Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens sh1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU
KIỆN NUÔI CẤY SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN
SERRATIA MARCESCENS SH1
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Tâm
MSSV: 1051110142 Lớp: 10DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2014

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan cuốn đồ án này là kết quả nghiên cứu của em, được tiến hành tại
phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học thuộc khoa Công nghệ Sinh học - Thực
phẩm - Môi trường, Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Các kết quả, số
liệu trong đồ án là hoàn toàn trung thực, chưa từng có ai công bố.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Tâm

Để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến các quý Thầy cô Trường Đại Học Công Nghệ TpHCM, đặc biệt là các Thầy cô
trong Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học đã tận tình dạy bảo cho em bao
năm qua, trang bị cho em những kiến thức quý giá và tạo dựng cho em nhiều kinh
nghiệm trong suốt quá trình học tập.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Hoài Hương, Cô đã luôn bên cạnh
giúp đỡ chỉ bảo, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình triển khai nghiên cứu và
hoàn thành đề tài tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy trong phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện và
cung cấp hóa chất để em có thể thực hiện được các thí nghiệm.
Và cuối cùng em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân
đã luôn ở bên em động viên, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập nghiên cứu
vừa qua.
Kiến thức còn nhiều hạn chế, chắc chắn sẽ không tránh khỏi những sai sót, em rất
mong được sự thông cảm và góp ý chân thành của thầy cô và các bạn.
Xin chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Tâm

i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH.............................................................................................vi
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................1
1.2. Mục đích của để tài......................................................................................3
1.3. Mục tiêu, nhiệm vụ của đề tài ......................................................................3
1.4. Nội dung của đề tài.......................................................................................3
1.5. Phƣơng pháp xử lí số liệu.............................................................................3
1.6. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài....................................................................3
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học ...............................................5
2.1.1. Khái niệm và phân loại.......................................................................5
2.1.2. Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu............................................6
2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu................................................7
2.2. Mối quan hệ giữa vi khuẩn và tuyến trùng EPN ..........................................9
2.2.1. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn
.............................................................................................................10
2.2.2. Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố diệt côn trùng...........................11
2.3. Giới thiệu về Serratia marcescens ...............................................................12
2.3.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens...............................................12
2.3.2. Phân loại Serratia marcescens............................................................ 13
2.3.3. Đặc điểm sinh lí..................................................................................13
2.3.4. Đặc điểm sinh hóa...............................................................................14
2.3.5. Đặc điểm phân bố ...............................................................................17
2.3.6. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens........................................19
2.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens............................20
2.4.1. Sắc tố....................................................................................................20
2.4.2. Enzyme ................................................................................................21
2.4.3. Biosurfactants ......................................................................................22
2.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens ................................................23
2.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men thu sinh khối.........................25
2.6.1. Quá trình lên men..............................................................................25
2.6.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và điều kiện lên men ............................27
Trang

ii
2.6.2.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng ..................................29
2.6.2.2. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men ...........................................30
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHÊN CỨU
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................32
3.2. Vật liệu – môi trƣờng – thiết bị sử dụng nghiên cứu ...................................32
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................32
3.2.2. Môi trƣờng ........................................................................................... 32
3.2.3. Hóa chất................................................................................................32
3.2.4. Dụng cụ ................................................................................................33
3.2.5. Thiết bị .................................................................................................33
3.3. Phƣơng pháp luận.........................................................................................34
3.4. Bố trí thí nghiệm...........................................................................................34
3.5. Phƣơng pháp khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng
SH1...............................................................................................................38
3.5.1. Phƣơng pháp quan sát hình thái sinh lý ..............................................38
3.5.2. Thử nghiệm sinh hóa và định danh chủng SH1 bằng bộ Kit API 20E
..............................................................................................................39
3.5.3. Thử nghiệm hoạt tính enzyme..............................................................42
3.6. Phƣơng pháp khảo sát môi trƣờng nuôi cấy chủng Serratia marcescens
SH1...............................................................................................................42
3.6.1. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng trên môi trƣờng cơ bản Nutrient
broth .....................................................................................................43
3.6.2. Xác định nguồn Nitơ tốt nhất cho sự phát triển của Serratia
marcescen SH1
..............................................................................................................44
3.6.3. Xác định nguồn Cacbon tốt nhất sự phát triển của Serratia
marcescens SH1
...............................................................................................................45
3.7. Phƣơng pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1 ...................46
3.7.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescensSH1
.......................................................................................................47
3.7.2. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện oxy lên sự phát triển của S.
marcescens SH1..................................................................................47
3.7.3. Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S.
marcescens SH1..................................................................................47

iii
3.7.4. Khảo sát ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S.
marcescens SH1.................................................................................. 48
3.7.5. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 trên môi
trƣờng mớivà điều kiện nuôi cấy mới.................................................49
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BỆNH LUẬN
4.1. Kết quả quan sát hình thái sinh lý và các thử nghiệm hóa sinh.....................50
4.1.1. Quan sát hình thái, sinh lý....................................................................50
4.1.2. Kết quả hóa sinh với bộ Kit API 20E ..................................................51
4.1.3. Kết quả thử nghiệm enzyme ................................................................53
4.2. Kết quả khảo sát môi trƣờng nuôi cấy S. marcescens SH1.........................56
4.2.1. Đƣờng cong tăng trƣởng trên môi trƣờng Nutrient broth ....................56
4.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn Nito lên sự phát triển của S. marcescens SH1
..............................................................................................................57
4.2.3. Ảnh hƣởng của nguồn Cacbon lên sự phát triển của S. marcescens
SH1.......................................................................................................58
4.3. Kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1...........................59
4.3.1. Ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1..............59
4.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện Oxy sự phát triển của S. marcescens SH1
..............................................................................................................61
4.3.3. Ảnh hƣởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S.
marcescens SH1 ...................................................................................62
4.3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S.
marcescens SH1 ...................................................................................63
4.3.5. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 trên môi
trƣờng mới và điều kiện nuôi cấy mới.................................................65
CHƢƠNG 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. Kết quả ...............................................................................................................69
5.2. Kiến nghị............................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................70
PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG
PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ

iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens....................................15
Bảng 2.2 Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia ............................................................16
Bảng 2.3. Tỉ lệ các loài Serratia phân lập đƣợc từ các môi trƣờng khác nhau.............18
Bảng 2.4. Tỉ lệ các chủng Serratia marcescens phân lập đƣợc từ các môi trƣờng
khác nhau.......................................................................................................................18
Bảng 3.1. Các chỉ tiêu định danh S. marcescens SH1 bằng bộ Kit API 20E................40
Bảng 3.2. Hàm lƣợng % nitơ tổng của các nguồn nitơ.................................................44
Bảng 3.3. Thành phần môi trƣờng và các nguồn nitơ khảo sát.....................................44
Bảng 3.4. Thành phần môi trƣờng và các nguồn cacbon khảo sát................................45
Bảng 3.5. Tỉ lệ và mật độ giống khảo sát .................................................................48
Bảng 4.1. Kết quả sinh hóa của bộ Kit API đối với chủng S. marcescens SH1...........52
Bảng 4.2. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn nitơ .....................................57
Bảng 4.3. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn Cacbon................................59
Bảng 4.4. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các độ pH........................................................... 60
Bảng 4.5. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các điều kiện lắc ...............................................61
Bảng 4.6. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các tỉ lệ cấy giống..............................................63
Bảng 4.7. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các nồng độ đệm của môi trƣờng nuôi cấy .......64
Bảng 4.8. Các thông số động học nuôi cấy S. marcescens SH1 trên 2 môi trƣờng......66
Bảng 4.9. Tính toán giá thành của 2 môi trƣờng ..........................................................67
Bảng 4.10. Chi phí sản xuất sinh khối của 2 môi trƣờng..............................................67

v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi ..........................................................13
Hình 2.2. Khuẩn lạc của S.marcescens trên môi trƣờng XLD.....................................17
Hình 2.3. Khuẩn lạc của S. marcescens trên NA ..........................................................17
Hình 2.4. Quy trình công nghệ lên men thu sinh khối..................................................24
Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của S.
marcescens SH1............................................................................................................35
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát, chọn các thành phần cho môi trƣờng tốt
nhất cho sự phát triển của S. marcescen SH1 ...............................................................36
Hình 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm, khảo sát các điều kiện nuôi cấy ............................37
Hình 4.1. Khuẩn lạc của S. marcescens SH1 trên môi trƣờng NA...............................50
Hình 4.2. Kết quả nhuộm Gram....................................................................................51
Hình 4.3. Kết quả sinh hóa bằng bộ Kit API 20E.........................................................52
Hình 4.4. Thử nghiệm hoạt tính lipase của SH1 trên Tween 20...................................54
Hình 4.5. Thử nghiệm hoạt tính protease......................................................................54
Hình 4.6. Khả năng phân giải chitin .............................................................................55
Hình 4.7. Đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcesces SH1 trên môi trƣờng NB..........56
Hình 4.8. Ảnh hƣởng của các nguồn Nitơ lên sự phát triển của S. marcescens SH1...
.......................................................................................................................................57
Hình 4.9. Ảnh hƣởng của các nguồn Cacbon lên sự phát triển của S. marcescens
SH1................................................................................................................................58
Hình 4.10. Ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1.....................60
Hình 4.11. Ảnh hƣởng của Oxy lên sự phát triển của S. marcescens SH1...................61
Hình 4.12. Ảnh hƣởng của tỉ lệ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1
.......................................................................................................................................62
Hình 4.13. Ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên quá trình lên men và phát triển của
S. marcescens SH1........................................................................................................64

vi
Hình 4.14. Đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 môi trƣờng NB và môi
trƣờng mới.....................................................................................................................65

