Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu các mối liên quan giữa khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ cao, hạn hán, độ mặn cao, cho các bạn tham khảo

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------
Vũ Thị Hoa Phƣợng
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY
(Solanum tuberosum L.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2015

2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------------------
Vũ Thị Hoa Phƣợng
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY
(Solanum tuberosum L.)
Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ QUỲNH MAI
Hà Nội – 2015

3. LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới cán
bộ hướng dẫn của tôi, TS. Lê Quỳnh Mai, người đã tận tình dạy bảo, dẫn dắt, tạo điều
kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ Phòng thí nghiệm Công nghệ nuôi cấy
Thực vật và Vi tảo, Trung tâm Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Thí
nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Enzyme và Protein, Đại học Khoa Học Tự Nhiên –
Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn tạo điều kiện cho tôi thực hiện thí nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thày giáo, cô giáo và các cán bộ Khoa Sinh học
đặc biệt là các thày, cô giáo và các cán bộ Bộ môn Sinh Lý Thực Vật và Hóa Sinh, trường
Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình giảng dạy cho tôi
trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với gia đình, bè bạn những người
đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong cuộc sống.
Nghiên cứu được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED)
tài trợ kinh phí trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu các mối liên quan giữa khả năng tập
chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ cao, hạn hán, độ mặn cao” với mã số
106.06-2012.14. Trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Tác giả
Vũ Thị Hoa Phƣợng

4. MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................5
1.1. Giới thiệu chung về khoai tây..........................................................................5
1.1.1. Nguồn gốc lịch sử........................................................................................5
1.1.2. Phân loại học ..............................................................................................5
1.1.3. Đặc điểm của cây khoai tây ........................................................................5
1.1.4. Vai trò của khoai tây ...................................................................................7
1.2. Hạn và đáp ứng của thực vật ở cạn trƣớc điều kiện hạn .............................8
1.2.1. Đặc điểm thích nghi của thực vật chịu hạn.................................................8
1.2.2. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật.................9
1.2.3. Đáp ứng hạn của thực vật.........................................................................12
1.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng hạn đến khoai tây ...........................................15
1.4. Tính tập chống chịu của thực vật .................................................................17
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .........................................................20
2.1. Vật liệu.............................................................................................................20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................20
2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................20
2.1.3. Thiết bị.......................................................................................................21
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu .........................................................22
2.2.1. Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu ..............22
2.2.2. Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý..................23
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll.........................................24
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu........................................25
2.2.5. Xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã ở khoai tây (Solanum
tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng tập chống chịu ở
Arabidopsis thaliana ...........................................................................................27
2.2.5.1. Thu mẫu..................................................................................................28
2.2.5.2. Tách RNA tổng số..................................................................................28

5. 2.2.5.3. Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số ................29
2.2.5.4. Xử lý DNA .............................................................................................30
2.2.5.5. Tổng hợp cDNA.....................................................................................30
2.2.5.6. Kiểm tra chất lượng cDNA ....................................................................31
2.2.5.7. Chọn gen đích.........................................................................................32
2.2.5.8. Thiết kế mồi ...........................................................................................33
2.2.5.9. Xác định tương quan mức độ biểu hiện .................................................34
2.2.5.10. Xử lý số liệu .........................................................................................34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................35
3.1. Ảnh hƣởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà 7........35
3.2. Đánh giá các chỉ số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu..................37
3.2.1. Hệ số nhân chồi.........................................................................................37
3.2.2. Chiều cao chồi............................................................................................38
3.2.3. Số lá...........................................................................................................39
3.2.4. Số rễ...........................................................................................................41
3.2.5. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô .......................................................42
3.3. Hàm lƣợng chlorophyll ở khoai tây HH7 đã qua giai đoạn tập chống chịu....44
3.4. Hàm lƣợng proline .........................................................................................45
3.5. Mức độ biểu hiện của một số gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính chịu
hạn của khoai tây...................................................................................................47
3.5.1. Hàm lượng và độ tinh sạch của RNA tổng số ...........................................47
3.5.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA...........................................................48
3.5.3. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMG400014309 (P1)...........................50
3.5.4. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMP400026903 (P2) ...........................51
3.5.5. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMT400045091 (P3)............................53
KẾT LUẬN ................................................................................................................55
KIẾN NGHỊ ...............................................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................57
PHỤ LỤC ...................................................................................................................66

6. DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu................................ 20
Bảng 2.2. Các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu ..................................21
Bảng 2.3. Nồng độ proline và giá trị độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm ...................26
Bảng 2.4. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng qPCR kiểm tra chất lượng cDNA ........31
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng qPCR với thể tích phản ứng 20 µl .......................32
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng qPCR ...............................................................32
Bảng 2.7. Thông tin các gen đích được chọn trong nghiên cứu............................... 33
Bảng 2.8. Các mồi sử dụng trong phản ứng qPCR kiểm tra sự biểu hiện của gen đích .......33
Bảng 3.1. Hàm lượng RNA tổng số và các giá trị đánh giá mức độ tinh sạch ........48
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA ......................................................... 49

7. DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.)....................................................... 6
Hình 1.2. Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn...................................... 13
Hình 1.3. Sơ đồ đơn giản của một quá trình nhận, truyền tín hiệu gây ra đáp ứng tập
chống chịu......................................................................................................... 18
Hình 2.1. Các nội dung nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai tây
(Solanum tuberosum L.) giống HH7.................................................................. 22
Hình 2.2. Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu ........ 23
Hình 2.3. Đường chuẩn proline ................................................................................. 26
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã .............. 28
Hình 3.1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo trên môi trường có
bổ sung sorbitol ................................................................................................. 36
Hình 3.2. Cây khoai tây trên đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt .................................... 36
Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ
sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm .............. 38
Hình 3.4. Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol
khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm............................ 38
Hình 3.5. Số lá trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol
khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm ............................ 40
Hình 3.6. Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ
sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm .............. 41
Hình 3.7. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chồi khoai tây HH7 trên môi
trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ............ 42
ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy) ................................................ 42
Hình 3.8. Hàm lượng chlorophyll trong lá khoai tây HH7 trên môi trường có các
nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
(đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy) .......................................................................... 44

8. Hình 3.9. Hàm lượng proline trong thân và lá khoai tây HH7 trên môi trường có các
nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
(đánh giá sau 4 tuần) ......................................................................................... 46
Hình 3.10. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được xử lý hạn
và mẫu đối chứng của gen PGSC0003DMG400014309 (P1), tương đồng với
gen mã hóa yếu tố phiên mã DREB1A ở Arabidopsis thaliana........................ 51
Hình 3.11. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được xử lý hạn
và mẫu đối chứng của của gen PGSC0003DMP400026903 (P2), tương đồng với
gen mã hóa yếu tố phiên mã RD26 ở Arabidopsis thaliana ............................ 52
Hình 3.12. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện của gen GSC0003DMT400045091
(Gen P3), tương đồng với gen yếu tố phiên mã At4g13040 ở Arabidopsis
thaliana ............................................................................................................. 53

9. BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt/
Kí hiệu
Từ nguyên gốc
ABA Abscisic acid
cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid
Chl. Chlorophyll
Chla Chlorophyll a
Chlb Chlorophyll b
cs. Cộng sự
DNA Deoxiribonucleic Acid
ĐC Đối chứng
ef1α Elongation factor 1-anpha
HH7 Hồng Hà 7
HK House keeping gene (Gen giữ nhà)
MS
Môi trường khoáng cơ bản MS
(Murashige & Skoog, 1962)
qPCR
Quantitative Polymerase Chain Reaction (Phản ứng
chuỗi trùng hợp định lượng)
Ref Reference gene (Gen tham chiếu)
RNA Ribonucleic Acid
ROS
Reactive Oxygen species
(Các dạng chứa oxi phản ứng)
TF Transcription factor (Yếu tố phiên mã)
TN Thí nghiệm

10. 1
MỞ ĐẦU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Tổ chức Nông Lương Thế Giới (FAO) khuyến cáo: Trong tương lai sản xuất
lương thực sẽ cần phải tăng 75% mới có thể cung cấp đủ lương thực cho 9 tỷ người
vào năm 2050. Theo số liệu do Liên hợp quốc công bố ngày 16-10-2010, trên thế giới
có khoảng 1 tỉ người thiếu ăn. Vấn đề an ninh lương thực là một vấn đề thế giới đã
đang và sẽ phải đối mặt. Hơn nữa, biến đổi khí hậu đang diễn biến ngày càng phức
tạp, nắng nóng kéo dài, hạn hán, xâm nhập mặn và nhiều dạng thời tiết khắc nghiệt
đang ảnh hưởng đến trái đất, đặc biệt ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển, năng
suất và chất lượng của cây trồng.
Trước điều kiện tự nhiên bất lợi, thực vật có nhiều cơ chế giúp chúng tồn tại.
Chúng có thể thích nghi (adapted) hoặc tập chống chịu (acclimated) với điều kiện
môi trường. Hai cơ chế này khác nhau cơ bản nhất ở khả năng di truyền và được quy
định ở việc biểu hiện gen thường trực hay có điều kiện. Khả năng thích nghi với điều
kiện sống liên quan đến những thay đổi trong cả một quần thể, trở thành đặc điểm
của loài và được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Ngược lại, khả năng tập
chống chịu mặc dù vẫn liên quan đến biểu hiện gen nhưng chỉ thể hiện dưới các điều
kiện nhất định và những thay đổi này lại không di truyền. Các cây qua giai đoạn tập
chống chịu sẽ thay đổi trực tiếp hình thái và sinh lý để có thể tồn tại trong nhiều loại
điều kiện môi trường khác nhau và những biến đổi trong quá trình tập chống chịu có
thể mất đi khi điều kiện trở lại bình thường. Và trong hoàn cảnh biến đổi khí hậu
đang diễn ra phức tạp như hiện nay, thì việc nghiên cứu tính tập chống chịu của cây
trồng cho chúng ta hi vọng sẽ thu được cây, đặc biệt là cây lương thực, có khả năng
chống chịu với các điều kiện bất lợi biến đổi bất thường.
Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là loại cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế
giới và là cây lương thực đứng thứ tư trên thế giới về mặt sản lượng tươi (xếp sau lúa
mì, gạo và ngô). Khoai tây được coi là ―nguồn lương thực thực phẩm của tương lai‖
đã được trồng trên 100 nước trên toàn thế giới và là thành phần quan trọng trong hệ
thống lương thực thế giới (FAO). Đã có nghiên cứu cho thấy khoai tây là loại cây có

11. 2
khả năng tập chống chịu với một số điều kiện bất lợi [18, 19, 50] . Ở Việt Nam, các
nghiên cứu về khoai tây tập trung chủ yếu vào việc khảo nghiệm, lai giống, tạo củ
nhỏ và một số bệnh cây, chủ yếu là bệnh virus, nhằm cải tạo giống và nâng cao chất
lượng cây. Hầu như chưa có nghiên cứu nào về cơ chế tập chống chịu của loại cây
này trước các điều kiện phi sinh học.
Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng tập chống
chịu hạn hán của khoai tây (Solanum tuberosum L.)”. Qua đề tài những kiến thức
cơ bản xung quanh khả năng và cơ chế tập chống chịu của khoai tây trước điều kiện
hạn sẽ phần nào được làm sáng tỏ. Cũng trong đề tài này, sự biểu hiện của một số
gen liên quan đến chịu hạn sẽ được đánh giá để thấy được vai trò của các gen này
trong quá trình tập chống chịu.
Các nghiên cứu trong luận văn này nằm trong đề tài “Nghiên cứu các mối liên
quan giữa khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ cao, hạn
hán, độ mặn cao” được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED) tài trợ với mã số 106.06-2012.14.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Đánh giá khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây giống.
- Xác định cường độ hạn trong giai đoạn tập chống chịu cho hiệu quả nâng cao
khả năng chống chịu hạn của khoai tây.
- Đánh giá sự thay đổi hàm lượng proline, một chất điều hòa thẩm thấu trong
tế bào được coi là chỉ thị cho quá trình đáp ứng bất lợi về áp suất thẩm thấu của thực
vật, ở cây khoai tây đã qua tập chống chịu hạn.
- Xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã ở khoai tây tương đồng với
các gen liên quan đến khả năng đáp ứng với hạn ở A. thaliana.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Đối tượng thực vật: Khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống HH7.
- Thông số của đối tượng: Các chỉ số sinh lý, sinh hóa gồm hệ số nhân chồi, chiều
cao chồi, số lá, số rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng chlorophyll và hàm
lượng proline ở các cây thí nghiệm và cây đối chứng.

