Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis).pdf

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Bùi Thị Liên
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH: SINH HỌC
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC
TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ
(Taxus chinensis)
Hà Nội – 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Bùi Thị Liên
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC
TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ
(Taxus chinensis)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 842 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH: SINH HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Phí Quyết Tiến
Hà Nội – 2021

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây
độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)” là do
tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Phí Quyết Tiến. Số
liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn chính xác, trung thực.
Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều được trích dẫn rõ ràng
tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Học viên
Bùi Thị Liên

ii
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành
và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Phí Quyết Tiến – Phó Viện Trưởng Viện Công
nghệ sinh học; Giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật,
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam,
là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, lên ý tưởng, định hướng nghiên
cứu, tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong
suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Vũ Thị Hạnh
Nguyên, TS. Quách Ngọc Tùng và các cán bộ Trung tâm Giống và Bảo tồn
nguồn gen vi sinh vật đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em thực hiện các thí
nghiệm trong phạm vi luận án và đồng thời truyền đạt nhiều kinh nghiệm
thực tiễn quý giá trong hoạt động nghiên cứu khoa học ở lĩnh vực vi sinh vật
học.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, các thầy, cô giáo thuộc Khoa
Công nghệ sinh học và Phòng Đào tạo, Quản lý Khoa học và Hợp tác quốc tế
của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện, hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều
kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện.
Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, là
hậu phương vững chắc giúp em có động lực học tập.
Luận văn được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: “Nghiên
cứu khai thác nấm nội sinh trên cây dược liệu bản địa nhằm thu nhận một số
hợp chất (paclitaxel hoặc một số hợp chất khác) có hoạt tính sinh học" cấp
bởi Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số TĐCNSH.05/20-
22.

iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tên đầy đủ
A-549 Ung thư phổi ở người (human lung carcinoma)
bapt baccatin III:3-amino-3 phenylpropanoyltransferase
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp Base pair
CMV Virus cytomegalo
dbat taxane 10b-hydroxylase
DMSO Dimethyl sulfoxide
DNA Deoxyribonucleic Acid
FDA Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ
HGT Horizontal gene transfer – Chuyển gen ngang
IC50 Nồng độ ức chế 50%
ITS Internal transcribed spacer
kDa kiloDalton
MCF7 Ung thư vú ở người (human breast carcinoma)
MIC Minimun inhibitory concentrations – Nồng độ ức chế tối thiểu
NCBI National Center for Biotechnology Information
OD Optical Density – Mật độ quang
PCR Polymerase chain reaction
SRB Sulforhodamine B
TCA Trichloracetic acid
TLTK Tài liệu tham khảo
ts taxadiene synthase
VSV Vi sinh vật

iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi nấm
nội sinh trên thực vật.........................................................................................7
Bảng 2.1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu........................20
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch
đại các gen dbat, bapt và ts.............................................................................24
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch
đại các gen dbat, bapt và ts.............................................................................24
Bảng 3.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư của 5 chủng vi nấm nội
sinh trên cây thông đỏ Bắc..............................................................................30
Bảng 3.2. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF6 với
các chủng tham chiếu......................................................................................41
Bảng 3.3. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF25 với
Bảng 3.4. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF6 với
Bảng 3.5. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF7 với

v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Mối quan hệ giữa vi vật nội sinh và cây chủ ....................................4
Hình 1.2. Một số các chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh...........................8
Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất kháng virus từ vi nấm nội sinh ..............10
Hình 1.4. Cây thông đỏ bắc (Taxus chinensis)...............................................12
Hình 1.5. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel...............................................16
Hình 3.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A) và MRSE
ATCC 35984 (B) của một số chủng vi nấm nội sinh .....................................27
Hình 3.2. Tỉ lệ ức chế của các chủng vi nấm nội sinh trên từng cùng
VSV kiểm định................................................................................................28
Hình 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi nấm
nội sinh trên cây thông đỏ. Ghi chú: 1. E. coli ATCC 11105; 2. C.
albicans ATCC 10231; 3. B. cereus ATCC 11778; 4. MRSE ATCC
35984; 5. P. aeruginosa ATCC 9027; 6. MRSA ATCC 33591; 7. E.
faecalis ATCC 29212. ....................................................................................29
Hình 3.4. Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng vi nấm nội
sinh tuyển chọn ...............................................................................................32
Hình 3.5. Điên di DNA tổng số của các chủng vi nấm tuyển chọn trên
gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 1 kb (Thermo scientific,
Mỹ)..................................................................................................................34
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen tham gia sinh
tổng hợp paclitaxel của 4 chủng tuyển chọn trên gel agarose 1,0%.
Giếng M: thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là
đối chứng âm...................................................................................................35
Hình 3.7. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử
dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TQF6
(a, b, c) và TQF25 (d, e, f) ..............................................................................38
Hình 3.8. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử
dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TDF6
(a, b, c) và TDF7 (d, e, f) ................................................................................38

vi
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS trên gel
agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ);
ĐC: là đối chứng âm.......................................................................................39
Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại của các chủng TQF6, TQF25,
TDF6 và TDF7 với giá trị Boostrap 1000, sử dụng thuật toán Kimuar 2
với nhóm ngoài là Murco bainieri (NR 103628)............................................45

vii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................i
LỜI CẢM ƠN..................................................................................................ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.....................................................................iii
DANH MỤC BẢNG.......................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH.........................................................................................v
MỞ ĐẦU..........................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................3
1.1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU..............................3
1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh ......................................................3
1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội
sinh 5
1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm...................................5
1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư............................................8
1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus..............................................................9
1.2.1. Cây thông đỏ (Taxus spp.).........................................................11
1.2.3. Các chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ vi nấm nội
sinh trên cây thông đỏ ............................................................................15
1.2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong sàng lọc vi nấm nội sinh sinh
paclitaxel và dẫn xuất của paclitaxel ....................................................16
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI
SINH............................................................................................................17
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............19
2.1. ĐỐI TƯỢNG.......................................................................................19
2.1.1. Chủng giống ..................................................................................19
2.1.2. Hóa chất, thiết bị...........................................................................19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................20
2.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định .......................20
2.2.2. Tách chiết các hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh.........21

viii
2.2.3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư ................................21
2.2.4. Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng
tuyển chọn ...............................................................................................23
2.2.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thông qua sàng các
gen chỉ thị ................................................................................................23
2.2.6. Xác định đặc điểm hình thái và bào tử của các chủng vi nấm
nội sinh tuyển chọn.................................................................................24
2.2.7. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn bằng giải
và phân tích trình tự vùng ITS..............................................................25
2.2.8. Xử lý thống kê số liệu ...................................................................26
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................27
3.1. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI
NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ............................................27
3.2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH .........................................................29
3.3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH
CHIẾT THÔ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ...........................................31
3.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG
SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM.............................33
3.5. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI
NẤM NỘI SINH TQF6, TQF25, TDF6, TDF7.......................................37
3.5.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và cuống
sinh bào tử của các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn .............37
3.5.2. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn bằng giải và
phân tích trình tự ITS ............................................................................39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................47
KẾT LUẬN..................................................................................................47
KIẾN NGHỊ.................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................48
PHỤ LỤC.......................................................................................................56

1
MỞ ĐẦU
Trong những thập kỷ qua, cây dược liệu luôn đóng vai trò quan trọng
trong bảo vệ và nâng cao sức khoẻ con người. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh vai trò của các hợp chất tách chiết từ cây dược liệu trong phòng và điều
trị bệnh truyền nhiễm do vi sinh vật, kích thích hệ thống miễn dịch và ngăn
ngừa ung thư. Tuy nhiên, vấn đề kháng thuốc kháng sinh và nạn chặt phá
rừng bừa bãi đang là vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ con người
và đa dạng sinh học của quốc gia. Do đó, việc tìm kiếm các hoạt chất mới mà
không cần khai thác cây dược liệu đang là hướng đi mới được các nhà khoa
học đặc biệt quan tâm.
Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật cư trú bên trong các mô tế bào
thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ. Trong các
nhóm vi sinh vật nội sinh, nấm nội sinh được chú ý hơn cả và đang được ứng
dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y-dược học. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh tiềm năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học của vi nấm nội
sinh như: kháng khuẩn, kháng virus, ức chế tế bào ung thư, trị tiểu đường,
chống viêm,.... Nhờ khả năng chuyển gen ngang, nấm nội sinh có thể sinh
tổng hợp các hoạt chất như cây chủ. Nhiều chất kháng sinh và kháng tế bào
ung thư mới đã được phát hiện gần đây từ nấm nội sinh bao gồm pestacin,
paclitaxel, camptothecin, ergoflavin, podophyllotoxin, benzopyran,
isopestacin, phloroglucinol, tetrahydroxy-1-methylxanthone, salidroside,
borneol, dibenzofurane, methyl peniphenone, lipopeptide, peniphenone,…
Gần đây, nấm nội sinh được đánh giá là nguồn nguyên liệu quan trọng của
ngành công nghiệp dược phẩm. Hiện nay, chỉ có khoảng 0,75–1,5% các loài
thực vật được nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh. Vì vậy, tiềm năng khai thác
nấm nội sinh nhằm tìm kiếm các hoạt chất mới là rất triển vọng
Cây thông đỏ (Taxus chinensis), thuộc họ Thủy tùng (Taxaceae), là cây
dược liệu quý được liệt vào sách đỏ của Việt Nam và thế giới. Trong y học
dân gian, cây thông đỏ được sử dụng trong điều trị bệnh truyền nhiễm và
hiểm nghèo. Đặc biệt, lá và vỏ cây là nguồn nguyên liệu để tách chiết
paclitaxel (paclitaxel), loại thuốc điều trị ung thư buồng trứng, vú và phổi
được thông qua bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ (FDA) vào
năm 1992. Tuy nhiên, sản xuất chất này vẫn là một thách thức trong ngành
dược phẩm vì 1 kg vỏ cây chỉ sản xuất được 10 g paclitaxel. Xuất phát từ thực

