiến hành ở pH 5 trong 7 giờ với các mức nhiệt ñộ: 30o
C, 35o
C,
40o
C, 45o
C, 50o
C, 55o
C 60o
C và 65o
C, rồi xác ñịnh HTch [7].
+ Xác ñịnh pH tối ưu cho hoạt tính chitinase: phản ứng xác ñịnh hoạt tính
chitinase ñược tiến hành ở nhiệt ñộ tối ưu trong 7 giờ với dãy pH 3,0; 3,6; 4,2; 4,8; 5,4
và 6, rồi xác ñịnh HTch. Thí nghiệm có sử dụng ñệm citrate (pH 3,0 – 6,2) [7].
+ Xác ñịnh nồng ñộ cơ chất tối tối ưu cho hoạt tính chitinase: phản ứng
xác ñịnh hoạt tính chitinase ñược tiến hành ở pH và nhiệt ñộ tối ưu trong 7
giờ với các các nồng ñộ huyền phù chitin: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 và 80
mg/ml, rồi xác ñịnh HTch [13].
+ Ảnh hưởng của ion kim loại ñến hoạt tính chitinase: khảo sát ảnh hưởng của
4 ion kim loại: Mn2+
, Mg2+
, Cu2+
, Fe2+
với ba nồng ñộ 3; 5 và 7mM. Lấy 1ml
enzyme trộn với 1ml dung dịch huyền phù chitin và 2 ml các dung dịch muối với 3
nồng ñộ 6; 10 và 14mM pha trong ñệm citrate pH5 và ủ ở nhiệt ñộ thích hợp trong 7
giờ. Mẫu ñối chứng ñược tiến hành trong ñiều kiện tương tự như vậy nhưng không
có mặt dung dịch muối. Từ kết quả xác ñịnh HTch, có thể kết luận ảnh hưởng hoạt
hóa hay ức chế của các ion kim loại ñến hoạt tính chitinase [13][7].
+ Xác ñịnh thời gian phản ứng tối ưu: tiến hành phản ứng thủy phân huyền
phù chitin ở ñiều kiện tối ưu với thời gian khác nhau: 1; 2; 3; 4; 5; 6 và 7 ngày rồi
xác ñịnh HTch của từng ngày [7].
+ Tinh sạch chitinase bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex [7],
• Nguyên tắc:
Phương pháp lọc gel Sephadex dùng ñể tách các phân tử trong một hỗn hợp
theo kích thước, hình dáng và khối lượng phân tử. Các phân tử có kích thước nhỏ
ñủ lọt vào bên trong lỗ gel thì bị giữ lại, di chuyển chậm qua cột. Trong khi ñó các
phân tử có kích thước lớn nằm ở kẽ hở giữa các hạt gel sẽ di chuyển nhanh hơn và
ñược giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.