1
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Từ xa xưa con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hằng ngày.
Các quá trình làm rượu, làm giấm, làm tương, muối chua… đều ứng dụng các đặc
tính sinh học của các nhóm vi sinh vật. Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của
vi sinh vật thì việc ứng dụng nó trong sản xuất và đời sống ngày càng rộng rãi và có
hiệu quả hơn. Ví dụ như việc chế vắc xin phòng bệnh, sản xuất kháng sinh. Sử dụng
vi sinh vật trong việc tạo phân bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật không gây hại
môi trường, làm cân bằng sinh thái.
Trong tự nhiên, ngoài những vi sinh vật có lợi còn có những vi sinh vật gây
hại, ví dụ như các nhóm vi sinh vật gây bệnh cho con người, động vật và thực vật,
các loài gây ô nhiễm nước, thực phẩm. Nhưng nếu ta nắm vững được các mặt lợi
hay hại của nó, ta sẽ đưa ra được các biện pháp khoa học để phát huy những mặt lợi
và hạn chế những mặt hại do chúng gây ra.
Serratia marcescens được biết đến là một loài vi khuẩn cơ hội, nhưng bên
cạnh đó nó cũng được biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh
học như khả năng diệt sâu, và khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp
chất thứ cấp do nó sinh ra…
Ngày nay để tăng năng suất và sản lượng trong trồng trọt thì người dân thường
sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học. Tuy nhiên, việc sử
dụng này chỉ đem lại lợi ích trước mắt mà không đảm bảo thâm canh bền vững, bên
cạnh đó, những sản phẩm này làm cho đất đai ngày càng bị ô nhiễm, diệt trừ nhiều
loài thiên địch có lợi cho cây trồng, mất cân bằng sinh thái trong đất và một số vi
sinh vật trong đất có thể bị tiêu diệt. Các thuốc trừ sâu hóa học này tồn dư rất lâu,
chúng không dễ dàng bị phân hủy dẫn đến tình trạng tồn dư và tích đọng lại, ngấm
sâu vào trong lòng đất và nước sẽ gây hại không những cho động vật, cây trồng mà
cả con người sống sống gần đó. Nếu con người hoăc các loài động vật ăn những loại

2
cây trồng còn tồn đọng một lượng không nhỏ thuốc trừ sâu hóa học thì lâu dần sẽ
ảnh hưởng rất tai hại đến sức khỏe của chính họ.
Các ngành hoá học và công nghiệp hoá chất không ngừng phát triển và ngày
càng sản xuất ra nhiều loại sản phẩm với mục đích diệt sâu – bệnh hại cây trồng.
Nhưng hiệu quả chỉ được trong một thời gian ngắn. Sau đó, liều lượng do con người
pha ngày càng tăng, các loại sâu bệnh thì ngày càng thích nghi được và lại có một
cuộc tìm kiếm loại thuốc mới để diệt chúng. Vòng tuần hoàn này cứ tiếp tục, lâu
dần, hệ sinh thái nông nghiệp sẽ bị phá hủy và giết chết các loai thiên địch có ích và
làm ô nhiễm môi trường sống của con người cũng như các loài động vật khác.
Trước tình hình đó, các biện pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng phương
pháp sinh học “thân thiện với con người và môi trường” được các nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu và cũng đã sản xuất được các loại sản phẩm xuất phát từ sinh
học. Việc sử dụng các tác nhân sinh học trong bảo vệ thực vật có tác dụng tiêu diệt
côn trùng gây hại, giảm thiểu bênh hại cho cây trồng, cân bằng hệ sinh thái (các loài
thiên địch, vi sinh vật có lợi, dinh dưỡng…) trong môi trường đất nói riêng và trong
môi trường sống nói chung mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các
thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác. Không gây ảnh hưởng tiêu cực
đến sức khỏe con người và cây trồng về trước mắt và cả lâu dài.
Do đó việc ứng dụng Serratia marcescens trong bảo vệ thực vật là một triển
vọng to lớn đối với nền nông nghiệp.
Bên canh đó vi khuẩn Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng sản
xuất sắc tố tự nhiên (prodigiosin). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính
kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được
nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh
vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u
(D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000;
Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992;

3
Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Ngoài ra, prodigiosin còn có thể sử dụng để
tạo mùa tự nhiên trong nghành dệt may (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Dựa trên cơ sở những lợi ích quan trọng của chủng Serratia marcescens cũng
như các sản phẩm trao đổi chất của Serratia marcescens mà em chọn đề tài: “Thiết
lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn
Serratia marcescens SH1”.
1.2. Mục đích của đề tài
Xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 để
thu sinh khối cực đại.
1.3. Nội dung của đề tài
- Định danh và khảo sát một số hoạt tính enzyme của chủng SH1.
- Khảo sát các nguồn cacbon và nitơ phù hợp với sự phát triển của Serratia
marcescens SH1
- Khảo sát các điều kiện lên men (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống, thời
gian thu sinh khối) thích hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1.
1.4. Phƣơng pháp xử lí số liệu
- Sử dụng phần mềm excel để tính toán và biểu diễn đồ thị
- Sử dụng phần mềm staghaphics để xử lí số liệu
1.5. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài
- Chọn được môi trường tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens
SH1.
- Khảo sát được điều kiện nuôi cấy (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống) tốt
nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1.
1.6. Kết cấu đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp gồm có 5 chương:
 Chương 1: Mở đầu
 Chương 2: Tổng quan
 Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

4
 Chương 4: Kết quả và thảo luận
 Chương 5: Kết luận và đề nghị

5
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học
2.1.1. Khái niệm và phân loại
Khái niệm: Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc
sinh học sản xuất ra từ các loại thảo dược hay các chủng vi sinh vật được nuôi cấy
trong môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp thủ công, bán thủ công
hoặc phương pháp lên men công nghiệp để tạo ra những chế phẩm có chất lượng
cao, có khả năng phòng trừ các loại sâu bọ gây hại cây trồng nông, lâm nghiệp.
Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi
khuẩn, virus) và các chất do vi sinh vật tiết ra, các chất có trong cây cỏ (là chất độc
hoặc dầu thực vật). Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chia
thành hai nhóm chính là:
- Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu là các vi sinh vật như nấm, vi
khuẩn, virus.
- Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ
hoặc dầu thực vật.
Như chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hóa học có ưu điểm rõ rệt là hiệu quả
diệt sâu nhanh nhưng có nhược điểm quan trọng là có độ độc cao với người và các
động vật có ích (trong đó có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy,
do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con người và sự trong sạch của môi trường, các thuốc
trừ sâu hóa học cần được hạn chế sử dụng dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu
sinh học.
Ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với người và môi
trường. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu như không độc
với người và các sinh vật có ích. Do ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh
học bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và
sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại. Do thời gian cách ly ngắn nên rất thích
hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè… Muốn

6
có nông sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc bảo vệ
thực vật sinh học.
2.1.2. Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu
Tuyến trùng sống trong đất có thể ký sinh trên côn trùng đất, nên chúng là
nguyên liệu tuyệt vời để sản xuất các thuốc trừ sâu vi sinh. Sau khi vào đất, tuyến
trùng phân tán và tấn công ngay côn trùng.
Tuyến trùng xâm nhập vào cơ thể côn trùng hoặc cùng thức ăn hoặc qua lỗ thở
và hậu môn côn trùng. Ở trong ruột côn trùng, tuyến trùng chui qua vách ruột đi vào
hệ tuần hoàn. Ở đây, tuyến trùng sinh trưởng và phát triển khá nhanh, gây chết cho
côn trùng trong 1-2 ngày.
Trừ một số ít tuyến trùng sống được trong điều kiện khô dưới dạng bào nang,
còn hầu hết tuyến trùng hoạt động trong điều kiện có màng nước bao quanh. Vì thế,
tuyến trùng chỉ tác động đến các loài côn trùng sống trong đất, nơi chúng sống lâu
hơn.
Trong số hàng nghìn loài tuyến trùng ký sinh ở côn trùng thì chỉ có nhóm
Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả năng vừa ký sinh vừa gây bệnh cho
côn trùng, do vậy được gọi là tuyến trình ký sinh gây bệnh côn trùng. Bao gồm 2
giống là Steinernema và Heterorhabditis. Bình thường thì EPN sống tự do trong đất
và mang theo vi khuẩn cộng sinh. Khi tìm được vật chủ (sâu hại), tuyến trùng sẽ
thâm nhập vào xoang máu qua các lỗ mở tự nhiên hoặc trực tiếp qua lớp vỏ và giải
phóng vi khuẩn. Vi khuẩn sinh sôi, tiết protein độc, giết chết vật chủ trong vòng 24
- 48 giờ. Do vậy, những tuyến trùng này được sử dụng làm tác nhân sinh học để sản
xuất thuốc sinh học tuyến trùng. Hiện đã có 17 loài tuyến trùng thuộc giống
Steinernema và 7 loài thuộc giống Heterorhabditis thuộc bộ Rhabditida có khả
năng này. Sau khi xâm nhập, chúng có khả năng gây bệnh và làm chết vật chủ trong
48 giờ. Các EPN có khả năng ký sinh trên 200 loài côn trùng thí nghiệm (có một
phần đời sống trong đất) .

7
2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu
Côn trùng chết trong tự nhiên chiếm khoảng 80-90%, trong đó hầu hết là chết
do vi sinh vật mà vi khuẩn là loài vi sinh vật chiếm đa số. Do đó, trong điều kiện tự
nhiên, vi khuẩn có tác dụng không nhỏ trong việc điều chỉnh số lượng quần thể sâu
hại. Trong đó một số quần thể vi khuẩn đã được sản xuất thành chế phẩm dùng để
phòng trừ sâu hại rừng.
Người ta đã phát hiện hàng trăm loài vi khuẩn có quan hệ với côn trùng, trong
đó có 90 loài gây bệnh cho côn trùng.
Trong tự nhiên, những loài vi khuẩn gây bệnh không phải đều có thể tạo thành
chế phẩm trừ sâu và cần có một số tính chất cơ bản về độ độc, tính ổn định, khả
năng lây lan, tác dụng nhanh, chọn lọc tốt, có thể sản xuất hàng loạt, kinh tế và an
toàn.
 Một số loài vi khuẩn sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu hại
- Clostridium brevifaciens
- Clostridium malacosomae
- Bacillus cereus
- Bacillus thuringienis
- Bacillus papillae.
 Một số loài vi khuẩn không sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu
hại
- Serratia marcescens
Giới thiệu về chế phẩm thuốc trừ sâu sản xuất từ vi khuẩn Bacillus
thuringienis (Bt)
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) : Phân lập lần đầu năm 1870 và trừ côn
trùng năm 1915. Đến 1971, đã có hơn 30 chủng Bt, chia thành 20 serotyp khác
nhau gây hại cho 400 loài côn trùng. Sản phẩm Bt diệt côn trùng có trên thị trường
từ đầu những năm 60 của thế kỷ 20. Bt là nhóm vi khuẩn háo khí, gram dương,
bào tử hình que, kích thước 3-6 x 0,8-13µ, đơn hay xếp chuỗi. Vi khuẩn di chuyển
nhờ roi dài 6 - 8µ. Bào tử hình trứng, chịu nhiệt, có kích thước 1-1,5 x 0,8 - 0,9µ.