2
tiễn, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng vi nấm nội sinh trên cây
thông đỏ là nguồn nguyên liệu thay thế để sản xuất paclitaxel và chất kháng
sinh mới. Đã có khoảng 60 chủng vi nấm nội sinh được công bố là có khả
năng sinh paclitaxel cao. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiều báo cáo đề
cập đến nấm nội sinh trên cây dược liệu nói chung và cây thông đỏ nói riêng
tại Việt Nam, cũng như mối tương quan giữa các nấm này với các sản phẩm
chuyển hóa của cây dược liệu. Với tiềm năng và thách thức trên, đề tài
“Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh
trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)” được thực hiện nhằm tìm kiếm chủng
vi nấm nội sinh có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất kháng sinh và kháng
tế bào ung thư mới nhằm tạo nguyên liệu mới với giá thành thấp cho ngành
dược, ứng dụng trong điều trị lâm sàng và đồng thời bảo tồn loài thông đỏ
Taxus chinensis quý hiếm.
Mục tiêu của đề tài :
Tuyển chọn và đánh giá được tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh
và gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (T.
chinensis).
Nội dung nghiên cứu:
- Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng ức chế vi sinh vật gây
bệnh cao.
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm tuyển
chọn.
- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa từ cao chiết tổng của các chủng vi
nấm tuyển chọn
- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp paclitaxel của các chủng nấm bằng chỉ
thị phân tử.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi nấm nội sinh
tuyển chọn.

3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU
1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh
Vi nấm nội sinh là nhóm vi sinh vật sinh trưởng và phát triển trong các
mô tế bào thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ.
Vi nấm nội sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học để bảo vệ và giúp cây
chủ chống lại tác nhân gây bệnh đồng thời thúc đẩy sự phát triển của thực vật
[1]. Trong 10 năm qua, các nhà khoa học đã công bố khoảng 770 loại vi nấm
nội sinh trên thực vật. Trong đó, các chi nấm phổ biến có thể được kể đến như
Altenaria, Aspergillus, Colletrotrichum, Guignardia, Nigrospora,
Penicillium, Phomopsis, Rhizoctonia và Xylaria [2].
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về cơ chế nội sinh của
vi nấm trên thực vật. Giả thuyết về sự xâm chiếm không triệu chứng khẳng
định cơ chế nội sinh là sự cân bằng đối kháng giữa vật chủ và nội sinh vật
(Hình 1.1) [3]. Vi sinh vật nội sinh và gây bệnh đều mang các gen độc tính,
giúp vi sinh vật xâm nhiễm cây chủ. Nếu độc tính lây nhiễm của vi nấm và
khả năng bảo vệ của cây chủ cân bằng, thì quá trình nội sinh sẽ diễn ra theo
và không gây tác động xấu tới cây chủ. Ở trạng thái cân bằng này, các yếu tố
môi trường đóng vai trò chính. Nếu quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra quá
mạnh mẽ ở cây chủ thì nấm sẽ bị tiêu diệt bởi các chất và protein bảo vệ.
Ngược lại, hiện tượng cây nhiễm bệnh nấm xảy ra khi cơ chế miễn dịch bảo
vệ của cây không đủ để cân bằng hay tiêu diệt độc tính từ vi nấm (Hình 1.1).
Hiện tượng này thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chủ quan và khách
quan như bản thân cây chủ và môi trường [4].
Tương tác giữa vi nấm và cây chủ có thể không chỉ là trạng thái cân
bằng giữa các yếu tố độc tính lây nhiễm và khả năng phòng vệ, mà là tương
tác cộng sinh. Vi nấm nội sinh có thể bảo vệ các cây chủ khỏi các tác nhân
gây bệnh bằng việc sản sinh các bằng cách bài tiết các chất đặc thù theo
thuyết “hiệu ứng khảm”. Theo một giả thuyết khác, vi nấm có thể hỗ trợ và
tăng cường khả năng miễn dịch của cây chủ [4]. Howitz và Sinclair đề xuất
giả thuyết “xenohormesis” cho rằng ở trạng thái phòng vệ, cây chủ sản sinh
các chất có khối lượng phân tử thấp truyền tín hiệu tới cộng đồng vi sinh vật
dị dưỡng nội sinh. Nhờ đó, các vi sinh vật nội dinh có thể cảm nhận sự thay

4
đổi trong quá trình trao đổi chất của cây chủ và sản xuất các chất chuyển hóa
thứ cấp hữu ích cho cây chủ. Dưới áp lực tiến hoá chọn lọc, nhiều vi sinh vật
đã mất các gen mã hoá protein tham gia sinh tổng hợp các chất này. Một số
cụm gen không bị ảnh hưởng bởi quá trình thích nghi và tiến hoá vì cần thiết
cho tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật nội sinh hoặc giữa các vi sinh vật
nội sinh với nhau. Ở giả thiết khác, các chất truyền tín hiệu từ thực vật cũng
có thể là sản phẩm trao đổi chất của các vi sinh vật nội sinh được kích thích
sinh tổng hợp bằng nhiều cơ chế điều hoà khác nhau của cây chủ [5].
Hình 1.1. Mối quan hệ giữa vi vật nội sinh và cây chủ [4]
Ước tính đã có khoảng 7% trong số 1,5 triệu loài nấm đã được công bố.
Việc ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới trong nghiên cứu về vi
sinh vật góp phần củng cố lập luận mới cho rằng: hiện có khoảng 3,5 - 5,1
triệu loài nấm tồn tại trên trái đất [6]. Nhận định này trái ngược với báo cáo
trước đó vào năm 2017 của Hawksworth và Lücking cho rằng có khoảng 2,2
đến 3,1 triệu loài nấm [7]. Trong đó, vi nấm nội sinh trên cây dược liệu chiếu
1 phần khá khiêm tốn. Chính vì vậy, vi nấm nội sinh có nhiều tiềm năng khai
thác và không chỉ đa dạng loài mà còn đa dạng về khả năng sinh tổng hợp các
chất có hoạt tính sinh học.

5
1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh
Vi nấm nội sinh khá đa dạng ở thực vật, đại diện cho nguồn tài nguyên
sinh học dồi dào về hợp chất tự nhiên có tiềm năng khai thác trong lĩnh vực
dược phẩm và nông nghiệp [8]. Tuy nhiên, vi nấm nội sinh vẫn chưa được
khai thác nhiều [9]. Nhiều hợp chất được sản xuất bởi các loại vi nấm này có
hoạt tính sinh học cao, thuộc các nhóm như alcaloid, flavonoid, steroid,
terpenoid, peptide, polyketone, quinol và phenol. Cho đến năm 2003, khoảng
4.000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đã được thu nhận từ vi
nấm [10]. Rất nhiều thông tin về đa dạng di truyền, cơ chế tương tác và các
chất có hoạt tính sinh học khác nhau từ vi nấm nội sinh đã được nghiên cứu
trong ba thập kỷ qua.
1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm
Các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh được sinh tổng hợp từ
vi nấm nội sinh, hoặc là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa
nấm và thực vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và bảo vệ cây chủ
khỏi những tác nhân gây bệnh. Đối với con người, các hợp chất kháng vi sinh
vật không chỉ có thể được sử dụng làm trong lĩnh vực y-dược mà còn được sử
dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và thực phẩm.
Trong những năm gần đây, số lượng các chất có hoạt tính kháng vi sinh
vật đã từ vi nấm nội sinh ngày càng nhiều (Bảng 1.1). Chủng vi nấm nội sinh
Penicillium cataractum phân lập từ cây bạch quả (Ginkgo biloba) sản xuất
penicimenolidyu AB, pasfonin có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây
bệnh như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumonia, Escherichia coli với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
trong khoảng 23–361 μM [6]. Nhiều chất kháng khuẩn từ chủng vi nấm nội
sinh Armillaria mellea từ cây thiên ma (Gastrodia elata) đã được phân lập,
thuộc một số lớp cấu trúc như alkaloid, peptit, steroid, terpenoit, phenol,
quinin và flavonoid cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gram
(+), nấm men và nấm sợi. Ba hoạt chất mới gồm phomoenamide,
phomonitroester và peacetylphomoxanthone B tách chiết từ dịch lên men nấm
nội sinh Phomopsis sp. PSU-D15 có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh
mạnh [11]. Đặc biệt, phomoenamide đã thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis H37Ra.