50. 31
• Dụng cụ và hóa chất:
- Ống nghiệm loại nhỏ (ñược ngâm tẩy trùng trong dd sulfo-cromic trong
24 giờ, rửa sạch, tráng nước cất và sấy khô).
- Máy quang phổ 6405 UV/Vis spectrophotometer (Jenway)
- Dung dịch NaN3 0,02%.
- Gel Sephadex G50 (Kích thước lỗ 20 – 80 µm, khoảng khối lượng phân tử
protein phân tách 1500 – 30000Da, hệ số trương nở 9-11ml/g gel khô):
Cân 2g gel khô ngâm trong lượng thừa NaN3 0,02% trong 24 giờ ñể gel
trương nở hoàn toàn.
- Dung dịch ñệm citrate pH 5,0.
- Dung dịch HNO3 50%.
• Tiến hành
Rửa cột bằng HNO3 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng
acetone, ñể khô.
Cho vào ñáy cột lớp bông gòn thủy tinh và lớp giấy lọc bên trên ñể tạo mặt
phẳng. Đóng khóa cột, dùng becher cho từ từ dung dịch gel ngâm trong NaN3
0,02% vào cột. Gel cho vào cột phải liên tục, tránh hiện tượng phân lớp.
Khi gel ñã cao hơn 10cm có thể mở khóa từ từ ñể cho lượng nước dư trong
gel chảy bớt ñi. Tiếp tục nhồi cột cho ñến khi lớp gel cao khoảng 4/5 chiều dài cột.
Sau khi nhồi cột xong, cắt một miếng giấy lọc ñặt lên trên mặt lớp gel nhằm
tránh hiện tượng xáo trộn bề mặt gel khi cho mẫu vào cột. Cho dung dịch ñệm vào
ñể chạy ổn ñịnh cột trong 30 phút. Chỉnh tốc ñộ dòng khoảng 2ml/ 9-10 phút.
Chọn mẫu enzyme có hoạt tính tốt nhất ñể qua gel, trước khi nạp cần chỉnh
lại nồng ñộ protein cho thích hợp khoảng 0,5 – 1 mg/ml. Đợi lớp dung dịch bên
trên vừa chạm bề mặt gel thì khóa cột. Hút 0,5ml dung dịch enzyme cho vào cột.
Mở khóa cho dung dịch chạy tiếp. Khi mẫu enzyme vừa thấm hết vào bề mặt gel,
cho dung dịch ñệm liên tục vào cột gel ñể rửa giải. Dịch rửa giải bên dưới ñược
hứng vào các ống nghiệm. Hứng khoảng 20-40 ống, mỗi ống 2ml. Đem các ống ño
OD ở bước sóng 280nm. Dựa vào giá trị ño ñược, vẽ thành các ñỉnh (peak), gồm

51. 32
các ống nghiệm thuộc cùng một peak. Chọn những peak cao ñem xác ñịnh hàm
lượng protein và xác ñịnh hoạt tính enzyme.
+ Tinh sạch chitinase bằng phương pháp sắc ký ái lực dùng cột chitin [39]:
• Nguyên tắc: dựa trên nguên tắc tương tác ñặc hiệu giữa enzyme và cơ chất.
Dùng pH thích hợp ñể tạo ra ái lực giữu protein ñích (chitinase) với cơ chất (chitin)
và sự rửa giải protein dích ra khỏ cơ chất.
• Dụng cụ và hóa chất:
- Ống nghiệm loại nhỏ (ñược ngâm tẩy trùng trong dd sulfo-cromic trong
24 giờ, rửa sạch, tráng nước cất và sấy khô).
- Máy quang phổ 6405 UV/Vis spectrophotometer (Jenway).
- Bột chitin tinh sạch, bông thủy tinh.
- Các loại ñệm:
+ NaCl 0.5M trong ñệm phosphate 20mM (pH6.0) (1).
+ Natri acetate 20mM (pH5,0) (2).
+ Natri acetate 20mM (pH4,0) (3).
+ Phosphate 1mM (pH6,0) (4).
• Tiến hành:
- Cân khoảng 7-10 gram bột chitin rồi ngâm trong nước cất, sau12 giờ
khuấy lắc chiết bỏ phần dịch nổi, tiếp tục bổ sung nước cất rồi chiết bỏ
phần dịch nổi cho ñến khi loại bỏ ñược hết các phần tử chitin có kích
thước nhỏ.
- Chuẩn bị cột: rửa cột bằng dung dịch ñệm (3), dùng 1 ít bông thủy tinh
nhồi ở ñáy cột, sau ñó tiếm hành nhồi chitin ñã trương nở vào cột. Sau khi
nhồi cột xong, cắt một miếng giấy lọc hoặc bông thủy tinh ñặt lên trên
mặt lớp chitin nhằm tránh hiện tượng xáo trộn bề mặt cột khi cho mẫu vào
cột. Cho dung dịch ñệm (1) vào ñể chạy ổn ñịnh cột trong khoảng 15-30
phút. Chỉnh tốc ñộ dòng khoảng 4s/giọt.
- Nạp mẫu: trước khi nạp cần chỉnh lại nồng ñộ protein cho thích hợp
khoảng 10 – 15 mg/ml bằng cách tủa rồi hòa tan trở lại bằng ñệm (1). Đợi