12. 3
- Đối tượng gen: 3 gen mã hóa cho các yếu tố phiên mã ở khoai tây
PGSC0003DMG400014309, PGSC0003DMP400026903 và
PGSC0003DMT400045091 tương đồng với các gen At4g13040.1, At4g27410.2 và
At1g63040 ở A. thaliana, lần lượt. Các gen được chọn là những gen của khoai tây có
mức độ tương đồng về trình tự nucleotide vùng chức năng >90% tương ứng với các
gen ở A. thaliana nêu trên. Trong đó, PGSC0003DMG400014309 và
PGSC0003DMP400026903 là hai gen lần lượt tương đồng với DREB1A và RD26 ở
A. thaliana liên quan đến khả năng chịu hạn đã được nghiên cứu [53];
PGSC0003DMT400045091 là gen có mức độ tương đồng 100% với gen At1g63040 ở
A.thaliana liên quan đến khả năng chống lại các bệnh liên quan đến nấm và khuẩn
[22]. Trong đề tài, các gen PGSC0003DMG400014309, PGSC0003DMP400026903
và PGSC0003DMT400045091 sẽ được nghiên cứu và xác định mức độ biểu hiện
trong quá trình tập chống chịu ở khoai tây.
Thí nghiệm nghiên cứu đánh giá khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây
trên môi trường hạn nhân tạo được bố trí và tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công
nghệ Nuôi cấy Thực vật và Vi tảo và một số phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Sinh Lý
Thực Vật và Hóa Sinh, khoa Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại
học Quốc gia Hà Nội. Một số máy móc thiết bị được sử dụng tại Phòng thí nghiệm
trọng điểm Quốc gia về Enzyme và Protein, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học
Quốc Gia Hà Nội.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây sẽ là một đóng
góp kiến thức quan trọng về sinh lý chống chịu hạn của khoai tây. Trong các nghiên
cứu về khoai tây ở Việt Nam đây là nghiên cứu đầu tiên hướng tới các hiểu biết cơ
bản về sinh lý liên quan đến tính tập chống chịu trước các yếu tố phi sinh học và tập
chống chịu hạn nói riêng.

13. 4
Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài sẽ là một gợi ý hữu ích về một gen đích có thể ứng dụng kỹ
thuật di truyền nhằm đưa lại cho cầy trồng một sức sống mới trong điều kiện biến đổi
khí hậu diễn ra ngày càng bất thường.

14. 5
Chƣơng 1- TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về khoai tây
1.1.1. Nguồn gốc lịch sử
Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây thân thảo, có củ thuộc họ cà, có
nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (Nam Mỹ) ở độ cao 2000-5000m.
Các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều di tích lịch sử chứng minh cây khoai tây có
từ khoảng 500 năm trước Công nguyên. Người Tây Ban Nha lần đầu tiên phát hiện ra
cây khoai tây khi họ đặt chân lên thung lũng Magdalenna (Nam Mỹ). Lúc đó, người
ta gọi khoai tây là Truffles vì hoa của nó có màu sặc sỡ [70]. Đến thời kỳ người Tây
Ban Nha chinh phục châu Mỹ trong thế kỷ XVI, hàng trăm giống khoai tây đã được
biết đến và được trồng, chủ yếu dọc miền núi, bây giờ là Bolivia, Chile, Colombia,
Ecuador và Peru [31]. Từ đó đến nay, cây khoai tây đã dần phổ biến hơn và đóng vai
trò quan trọng trong đời sống con người.
1.1.2. Phân loại học
Phân loại học của khoai tây trong hệ thống học thực vật (USDA, NRCS, 2010):
Giới: Plantae (plants)
Ngành: Magnoliophyta (flowering plants)
Lớp: Magnoliopsida (dicotyledons)
Bộ: Solanales
Họ: Solanaceae
Chi: Solanum L.
Loài: Solanum tuberosum L.
1.1.3. Đặc điểm của cây khoai tây
Khoai tây có thân chính mọc từ hạt hoặc từ củ. Chiều cao thân khoai tây từ 45
đến 90 cm tùy thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác và độ phì của đất. Thân và lá khoai
tây có nhiều lông. Thân cây khoai tây là một hệ thống gồm thân, tia củ và củ. Tia củ
phát triển từ thân ngầm. Trong điều kiện thuận lợi sẽ phát triển củ. Trong điều kiện
không thuận lợi sẽ trồi lên mặt đất, phát triển thành thân.

15. 6
Hình 1.1. Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.)
(Nguồn: Atlas des plantes de France. 1891)
Lá khoai tây là lá kép lông chim, không đối xứng. Các lá chét có đặc điểm là
luân phiên xen kẽ một lá to đến một lá nhỏ (Hình 1.1).
Khoai tây có hoa cân đối. Màu sắc hoa là đặc điểm phân biệt các giống: Cánh
hoa có màu: trắng, tím-đỏ, tím-xanh, xanh thẫm. Hoa khoai tây mọc thành chùm, là
hoa lưỡng tính. Khoai tây là cây tự thụ phấn nhưng cũng có trường hợp giao phấn. Sự
thụ phấn chéo của khoai tây được thực hiện nhờ côn trùng. Sau thời kỳ ra hoa, một
vài loài kết quả.
Quả chưa chín có màu xanh, quả chín có màu đỏ anh đào giống như màu cà
chua. Quả khoai tây thuộc loại quả mọng, có 2 ô, hạt rất nhỏ.

16. 7
Mầm ngủ trên thân khoai tây được tạo thành ở các nách lá và củ. Mầm ngủ ở
mỗi củ thường là một số, phần lớn là 3 mầm. Các mắt ngủ trên củ khoai tây phân bố
theo hình xoắn ốc. Chúng được phân bố không đều trên bề mặt củ. Thường tập trung
chủ yếu ở phần trên của củ, nơi có các tế bào tương đối trẻ [2].
Đời sống của cây khoai tây được chia làm 4 thời kỳ:
- Thời kỳ ngủ
- Thời kỳ nảy mầm
- Thời kỳ hình thành thân củ
- Thời kỳ phát triển củ
1.1.4. Vai trò của khoai tây
Khoai tây là thực phẩm cung cấp năng lượng và là nguồn dinh dưỡng có giá
trị. Khoai tây giàu tinh bột, đường, chủ yếu là đường sacarose, có loại đường đơn như
glucose và fructose nhưng hàm lượng thấp, nhiều loại vitamin: B1, B2, B3, đặc biệt
là vitamin C… Trong khoai tây chứa đạm, bên cạnh các loại protit (khoảng 2% trọng
lượng tươi) là các axit amin tự do (trong củ thường có đến 20 axit amin tự do). Trong
khoai tây còn chứa nhiều khoáng chất, nhiều nhất là kali (lượng oxit kali chiếm gần
60% trọng lượng chất khoáng). Ngoài ra còn có canxi, magie, sắt,... Vỏ củ khoai tây
cung cấp một lượng lớn chất sơ.
Sử dụng 100g khoai tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein, 3% năng
lượng, 10% sắt, 10% vitamin B1và 20-50% nhu cầu vitamin C cho một người trong
một ngày đêm [8, 31].
Ngoài việc dùng khoai tây làm lương thực và thực phẩm, các nước phát triển
sử dụng khoai tây làm thức ăn cho gia súc. Hàng năm, Pháp sử dụng từ 1 đến 1,4
triệu tấn khoai tây cho chăn nuôi. Bên cạnh đó, khoai tây còn được dùng nhiều trong
công nghiệp sản xuất axit hữu cơ như axit lactic, axit xitric; các dung môi hữu cơ như
ethanol, butanol, xeton, …

17. 8
1.2. Hạn và đáp ứng của thực vật ở cạn trƣớc điều kiện hạn
Thực vật ở cạn sống bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển trong suốt
quá trình phát triển cá thể. Vì vậy, chúng chịu ảnh hưởng sâu sắc bởi điều kiện ngoại
cảnh. Ngày nay, do biến đổi khí hậu toàn cầu, hiện tượng hạn, mặn, úng, nóng, lạnh,
… (các yếu tố cực đoan phi sinh học, abiotic stress) xảy ra ngày càng nhiều. Trong
đó, hạn là một trong các yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và
năng suất cây trồng. Hạn làm thay đổi nhiều quá trình sinh lý và có thể làm biến đổi
hình thái của thực vật.
Hạn hán là một thiên tai phổ biến trên thế giới với biểu hiện thiếu hụt nghiêm
trọng lượng mưa, giảm lượng ẩm trong không khí, suy kiệt dòng chảy sông suối, hạ
thấp mực nước ao hồ, mực nước trong các tầng chứa nước dưới đất, … Xét trên mối
quan hệ giữa hạn với thực vật, hạn của môi trường được chia làm hai kiểu: Hạn đất
và hạn không khí.
- Hạn đất: Hạn đất xuất hiện khi không có mưa trong thời gian dài, khi cây
không thể hút đủ nước bù đắp lại lượng nước mất đi qua con đường thoát hơi nước,
dẫn tới sự mất cân bằng nước trong cây và cây có dấu hiệu bị khô héo.
- Hạn không khí: Hạn không khí xuất hiện khi độ ẩm tương đối của không khí
giảm xuống quá thấp, gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bên trong lá dưới
khí khổng và không gian ngay bên ngoài lá, thoát hơi nước tăng nhanh, gây nên sự
mất cân bằng nước trong mô cây và cây bị héo [3].
1.2.1. Đặc điểm thích nghi của thực vật chịu hạn
Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền, thể
hiện ra ở các thích nghi về hình thái và sinh lý. Một số giảm thiểu sự thoát hơi nước
nhờ có lớp cutin dày, khí khổng nằm sâu, thân mọng nước, lá có thể tiêu giảm, sử
dụng nước hiệu quả bằng cách tiến hành quang hợp theo con đường CAM. Một số
ngừng sinh trưởng cho đến khi điều kiện trở lại bình thường. Một số có chu kỳ sinh
dưỡng ngắn, chỉ trong vài tuần. Khi có mưa, đất ẩm, hạt giống của chúng nảy mầm.
Chúng sinh trưởng và phát triển thật nhanh chóng, hình thành hạt trước khi mùa khô
hạn đến [3].

