Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng prsv

a
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGUYỄN THỊ THANH NGA
NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƯA HẤU
(CITRULUS LANATUS THUMB.)
CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH
VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV
LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
HÀ NỘI, 2015

b
Nguyễn Thị Thanh Nga
NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƢA HẤU
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH
Viện Công nghệ Sinh học
HÀ NỘI, 2015
NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƢA HẤU
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH
Viện Công nghệ Sinh học
HÀ NỘI, 2015

i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, GS.TS. Lê Trần Bình đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Tường
Vân, TS. Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Phạm Thị Vân cùng tập thể cán
bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện
làm việc, nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong
suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng
và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình học tập và bảo vệ luận án.
Tôi xin cảm ơn Trại Sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế, Viện Công nghệ Sinh học đã
hỗ trợ tôi trong việc trồng cây thu hạt giống trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, Ban Chủ
nhiệm Khoa Nông – Lâm cùng các đồng nghiệp đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi,
giúp đỡ để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án.
Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình,
bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!
Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015
Nghiên cứu sinh

ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án
là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng
ý và cho phép của các đồng tác giả.
Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015
Nghiên cứu sinh

iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………….. 4
1.1. Giới thiệu về cây dưa hấu và bệnh hại dưa hấu…………………………... 4
1.1.1. Cây dưa hấu…………………………………………………………….. 4
1.1.2. Các loại bệnh hại dưa hấu………………………………………..……... 10
1.1.3. Bệnh virus hại dưa hấu………………………………………….……… 11
1.2. PRSV và PRSV gây hại trên dưa hấu……………………..……………... 13
1.2.1. Phân loại ……………………………………………………………….. 13
1.2.2. Cấu trúc…………………………………………………………………. 14
1.2.3. Phạm vi kí chủ, cơ chế truyền bệnh ……………………………………. 19
1.2.4. Biện pháp phòng trừ …………………………………………………… 20
1.2.5. PRSV gây bệnh trên dưa hấu…………………………………………… 20
1.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus….. 21
1.3.1. Kỹ thuật RNAi………………………………………………………….. 21
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus…………….. 26
1.3.3. Một số hạn chế của công nghệ RNAi và giải pháp……………………... 28
1.3.4. Một số nghiên cứu chuyển gen tạo tính kháng virus cho dưa hấu ……... 29

iv
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………. 31
2.1. Vật liệu, địa điểm nghiên cứu…………………………………………….. 31
2.1.1. Vật liệu thực vật………………………………………………………… 31
2.1.2. Chủng vi sinh vật, vector……………………………………………….. 31
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị, vật tư………………………………………………… 32
2.1.4. Hóa chất………………………………………………………………… 33
2.1.5. Địa điểm………………………………………………………………… 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………. 33
2.2.1. Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây dưa hấu………………………. 34
2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào
cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ………………………………………. 39
2.2.3. Chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu…………………… 44
2.2.4. Phân tích cây chuyển gen kháng PRSV.................................................... 45
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………… 49
3.1. Xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu ………………………………… 49
3.1.1. Khả năng tái sinh chồi và cụm chồi …………………………………… 49
3.1.2. Kết quả kích thích kéo dài chồi………………………………………… 54
3.1.3. Kết quả tạo rễ cho chồi ………………………………………………… 55
3.1.4. Ảnh hưởng của giá thể tiếp nhận đến khả năng thích ứng cây in vitro… 56
3.1.5. Tổng kết quy trình tái sinh …………………………………………….. 58
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen
vào cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ………………………………...… 59
3.2.1. Đánh giá khả năng sống sót của cây dưa hấu trên môi trường chứa chất

v
chọn lọc Km....................................................................................................... 59
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến hiệu quả chuyển gen....... 60
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen................... 61
3.2.4. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu ………………………………… 63
3.2.5. Kết quả phân tích các dòng cây chuyển gen gus ………………………. 65
3.2.6. Kết quả chuyển gen gus vào cây dưa hấu................................................. 67
3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi vào dưa hấu............................................ 68
3.4. Kết quả phân tích biểu hiện gen và đánh giá khả năng kháng virus của
các dòng cây chuyển gen ................................................................................... 69
3.4.1. Phân tích các dòng cây chuyển gen T0..................................................... 69
3.4.2. Phân tích các dòng cây chuyển gen T1..................................................... 79
Chƣơng 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU….……………………. 83
4.1. Khả năng nuôi cấy in vitro cây dưa hấu……………………………….….
4.2. Khả năng chuyển gen ở dưa hấu…………………………………….…….
4.3. Tạo tính kháng virus bằng chuyển gen ở dưa hấu………………………...
4.4. Triển vọng của các dòng chuyển gen trong bối cảnh GMO chung.............
83
86
90
94
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................................. 96
1. KẾT LUẬN.................................................................................................... 96
2. ĐỀ NGHỊ........................................................................................................ 97
SUMMARY....................................................................................................... 98
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO

vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Axit Deoxyribonucleic
ARN Axit Ribonucleic
BAP 6 - Benzyl Amino Purin
IAA Indol - 3 - Axetic Axit
IBA 3 - Indol Butyric Axit
NAA α - Naptalen Axetic Axit
bp Base pair
CP Coat protein
Nib Nuclear Inclusion Body protein
HC-Pro Helper component-proteinase
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA Ethylene diamine Tetra-acetic Acid
LB Luria-Bertani
PCR
RT-PCR
Polymerase Chain Reaction
Reverse transcription polymerase chain reaction
RNAi RNA interference
miRNA microRNA
siRNA small interfering RNA
mRNA messenger RNA
dsRNA double-stranded RNA
RISC RNA-induced silencing complex
Taq Thermus aquaticus

vii
PRSV Papaya ringspot virus
Km kanamycin
Cefo Cefotaxime
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
gus beta-glucuronidase

viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong dưa hấu…………………………… 9
Bảng 1.2. Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dưa hấu ………….. 10
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA và BAP… 36
Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA, BAP,
NAA…………………………………………………………………………… 36
Bảng 2.3. Nồng độ GA3 sử dụng trên MT kéo dài chồi……………………... 37
Bảng 2.4. Nồng độ IBA sử dụng trên MT tạo rễ …………………………….. 37
Bảng 2.5. Thành phần các loại giá thể thích ứng cây in vitro ……………….. 38
Bảng 2.6. Các nồng độ Km sử dụng................................................................... 39
Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trường ........................................................ 40
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tuổi lá mầm tái sinh chồi…………………………. 50
Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA, BAP, NAA đến sự phát sinh chồi…... 53
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi có
kích thước < 1cm…………………………………………………….…….….. 54
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IBA và môi trường cơ bản đến khả năng tạo rễ của
chồi dưa hấu………………………………………………………………...…. 56
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng thích ứng cây ra môi trường.. 58
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ Km đến sự phát triển của chồi.................... 60
Bảng 3.8. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu…………………………….. 64
Bảng 3.9. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu............ 67
Bảng 3.10. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu........ 69

ix
Bảng 3.11. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu.......... 72
Bảng 3.12. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp-
Nib-HCpro thế hệ T0 và WT ............................................................................ 75
Bảng 3.13. Kết quả PCR phân tích các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T1..... 80
Bảng 3.14. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp-
Nib-HCpro thế hệ T1 và cây WT....................................................................... 82

x
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc của PRSV…………………………………………………. 15
Hình 1.2. Bản đồ tổ chức genome của PRSV…………………………………. 15
Hình 1.3. Con đường tạo thành RNAi………………………………………. 25
Hình 2.1. Sơ đồ vector pCB-gusplus…………………………………………. 31
Hình 2.1. Sơ đồ vector pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro ……..……………. 32
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát…………………………………………. 34
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tuổi lá mầm dưa hấu đến khả năng tái sinh chồi…... 50
Hình 3.2. Ảnh hưởng của vị trí trên lá mầm đến khả năng tái sinh chồi……… 50
Hình 3.3. Kết quả tái sinh chồi dưa hấu từ lá mầm sau 6 tuần nuôi cấy……… 52
Hình 3.4. Hình ảnh chồi có hình thái bất thường so với đối chứng…………… 52
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi.. 55
Hình 3.6. Kết quả tạo rễ cho chồi dưa hấu D2………………………………… 56
Hình 3.7. Kết quả thích ứng cây in vitro……………………………………… 57
Hình 3.8. Một số hình ảnh về xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu……… 59
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến biểu hiện gus............ 61
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến biểu hiện Gus.................... 62
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện gus……….. 62
Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn đến
biểu hiện Gus………………………………………………………………….. 63
Hình 3.13. Hình ảnh chuyển gen gus vào cây dưa hấu.................................... 65
Hình 3.14. Biểu hiện bền vững của gus ở các dòng dưa hấu chuyển gen.. ... 66

xi
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen
nptII trên gel agarose 0,8%................................................................................. 67
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen T0
với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri............................................ 70
Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu
PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%........................................... 71
Hình 3.18. Một số hình ảnh chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro……….… 72
Hình 3.19. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu
PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%........................................... 73
Hình 3.20. Mẫu lá bí ngô bị nhiễm PRSV…………………………………….. 74
Hình 3.21. Các mức độ biểu hiện bệnh ở lá dưa hấu chuyển gen...................... 76
Hình 3.22. Một số hình ảnh về tính kháng bệnh PRSV của các dòng dưa hấu
chuyển gen.......................................................................................................... 78
Hình 3.23. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen D2.7
thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri............................ 79
Hình 3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen L2.3
thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri............................ 80

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây trồng quan trọng có giá trị dinh
dưỡng và thương mại cao, được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,
trong đó quá nửa diện tích được trồng ở vùng Đông Nam Á, châu Phi, vùng biển
Caribê và miền Nam nước Mỹ. Trong quá trình sản xuất dưa hấu, cây rất dễ bị
nhiễm các bệnh do vi khuẩn, virus hay do nấm gây ra, ảnh hưởng nghiêm trọng đến
năng suất và chất lượng quả. Trong các nguyên nhân gây bệnh, virus là một trong
những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cũng như chất lượng dưa hấu.
Có hơn 10 loại virus gây bệnh khá nghiêm trọng cho dưa hấu, trong đó virus
đốm vòng đu đủ (papaya ringspot virus type W - PRSV-W) là một trong những
virus gây hại nặng nề nhất. Chiến lược kiểm soát virus chủ yếu dựa vào thuốc trừ
sâu để tiêu diệt các loại côn trùng truyền bệnh, sử dụng thuốc diệt cỏ để tiêu diệt cỏ
dại cũng như các thực vật khác mang mầm bệnh. Tuy nhiên, các phương pháp này
chỉ có tác dụng phòng bệnh, khi cây đã bị nhiễm virus thì các phương pháp kiểm
soát trên không còn tác dụng. Biện pháp có hiệu quả nhất trong việc phòng và
chống bệnh virus hại thực vật nói chung là tạo ra các giống cây trồng kháng bệnh
virus. Tuy nhiên, các giống cây trồng có khả năng kháng bệnh virus một cách tự
nhiên không nhiều. Các phương pháp chọn giống truyền thống cũng đã đạt được
một số thành công trong việc ứng dụng các nguồn gen thực vật có khả năng kháng
tự nhiên đối với virus vào việc lai tạo để tạo giống kháng virus, tuy nhiên hiệu quả
còn chưa cao. Tạo cây trồng chuyển gen mang gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ
chính virus tỏ ra thực sự có hiệu quả trong việc tạo tính kháng virus cho cây trồng.
Trong những năm gần đây, đã có những thành công trong việc tạo ra nhiều
loại cây trồng có khả năng kháng lại virus dựa theo nguyên lý bất hoạt gen thông
qua RNA interference (RNAi). Ở thực vật, RNAi có thể được thực hiện bằng cách
chuyển đoạn gen đích có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense

2
hoặc cấu trúc RNA kẹp tóc bổ sung với chính nó. Hiện nay, RNAi là kỹ thuật triển
vọng được nghiên cứu ứng dụng trong việc tạo tính kháng virus ở thực vật.
Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, chúng tôi đã tiến hành
đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (Citrulus lanatus Thumb.) chuyển gen
kháng bệnh virus đốm vòng PRSV”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng được quy trình tái sinh và chuyển gen vào cây dưa hấu Việt Nam.
- Tạo dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng với virus PRSV.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng
tái sinh in vitro các giống dưa hấu thu thập được.
3.2. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào các
giống dưa hấu dựa vào gen chỉ thị gus trong vector pCB-gusplus sử dụng phương
pháp Agrobacterium;
3.3. Chuyển gen kháng virus PRSV vào dưa hấu thông qua việc sử dụng
chủng Agrobacterium tumefaciens CV58C1 chứa vector pK7GWIW2(II)/CP-Nib-
HCpro
3.4. Phân tích cây chuyển gen và đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt
Nam của các dòng cây chuyển gen thu được.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng thành công nguyên lý làm
câm gen RNAi và kỹ thuật chuyển gen ở thực vật để tạo được các dòng dưa hấu
kháng bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV gây ra. Khả năng kháng virus của dòng cây
chuyển gen đã được di truyền ổn định sang thế hệ T1.
Luận án đã đạt được các đóng góp cụ thể như sau:
1. Đã xây dựng được quy trình tái sinh vào 4 giống dưa hấu.