52. 33
lớp dung dịch bên trên vừa chạm bề mặt chitin thì khóa cột. Hút khoảng
2-3 ml dung dịch enzyme cho vào cột. Mở khóa cho dung dịch chạy tiếp.
- Chạy sắc ký: lần lượt chạy các dung dịch ñệm sau:
+ Đệm (1) chạy 3 cột: chitinase bắm vào cột.
+ Đệm (2) chạy 3 cột: rửa rải các protein ngoại trừ chitinase.
+ Đệm (3) chạy cho ñến khi kết thúc nhằm rửa giải chitinase.
- Dịch rửa giải bên dưới ñược hứng vào các ống nghiệm. Hứng khoảng 40-
60 ống, mỗi ống 2ml. Đem các ống ño OD ở bước sóng 280nm. Dựa vào
giá trị ño ñược, vẽ thành các ñỉnh (peak), gom các ống nghiệm thuộc cùng
một peak. Chọn những peak cao ñem xác ñịnh hàm lượng protein và xác
ñịnh hoạt tính enzyme.
- Trước khi xác ñịnh hoạt tính chitinase cần tiến hành thẩm tích bằng ñệm (4).
2.3.9. Xử lý số liệu: số liệu thực nghiệm ñược xử lý trên phần mềm Microsoft
Execel 2007 và MSTATC 2003.

53. 34

54. Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

55. 34
3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase tại Đăk Lăk
Môi trường Czapek có bổ sung huyền phù chitin ñược dùng ñể phân lập các
chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase trong ñất tại Đăk Lăk. Kết quả ñã phân lập
ñược 34 chủng nấm mốc ký hiệu từ D1 ñến D34 trong ñó 19 chủng (D1 – D19)
ñược phân lập từ ñất ñỏ và 15 chủng (D20 – D34) từ ñất xám. Các khuẩn lạc mọc
lên ñược quan sát và mô tả trong bảng 3.1.
Bảng 3 .1. Đặc ñiểm khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk
STT
Ký
hiệu
chủng
Đặc ñiểm khuẩn lạc
Hình dạng Màu sắc
Rìa khuẩn
lạc
Độ nổi
Sắc tố
hòa
tan
1 D1 Tròn có vành ở mép Trắng Nhung Gồ ghề
2 D2 Tròn có vành ở mép Xanh rêu Lông Lồi nhọn
3 D3 Rễ Trắng Lượn sóng Gồ ghề
4 D4 Rễ Xám tro Rễ Gồ ghề
5 D5 Rễ Xám tro Lông Lõm
6 D6 Tròn, mép viền răng cưa Xám Nhung Bằng phẳng
7 D7 Tròn có vành ở mép Trắng Nhung Lồi nhọn
8 D8 Tròn có vành ở mép Xanh rêu Lông Lồi nhọn Nâu ñen
9 D9 Dạng ñồng tâm
Ttrắng,
xanh, cam
Nhung Phẳng
10 D10 Tròn có vành ở mép Nâu Lông Lồi nhọn
11 D11 Rễ Vàng Lượn sóng Gồ ghề
12 D12 Rễ Đen Cành
Ăn sâu vào
thạch
13 D13 Đồng tâm Xanh Lông Gồ ghề
14 D14 Mép dạng rễ Cam Lông Lồi cong
15 D15 Rễ Trắng, ñen Cành Dạng nón Nâu ñen
16 D16 Tròn có vành ở mép Xanh rêu Lông Lồi nhọn