8
Trong môi trường, bào tử sinh tế bào dinh dưỡng hình que. Hầu hết các chủng
Bt trong thời gian hình thành bào tử, đều sản sinh ra tinh thể độc delta-endotoxin (
tiền độc tố) và độc tố này được hoạt hoá trong ruột giữa do các men phân giải
protein. Ngoài ra, delta-endotoxin còn gây rối màng biểu mô ruột giữa, làm mất cân
bằng tính thấm của tế bào, côn trùng bị liệt và chết.
Delta-endotoxin còn tương tác với các liposome của màng tế bào biểu mô, làm
tăng sự rối loạn màng biểu mô ruột giữa. Delta-endotoxin có hiệu lực trừ sâu non
cánh phấn Lepidoptera và một số loài của Diptera và Coleoptera. Các thuốc thương
phẩm của Bacillus thuringiensis đều chứa bào tử và delta-endotoxin có hiệu lực trừ
nhiều loài dịch hại trong nông và lâm nghiệp.
Phương thức tác động: Bacillus thuringiensis sản sinh bào tử bên, các protein
kết tinh và tạo bào tử ra trong quá trình bào tử nảy mầm. Khi vào bụng côn trùng, vi
khuẩn thể hiện hoạt tính trừ sâu với sâu non và trưởng thành bộ cánh vảy
Lepidoptera và một số loài thuộc bộ cánh cứng Coleoptera. Trong cơ thể côn trùng,
tinh thể protein bị hoà tan và men protease trong ruột côn trùng biến tinh thể
độc(tiền độc tố) thành 4 chất độc nhỏ hơn. Các chất độc bị thuỷ phân bao vây tế bào
ruột giữa côn trùng, đặc biệt phía chất nhận, nơi tạo các amino axit. Quá trình này
phụ thuộc vào hàm lượng của ion kali. Sự tác động này tạo lỗ hổng, cho phép lựa
chọn cation, làm tăng tính thấm của màng tế bào. Tính thấm nước tăng, tế bào bị
phồng lên thậm chí bị vỡ, phá vỡ thành ruột giữa. Tính chọn lọc đặc trưng của các
chủng Bt với các loài côn trùng phụ thuộc vào cường độ các chất độc bao vây các
chất nhận. Ngoài ra, các bào tử của Bt trong ruột côn trùng cũng tiếp tục phát triển
và sản sinh ra tinh thể độc và bào tử mới, làm tăng hiệu lực của Bt.
Bt là thuốc trừ sâu có tác động đường ruột; không có tác động tiếp xúc, xông
hơi và nội hấp. Vào trong cơ thể côn trùng, các tinh thể nội độc tố bị hoà tan, huỷ
hoại các tế bào biểu mô (epithelial cell) ruột côn trùng, côn trùng chán hay ngừng
ăn và tử vong.

9
2.2. Mối quan hệ giữa vi khuẩn cộng sinh và tuyến trùng
Theo Gouge và Snyder (2006), EPN (Entomopathogenic nematodes) là những
động vật không xương sống, thuộc ngành giun tròn (Nematoda), thường được
gọi là “roundworms”. EPN có khả năng ký sinh gây chết côn trùng đặc biệt là côn
trùng sống trong môi trường đất (do đó được gọi là tuyến trùng ký sinh gây bệnh
côn trùng), đúng như tên gọi chúng chỉ gây bệnh cho côn trùng, vô hại với con
người, cây trồng và vật nuôi. EPN sống bên trong cơ thể vật chủ nên được
gọi là “nội ký sinh”. Chúng lây nhiễm cho rất nhiều loại côn trùng khác nhau
sống trong đất, bao gồm cả những dạng ấu trùng của bướm, ngài, bọ cánh cứng,
ruồi, dế trũi và châu chấu trưởng thành, ngay cả một số ấu trùng côn trùng có kích
thước nhỏ, có vòng đời ngắn như ấu trùng muỗi, rầy nâu hại lúa. Tiêu biểu là hai
họ Steinernematidae và Heterorhabditidae hiện được sử dụng như một nhóm tác
nhân phòng trừ sinh học sâu hại rất có hiệu quả trên thế giới (Poinar, 1966). Cả 2
họ này được đánh giá lây nhiễm cao, đa dạng ký chủ (Gaugler và Kaya, 1990) và
với vi khuẩn cộng sinh trong ruột của chúng có khả năng gây ra nhiễm trùng huyết
cho ký chủ. Các vi khuẩn cộng sinh của chi Steinernema và Heterorhabditis
tương ứng thuộc chi Xenorhabdus và Photorhabdus (Boemare và cộng sự, 1997).
Ở giai đoạn IJs (infective juveniles) tuyến trùng xâm nhập vào xoang máu côn
trùng và giải phóng vi khuẩn cộng sinh gây nhiễm trùng huyết ký chủ. Vi khuẩn sẽ
phân hủy ký chủ tạo ra thức ăn cho tuyến trùng và sản xuất các kháng sinh chống lại
sự xâm nhập của các vi sinh vật khác. Các kháng sinh của vi khuẩn cộng sinh sản
xuất như xenorhabdins, xenocoumacins, hydroxystilbens và antraquinons (Li và
cộng sự, 1998; Fodor và cộng sự, 2010).
Mặc dù mối quan hệ rất cụ thể và phụ thuộc lẫn nhau giữa tuyến trùng EPN
và vi khuẩn cộng sinh của nó nhưng một số vi khuẩn phụ thuộc đã được báo cáo có
liên quan đến tuyến trùng và ký chủ bị nhiễm tuyến trùng EPN. Poinar (1966) đã
phân lập được Achromobacter nematophilus từ Galleria mellonella bị lây
nhiễm bởi S.(Neoplectana) carpocapsae và cũng tìm thấy trong đó Alcaligenes

10
sp., Aerobacter sp., Proteus sp. và Pseudomonas aeruginosa. Thêm Alcaligenes
dorans, Pseudomonas fluorescens, P. maltophilia, P. alcaligenes và
Acinetobacter sp. cũng được phân lập từ loài tuyến trùng này (Lysenko và
Weiser, 1974). Các vi khuẩn khác như Escherichia coli, Ochrobactrum anthropi,
Paracoccus denitrificans, Pseudomonas aureofaciens, P. fluorescens Biovar B và
Xanthomonas maltophilia đã được tìm thấy liên quan đến S. scapterisci
(Aguilera và Smart, 1993; Aguilera và cộng sự, 1993). Ngoài ra, với chi
Heterorhadibditis đã được tìm thấy có vi khuẩn khác cộng sinh với nó, bao gồm
Providencia rettgeri (Jackson và cộng sự, 1995), Ochrobactrum anthropi và O.
Intermedium (Babic và cộng sự, 2000).
Một loài vi khuẩn không cộng sinh từ chi Serratia, như S. liquefaciens, cũng
được phát hiện liên quan đến Steinernema spp. và Heterorhabditis spp. (Boemare
và cộng sự, 1997). Ngoài S. proteomaculans thì S. marcescens cũng được tìm
thấy trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006).
Mặc dù tất cả các nghiên cứu, báo cáo sự kết hợp của vi khuẩn không cộng sinh
với tuyến trùng EPN không có mô tả độc lực của các vi khuẩn liên quan, sự vận
chuyển vi khuẩn của tuyến trùng vào bên trong côn trùng, làm thế nào chúng được
vận chuyển hoặc mức độ liên kết giữa tuyến trùng và vi khuẩn. Trong báo cáo
mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa
Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae.
2.2.1. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn
Trong tổ hợp cộng sinh vi khuẩn có vai trò rất lớn đối với tuyến trùng, thể hiện
qua các mặt sau:
- Sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm: Độc tố do vi khuẩn cộng sinh
tiết ra một số protein độc có khả năng nhiễm xoang máu côn trùng vật chủ và làm
cho côn trùng chết một cách nhanh chóng trong vòng 24 - 48 giờ. Như vậy, thời
gian chết của côn trùng vật chủ khác nhau còn tùy loại tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn

11
thuộc và cũng phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn
48 giờ.
- Cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng: Tuyến trùng sử dụng vi khuẩn
cộng sinh vừa được giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trông xoang máu côn
trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng. Nhờ đó mà IJs cũng nhanh chóng phát
triển sang tuổi 4 và đạt đến tuổi trưởng thành. Từ thế hệ 2, tuyến trùng chuyển sang
dinh dưỡng hoạt hóa xác chết con trùng. Nhờ các enzyme do vi khuẩn tiết ra mà các
mô cơ thể côn trùng trở thành nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng. Từ đó thế
hệ thứ 2 của tuyến trùng tiếp tục phát triển, sinh khối các thế hệ tiếp theo. Thông
thường trong cơ thể công trùng, tuyến trùng có thể phát triển 2 đến 4 thế hệ, phụ
thuộc vào sinh khối côn trùng làm nguồn thức ăn cho chúng.
- Ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: vi khuẩn
cộng sinh có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác nhân sinh
học khác như nấm, vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác côn trùng. Nhờ vậy mà
chúng bảo vệ nguyên vẹn nguồn thức ăn giành cho tuyến trùng cộng sinh của
chúng.
2.2.2. Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố giết chết côn trùng
Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có thể tiêu diệt một phổ khá lớn các loài côn
trùng vật chủ do chúng có khả năng vượt qua các hệ thống bảo vệ của côn trùng và
sản xuất các chất độc tố (toxin) để giết côn trùng bị nhiễm.
Cũng giống như các vi khuẩn gram âm khác các loài Xenorhabdus spp. và
Photorhabdus spp có khả năng sản sinh ra nội độc tố. Nội độc tố do X. poinarii sinh
ra là các hợp chất lipopolisacharide của thành tế bào, các chất này gây độc đối với
huyết cầu (haemocytes) của côn trùng. Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa rõ ràng là chỉ
một mình nội độc tố có hiệu lực giết chết côn trùng vật chủ hay còn nhiều yếu tố
khác nữa. Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép X. enorhabdus nhân nhanh số
lượng và sản sinh ra ngoại độc tố (exotoxin), các ngoại độc tố được chứng minh
trong P. Luminescens (Bowen và cộng sự, 1998) và X. Nematiphilus bằng cách tiêm
các dịch nuôi cấy vi khuẩn vào cơ thể côn trùng thì côn trùng sẽ chết nhanh chóng.