3
2. Đã tối ưu hóa được quy trình chuyển gen vào 2 giống dưa hấu nghiên cứu.
3. Chuyển thành công cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro vào 2 giống dưa hấu
nghiên cứu nhằm tạo tính kháng đối với PRSV Việt Nam.
4. Đã tạo được 2 dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với
PRSV Việt Nam, khả năng kháng virus của 2 dòng cây chuyển gen này đã
được di truyền ổn định sang thế hệ T1.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này là cơ sở khoa học cho việc
nghiên cứu tái sinh invitro, chuyển gen vào các giống dưa hấu khác có nguồn gốc
Việt Nam.
Bên cạnh đó, kết quả luận án đã khẳng định khả năng tiếp nhận đoạn gen
chuyển trong chuyển gen của 2 giống dưa hấu nghiên cứu (D2 và L2), làm cơ sở để
chuyển các gen mục tiêu theo những mục đích khác vào 2 giống dưa hấu này như
chuyển gen làm tăng tính chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường, chuyển
gen kháng các virus khác,…
Các dòng dưa hấu chuyển gen mang cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro có khả
năng kháng với PRSV tạo được trong nghiên cứu này rất có triển vọng để làm giống
hoặc lai tạo giống mới theo mục đích tạo giống kháng với PRSV.
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 138 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 26
trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 17 trang, kết quả 33 trang, thảo luận 13
trang, kết luận 2 trang, danh mục các công trình công bố 1 trang, tài liệu tham khảo
19 trang với 159 tài liệu tham khảo, tóm tắt kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh 3
trang. Trong luận án có 7 bảng và 21 hình.

4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây dƣa hấu và bệnh hại dƣa hấu
1.1.1 Cây dƣa hấu
Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây trồng quan trọng thuộc họ bầu bí.
Quả dưa hấu có giá trị dinh dưỡng và thương mại cao, có thể dùng ăn trực tiếp, làm
salad, nước ép, kẹo và ăn hạt. Ở vùng sa mạc, người ta sử dụng dưa hấu như một
nguồn cung cấp nước cho cơ thể (Niao et al., 2005). Giá trị dinh dưỡng của dưa hấu
không chỉ bởi vị ngọt, mát của nó mà còn vì quả dưa hấu chứa một hàm lượng lớn
chất xơ, nhiều loại vitamin và khoáng chất, hạt dưa hấu rất giàu chất béo và protein
(Niao et al., 2005; Swain & Powell, 2004). Hiện nay, dưa hấu được trồng phổ biến ở
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó quá nửa diện tích được trồng ở vùng Đông
Nam Á, Châu Phi, vùng biển Caribê và miền Nam nước Mỹ (Niao et al., 2005;
Swain & Powell., 2004; Ellul et al., 2007).
1.1.1.1. Nguồn gốc
Dưa hấu có nguồn gốc từ sa mạc Kalahari ở Châu Phi. Năm 1857,
Livingstone (Nhà thám hiểm người Scotland thế kỷ 19, một trong những người đầu
tiên khám phá khu vực Châu Phi) đã quan sát thấy dưa hấu mọc tràn lan ở sa mạc
Kalahari và ngày nay người ta vẫn có thể tìm thấy những loài được coi là tổ tiên của
dưa hấu ở Châu Phi, được gọi là Tsamma melon (Swain & Powell, 2004).
Việc thu hoạch dưa hấu đã được mô tả trong chữ tượng hình ở các tòa nhà cổ
xưa của Ai Cập hơn 4000 năm trước, hạt giống dưa hấu cũng được tìm thấy trong
các lăng mộ của các Pharaoh Tutankhamen. Từ Ai Cập, dưa hấu lan rộng ra khắp
các nước dọc theo biển Địa Trung Hải theo các chuyến tàu chở hàng. Đến thế kỷ 10
dưa hấu đã được du nhập vào Trung Quốc – một trong những quốc gia sản xuất dưa
hấu lớn nhất thế giới hiện nay. Đến thế kỷ 13, dưa hấu được tìm thấy ở châu Âu và
thế kỷ 16, dưa hấu được tìm thấy ở châu Mỹ. Thuật ngữ “watermelon” lần đầu tiên

5
được đề xuất bởi John Mariani vào năm 1615 trong từ điển thực phẩm và đồ uống
của Mỹ (Davis et al., 2004; Niao et al., 2005; Adrian, 2008). Ở Việt Nam, dưa hấu
được biết đến từ câu chuyện truyền thuyết Mai An Tiêm.
Citrullus colocynthis được xem là một trong những tổ tiên của dưa hấu hiện
nay. Loại dưa hấu này có quả nhỏ, đường kính tối đa là 7,5 cm, thịt quả màu trắng,
có vị đắng, hạt nhỏ có màu nâu. C. colocynthis là loại dưa hấu hoang dã được trồng
xen với sắn, ngô, khoai lang ở nhiều quốc gia ở miền Bắc và miền Đông của Châu
Phi như Ả rập, Nigieria, Ai cập, Iran, Namibia,… Tổ tiên của dưa hấu không có vị
ngọt, thậm chí đôi khi có vị đắng, thịt quả cứng và màu trắng giống như colocynthis
(Swain & Powell, 2004; Guner et al., 2004).
1.1.1.2. Phân loại
Dưa hấu thuộc: Bộ Cucurbitales
Họ: Cucurbitaceae
Chi: Citrullus
Loài: C. lanatus, C. colocynthis, C. ecirrhorus và C. sp
Tên tiếng Anh: Watermelon.
Tên Trung Quốc: Tây Hoa.
1.1.1.3. Đặc điểm hình thái
Dưa hấu là cây thân leo, có bộ rễ lan xa nên dù ở vùng khô cằn cũng có thể
cho ra loại trái cây chứa đến 90% nước, làm cho dưa hấu trở thành nguồn hyđrat
hoá quan trọng ở những nơi khan hiếm nước.
Quả dưa hấu có vỏ cứng, là loại quả phổ biến và có giá trị quan trọng nhất
trong họ Bầu bí. Quả dưa hấu rất đa dạng về hình dạng và màu sắc. Màu sắc vỏ quả
dưa hấu cũng thay đổi từ màu xanh sáng đến xanh đậm, có hoặc không có sọc. Về
màu sắc thịt quả có màu đỏ, màu hồng, màu vàng, màu cam và màu trắng. Hạt dưa
hấu cũng rất đa dạng về kích cỡ (lớn, trung bình, nhỏ) và có màu đen, màu nâu và

6
màu trắng. Về hình dạng, trên mặt phẳng cắt dọc, quả dưa hấu có các hình dạng
chính như sau: thuôn dài, oval và tròn.
Trong các loại dưa hấu, dưa hấu ruột đỏ, hạt đen là phổ biến nhất, tiếp theo là
dưa hấu ruột vàng, dưa hấu mini, dưa hấu không hạt. Mặc dù việc tạo ra dưa hấu
không phải ruột đỏ khó khăn hơn nhưng hiện nay chúng đã có mặt phổ biến trên thị
trường.
1.1.1.4. Đặc điểm sinh trƣởng phát triển
Dưa hấu là loại cây trồng nhiệt đới, sinh trưởng, phát triển kéo dài trong điều
kiện thời tiết ấm áp, khô ráo và đầy đủ ánh nắng. Cây dưa hấu rất nhạy cảm với
nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của dưa hấu ở vào khoảng 25-30o
C,
cho hoa nở và thụ phấn là 25o
C, và cho quả lớn và chín là 30o
C. Dưa hấu có rễ mọc
sâu, chịu úng kém, nhất là khi cây đã trổ bông và đậu quả. Khi bị úng, dưa hấu dễ bị
thối rễ, có thể dẫn đến cây bị chết hoặc khó trổ bông, thụ phấn và đậu quả, và khi đã
đậu quả thì lại dễ thối, chất lượng kém. Ẩm độ không khí cao dễ phát sinh bệnh.
Dưa hấu có thể trồng được trên nhiều loại đất, tuy nhiên đất phải thoát nước
tốt, cơ cấu nhẹ, tầng canh tác sâu, không quá phèn. Các vùng đất cát gần biển, đất
phù sa ven sông là những vùng đất lý tưởng để trồng dưa hấu. Đất cát pha có đặc
điểm là tơi xốp, nhiệt độ đất dễ tăng cao, dễ thoát nước rất có lợi cho bộ rễ dưa hấu
phát triển, chất lượng dưa tốt, tốn ít công chăm sóc. Nơi đất cao, thoáng, không bị
bóng râm che, không bị gió bão, pH trong khoảng 5 – 7 là thích hợp để trồng dưa
hấu.
Dưa hấu có thể được trồng quanh năm ở những vùng gần xích đạo. Ở Việt
Nam, dưa hấu được trồng quanh năm ở các tỉnh phía Nam, tập trung vào các vụ
chính như: vụ dưa noel (gieo hạt tháng 9), vụ dưa hấu tết (gieo hạt tháng 11), vụ
dưa hè thu (gieo trồng trong suốt mùa mưa),… Ở miền Bắc, dưa hấu được trồng 2
vụ chính: vụ dưa hè thu (gieo hạt trong tháng 3) và vụ đông xuân (gieo hạt trong
tháng 10, một số tỉnh miền Núi phía Đông Bắc gieo hạt vào tháng 12).