56. 35
17 D17 Tròn có vành ở mép Nâu Lông Lồi cong
18 D18 Không ñều Nâu Mép có múi Phẳng Đen
19 D19 Rễ Trắng Lượn sóng Gồ ghề
20 D20 Tròn có viền ở mép Trắng Nhung Lồi cong Nâu ñen
21 D21 Tròn có viền ở mép Xanh Cành Dạng nón
22 D22 Tròn có viền ở mép Nâu Lông Lồi nhọn
23 D23 Tròn có viền ở mép Xanh Lông Phẳng
24 D24 Tròn ñồng tâm Đen, trắng Nhung Lõm
25 D25 Tròn, viền răng cưa Xanh nâu Bằng phẳng Lồi cong
26 D26 Rễ Nâu Cành Gồ ghề
27 D27 Tròn có viền ở mép Xám tro Lông Lồi cong
28 D28 Tròn có viền ở mép Trắng Lông Lồi cong
29 D29 Rễ Trắng Cành
Bằng
phẳng
30 D30 Tròn, viền mép răng cưa Xám tro Lông Lồi cong
31 D31 Tròn có vành ở mép Xanh rêu Lông Lồi nhọn
32 D32 Rễ Xanh trắng Lông Gồ ghề
33 D33 Rễ Trắng Lượn sóng Gồ ghề
34 D34 Rễ Trắng Cành Dạng nón

57. 36

58. 37
Ảnh 3.1. Khuẩn lạc của 34 chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk
3.2. Tuyển chọn và ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao
3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao
Các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase ñược phân lập tại Đăk Lăk (34
chủng) tiếp tục ñược nuôi cấy ñồng loạt trong môi trường cảm ứng (có chitin) ñể so
sánh HTch. Kết quả thực nghiệm ñược ghi nhận trong bảng 3.2 và hình 3.1.
Bảng 3.2. Hàm lượng ñường khử trong dịch nuôi cấy và hoạt tính chitinase của
các chủng nấm mốc
Chủng
nấm mốc
Gía trị
OD540nm
Hàm lượng ñường
khử trong dịch
nuôi cấy (mg/ml)
Hoạt tính chung
chitinase (UI/ml)
D1 0,050 40,24 0,11i
D2 0,047 39,33 0,11i
D3 0,032 34,79 0,10i
D4 2,450 767,52 2,13b
D5 0,010 28,12 0,08i
D6 0,016 29,94 0,08i
D7 0,016 29,94 0,08i
D8 0,011 28,42 0,08i
D9 2,935 914,48 2,54a

59. 38
D10 0,018 30,55 0,08i
D11 0,022 31,76 0,09i
D12 0,013 29,03 0,08i
D13 0,015 29,64 0,08i
D14 0,330 125,09 0,35efg
D15 0,030 34,18 0,09i
D16 0,015 29,64 0,08i
D17 0,280 109,94 0,31fgh
D18 0,940 309,94 0,86d
D19 0,430 155,39 0,43ef
D20 0,024 32,36 0,09i
D21 0,810 270,55 0,75d
D22 0,170 76,61 0,21ghi
D23 0,019 30,85 0,09i
D24 1,810 573,58 1,59c
D25 0,030 34,18 0,09i
D26 0,030 34,18 0,09i
D27 0,540 188,73 0,52e
D28 0,016 29,94 0,08i
D29 0,013 29,03 0,08i
D30 0,009 27,82 0,08i
D31 2,300 722,06 2,01b
D32 1,752 556,00 1,54c
D33 0,011 28,42 0,08i
D34 0,070 46,30 0,13hi
ANOVAz
/ CHỦNG NẤM **
CV(%) 15,38
Z* khác biệt có ý nghĩa ở mức P0,01.
Các trị số có các chữ cái giống nhau trong cùng một cột không có sự khác biệt theo trắc nghiệm
phân hạng Ducan’s Multiple Rang test.