6
Hợp chất fusaripeptide A được phát hiện từ chủng Fusarium sp. phân
lập từ rễ cây ngựa bạc hà (Mentha longifolia) có khả năng sinh kháng nấm
men gây bệnh ngoài da (Candida albicans, Candida glabrata, Candida
krusei) và nấm sợi (Aspergillus fumigates) [12]. Nấm nội sinh Phomopsis sp.
YM 311483 từ cây Neem Ấn Độ (Azadirachta indica) sinh tổng hợp bốn loại
lactone mới, có hoạt tính kháng nấm Aspergillus niger, Botrytis cinere và
Fusarium sp. [9]. Chủng Fusarium nội sinh trên cây dương xỉ (Selaginella
pollescens) được thu thập trong khu bảo tồn Guanacaste của Costa Rica được
chứng minh có khả năng ức chế mạnh C. albicans [13]. Jesterone là hợp chất
kháng nấm mới ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp được phân lập từ nấm
Pestalotiopsis jester nội sinh trên cây gỗ trai (Fagraea bordenii Wernham)
[14].
Chi Epichloë nội sinh trong các loài cỏ khác nhau có khả năng sản sinh
nhiều alkaloid gây độc cho một số loài côn trùng gây hại và thậm chí cả động
vật có xương sống [15]. Acid nodulisporic được sản xuất bởi nấm nội sinh
Nodulisporium sp. cũng được báo cáo tác dụng kiểm soát côn trùng ăn cỏ vì
với cơ chế kích hoạt glutamate trong các kênh clo của cơ và tế bào thần kinh
côn trùng dẫn đến dòng chảy của các ion clo qua các kênh, dẫn đến tê liệt cơ
thể [16].
Epicoccum nigrum cũng được biết đến với khả năng chống lại vi khuẩn
và nấm gây bệnh trên thực vật [15]. E. nigrum đã cho thấy hoạt tính ức chế
Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi (Psv) trên nốt sần cây ô liu lên đến
96% [17]. Các E. nigrum phân lập từ mía đã cho thấy khả năng chống lại nấm
bệnh Sclerotinia sclerotiorum trên cây hướng dương và chống lại nấm
Pythium sp. trên cây bông; kháng lại Phytoplasma và Monilinia sp. trên quả
đào và quả xuân đào.

7
Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi nấm nội sinh trên thực vật
Chủng vi nấm
nội sinh
Cây chủ Chất kháng sinh
Hoạt tính kháng VSV
gây bệnh
TLTK
Fusarium solani
Thông đỏ
(Taxus baccata)
1-tetradecene, 8-octadecanone,
8-pentadecanone,
Octylcyclohexane, 10-
nonadecanone
S. aureus
S. epidermidis
B. subtilis
Klebsiella pneumonia
E. coli
Shigella flexneri
[18]
Phomopsis
liquidambaris
Dây càng cua
(Cryptolepis buchanani)
Oblongolide Y
E. coli
B. subtilis
P. aeruginosa
[19]
Chaetomium sp.
Cây dưa muối
(Senecio stapeliiformis)
p-hydroxybenzaldehyde, Uracil,
5 effectively
E. coli
S. aureus
[20]
Penicillium
cataractum
Cây bạch quả
(Ginkgo biloba)
Penicimenolidyu A ,
Penicimenolidyu B, Rasfonin
S. aureus
B. subtilis
P. aeruginosa
K. pneumonia
E. coli
[6]
Fusarium sp.
Ngựa bạc hà
(Mentha longifolia)
Fusaripeptide A
C. albicans
C. glabrata
C. krusei
A. fumigates
[12]
Penicillium sp.
Trúc đào thơm
(Nerium indicum)
3-O-methylviridicatin,
Viridicatol
F. graminearum [21]
Rhizopycnis
vagum
Thuốc lá
(Nicotiana tabacum)
Rhizopycnin D, TMC-264 Magnaporthe oryzae [22]
Pestalotiopsis sp.
Thạch hộc tía
(Dendrobium officinale)
LL-P880γ, LL-P880α, Ergosta-
5,7,22-trien-3β-ol
A. fumigatus [23]

8
1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư
Các sản phẩm trao đổi chất bậc hai thu được từ vi nấm nội sinh đã được
chứng minh là nguồn cung cấp các chất gây độc tế bào ung thư mới. Năm
2000, Demain và Vaishnav, ước tính rằng khoảng 57% các hợp chất trong thử
nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư là các sản phẩm tự nhiên và các dẫn xuất
từ vi nấm [16]. Theo các nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng
loạt các chất chuyển hóa thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao
gồm: alkaloid, benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon,
steroid, terpenoid, tetralon. Các báo cáo cho thấy rằng các hợp chất hoạt tính
sinh học tự nhiên được phân lập từ vi nấm nội sinh có thể đóng vai trò là
nguồn thay thế cho việc khám phá ra các loại thuốc chống ung thư mới [24].
Hình 1.2. Một số các chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh [24, 25]
Chất ergoflavin (Hình 1.2) được minh chứng là hoạt chất ức chế tế bào
ung thư mới, được phân lập từ nấm nội sinh Claviceps purpurea phát triển
trên lá của cây thuốc sến xanh (một loài thuộc họ hồng xiêm). Chủng nấm nội
Chaetominine
P Phaeosphoramide
A (R=αC6H11) và B (R=βC6H11)
Ergoflavin Camptothecin

9
sinh Penicillium brasilianum được tìm thấy ở vỏ rễ cây xoan, thúc đẩy sự sinh
tổng hợp các amit phenylpropanoid (nhóm chất phenylpropanoid) hiệu quả
trong điều trị ung thư. Chủng nấm Entrophospora infrequens SW116 được
phân lập từ cây họ thụ đào (Nothapodytes foetida) - một cây thuốc có nguồn
gốc từ Ghats, Ấn Độ, được phát hiện với khả năng sinh camptothecin (Hình
1.2) [25]. Camptothecin là một chất ức chế topoisomerase được biết đến với
khả năng điều trị một loạt các ung thư: ung thư dạ dày, ung thư trực tràng,
ung thư ruột kết, ung thư bàng quang,…
Hoạt tính gây độc tế bào liên quan đến bệnh bạch cầu ở người K562 và
dòng tế bào SW1116 ung thư ruột kết được ghi nhận bởi một alkaloid
chaetominine (Hình 2) thu được từ chủng vi nấm nội sinh Chaetomium sp.
IFB-E015, phân lập trên cây sa sâm (Adenophora axiliflora) [26]. Nấm nội
sinh Phaeosphaeri avenari sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học gồm:
phaeosphoramides A và B, hiệu quả trong ức chế chất dẫn truyền tín hiệu và
chất kích hoạt phiên mã (STAT) -3 của tế ung thư [27]. Chủng vi nấm nội
sinh mới Trametes hirsuta đã được phát hiện với khả năng sản xuất
podophyllotoxin và các lignans aryl tetralin liên quan khác có đặc tính chống
ung thư mạnh [25].
Do như cầu sử dụng paclitaxel trong điều trị ung thư cao nên từ năm
1995, các nghiên cứu ngoài nước đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội
sinh từ các cây thông đỏ quý hiếm ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Những
chủng nấm phổ biến được phân lập từ cây thuộc các chi: Taxomyces sp.,
Pestolotiopsis sp., Penicillium sp. và Truncatella sp.. Các loại nấm này có khả
năng sinh paclitaxel hoặc các dẫn xuất từ paclitaxel thấp nhưng việc áp dụng
công nghệ giải trình tự gen và chỉnh sửa hứa hẹn triển vọng khai thác
paclitaxel từ vi nấm ở quy mô công nghiệp trong tương lai. Các nghiên cứu về
các chất có hoạt tính sinh học khác từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ vẫn
còn bỏ ngỏ.
1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus
Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh còn là ứng cử viên
tiềm năng trong nghiên cứu và tạo các thuốc kháng virus. Việc khảo sát sàng
lọc các chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp các chất kháng virus cũng là
hướng đi có nhiều hứa hẹn, mặc dù có rất ít nghiên cứu được ghi nhận. Hai

10
hợp chất mới, acid cytonic A và B được phân lập từ Cytonaema spp. có khả
năng ức chế virus cytomegalovirus (CMV) ở người [28]. Hợp chất kháng
virus hinnuliquinone được sinh tổng hợp bởi vi nấm Nodulisporium
hinnuleum cư trú ở lá cây sồi (Quercus coccifera) thể hiện hoạt tính ức chế
HIV-1 [29]. Các hoạt chất pullularins AD (cyclo hexadepsi-peptides) được
sản xuất bởi Pullularia spp. BCC 8613 được phát hiện có hoạt tính kháng
virus herpes simplex (HSV) [29]. Nấm nội sinh Alternaria tenuissima
QUE1Se sản sinh ra altertoxins, một hợp chất hiệu quả chống lại virus HIV-1.
Một số hợp chất được sản xuất từ Emericella spp. (HK-ZJ), bao gồm
emerimidine, dehydroaustin, austinol, bao gồm aspernidine, austin,
emeriphenolicins và acetoxy dehydroaustin đã được báo cáo là có hoạt tính
kháng virus cúm A (H1N1) [30].
Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất kháng virus từ vi nấm nội sinh [29]
1.1.2.4. Các chất có hoạt tính sinh học khác
Chất chống oxi hóa (antioxidant) là những chất có thể ngăn ngừa hoặc
làm giảm tổn thương cho các tế bào gây ra bởi sự mất cân bằng phản ứng oxy
hóa khử (reactive oxygen species). Nếu tế bào không thể trung hòa và loại bỏ
pullularins AD
cytonic A