18. 9
1.2.2. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chống chịu của thực vật
trước các điều kiện phi sinh học. Nhiệt độ cao, hạn và nồng độ muối cao là những
yếu tố gây hại lớn nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thực vật. Nhiệt độ cao ảnh
hưởng trực tiếp đến cấu trúc protein, màng sinh chất và làm ngừng các quá trình
quang hợp, hô hấp nội bào và thậm chí có thể gây chết tế bào hàng loạt. Trong khi
đó, hạn và mặn làm giảm thế nước của thực vật, làm tế bào không thể phát triển, phá
vỡ các protein trong tế bào, gây mất cân bằng ion dẫn đến các hoạt động trao đổi chất
bị đình trệ, quang hợp bị ức chế và có thể gây chết tế bào [13]. Các nhà khoa học
cũng đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng cộng hưởng của các yếu tố bất lợi khác
nhau đến cây trồng [52, 62].
Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước
Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là
ngừng sinh trưởng. Sự hạn chế sinh trưởng của chồi trong điều kiện hạn làm giảm
nhu cầu trao đổi chất của thực vật và kích thích các quá trình sinh tổng hợp các hợp
chất bảo vệ, điều chỉnh thẩm thấu. Sự ngưng sinh trưởng ở rễ cho phép mô phân sinh
của rễ vẫn thực hiện chức năng và phát triển nhanh chóng khi điều kiện bất lợi giảm
[32]. Hạn chế sự phát triển rễ bên cũng là một cách thức đáp ứng hạn, điều này thúc
đẩy sự sinh trưởng của rễ chính, giúp tăng cường khả năng hấp thu nước từ các tầng
đất sâu hơn [88].
Nước sẵn có trong tế bào bị giảm do thiếu hụt nước từ rễ lên lá, gây ra bởi sự
đóng khí khổng. Quá trình dẫn truyền nước trong cây giảm làm giảm nhu cầu dinh
dưỡng của chồi, nó cũng cản trở sự dẫn truyền trong mạch gỗ và có thể hình thành
một đáp ứng thích nghi. Điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một cách đối phó với hạn
của thực vật. Sự tổng hợp các chất tan như polyol và proline trong điều kiện bất lợi
giúp thực vật ngăn chặn sự mất nước và các chất này đóng vai trò quan trọng trong
việc duy trì sức trương của tế bào [12].
Sự thay đổi trong sinh trưởng cùng với việc giảm hoạt động của cơ quan
quang hợp do sự tiếp xúc với điều kiện bất lợi trước đó dẫn đến sự biến đổi trong sự

19. 10
phân chia nguồn carbon giữa các tế bào/mô sản xuất và tế bào/mô tích trữ (source
and sink tissue) [66]. Vì vậy, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinh
trưởng trong điều kiện bình thường bây giờ được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc để tổng
hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu [45].
Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp
Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA khiến cho khí khổng
đóng lại. Điều này làm giảm hàm lượng carbon dioxide trong mô lá và cản trở quá
trình quang hợp. Sự cản trở quá trình quang hợp sẽ mất đi và quang hợp sẽ phục hồi
nếu khí khổng mở ra khi điều kiện trở lại bình thường [16]. Một vài loài thực vật đã
sử dụng sản phẩm của quang hợp để điều chỉnh thẩm thấu, điều này giúp ngăn cản sự
mất sức trương của tế bào.
Sự hạn chế carbon dioxide do kéo dài thời gian đóng khí khổng trong điều
kiện bất lợi dẫn đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả năng vận chuyển electron,
điều này có thể làm giảm các phân tử oxy và tăng cường các dạng ROS (reactive
oxygen species). ROS là các phân tử hóa học chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏ
ngoài cùng như superoxide, hydropeoxide, hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS
trong tế bào gây tác động trực tiếp đến các phân tử lớn như axit nucleic (DNA và
RNA), protein và lipid. Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và
cơ chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng
hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào [43].
Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào
Sinh trưởng của thực vật được xác định bởi hệ số hô hấp, là tỷ lệ giữa CO2
được đồng hóa trong quang hợp và CO2 thải ra trong quá trình hô hấp. Hệ số hô hấp
được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp – ATP,
nước và các chất tan được hấp thu bởi rễ, sự vận chuyển của các sản phẩm đến các
mô dự trữ, NADH và chu kỳ TCA trung gian (quá trình sinh tổng hợp trong quá trình
phát triển của thực vật). Trong điều kiện hạn, các quá trình này bị ảnh hưởng và dẫn
đến sự tăng cường hô hấp. Bên cạnh đó, sự tăng cường hô hấp cũng là do sự kích
hoạt các quá trình đòi hỏi nhiều năng lượng như tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm
thấu và chống oxi hóa xảy ra trong điều kiện hạn [9].

20. 11
Ảnh hưởng của hạn đến hormone
Hormone thực vật điều chỉnh các quá trình khác nhau cho phép thực vật tập
chống chịu với các điều kiện bất lợi. Khi thiếu nước, ABA được tổng hợp ở rễ và vận
chuyển lên lá. Ở đây, ABA làm khí khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởng
của thực vật, vì vậy nó cho phép thực vật thích ứng với điều kiện hạn [86]. Ở lúa
mạch, ABA nội sinh tăng lên gấp 5 lần để chống chịu với hạn, điều này cho thấy vai
trò của ABA giúp cải thiện khả năng chống chịu hạn [79]. Kết quả theo dõi 9-cis-
epoxycarotenoid dioxygenase (NCED3), một emzyme then chốt trong quá trình sinh
tổng hợp ABA ở A. thaliana trong điều kiện hạn đã cho thấy sự tăng cường biểu
hiện [34]. Bên cạnh sự tăng cường hàm lượng ABA, hàm lượng auxin cũng có sự
biến đổi khi thực vật chống chịu với hạn. Ở lúa mì, khả năng chống chịu hạn đã được
hỗ trợ bởi sự giảm hàm lượng indole-3-acetic acid (IAA) ở lá [87]. Tuy nhiên, có một
vài bằng chứng cho rằng sự tăng hàm lượng IAA tạm thời ở lá ngô trong suốt giai
đoạn đầu tiếp xúc với hạn, sau đó giúp thực vật tập chống chịu với hạn ở giai đoạn
sau [82]. Sự giảm nhanh chóng hàm lượng zeatin và gibberellin nội sinh cũng đã xảy
ra ở lá ngô để đối phó với hạn. Bên cạnh đó, hàm lượng và khả năng hoạt động của
cytokinin cũng giảm trong điều kiện hạn [61]. Ở cỏ linh lăng, hàm lượng cytokinin
giảm trong suốt thời kỳ hạn làm thúc đẩy quá trình già hóa nhanh hơn [23].
Cytokinin được biết đến giúp làm chậm quá trình già hóa và khi hàm lượng cytokinin
nội bào tăng nhờ có sự tăng cường biểu hiện của gen ipt liên quan đến sinh tổng hợp
cytokinin dẫn đến những đáp ứng hạn [59]. Cytokinin cũng gây ảnh hưởng xấu đến
sinh trưởng của rễ, hạn chế sự sinh trưởng rễ chính và tăng cường phát triển rễ bên.
Nhờ vậy mà khả năng chống chịu hạn của A.thaliana được tăng lên [85].
Brassinosteroid (BR) cũng đã được báo cáo rằng có khả năng bảo vệ thực vật
chống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học [39]. BR làm tăng cường khả năng hấp thu
nước và ổn định màng cũng như làm giảm sự rò rỉ ion khỏi màng ở lúa mì khi chống
chịu với hạn [67].

21. 12
1.2.3. Đáp ứng hạn của thực vật
Thực vật có những cơ chế đáp ứng giúp chúng tăng cường tính chống chịu đối
với các điều kiện bất lợi trên. Hệ thống mô hình xử lý hạn cho cây mô hình A.
thaliana đã được Amal Harb và cs (2010) thiết kế để nghiên cứu những thay đổi của
cây khi bị hạn. Kết quả nghiên cứu cho thấy, thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi qua
ba giai đoạn: giai đoạn ban đầu là giai đoạn đánh giá điều kiện, tiếp đó thực vật đáp
ứng tập chống chịu và cuối cùng sẽ hình thành một cân bằng mới [27]. Thực vật đáp
ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và không
phụ thuộc ABA. Theo các con đường đó các tín hiệu bất lợi từ môi trường được tế
bào tiếp nhận và được dẫn truyền đến nhân theo hai con đường hoặc thông qua ABA
hoặc không thông qua ABA [75]. Các tín hiệu được dẫn truyền đến nhân gây ra sự
tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa yếu tố phiên mã. Các yếu tố phiên mã gây
ra sự tăng cường biểu hiện của các gen liên quan đến tính chống chịu. Các đáp ứng
này sẽ bị mất dần khi điều kiện bất lợi mất đi [9, 80].
Thực vật cảm nhận các yếu tố bất lợi, hay các tác nhân từ môi trường nói
chung thông qua hàng loạt các thụ thể bề mặt tế bào như các serine/threonine-like
receptor kinase, được gọi chung là các receptor-like kinase (RLKs), các thụ thể liên
kết với kênh ion (ion chanel-linked receptor), các G-protein-couple receptor (GPCRs)
và các thụ thể histidine kinase. Các kênh Ca2+
cho phép Ca2+
được chuyển vào tế bào
chất khi được kích hoạt bởi các yếu tố bất lợi [88]. Vì vậy các kênh này hoạt động
như các các thụ thể liên kết với kênh ion của yếu tố bất lợi. GPCRs là một nhóm thụ
thể màng khác. Trong điều kiện bất lợi, chúng kích hoạt các enzyme phospholipase C
hoặc D và chuyển hóa thành các tín hiệu [81].
Các thụ thể nội bào ABA, PYR/RCAR, là các tín hiệu của yếu tố bất lợi gây ra
bởi hạn, thông qua kích hoạt serine/threonine kinase SnRK2 trong đáp ứng với ABA
[73]. Do sự tổng hợp ABA dẫn đến tăng cường đáp ứng với điều kiện bất lợi, thụ thể
ABA có thể được coi là một thiết bị cảm biến yếu tố bất lợi.