60. 39
Các chủng nấm mốc ñược nuôi cấy trong môi trường cảm ứng sẽ sinh ra
chitinase. Enzyme này thực hiện phản ứng thủy phân, cắt huyền phù chitin thành
các N-acetyl glucosamine (ñường khử) hoặc các olygomer phân tử thấp cũng có
tính khử. Do ñó, hàm lượng ñường khử trong dịch nuôi cấy cũng phản ánh khả
năng sinh chitinase của các chủng nấm mốc. Từ bảng số liệu 3.2, cho thấy trong
dịch nuôi cấy các chủng nấm mốc ñều có ñường khử. Điều này chứng tỏ tất cả các
chủng nấm mốc trên có khả năng sinh chitinase trong môi trường cảm ứng. Tuy
nhiên, hàm lượng ñường khử trong dịch nuôi cấy chỉ là chỉ tiêu mang tính chất ñịnh
tính. Để tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao, chúng tôi căn
cứ chủ yếu vào hoạt tính chitinase. Kết quả thí nghiệm cho thấy HTch của các
chủng chênh lệch nhau khá lớn, sự sai khác này rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Cụ
thể có 22 chủng (tỷ lệ 64,7%) cho hoạt tính chitinase rất thấp (HTch0,129UI/ml,
phân hạng:i-hi); 5 chủng (tỷ lệ 14,7%,) có hoạt tính chitinase thấp (HTch từ 0,23-
0,52UI/ml phân hạng:ghi-e); 2 chủng D18 và D21 (tỷ lệ 5,9%) có hoạt chitinase
trung bình (HTch từ 0,75-0,86UI/ml, phân hạng: d); 2 chủng D24 và D32 (tỷ lệ
5,9%) cho hoạt tính chitinase khá cao (1,54-1,59UI/ml, phân hạng: c); và 3 chủng
D4, D9 và D31 cho hoạt tính chitinase cao (HTch 2,01UI/ml, phân hạng: b-a).
Hình 3.1. Hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk

61. 40
Theo kết quả nghiên cứu, các chủng nấm mốc mà chúng tôi tuyển chọn có
hoạt tính chitinase vượt trội so với những nghiên cứu của các tác giả khác cũng trên
ñối tượng là vi nấm. Nhóm nghiên cứu Đinh Minh Hiệp và cộng sự (2007) ñã khảo
sát hoạt tính các enzyme chitinase, B-glucanase, cellulase, pectinase, amylase,
protease của các chủng Trichoderma phân lập tại việt Nam, kết quả chủng chủng
nấm mốc cho hoạt tính chitinase cao nhất cũng chỉ ñặt 18,2x10-2
U/ml [6].
Parameswaran Binod và cộng sự (2005) nghiên cứu sản xuất và tinh sạch chitinase
từ các chủng Penicillium aculeatum cho kết quả hoạt tính chitinase của chủng cao
nhất là 1.86 UI/ml. N.N. Nawani (2004) và cộng sự cũng khảo sát hoạt tính
chitinase của 3 chủng Streptomyces sp. NK1057, Streptomyces sp. NK528 và
Streptomyces sp. NK95 kết quả chủng NK1057 cho hoạt tính chitnase cao nhất là
294mU/ml.
Từ sự so sánh sơ bộ trên cho thấy, nhiều chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk
có hoạt tính chitinase rất cao, mở ra triển vọng sử dụng các chủng nấm này ñể nuôi
cấy thu nhận chitinase thương mại có hiệu quả.
Dựa vào kết quả sàng lọc trên, chúng tôi chọn ba chủng nấm mốc D4, D9 và
D31 có hoạt tính chitinase cao nhất ñể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao
Ba chủng nấm mốc D4, D9 và D31 ñược ñịnh danh sơ bộ dựa vào ñặc ñiểm
hình thái:
+ Chủng D4 thuộc giống Trichoderma có ñặc ñiểm: bào tử hình tròn, không
thành chuỗi. Cuống sinh bào tử dài chỉ phân nhánh ở ñầu cùng và khác biệt rõ rệt
với sợi nấm dinh dưỡng. Nhánh bên phân nhánh ngắn và dày mang những thể hình
chai cụm lại ngắn và mập, mỗi thể hình chai chỉ mang một bào tử ở ñầu cùng.
+ Chủng D9 thuộc giống Penicillium có ñặc ñiểm: cuống sinh bào tử hơi
phình ra ở ñầu cùng, ngọn phân nhánh thành chùm. Đầu cùng cuống sinh bào tử có
mang các thể bình, bào tử hình cầu ñến thuôn dài nằm trên thể bình.
+ Chủng D31 thuộc giống Paecilomyces có ñặc ñiểm: cuống sinh bào tử phình
to ở phân bụng, thon ở ñầu cùng. Ở ñầu cùng mang bào tử. Bào tử hình cầu, dạng
chuỗi dài.