12
Các vi khuẩn này sản sinh các enzyme ra ngoài tế bào, các chất này chủ yếu là
protease, lipase, chitinase.
2.3. Giới thiệu về Serratia marcescens
2.3.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens
Serratia marcescens bắt nguồn từ sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn
thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về
“máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, năm 332 trước công nguyên,
những người lính của quân đội Macedonian của Alexander thấy rằng bánh mì
của họ đôi khi xuất hiện máu trên đó.
Năm 1800, Christian Gottfried Ehrenberg (1795–1876) phát hiện gần 100 tài
liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm.
Nhà sử học và vi sinh vật học ERL Gaughran (1969) đã phát hiện hơn 35 báo
cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó sự việc như vậy ghi nhận lần đầu
vào năm 1169 tại Đan Mạch.
Trong bong tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh
được sử dụng trong thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia. Tuy nhiên điều này
lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ
(Gillen và Gibbs, 2011). Bartholomeo Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya) là
người đầu tiên phát hiện và đặt tên là Serratia marcescens cho nguyên nhân của
sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu.
Ban đầu Bizio mô tả S. marcescens như là một loại nấm do ông nhìn thấy
những đốm đỏ dưới kính hiển vi. Sau đó vào những năm 1850, các nhà khoa học đã
phân loại lại S. marcescens là vi khuẩn.
Từ những năm 1906, các bác sĩ dùng Serratia marcescens như là một điểm
đánh dấu sinh học để nghiên cứu về sự di truyền của vi sinh vật vì cho đến những
năm 1950 thì S. marcescens vẫn được xem là một mầm vô hại và cũng vì màu hồng
đặc trưng của S. marcescens.
Đến năm 1960 thì Serratia marcescens được công nhận là tác nhân gây
bệnh cơ hội ở người bởi giáo sư Scheurlen của trường đại học Strasbourg.

13
2.3.2. Phân loại Serratia marcescens
Theo Bizio (1823), Serratia marcescens được phân loại như sau:
- Giới: Bacteria
- Ngành: Proteobacteria
- Lớp: Gamma Proteobacteria
- Bộ: Enterobacteriales
- Họ: Enterobacteriaceae
- Chi: Serratia
- Loài: Serratia marcescens
2.3.3. Đặc điểm sinh lí
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, có đường kính
khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm (David R.C., 2012).
Hình 2.1. Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011)
Serratia marcescens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 5 - 400
C
và trong ngưỡng pH từ 5 - 9 .
Serratia marcescens có thể dễ dàng tìm thấy trong nước, đất, trên thực vật,
trong côn trùng, trong cơ thể người và động vật. Được tìm thấy nhiều trong thực

14
phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng
trưởng của S. marcescens.
S. marcescens có thể dễ dàng di động bằng tiên mao và tiêm mao. Chúng có
thể bám dính với nhau trên môi thạch thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 - 0,8%).
Các cụm tế bào có chiều dài từ 5 – 30µm . S. marcescens cũng có thể tạo thành
một màng sinh học. S. marcescens có thể phát triển trong sự hiện của oxy hoặc
trong trường hợp không có oxy. Chủ yếu sử dụng quá trình lên men để lấy
năng lượng, có các enzyme (superoxide dismutase, calatase và peroxides) bảo vệ
nó khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trường oxy hóa.
2.3.4. Đặc điểm sinh hóa
Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ
Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNase, lipase, chitinase và
gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Bên cạnh đó, các đặc điểm khác để xác định
Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào
như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997).
Thủy phân casein là một đặc điểm chung của S. marcescens. Casein là một
protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. S.
marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide
(CO-NH) trong casein. Ngoài ra, S. marcescens còn có enzyme gelatinase ngoại
bào phân hủy gelatine.
Các sắc tố màu đỏ được sản xuất bởi S. marcescens được biết đến như là một
yếu tố đặc biệt mà điển hình là prodigiosin, nhưng chỉ xuất hiện trong một
số chủng.
Prodigiosin có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế
bào T), vì vậy có thể S. marcescens sống trong cơ thể người sẽ không tổng hợp
prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và
Falkiner, 1997).

15
Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và John,
2010)
STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả
1 Di động +
2 Indole -
3 Methyl red -
4 Voges Proskauer +
5 Citrate +
6 Dnase +
7 Catalase +
8 Oxidase -
9 Urease -
10 Gelatinase +
11 Chitinase +
12 Triple sugar iron Môi trường chuyển
sang acid, không sinh khí
và không sinh H2S
13 Hydrogen sulphide peoduction -
14 Lyine decarboxylase +
15 Ornithine decarboxylase +
16 Lên men glucose +
17 Lên men sucrose +
18 Lên men fructose +
19 Lên men xylose -
20 Lên men rhaminose -
21 Lên men lactose -
22 Lên men arabinose -

16
Bảng 2.2. Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia (F. Grimont and P.A.D. Grimont,
2006)
Đặc điểm
S.
marcescens
s.
liquefaciens
S.
grimesii
S.
proteamaculans
S.
quinivorans
S.
ficaria
S.
fonticola
S.
rubidaea
S.
odorifera
S.
plymuthica
S.
entomophila
S.
glossinae
S.
nematodiphila
S.
ureilytica
Dnase + + + + + + - + + + + ND + ND
Gelatinase + + + + + + - + + + + - + ND
Lipase (Tween 80
hydrolysis)
+ + + + + + + + - + + ND + +
Lipase (corn oil
hydrolysis)
+ + + + + + + + + + + ND ND ND
Sản xuất prodigiosin V - - - - - - V - V + - + -
Indole - - - - - - - - V - - - - -
Urease - - - - - - - - - - - + - +
Arginine dihydrolase - - + - - - - - - - - - + +
Lysine decarboxylase + + + + + - + V + - - + + +
Ornithine
decarboxylase
+ + + + + - + - V - - + + +
L-arabinose - + + + + + + + + + - + + -
D-Dulcitol - - - - - - + - - - - ND ND ND
Lactose - V V V V V + + + + - ND + -
D-Sobitol + + + V V + + - + V - + + +
Sucrose + + + + + + V + V + + - + +
Trong đó: ND: không xác định; V: phản ứng thay đổi

17
2.3.5. Đặc điểm phân bố
Serratia marcescens khá phổ biến. Nó thường được tìm thấy trong đất, trong
nước, thực vật, trong côn trùng cũng như trong ống tiêu hóa của người và động vật
- Trong nước và đất:
Trong 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông thì Serratia
marcescens chiếm 75%, S. marcescens xuất hiện nhiều nhất ở các vùng nước bị ô
nhiễm. Bên cạnh đó, S. marcescens có thể đóng một vai trò quan trọng trong chu
kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng như hòa tan
vàng và đồng (Pares, 1964).
- Trong côn trùng:
Sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng cho thấy
Serratia marcescens chiếm ưu thế (Grimont và cộng sự, 1979). Serratia
marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối với côn
trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết
sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006).
Bên cạnh đó, cũng có thể tìm thấy Serratia marcescens trong ống tiêu hóa của
người và động vật có xương sống, cũng như trong thực vật.
Hình 2.2. Khuẩn lạc của S.
marcescens trên XLD (Bizio, 1823)
Hình 2.3. Khuẩn lạc của S.
marcescens trên NA (Benzutze)

18
Bảng 2.3. Tỉ lệ các loài Serratia phân lập được từ các môi trường khác nhau
(F.Grimont và P.A.D.Grimont, 2006)
Động vật
có vú
Khu vực ở
của động
vật
Nước
Thực
vật
Bệnh nhân
nhập viện
S. marcescens 10 2 75 10 97
S. plymuthica 4 2 1 5 0
S. liquefaciens 43 55 11 38 2
S. proteamaculans 39 29 8 32 0
S. grimesii 3 10 5 7 0,5
S. rubidaea 0 0 0 1 0,2
S. odorifera 0 0 0 4 0,1
S. ficaria 0 2 0 4 0
Tổng số phần trăm (%) 100 100 100 100 100
Bảng 2.4. Tỉ lệ các chủng Serratia marcescens phân lập được từ các môi
trường khác nhau (F.Grimont và P.A.D.Grimont, 2006)
Chủng Nước
Thực vật và động
vật gặm nhấm
Bệnh nhân nhập
viện
A1 12 19 0.1
A2/6 23 5 7
A3 21 38 7
A4 34 38 26
A5/8 7 0 47
TCT 3 0 13
Tổng số phần trăm 100 100 100

19
2.3.6. Tình hình nghiên cứu về Serratia marcescens
Năm 1997, Hejazi, A., và Falkiner đã nghiên cứu khả năng sinh enzyme
ngoại bào của Serratia marcescens. Một số enzyme này đã được chứng minh là có
khả năng làm suy giảm chitin, vách tế bào chủ yếu của các loại nấm.
Năm 2005, R Krausse và cộng sự đã nghiên cứu và cho thấy rằng Serratia
marcescens NCTC 10211 có thể làm việc như là một probiotic trong ức chế sự tăng
trưởng của H.pylori, tác nhân gây viêm loét dạ dày .
Năm 2006, Brigida và Itamar đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng
của Serratia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của
S. marcescens lên thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh.
Năm 2007, Jaiganesh và cộng sự đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát nấm gây
bệnh trên cây lúa Pyricularia oryzae bằng cách sử dụng Serratia marcescens.
2.4. Một số hợp chất thứ cấp đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens
2.4.1. Sắc tố (prodigiosin)
Sắc tố Prodigiosin là một hợp chất chuyển hóa thứ cấp, được hình thành bởi
các enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole và 4-methoxy-2, 2’-methyl-3-amyl-6-
methoxyprdigiosene (Williams và Qadri, 1980).
Prodigiosin được tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marcescens (Han và cộng sự,
1998), được biết đến như là một yếu tố đặc biệt, nhưng chỉ xuất hiện trong một số
chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin
hydrochloride (cPrG-HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và
desmethoxyprodigiosin. Trong đó khả năng ức chế miễn dịch có trong
uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride
(cPrG-HCI) (Krishna, 2008).
Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin được sản xuất bởi biogroup
A1 và A2/6, nó không được sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8. Hoặc TCT
(Grimont, 1997). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6