7
1.1.1.5. Tình hình sản xuất dƣa hấu
Năm 2012, trên thế giới có khoảng 34,7 triệu ha diện tích trồng dưa hấu, giảm
2,88% so với năm 2011 (35,7 triệu ha). Trung Quốc là nước sản xuất dưa hấu lớn
nhất với khoảng 18,2 triệu ha (51,2%), tiếp theo là Thổ Nhĩ Kỳ (165 nghìn ha), Iran
(145 nghìn ha), Liên bang Nga (125 nghìn ha), Brazil (95 nghìn ha), Ukrane (61
nghìn ha), Ai cập (57 nghìn ha), Mỹ (50 nghìn ha),… Năng suất dưa hấu năm 2012
đạt 30,34 tấn/ha, tăng 4,37% so với năm 2010 (29,07 tấn/ha), sản lượng đạt 105,4
triệu tấn, tăng 0,67% so với năm 2011 (104,5 triệu tấn). Trong đó, Trung Quốc sản
xuất 70,2 triệu tấn (chiếm 66,6% tổng sản lượng dưa hấu trên toàn thế giới), đứng
sau Trung Quốc là các quốc gia như Thổ Nhĩ Kỳ 4,04 triệu tấn, Iran 3,8 triệu tấn,
Brazil 2,07 triệu tấn, Mỹ 1,77 triệu tấn, Ai cập 1,87 triệu tấn (FAO, 2014).
Năm 2012, Việt Nam có khoảng 31 nghìn ha (tăng 14% so với năm 2011 –
27,2 nghìn ha) diện tích đất trồng dưa hấu, năng suất trung bình đạt 15,16 tấn/ha
(tăng 6,39% so với năm 2011), tổng sản lượng đạt 470 nghìn tấn, tăng 0,43% so với
năm 2011 (FAO, 2014). Dưa hấu được trồng rất phổ biến ở vùng đồng bằng sông
Cửu Long đặc biệt là Long An và Tiền Giang, Quảng Ngãi, năng suất đạt từ 15-25
tấn/ha. Ở miền Bắc, dưa hấu được trồng nhiều ở một số tính như Vĩnh Phúc, Thái
Bình, Hải Dương, Hà Nội, Bắc Giang, Hòa Bình, Bắc Kạn,…
1.1.1.6. Giá trị dinh dƣỡng và thƣơng mại của dƣa hấu
Dưa hấu được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: thực phẩm, mỹ phẩm,
dược phẩm và hóa phẩm. Vì có giá trị dinh dưỡng rất cao, dưa hấu được xếp vào
nhóm 10 thực phẩm tốt nhất. Người ta không chỉ yêu thích dưa hấu bởi vị ngọt, mát
của nó mà còn bởi trong dưa hấu chứa một hàm lượng lớn các vitamin và khoáng
chất, một lượng nhỏ protein và chất béo (Niao et al., 2005; Adrian, 2008). Theo
khuyến cáo của Hoa Kỳ, 280 gram thịt quả dưa hấu cung cấp 25% nhu cầu vitamin
C và 20% nhu cầu vitamin A, 8% nhu cầu kali, 4 % nhu cầu sắt và 2% nhu cầu
canxi mỗi ngày cho con người. Thịt quả dưa hấu rất giàu lycopene (2300 – 7200 µg
/ 100 g), là chất chống oxi hóa mạnh có tác dụng làm giảm nguy cơ ung thư tuyến

8
tụy, tuyến tiền liệt và dạ dày… Hàm lượng lycopene của dưa hấu ruột đỏ cao hơn so
với cà chua, bưởi đào và ổi (Compton et al., 2004; Rimando & Perkins-Veazie,
2005; Swain & Powell, 2004). Ngoài ra dưa hấu còn chứa hàm lượng lớn chất xơ, có
tác dụng chống một số bệnh về tiêu hóa như táo bón, trĩ, làm giảm hàm lượng
cholesterol và giảm nguy cơ bị các bệnh tim mạch cho cơ thể (Niao et al., 2005)
Dưa hấu giàu L-citrulline, một axit amin có thể được chuyển hóa thành L-
arginine - một axit amin không thay thế, đóng vai trò quan trọng trong việc chữa
lành vết thương, loại bỏ amoniac ra khỏi cơ thể và tham gia tổng hợp nitric oxit
(NO) - chất đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như tập hợp tiểu
cầu và điều chế quá trình miễn dịch của cơ thể. Các nghiên cứu cho rằng có sự gia
tăng tế bào limpho – tế bào đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch sau
khi uống arginine (Febres et al., 2008; Fire et al., 1998).
Ở các vùng khác nhau trên thế giới, dưa hấu được sử dụng theo những cách
khác nhau. Dưa hấu thường được dùng làm món tráng miệng sau bữa ăn, làm salad,
nước ép, kem, thạch hoa quả và dùng cùng với một số loại rượu như vodka, rum…
Tại miền Nam nước Nga, bia được làm từ nước ép dưa hấu hoặc nước ép dưa hấu
có thể được đun sôi để uống như một loại siro. Tại Iraq và Ai cập và nhiều quốc gia
khác ở Châu Phi, dưa hấu được sử dụng như một loại thực phẩm chủ yếu, là nguồn
cung cấp nước cho cơ thể và làm thức ăn chăn nuôi.

9
Bảng 1.1. Thành phần dinh dƣỡng trong dƣa hấu
(nguồn: USDA)
STT Thành phần Giá trị dinh dƣỡng trong 100g
1 Năng lượng 127 kJ (30 kcal)
2 Đường 7,55 g
3 Chất xơ 0,4 g
4 Chất béo 0,15g
5 Protein 0,61g
6 Vitamin A 28 µg
7 Vitamin B1 0,033 mg
12 Vitamin B9 3 µg
13 Vitamin C 8,1 mg
14 Vitamin E 0,05 mg
15 Vitamin K 0,01 µg
16 Can-xi 7 mg
17 Sắt 0,24 mg
18 Magie 10 mg
19 Phốt pho 11 mg
20 Kali 112 mg
21 Kẽm 0,1 mg
22 Natri 1 mg
23 Folate 3 µg

10
1.1.2. Các loại bệnh hại dƣa hấu
Bệnh hại dưa hấu có thể gây ra bởi nấm, vi khuẩn, virus và một số tuyến trùng
(Bảng 1.2) (Kucharek et al., 2005).
Bảng 1.2. Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dƣa hấu
Nhóm
phân loại
STT Sinh vật gây bệnh Triệu chứng đặc trƣng
Nấm
1 Pythium spp. Úng nước, bạc lá, thối quả
2 Rhizoctonia spp.
Bạc lá, úng nước, thối gốc và
quả
3
Fusarium oxysporum f. s. p.
Niveum
Héo rũ thân, lá
4 Fusarium sp. Thối vỏ quả
5 Didymella bryoniae Chảy mủ, úng thân, lá, quả
6 Psuedoperonospora cubensis 2 Sương mai ở lá, cháy lá
7 Colletotrichum lagenarium Cháy lá
Nấm
8 Alternaria cucumerina Cháy lá
9 Cercospora citrullina Đốm và cháy lá
10 Phytophthora capsici Thối quả, bạc lá, thối gốc
11 Sclerotium rolfsii Thối gốc, hoa, quả, đốm
12 Sphaerotheca fuliginea Bệnh phấn trắng
13 Colletotrichum orbiculare Cháy lá, thân, quả, cuống lá
14
Botryosphaeria quercum
(Schw.)
Thối gốc
15 Cladosporium lagenarium Vảy nấm
16 Corynespora cassicola Đốm lá
17 Lasiodiplodia theobromae Thối gốc, cháy lá
18 Erysiphe cichoracearum Phấn trắng bề mặt
19 Macrophomia phaseolina Thối gốc

11
20 Phymatotrichum omnivorum Thối rễ
21 Phytophthora sp Thối gốc, quả
22 Thielaviopsis basicola Thối rễ
23 Verticillium albo-atrum Héo thân và lá
Vi khuẩn
24 Pseudomonas lachrymans Đốm sáng ở góc lá, thối quả
25
Acidovorax avenae subsp.
Citrulli
Đốm sáng lá, quả
26 Erwinia spp. Thối vỏ
Virus
27
Papaya ringspot virus type
W (formally watermelon
mosaic virus 1)- PRSV
Khảm lá và quả
28
Watermelon mosaic virus –
WMV
Virus
29
Zucchini yellow mosaic
virus – ZYMV
30
Tomato spotted wilt virus –
TSWV
Khảm lá
31 Cucumber mosaic virus - CMV Khảm lá
32 Squash mosaic virus - SQMV Khảm lá
Tuyến
trùng
33 Meloidogyne incognita Hại rễ
34 Meloidogyne javanica Hại rễ
35 Meloidogyne arenaria Hại rễ
36 Rotylenchus reniformis Hại lá
1.1.3. Bệnh virus hại dƣa hấu
Virus cũng là một nguyên nhân chính làm giảm năng suất cũng như chất lượng
dưa hấu. Các triệu chứng bệnh virus xuất hiện ở dưa hấu cũng như các cây trồng
khác trong họ bầu bí có thể phân thành 3 nhóm điển hình: (1) khảm lá, lá biến dạng,
hình dạng và màu sắc vỏ quả bị biến dạng; (2) Các lá già bị vàng, sau đó toàn bộ

12
cây bị vàng lụi đi, lá thường dày lên bất thường; (3) Cháy lá. Trên thế giới, có hơn
10 loại virus gây ảnh hưởng khá nghiêm trọng cho dưa hấu, trong đó phổ biến và
gây hại nặng nề nhất là virus đốm vòng đu đủ (papaya ringspot virus type W -
PRSV-W), virus khảm dưa hấu (watermelon mosaic virus - WMV), virus khảm
vàng bí ngô (zucchini yellow mosaic virus -ZYMV và virus khảm dưa chuột
(cucumber mosaic virus -CMV và rất khó kiểm soát. Triệu chứng đặc trưng của 4
loại bệnh virus này khá giống nhau gây ra triệu chứng khảm và biến dạng ở lá và
quả, vì thế rất dễ gây nhầm lẫn khi nhận biết virus (Krubphachaya et al., 2007; Lê
Thị Ánh Hồng, 2002).
Trong công tác kiểm soát các bệnh virus hại cây trồng, việc sử dụng các loại
thuốc kháng sinh là không có tác dụng. Các biện pháp kiểm soát chủ yếu nhằm vào
việc đề phòng virus thông qua việc tiêu diệt các vector truyền bệnh, thường dùng là
phun thuốc trừ sâu để tiêu diệt các loại côn trùng truyền bệnh, sử dụng thuốc diệt cỏ
để tiêu diệt cỏ dại cũng như các thực vật khác mang mầm bệnh, tạo tính kháng đối
với virus cho cây trồng. Khi cây đã bị nhiễm virus, các phương pháp kiểm soát trên
không còn tác dụng. Trong các biện pháp phòng bệnh virus hại cây trồng hiện nay,
biện pháp có hiệu quả nhất là tạo ra tính kháng đối với virus cho cây.
Do dưa hấu là loại cây trồng rất nhạy cảm với nhiều loài vi khuẩn, nấm và
virus gây bệnh nên việc cải thiện khả năng kháng bệnh của dưa hấu bằng kỹ thuật di
truyền đã và đang rất được quan tâm nghiên cứu. Khả năng kháng tự nhiên đối với
một số loại virus đã được xác định trong một số loài dưa hấu hoang dã, như kháng
WMV 2 (Xu et al., 2004), ZYMV (Ling et al., 2009; Xu et al., 2004) hoặc PRSV-w
(Strange et al., 2002; Guner et al., 2002), tuy nhiên quả của những loài dưa hấu này
lại có chất lượng kém, đòi hỏi phải mất nhiều năm để đánh giá, lựa chọn, lai tạo để
tạo giống có khả năng kháng được virus và chất lượng quả tốt. Các phương pháp
truyền thống đã tạo ra các giống dưa hấu có khả năng kháng bệnh thán thư, bạc lá,
bệnh héo do nấm Fusarium (Mohr, 1986; Crall et al., 1994), nhưng đối với một số
bệnh như bệnh đốm quả do vi khuẩn, bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV, bệnh khảm
dưa hấu do WMV, bệnh khảm vàng bí xanh do ZYMV đang gặp rất nhiều khó khăn

13
trong việc tạo giống kháng bệnh bằng các phương pháp này. Trong khi đó, công
nghệ chuyển gen ngoài việc giúp rút ngắn thời gian chọn tạo giống so với phương
pháp truyền thống đồng thời vẫn không làm mất đi những đặc tính tốt sẵn có ở các
cây chuyển gen do đó được coi là phương pháp có hiệu quả để kiểm soát các bệnh
virus hại cây trồng nói chung, trong đó có dưa hấu. Cho đến nay, đã có nhiều công
bố về nghiên cứu chuyển gen vào dưa hấu như chuyển gen để tăng cường tính
kháng đối với bệnh héo rũ do nấm Fusarium gây ra thông qua ống phấn (Chen et
al., 1998), chuyển gen chỉ thị gus và gen kháng thuốc diệt cỏ bar thông qua A.
tumefaciens (Akashi et al., 2005; Park et al., 2005; Suratman et al., 2010; Cho et al.,
2008), chuyển gen biểu hiện protein HAL1 của Saccharomyces để làm tăng tính
chịu mặn (Ellul et al., 2003), chuyển gen kháng CGMMV (Park et al., 2005),
WMV-2 (Zhong et al., 2003), chuyển gen kháng đồng thời WMV, ZYMV và PRSV
(Niao et al., 2005) hoặc ZYMV và PRSV (Yang et al., 2010). Tuy nhiên, cho đến
nay, việc chuyển gen vào các giống dưa hấu chưa được tiến hành ở Việt Nam.
1.2. PRSV và PRSV gây hại trên dƣa hấu
Năm 1949, Jensen lần đầu tiên phát hiện virus đốm vòng đu đủ ở Mỹ và phân
lập virus từ đu đủ Hawaii. Sau đó virus lần lượt được tìm thấy ở khắp các quốc gia
trên thế giới, đặc biệt là ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (các nước vùng Caribê,
Ấn Độ, Nam Mỹ, Trung Quốc, Thái Lan, Philippin, Malaisia, Việt Nam,…)
(Shinichiro et al., 2005).
1.2.1. Phân loại
PRSV là virus thực vật, thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae. Potyvirus có
khoảng 160 loài, là chi gây ảnh hưởng lớn nhất đến sự sinh trưởng, phát triển của
cây trồng trong số các virus gây bệnh ở thực vật (Gonsalves et al., 2009). Dựa vào
hình thái phân tử virus, khả năng lan truyền thông qua các loài rệp, quan hệ huyết
thanh và khả năng tạo thể vùi hình bánh xe trong tế bào kí chủ, PRSV được chia
thành hai chủng: PRSV-w và PRSV-p (James, 2011 ; Shinichiro et al., 2007).