11
các gốc tự do, các phân tử không ổn định, DNA và protein chức năng sẽ bị
phá hủy, dẫn tới viêm, ung thư và bão cytokine. Trong y học hiện đại, chất
chống oxy hóa đang trở thành một liệu pháp sinh học tự nhiên đầy hứa hẹn.
Một số chất chống oxy hóa tự nhiên mới như pestacin, corynesidones AB,
2,14-dihydroxy-7-drimen-12,11-olide, lapachol, coumarin, 5-
(hydroxymethyl) -2-furanocarboxylic acid, isopestacin, phloroglucinol,
tetrahydroxy-1-methylxanthone, salidroside, p -tyrosol, borneol và rutin được
tách chiết từ vi nấm nội sinh [31, 32].
Các vi nấm nội sinh còn được biết đến là một nguồn cung cấp các chất
chống bệnh tiểu đường [33]. Các xét nghiệm in vivo và in vitro về hợp chất
lectin (N-acetylgalactosamine, 64 kDa) được sinh ra bởi nấm nội
sinh Alternaria spp. từ cây ghi (Viscum) cho thấy hoạt chất này làm giảm biểu
hiện bệnh ở chuột bị bệnh [34]. Chất chuyển hóa phipeptidal
demethylasterriquinone B-1 (L-783,281) có hoạt tính giống insulin được tạo
ra bởi chủng Pseudomassaria spp. phân lập từ rừng nhiệt đới châu Phi cũng
đã được báo cáo [35].
Ngoài ra, các vi nấm nội sinh cũng có tiềm năng khai thác thuốc trị sốt
rét mới trong ngành dược phẩm. Sinh tổng hợp chất phomoxanthones AC,
một sesquiterpene thơm, do nấm Phomopsis archeri từ cây Vani (Vanilla
albindia) gần đây đang thu hút sự chú ý của các nhà khoa học [36].
Cercosporin chiết xuất bởi nấm Mycosphaerella sp. từ một cây họ Thiến thảo
(Psychotoria verticalis) đã chứng minh hiệu quả trong việc ức chế ký sinh
trùng Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum và Leishmania donovani
[37].
1.2. CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI NẤM NỘI
SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ (Taxus spp.)
1.2.1. Cây thông đỏ (Taxus spp.)
Cây thông đỏ (Taxus spp.) thuộc họ thanh tùng (Taxaceae) là loài cây
gỗ quý hiếm thuộc nhóm gỗ 1A. Cây thông đỏ phân bố hẹp ở các nước châu
Á như: Trung Quốc, Myanma, Nêpan, Ấn Độ, Philipines, Indonesia và
Việt Nam. Thông đỏ phân bố chủ yếu ở những vùng cận nhiệt đới với độ cao
khoảng 1000-2000 m. Cây thông đỏ là loại cây chậm phát triển nhưng có thể
phát triển tới độ cao trưởng thành khoảng 20 m, với thân cây có đường kính

12
lên đến 1,5 m. Cây phát triển tốt trong những khu vừng đặc trưng của họ Sồi
Dẻ, Giẽ, đặc biệt là khu vực núi đá vôi. Chi Taxus được mô tả lần đầu tiên tại
Việt Nam vào năm 1919, tuy nhiên số lượng tìm thấy là không nhiều, chỉ là
các cá thể riêng lẻ, chưa tạo thành quần thể. Trong sách đỏ Việt Nam 2007,
thông đỏ được xếp vào cấp VU – loài sẽ nguy cấp. Việt Nam có hai loại thông
đỏ khác nhau là T. chinensis và T. wallichiana. T. wallichiana phân bố ở rừng
thứ sinh ở tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam ở độ cao 1200–1400 m, trong khi T.
chinensis phân bố ở rừng thường xanh trên núi đá vôi ở các tỉnh phía bắc Việt
Nam ở độ cao 1000 –1900 m [38]. Cụ thể, T. chinensis chỉ xuất hiện ở những
khoảnh rừng nhỏ lẻ, biệt lập ở các tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Hòa
Bình, Sơn La. Sự phát triển từ một hạt giống thành một cây sinh sản phát triển
đầy đủ cần hơn 35 năm.
Hình 1.4. Cây thông đỏ bắc (Taxus chinensis) [38]
Thông đỏ được biết đến là loại gỗ quý có giá trị kinh tế cao và thường
dùng làm gỗ gia dụng. Theo y học dân gian, lá được dùng từ lâu đời để trị hen
suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hoá không bình thường... Ngoài ra, cành, vỏ,
lá với liều lượng thấp còn được dùng để trị thực tính, bệnh giun đũa, đau đầu
và điều trị ung thư. Đặc biệt vào năm 1962, các nhà khoa học tại Mỹ đã công
bố phát minh làm “chấn động’’ dư luận, khẳng định trong cây Thông đỏ có
hoạt chất paclitaxel chữa bệnh ung thư - căn bệnh mà y học lúc đó còn đang
bó tay. Năm 1992, bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ (FDA) đã
chấp nhận paclitaxel là loại thuốc điều trị đặc hiệu bệnh ung thư buồng trứng,
miệng, ung thư vú. Theo số liệu năm 2000, thị trường tiêu thụ paclitaxel toàn

13
cầu đạt 1,6 tỷ đô la. Các hoạt động khai hoang của con người trong vài thập
kỷ qua đã làm giảm đáng kể diện tích rừng của thủy tùng, dẫn đến hậu quả là
thông đỏ bị liệt vào danh sách loài có nguy cơ tuyệt và cần được bảo tồn.
Ngoài paclitaxel, nhiều chất có hoạt tính sinh học giá trị đã được
nghiên cứu từ cây thông đỏ. Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ các
cây T. chinensis, T. cuspidata và T. media tại vùng đông bắc Trung Quốc đã
phát hiện 20 hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn và 9 chất có khả năng gây độc
tế bào ung thư. Các chất chuyển hóa này chủ yếu được phát hiện chủ yếu
trong lá của T. cuspidata và T. media. Trong số đó, dodecanol có tác dụng
kháng nấm [39]. Phosphomycin, acid fumaric, acid caffeic, acid cis -2-
hydroxycinnamic, acid 4-hydroxybenzoic và acid 3,4-dihydroxyphenylacetic
có đặc tính kháng khuẩn phổ rộng. Phosphomycin, acid 4-hydroxybenzoic và
acid 3,4-dihydroxyphenylaxetic có thể ức chế sự tổng hợp cấu trúc tế bào [40,
41]. Acid fumaric, acid cis -2-hydroxycinnamic và acid caffeic có thể điều
chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào. Ngoài ra, 9 chất được tìm thấy có tác
dụng ức chế mạnh tế bào ung thư. Trong số đó, acid caffeic, 4-
hydroxybenzoic acid, acid 3,4-dihydroxy, squalene, anandamide, acid
dehydroshikimic và salicin được phát hiện chủ yếu ở T. media; chỉ có acid
2,3-dihydroxybenzoic và fucose được phát hiện ở T. cuspidate [42, 43]. Điều
này khẳng định, các chất có hoạt tính sinh học từ cây không đỏ khá đa dạng
và dao động mạnh tùy thuộc vào chi và môi trường phát triển.
1.2.2. Đa dạng và phân loại vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ
Cho đến nay, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu đa dạng sinh học và
phân bố của vi nấm nội sinh trên các cây thuộc chi Thông đỏ. Caruso và cộng
sự (2000) đã phân lập 150 chủng nấm từ cây T. baccata và T. brevifolia.
Trong đó, các chủng thuộc chi Alternaria, Fusarium và Mucor chiếm ưu thế
nhất. Wang và cộng sự (2008) đã phân lập được 40 chủng nấm nội sinh từ lá
cây Taxus mairei ở Fushan, Đài Loan. Dựa trên các đặc điểm hình thái và
phân loại bằng sinh học phân tử, phần lớn các chủng thuộc chi Colletotrichum
và Fusarium [44].
Năm 2017, Jam và Fotouhifar đã nghiên cứu đa dạng vi nấm nội sinh
trên cây thủy tùng T. baccata L. ở Iran. Từ 80 mẫu cành và vỏ cây, đã phân
lập được 125 chủng vi nấm nội sinh. Hầu hết các loại vi nấm nội sinh đã được