20
thường gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC
(Grimont,1997;Wiliams và Qadri, 1980). Prodigiosin được biết đến là có khả năng
kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia
marcescens sống trong cơ thê người, có thể chúng sẽ không tổng hợp prodigiosin và
do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997).
Bên cạnh đó, một sắc tố màu vàng là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic
semialdehyde axit, được sản xuất nhờ sự phân cắt 3, 4 - dihydroxy axit (3,4-DHP)
do enzyme 3, 4-DHP 2, 3-dioxygenase (Trias và cộng sự,1988). Enzyme này được
kích thích bởi tyrosine trong tất cả các chủng S. marcescens. Tuy nhiên, hiện nay
chỉ S. marcescens chủng dạng sinh học A8a đã bị mất khả năng phát triển trên các
hợp chất thơm có thể sản xuất sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006).
Hoạt tính sinh học của prodogiosin:
 Hoạt tính kháng khuẩn
Prdigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi khuẩn
(Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả
năng thấm qua màng tế bảo và khả năng ức chế các enzyme như DNA gryase,
topoisomerase IV… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi khuẩn
(Ramina và Samira, 2009).
Nhiều nghiên cứu đã thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng
được nhiều vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,
Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella
pneumoniae, Bacillus cereus,... (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự,
2012).
 Hoạt tính chống tế bào ung thư
Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng
tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và
cộng sự, 2009; Perez- Tomas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc này,
prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thư.

21
Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh lần đầu
tiên bằng những tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7
hepatocarcinoma xenografted. Một mô hình khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy
prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách nó đã giảm sự di căn trên tế
bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này đã cho thấy rằng prodigiosin
ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế.
Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng
tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng
trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế bào
cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng tế bào này
(Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
 Hoạt động ức chế miễn dịch
Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả bởi
Nakamura và cộng sự. Họ cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và
metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy Serratia và quan sát sự ức chế
chọn lọc sự phát triển của các tế bào T đa giá so với các tế bào B (Han và cộng sự,
2001). Sau đó hoạt động ức chế miễn dịch đã được chứng minh cho các chất
tương tự prodigiosin khác như undecylprodigiosin, cPrG, MAMPDM,
nonylprodigiosin và tổng hợp tương tự PNU156804.cPrG.HCl, MAMPDM và
prodigiosin thấy sự ức chế tăng sinh tế bào T đa giá so với các tế bào B in vitro
trong tế bào lá lách chuột. Prodigiosin ức chế sự tăng sinh của tế bào lympho
kích thích với concanacalin A, chống CD3 và chống CD28, hoặc phorbol myrisate
và ionomycin. Những kết quả này cho thấy prodigiosin ức chế cả thụ thể tế bào
T phụ thuộc và tăng sinh độc lập với các tế bào (Pandey và cộng sự, 2007)
2.4.2. Enzyme
Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease, chitinase,
lipase, DNase, gelatinase. phytase…..
Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải
có chứa chitin trong quá trình sản xuất thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soát sinh

22
học đối với sâu và nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước…(Joshi và cộng sự,
1989).
Enzyme chitinase
Chitinases có tiềm năng to lớn cho công nghệ sinh học ứng dụng và có thể
được sử dụng như tác nhân kiểm soát sinh học chống lại nấm bệnh cũng sâu bệnh
trong nông nghiệp (Jones và cộng sự, 1986; Kobayashi và cộng sự, 2002; Pan và
cộng sự, 2006). Một số chi của vi khuẩn bao gồm Serratia (Suzuki và cộng sự,
2002, Enterobacter ( Chernin và cộng sự, 1995) có thể sản xuất enzymes
chitinolytic ở mức cao. Serratia marcescens là một trong những yếu tố làm suy
giảm chitin. Nhiều chitinases đã báo cáo là được sản xuất từ S. marcescens, chẳng
hạn như chiA, ChiB, và ChiC (Watanabe và cộng sự, 1997), và một loại protein
chitin ( CBP21 ), CBP21 tìm thấy là cần thiết cho việc phân giải chitin (Vaaje -
Kolstad và cộng sự, 2005 ). Chitinases từ vi khuẩn đã được sử dụng trong việc
kháng nấm bệnh như Rhizoctonia solaniand Aspergillus parasiticus (Chernin và
cộng sự, 1995).
Enzyme phytase
Phytase là một enzym ngoại bào có thể xúc tác cho quá trình thủy phân acid
phytic và monophosphate vô cơ làm giảm phhosphate myoinositol. Serratia
marcescens là một vi sinh vật có thể tiết phytase được phân lập từ đất cây họ đậu và
có thể sản xuất phytase. Phytases có thể phân hủy phytate, đó là dạng tồn tại của
phosphate trong các nhà máy. Ứng dụng phytase có thể giảm phốt pho thải lên đến
50%, một ứng dụng mà sẽ góp phần đáng kể đối với bảo vệ môi trường. Một loạt
các phytases được phát hiện và đặc trưng trong 10 năm qua. Phytase cũng đã được
phát hiện trong nhiều vi khuẩn như Aerobacter aerogens, Pseudomonas sp., E.coli,
Bacillus subtilis, Serratia marcescnes.
2.4.3. Biosurfactants
Biosurfactants là một nhóm cấu trúc đa dạng của amphipathic hoạt động bề
mặt các phân tử với cả hai vùng ưa nước và kỵ nước. Hầu hết các bề mặt của vi sinh

23
vật là các phân tử phức tạp, bao gồm các cấu trúc khác nhau như: lipopeptides,
glycolipid, khu phức hợp polysaccharide-protein, axit béo và phospholipid .
Trong vài thập kỷ qua, biosurfactants đã được sự chú ý bởi vì chúng thể hiện
một số lợi thế qua tổng hợp hóa học bề mặt. Lợi thế như vậy bao gồm phân hủy sinh
học, độc tính thấp, cân bằng sinh thái và khả năng được sản xuất từ chất tái tạo rẻ
hơn (Mohan và cộng sự, 2006) và hiệu quả tại các giá trị nhiệt độ và pH cực đoan
(Cameotra và Makkar, 1998). Phạm vi ứng dụng công nghiệp của biosurfactants
bao gồm tăng cường thu hồi dầu, khoan dầu thô, dầu phế thải, xử lý sinh học của
các chất ô nhiễm, chăm sóc sức khỏe và chế biến thực phẩm (Hickey và cộng
sự, 2007; Ghojavand và cộng sự, 2008).
Hầu như các chủng S. marcescens, từ các chủng sinh sắc tố và các chủng
không sinh sắc tố đều có thể sản xuất biosurfactants. Biosurfactants được S.
marcescens sản xuất với số lượng lớn ở nhiệt độ 300
C, nhưng không sản xuất được
ở 370
C trong pha cân bằng của quá trình tăng trưởng. Ba aminolipids, từ W1 đến
W3 có các hoạt động làm ướt và đã được phân cách bởi sắc ký lớp mỏng
(Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 được xác định là serratamolide, một
cyclodepsipeptide trước đó phát hiện bởi Wasserma và các cộng sự (1961).
2.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens
S. marcescens đã được khảo sát cho sự tăng trưởng và khả năng gây bệnh của
nó trong các ấu trùng sâu bướm sáp (Galleria mellonella). Tất cả các chủng gây
bệnh cho ấu trùng của G. mellonella dẫn đến tử vong trong vòng 48 giờ. Chủng đã
được chứng minh có một gen mã hóa protein metalloprotease serralysin. Gen mã
hóa protein metalloprotease được xác định là góp phần vào quá trình gây chết côn
trùng (Tambong., J.T, và cộng sự, 2014)
S. marcescens được biết đến với khả năng tiết nhiều enzyme ngoại bào như
chitinase, lecthinase, hemolysin, lipase, protease, nuclease..Mặc dù S. marcescens
có thể sản xuất nhiều protease khác nhau, trong đó có metalloprotease kẽm,
serralysin. Meada và cộng sự năm 1995 báo cáo rằng serralysin đóng một vai trò

24
quan trọng trong sinh bệnh học của sinh vật này. Nghiên cứu đã chứng minh
serralysin nhanh chóng làm suy giảm một loạt cấu trúc protein và huyết thanh. Theo
đó, protease vi khuẩn như serralysin đóng một vai trò quan trọng như một yếu tố
độc lực (Yutaka Kida và cộng sự, 2007)
Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng lây nhiễm cho trứng, ấu
trùng, nhộng và sâu trưởng thành của loài heliothines-thuộc chi bướm đêm gây hại
cho nông nghiệp (Sikorowski và Lawrence, 2009)
Ấu trùng lớn tuổi bị nhiễm vi khuẩn thường bộc lộ phản ứng là giảm các kích
thích bên ngoài, và cái chết xảy ra một hoặc hai ngày sau đó. Vi khuẩn sau khi xâm
nhập vào trong đường máu của vi khuẩn và gây ra nhiễm trùng huyết và gây tử
vong.
Theo kết quả nghiên cứu của Estrada và cộng sự năm 2012 thì ấu trùng bị
nhiễm trở thành màu đỏ sau khi chết, và tỉ lệ sống sót của những ấu trùng bị nhiễm
là rất ít. Một số ấu trùng bị nhiễm trong giai đoạn cuối của ấu trùng thì sau khi hóa
nhộng nó cũng sẽ bị chết do nhiễm khuẩn và khi chết nó cũng xuất huyết có màu đỏ
của S. marcescens. Đến giai đoạn sâu trưởng thành, nó có thể được lấy nhiễm bằng
cách cho ăn thực phẩm bị ô nhiễm, các vi khuẩn sẽ xâm nhập vào các mô của côn
trùng và gây chết. Serratia marcescens có khả năng lây nhiễm và loại bỏ cao đối
với bộ H. Zea và H virescens .
Serratia marcescens còn có thể kết hợp với một số loại tuyến trùng hay giun
tròn để gây bệnh cho côn trùng ví dụ như: O. Carolinensis kết hợp
với Serratia marcescens gây bệnh côn trùng trên lớp biểu bì bên ngoài của nó.
Ngoài ra cũng có thể tạo được mối quan hệ nhân tạo giữa vi khuẩn và các
tuyến trùng, bằng cách trộn chung tuyến trùng với vi khuẩn và nuôi chúng trong
một khoảng thời gian. Cũng trong nghiên cứu của Estrada và cộng sự, năm 2012 thì
khi Steinernema carpocapsae kết hợp với S. marcescens mang đến hiệu quả diệt
100% ấu trùng Galleria mellonella chỉ sau 48 giờ. Mặc dù vậy sự tồn tại của S.
marcescens cũng không ảnh hưởng đến vi khuẩn cộng sinh X. Nematophila.