22. 13
Hình 1.2. Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn
Trong quá trình tiếp nhận tín hiệu bất lợi từ môi trường không thông qua
ABA, đường là một hợp chất quan trọng. Các hexokinase là thiết bị cảm biến đường
ở thực vật, chúng đóng vai trò ngăn chặn sự biểu hiện các gen liên quan đến quá trình
quang hợp khi hàm lượng hexose trong tế bào lá cao [41]. Trehalose - 6 - phosphate
(T6P) là một phân tử đường tín hiệu, có chức năng điều chỉnh quá trình sinh trưởng,
phát triển và làm tăng hàm lượng sucrose trong thời kỳ ra hoa. Sự tăng cường biểu
hiện của trehalose - 6 - phosphate phosphatase ở ngô trong thời kỳ ra hoa giúp cải
thiện năng suất trong điều kiện hạn [56]. ROS là sản phẩm của các quá trình trao đổi
chất trong điều kiện bất lợi, cũng là những phân tử tín hiệu quan trọng [51]. Các tín
hiệu oxi hóa được chuyển qua tín hiệu trung gian thứ hai như Ca2+
hoặc phosphatidic
acid (PA) - kích hoạt protein kinase serine/threonine và mitogen - activated protein

23. 14
kinase (MAP) dẫn đến sự phiên mã của các gen đóng vai trò quan trọng trong tập
chống chịu [17].
Cơ chế truyền tín hiệu
Các tín hiệu được các thụ thể tiếp nhận sau đó truyền lại cho các phân tử tín
hiệu thứ hai như các protein kinase, các phosphatase (serine/threonine phosphatases),
các phospholipid như phosphoinositides [5]. ROS, Ca2+
, nitric oxide, cAMP và các
phân tử đường đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu [81]. Trong
điều kiện bất lợi gây ra bởi những yếu tố khác nhau có nhiều phân tử tín hiệu giống
nhau. Điều này chỉ ra rằng các con đường đáp ứng các điều kiện bất lợi khác nhau có
thể xảy ra nhờ những chất truyền tín hiệu chung [9]. Các phân tử protein kinase kích
hoạt phân chia tế bào thông qua quá trình phosphoryl hóa các protein và là một trong
các cơ chế chính của quá trình truyền tín hiệu.
Hàm lượng canxi trong tế bào chất tăng trong điều kiện bất lợi. Ca2+
trong tế
bào chất tăng lên chủ yếu từ ngoài vào tế bào qua màng hoặc được huy động từ
nguồn dự trữ trong tế bào, cụ thể là từ không bào. Một vài kênh cảm ứng Ca2+
như
calmodulin (CaM) hay CaM - binding protein đã được tìm thấy trong tế bào tham gia
truyền tín hiệu đến nhân thông qua các tín hiệu như phospholipase hay Ca2+
-
dependent kinase [81].
Điều khiển phiên mã trong biểu hiện gen
Một số lượng lớn các gen được tìm ra liên quan đến các đáp ứng với điều kiện
bất lợi [88]. Microarray DNA cung cấp thông tin có ý nghĩa lớn trong việc phân tích
biểu hiện của toàn bộ hệ gen và đã được sử dụng để nghiên cứu các mô hình biểu
hiện gen ở các đáp ứng với hạn hoặc mặn ở một số loài thực vật [25, 72, 29, 44]. Các
gen tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn bao gồm các gen liên quan đến tổng
hợp các chất điều hòa thẩm thấu, các gen mã hóa cho các protein LEA, aquaporin,
các phân tử tín hiệu và các yếu tố phiên mã. Trong đó, các gen mã hóa cho các yếu tố
phiên mã được quan tâm nhiều bởi các yếu tố phiên mã hoạt động như những công
tắc tác động đến hàng loạt các gen đáp ứng với điều kiện bất lợi [5]. Có hơn 100 yếu
tố phiên mã mà sự biểu hiện của chúng được tăng cường khi tiếp xúc với điều kiện

24. 15
hạn, chúng đã được tìm ra bằng phân tích toàn bộ hệ phiên mã ở cây A. thaliana tiếp
xúc với hạn [65]. Hạn làm tăng cường mức độ biểu hiện của các gen, được điều khiển
bởi các yếu tố phiên mã thuộc họ bZIP, AP2/ERF, HD-ZIP, MYB, Bhlh, NAC, NF-
Y, EAR và ZPT2 [91]. Những yếu tố phiên mã này được kích hoạt bởi các tín hiệu
hạn. Do hạn xảy ra cùng với sự tăng lên về hàm lượng ABA, một vài yếu tố phiên mã
được kích hoạt bởi ABA. Những các yếu tố phiên mã đáp ứng ABA (ABFs) chủ yếu
thuộc họ bZIP và kết hợp với các yếu tố đáp ứng ABA (ABRE) trong các promoter
của các gen đáp ứng hạn [37, 92]. Trong khi đó, sự hoạt động của một số gen mã hóa
yếu tố phiên mã họ CBF/DRE, NAC và ZF-HD lại không phụ thuộc ABA. Tuy
nhiên, một vài nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động của các gen mã hóa yếu tố phiên mã
thuộc họ AP2/ERF được điều khiển qua cả 2 con đường phụ thuộc ABA và không
phụ thuộc ABA [49, 89].
APETALA2/ethylene response element - binding protein (AP2/EREBP) là họ
yếu tố phiên mã chính trong các họ yếu tố phiên mã ở A.thaliana, gồm 147 gen,
chiếm 9% các yếu tố phiên mã [20]. Ở thực vật bậc cao, có gần 200 gen yếu tố phiên
mã AP2 đã được báo cáo. Các AP2/EREBP được đặc trưng bởi sự có mặt của DNA-
binding domain, được gọi là AP2 domain, chứa khoảng 68 amino acid [26, 64]. Dựa
vào sự có mặt của một hoặc hai AP2 – DNA - binding domain, họ gen này được chia
thành 4 phân họ: AP2, DREB, ERF, RAV [68]. Phân họ AP2 mã hóa cho các protein
có hai AP2 domain và các protein này liên quan đến các quá trình sinh trưởng như
phát triển các mô phân sinh, các bào quan và sự phát triển hoa. Các phân họ DREB
(dehydration - responsive element binding), ERF (ethylene - responsive factor) và
RAV (related to ABI3/VP1) mã hóa cho các protein chứa một AP2 domain và các
thành viên trong phân họ gen này liên quan đến hệ thống truyền tín hiệu [24, 76].
1.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng hạn đến khoai tây
Trong quá trình sinh trưởng, khoai tây cần rất nhiều nước. Để tạo ra 100kg củ
khoai tây cần 12-15 m3
nước, để đạt được năng suất củ từ 19-33 tấn/ha, mỗi hecta
khoai tây cần 2800-2900 m3
nước. Giai đoạn trước khi hình thành củ đòi hỏi ẩm độ
đất khoảng 60%, giai đoạn hình thành củ là 80%. Nếu thiếu nước ở giai đoạn hình

25. 16
thành củ thì năng suất giảm rõ rệt. Cụ thể: ẩm độ đất là 60% thì năng suất giảm 4,3%;
ẩm độ đất còn 40%, năng suất giảm 33,9%; không tưới năng suất giảm 63% [1].
Khoai tây được trồng bằng củ nên khi phát triển không hình thành rễ chính mà chỉ có
các rễ phụ thưa thớt. Phần lớn rễ tập trung ở tầng đất mặt nên khả năng hút nước của
cây không lớn. Gặp điều kiện khô hạn, khoai tây rất dễ bị thiếu nước và phát triển
kém [2]. Nghiên cứu của Deblonde và cộng sự năm 1999 chỉ rõ, năng suất và yếu tố
cấu thành năng suất bị tác động mạnh mẽ bởi tổng lượng nước tưới. Tuy nhiên, tác
động của hạn đến cây trồng phụ thuộc vào thời gian, gian đoạn và mức độ nghiêm
trọng của khô hạn [28, 38]. Hạn thường tác động mạnh ở 3 giai đoạn: sinh trưởng
sinh dưỡng, phình to củ và chín (héo tán cây, vỏ củ cứng lại, đường chuyển hóa thành
tinh bột). Nhiều thí nghiệm đã chứng minh, thiếu nước ở giai đoạn sinh trưởng sinh
dưỡng thì củ rất nhỏ nhưng số lượng củ/cây nhiều. Khô hạn bắt đầu vào giai đoạn
phình to củ làm cho giai đoạn hình thành củ kéo dài hơn nhưng lại giảm số lượng củ
và năng suất [30]. Thiếu nước ở giai đoạn chín sinh lý, có thể tăng lượng chất khô mà
khoai tây có thể tích lũy được trong củ [15].
Đã có những nghiên cứu chứng minh sự đáp ứng hạn của khoai tây có liên
quan đến biểu hiện gen. Năm 2011, cơ quan Phát triển Nông thôn Hàn quốc công bố
việc phát hiện một gen giúp tăng cường khả năng chịu hạn ở khoai tây. Gen này mã
hóa cho một yếu tố phiên mã trong nhóm MYB, putative R1-type MYB-like
transcription factor (StMYB1R-1). Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây khoai tây
tăng cường biểu hiện gen StMYB1R-1 có khả năng chống chịu cao với hạn mà đồng
thời lại không ảnh hưởng tới các tính trạng nông học khác [74]. Nghiên cứu của Anil
Kumar Singh và cs (2013) đã chỉ ra sự tăng cường biểu hiện của một số gen mã hóa
yếu tố phiên mã họ NAC ở khoai tây trong điều hiện hạn [77].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về khoai tây chủ yếu tập trung vào việc khảo
nghiệm, lai giống, kỹ thuật canh tác, các bệnh về cây nhằm nâng cao năng suất và
chất lượng cây [2, 3, 4]. Gần đây, năm 2013, Sở Khoa học và Công nghệ Vĩnh Phúc
đã tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống khoai tây trồng
tại Vĩnh Phúc. Nghiên cứu được tiến hành trên 5 giống khoai tây KT3, Diamant,

26. 17
Solara, Esprit và Atlantic. Kết quả cho thấy, giống khoai KT3 và Diamant có khả
năng chịu hạn tốt hơn so với các giống còn lại. Khả năng chịu hạn được đánh giá
thông qua một số chỉ tiêu: hàm lượng proline của lá, sự biến đổi áp suất thẩm thấu
của tế bào, khả năng trao đổi nước, sự biến đổi huỳnh quang diệp lục của lá và chỉ
tiêu năng suất.
Hiện tại, trong nước chưa có nghiên cứu nào về khả năng tập chống chịu của
khoai tây trước các điều kiện phi sinh học. Có thể thấy rằng, nghiên cứu của chúng
tôi sẽ đóng góp kiến thức quan trọng về sinh lý chống chịu hạn của khoai tây, mở đầu
cho một hướng đi mới liên quan đến khả năng tập chống chịu của thực vật trước các
yếu tố bất lợi phi sinh học từ môi trường.
1.4. Tính tập chống chịu của thực vật
Năng suất của cây trồng có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với đời sống con
người cũng như sự phát triển kinh tế của mỗi quốc gia. Tuy nhiên, nó đang bị giảm
mạnh bởi các yếu tố bất lợi phi sinh học từ môi trường. Các cơ chế chống chịu và đáp
ứng với các yếu tố bất lợi từ môi trường đã đang và sẽ được tập trung nghiên cứu
mạnh mẽ. Thực vật vượt qua những điều kiện bất lợi của môi trường bằng sự phát
triển khả năng chống chịu (tolerance), đề kháng (resistance) hoặc né tránh
(avoidance). Khả năng tập chống chịu (acclimation) với yếu tố bất lợi từ môi trường
của thực vật thì cho phép thực vật tăng cường tính chống chịu với các điều kiện bất
lợi ở ngưỡng lớn sau giai đoạn được tiếp xúc với các điều kiện bất lợi ở ngưỡng nhỏ
và vừa.

27. 18
Hình 1.3. Sơ đồ đơn giản của một quá trình nhận, truyền tín hiệu gây ra đáp ứng
tập chống chịu [21]
Một vài báo cáo đã cung cấp bằng chứng rằng thực vật có thể đáp ứng một
cách nhanh chóng hoặc cảm ứng mạnh mẽ, dẫn đến tăng cường khả năng chống chịu
với các yếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học từ môi trường [7]. Có thể nói hiện
tượng này tương tự với quá trình gây đáp ứng miễn dịch bằng vacxin ở động vật. Các
quá trình sinh lý đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường của thực vật có thể được
kích hoạt nhanh hơn hoặc tốt hơn hoặc cả hai sau giai đoạn tập chống chịu. Trước khi
tìm hiểu kỹ hơn về tính tập chống chịu của thực vật, phải nói đến một hiện tượng gần
giống với nó đấy là quá trình hình thành các đáp ứng bằng các yếu tố gây đáp ứng
(priming agents) và được gọi là giai đoạn chuẩn bị (priming state). Trong trường hợp
này, các yếu tố gây đáp ứng là các yếu tố như nitric oxide (NO), hydrogen peroxide
(H2O2), hydrogen sulfide (H2S), các polyamine và các vi sinh vật hữu ích nhất định
nhưng lại có khả năng gây tăng cường tính chống chịu của thực vật trước các bất lợi
từ môi trường khác như hạn, mặn, nóng, lạnh hoặc các kim loại nặng… [21]. Trong cơ
chế tập chống chịu thì chính các yếu tố bất lợi là các yếu tố gây đáp ứng với chính chúng.