14
PRSV-p phổ biến hơn, gây thiệt hại lớn nhất tới đu đủ và một số cây họ bầu
bí, còn PRSV-w chỉ gây hại trên họ bầu bí mà không gây hại trên cây đu đủ
(Edwardson & Christie, 1986). Các triệu chứng do PRSV-p gây ra trên cây trồng
bao gồm những vết đốm vòng và sự biến dạng của lá, quả, thân và cuống lá xuất
hiện những vệt thối hoặc úng nước. Trong khi đó, PRSV-w gây ra những triệu
chứng đặc trưng như khảm và biến dạng ở lá và quả. Mức độ biểu hiện triệu chứng
phụ thuộc vào chủng virus, giai đoạn nhiễm bệnh cũng như thể trạng của cây trồng
(Purcifull et al., 1984).
Nghiên cứu trình tự gen của các dòng virus từ Thái Lan, Việt Nam, Philippin,
Ấn Độ,… cho thấy mức độ tương đồng giữa hai dạng PRSV-p và PRSV-w khá cao,
sự sai khác có thể do quá trình tiến hóa cũng như sự khác nhau về vùng phân bố. Từ
phân tích sự tương đồng giữa hai dạng có giả thuyết cho rằng PRSV-p tiến hoá từ
PRSV-w do đột biến.
1.2.2. Cấu trúc
PRSV không có vỏ bọc, nucleocapsid có dạng hình sợi, xoắn, dài khoảng
760-800nm, đường kính 12nm (Purcifull et al., 1984). Bộ gen của virus là một
sợi RNA đơn dương chứa 5,5% acid nucleic liên kết với protein (VPg) ở đầu 5’
và có đuôi poly(A) ở đầu 3’. Sợi RNA genome này được bao bọc bằng vỏ protein
(capsid). Vỏ protein là sự lặp lại của những tiểu phần nhỏ là protein vỏ (coat
protein) (Bernsein et al., 2001; Gonsalves et al., 2009).
Hệ gen của PRSV có kích thước 10326 nucleotide, ngoại trừ đầu poly(A),
và chứa một khung đọc mở lớn bắt đầu từ vị trí nucleotide 86-88 và kết thúc ở vị
trí 10118-10120, mã hoá cho một polyprotein chứa 3344 amino acid. Polyprotein
này được xử lý hậu dịch mã tạo thành 12 loại protein. Trình tự bảo thủ cao
(AAAUAAAANANCUCAACACAUA) ở đầu 5’ của PRSV đóng vai trò quan
trọng cho sự tái bản của virus (Park et al., 2005; Nishantha J, 2004; Bateson et
al., 2002).

15
(Nguồn: Gonsalves et al., 2009)
Trong các protein của Potyvirus, bao gồm PRSV, hai protein được quan tâm
nhiều nhất là protein vỏ (CP) và protein sao chép (Nib), ngoài ra, Hc-Pro gần đây cũng
được quan tâm nghiên cứu trong việc tạo cây chuyển gen kháng virus.
1.2.2.1. Protein vỏ (coat protein – CP)
Protein vỏ là một protein đa chức năng cần thiết cho sự bao bọc acid nucleic,
tham gia vào sự lan truyền của virus thông qua các loài rệp, sự di chuyển của virus
trong tế bào thực vật (Boulton, 2002).
Chức năng quan trọng nhất của protein vỏ là tham gia tạo capsid bao bọc acid
nucleic của virus nhằm tránh tác dụng phá hủy của enzyme nuclease, giữ cho hình thái
Hình 1.2. Bản đồ tổ chức genome của PRSV
(Nguồn: Báo cáo tổng kết đề tài KC 04, Chu Hoàng Hà
và cs, 2010)
Hình 1.1. Cấu trúc của PRSV (A: PRSV-w; B: PRSV-p)
(Nguồn: Nishantha_Jayathilake, 2004)
(Nguồn: Gonsalves et al., 2009)
A: PRSV dưới kính hiển vi điện tử, B: Cấu trúc bên ngoài

16
và kích thước virus ổn định, tham gia vào sự hấp thụ virus lên vị trí đặc hiệu trên tế bào
mẫn cảm, protein vỏ mang tính kháng nguyên đặc hiệu của virus. Vì vậy, gen CP và
protein vỏ của nó đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sự có mặt của PRSV,
nghiên cứu đa dạng di truyền và tạo cây chuyển gen kháng PRSV (Cuong Viet Ha,
2007).
Protein vỏ được chia thành 3 vùng điển hình, trong đó vùng đầu N- và đầu C- là
những vùng có trình tự bảo thủ cao và là vùng của virion tiếp xúc với bề mặt tế bào kí
chủ. Ngoài ra, vùng N- của CP là vùng có trách nhiệm tương tác với protein HC để lan
truyền thành công virus trong cây trồng. Sự lây nhiễn virus cho cây trồng sau khi loại
bỏ vùng N- và C- bằng trypsin cho thấy rằng các vùng này có liên quan nhiều đến khả
năng lây nhiễm của virus. Vùng thứ 3 có ảnh hưởng quan trọng trong CP là vùng
DAG, vùng này cũng có trình tự bảo thủ cao, nằm gần đầu N-, có vai trò quan trọng
trong sự lan truyền của virus thông qua các loài rệp, sự thay thế hay loại bỏ vùng DAG
đều dẫn đến sự giảm mạnh mẽ khả năng lan truyền virus trong cây trồng (Hallan &
Gafni, 2001; Urcuqui-Inchima et al., 2001; Cuong Viet Ha, 2007).
Trong quá trình lây nhiễm, cDNA tương ứng với RNA bộ gen của virus cần phải
di chuyển đến nhân của các tế bào. Sự di chuyển này được thực hiện với sự tham gia
của các protein của virus, các thành phần của tế bào chủ và có thể cả các protein được
tổng hợp từ gen nhân của tế bào chủ (Gafni & Epel, 2002). Mặc dù, việc đưa genome
của virus vào nhân tế bào theo hình thức vận chuyển cả virion nguyên vẹn hay chỉ vận
chuyển phức hợp nucleoprotein còn chưa rõ ràng nhưng sự có mặt của protein vỏ của
virus trong nhân tế bào sau quá trình lây nhiễm đã cho thấy protein vỏ có thể có vai trò
trong quá trình vận chuyển genome của virus vào nhân tế bào. Sự vận chuyển phức hợp
nucleoprotein của virus từ tế bào chất vào nhân tế bào qua các lỗ màng nhân và có sự
tham gia gián tiếp của các thụ thể vận chuyển có nguồn gốc từ tế bào chủ, gọi là các
karyopherin. Các karyopherin liên kết với phức hợp nucleoprotein của virus, sau đó
chúng liên kết với các lỗ màng nhân giúp cho quá trình vận chuyển genome của virus
vào trong nhân được thực hiện. Trong quá trình liên kết giữa các karyopherin với phức
hợp nucleoprotein của virus, protein của virus sẽ được gắn với tín hiệu đặc trưng của

17
nhân, và những dấu hiệu đó chủ yếu được gắn vào vùng đầu N-, một số ít được gắn vào
vùng đầu C- của CP (Gafni & Epel, 2002; Kunik et al., 1998; Liu et al., 1999; Unseld
et al., 2001).
Protein vỏ cũng tham gia vào quá trình vận chuyển acid nucleic của virus từ nhân
tế bào chủ ra tế bào chất. Trong trường hợp này, một tín hiệu vận chuyển acid nucleic
cũng được các karyopherin gắn vào vùng đầu C- hoặc vùng trung tâm của protein vỏ
của virus (Rhee et al., 2000; Unseld et al., 2001). Có thể khẳng định rằng, ngoài chức
năng bao bọc, bảo vệ acid nucleic, protein vỏ còn có vai trò quan trọng trong việc vận
chuyển genome của virus trong tế bào chủ.
1.2.2.2. Protein Nib
Protein Nib là RNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA
polymerase, RdRp), chịu trách nhiệm tái bản sợi RNA dương và âm của virus, có vai
trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm và sao chép genome của virus trong ký chủ.
RdRp cùng với các thành phần khác của virus và tế bào chủ tạo thành một phức hợp
sao chép thực hiện quá trình tái bản genome của virus. RdRp đóng vai trò quan trọng
trong giai đoạn sớm của sự tái bản genome của virus và làm tăng khả năng ức chế của
enzyme này, được xem như chìa khóa tổng hợp một phân tử đặc biệt, ví dụ như scFv
ức chế hoạt động của enzyme RdRp. Nói cách khác, việc ngăn cản hay ức chế hoạt
động RdRp có thể phá vỡ sự tái bản của virus ở giai đoạn sớm một cách hiệu quả hơn.
(Cuong Viet Ha, 2007; Anindia et al., 2005)
1.2.2.2. Protein HC
Helper component-proteinase (HC-Pro) là một protein đa chức năng có liên
quan đến khả năng truyền qua vector côn trùng ở cây. Mặt khác HC-Pro là một
protease có vai trò phân cắt các polyprotein thành các protein chức năng do đó có
vai trò quan trọng trong sự hoàn thiện các đa phân tử protein sau dịch mã, sự biểu
hiện và ức chế biểu hiện các triệu chứng của virus sau phiên mã (Cuong Viet Ha,
2007).