25
2.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men thu sinh khối
2.6.1. Quá trình lên men thu sinh khối
Hình 2.4. Quy trình công nghệ lên men thu sinh khối
Thuyết minh quy trình:
Chuẩn bị môi trường:
Nuôi cấy vi sinh vật ở bất cứ quy mô nào (phòng thí nghiệm, nhân giống cấp
1, 2, 3 hay trong nồi lên men) đều phải đảm bảo đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng
cho vi sinh vật hoạt động nhân sinh khối cũng như tạo sản phẩm. Tính chất và thành
phần của môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào nhu cầu của vi sinh vật cũng như thích
hợp cho việc thu hồi sản phẩm sau lên men.
Nhân giống
Trong sản xuất, việc hoạt hóa giống và thường xuyên kiển tra chất lượng của
giống là điều hết sức cần thiết và không thể thiếu. Muốn làm tốt khâu này cần phải
tiến hành các việc sau:
- Kiểm tra độ thuần khiết của giống trong lên men
- Kiểm tra khả năng biến đổi của giống
- Hoạt hóa giống sau một thời gian sử dụng
Để hoạt hóa giống người ta thường sử dụng môi trường nuôi cấy giàu các chất
kích thích sinh trưởng như cao nấm men, hỗn hợp vitamin, acid béo.
Thu hồi sản phẩm
Giống vi
sinh vật
Nhân giống
cấp 1,2,3
Lên men
Khử trùng môi trường
Chuẩn bị môi trường

26
- Giữ giống bằng phương pháp thích hợp để có thể duy trì những hoạt tính ưu
việt của chúng, chống thoái hóa giống, mất hoạt tính.
Mục đích của việc nhân giống là để tăng sồ lượng tế bào vi sinh vật. Trong
quy trình lên men, thì tùy chủng giống vi sinh vật khác nhau mà cần nhân theo cơ
chất và môi trường nhân khác nhau.
Trong công nghiệp, người ta thường nhân với lượng lớn sinh khối vi sinh vật
như sau:
- Giai đoạn trong phòng thí nghiệm (nhân giốn cấp I)
Đây là giai đoạn cấy giống vi sinh vật thuần khiết từ ống giống, đem nhân ở
môi trường sinh dưỡng chuyên tính vô trùng, nuôi cấy trong phòng thí nghiệm,
nhằm đáp ứng đủ lượng giống cần thiết cho bước tiếp theo.
- Giai đoạn ở xưởng (nhân giống sản xuất)
Đây là giai đoạn cần nhân một lượng giống lớn để đáp ứng cho khâu giống
trong sản xuất. Từ giống cấp 1,2,3 nhân trong nồi lên men hay trong cơ chất đặc
(chất mang)
 Khử trùng môi trường
Môi trường trước khi đưa vào cấy giống phải được khử trùng để diệt hết các vi
sinh vật cũng như các mầm sống nhằm đảm bảo trong khi nuôi cấy vi sinh vật sẽ
không bị tạp nhiễm các chủng loài khác. Quá trình thanh trùng sẽ diễn ra trong các
nồi áp suất cao. Môi trường trong các bình nhỏ như bình tam giác hay bình thủy
tinh được thanh trung trong nồi áp suất riêng, còn môi trường lớn sẽ thanh trùng
trong nồi lên men
 Lên men
Phương pháp lên men phụ thuộc vào các đặc điểm sinh lý của vi sinh vật nuôi
cấy đối với oxy, người ta coi quá trình đó là hiếu khí, kị khí hay kị khí không bắt
buộc. Để phù hợp với các đặc điểm sinh lý đó sẽ có các phương pháp lên men phù
hợp.

27
- Phương pháp lên men bề mặt: Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi
trường (hay là phát triển trên môi trường dịch thể trong bình nuôi). Phương pháp
này thì oxy sẽ được cung cấp trực tiếp từ không khí.
- Phương pháp lên men chìm
Trong phương pháp nuôi cấy này, các vi sinh vật phát triển trong môi trường
dịch thể, đối với các vi sinh vật kị khí thì người ta không cấp khí, còn đối với các vi
sinh vật hiếu khí người ta cấp oxy cho vi sinh vật phát triển. Tùy theo nhu cầu oxy
của từng loại vi sinh vật mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau để tăng
lượng oxy hòa tan trong môi trường, ví dụ như tăng cường lượng khí cấp, sử dụng
cánh khuấy với các tốc độ khác nhau...
Trong quá trình lên men ta sẽ điều chỉnh nhiệt độ, pH và điều kiện oxy phù
hợp với sự phát triển của chủng vi sinh vật
 Thu hồi sản phẩm
Ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để thu hồi sinh khối vi sinh
vật như ly tâm, tự lắng kết, lắng kết điện trường.
Tùy theo mục đích sử dụng mà sinh khối vi sinh vật được bảo quản cũng như
tạo các chế phẩm khác nhau
2.6.2. Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện lên men
Quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn được chia thành 4 giai đoạn: pha tiềm
phát (pha lag), pha tăng tốc (pha log), pha cân bằng và pha suy vong.
- Pha Lag (tiềm phát): Pha này được tính từ khi bắt đầu cấy đến khi tốc độ sinh
trưởng của vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh. Trong thời gian này vi khuẩn dần dần
làm quen với môi trường và thích nghi với môi trường. Ở giai đoạn này vi khuẩn
mới bắt đầu sinh sản với tốc độ chậm. Thời gian của pha này phụ thuộc vào sự thích
nghi của vi khuẩn đối với môi trường.
- Pha Log (tăng tốc): Pha này là pha tăng trưởng mạnh nhất. Tế bào sinh
trưởng với tốc độ nhanh nhất và sinh khối tế bào được tạo thành theo cấp độ lũy
thừa. Tế bào ở pha này trẻ về sinh lý, có hoạt tính sinh học cao. Tế bào sinh ra
nhanh, lượng cơ chất giảm mạnh và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra.

28
- Pha cân bằng: việc chuyển từ pha logarit sang pha ổn định diễn ra dần dần.
Trong pha cân bằng, quần thế vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, ở pha này
thì lượng tế bào sinh ra bằng lượng tế bào chết đi, sinh khối sinh ra không tăng lên
và cũng không giảm.Vì vậy khi nồng độ cơ chất giảm thì tốc độsinh trưởng của vi
khuẩn cũng giảm.
Nguyên nhân tồn tại pha này là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của quá trình
trao đổi chất (như axit hữu cơ) và việc cạn dần các chất dinh dưỡng trong môi
trường. Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng.
Sản lượng phụ thuộc vào tính chất và sốlượng các chất dinh dưỡng sử dụng vào
điều kiện nuôi cấy. Đó là sự sai khác giữa sốlượng vi khuẩn cực đại và khối lượng
vi khuẩn ban đầu.
- Pha suy vong: Trong pha này lượng tế bào ngày càng già và chết đi, sự cân
bằng bị phá vỡ, ngoài sự biến đổi về số lượng tế bào còn có sự biến đổi về kích
thước.
Từ việc đánh giá được sự phát triển của các pha, ta có thể vẽ được đường
cong sinh trưởng của vi khuẩn. Nhìn vào đường cong sinh trưởng của vi khuẩn ta có
thể thấy rõ vi khuẩn phát triển mạnh nhất ở giai đoạn nào và thời điểm nào là thu
được số lượng sinh khối lớn nhất.
Thời gian sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào môi trường
nuôi cấy (như các chất dinh dưỡng cần thiết) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt
độ, pH, điều kiện thông khí, thời gian nuôi cấy…
Vấn đề đặt ra ở đây đó là nên thu sinh khối ở giai đoạn nào là tốt nhất và chất
lượng nhất, bởi chọn thời điểm lấy sinh khối nhằm tạo điều kiện cho quá trình phát
triển sau này. Nếu thu hồi sinh khối ở pha cân bằng thì sẽ có nhiều tế bào già và
chết. Theo một số tài liệu nghiên cứu thì sinh khối nên được lấy ra ở thời điểm đầu
pha cân bằng là tốt nhất.

29
2.6.2.1. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát
triển của S. marcescens
Môi trường nuôi cấy là nguyên liệu cung cấp nguồn dinh dưỡng cho các quá
trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào và các quá trình trao đổi năng
lượng của vi sinh vật.
Trong quá trình lên men một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường
đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá
thành thấp nhất đối với chủng vi sinh vật đó. Vi khuẩn muốn sinh trưởng và phát
triển tốt thì trong môi trường phải có đầy đủ các thành phần chủ yếu như C, H, N,
và O.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon:
Tất cả các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể tế bào vi sinh vật đều là các
hợp chất chứa cacbon. Trong cơ thể vi sinh vật cacbon chứa 50% khối lượng khô,
và nó được tổng hợp từ các hợp chất hữu cơ hoặc CO2, vì vậy vấn đề chuyển hóa
các nguồn thức ăn cacbon thành các thành phần hữu cơ của tế bào vi sinh vật chiếm
vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật.
Serratia marcescens có thể sử dụng được nhiều loại hydrocacbon như sucrose,
manitose, maltose, glucose…
Ảnh hưởng của nguồn nitơ:
Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác đều cần Nitơ trong quá trình
sống để xây dựng tế bào. Trong cơ thể vi sinh vật nitơ chiếm khoảng 14 % khối
lượng khô của tế bào. Nó góp phần vào việc tạo thành các axit amin, nucleotit của
axit nucleic và coenzyme, vì vậy nitơ có vai trò không thể thiếu được trong quá
trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.
Lựa chọn một nguồn nitơ thích hợp sẽ góp phần thúc đẩy quá trình phát triển
của S. marcescens.