28. 19
Cơ chế tập chống chịu được biết đến bao gồm cơ chế nhận tín hiệu từ các biểu
hiện bất lợi từ môi trường, tiếp đến là quá trình truyền tín hiệu đó từ ―cảm biến‖ vào
nhân. Trong nhân, một số gen đặc hiệu liên quan đến việc đáp ứng lại với yếu tố bất
lợi sẽ được hoạt hóa và các protein được biểu hiện các đáp ứng thích hợp [27, 78]
(Hình 1.3). Các đáp ứng đó sẽ đảm bảo tái lập cân bằng nội môi trong tế bào, bảo vệ
chức năng màng sinh chất và protein nhằm chống chịu lại điều kiện bất lợi [14]. Rất
nhiều gen được hoạt hóa theo chiều hướng giữ cân bằng trao đổi nước và các ion của
tế bào, bảo vệ chức năng các chaperone, giảm oxi hóa và bảo vệ áp suất thẩm thấu.
Riêng trong cơ chế cân bằng thẩm thấu của mô, tế bào, các cây có xu hướng tăng
sinh proline và một số loại đường như galactinol, glucose, fructose, sucrose, raffinose
những chất này được biết đến là các chất bảo vệ thẩm thấu khi thực vật cần chống lại
những bất lợi từ môi trường [71, 90]. Những hoạt động đáp ứng qua gen biểu hiện
như thế của thực vật đa phần được điều hòa qua các yếu tố phiên mã. Rất nhiều gen
mã hóa cho yếu tố phiên mã được xác định gia tăng biểu hiện trong các pha sớm khi
thực vật phản ứng với môi trường [10, 35, 42].
Các cơ chế liên quan đến quá trình đáp ứng của thực vật với các yếu tố bất lợi
từ môi trường từ lâu đã trở thành tâm điểm của các nghiên cứu về sinh học nói chung
và thực vật nói riêng [21]. Đề tài ―Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai
tây (Solanum tuberosum L.)‖ được thực hiện theo định hướng đó và mong muốn góp
phần tìm hiểu thêm về sức sống của thực vật trong các biến đổi của môi trường.

29. 20
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn được tiến hành trên cây khoai tây có
nguồn gốc từ hạt, giống HH7, được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển
Cây có củ - Viện Cây Lương Thực và Cây Thực Phẩm – Viện Hàn lâm Khoa học
Nông nghiệp Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Các hóa chất chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích
1 Các muối đa lượng, vi lượng và
vitamin theo công thức môi
trường khoáng cơ bản MS
Bio Basic Canada
INC.
Môi trường
nuôi cấy
Sorbitol
2 TriZol Invitrogen, USA Tách chiết
RNA tổng sốEDTA, Chloroform,
Isopropanol
Sigma
Ethanol Merck
Ultrapure diluted water Invitrogen
Agarose Sigma Điện di
Universal DNA Ladder
DNA Loading Dye 6X
KAPA
10X BlueJuice Invitrogen
4 5X buffer DNase
BioLabs
Xử lí DNA
DNAse I

30. 21
STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích
5 Thermo Scientific RevertAid
First Strand cDNA Synthesis Kit
Thermo Scientific Tổng hợp
cDNA
6 SYBR Green AB, Mỹ Kiểm tra chất
lượng cDNA
và sự biểu hiện
gen
Cặp mồi GADPH 3’, GADPH
5’, ef1, P1, P2, P3
Macrogen
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật và các hóa chất khác như:
aga, sucrose, ethanol, axit acetic, axit boric, EDTA, ethidium bromide… được sử
dụng đều có độ sạch phân tích.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị và máy móc thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự
nhiên – Đại Học Quốc Gia Hà Nội sử dụng trong nghiên cứu được thống kê trong
bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
STT Thiết bị Hãng/loại thiết bị
1 Tủ an toàn sinh học Biohazard MDH contamination control
2 Máy nghiền đồng thể mô thực vật Retsch MM40
3 Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5417R
4 Máy real time PCR Bio-RAD iQ5
5 Tủ lạnh -20o
C và -80o
C Toshiba
6 Máy soi gel UV BCE
7 Máy đo mật độ quang học Thermo Electron Corporation (CAT
335902)
8 Máy quang phổ định lượng axit
nucleic/protein
NanoDrop ND100
9 Máy đo pH HoriBa

31. 22
Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân, thiết
bị khử trùng, lò vi sóng, bể ổn nhiệt, tủ hút, tủ lạnh, tủ sấy, …
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các nội dung nghiên cứu được tiến hành như sau:
Hình 2.1. Các nội dung nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai tây
(Solanum tuberosum L.) giống HH7.
2.2.1. Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu
Hạt khoai tây giống HH7 được khử trùng bằng dung dịch hydropeoxit 15%
trong 10 phút và được gieo trên môi trường khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS,
1962), có bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar và sorbitol với hàm lượng khác nhau. Các
nồng độ sorbitol sử dụng là: 0 mM; 50 mM; 100 mM; 200 mM.
Tỷ lệ nảy mầm của hạt được đánh giá và các hạt nảy mầm trên môi trường có
bổ sung sorbitol được coi là đã qua giai đoạn tập chống chịu.
Sorbitol là một trong các đường polyol được sản sinh trong tế bào thực vật khi
gặp điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu. Vì vậy, khi sử dụng sorbitol bổ sung vào
môi trường sẽ tạo môi trường hạn cho cây mà không có thêm ảnh hưởng nào khác.

32. 23
2.2.2. Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý
Sau 30 ngày gieo hạt, cắt lấy phần thân cây con có chiều cao 1,5 cm mang 2 lá
chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương với giai đoạn nảy mầm và
cao hơn (Hình 2.2).
Hình 2.2. Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu
( Môi trường khoáng cơ bản MS và hàm lượng sorbitol được ghi trong khung)
Như vậy, có 10 công thức cấy chuyển được thiết lập. Các công thức chuyển
môi trường này được chia thành 4 nhóm để đánh giá:
Nhóm đối chứng (ĐC): 0-0
Nhóm thí nghiệm thứ nhất (TN1): 0-50 và 50-50
Nhóm thí nghiệm thứ hai (TN2): 0-100; 50-100 và 100-100
Nhóm thí nghiệm thứ ba (TN3): 0-200; 50-200; 100-200 và 200-200
Sau 4 - 6 tuần, tiến hành đánh giá khả năng tập chống chịu bằng cách so sánh
giữa mẫu đã qua tập chống chịu và mẫu chưa qua tập chống chịu trong từng nhóm
TN, thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá, số rễ, trọng
lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng Chl. và hàm lượng proline.
Hệ số nhân chồi
Trong nuôi cấy mô, khoai tây có hai dạng phát sinh chồi. Một là phát sinh trực
tiếp chồi mới từ vị trí cắt cấy chuyển vào môi trường. Hai là các chồi ngủ ở nách lá
sẽ phát triển thành chồi chính. Trong TN này, số chồi được tính cả hai dạng trên.

33. 24
Hệ số nhân chồi =
Chiều cao chồi
Chiều cao chồi được đo từ điểm cắt mẫu ban đầu đến điểm cao nhất của chồi
sau thời gian nuôi cấy. Chiều cao chồi trung bình được tính theo công thức:
Chiều cao chồi = (cm)
Số lá
Số lá được đếm cụ thể trên mỗi chồi. Số lá trung bình được tính theo công
thức:
Số lá =
Số rễ
Khi cấy chuyến, số rễ ban đầu ở mỗi công thức môi trường đồng nhất bằng 0.
Số rễ trung bình của mỗi công thức chuyển môi trường được tính theo công thức:
Số rễ trung bình=
Trọng lượng tươi và trọng lượng khô
Mỗi công thức chuyển môi trường lấy 5 mẫu. Mẫu được lấy ra từ môi trường,
rửa với nước để loại bỏ thạch. Thấm khô rễ, đặt lên đĩa pettri và cân. Trọng lượng
tươi của mẫu được xác định bằng công thức:
Trọng lượng tươi =
Sau khi mẫu được xác định trọng lượng tươi sẽ được sấy ở nhiệt độ 37o
C
trong 24 giờ và cân lại. Trọng lượng khô của mẫu được xác định bằng công thức:
Trọng lượng khô =
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll
Hàm lượng Chl. được xác định dựa theo phương pháp của của Robert J. Porra
[60]. Chl. được chiết từ mô lá trong aceton 80% với quy trình như sau:
- Cân 10 mg lá vào ống eppi

34. 25
- Thêm 20µl aceton 80%
- Nghiền bằng chày nhựa
- Bổ sung aceton 80% đến 1,5ml
- Ly tâm 2000 rpm trong 1 phút
- Thu 1000µl dịch nổi
- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 646 nm và 664 nm (A646 và A664). Pha loãng dịch
đo bằng aceton 80% nếu chỉ số hấp thụ vượt quá giá trị 1.
Hàm lượng Chl. được tính toán theo công thức:
Chla (µg/ml) = [12.7 × (A664) – 2.69 × (A646)] × hệ số pha loãng
Chlb (µg/ml) = [22.9 × (A646) – 4.68 × (A664)] × hệ số pha loãng
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu
Hàm lượng proline của mẫu được xác định bằng phương pháp so màu (Bates
và cs., 1973) [6]. Quy trình được tiến hành theo các bước sau:
- Cân 50 mg lá và thân vào ống eppi, cho vào mỗi ống 1 viên bi nghiền
- Nghiền với nito lỏng bằng máy nghiền
- Bổ sung 1,5 ml acid sulfosalicylic 3% (w/v), lắc đều ống lên xuống
- Ly tâm 7000 vòng/20 phút
- Thu 300 µl dịch nổi, bổ sung 600 µl axit sulfosalicylic 3% (w/v) (Tỷ lệ 1:2)
- Thực hiện phản ứng màu: lấy 200µl dịch trong cho vào ống eppi, bổ sung
200 µl axit axetic và 200 µl dung dịch nynhidrin (0,1 g ninhydrin + 2,4 ml acetic
acid + 1,6 nml phosphoric acid 6M), ủ phản ứng ở 100o
C trong 1 giờ, sau đó
dừng phản ứng bằng cách làm lạnh trong đá bào ít nhất 15 phút.
- Bổ sung 400 µl toluence vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều
- Thu 200 µl dịch nổi
- Bổ sung 800 µl toluence
- Đo độ hấp thụ với bước sóng 520 nm (A520)
Hàm lượng proline trong mẫu được tính toán bằng cách so sánh với đường chuẩn.
Quy trình xây dựng đƣờng chuẩn proline được tiến hành như sau:

35. 26
- Pha proline chuẩn trong axit sulfosalicylic 3% (w/v) với các nồng độ: 0 mM,
25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM và 150 mM.
- Thực hiện phản ứng màu và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương
pháp xác định proline mẫu.
Bảng 2.3. Nồng độ proline và giá trị độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm
Nồng độ proline (mM) A520
0 0,000
25 0,191
50 0,379
75 0,631
100 0,761
- Xây dựng đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng độ proline chuẩn và
giá trị độ hấp thụ bằng phần mềm Excel 2007 (Hình 2.3).
Hình 2.3. Đường chuẩn proline
- Mối tương quan giữa nồng độ proline chuẩn và giá trị độ hấp thụ được thể
hiện bằng công thức:
Y= 0,007x – 0,001
Trong đó:

36. 27
x là nồng độ proline
y là độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm (A520)
Vậy công thức xác định nồng độ proline là:
x = (A520 + 0,001) / 0,007 (mM)
Nồng độ proline mM được quy ra hàm lượng µg/mg theo công thức:
Hàm lượng proline (µg/mg) =
Trong đó:
x: nồng độ proline (mM)
V: thể tích dịch chiết proline (ml)
HSPL: hệ số pha loãng
m: khối lượng mẫu tươi (mg)
2.2.5. Xác định biểu hiện của một số gen mã hóa cho yếu tố phiên mã ở khoai tây
(Solanum tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng tập
chống chịu ở Arabidopsis thaliana
Kết quả đánh giá khả năng tập chống chịu thông qua các chỉ số nuôi cấy mô,
hàm lượng Chl. và proline cho biết nồng độ sorbitol trong môi trường là 50 mM
mang lại hiệu quả tập chống chịu hạn cao nhất cho khoai tây HH7. Tiến hành xác
định biểu hiện của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã trong cây con khoai tây thu
được từ môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol (mẫu TN) và môi trường không
có sorbitol ( mẫu ĐC).
Quy trình xác định biểu hiện một số gen mã hóa yếu tố phiên mã được tiến
hành theo sơ đồ hình 2.4.

37. 28
Thu mẫu Chọn gen đích
Tách RNA tổng số Thiết kế mồi
Kiểm tra, xác định hàm lượng RNA tổng số
Xử lý DNA
Tổng hợp cDNA
Kiểm tra chất lượng cDNA
Xác định biểu hiện của các gen đích
Xử lý số liệu
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã
2.2.5.1. Thu mẫu
Quá trình thu mẫu được tiến hành như sau:
- Chồi khoai tây in vitro giống HH7 được cấy chuyển đồng thời trên môi
trường MS không có sorbitol và môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol.
- Thu mẫu ở 10 mốc thời gian: 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 72h và 120h
bằng cách cân 120 mg (±5 mg) mẫu thân và lá vào các ống eppi đã có bi nghiền và
thả ngay vào nitrogen lỏng.
Mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu (tủ -70o
C) hoặc trong nitrogen
lỏng cho đến khi tiến hành bước thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5.2. Tách RNA tổng số
Quy trình tách RNA tổng số được tiến hành theo các bước sau [44]:
- Nghiền mẫu trong điều kiện nitrogen lỏng bằng máy nghiền mẫu thực
vật Restch Mill tốc độ 25 Hz trong 1 phút.
- Lấy ống eppi ra khỏi nitrogen lỏng cho vào bình đá bào, chờ 1-2 phút,
làm ấm nắp ống bằng tay, mở từ từ, để ống trên giá để ống eppi.

38. 29
- Thêm 500 µl TRIzol vào mỗi ống. Vortex kỹ.
- Ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút sau khi xong mẫu cuối cùng
- Thêm 200 µl chloroform vào mỗi mẫu. Vortex.
- Ủ ở nhiệt độ phòng 3 phút.
- Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4o
C. Dung dịch tách 3 pha.
- Chuyển dịch nổi sang ống mới (Chỉ thu pha dịch trong tránh hoàn toàn
pha trắng sữa thứ 2).
- Chuẩn bị hỗn hợp isopropanol và NaCl 2 M (1:1) để lạnh 4o
C.
- Bổ sung hỗn hợp vào dịch chiết với tỉ lệ 2:1. Lắc nhẹ ống bằng cách
đảo lên xuống nhẹ tay.
- Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4o
C.
- Đổ phần dịch ra cốc thủy tinh, giữ lại tủa.
- Rửa tủa 2 lần với 500 µl ethanol 70% bằng ly tâm 12000 rpm trong 5
phút ở 4o
C.
- Để khô tủa ở nhiệt độ phòng.
- Hòa tan tủa trong 40 µl nước RNase – free
- Lắc 300 U/min trong 10 phút
Chất lượng của RNA tổng số được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose
và xác định hàm lượng, độ tinh sạch.
2.2.5.3. Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số
RNA được kiểm tra sơ bộ bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose với quy trình
như sau:
Chuẩn bị bản gel:
- Hòa tan 1,7g agarose trong 100 ml TAE 1x
- Đun nóng dung dịch để agarose hòa tan hoàn toàn
- Để dung dịch nguội bớt đến 50 - 60o
C, thêm vào 1 µl redsafe hoặc 5 µl
ethedium bromide, lắc đều.
- Đổ bản gel với số giếng tương ứng với số mẫu
- Mix mẫu {2 µl nước + 3 µl mẫu + 1 µl dye caspa 6x}
- Tra mẫu lên giếng theo thứ tự

39. 30
- Chạy bản gel với hiệu điện thế 60V trong 5 phút, rồi chạy tiếp với hiệu điện
thế 80V trong 30 phút.
- Bản gel sau điện di được quan sát dưới máy soi gel UV để xác định có sản
phẩm RNA tách chiết.
Hàm lượng RNA tổng số được xác định bằng máy đo quang phổ định lượng
(máy đo NanoDrop) và chất lượng được đánh giá sơ bộ qua đường cong hấp thụ.
Các mẫu RNA có giá trị A260/280 trong khoảng 2,0 và giá trị A260/230 > 1,8 là
những mẫu RNA đạt tiêu chuẩn.
2.2.5.4. Xử lý DNA
Các mẫu RNA tổng số thu được có thể còn lẫn DNA hệ gen của khoai tây. Để
đảm bảo không còn lẫn DNA hệ gen trong cDNA sau này, mẫu được xử lý bằng
DNAse theo quy trình sau:
- Từ kết quả hàm lượng RNA trong mẫu, chuẩn bị mẫu 4 µg/17 µl nước
DEPC
- Thêm vào mỗi mẫu 2 µl buffer DNAse I 10X và 1 µl enzyme DNAse I
- Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng
- Thêm 1 µl EDTA 110 mM
- Ủ 65o
C trong 10 phút.
Các ống mẫu được cắm sang đá, bước tổng hợp cDNA được tiến hành ngay
trong ngày.
2.2.5.5. Tổng hợp cDNA
cDNA được tổng hợp theo bộ kit The Thermo Scientific RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit. Bộ kit sử dụng ReverAid Reverse Transcriptase (RT), có
sự hoạt động kém của RNase H so với AMV reverse transcriptase. Enzyme này hoạt
động chủ yếu ở nhiệt độ 42-45o
C và phù hợp cho sự tổng hợp cDNA có độ dài trên
13 kb. Bộ kit sử dụng Thermo ScientificTM
RiboLockTM
RNase Inhibitor có hiệu quả
bảo vệ RNA khỏi sự phân hủy và nhiễm bẩn ở nhiệt độ trên 55o
C. Quy trình tổng hợp
cDNA được tiến hành như sau:
- Thêm các chất sau vào ống eppi khô, không có nuclease, cắm trên đá:

40. 31
Khuôn RNA RNA đã xử lý DNA 2 µg (11 µl)
Primer Oligo (dT)18 1 µl
Nước không có nuclease 1 µl
Tổng thể tích 12 µl
- Mix nhẹ nhàng, ly tâm nhanh và ủ 65o
C trong 5 phút. Làm lạnh nhanh trong
đá bào.
- Thêm các chất theo bảng sau:
5X Reaction Buffer 4 µl
RiboLock RNase Inhibitor (20U/µl) 1 µl
10 dNTP Mix 2 µl
RevertAid MuL V RT (200 U/µL) 1 µl
Tổng thể tích 20 µl
- Mix nhẹ nhàng và li tâm nhanh
- Ủ 60 phút ở 42o
C
- Dừng phản ứng bằng cách ủ trong 5 phút ở 70o
C.
2.2.5.6. Kiểm tra chất lượng cDNA
Chất lượng cDNA được kiểm tra bằng qPCR. Cặp mồi được sử dụng để kiểm
tra chất lượng cDNA là cặp mồi GAPDH 3’ (G3) và GAPDH 5’ (G5). Thông tin cặp
mồi được trình bày trong bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng qPCR
kiểm tra chất lượng cDNA
Tên mồi Trình tự mồi Độ dài
G3
5’-TTCAACATCATCCCTAGCAGCACT-3’ 24 Nu
3’-TAAGGTCGACAACAGAAACATCAG-5’ 24 Nu
G5
5’- AAGGACAAGGCTGCTGCTCAC-3’ 21 Nu
3’- AACTCTGGCTTGTATTCATTCTCG-5’ 24 Nu
 Phản ứng qPCR với hai cặp mồi trên được thực hiện với các thành phần trong
bảng 2.5.

41. 32
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng qPCR với thể tích phản ứng 20 µl
Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng
SYBR Green 10
Mồi 5’-3’ 4 0,5 µM
Mồi 3’-5’ 4 0,5 µM
Mẫu cDNA khuôn 2
Tổng thể tích phản ứng 20
 Chu trình nhiệt được sử dụng trong thí nghiệm được thể hiện trong bảng 2.6
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng qPCR
Nhiệt độ Thời gian Số chu kì
50o
C 2 phút 1
95 o
C 10 phút 1
95 o
C 15 giây
40
60 o
C 1 phút
95 o
C 15 giây
160 o
C 15 giây
95 o
C 15 giây
Các mẫu cDNA đạt tiêu chuẩn là các mẫu có giá trị Ct chênh lệch giữa hai
mồi không quá 1,5.
Các mẫu cDNA đạt tiêu chuẩn được bảo quản ở -20o
C cho thí nghiệm tiếp sau
hoặc bảo quản lâu dài ở -80 o
C.
2.2.5.7. Chọn gen đích
Từ trình tự các gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn đã biết trên
cây mô hình A.thaliana. So sánh các trình tự trên với các gen yếu tố phiên mã ở
khoai tây (Solanum tuberosum L.) trên ngân hàng gen Plant Transcription factors
Database v 3.0. Một số gen của khoai tây tương đồng với các gen liên quan đến tính
chịu hạn đã biết ở A. thaliana với mức độ tương đồng > 90% được chọn làm gen đích
cho nghiên cứu này (Bảng 2.7).