62. 41
Ảnh 3.2.Hình thái của ba chủng nấm mốc D4, D9 và D31.
(A: Chủng nấm mốc nuôi cấy trên môi trường PGA trong ñĩa petri sau 3 ngày;
B: khuẩn lạc; C: cuống mang bào tử quan sát ở vật kính 10X; D: cuống mang bào
tử quan sát ở vật kính 40X; E: bào tử. B*
: bề mặt chủng nấm mốc D4).
Các chủng nấm mốc này tiếp tục ñược ñịnh danh theo phương pháp sinh học
phân tử dựa vào gen 28S rRNA. Gen 28S rRNA của các chủng nấm mốc có trình
tự nucleotid như sau:
+ Gen 28S rRNA của chủng D4:
GGGGTTCTCTCCGGTGCACTTCGCCGCGTTCAGGCCAGCATCAGTT
CGTCGCGGGGGAAAAAGGCTTCGGGAACGTGGCTCCTCCGGGAGTGTT
ATAGCCCGTTGCATAATACCCTGCGGTGGACTGAGGACCGCGCATCTGC
AAGGATGCTGGCGTAATGGTCACCAGCGACCCGTCTTGAAAC
+ Gen 28S rRNA của chủng D9:
GTCCGAGCCGAAGCGCGTTCCTCGGTCCGGGCTGGCCGCATGGCACC
CTCGGCTATAAGACGCCCCGGGGGGCGTTACATTCCGAGGGCCTTTGACC
GGCCGCCCAAACCGACGCTGGCCCGCCCGCGGGGAAGTACACCGGCCCG
AAGGCCGGCTGAACCCCGCGAGCGAGTCTGGTCGCAAGCGCTTCCCTT
B*
C D F
A C D E
A B C D E
A B C D E

63. 42
+ Gen 28S rRNA của chủng D31:
CGTTCTCGCTGGTGCACTCCGCCGGGTTCAGGCCAGCATCAGTTCG
CCGCGGGGGAAAAAGGCTTCGGGAACGTGGCTCCTACGGGAGTGTTAT
AGCCCGTTGCATAATACCCTGGGGCGGACTGAGGTTCGCGCTCCGCAA
GGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGCGACCCGTCTTGAAAC
Từ trình tự nucleotid của gen 28S rRNA, tiến hành tra cứu trên BLAST
SEARCH. Kết quả ñịnh danh cho thấy chủng D4 là Trichoderma hamatum, D9 là
Penicillium janthinellum và D31 là Paecilomyces lilacinus.
3.3. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy
Trong trường hợp này chitin vừa là nguồn carbon vừa là cơ chất cảm ứng
sinh chitinase, do ñó việc khảo sát ñể tìm ra nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi
cấy tối ưu cho việc sinh tổng hợp chitinase của các chủng nấm mốc là rất quan
trọng. Kết quả thí nghiệm ñược ghi nhận trong bảng 3.3 và minh họa ở hình 3.2.
Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng ñộ chitin thích hợp ñể nuôi cấy nấm mốc
Trichoderma hamatum là 0,25%, trong khi ñó Penicillium janthinellum và
Paecilomyces lilacinus lại sinh chitinase có hoạt tính cao nhất ở nồng ñộ chitin 0,5%.
Các chủng nấm mốc này sinh chitinase mạnh ở nồng ñộ huyền phù chitin bổ sung
thấp hơn so với một số nấm mốc: Trichoderma harzianum [34] và Penicillium
aculeatum NRRL 2129 [40]. M. H. El-Katatny và cộng sự (2000) khi khảo sát lựa
chọn nguồn carbon phù hợp ñã phát hiện ra chitin là cơ chất cảm ứng tốt nhất
Trichoderma harzianum sinh tổng hợp chitinases trên nền môi trường Czapek và
nồng ñộ chitin 0,75% là tối hảo cho tổng hợp chitinase và chitin 1% là tốt nhất cho
tổng hợp B-1,3-glucanase. Tương tự, trong nghiên cứu của Parameswaran Binod và
cộng sự (2006) về lựa chọn nguồn chitin phù hợp cho quá trình tổng hợp chitinase.
Khi bổ sung huyền phù chitin 1%, hoạt tính chitinase của Penicillium aculeatum
NRRL 2129 mạnh nhất (4.62 U/gds).