18
Nghiên cứu ban đầu đã chứng minh sự tham gia của HC-Pro của các potyvirus
trong sự truyền qua vector côn trùng ở cây trồng. HC-Pro có hoạt tính sinh học cho
phép truyền tải các virion, sự tương tác giữa protein HC và protein vỏ cũng như
tương tác với chính cá thể rệp là cần thiết cho sự lan truyền của rệp trong cây trồng.
Các thử nghiệm cho thấy rằng sự tương tác giữa protein HC và protein vỏ của
potyvirus tăng ở những cá thể rệp có sự lây nhiễm vào cây trồng hơn so với những
cá thể rệp không được lây nhiễm. Những nghiên cứu về khả năng của một protein
HC trong việc giữ lại một virion trong các cá thể rệp đã cho thấy mức độ truyền
potyvirus ở các loài rệp khác nhau là khác nhau (Wang et al., 1998)
Hai tiểu phần được coi là có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lan truyền
của rệp trong cây trồng là vùng đầu N và vùng trung tâm trong HC-Pro. Sự bảo thủ cao
của 3 liên kết peptide (Lys-Ile/ Leu-Thr/Ser-Cys) được tìm thấy trong một vùng giàu
Cys trong khu vực đầu N của HC-Pro (vùng “KITC”) được cho là có liên quan đến sự
tương tác của các potyvirus với ngòi chích của các cá thể rệp (Yap et al., 2009). Sự đột
biến từ Lys thành Glu trong vùng KITC trong HC-Pro của Potato virus C không có ảnh
hưởng đến khả năng truyền tải virion của HC-pro. Tuy nhiên, các HC-Pro của PVY đã
có mặt trong đường ống tiêu hóa của rệp cho thấy rằng đột biến từ Lys thành Glu của
PVC lại có ảnh hưởng đến khả năng tương tác của HC-Pro với CP hay cá thể rệp.
Ngược lại, sự ngăn cản khả năng lan truyền của rệp cũng như sự truyền tải các virion
do các đột biến ở trình tự bảo thủ cao Pro-Thr-Lys (PTK) trong vùng trung tâm của
HC-pro của ZYMV lại cho thấy rằng khu vực cho phép truyền tải virion nằm bên ngoài
vùng đầu N (Cuong Viet Ha, 2007; Yap et al., 2009).
Gal-on và Raccah (2000) đã báo cáo rằng sự thay thế Ile cho Arg trong trình tự
bảo thủ Phe-Arg-Asn-Lys (FRNK) ở vùng trung tâm của HC-Pro có ảnh hưởng tới sự
biểu hiện triệu chứng virus ở cây trồng (Gal-on & Raccah, 2000). Dưa chuột và dưa
hấu bị nhiễm với ZYMV có chứa đột biến này thì bị mất triệu chứng bệnh trong khi
các triệu chứng trên bí đao lại biểu hiện ở nhiều cấp độ nặng nhẹ khác nhau mặc dù sự
tích lũy virus ở các cây trồng này đều đạt đến một mức độ như nhau đối với ZYMV.
Những sự thay đổi một amino acid trong HC-Pro của Plum pox virus (PPV) cũng gây

19
ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự biểu hiện các triệu chứng ở các cây thân thảo (Sáenz et
al., 2001).
Vùng trung tâm của HC-Pro còn có vai trò trong quá trình sao chép RNA của
virus, đột biến trong trình tự bảo thủ cao Ile-Gly-Asn (IGN) dẫn đến kìm hãm quá trình
sao mã RNA. Mặt khác, đột biến trong trình tự bảo thủ cao Cys-Cys/Ser-Cys (CC/SC)
cũng kìm hãm sự di chuyển của virus qua các tế bào (Urcuqui-Inchima et al., 2000).
HC-Pro còn có vai trò ức chế một cách hiệu quả sự làm câm gen sau phiên mã
(Kasschau & Carington, 2001). Kasschau & Carington (2001) đã chứng minh vai trò
của HC-Pro trong sự di chuyển cũng như sao chép hệ gen của virus phụ thuộc vào sự
ức chế quá trình làm câm gen sau phiên mã, các đột biến ở vùng trung tâm của HC-Pro
đã gây ra những sai sót trong sự di chuyển, sao chép cũng như các sai sót trong sự ức
chế quá trình làm câm gen sau phiên mã của virus (Kasschau & Carington, 2001).
1.2.3. Phạm vi kí chủ, cơ chế truyền bệnh
Phạm vi kí chủ :
PRSV-p gây hại trên 15 loài của 3 họ thực vật là Caricaceae, Cucurbitaceae và
Chenopodiaceae trong khi PRSV-w gây hại trên 38 loài của 11 chi trong 2 họ thực
vật Cucurbitaceae và Chenopodiaceae (Babadoost et al., 2000; Shinichiro et al.,
2007).
Cơ chế truyền bệnh:
Nhìn chung, virus không thể tự lan truyền, chúng luôn phải nhờ một sự trợ
giúp từ bên ngoài để có thể lây lan (Song et al., 2004). PRSV truyền bệnh bằng hai
cách: Một là do tiếp xúc cơ giới như thông qua các vết thương cơ giới do trong quá
trình canh tác con người vô ý tạo ra, do gió mưa, động vật gây xây sát; Hai là do
côn trùng môi giới chủ yếu là các loài rệp thuộc họ Aphididae như Aphis gosipii,
Aphis crasivora, đặc biệt loài rệp Myzus persicae, loài rệp này cũng thường gây hại

20
nhiều cho các loại rau cải, bầu bí, mướp, dưa... Bệnh lây lan rất nhanh, nhất là
những cây được 5 – 6 tháng tuổi trở lên.
1.2.4. Biện pháp phòng trừ
Do tính chất gây hại chủ yếu trong hệ mạch dẫn, khả năng phát tán nhanh
chóng qua các môi giới truyền bệnh nên bệnh có mức độ phát triển mạnh, dễ gây
thành dịch. Đây là một trong những loại bệnh khó phòng trừ, các biện pháp hóa học
ít có tác dụng.
Trên thế giới, nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã được áp
dụng như :
-Loại bỏ nguồn bệnh bằng cách chọn cây giống tốt, có sức đề kháng cao, xử
lý hạt giống (bằng nhiệt, hóa chất,…).
-Theo dõi và phá hủy cây bệnh ngay từ khi bắt đầu có biểu hiện bệnh lý
nhằm tránh lây lan sang cây khác.
-Phòng trừ môi giới truyền bệnh: dùng thuốc diệt trừ côn trùng truyền bệnh,
dùng bẫy thu hút, bắt và tiêu diệt côn trùng có hại,...
-Áp dụng các biện pháp xen canh, luân canh, phun thuốc diệt cỏ,…
Tuy nhiên, các biện pháp kể trên không mang lại hiệu quả cao trong việc
phòng trừ đối với bệnh mà lại tốn rất nhiều công sức. Vì thế, hướng giải quyết tốt
nhất để phòng và trừ bệnh là cần thiết phải có những giống cây có khả năng kháng
lại loại virus này. Đây là biện pháp đang được các nhà khoa học Việt Nam cũng như
thế giới quan tâm và coi đó như là một phương hướng trong chiến lược phòng trừ
bệnh virus hại cây trồng hiện nay cũng như trong tương lai (Song et al., 2004).
1.2.5. PRSV gây bệnh trên dƣa hấu
Virus gây bệnh đốm vòng đu đủ là một trong những nguyên nhân chính gây
bệnh trên họ bầu bí, trong đó có dưa hấu. Các mô tả về triệu chứng do PRSV gây ra
trên cây họ bầu bí cho thấy hầu hết cây trong họ bầu bí nhiễm bệnh đều do PRSV-w

21
gây ra (Strange et al., 2002; Guner et al., 2002), với triệu chứng như khảm loang lổ,
biến dạng, hoại tử trên lá, quả và thân (Guner et al., 2002; Halliwell et al., 1979).
Các đốm sáng xuất hiện là do hàm lượng diệp lục bị giảm mạnh, dẫn đến giảm khả
năng quang hợp và ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm.
Cùng với ZYMV, PRSV-w thường xuyên lây nhiễm vào dưa hấu (đồng thời hoặc
riêng lẻ) và lan truyền nhanh chóng thông qua các loài rệp, các vết thương cơ giới,
gây ra sự sụt giảm năng suất nghiêm trọng (Ma et al., 2005; Provvidenti et al., 1984;
Xu et al., 2004).
1.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus
Chuyển gen vào cây trồng đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong tạo giống
cây trồng. Cho đến nay, rất nhiều loại gen đã được chuyển vào cây trồng và nhiều
loài cây chuyển gen được trồng thử ở điều kiện đồng ruộng, nhiều loại cây chuyển
gen được sản xuất đại trà như cà chua, bông, cải dầu, ngô, khoai tây,… Năm 2011,
có hơn 160 triệu ha cây trồng biến đổi gen, tương đương với 10,67% tổng diện tích
đất nông nghiệp trên toàn thế giới (1,5 tỷ ha), tập trung chủ yếu ở các quốc gia như
Mỹ (66,8 triệu ha), Brazil (25,4 triệu ha) Achentina (22,9 triệu ha), Ấn Độ (9,4 triệu
ha), Canada (8,8 triệu ha), Trung Quốc (3,5 triệu ha),... Cây trồng chuyển gen có thể
được tạo ra với các đặc tính như kháng virus, kháng côn trùng, chín chậm, kháng
chất diệt cỏ, tăng hàm lượng chất dinh dưỡng,… (Guner et al., 2002).
1.3.1. Kỹ thuật RNAi
1.3.1.1. Lịch sử phát triển
RNAi (RNA interference) là cơ chế tự nhiên của tế bào sống, làm bất hoạt sự
hoạt động của một gen nào đó sau quá trình phiên mã thông qua cơ chế can thiệp
của các RNA nhỏ. Hiện tượng này được quan sát lần đầu tiên trên những cây thuốc
lá kháng bệnh đốm vòng do virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ring spot virus -
TRSV) gây ra (Wingard, 1928).
Năm 1990, nhiều báo cáo gây bất ngờ của các nhà khoa học Mỹ và Hà Lan khi
nghiên cứu chuyển gen sinh tổng hợp Chalcone, gen mã hóa cho enzyme quy định

22
màu sắc hoa (Chalcone synthase - CHS), nhằm tăng thêm màu tím đậm trên cây hoa
dã yên thảo (petunia). Tuy nhiên, kết quả không được như mong muốn, thay vì
được làm đậm thêm màu hoa thì các cây hoa chuyển gen thu được lại có biểu hiện
khảm trắng hoặc trắng tuyền. Điều này chứng tỏ lượng Chalcone đã được tổng hợp
ít đi do sự hoạt động của gen chalcone đã bị ảnh hưởng dẫn đến sự giảm lượng sắc
tố của hoa. Một điều thú vị nữa là qua các thế hệ, màu trắng của cánh hoa lại giảm
đi, các cánh hoa lại dần dần chuyển sang màu tím. Những nghiên cứu sâu hơn về
kiểu hình của cây đã cho thấy sự mất điều khiển ở đây là do sự ức chế sau phiên mã
sự biểu hiện gen tổng hợp chalcone thông qua việc tăng tỷ lệ phân hủy mRNA
(Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990). Một vài trường hợp tương tự cũng
được quan sát thấy trên một số đối tượng thực vật và nấm (Cogoni et al., 1994;
Romano & Macino, 1992). Thuật ngữ “co-supperession” (đồng ức chế) được sử
dụng để chỉ hiện tượng này.
Các hiện tượng trên vẫn chưa thực sự giải thích được cho đến năm 1998, Fire
và Mello đã lây nhiễm sợi đôi RNA (double stranded RNA, dsRNA) bao gồm cả sợi
có nghĩa (sense) và sợi vô nghĩa (antisense), mã hóa cho một protein cơ bắp vào
giun tròn C. elegans, cơ chế RNAi đã được làm sáng tỏ. Họ phát hiện khi chỉ tiêm
phân tử RNA mã hóa cho protein cơ bắp (sợi có nghĩa) không làm thay đổi hành vi
của giun tròn, khi tiêm phân tử RNA đối mã với RNA trên (sợi vô nghĩa) cũng
không làm thay đổi gì. Tuy nhiên, khi tiêm đồng thời cả sợi có nghĩa và sợi vô
nghĩa thì giun tròn có những cử động lạ, cụ thể là co giật. Các biểu hiện này tương
tự như ở những con giun tròn hoàn toàn thiếu gen tổng hợp protein cơ bắp này. Fire
và Mello đã giải thích hiện tượng trên là do có trình tự nucleotide hoàn toàn bổ sung
với nhau nên sợi có nghĩa và sợi vô nghĩa RNA đã kết hợp lại với nhau tạo ra RNA
sợi đôi, và cho rằng phân tử RNA sợi đôi đó có thể làm bất hoạt gen mang cùng mật
mã với chúng. Fire và Mello đã sử dụng thuật ngữ “RNA interference” (RNAi) để
đặt tên cho cơ chế này. Khám phá này đã làm sáng tỏ nhiều thí nghiệm tiến hành
trước đó, đồng thời đề ra một cơ chế tự nhiên để kiểm soát thông tin di truyền, mở