14
xác định thuộc ngành Mycelia stelia (67,2%) và Ascomycota (32%) và những
loài khác thuộc Zygomycota (0,8%). Trong đó, Cladosporium và Alternaria là
những chi ưu thế. Nhiều loài nấm nội sinh mới lần đầu tiên được phát hiện
trên cây thủy tùng như Pseudodictyosporium elegans, Cladosporium
basiinflatum, C. perangustum, C. subtilissimum, Geniculosporium serpens,
Phoma pratorum, Paraphoma fimeti, Phomopsis archeri, Sclerostagonospora
cycadis và Seimatosporium cf. pezizoides [45].
Song song với đánh giá đa dạng và phân bố của vi nấm nội sinh, nhiều
nghiên cứu đã tập trung đánh giá khả năng sinh paclitaxel của các chủng nấm
phân lập được. Cho tới nay, đã có hơn 150 chủng vi nấm sinh sinh paclitaxel
thuộc 26 chi nấm được ghi nhận. Một số chi nấm sinh paclitaxel chiếm ưu thế
như Taxomyces, Pestolotiopsis, Penicillium, Pestalotiopsis, Colletotrichum và
Fusarium [45].
Phân loại vi nấm đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu đa dạng
nấm nội sinh. Hiện nay, nghiên cứu hình thái hệ sợi, cơ chế sinh bào tử và đặc
điểm của bào tử là phương pháp chính dùng để phân loại vi nấm. Tuy nhiên,
không phải tất cả các loài nấm nội sinh đều tạo ra bào tử bào tử trong suốt
vòng đời của chúng. Theo một khảo sát, tỷ lệ các chủng không sinh bào tử đạt
khoảng 41,3% [46], dẫn đến những khó khăn trong việc định danh vi nấm tới
loài. Phân loại bằng sinh học phân tử cho thấy, việc định danh chỉ dựa trên
đặc điểm hình thái tế bào và bào tử là không chính xác với mối quan hệ phát
sinh loài thực sự của chúng. Ứng dụng các công cụ sinh học phân tử và tin
sinh học cho phép định danh loài với độ nhạy và độ đặc hiệu cao dựa trên
việc so sánh DNA ribosome (rDNA) của từng vi sinh vật nội sinh với cơ sở
dữ liệu trình tự GenBank bằng cách sử dụng công cụ BLAST trên NCBI.
Ribosome DNA là một bộ gen lớn nằm trong nhân và có trình tự bảo tồn cao
nhất nhờ hàng nghìn đơn vị sao chép trong cấu trúc gen. Các đơn vị này bao
gồm: trình tự gen mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ 18S; trình tự gen mã hóa cho
tiểu đơn vị lớn 26S và một gen ngắn 5,8S giữa 18S và 26S và vùng đệm trong
(ITS) giữa mỗi gen trên. Gen 26S có kích thước lớn nhất trong số chúng với
tổng chiều dài hơn 3000 bp, gần gấp đôi chiều dài của gen 18S. Gen 5,8S là
gen ngắn nhất với tổng số 165 bp. Chiều dài của các gen này vẫn ổn định giữa
các loài tương đối trong khi gen ITS thường là 500-700 bp và dao động giữa
các loài. Khi giải trình tự, kích thước lớn của gen 26S cũng như kích thước

15
quá nhỏ của gen 5.8S gây khó khăn cho việc phân tích dữ liệu. Ngược lại, gen
ITS có kích thước trung bình và trình tự dao động cho phép giải quyết hiệu
quả các vấn đề về xác định mối quan hệ phát sinh loài ở bậc phân loại gần.
Do đó, khuếch đại và giải trình tự gen ITS được áp dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu về vi nấm gần đây.
1.2.3. Các chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ vi nấm nội sinh
trên cây thông đỏ
Hiện nay, đa số các nghiên cứu trên thế giới đang tập trung khai thác
paclitaxel từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ. Năm 1993, Taxomyces
andreanae là chủng nấm đầu tiên có khả năng sinh paclitaxel được phân lập
từ vỏ cây thông đỏ Thái Bình Dương. Đồng thời, paclitaxel từ chủng nấm này
cũng thúc đẩy sự ổn định của các vi ống và kích thích sự polymer hóa in vitro
tương tự như paclitaxel từ cây thông đỏ. Phát hiện này đã cung cấp một
phương pháp thay thế để thu được paclitaxel có hoạt tính sinh học tương tự
chất thu nhận từ cây với giá thành sản xuất thấp [51].
Cho đến nay, ít nhất 34 chi nấm nội sinh như Alternaria, Aspergillus,
Botryodiplodia, Botrytis, Cladosporium, Ectostroma, Fusarium, Metarhizium,
Monochaetia, Mucor, Ozonium, Pap Formulapora, Periconia, Pestalotia,
Pestalotiopsis, Phyllosticta, Pithomyces, Taxomyces, Tubercularia được
chứng minh là có khả năng sản xuất paclitaxel và các chất tương tự của nó
(baccatin III, 10-deacetylbaccatin III). Fusarium solani được phân lập từ
những mẩu thân Taxus celebica sau khi nuôi cấy trên môi trường lỏng có thể
sản xuất 1,6 μg/l paclitaxel. Paclitaxel chiết xuất từ dịch lên men có thể gây
độc tế bào Jurkat tới 60%, trong khi paclitaxel chuẩn chỉ có 51%. Ngoài
paclitaxel, nấm này còn sản xuất ra các taxane, baccatin III và 10 deacetyl
baccatin III, những tiền chất dùng trong bán tổng hợp paclitaxel công nghiệp.
Tương tự, Aspergillus candidus MD3 được phân lập từ vỏ Taxus media có thể
sinh tổng hợp 112 mg/g paclitaxel (tính theo khối lượng khô của sợi nấm).
Chủng Aspergillus niger var. taxi HD86-9 phân lập từ Taxus cuspidata có thể
sản xuất 273,46 μg/L. Đặc biệt, Metarhizium anisopliae, H-27, một trong 13
loài nấm được sàng lọc từ 115 dòng nấm được phân lập từ vỏ cây thông đỏ
(T. chinensis) có thể sản xuất ra 846,1 μg/L paclitaxel.

16
Ngoài paclitaxel, hai chất kháng nấm thuộc nhóm polyketide, clavatol
và patulin được tìm thấy bởi chủng nấm nội sinh Aspergillus clavatonanicus
phân lập từ T. mairei. Những chất này có thể được sản sinh theo cơ chế bảo
vệ cây chủ T. mairei khỏi lại sự tấn công của mầm bệnh thực vật [46].
1.2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong sàng lọc vi nấm nội sinh sinh
paclitaxel và dẫn xuất của paclitaxel
Con đường sinh tổng hợp paclitaxel ở thông đỏ là quá trình phức tạp,
đã được nghiên cứu trong thập kỷ qua. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định vai
trò của 19 enzym tham gia sinh tổng hợp paclitaxel từ geranylgeranyl
diphosphate (GGPP). Một số gen mã hóa enzym chức năng tham gia chính
vào con đường sinh tổng hợp paclitaxel đã được tách dòng, biểu hiện như
geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS), taxadiene synthase (TS),
taxane 5a-hydroxylase (THY5a), taxa-4(20), 11(12)-dien5a-ol-O-
acetyltransferase(TAT), taxane 10b-hydroxylase (DBAT), taxane
13ahydroxylase (THY13a), taxane 2a-O-benzoyltransferase (TBT), 10-
deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase (10-DABT), phenylalanine
aminomutase (PAM), baccatin III:3-amino-3-phenylpropanoyltransferase
(BAPT), and 30-N-debenzoyl-20-deoxypaclitaxel N-benzoyltransferase
(DBTNBT). Tuy nhiên, con đường sinh tổng hợp và cơ chế cảm ứng điều hòa
paclitaxel vẫn chưa được nghiên cứu ở vi nấm nội sinh (Hình 1.5).
Hình 1.5. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel [46]

17
Khả năng sinh tổng hợp paclitaxel ở vi nấm nội sinh được giả thuyết là
do cơ chế chuyển gen ngang (HGT-horizontal gene transfer). Vi nấm nội sinh
sản sinh ra một số hợp chất để duy trì mối quan hệ cộng sinh với cây chủ,
thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ
[47]. Chuyển gen ngang thường được quan sát trong sinh vật nhân sơ và cho
đến gần đây được chứng minh có tầm quan trọng hạn chế đối với sinh vật
nhân chuẩn. Hezari và cộng sự đã tách dòng thành công gen ts và chỉ ra rằng
gen này có nguồn gốc thực vật chứ không phải có nguồn gốc từ vi nấm [48].
Kết quả giải trình tự gen khác như dbat và bapt cho thấy trình tự nucleotide
của các gen từ nấm có độ tương đồng cao gen tương ứng từ cây thông đỏ.
Không riêng vi nấm sinh paclitaxel, nhiều chất kháng tế bào ung thư khác
gồm podophyllotoxin, camptothecine, vinblastine, hypericin và diosgenin đã
được tìm thấy ở vi nấm ký sinh trên cây chủ có khả năng sinh chất tương
đương [47, 49].
So với phương pháp truyền thống tốn nhiều thời gian và công sức, việc
sử dụng chỉ thị phân tử đang là công cụ hữu hiệu nhằm sàng lọc các chủng vi
nấm có khả năng sinh paclitaxel. Dựa trên sự bảo thủ của 3 gen chính tham
gia sinh tổng hợp paclitaxel, các cặp mồi PCR đặc hiệu được thiết kế dựa trên
các vùng bảo thủ của gen ts, dbat và bapt. Gen ts được khuếch đại thành công
từ các chủng nấm khác nhau như Fusarium solani, Taxomyces andreanae và
Gibberella intermedia. Sản phẩm PCR khuếch đại gen dbat được quan sát
thấy ở nấm Fusarium solani, Cladosporium cladosporoides, Aspergillus
candidus và Fusarium redolens. Ngoài ra, gen bapt được khuếch đại thành
công ở Colletotrichum gloeosporioides, Guignardia mangiferae và Fusarium
redolens. Hiện nay, có hơn 30 chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp paclitaxel
dao động từ 10 ng/L đến 800 μg/L thông qua sàng lọc truyền thống/chỉ thị
phân tử.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI
SINH
Ở Việt Nam, gần đây đã có đề tài nghiên cứu về vi nấm nội sinh; tuy
nhiên, các nghiên cứu chuyên sâu về nấm nội sinh cây thông đỏ bắc (T.
chinensis) đến nay chưa có nhiều công bố. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của
PGS. TS. Lê Mai Hương tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện

18
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tách chiết thành công chất 10-
deacetil baceatin III (10-DAB), tiền chất của paclitaxel, từ cây thông đỏ Nam
thu thập tại Việt Nam. Từ mẫu cây, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6
chủng vi nấm. Năm 2010, nhóm nghiên cứu này cho rằng, vi nấm nội sinh
được phân bố trên các bộ phận ở mức độ khác nhau, nhiều nhất ở lá (50
chủng), thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1
chủng). Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy, 17 chủng (chiếm 25%)
thể hiện hoạt tính gây độc 3 dòng tế bào ung thư. Bằng phương pháp phân
loại hình thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng vi nấm tiềm năng
gồm Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium
ehrlichii SHT101 và Gongroniella butleri SHT106. Công trình nghiên cứu
này bước đầu đã minh chứng tiềm năng khai thác các chất có hoạt tính sinh
học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây thông đỏ.
Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã nghiên cứu lựa chọn môi
trường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi nấm nội sinh Fusarium oxyporum
trên cây thông đỏ (T. wallichiana) tại Lạc Dương, Lâm Đồng. Khả năng sinh
paclitaxel của chủng nấm đạt cao nhất 250,98 mg/kg sinh khối khô [50]. Các
kết quả này là tiền đề và cơ sở khoa học để các nhà khoa học trong nước thực
hiện các nghiên cứu tiếp theo tạo nguồn nguyên liệu paclitaxel chữa bệnh ung
thư ở quy mô công nghiệp.
Tại Việt Nam, hiện vẫn chưa có nghiên cứu sâu về các hoạt tính kháng
sinh và gây độc tế bào ung thư từ các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ
T. chinensis tại Hà Giang. Nghiên cứu này rất cần thiết vì không những khai
thác nguồn vi nấm bản địa có khả năng sinh các chất kháng sinh và kháng tế
bào ung thư mới mới mà còn góp phần bảo tồn loài thông đỏ quý hiếm đang
bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam.

19
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG
2.1.1. Chủng giống
Bộ sưu tập vi nấm nội sinh gồm 25 chủng được phân lập từ các mẫu
cây thông đỏ (Taxus chinensis) thu thập tại huyện Quản Bạ và huyện Đồng
Văn tỉnh Hà Giang năm 2019, được lưu giữ tại Trung tâm Giống và Bảo tồn
nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
Các chủng vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli ATCC 11105,
Bacillus cereus ATCC 11778, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,
Candida albicans ATCC 10231, Staphylococcus epidermidis kháng
methicilin (MRSE) ATCC 35984 và Staphylococcus aureus kháng methicilin
(MRSA) ATCC 33591, Enterococcus faecalis ATCC 29212 nhận từ Bộ sưu
tập giống VSV của Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các dòng tế bào ung thư gồm A-549 (ung thư phổi người), MCF-7 (ung
thư vú người) do J. M. Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và GS.
Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
Một số hóa chất chính cho thí nghiệm : Cao nấm men, cao thịt, trypton
(Himedia-Ấn Độ); glucose (Trung Quốc); NaCl (Trung Quốc), KH2PO4,
K2HPO4, MgSO4 (Trung Quốc); trypsin (Merck, Đức); DPPH (Merck, Đức);
dimethyl sulfoxide (DMSO) (Merck, Đức); ethyl acetate (Sigma, Mỹ); SRB
(Sulforhodamine B) (Gibco, Mỹ); agar (Viết Nam)và một số hóa chất phân
tích khác.
Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu này được trình
bày trong bảng 2.1.

20
Bảng 2.1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
1 Máy cô quay chân không IKK của Đức
2 Máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 Nhật Bản
3 Cân kỹ thuật Precisa XB 1200C Thụy Sĩ
4 Cân phân tích Shimazu AY120 Nhật Bản
5 Máy ly tâm lạnh Biofuge Fresco, Kendro, Đức
6 Máy lắc có kiểm soát nhiệt độ BSI-25R CPT, Mỹ
7 Nồi khử trùng ALP MC-40DP, Nhật Bản
8 Tủ ấm Trung Quốc
9 Lò vi sóng Sharp, Nhật Bản
2.1.3. Môi trường
PDA (g/L): Khoai tây 200; glucose 20; MgSO4 0,2; K2HPO4 0,2; agar 20;
pH 6,5
PDB (g/L) : Khoai tây 200; glucose 20; MgSO4 0,2; K2HPO4 0,2; pH 6,5
LB (g/L): NaCl 10; tryptone 5; Cao nấm men 5; agar 20; pH 7
Hansen (g/L): Glucose 20; peptone 10; KH2PO4; MgSO4 2; agar 20; pH 6
Czapek-Dox (g/L) : Sucrose 30,0; NaNO3 2,0; K2HPO4 1,0;
MgSO4.7H2O 0,5; KCl 0,5; FeSO4.6H2O 0,01; agar 15; pH 7,3.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi nấm
nội sinh được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch kết hợp hiệu chỉnh
theo El-Sayed và cộng sự (2019) [51]. Các chủng vi nấm được nuôi cấy trên
môi trường PDB ở nhiệt độ 30⁰C trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong 7
ngày. Môi trường thạch LB sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt độ 30-

21
37⁰C, hút dịch VSV kiểm định có mật độ tế bào đạt 5 x 108
CFU/mL lên trên
bề mặt đĩa Petri hoặc các khay. Khi thạch đông dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô
trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra. Sau 7 ngày nuôi cấy, thu hồi và ly tâm
dịch nuôi cấy các chủng vi nấm với tốc độ 6.000-8.000 vòng/phút ở 4⁰C. Bổ
sung 100 μL dịch vào các giếng thạch trên đĩa Petri và đặt các đĩa trong tủ
lạnh khoảng 5-6 giờ để dịch từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy
vi sinh vật. Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 28-30⁰C trong 14-18 giờ, quan sát
vòng kháng khuẩn.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định theo kích thước
vòng kháng khuẩn (VKK) theo công thức:
VKK = D - d (mm),
Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
d: Đường kính lỗ thạch (mm)
2.2.2. Tách chiết các hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh
Phương pháp tách chiết các hoạt chất sinh học từ vi nấm nội sinh được
tiến hành theo mô tả trước đây [52]. Các chủng nấm được cấy vào môi trường
PDB (100 mL) và ủ ở 25⁰C trên máy lắc trong 5 ngày và được sử dụng làm
bình giống gốc. Tiếp giống 3% v/v (15 mL) được chuyển vào 500 mL PDB
và ủ ở 25°C trong 21 ngày trong bóng tối như một môi trường nuôi cấy tĩnh.
Sau đó, dịch nuôi được lọc qua bốn lớp vải thưa để loại bỏ các sợi nấm. Các
sợi nấm sau khi thu hồi được làm khô qua đêm ở 35 – 40°C và chiết xuất
bằng ethyl acetate trong 12 giờ. Môi trường nuôi cấy cũng được chiết với
ethyl acetate theo tỉ lệ 1 : 3. Phần dung môi phía trên được thu lại và cô quay
ở 60o
C. Sau đó cặn kháng sinh thô được làm khô và cân đến khối lượng
không đổi (cao chiết). Quá trình tách chiết được lặp lại 2 – 3 lần. Cao chiết
được bảo quản ở 4o
C cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Phương pháp gây độc tế bào đươc xác định tại phòng Thử nghiệm sinh
học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.

22
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia
Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào
chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển
hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện
theo phương đã được công bố trước đây [53]. Phép thử tiến hành xác định
hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical
Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng
Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB
gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng
nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể
như sau:
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng
đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Chất thử đã pha ở nồng độ 100 µg/mL được đưa vào các giếng của đĩa
96 giếng. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190 L) sẽ được
sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ
được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%.
- Ủ trong tủ ấm 72 giờ. Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1
giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37o
C, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi
để khô ở nhiệt độ phòng.
- 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10
phút rồi đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader
(Biotek).
- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được
xác định thông qua công thức sau:
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các
nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL được sử dụng như là chất
đối chứng tham khảo;

23
- DMSO 1% luôn được sử dụng như đối chứng âm (nồng độ cuối cùng
trong giếng thử là 0.05%). Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ
được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết
được coi có hoạt tính tốt với IC50  20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được
coi có hoạt tính tốt khi IC50  5 μM [54].
2.2.4. Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng tuyển
chọn
Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết được được tiến hành
theo mô tả trước đây [55]. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL DPPH (1000
µg/mL) và 960 µL cao chiết có nồng độ khác nhau 25, 50, 100, 200, 400
µg/mL. Hỗn hợp được ủ trong tối ở nhiệt độ 30ºC trong thời gian 30 phút, đo
độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517 nm. Chất chuẩn được sử dụng là
ascorbic acid. Phần trăm loại bỏ gốc tự do được tính theo công thức:
% Loại bỏ gốc tự do = x 100%
Trong đó: AC là giá trị hấp thu của đối chứng, AS hấp thu của mẫu.
2.2.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thông qua sàng các gen
chỉ thị
Các chủng vi nấm nội sinh được nuôi cấy trên PDA lỏng trong 3 – 5
ngày, sau đó li tâm thu sinh khối ở 10.000 vòng trong 5 phút. DNA tổng số
được tách chiết bằng kit Dneasy Plant Mini kit (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sàng lọc vi nấm nội sinh sản xuất
paclitaxel bằng PCR dựa trên 3 cặp mồi (Bảng 2.2) cho dbat (dbat-F/dbat-R);
bapt (bapt-F/bapt-R); ts (ts-F/ts-R) theo chu trình nhiệt được trình bày trong
Bảng 2.3 [56, 57]. Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di
trên gel agarose 1,0%.