42. 33
Bảng 2.7. Thông tin các gen đích được chọn trong nghiên cứu
Tên locus gen
Gen tƣơng đồng ở
A.thaliana
Kí hiệu
trong đề tài
PGSC0003DMG400014309 At4g13040.1 (DREB1A) P1
PGSC0003DMP400026903 At4g27410.2 (RD26) P2
PGSC0003DMT400045091 Atg13040 P3
2.2.5.8. Thiết kế mồi
Gen tham chiếu được chọn cho qPCR trong nghiên cứu này là ef1α [55].
Dựa trên trình tự mã hóa (CDS-coding sequence) của các gen đích đã chọn trên
(Phụ lục 1, Phụ lục 2 và Phụ lục 3), sử dụng chương trình Primer3Plus để thiết kế
mồi đặc hiệu cho nhân đoạn 1 gen với các tiêu chuẩn đầu vào: độ dài của sản phẩm
từ 180 - 240 bp; kích thước mồi 20 - 24 bp; Tm của mồi là 60 - 62o
C với nhiệt độ
chênh nhau tối đa giữa hai mồi là 1o
C và mồi phải chứa 40 - 60 % GC. Thông tin các
cặp mồi thiết kế được trình bày trong bảng 2.8.
Bảng 2.8. Các mồi sử dụng trong phản ứng qPCR
kiểm tra sự biểu hiện của gen đích
STT Gen
Trình tự mồi
Độ dài mồi
(bp)
1 ef1α 5’-ATTGGAAACGGATATGCTCCA-3’ 21 Nu
5’-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3’ 21 Nu
2 P1 5’-AGCTGGCAGGAAGAAGTTTCGA-3’ 22 Nu
5’-CTTAATGCTAAAGCCGCCACGT-3’ 22 Nu
3 P2 5’-ACGCCTGGATTCAGCCAATTTC-3’ 22 Nu
5’-TTGGTGTTGCCTCGGAAATTCG-3’ 22 Nu
4 P3 5’-CGCAAGCTGTTAGGACTTTGCT-3’ 22 Nu
5’-TGGAAATTGTTGAGCGGTCTGC-3’ 22 Nu

43. 34
2.2.5.9. Xác định tương quan mức độ biểu hiện
Gen tham chiếu và gen đích đã chọn được tiến hành qPCR với các cặp mồi
tương ứng (Bảng 2.8) sử dụng các thành phần phản ứng như trong bảng 2.5 và chu
trình nhiệt như bảng 2.6.
2.2.5.10. Xử lý số liệu
Sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt
của Livak và cs 2001 để xác định tương quan
mức độ biểu hiện giữa mẫu TN và mẫu ĐC [46].
Tương quan mức độ biểu hiện của các gen đích đã chọn tại mỗi mốc thời gian
nghiên cứu được tính như sau:
ΔCt (TN) = Ct (TN/Tg) – Ct (TN/Ref)
ΔCt (ĐC) = Ct (ĐC/Tg) – Ct (ĐC/Ref)
ΔΔCt = ΔCt (TN) - ΔCt (ĐC)
Tương quan mức độ biểu hiện = 2-ΔΔCt
(lần)
Trong đó:
Ct (ĐC/Tg): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường ĐC (0 mM sorbitol) với cặp
mồi của gen đích (P1, P2 và P3).
Ct (ĐC/Ref): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường ĐC với cặp mồi của gen
tham chiếu, elf1α.
Ct (TN/Tg): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường TN (50 mM sorbitol) với cặp
mồi của gen đích (P1, P2 và P3).
Ct (ĐC/Ref): Giá trị Ct của mẫu trong môi trường TN với cặp mồi của gen
tham chiếu, elf1α.

44. 35
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà 7
Môi trường MS có chứa đầy đủ dinh dưỡng (đường, đa lượng, vi lượng,
vitamin), là môi trường cần thiết cho nuôi cấy mô tế bào thực vật những cũng thích
hợp cho sự phát triển của nấm và khuẩn. Yêu cầu trước tiên của nuôi cấy in vitro là
điều kiện vô trùng. Trước khi đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro, mẫu cần được loại bỏ
các yếu tố nấm, khuẩn. Trong bước này, ethanol 70% và dung dịch hydropeoxit 15%
được dùng để khử trùng hạt khoai tây. Một thí nghiệm đã được tiến hành để đánh giá
khả năng khử trùng hạt khoai tây HH7 của các hóa chất trên và kết quả cho tỷ lệ mẫu
sống và sạch cao nhất là sử dụng ethanol 70% trong 1 phút để sơ bộ loại bỏ mầm
bệnh trên bề mặt, tiếp đó dùng dung dịch hydropeoxit 15% trong 10 phút và rửa lại
bằng nước cất khử trùng 3 lần, mỗi lần 15 phút (số liệu không được trình bày). Hạt
khoai tây HH7 sau khi được khử trùng đã được cấy trên môi trường MS có bổ sung
sorbitol với các nồng độ 0 mM, 50 mM, 100 mM và 200 mM sorbitol. Các cây con
nảy mầm trên các môi trường có sorbitol sẽ được coi là các cây đã qua tập chống
chịu ở giai đoạn nảy mầm. Thí nghiệm vừa là bước tạo tập chống chịu cho các cây
con khoai tây vừa đánh giá tác động của sorbitol đến khả năng nảy mầm của hạt
khoai tây HH7. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây trên các môi trường được đánh giá
sau 30 ngày. Kết quả cho thấy, giống khoai tây đang nghiên cứu chịu ảnh hưởng rõ
rệt của điều kiện hạn. Khả năng nảy mầm của hạt giảm khi nồng độ sorbitol tăng
(Hình 3.1). Tỷ lệ nảy mầm giảm đều theo thứ tự 96,33%; 91,67%; 86,33% tương ứng
với nồng độ sorbitol tăng từ 0 mM lên 50 mM và 100 mM. Khi độ hạn tăng cao với
hàm lượng sorbitol 200 mM trong môi trường gieo, tỷ lệ nảm mầm chỉ còn 53,33%.
Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sorbitol khác
nhau đến tỷ lệ nảy mầm của hạt ngô đã được Jain và cs công bố [36]. Kết quả cũng
có sự tương đồng với kết quả về tỷ lệ nảy mầm của khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng
của mặn dưới tác dụng của NaCl trong môi trường [44].

45. 36
Hình 3.1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo trên môi
trường có bổ sung sorbitol
Hình 3.2. Cây khoai tây trên đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt

46. 37
Quan sát các cây con khoai tây sau 30 ngày gieo hạt, ta thấy sorbitol trong môi
trường không chỉ ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt mà còn ảnh hưởng đến thời
gian nảy mầm và chiều dài thân mầm. Các cây con trong môi trường có nồng độ
sorbitol cao hơn nảy mầm chậm hơn và có thân ngắn hơn (hình 3.2).
3.2. Đánh giá các chỉ số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu
Các cây con nảy mầm trên môi trường ĐC (môi trường MS) và môi trường
TN (MS có bổ sung lần lượt 50 mM, 100 mM, 200 mM sorbitol) là những cây con đã
qua tập chống chịu, được tiến hành cấy chuyển sang môi trường có độ hạn ngang
bằng và cao hơn (theo sơ đồ hình 2.2). Sau 4 - 6 tuần khả năng tập chống chịu của cây
con khoai tây sẽ được đánh giá thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi; chiều cao chồi;
số lá; số rễ; trọng lượng tươi; trọng lượng khô; hàm lượng Chl.; hàm lượng proline.
3.2.1. Hệ số nhân chồi
Ở mẫu ĐC, các chồi được cấy chuyển nhưng hoàn toàn không bị ảnh hưởng
của hạn (các môi trường nuôi cấy đều không chứa sorbitol) có hệ số nhân tương đối
đạt 1,95 lần sau 4 tuần và 4,65 sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.3). Hệ số nhân chồi chịu
ảnh hưởng không nhỏ của hàm lượng sorbitol tăng cao trong môi trường nuôi cấy.
Các mẫu chưa qua tập chống chịu khi chuyển sang các môi trường 50, 100 và 200
mM sorbitol, hệ số nhân chồi giảm dần xuống mức 1,75; 1,35 và 1,08 lần sau 4 tuần.
Cũng cùng chiều hướng đó, sau 6 tuần, hệ số nhân giảm từ 4,65 trong công thức 0-0
xuống còn 3,66 và 2,67 lần lượt trong các công thức chuyển 0-50 và 0-100. Khi nồng
độ sorbitol trong môi trường tăng cao đến 200 mM, hệ số nhân sau 6 tuần của các
mẫu chưa qua tập chống chịu chỉ đạt 1,73.
Các mẫu đã qua tập chống chịu cũng không thể hiện khả năng nhân chồi trong
nuôi cấy khi được chuyển sang các môi trường tiếp tục duy trì mức độ hạn nhân tạo
hoặc nâng cao mức hạn. Trong các công thức chuyển mẫu đã qua tập chống chịu, chỉ
có công thức 50-100 cho hệ số nhân cao hơn mẫu chưa qua tập chống chịu trong
cùng môi trường là 0-100, đạt 1,35 sau 4 tuần và 2,67 sau 6 tuần cấy chuyển. Ở các
môi trường khác 50 và 200 mM sorbitol không có mẫu đã qua tập chống chịu nào có
hệ số nhân chồi cao hơn so với mẫu chưa qua tập chống chịu.

47. 38
Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ
sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
3.2.2. Chiều cao chồi
Hình 3.4. Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ
sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

48. 39
Trong công thức chuyển môi trường ĐC (0-0), chiều cao chồi trung bình đạt
7,06 cm sau 4 tuần và 8,48 cm sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.4). Ở những mẫu chưa
qua tập chống chịu, chiều cao chồi trung bình chịu ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng
sorbitol trong môi trường. Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 50 mM, sau 4
tuần chiều cao chồi giảm xuống 1,5 lần so với môi trường không có sorbitol. Khi nồng
độ sorbitol trong môi trường tăng đến 200 mM, chiều cao chồi chỉ còn 1,96 cm, giảm 3,6
lần so với môi trường không có sorbitol sau 4 tuần. Tuy nhiên ở công thức 0-100, chiều
cao chồi có giảm so với công thức ĐC nhưng lại cao hơn công thức 0-50.
Những mẫu đã qua tập chống chịu trong các môi trường chứa sorbitol không
thể hiện rõ sự phát triển về chiều cao chồi. Trong các công thức chuyển môi trường
đã qua tập chống chịu chỉ công thức 50-50 cho cây có chiều cao chồi cao gấp 1,1 lần
và 1,2 lần so với công thức môi trường đối chứng 0-50 lần lượt sau 4 tuần và 6 tuần.
Trong công thức 100-200 cũng cho cây có chiều cao chồi cao hơn so với mẫu chưa
qua tập chống chịu trong cùng môi trường 200 mM sorbitol. Tuy nhiên sự chênh lệch
này không đáng kể. Ở những mẫu đã qua tập chống chịu còn lại đều có chiều cao
chồi thấp hơn hoặc tương đương với môi trường ĐC.
Nhìn chung có thể nhận thấy các công thức TN có hệ số nhân tương đối cao
thì chiều cao chồi thấp và ngược lại. Điều này thể hiện sinh khối của mẫu in vitro có
những giới hạn nhất định trong điều kiện hạn. Việc đánh giá khối lượng mẫu sẽ cho
thông tin quan trọng hơn về sinh trưởng của khoai tây trong điều kiện hạn nhân tạo.
3.2.3. Số lá
Trong môi trường không có sorbitol, số lá trung bình của mẫu đạt giá trị thấp
nhất sau cả 4 tuần và 6 tuần (Hình 3.5). Ở các mẫu chưa qua tập chống chịu, sau 4
tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng, số lá trung bình tăng 5,44 lá trong
môi trường 50 mM sorbitol và 6,75 lá trong môi trường 100 mM sorbitol. Khi nồng
độ sorbitol tăng đến 200 mM, số lá trung bình giảm xuống còn 6,1 lá. Tương tự sau 6
tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 50 mM và 100 mM thì số lá
trung bình đạt đến 4,51 lá và 5,8 lá, lần lượt. Có một sự khác biệt so với 4 tuần là sau
6 tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 200 mM thì số lá trung bình
lại tăng đến 6,61 lá.