23
ra một lĩnh vực nghiên cứu mới (Fire et al.., 1998). Nhờ những phát minh quan
trọng này, năm 2006 Fire và Mello đã được trao giải thưởng Nobel về Y học.
1.3.1.2. Cơ chế hoạt động RNAi trong cây trồng
RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA. Ở
thực vật có 3 con đường ức chế RNA: (1) ức chế gen sau phiên mã (post-
transcriptional gene silencing, PTGS) thông qua siRNA (short interfering RNA); (2)
ức chế gen sau phiên mã qua con đường tạo ra các miRNA (micro-RNA) trong điều
chỉnh biểu hiện gen của tế bào; (3) sự câm gen phiên mã (transcriptional gene
silencing – TGS) bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp
qua siRNA, nó bao gồm sự methyl hóa histone và ADN (Baulcombe, 2004).
Các thành phần quan trọng tham gia vào cơ chế RNAi là enzyme Dicer,
enzyme Argonaute, phức hệ RISC (RNA-incluced silencing complex), siRNA hoặc
miRNA.
Sự ức chế RNA thông qua siRNA xảy ra ở tế bào chất và là con đường quan
trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus, nơi mà dsRNA có thể sao chép gián tiếp
hoặc một đặc điểm cấu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn. Đối với những virus có
genome là ADN, các dsRNA có thể được tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung gối
nhau (Baulcombe, 2004). Khi chuỗi xoắn kép RNA (dsRNA) xuất hiện trong tế bào
chất, Dicer – một loại ribonuclease III đặc hiệu cho các dsRNA được hoạt hóa
thông qua sự phân hủy một phân tử ATP và lập tức cắt những chuỗi kép RNA này
thành những đoạn ngắn khoảng 21 – 25 nucleotide, gọi là siRNA (Hammond et al.,
2000; Zamore et al., 2000, Hannon, 2002, Pare & Hobman, 2007). Khi lai những
RNA cho thấy, đó là những sợi đôi có chứa nhóm phosphate ở tận cùng đầu 5’. Sau
khi bị cắt bởi Dicer, chuỗi kép siRNA đi vào phức hệ RISC và được các helicase
trong phức hệ RISC cắt các liên kết hydro tách chúng ra làm hai chuỗi đơn, trong đó
chỉ có một chuỗi đơn siRNA có đầu 5’ có hoạt lực với Argonaute mới được gắn với
phức hệ RISC tạo phức hợp siRNA-RISC, quá trình này có tiêu tốn năng lượng
ATP (Schwarz et al., 2002, Redfern et al., 2013, Riley et al., 2012, Ender &

24
Meister, 2010). Phức hợp siRNA-RISC nhận biết các phân tử mRNA của tế bào có
trình tự tương đồng với trình tự của chuỗi đơn siRNA. Sau quá trình nhận dạng, các
mRNA và siRNA bắt cặp bổ sung với nhau ở đoạn tương đồng, mRNA bị cắt đứt ở
khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA tạo thành những đoạn nhỏ khoảng 12
nucleotide từ đầu 3’. Sau khi bị cắt đứt, mRNA bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease
(hình 1.4) (Verdel et al., 2004).
Cơ chế ức chế miRNA: Ngay sau khi phát hiện ra RNAi, người ta nhanh
chóng nhận ra rằng cơ chế này đã tồn tại từ lâu trong tế bào bởi một hệ thống điều
hòa biểu hiện gen gọi là micro-RNA (miRNA). miRNA là một loại RNA nhỏ, kích
thước khoảng 21-24 nucleotide, không mã hóa thông tin di truyền, có chức năng
chủ yếu là điều khiển âm sau phiên mã vì cặp base có trình tự gần như bổ sung hoàn
toàn với mRNA đích (Bartel et al., 2004). Khác với siRNA, miRNA có nguồn gốc
từ các mRNA có cấu trúc kẹp tóc được phiên mã từ hệ gen nhân trong khi siRNA
thường có nguồn gốc từ mRNA sợi đôi hoặc những cấu trúc kẹp tóc kéo dài được
phiên mã từ transposon, ADN virus hoặc ADN ngoài nhiễm sắc thể. Trong nhân tế
bào, các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gene gọi
là các phân tử miRNA nguyên thuỷ (pri- miRNA), các phân tử này có chứa các cấu
trúc kẹp tóc (hairpin) và bị cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi pre-
miRNA (phân tử tiền microRNA). Các pre-miRNAs sau đó được di chuyển ra ngoài
tế bào chất và bị enzyme Dicer cắt thành những đoạn ngắn miRNA sợi đôi (khoảng
19 – 21 nucleotide). Sau đó, các miRNA sợi đôi bị helicase cắt các liên kết hydro
tạo ra miRNA sợi đơn, trong đó chỉ có một sợi có đầu 5’ có hoạt lực với Agronaute
mới được kết hợp với phức hệ RISC tạo thành phức hợp miRNA-RISC. Ở thực vật,
cơ chế tương tác giữa phức hợp miRNA-RISC với mRNA đích sẽ dẫn đến sự tiêu
hủy mRNA, từ đó ức chế biểu hiện gen. Tuy nhiên, ở động vật, phức hợp miRNA-
RISC thường can thiệp chủ yếu bằng cách cản trở quá trình dịch mã của mRNA
(Jones-Rhoades và Bartel, 2004). Mức độ tương đồng của miRNA trong phức hệ
RISC với mRNA đích sẽ quyết định đến hiệu quả bất hoạt quá trình dịch mã của
mRNA. Nói chung, mRNA đích sẽ bị tiêu hủy nếu trình tự của nó tương đồng hoàn

25
toàn với trình tự của miRNA. Mặt khác, nếu trình tự của miRNA chỉ cần tương
đồng với mRNA đích từ vị trí nucleotide thứ 2 đến 8 tính từ đầu 5’ thì miRNA sẽ
liên kết với mRNA đích và ngăn cản sự dịch mã mà không làm tiêu hủy mRNA
(Denli et al., 2004) (hình 1.4).
Hình 1.3. Con đƣờng tạo thành RNAi. a, b: siRNA; c: miRNA
(nguồn: Dykxhoorn et al., 2003)
Phần lớn miRNA thực vật điều khiển đích của chúng bằng cách cắt mRNA
trực tiếp ở vùng mã hóa (Bartel và Bartel, 2003; Bartel, 2004). Một vài miRNA
thực vật được chứng minh là mấu chốt trong sự phát triển lá và ra hoa thông qua
gen đích là các nhân tố phiên mã liên quan (Reinhart et al., 2002; Bartel và Bartel,
2003). Khác với nhân tố phiên mã, miRNA có thể nhắm tới một giới hạn phiên mã
rộng, quy định sự phát triển theo hướng đặc hiệu mô hoặc phản ứng với một giới
hạn áp lực môi trường (Jones-Rhoades và Bartel, 2004; Adai et al., 2005). Các kiểu
biểu hiện khác nhau và sự phong phú tiềm năng gen đích mRNA gợi ý rằng miRNA
có thể điều khiển nhiều quá trình sinh lý và có thể đóng một vai trò trực tiếp trong
sự di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ở thực vật (He và Hannon, 2004;
Kidner và Martienssen, 2005).

26
Con đường làm câm gen thứ ba liên quan tới sự methyl hóa phân tử ADN và
sự ức chế phiên mã. Cơ chế ức chế biểu hiện gen này lần đầu tiên được khám phá
trên thực vật, khi cấu trúc đoạn gen chuyển và RNA virus có xu hướng methyl hóa
ADN tạo nên trình tự nucleotide đặc hiệu (Jones et al., 2001; Mette et al., 2000;
Wassenegger et al., 1994). Năm 2002, khi nghiên cứu sự sinh sản của nấm men,
Volpe và cs đã quan sát thấy sự hình thành sợi tạp sắc ở xung quanh vùng tâm động
được liên kết với siRNA (Volpe et al., 2002). Năm 2003, Zilberman và cs đã phát
hiện sự methyl hóa ADN thông qua siRNA trên thực vật được liên kết với biến đổi
histone (Zilberman et al., 2003). Một vai trò quan trọng của sự câm gen ở mức độ
nhiễm sắc thể là bảo vệ genome tránh những biến đổi gây ra bởi transposon
(Baulcombe, 2004).
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus
Việc chuyển gen nhằm tạo ra những giống cây trồng có khả năng kháng virus
bằng cách sử dụng chính các yếu tố gây bệnh (pathogen-derived resistance - PDR)
có nguồn gốc từ virus đó để chuyển vào cây trồng đang được xem là biện pháp có
hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh virus hại cây trồng (Satyajit et al., 2014). Biện
pháp này đã giúp tạo ra nhiều loài cây trồng có khả năng kháng lại virus (Simón-
Mateo and García, 2011).
Trong các kỹ thuật chuyển gen, RNAi được xem là một trong những kỹ thuật
đem lại nhiều triển vọng và được ứng dụng trong việc tạo ra các giống cây trồng
chuyển gen có khả năng kháng virus. Cho đến nay, đã có nhiều loại cây trồng
chuyển gen kháng nhiều loại virus khác nhau được tạo ra bằng kỹ thuật RNAi thông
qua việc chuyển gen mã hóa cho các protein (CP, Nib, Pro,…) của chính virus đó
như: kháng Potato virus Y (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000), Barley
yellow dwarf virus – PAV (BYDV-PAV) (Wang et al., 2000), Curcumber mosaic
virus (CMV) (Kalantidis et al., 2002), Tobaco mosaic virus (TMV) (Kai et al.,
2005); Curcumber green mottle mosaic virus (CGMMV) (Park et al., 2005),
Tobacco streak virus (TSV) (Pradeep et al., 2012), Rice stripe virus (Zhou et al.,

27
2012), African cassava mosaic virus (ACMV) (Vanitharani et al., 2003; Ruiz-Ferrer
& Voinnet, 2007), Cassava brown streak disease (CBSD) (Patil et al., 2011),
Tomato yellow leaf curl virus (TYLC) (Fuentes et al., 2006), Rice tungro
bacilliform virus (RTBV) (Tyagi et al., 2008), Citrus tristeza virus (CTV) (López et
al. 2010), Potato spindle tuber viroid (PSTVd) (Schwind et al., 2009),… Trong các
nghiên cứu này, người ta thường sử dụng cấu trúc RNAi chứa trình tự gen của virus
lặp lại đảo chiều để chuyển vào cây. Cấu trúc RNAi này sẽ được biểu hiện thành
RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen, từ đó kích
thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây.
Hiệu quả làm câm gen đạt được cao nhất khi cấu trúc hpRNA được lặp lại với
một trình tự intron (ihpRNA) (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001). Năm 2007,
Shinichiro Kamachi và cs đã tạo được một số dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng
kháng virus CGMMV khi chuyển cấu trúc ihpRNA chứa gen mã hóa cho protein vỏ
của virus CGMMV, hiệu quả kháng đối với CGMMV đạt 85,7% ở thế hệ T2. Khi
phân tích RNA trong các dòng cây chuyển gen, các nhà khoa học đã xác định sự có
mặt của các siRNA (Shinichiro et al., 2007). Cũng năm này, Bonfim và cs đã tạo
được một dòng cây đậu chuyển gen kháng Bean golden mosaic virus (BGMV), hiệu
quả kháng đạt được 93% (Bonfim et al., 2007). Nói chung, sự có mặt của các
siRNA đã kìm hãm sự nhân lên của virus trong các tế bào của cây chuyển gen, từ đó
làm chậm sự tích lũy virus, làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh (Gottula
et al., 2009).
Cho đến nay, đã có nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus được
công nhận và trồng thương mại như: đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng
(PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển
gen kháng đồng thời ba loại virus CMV, WMV (Watermelon mosaic virus) và
ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà
chua chuyển gen kháng CMV đã được công nhận và trồng ở Trung Quốc,… Ngoài
ra, rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai
đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn

28
chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen
kháng Maize steak virus (Mastrevirus); khoai tây chuyển gen kháng đồng thời ba
loại virus Potato virus X (PVX), Potato virus Y (PVY), Potato leafroll virus
(PLV),… (Reddy et al., 2009).
Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen
RNAi để tạo giống cây trồng kháng bệnh virus. Kết quả ban đầu cho thấy đã tạo
được các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus
khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus này (Phạm Thị Vân và cs,
2008; Phạm Thị Vân và cs, 2009); Cây đu đủ chuyển gen đa đoạn CP-Nib-HCpro
của PRSV; Cây cam Xã Đoài, cam Sành, quýt đường Canh chuyển gen đa đoạn
RdRp-CP-p20-p23 của CTV,… Đây là tiền đề quan trọng giúp mở ra khả năng ứng
dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên các loại cây trồng quan trọng khác tại Việt
Nam, trong đó có dưa hấu.
1.3.3. Một số hạn chế của công nghệ RNAi và giải pháp
Tuy tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi đã được chứng minh bằng thực tế, có
nhiều giống cây kháng lại các bệnh khác nhau do virus gây ra được nghiên cứu
thành công. Tuy vậy, phương pháp này cũng có một số hạn chế nhất định mà một
trong số đó là tính kháng bệnh của cây chuyển gen đối với một dòng virus nhất định
phụ thuộc vào độ tương đồng của đoạn gen chuyển và trình tự gen tương ứng của
virus đó. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng này nhỏ hơn
90% thì cây chuyển gen không kháng lại được dòng virus đó. Mặt khác, trong quá
trình canh tác trên đồng ruộng, cây trồng có thể bị nhiễm đồng thời với nhiều loại
virus khác nhau. Hơn nữa, nhiều loại virus có khả năng chống lại cơ chế đề kháng
bằng RNAi của thực vật thông qua biểu hiện các protein của virus có khả năng ức
chế biểu hiện gen của tế bào chủ, nhiều trường hợp dẫn đến hiệu ứng chệch mục
tiêu của các phân tử siRNA hoặc phản ứng kích thích hệ miễn dịch của động vật
phơi nhiễm các phân tử siRNA hoặc sự bão hòa bộ máy câm gen của cây chuyển
gen hoặc sinh vật phơi nhiễm các phân tử siRNA,… làm cho việc nghiên cứu tạo ra

29
cây trồng kháng virus thông qua ứng dụng cơ chế RNAi trở nên khó khăn hơn và
không phải đối với trường hợp virus nào cũng cho kết quả như mong đợi (Nguyễn
Thị Hải Yến, 2012).
Để khắc phục những hạn chế nêu trên, các nhà khoa học đang chú ý đến việc
sử dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp để tạo ra các gen đa đoạn gồm nhiều đoạn thuộc
các gen của các dòng virus hoặc của nhiều loài virus khác nhau bằng. Do gen đa
đoạn thường được tạo ra từ các đoạn có trình tự bảo thủ cao ở một hay nhiều gen
của một hay nhiều dòng virus khác nhau nên cây chuyển gen mang các cấu trúc đó
sẽ có phổ kháng bệnh rộng hơn, hiệu quả kháng bệnh thường cao hơn so với các cây
chỉ được chuyển một gen nguyên bản của một dòng virus.
1.3.4. Một số nghiên cứu chuyển gen tạo tính kháng virus cho dƣa hấu
Cho đến nay, việc nghiên cứu chuyển gen tạo tính kháng virus cho cây dưa
hấu chưa được quan tâm nhiều như các đối tượng thực vật khác. Tuy nhiên đã có
một vài công trình về chuyển gen RNAi tạo tính kháng virus cho dưa hấu và có
những kết quả nhất định.
Năm 2003, Zhong và cộng sự đã chuyển gen mã hóa cho protein vỏ (coat
protein – CP) của virus WMV-2 vào dưa hấu. Khi lây nhiễm WMV-2 cho dưa hấu
chuyển gen, thấy rằng dưa hấu chuyển gen có thể trì hoãn việc nhiễm bệnh và tỷ lệ
nhiễm bệnh cũng như các triệu chứng bệnh giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng.
Năm 2005, Park và cộng sự đã chuyển thành công một đoạn cADN mã hóa
cho protein vỏ của Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) vào dưa hấu và
đặt tên là “Dongdae”. Tỷ lệ chuyển gen đạt được là rất thấp, 0,1% với phương pháp
chuyển gen thông qua vi khuẩn và 0,3% với phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm.
Kết quả phân tích Southern blot cho thấy một hoặc nhiều phiên bản của gen CP của
CGMMV đã được gắn vào genome của dưa hấu ở nhiều vị trí khác nhau. Thí
nghiệm lây nhiễm nhân tạo CGMMV trên dưa hấu chuyển gen cho thấy 10 trong số
140 cây chuyển gen thế hệ T1 có khả năng kháng lại CGMMV.

30
Niao và cộng sự (2005) đã chuyển thành công gen mã hóa protein vỏ của
virus WMV và gen mã hóa cho protein sao chép của ZYMV và CMV vào dưa hấu.
Hiệu quả chuyển gen ở vào mức 0,17% (Niao et al., 2005).
Yang và cộng sự (2011) đã tiến hành chuyển gen mã hóa protein vỏ của
ZYMV và PRSV-w vào lá mầm dưa hấu thông qua vi khuẩn Agrobacterium và đã
thu được những dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng đối với 2 loại virus
gây hại phổ biến nhất này. Đánh giá khả năng kháng bệnh của 10 dòng dưa hấu
chuyển gen kháng ZYMV và PRSV-w cho thấy 2/10 dòng có khả năng kháng tuyệt
đối đối với 2 loại virus nghiên cứu. Ở 2 dòng kháng bệnh hoàn toàn này, có xự xuất
hiện của những đoạn RNA ngắn (siRNA), điều đó càng khẳng định các siRNA là
nguyên nhân gián tiếp làm hỏng gen sau phiên mã và đây chính là cơ chế cơ bản
cho tính kháng đối với virus (Yang et al., 2011).

31
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Nghiên cứu được tiến hành trên 4 giống dưa hấu, trong đó:
Giống D1 có nguồn gốc địa phương (Bình Thuận), quả có vỏ đen, tròn, to,
ruột đỏ và giống D2 có nguồn gốc từ giống F1-Tiểu Long – Thăng Long, quả có vỏ
xanh, hình oval, to, ruột đỏ đang được chọn lọc ở thế hệ F9.
Giống L1 là Dưa hấu lai Hắc Mỹ Nhân F1 Kingkong được sản xuất bởi Công
ty Cổ phần Giống mới, Việt Nam. Giống L2 là Dưa hấu lai F1 TG938 do Công ty
TNHH C.H Việt Nam sản xuất.
2.1.2. Chủng vi sinh vật, vector
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58C1 chứa plasmid pCB-
gusplus do Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam cung cấp. pCB-gusplus có cấu trúc gus-intron nên dễ dàng hơn trong việc
kiểm tra cây chuyển gen bằng phản ứng nhuộm màu (hình 2.1)
Hình 2.1. Sơ đồ vector pCB-gusplus
(Nguồn: Phòng Công nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ Sinh học)

32
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58C1 chứa plasmid
pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro do Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp. pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro
mang cấu trúc RNAi chứa tổ hợp 3 đoạn có độ bảo thủ cao thuộc các gen CP (206
bp), Nib (187 bp) và HCpro (228 bp) của virus PRSV-p trên mẫu đu đủ nhiễm
PRSV được thu thập tại Lý Nhân (hình 2.2).
Hình 2.2. Sơ đồ vector pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro
(Nguồn: Phòng Công nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ Sinh học)
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị, vật tƣ
Panh, kéo, dao cắt, buồng cấy vô trùng, pipetman, cân phân tích, tủ sấy, hệ
thống giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH, máy đo OD, máy khuấy từ,... sử
dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy nghiền mẫu Retsch,
máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), Máy soi ADN (Mini-transllumminatior,
Bio-Rad, Mỹ), Máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy
Votex (Minishaker, IKA, Đức), máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Sigma), hệ thống giàn
đèn nuôi cấy mô tế bào cùng với các trang thiết bị khác sử dụng trong thí nghiệm
biến nạp, đánh giá, phân tích cây chuyển gen.
Giá thể trồng cây TN1 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Trung tâm nghiên
cứu phân bón và dinh dưỡng cây trồng sản xuất.
CP/Nib/HCpro CP/Nib/HCpro

33
2.1.4. Hóa chất
Kit tách chiết RNA (Trizol Reagents Kit), bộ hóa chất sử dụng cho RT-PCR
(Cloned AMV Reverse Transcriptase Kit) (Invitrogen).
Maker ADN 1kb (Fermentas).
Môi trường MS cơ bản bao gồm các muối đa lượng và vi lượng, các chất hữu
cơ và vitamin theo Murashige và Skoog (1962), môi trường nuôi khuẩn LB, đường
sucrose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như: BAP, IBA, NAA, Kinetin, GA3,
các loại kháng sinh như Kanamycin (Km), Rifamycine, Cefotaxime (Cefo),...
Các hóa chất thông dụng khác như: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Tris-
HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCL2, Ethanol 70%, X-gluc, nước cất, nước khử
ion, Taq ADN polymerase, dNTPs…. của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck,
Sigma, Amersham Pharmacia Biotech,…
Các thí nghiệm được tiến hành trên trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất có tại
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ gen,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.5. Địa điểm
Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm trong luận án được bố trí theo sơ đồ hình 2.3. Các thí nghiệm
được chia làm 4 giai đoạn, giai đoạn 1: xây dựng quy trình tái sinh ở cây dưa hấu;
giai đoạn 2: xây dựng quy trình chuyển gen gus vào cây dưa hấu thông qua chuyển
cấu trúc gus-intron; giai đoạn 3: chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào cây dưa
hấu; giai đoạn 4: phân tích cây chuyển gen.

34
2.2.1. Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây dƣa hấu
Các thí nghiệm được bố trí ở điều kiện: nhiệt độ: 25 - 27oC
; thời gian chiếu sáng:
8/16h và cường độ chiếu sáng 2000 lux; mẫu cấy được đặt nằm ngang trên bề mặt
môi trường.
Các công thức thích hợp của thí nghiệm trước sẽ được chọn để áp dụng cho các
thí nghiệm tiếp theo.
2.2.1.1. Khử trùng mẫu
Việc khử trùng mẫu được tiến hành theo phương pháp của Akashi và cs
(2005) có cải tiến. Các bước tiến hành như sau:
Trước hết, hạt dưa hấu được rửa sạch các chất bám bề mặt bằng xà phòng, rửa
lại dưới vòi nước sạch cho đến khi hết bọt xà phòng bám dính trên bề mặt hạt. Sau
đó hạt được đưa vào bình thủy tinh sạch và khử trùng bề mặt trong buồng cấy vô
trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó ngâm trong dung dịch Javel thương mại ở
Xây dựng quy trình tái
sinh cây dƣa hấu
Xây dựng quy trình
chuyển gen gus vào cây
dƣa hấu
Tạo dòng cây dƣa hấu
chuyển gen kháng PRSV
Phân tích cây chuyển gen
Phân tích
PCR, RT-PCR
Đánh giá tính
Kháng PRSV
Chuyển cấu trúc Gus-
plus
Thông qua A.tumefaciens
Chuyển cấu trúc
RNAi/Cp-Nib-HC-pro
Thông qua A.tumefaciens
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

35
nồng độ 30% trong 20 phút rồi rửa lại 3 - 5 lần bằng nước cất khử trùng. Hạt đã khử
trùng bề mặt được bóc vỏ, phôi hạt được tiếp tục khử trùng bằng cồn 70% trong 1
phút, sau đó ngâm trong dung dịch Javel 5% có bổ sung 0,05% Tween-20 trong 5
phút rồi rửa lại 3 – 5 lần bằng nước cất khử trùng và được thấm khô trên giấy thấm
khử trùng. Phôi hạt sau khi khử trùng được cho nảy mầm trên môi trường MS có bổ
sung 30% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,8, nuôi trong tối ở 25 - 27oC
. Sau 3, 5, 7, 9
ngày nảy mầm, các mảnh lá mầm được cắt thành các mảnh nhỏ kích thước khoảng
1 – 2 mm2
và được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.1.2. Tối ƣu quá trình tạo đa chồi từ lá mầm
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm, vị trí mảnh lá mầm đến khả năng tái
sinh chồi dưa hấu
Các mảnh lá mầm của 4 dòng dưa hấu nghiên cứu ở các độ tuổi 3, 5, 7, 9 ngày
tuổi được cắt viền xung quanh lá, sau đó được cắt làm 2 phần trong đó có 1 phần
gần gốc lá mầm, phần còn lại gần ngọn lá mầm để nghiên cứu khả năng tái sinh
chồi của chúng trên môi trường tái sinh MS có bổ sung 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l
IBA, 30% sucrose và 0,8% agar.
Tỷ lệ phát sinh đa chồi của các mảnh lá mầm ở các độ tuổi (số chồi tạo thành /
số mảnh), vị trí tái sinh chồi (phần gần gốc lá mầm / gần ngọn lá mầm), chất lượng
chồi được đánh giá sau 4 – 6 tuần
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng tái sinh đa chồi
dưa hấu
Các mảnh lá mầm dưa hấu ở ngày tuổi và vị trí tái sinh tốt nhất được cắt thành
các mảnh 1 – 2 mm2
, đặt trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8 g/l
agar, 0,5 mg/l IBA và BAP ở các nồng độ khác nhau (Bảng 2.1). Số mảnh lá mầm
phát sinh chồi/số chồi tạo thành/số mẫu cấy ban đầu, chất lượng chồi được đánh giá
sau 4 – 6 tuần.