30
2.6.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của Serratia
marcescens
Ảnh hưởng của pH:
Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn chịu tác động của ion H+
và OH-
trực
tiếp hoặc gián tiếp ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và phát triển của vi khuẩn. Nếu
pH không thích hợp, vi khuẩn có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt.
S. marcescens có thể phát triển trong khoảng pH rộng từ 5-9, nhưng ứng với
các môi trường thì S. marcescens sẽ phát triển tốt ở các ngưỡng pH nhất định.
Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, sản phẩm của quá trình lên men sinh ra
cũng làm giảm pH môi trường. Do đó, nó cũng gây ức chế tới sự phát triển của vi
khuẩn.
Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ môi trường với vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết, vì nhiệt độ
không chỉ đơn thuần ảnh hưởng đến cường độ phát triển của từng loại vi sinh vật
mà chính là khả năng sinh trưởng của chúng ở nhiệt độ đó. Mỗi loại vi sinh vật đều
có nhiệt độ phát triển tối thiểu, tối thích và tối đa mà chúng có thể chịu được khác
nhau.
Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzym của tế bào vi sinh vật.
Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzym, làm
đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn.
S. marcescens có thể phát triển ở ngưỡng nhiệt độ khá rộng từ 5 - 400
C.
Ảnh hưởng của Oxy:
S. marcescens là vi khuẩn kị khí tùy nghi nên nó có thể sống được cả trong môi
trường hiếu khí và kị khí. Nhưng nó phát triển tốt nhất trong môi trường hiếu khí.

31
Trong quá trình nuôi cấy với mục đích thu hồi sinh khối, vi khuẩn cần hô hấp
để sinh trưởng và phát triển. Vì thế trong nuôi cấy, ta cần kiểm tra khả năng sử dụng
oxy để từ đó cung cấp oxy cho phù hợp.
Ảnh hưởng của mật độ cấy giống:
Mật độ cấy giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn.
Nếu mật độ cấy giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu
suất thu hồi sinh khối thấp. Nếu mật độ cấy giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi
cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh
quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức
chế quá trình sinh trưởng. Vì vậy chọn mật độ cấy giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh
trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men.

32
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện
Địa điểm nghiên cứu:
Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học,
Khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm –Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ
Thành Phố Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện:
Đề tài được thực hiện từ ngày 07/04/2014 đến ngày 29/6/2014
3.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị sử dụng nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu ngiên cứu
Nguồn vi sinh vật thử nghiệm là chủng SH1 của phòng thí nghiệm Công Nghệ
Sinh Học, Khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm –Môi Trường, Trường Đại Học
Công Nghệ TP.HCM, được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử có số
đăng kí trên Genbank là KF534508.1.
3.2.2. Môi trường ( thành phần môi trường xem phu lục)
- Môi trường Nutrient agar
- Môi trường Nutrient broth
- Môi trường Peptone glycerol broth
- Môi trường thạch mềm NA
- Môi trường Gelatine
- Môi trường Casein
- Môi trường huyền phù chitin
- Môi trường thử nghiệm họa tính lipase
3.2.3. Hóa chất
- Hóa chất dùng để nhuộm Gram
- Crystal vilet
- Fuchsin
- Trichloroacetic acid (TCA)
- Đệm phosphate

33
- KI
- K2HPO4
- Iod
- KOH
- NaCl
- HCl
- NaOH
- Ethanol 70%
- Ethanol 96%
3.2.4. Dụng cụ
- Cốc thủy tinh
- Erlen
- Đũa thủy tinh
- Chai thủy tinh 100ml
- Ống nghiệm
- Ống đong
- Đĩa petri
- Pipette 5ml, 10ml.
- Pipetteman
- Đầu tuýp
- Cuvette
- Lame
3.2.5. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV-Vis
- Máy đo pH
- Kính hiển vi quang học
- Cân kĩ thuật
- Tủ lạnh
- Máy nước cất

34
- Bếp điện từ
- Máy lắc
- Máy li tâm
3.3. Phƣơng pháp luận
Mục đích: Xây dựng quy trình lên men thu sinh khối cực đại vi khuẩn Serratia
marcescens SH1.
Mục tiêu: Xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy chủng Serratia
marcescens SH1.
Phương pháp giải quyết vấn đề: Trong thành phần môi trường nuôi cấy vi
sinh thì nguồn cacbon và nito đóng vai trò quan trọng trong thu sinh khối, cần xác
định nguồn nito và cacbon thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn. Về điều kiện
lên men thì cần xác định các thông số: pH, điều kiện oxy (số vòng lắc/phút), mật độ
cấy giống, thời gian lên men nhằm thu sinh khối cực đại.
Nội dung nghiên cứu:
- Quan sát hình thái, định danh và khảo sát một số hoạt tính enzyme ngoại
bào của chủng SH1
- Khảo sát các nguồn cacbon và nito phù hợp với sự phát triển của Serratia
marcescens SH1
- Khảo sát các điều kiện lên men (pH, điều kiện oxy (số vòng lắc/phút),
mật độ cấy giống, thời gian thu sinh khối) thích hợp với sự phát triển của Serratia
marcescens SH1
3.4. Bố trí thí nghiệm

35
Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của
SH1
Trên sơ đồ hình 3.1 là bố trí thí nghiệm nhằm khẳng định lại chủng SH1 bằng
các thử nghiệm sinh hóa với bộ Kit API 20E, soi và kiểm tra hình thái tế bào thông
qua nhộm Gram. Kiểm tra lại hoạt tính của một số enzyme ngoại bào của S.
marcescens SH1 sau quá trình bảo quản.
Chủng vi khuẩn SH1
Quan sát hình thái, sinh lí
Thử nghiệm các hoạt tính enzyme
Soi khuẩn lạc
Thử nghiệm sinh hóa Sử dụng bộ Kit
API 20E
Protease
Nhuộm Gram
Lipase
Chitinase

36
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát, chọn các thành phần môi trường
tốt nhất cho sự phát triển của S. marcescen SH1
Trên sơ đồ hình 3.2 là bố trí thí nghiệm này nhằm xác định thành phần môi
trường (nguồn cacbon và nitơ) nuôi cấy tốt nhất cho sự phát triển sản xuất sinh khối
của chủng Serratia marcescens SH1.
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên sự phát triển của vi sinh vật
Khảo sát đường cong tăng trưởng của vi sinh vật trên môi trường NB
Chủng Serratia marcescens SH1
Chọn nguồn Nitơ thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật
Chọn thời gian nuôi cấy thích hợp để tiến hành các thí nghiệm sau
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Cacbon lên sự phát triển của vi sinh
vật
Chọn nguồn Cacbon thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật
Xác định các thành phần môi trường
tốt nhất cho sự phát triển của S.
marcescens SH1

37
Hình 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm, khảo sát các điều kiện nuôi cấy S.
marcescens SH1
Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên sự phát triển của vi
khuẩn
Chủng Serratia marcescens SH1
Chọn pH môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn
Khảo sát ảnh hưởng của Oxy lên sự phát triển của khuẩn
Khảo sát ảnh hưởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của vi
khuẩn
Chọn mật độ cấy giống thích hợp nhất cho sự phát triển của vi
khuẩn
Chọn điều kiện Oxy thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm bổ sung lên sự phát triển của vi
khuẩn
Chọn nồng độ đệm thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn
Chọn được các điều kiện nuôi cấy
thích hợp

38
Trên sơ đồ hình 3.3 là bố trí thí nghiệm này nhằm mục đích xác định các điều
kiện nuôi cấy (pH, nồng độ Oxy, mật độ cấy giống, bổ sung đệm) tốt nhất cho sự
phát triển sản xuất sinh khối của chủng Serratia marcescens SH1 .
3.5. Phƣơng pháp khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng
SH1
3.5.1. Phương pháp quan sát hình thái sinh lý
Soi khuẩn lạc:
Tiến hành cấy ria vi khuẩn trên môi trường Nutrient Agar (NA), ủ ở nhiệt độ
phòng trong 24 giờ.
Dùng dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc.
Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 4X.
Nhuộm Gram:
Nguyên tắc:
Dựa trên sự khác biệt về cấu tạo của lơp peptidoglycan ở thành tế bào vi
khuẩn mà người ta chia thành 2 loại là Gram (-) và Gram (+).
Các vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglycan dày hơn làm cho vi khuẩn giữ
chắc màu tím kết tinh (violet) và không bị tẩy màu bởi cồn. Sau khi nhuộm fuchsin,
vi khuẩn không bắt màu đỏ mà vẫn giữ nguyên màu tím, đó là vi khuẩn Gram (+).
Các vi khuẩn Gram (-) có lớp peptidoglycan mỏng hơn làm cho vi khuẩn
không giữ được màu tím và bị tẩy màu bởi cồn trở thành không màu. Khi nhuộm
fuchsin vi khuẩn bắt màu đỏ, đó là vi khuẩn Gram (-).
Cách tiến hành:
 Làm tiêu bản
- Chọn lame sạch và khô. Dùng que cấy vô trùng lấy một chút sinh khối vi
sinh vật làm vết bôi trên lame.
- Dùng kẹp gỗ hơ nhẹ mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết
bôi.

39
 Nhuộm tiêu bản
- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 1 phút, rửa nước,
thấm khô.
- Nhộm lại bằng dung dịch Indine trong 1 phút, rửa nước , thấm khô.
- Tẩy cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến
khi tan hết màu, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin 30 giây, rửa nước, thấm khô.
Quan sát vi sinh vật dưới vật kính 100X với một giọt dầu soi kính. Vi khuẩn
Gram âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn gram dương sẽ bắt màu tím.
Sử dụng chủng E. Coli để làm đối chứng Gram (-) và Bacillus subtilis để làm
đối chứng Gram (+).
3.5.2. Thử nghiệm sinh hóa và định danh chủng SH1 bằng bộ kit API 20E
Sử dụng bộ Kit API 20E của hãng BioMerieux để định danh chủng SH1, đây
là bộ Kit chuyên sử dụng để định danh các vi khuẩn gram âm đường ruột
Quá trình định danh được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất
(BioMerieux)
Cách tiến hành:
- Tăng sinh chủng vi khuẩn: Tăng sinh chủng vi khuẩn Serratia marcescens
SH1 trong môi trường NB tiến hành nuôi trong điều kiện lắc 150 vòng/phút ở nhiệt
độ phòng trong 24 giờ. Pha loãng sao cho OD620 khoảng 0,582.
- Cấy trang trên môi trường NA để lấy khuẩn lạc đặc trưng: Chủng vi khuẩn
đã tăng sinh sẽ được pha loãng để cấy trang. Sử dụng nước muối sinh lý (0,85%) đã
hấp khử trùng để pha loãng, tiến hành pha loãng sinh khối ở các nồng độ 10-1
, 10-2
…10-6
. Tiến hành cấy trang ở 3 nồng độ 10-4
, 10-5
, 10-6
. Sau đó đem ủ ở 370
C cho
đến khi có khuẩn lạc.
- Chuẩn bị các dung dịch cho việc định danh API
 Chuẩn bị dung dịch Mc Faland, nước muối sinh lý 0,85%, nước cất. Tất
cả đem hấp khử trùng 1210
C trong 15 phút.
 Dầu khoáng ( hay còn gọi dầu paraffin ) sấy ở nhiệt độ 1500
C trong 1h.