49. 40
Ở những mẫu đã qua tập chống chịu, trong các công thức 50-50, 100-100,
100-200 và 200-200, cho số lá trung bình lớn hơn so với những mẫu chưa qua tập
chống chịu khi được cấy chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương
hoặc cao hơn cả sau 4 tuần và 6 tuần. Tuy nhiên sự khác biệt này tương đối nhỏ.
Trong công thức 50-100 và 50-200, tuy mẫu đã qua tập chống chịu nhưng số lá lại
giảm nhẹ so với môi trường ĐC 0-100 và 0-200, tương ứng, sau 4 tuần. Sau 6 tuần
thì số lá trung bình của mẫu trong công thức 50-200 tăng lên 1,1 lần so với môi
trường ĐC 0-200.
So sánh giữa các nhóm môi trường, có thể thấy rằng hàm lượng sorbitol trong
môi trường hạn cấp 2 ảnh hưởng rõ rệt đến số lá theo chiều hướng làm tăng số lá
trung bình/chồi. Thực tế thì tổng số lá ở các nhóm môi trường hạn cao vẫn ít hơn số
lá ở môi trường hạn thấp nhưng do số chồi thì ngược lại, lại thấp hơn nên số lá/chồi
mới có xu hướng tăng. Về hình thái lá, các lá trong môi trường hạn cao 200 mM
sorbitol rất bé, màu xanh tương đối nhạt hơn lá trong môi trường hạn vừa 50 mM,
100 mM sorbitol hay không hạn.
Hình 3.5. Số lá trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ
sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

50. 41
3.2.4. Số rễ
Số rễ khoai tây HH7 nuôi cấy chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi hàm lượng sorbitol
trong môi trường. Số rễ trung bình/chồi của các mẫu chưa qua tập chống chịu khi
chuyển sang môi trường có sorbitol đều giảm thể hiện qua so sánh công thức cấy
chuyển 0-0 với các công thức 0-50, 0-100 và 0-200 (Hình 3.6).
Hình 3.6. Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ
sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
Biểu đồ về số rễ của mẫu chồi nuôi cấy cho thấy có xu hướng tăng khi hàm
lượng sorbitol trong môi trường tăng ở những mẫu đã qua tập chống chịu so với
những mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường nuôi cấy. Cụ thể, sau 4
tuần và 6 tuần, công thức môi trường 50-50 có số rễ trung bình cao hơn môi trường
ĐC 0-50, lần lượt gấp 1,5 và 1,2 lần. Tương tự, sau 4 tuần, số rễ trung bình của mẫu
trong công thức chuyển 50-100 và 100-100 cao gấp 1,1 và 1,3 lần so với công thức
môi trường ĐC 0-100. Xu hướng này cũng được ghi nhận trong nhóm môi trường
200 mM sorbitol trong các công thức 0-200, 50-200, 100-200 và 200-200. Một điều
đặc biệt là, những mẫu đã qua tập chống chịu ở ngưỡng 50 mM và 100 mM sorbitol

51. 42
trong các công thức chuyển môi trường 50-50 và 100-100 có số rễ trung bình cao hơn
cả mẫu trong điều kiện môi trường không bị hạn.
3.2.5. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô
Hình 3.7. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chồi khoai tây HH7 trên
môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn
ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy)
Trọng lượng tươi của khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng lớn bởi điều kiện hạn.
Khi chuyển cây con nảy mầm sau 30 ngày sang các môi trường có chứa sorbitol, hàm
lượng sorbitol càng cao thì trọng lượng tươi của mẫu càng giảm. Trong công thức
ĐC 0-0, trọng lượng tươi của mẫu đạt 241,55 mg và giảm mạnh xuống còn 174,99
mg và 147,36 mg khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng lên 50 mM và 100 mM.
Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng cao đến 200 mM, trọng lượng tươi của
mẫu chỉ còn 71,79 mg. Điều này rất phù hợp với sinh lý nói chung của cây trồng khi
gặp điều kiện môi trường gây bất lợi về áp suất thẩm thấu làm giảm khả năng hấp thu
nước của cây [58]. Trong khi đó trọng lượng khô có giảm khi chuyển cây sang các

52. 43
điều kiện hạn tăng cao nhưng mức giảm là tương đối ít so với biến động của trọng
lượng tươi (Hình 3.7). Cụ thể, trong công thức ĐC 0-0, trọng lượng khô của mẫu đạt
20,99 mg, giảm còn 18,37 mg và 14,72 mg trong môi trường 0-100 và 0-200. Tuy
nhiên, trong công thức TN 0-50, trọng lượng khô đạt 22,19 mg, có sự tăng nhẹ so với
môi trường ĐC 0-0. Xem xét về tính tập chống chịu, cả giá trị trọng lượng tươi và
trọng lượng khô của mẫu đều tăng ở các mẫu đã được tiếp xúc hạn so với các mẫu
đối chứng trong cùng nhóm môi trường thí nghiệm. Cụ thể, trong cả 3 nhóm môi
trường, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của các mẫu đã tiếp xúc hạn ở ngưỡng
50 mM sorbitol trong giai đoạn nảy mầm đều cao hơn so với mẫu chưa được tập
chống chịu. Đặc biệt là mẫu trong công thức 50-100 có trọng lượng tươi đạt 185,95
mg, trọng lượng khô đạt 27,48 mg gấp 1,3 lần và gấp 1,5 lần so với mẫu đối chứng
công thức 0-100, tương ứng.
Xét đến tỉ lệ giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mỗi loại mẫu trong
các công thức chuyển môi trường có thể thấy rõ sự khác biệt lớn thể hiện chủ yếu
trong khả năng trữ nước của cây nuôi cấy trong các điều kiện hạn. Ở môi trường nuôi
cấy bình thường (không bổ sung sorbitol) trọng lượng tươi của các mẫu đạt hơn 11,5
lần so với trọng lượng khô. Trong khi đó, trên môi trường 50mM sorbitol và 100mM
sorbitol, tỉ lệ giữa trọng lượng tươi và khô của chồi khoai tây ở các công thức chuyển
đều xấp xỉ nhau và vào khoảng từ thấp nhất 6,77 đến cao nhất 7,88 lần. Đối với môi
trường có độ hạn cao, 200mM sorbitol, tỉ lệ này thấp hơn hẳn, chỉ đạt 4,88 ở công
thức 0-200 và tăng dần đến 5,66 là mức cao nhất ở công thức 200-200. Điều này cho
thấy điều kiện hạn trong nuôi cấy đã làm giảm nhanh khả năng hấp thu nước của
khoai tây in vitro nhưng không làm giảm khả năng tích lũy chất khô. Và, nếu các
chồi khoai tây đã qua giai đoạn tập chống chịu khi nảy mầm thì khả năng tích lũy
chất khô của chúng được cải thiện đáng kể.

53. 44
3.3. Hàm lƣợng chlorophyll ở khoai tây HH7 đã qua giai đoạn tập chống chịu
Hình 3.8. Hàm lượng chlorophyll trong lá khoai tây HH7 trên môi trường có các
nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
(đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy)
Chl. là nhóm sắc tố chiếm vai trò quan trọng nhất đối với quang hợp. Trong
đó, chỉ có Chla chuyển đổi năng lượng ánh sáng mặt trời thành năng lượng hóa học
và Chlb là sắc tố phụ quang hợp quan trọng nhất [4].
Rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn đến sự thay đổi trong sinh tổng
hợp các sắc tố quang hợp ở thực vật đã được tiến hành và đều cho thấy sự suy giảm
về hàm lượng chlorophyll. Manivannan và cs. ghi nhận sự giảm đáng kể hàm lượng
Chla, Chlb và Chl tổng số ở cả 5 giống hoa hướng dương (Helianthus annuus L.) khi
lượng nước tưới giảm đi 40% [48]. Nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn được gây ra
bởi sorbitol ở ngô đã chỉ ra sự sụt giảm về hàm lượng của cả Chla và Chlb nhưng tỷ lệ
hàm lượng Chla / Chlb lại tăng [36]. Nghiên cứu ảnh hưởng bởi hạn đến hàm lượng
chlorophyll ở ba cây trồng họ đậu của Mafakheri và cs năm 2010 đã chỉ ra rằng, hạn
làm giảm đáng kể hàm lượng Chla, Chlb và tổng lượng Chl. của cây đậu (Cicer
arietinum) trong giai đoạn sinh trưởng và trong giai đoạn ra hoa. Cũng trong nghiên

54. 45
cứu này, tác giả đã chỉ ra rằng, Chla nhạy cảm với yếu tố hạn hơn so với Chlb. Điều này
được minh chứng bởi sự tăng lên về tỷ lệ Chla / Chlb ở mẫu TN so với mẫu ĐC [47].
Trong nghiên cứu này, các cây con được chuyển từ môi trường tập chống chịu
sang các môi trường có hàm lượng sorbitol duy trì và tăng cường (Hình 2.2). Trước
hết đối với các mẫu chưa được tiếp xúc hạn trong giai đoạn nảy mầm, hàm lượng
Chla và Chlb đều có chiều hướng tăng nhẹ khi được chuyển sang các môi trường có
bổ sung sorbitol (Hình 3.8). Tuy vậy, về tỷ lệ Chla /Chlb không thấy có sự ảnh hưởng
rõ rệt nào của hàm lượng sorbitol tăng lên trong môi trường thí nghiệm.
Các cây khoai tây HH7 đã nảy mầm trên môi trường hạn đều có hàm lượng cả
Chla và Chlb cao hơn so với các mẫu cây được chuyển từ môi trường không hạn.
Trong đó, dễ dàng nhận thấy trên hình 3.8, trong cả 3 nhóm môi trường, các mẫu
khoai tây được tập chống chịu ngưỡng 50 mM sorbitol cho kết quả hàm lượng Chl.
tăng cao nhất ở mỗi nhóm môi trường. Đặc biệt các công thức chuyển 50-50 và 50-
100 cho thấy sự tăng tỷ lệ Chla / Chlb đáng kể. Hàm lượng 2 loại Chl. đạt cao nhất ở
mẫu chồi chuyển từ môi trường tập chống chịu 50 mM sang môi trường 100 mM
sorbitol. Tuy nhiên, mẫu chuyển từ môi trường nảy mầm chứa 100 mM sorbitol sang
môi trường vẫn bổ sung 100 mM sorbitol lại có hàm lượng Chl. giảm thấp gần bằng
mức của mẫu chưa qua tập chống chịu. Tương tự ở nhóm 3, các mẫu tập chống chịu
50 mM, 100 mM tăng hàm lượng Chl. trong khi mẫu đã tiếp xúc 200mM lại có chiều
hướng giữ hàm lượng Chl. tương đương mẫu chưa qua tập chống chịu (Hình 3.8).
Kết quả nghiên cứu cho thấy, những mẫu đã qua tập chống chịu đều có hàm
lượng Chl. cao hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu và cao hơn so với môi
trường đối chứng 0-0. Đặc biệt trong môi trường tiếp xúc hạn ở ngưỡng 50 mM
sorbitol cho thấy sự tăng về cả hàm lượng Chla, Chlb và tăng cả về tỷ lệ hàm lượng
Chla/ Chlb.
3.4. Hàm lƣợng proline
Proline được coi là chất bảo vệ thẩm thấu, có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội
bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu [80].
Do vậy, khi cây gặp điều kiện bất lợi về hạn, thì tế bào sẽ tăng cường sinh tổng hợp