64. 43
Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy
ở các nồng ñộ chitin khác nhau:
Đơn vị tính UI/ml
Nồng ñộ
chitin
(%)
Nấm mốc
0,10 0,25 0,50 0,75 1,00
Anova
z
CV
(%)
Trichoderma
hamatum
1,8b
1,97a
0,94b
0,97b
0,98b
** 15,02
Penicillium
janthinellum
1,40c
1,74bc
3,11a
2,18b
1,19c
** 12,08
Paecilomyces
lilacinus
1,18b
1,27b
2,49a
1,47b
1,42b
** 13,39
Z* khác biệt có ý nghĩa ở mức P0,01.
Các trị số có các chữ cái giống nhau trong cùng một hàng không có sự khác biệt theo trắc nghiệm
phân hạng Ducan’s Multiple Rang test.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase
3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy
Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho quá trình sinh tổng hợp protein, do
ñó sẽ tác ñộng ñến quá trình sinh chitinase. Tuy nhiên, mỗi loại vi sinh vật lại có

65. 44
khả năng ñồng hóa các nguồn nitơ khác nhau. Vì vậy, việc lựa chọn nguồn nitơ phù
hợp cũng rất cần thiết.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ñến hoạt tính chitinase
Các chủng nấm mốc ñược nuôi cấy trên hai nguồn nitơ khác nhau: nitơ hữu
cơ (peptone) và nitơ vô cơ (natrinitrate, ure và amonium sulfate). Kết quả thí
nghiệm ñược ghi nhận ở bảng 3.4 và minh họa qua hình 3.3.
Bảng 3.4. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi
cấy bổ sung các nguồn nitơ khác nhau:
Đơn vị tính UI/ml
Nguồn nitơ
1%
Nấm mốc
ĐC Natrinitrate
Amonium
sulfate
Peptone Ure
Anova
z
CV
(%)
Trichoderma
hamatum
4,35a
2,08c
1,67d
2,78b
1,77cd
** 5,86
Penicillium
janthinellum
2,64b
1,85c
1,71c
4,66a
2,49b
** 6,34
Paecilomyces
lilacinus
2,60b
2,53b
1,67c
3,58a
1,66c
** 8,10
Z* khác biệt có ý nghĩa ở mức P0,01.
Các trị số có các chữ cái giống nhau trong cùng một hàng không có sự khác biệt theo trắc nghiệm
phân hạng Ducan’s Multiple Rang test.
Kết quả thực nghiệm ñược xử lý anova và trắc nghiệm phân hạng Ducan
theo phần mềm MSTATC cho thấy cả 3 nguồn nitơ vô cơ bổ sung vào môi