40
Tiến hành test định danh API 20E
- Cho một ít nước cất vô trùng vào khay nhựa của bộ Kit để giữ ẩm trong suốt
quá trình ủ trong tủ ấm
- Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý
(0,85%) vô trùng, lắc đều sao cho đạt độ đục so với Mc Faland 3M
- Dùng pipetman vô trùng hút dịch vi khuẩn vào các ô của bộ Kit. Các ô CIT,
GEL và VP thì cho đầy đủ, các ô còn lại cho vừa đủ, 5 ô AHD, ODC, H2S và URE
cho thêm parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí.
- Ủ bộ Kit ở 370
C từ 18-24 giờ. Sau đó đọc kết quả
Bảng 3.1. Các chỉ tiêu định danh bằng bộ Kit API 20E
Thử nghiệm Âm tính (-) Dương tính (+)
ONPG Không đổi màu Vàng
ADH Vàng Đỏ/ cam
LDC Vàng Đỏ/cam
ODC Vàng Đỏ/ cam
CIT Vàng Xanh/xanh lá
H2S Không màu Đen
URE Vàng Đỏ/cam
TDA Vàng Nâu sậm
IND Vàng Có vòng đỏ
VP Không màu Hồng đỏ
GEL Không màu (còn kết tủa
đen)
Đen
GLU Xanh/xanh lá Vàng
MAN Xanh/xanh lá Vàng
INO Xanh/xanh lá Vàng
SOR Xanh/xanh lá Vàng
RHA Xanh/xanh lá Vàng

41
SAC Xanh/xanh lá Vàng
MEL Xanh/xanh lá Vàng
AMY Xanh/xanh lá Vàng
ARA Xanh/xanh lá Vàng
Ghi chú:
- ONPG: orthor-nitophenyl galactosidase - GEL: gelatin
- ADH: arginine dihydrolase - GLU: glucose
- LDC: lysine decacboxylase - MAN: manitol
- ODC: ornithine decacboxylase - INO: inositol
- CIT: citrate - SOR: sorbotol
- H2S: sinh H2S - RHA: rhamnose
- URE: urea - SAC: sucrose
- TDA: tryptophane deaminase - MEL: metibiose
- IND: indol - AMY: amygdaline
- VP: phản ứng Voges-proskauer - ARA: arabinnose
Đọc kết quả: Sau 18 đến 24 giờ
Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử đọc kết
quả dựa vào bảng trên
- Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử
 TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện thì kết
quả phản ứng là dương tính (+), màu vàng thì kết quả âm tính (-).
 IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND, đợi sau 2 phút. Có vòng màu đỏ
xuất hiện là dương tính (+), màu vàng là âm tính(-).
 VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2, đợi
sau 10 phút. Nếu có màu hồng hoặc đỏ là dương tính (+). Nếu không đổi màu hoặc
màu hồng nhạt xuất hiện trong 10-12 phút là phản ứng âm tính (-).

42
Sau 18 giờ thì đọc kết quả của các thông số trừ (TDA, IND, VP). Sau 24 giờ
thì đọc lại kết quả của tất cả các phản ứng và hiện tượng của các chỉ tiêu và đọc
luôn cả TDA, IND, VP.
- Sau 24 giờ đọc lại kết quả thì tiến hành đọc GLU trước, nếu kết quả khác với
kết quả nhận được lúc 18 giờ thì tiến hành đọc tiếp, còn giống thì ta không đọc
những kết quả đã đọc lúc 18 giờ nữa, tiến hành đọc 3 chỉ tiêu còn lại.
3.5.3. Thử nghiệm các hoạt tính enzyme
Thử nghiệm hoạt tính lipase:
Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NB trong 24 giờ, ở
nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút.
Pha môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 1210
C trong 15 phút.
Để môi trường nguội đến khoảng 500
C đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy
sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri chứa môi trường thử
nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Xem khả năng phân
giải và đo đường kính vòng tủa trên bề mặt môi trường. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Thử nghiệm hoạt tính protease:
Pha môi trường geltatine agar và môi trường casein agar, hấp 1210
C trong 15
phút. Để môi trường nguội đến khoảng 500
C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch
trên mỗi đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Cho 20 μl
dịch trong của canh trường tăng sinh vi khuẩn (dịch trong sau khi ly tâm) vào hai
giếng thạch, giếng còn lại cho 20 μl môi trường Nutrient broth để làm đối chứng. Ủ
tất cả các đĩa thạch ở nhiệt phòng trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Kiểm tra và đo kích thước vòng phân giải
(D-d, mm), với D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ đục. Thí nghiệm
lặp lại 3 lần.
Thử nghiệm hoạt tính chitinase:

43
Pha môi trường thạch huyền phù chitin, hấp 1210
C trong 15 phút. Để môi
trường nguội đến khoảng 500
C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa
agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Cho 20 μl dịch trong
của canh trường tăng sinh vi khuẩn (dịch trong thu được sau khi ly tâm) vào hai
giếng thạch, giếng còn lại cho 20 μl môi trường NB để làm đối chứng. Ủ tất cả
các đĩa thạch ở nhiệt phòng trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, tráng thuốc thử lugol. Đo kích thước vòng phân giải (D-d,
mm), với D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ đục. Thí nghiệm lặp
lại 3 lần.
3.6. Phƣơng pháp khảo sát môi trƣờng nuôi cấy Serratia marcescens SH1
3.6.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng trên môi trường cơ bản Nutrient broth
- Tăng sinh chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH1 trong môi trường NB 24
giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620=0.8
- Sử dụng môi trường NB để khảo sát đường cong tăng trưởng. Mỗi bình 20
ml môi trường,tỉ lệ cấy giống 1% (0,2 ml giống trong 20 ml môi trường). Nuôi lắc
150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
- Tiến hành khảo sát trong 24 giờ, cứ 2 giờ lây mẫu 1 lần. Đo OD ở bước
sóng 620 nm và dựng đường cong tăng trưởng. Mỗi nghiệm thực lặp lại 3 lần,
Chọn thời gian nuôi cấy tốt nhất để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.6.2. Xác định nguồn Nitơ tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescen
SH1
Dựa vào môi trường ban đầu là Nutrient broth (NB), Peptone được xem là
nguồn nito chủ yếu trong môi trường NB. Tiến hành định lượng nito tổng của các
nguồn nitơ sử dụng và nitơ đối chứng của môi trường NB bằng phương pháp
kjeldahl. Dựa trên môi trường NB, peptone sẽ được lần lượt thay thế bằng các
nguồn nitơ khác nhau.

44
Bảng 3.2. Hàm lượng % nito tổng của các nguồn nito (định lượng bằng
phương pháp Kjeldahl)
Nguồn Nito Hàm lượng % nito tổng số
Peptone 11.36
Tryptone 15.34
Cao nấm men 10.65
Aminoacetic acid 15.9
Casein enzyme
hydrolysale 13.06
Dựa vào kết quả kjeldahl của bảng 3.2, tính toán các thành phần môi trường
như sau:
Bảng 3.3. Thành phần môi trường và các nguồn nitơ khảo sát
Môi trường Thành phần Khối lượng (g/l)
Nutrient broth (NB)
(Đối chứng)
Peptone 5,00
Meat 3,00
Meat + Tryptone (MT) Meat 3,00
Tryptone 3,70
Meat + Yeast (MY) Meat 3,00
Yeast extract 5,33
Meat + Casein enzyme
hydrolysale (MC)
Meat 3,00
Casein enzyme hydrolysale 4,35
Cách tiến hành:
- Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở
nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620 ≈ 0,8.
- Sử dụng các môi trường MT, MY, MC, NB tương ứng với các nguồn Nitơ
Tryptone, Yeast extract, Casein enzyme hydrolysale và Peptone để tăng sinh, môi
trường nuôi cấy sẽ được chuẩn độ đến pH 7,5 trước khi cấy giống. Tất cả sẽ được

45
nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ, lắc 150 vòng/phút, tỉ lệ cấy giống 1% (cấy
0,2 ml giống vào 20 ml môi trường, sử dụng giống đã pha loãng có OD620 ≈ 0,8).
- Sau 15 giờ tiến hành đo OD các dịch nuôi cấy ở bước sóng 620 nm để xác
định mật độ tế bào. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chọn môi trường (nguồn nitơ)
cho mật độ tế bào cao nhất sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.6.3. Xác định nguồn Cacbon tốt nhất sự phát triển của Serratia marcescens
SH1
- Dựa trên môi trường Peptone glycerol để tính toán lượng cacbon trong các
môi trường khác sao cho khối lượng cacbon trong các môi trường là như nhau. Các
nguồn cacbon được sử dụng để khảo sát là glycerol, sucrose, maltose, manitol,
glucose.
- Môi trường chính là Meat extract +Yeast extract (môi trường đã được chọn ở
thí nghiệm trước) và lần lượt bổ sung các nguồn cacbon khác nhau.
Sau khi tính toán ta sẽ có thành phần các môi trường như sau:
Bảng 3.4. Thành phần môi trường và các nguồn cacbon khảo sát
Tên môi trường Thành phần môi
trường
Khối lượng
(g//l)
MG1
Meat extract 3,00
Yeast extract 5,33
Glycerol 10ml
MS
Meat extract 3,00
Yeast extract 5,33
Sucrose 11.72
MG2
Meat extract 3,00
Yeast extract 5,33
Glucose 12.34
MM1
Meat extract 3,00
Yeast extract 5,33
Maltose 11.72

Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens sh1

Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens sh1

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens sh1

Similar to Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens sh1 (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens sh1