24
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các
gen dbat, bapt và ts
Gen
Tên đoạn
mồi
Trình tự mồi (5′ - 3′)
Kích thước
dự đoán
TLTK
dbat
dbat-F GGGAGGGTGCTCTGTTTG
153 – 650 bp [57]
dbat-R GGCCTGCTCCTAGTCCATCACAT
bapt
bapt-F CCTCTCTCCGCCATTGACAA
450 - 600 bp [57]
bapt-R GTCGCTGTCAGCCATGGCTT
ts
ts-F ATCAGTCCGTCTGCATACGACA
400 – 500 bp [56]
ts-R TAAGCCTGGCTTCCCGTGTTGT
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các gen
dbat, bapt và ts
Gen Các bước Nhiệt độ (o
C) Thời gian Số chu kỳ TLTK
dbat
Biến tính 95 6 phút 1
[56]
Biến tính 94 50s
35
Gắn mồi 50 30s
Kéo dài 68 50s
Kết thúc 68 10 phút 1
bapt
Biến tính 95 6 phút 1
[56]
Biến tính 94 50s
30
Gắn mồi 55 50s
Kéo dài 68 50s
ts
Biến tính 6 phút 1
[57]
Biến tính 94 50s
32
Gắn mồi 55 1 phút
Kéo dài 72 80s

25
2.2.6. Xác định đặc điểm hình thái và bào tử của các chủng vi nấm nội
sinh tuyển chọn
Xác định đặc điểm hình thái : Các chủng vi nấm tuyển chọn được nuôi
cấy trên môi trường Czapek-Dox trong 3-10 ngày ở 28⁰C và được quan sát
đặc điểm hình thái theo các khóa phân loại nấm [58, 59] , dựa trên một số đặc
điểm chính sau:
- Hình dạng khuẩn lạc: tròn, vô định hình
- Bề mặt: lồi lõm, nhung mượt, mịn, xốp, ...
- Màu sắc khuẩn lạc, sự thay đổi màu khuẩn ty khí sinh theo thời gian
nuôi cấy
- Dạng mép khuẩn lạc: mỏng, dày, phẳng, răng cưa, ...
- Giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc: ít hoặc nhiều, màu sắc giọt tiết
- Tiết màu sắc vào môi trường nuôi cấy
Xác định đặc điểm bào tử : Các chủng nấm sợi được nuôi cấy trong tủ
ấm ở 28-30°C trên môi trường thạch Czapek-Dox có cắm la men nghiêng.
Sau 72 giờ, lamen được lấy ra quan sát hình thái cuống sinh bào tử và bào tử
được quan sát dưới kính hiển vi quang học tập trung vào một số điểm:
- Sợi nấm (hyphae): có vách ngăn, không có vách ngăn, có mấu, ...
- Bào tử (conidia): kiểu phát sinh bào tử, hình dạng, kích thước, cách
sắp xếp, ...
- Cuống sinh bào tử: có vách ngăn hoặc không, có hoặc không có cấu
trúc đặc biệt như tế bào chân, có hoặc không có hình thái đặc biệt như bó giá,
đệm giá.
Căn cứ vào kết quả quan sát về đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm vi thể,
các chủng nấm nghiên cứu được xác định tên khoa học theo các khóa phân
loại.
2.2.7. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn bằng giải và
phân tích trình tự vùng ITS
Các chủng vi nấm nội sinh được nuôi cấy trên PDA lỏng trong 3 – 5
ngày, sau đó li tâm thu sinh khối ở 10.000 vòng trong 5 phút. DNA tổng số

26
được tách chiết bằng kit Dneasy Plant Mini kit (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA tổng số được sử dụng như là
một mẫu để khuếch đại các vùng ITS cùng với gen 5,8S rRNA thông qua
PCR, sử dụng các mồi phổ ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và
ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) theo chu trình nhiệt: 95⁰C
trong 6 phút; 30 chu trình: 94⁰C trong 50 giây, 50⁰C trong 30 giây, 72⁰C trong
80 giây; 72⁰C trong 10 phút, giữ mẫu ở 4⁰C [60]. Sản phẩm PCR được kiểm
tra, tinh sạch và gửi đến First BASE Laboratories Sdn. Bhd. (Malaysia) để
giải trình tự. Kết quả giải trình tự gen hai chiều được kiểm tra bằng phần mềm
BioEdit 7.2, so sánh với các gen tương ứng đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ
liệu GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Cây
phân loại được xây dựng dựa trên mức độ tương đồng của trình tự nucleotide
giữa các loài được tính toán thống kê bằng phần mềm MEGA 7.0.
2.2.8. Xử lý thống kê số liệu
Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học
trên phần mềm Microsoft Excel 2016. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán
dựa trên những công thức cơ bản của thống kê trong đó có công thức:
Giá trị trung bình(X): X = I;
Độ lệch chuẩn (δ): δ = ; Sai số (m):

27
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI
NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của vi sinh vật nội sinh, đặc
biệt là vi nấm, là khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất ức chế VSV gây bệnh
[13]. Từ 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập trên cây thông đỏ Bắc tại Hà
Giang, sàng lọc hoạt tính kháng sinh trên 7 chủng vi sinh vật kiểm định bằng
phương pháp khuếch tán đĩa thạch được tiến hành. Kết quả cho thấy rằng
12/25 chủng (chiếm 48%) có khả năng kháng ít nhất một chủng VSV kiểm
định trong thử nghiệm (Hình 3.3).
Hình 3.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A) và MRSE
ATCC 35984 (B) của một số chủng vi nấm nội sinh
Số lượng chủng thể hiện hoạt tính trên từng chủng VSV kiểm định dao
động trong khoảng 8 – 36% (Hình 3.2). Trong đó, các chủng vi nấm nội sinh
thể hiện hoạt kháng mạnh đối với MRSE ATCC 35984 (chiếm 36%) và B.
cereus ATCC 11778 (chiếm 32%). Tỷ lệ thấp hơn được ghi nhận với các
chủng MRSA ATCC 33591 (chiếm 24%), P. aeruginosa ATCC 9027 (chiếm
24%), E. faecalis ATCC 29212 (chiếm 20%), C. albicans ATCC 10231
(chiếm 16%) và E. coli ATCC 11105 (chiếm 8%).
(A) (B)

28
Hình 3.2. Tỉ lệ ức chế của các chủng vi nấm nội sinh trên từng cùng VSV
kiểm định
Trong số 12 chủng có khả năng ức chế VSV kiểm định, có 6/12 chủng
(chiếm 50%) thể hiện hoạt tính trên cả 3 nhóm: Gram (-), Gram (+) và nấm
men; có 5/12 chủng (chiếm 41,67%) chỉ thể hiện hoạt tính trên nhóm vi khuẩn
Gram (+) và có 1/12 chủng (chiếm 8,33%) chỉ thể hiện hoạt tính trên nhóm vi
khuẩn Gram (-). Đặc biệt, 4 chủng gồm TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 thể hiện
phổ kháng rộng trên ít nhất 5 chủng VSV kiểm định với đường kính vòng
kháng dao động từ 7 - 30 mm (Hình 3.1). Vì vậy, 4 chủng vi nấm gồm TQF6,
TQF25, TDF6, TDF7 được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu gần đây, Gauchan và cộng sự (2021) đã phân lập được 13
chủng nấm nội sinh từ 16 mẫu cây thông đỏ (T. wallichiana) thu thập tại
Nepal [61]. Trong đó, chỉ có 3 chủng vi nấm (chiếm 23.1%) thể hiện hoạt tính
kháng E. coli, S. aureus và B. subtilis, với đường kính vòng kháng khuẩn dao
động từ 6,5-10,2 mm. Ở nghiên cứu khác trên cây thông đỏ Himalayan (T.
wallichiana Zucc.), 3/16 chủng vi nấm thể hiện hoạt tính kháng ít nhất một
loại vi sinh vật kiểm định [62], thấp 2 lần tỷ lệ vi nấm sinh kháng sinh trên
cây thông đỏ (T. chinensis) thu thập tại Hà Giang, Việt Nam.