36
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh có bổ sung IBA và BAP
Tên môi trƣờng Nồng độ BAP (mg/l)
TS0 0
TS1 0,5
TS2 1,0
TS3 1,5
TS4 2,0
TS5 2,5
TS6 3,0
TS7 3,5
TS8 4,0
TS9 7,0
TS10 9,0
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, IBA và NAA đến khả năng tái sinh
đa chồi dưa hấu
Các mảnh lá mầm dưa hấu ở ngày tuổi và vị trí tái sinh tốt nhất được cắt thành
các mảnh 1 – 2 mm2
, đặt trên môi trường tái sinh tốt nhất (thí nghiệm 2) có bổ sung
NAA ở các nồng độ 0,1; 0,2 mg/l trong 4 – 6 tuần.
Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh có bổ sung IBA, BAP, NAA
Tên môi trƣờng Nồng độ NAA (mg/l)
TS11 0,1
TS12 0,2
Chỉ tiêu quan sát: Số mảnh lá mầm phát sinh chồi/số chồi tạo thành/số mẫu cấy
ban đầu, chất lượng chồi.
2.2.1.3. Ảnh hƣởng tổ hợp của IBA và GA3 đến khả năng kéo dài chồi dƣa hấu
Các chồi tái sinh được cấy vào trong môi trường MS có bổ sung 30 g/l đường
sucrose, 8 g/l agar, 0,1 mg/l IBA, 580 mg/l MES và GA3 ở các nồng độ 0; 0,3; 0,5;

37
0,7 mg/l trong 2 tuần.
Bảng 2.3. Nồng độ GA3 sử dụng trên MT kéo dài chồi
Tên môi trƣờng Nồng độ GA3 (mg/l)
KC0 0
KC1 0,3
KC2 0,5
KC3 0,7
Các chồi được cấy vào trong môi trường thạch.
Chỉ tiêu quan sát: Số chồi được kéo dài / mức độ kéo dài chồi / số chồi cấy,
chất lượng chồi sau kéo dài.
2.2.1.4. Ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ cho chồi dƣa hấu
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh, có đầy đủ thân, lá và rễ để chuyển ra
trồng ngoài tự nhiên. Cây con phải khoẻ mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng cao sức
sống khi ra môi trường bên ngoài.
Các chồi sau giai đoạn tái sinh hoặc kéo dài, kích thước > 1cm, khỏe mạnh,
mập mạp có thể được chuyển sang môi trường ra rễ MS có bổ sung IBA với các
nồng độ 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 mg/l hoặc môi trường ½ MS có bổ sung 0,1 mg/l
IBA. Các chồi được cấy thẳng đứng trong môi trường nuôi cấy. Số chồi được ra rễ /
số chồi cấy, chất lượng rễ (số lượng, độ dài, kích thước) được đánh giá sau 2-3 tuần.
Bảng 2.4. Nồng độ IBA sử dụng trên môi trƣờng tạo rễ
Tên môi trƣờng Nồng độ IBA (mg/l)
RR0 (MS) 0
RR1 0,1
RR2 0,2
RR3 0,3
RR4 0,5
RR5 (1/2MS) 0,1

38
2.2.1.5. Ảnh hƣởng của giá thể tiếp nhận đến khả năng thích ứng cây ra môi
trƣờng
Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra giá thể thích hợp cho cây phát triển.
Thời gian tối thiểu để cây con thích nghi được với môi trường sống là 2 – 3 tuần.
Bảng 2.5. Thành phần các loại giá thể thích ứng cây in vitro
Công thức Thành phần giá thể Tỷ lệ
GT1 Giá thể trồng cây : Trấu hun 1: 1
GT2 Trấu hun : Cát đen 1 : 1
Chỉ tiêu quan sát: tỷ lệ cây sống ngoài vườn ươm, sức sinh trưởng của cây.
2.2.1.6. Thu thập và xử lí số liệu tái sinh
Để đánh giá và tìm được môi trường tái sinh cây dưa hấu tốt nhất, các thí
nghiệm được đánh giá theo những công thức sau:
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) =
Tổng số mẫu tạo chồi
x 100
Tổng số mẫu cấy
Số chồi TB/ mẫu =
Tổng số chồi
Tổng số mẫu tạo chồi
Tỷ lệ số chồi ra rễ (%) =
Tổng số chồi ra rễ
x 100
Tổng số chồi nuôi cấy
Số rễ TB/ chồi =
Tổng số rễ
Tổng số chồi ra rễ
Các số liệu được tính toán theo phương pháp phân tích thống kê toán học. Quá
trình xử lí được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Excel 5.0 và được mô
phỏng bằng các bảng và hình.

39
2.2.2. Đánh giá ảnh hƣởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào cây
dƣa hấu thông qua chuyển gen gus
2.2.2.1. Xác định ngƣỡng sống sót của cây dƣa hấu trên môi trƣờng chứa chất
chọn lọc kanamycin (Km)
Để đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ chất chọn lọc Km đến khả năng sinh
trưởng, phát triển của chồi dưa hấu, các chồi dưa hấu D2 (không chuyển gen) đã
được nuôi trên môi trường có bổ sung các nồng độ Km khác nhau (0, 50, 100, 150,
200mg/l) trong 2 – 4 tuần.
Bảng 2.6. Các nồng độ Km sử dụng
Tên môi trƣờng Nồng độ Km (mg/l)
Km0 0
Km1 50
Km 2 100
Km 3 150
Km 4 200
2.2.2.2. Chuẩn bị vật liệu chuyển gen
Hạt dưa hấu được khử trùng như trong mục 2.2.1.1. và được cho nảy mầm
trên môi trường MS, 30% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,8 nuôi trong tối. Sau 5 ngày,
các mảnh lá mầm được cắt thành những mảnh có kích thước khoảng 1 – 2 mm2
và
được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.

40
2.2.2.3. Thành phần các loại môi trƣờng dùng cho nghiên cứu
Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trƣờng
Tên môi trƣờng Công thức
Nuôi khuẩn (LB) 10 g/l trypton, 10 g/l NaCl, 5 g/l extract yeast, pH 7,0
Hòa tan khuẩn
(HTK)
MS, 200 M AS, 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l IBA, pH 5,6
Đồng nuôi cấy
(ĐNC)
MS, 200 M AS, 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l IBA, 30%
sucrose, 0,8% agar, pH 5,6
Tái sinh chồi (TS)
MS, 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l IBA, 30% sucrose, 0,8% agar,
200 mg/l km, 500 mg/l cefo, pH 5,6
Kéo dài chồi (KD)
MS, 0,1 mg/l IBA, 0,5 mg/l GA3, 30% sucrose, 0,8% agar,
150 mg/l km, 500 mg/l cefo, pH 5,6
Tạo rễ cho chồi
(RR)
MS, 0,1 mg/l IBA, 30% sucrose, 0,8% agar, 100 mg/l km,
250 mg/l cefo, pH 5,6
2.2.2.4. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens
Một ngày trước khi biến nạp, tiến hành nuôi lắc một khuẩn lạc vi khuẩn
A.tumefaciens CV58C1 chứa vector pCB-gusplus trong 5 ml LB lỏng có bổ sung 40
mg/l rifamycin, 50 mg/l Spectinomycine, 50 mg/l Streptomycine ở 28oC
trong 6 - 8
giờ với tốc độ lắc 200 v/p. Sau đó, hút 1 ml dịch khuẩn vừa nuôi chuyển sang bình
chứa 50 ml LB lỏng có bổ sung các kháng sinh như trên để tiến hành nuôi lắc qua
đêm cho đến khi đạt đến OD600= 0,7 – 1,0. Tiếp theo, lấy 4 – 5 ml dịch khuẩn trên
nuôi trong 30 ml LB lỏng không bổ sung kháng sinh, nuôi lắc cho đến khi đạt các
nồng độ OD khác nhau trước khi tiến hành biến nạp.
Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ vi khuẩn thích hợp nhất cho biến nạp
Sáu nồng độ vi khuẩn đã được thử nghiệm (OD600= 0,0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9;
1,1) để đánh giá ảnh hưởng của chúng đến hiệu quả quá trình chuyển gen vào 30
mảnh lá mầm của các dòng dưa hấu nghiên cứu. Vi khuẩn được thu nhận bằng ly

41
tâm với vận tốc 4500 v/p trong 15 phút và sau đó được hòa tan trong 50 ml môi
trường hòa tan khuẩn để tiến hành biến nạp.
2.2.2.5. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Thí nghiệm 1: Xác định ngưỡng thời gian nhiễm khuẩn thích hợp nhất cho biến
nạp
Các mảnh lá mầm được cắt thành những mảnh có kích thước khoảng 1 – 2
mm2
, sử dụng đầu lưỡi dao để tạo thêm các vết thương trên mặt lá rồi ngâm vào
dung dịch hòa tan khuẩn trong 15, 30, 45 phút. Sau đó, các mảnh lá được thấm khô
và chuyển vào môi trường đồng nuôi cấy.
Thí nghiệm 2: Xác định ngưỡng thời gian đồng nuôi cấy thích hợp nhất cho biến
nạp
Sau 2, 3, 4, 5 ngày, các mảnh lá mầm được rửa khuẩn trong nước cất khử
trùng có bổ sung 500 mg/l cefo, thấm khô và chuyển vào môi trường tái sinh. Sau 6
tuần, các chồi hoặc cụm chồi thu được được chuyển sang môi trường tạo rễ hoặc
môi trường kéo dài chồi trong 2 – 3 tuần tùy thuộc vào độ lớn của chồi. Các cây ra
rễ trong môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang giá thể trấu hun : cát (1 : 1) trước
khi tiến hành đánh giá cây chuyển gen.
Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ chuyển gen (H) được tính theo tỷ lệ giữa tổng số cây
kiểm tra cho kết quả PCR dương tính với tổng số mẫu biến nạp ban đầu.
H (%) = (tổng số cây PCR dương tính với gen gus hoặc nptII / tổng số mẫu
biến nạp) x 100
2.2.2.6. Kiểm tra biểu hiện của gen gus
Biểu hiện tạm thời hay bền vững của gen gus được phân tích theo phương
pháp của Jefferson (1987). Các mảnh lá mầm sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi
khuẩn Agrobacterium hoặc các bộ phận của chồi dưa hấu được hình thành trên môi
trường chọn lọc được ngâm trong dung dịch X-gluc (Tris/NaCl pH7,2 + 10 mg/ml
X-gluc + 10% Triton X-100) và ủ ở 37oC
trong 24 – 36h. Mảnh lá hoặc mô sẽ được

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng prsv

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng prsv

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng prsv

Similar to Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng prsv (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng prsv