29
Hình 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi nấm nội
sinh trên cây thông đỏ. Ghi chú: 1. E. coli ATCC 11105; 2. C. albicans
ATCC 10231; 3. B. cereus ATCC 11778; 4. MRSE ATCC 35984; 5. P.
aeruginosa ATCC 9027; 6. MRSA ATCC 33591; 7. E. faecalis ATCC 29212.
So sánh với các nghiên cứu về nấm nội sinh trên cây huyết giác
(Dracaena cambodiana) và cây bạch mộc hương (Aquilaria sinensis) cho
thấy tỷ lệ nấm nội sinh thể hiện hoạt tính ức chế vi sinh vật kiểm định thường
thấp, đạt 8.3% tổng số chủng phân lập được. Trên cây hỷ thụ (Camptotheca
acuminata), đã báo cáo rằng 27,6% các chủng vi nấm phân lập có hoạt tính
kháng khuẩn. Tổng hợp các nghiên cứu trên, vi nấm nội sinh trên cây thông
đỏ (T. chinensis) hứa hẹn nhiều tiềm năng khai thác các hoạt chất kháng sinh
mới.
3.2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH
Ngoài khả năng sinh kháng sinh ức chế vi sinh vật gây bệnh, vi nấm
nội sinh trên cây thông đỏ còn là nguồn cung cấp các chất gây độc tế bào ung
thư ứng dụng trong điều trị lâm sàng và dược phẩm như paclitaxel. Trong

30
nghiên cứu này, 5 chủng vi nấm tiềm năng được tách chiết bằng dung môi
ethyl acetate và đánh giá hoạt tính gây độc trên 2 dòng tế bào ung thư phổi
A549 và vú MCF-7.
Bảng 3.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư của 5 chủng vi nấm nội sinh trên
cây thông đỏ Bắc
STT Kí hiệu chủng
Tỉ lệ ức chế tế bào (%)
A-549 IC50 MCF-7 IC50
1 TQF6 (100 µg/mL) 30,99 ± 1,53 >100 21,36 ± 2,67 >100
2 TQF25 (100 µg/mL) 44,99 ± 0,69 >100 43,51 ± 2,26 >100
3 TDF6 (100 µg/mL) 92,65 ± 1,4 7,61±0,21 77,15 ± 1,98 16,92±0,61
4 TDF7 (100 µg/mL) 93,91 ± 2,18 13,4±0,9 89,22 ± 4,09 17,82±2,02
5 Ellipticine (µg/mL) 92,81 ± 1,06 0,44±0,05 93,97 ± 1,07 0,47±0,02
Ghi chú: Ellipticine được sử dụng làm đối chứng dương.
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, cao chiết tổng (100 µg/mL) từ 4 chủng vi
nấm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư ở mức độ khác nhau. Trong đó,
2/4 chủng vi nấm gây độc tế bào ung thư A-549 và MCF-7 cao với khả năng
ức chế tế bào cao hơn 70% (Bảng 3.1). Hoạt chất thô từ chủng TDF7 ức chế
mạnh nhất với tế bào ung thư phổi A549 và MCF-7 với tỷ lệ ức chế tế bào đạt
93,91 ± 2,18% và 89,22 ± 4,09, tương ứng. Ở mức thấp hơn, tỷ lệ ức chế tế
bào ung thư phổi A-549 và ung thư vú MCF-7 đạt lần lượt 92,65 ± 1,4% và
77,15 ± 1,98% so với mẫu đối chứng khi xử lý với cao chiết từ chủng nấm
TDF6 (Bảng 3.1). Mặc dù chủng TQF6, TQF25 thể hiện hoạt tính kháng vi
sinh vật kiểm định mạnh và rộng trên nhiều chủng VSV kiểm định nhưng
hoạt tính gây độc tế bào A549 và MCF-7 thấp. Sự ức chế mạnh các dòng tế
bào ung thư có thể do sự tương tác của các hợp chất có hoạt tính sinh học
trong cao chiết với protein p53, một protein quan trọng nằm trong điều hòa
chu kỳ tế bào – gọi là gen áp chế khối u p53 [63]. Khi có tổn thương ở DNA,
p53 làm ngừng chu kỳ tế bào cho đến khi DNA bị tổn thương được sửa chữa
hoặc p53 có thể làm cho tế bào chết theo lập trình (apoptosis) nếu không còn
khả năng sửa chữa DNA. Các chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư bám vào
đầu N của p53 và giúp protein này không bị phân huỷ.
Báo cáo về hoạt tính gây độc tế bào ung thư vi nấm trên cây thông đỏ
tây Himalayan (T. fuana) chỉ ra rằng chỉ có 5/15 cao chiết tổng có khả năng

31
ức chế tế bào MCF-7 với tỷ lệ tế bào sống sót dao động từ 0-45,7% [64]. Năm
2017, Vasundhara và cộng sự đã phân lập được chủng vi nấm Diaporthe sp.
T1 từ cây thông đỏ (T. baccata), sinh chất trichalasin E, F and H ức chế 79 ±
6% tế bào MCF-7 [65]. Chủng F. tricinctum T6 phân lập từ cây thông đỏ (T.
tabaca L. subsp. wallichiana (Zucc.) tại Ấn Độ được báo cáo khả năng ức chế
sự phát triển của các dòng tế bào ung thư MCF-7 và HeLa [52]. Các công bố
trên khá tương đồng với kết quả gây độc tế bào ung thư MCF-7 và A-549 thu
nhận từ nghiên cứu này.
Bên cạnh cây thông đỏ, khả năng sinh tổng hợp chất gây độc tế bào ung
thư từ nấm nội sinh trên các cây dược liệu/thảo dược khác cũng khá đa dạng
và phong phú. Năm 2017, Liu và cộng sự đã nghiên cứu khả năng gây độc tế
bào của các chủng vi nấm nội sinh trên 3 cây ngập mặn: cây trang (Kandelia
candel), đước vòi (Rhizophora stylosa) và cây họ đước (Rhizophoraceae). Kết
quả cho thấy 10/28 chủng vi nấm nội sinh phân lập được thể hiện hoạt tính ức
chế đáng kể sự phát triển của tế bào A-549 với tỷ lệ sống sót trong khoảng 7 -
57,6%. Đặc biệt, ba chủng nấm nội sinh đã ức chế rõ rệt sự hình thành mạch
ung thư phổi oncoprotein do HPV-16 E7 gây ra trong ống nghiệm [66].
Aspergillus nomius phân lập trên cây lô hội (Aloe vera L.) có khả năng sinh
chất sulphorhodamine gây độc tế bào ung thư MCF-7 với tỉ lệ tế bào sống đạt
2% [67].
3.3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH
CHIẾT THÔ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM
Trong y học hiện đại, chất chống oxy hóa đang trở thành một liệu pháp
sinh học tự nhiên đầy hứa hẹn. Các vi nấm nội sinh được biết đến là một
nguồn đầy hứa hẹn của các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học tự nhiên với
hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ và đã được coi là có hiệu quả và kinh tế.

32
Hình 3.4. Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn

33
Cao chiết tổng của 4 chủng tuyển chọn đều có hoạt tính chống oxy hóa
cao. Tăng nồng độ cao chiết, hoạt động chống oxy hóa tăng dần. Tại nồng độ
400 µg/mL hoạt tính chống oxy hóa DPPH của TQF6, TQF25, TDF6 và
TDF7 lần lượt là 93,78; 93,49; 89,15 và 60,71% (Hình 3.4).
Nghiên cứu hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH từ cao chiết chủng
Preussia africana phân lập trên cây lô hội cho thấy tại nồng độ 500 µg/mL,
hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH đạt 87%. Mười bốn chủng phân lập từ H.
mysorense và 13 chủng phân lập từ N. foetida đều thể hiện hoạt tính loại bỏ
gốc tự do DPPH. Trong đó, 55% các chủng có hiệu quả loại bỏ gốc tự do
DPPH lớn hơn 95% và 40% số chủng có hoạt tính lớn hơn 75% [55]. Một số
chất chống oxy hóa tự nhiên mới như pestacin, corynesidones AB, 2,14-
dihydroxy-7-drimen-12,11-olide, lapachol, coumarin, 5- (hydroxymethyl) -2-
furanocarboxylic acid, isopestacin, phloroglucinol, tetrahydroxy-1-
methylxanthone, salidroside, p -tyrosol, borneol và rutin được tách chiết từ vi
nấm nội sinh [31, 32]. Khả năng chống oxy hóa của vi nấm nội sinh Xylaria
spp. và Chaetomium spp. phân lập từ Nerium oleander và Ginkgo biloba (một
loại cây thuốc thông thường) đã được báo cáo [60]. Hai chủng vi nấm nội sinh
Pestalotiopsis microspore và Cephalosporin spp. phân lập từ Terminalia
morobensis và Tracheospermum jasminoides cũng đã được báo cáo về khả
năng sản xuất các chất chống oxy hóa là pestacin, isopestacin, graphislactone
A.
3.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG
SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM
Trong thập kỷ qua, đa số các nghiên cứu vi nấm nội sinh trên cây thông
đỏ tập trung phân lập, sàng lọc paclitaxel và thử nghiệm hoạt tính ức chế tế
bào ung thư ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nhược điểm của quy
trình này là chi phí cao, đòi hỏi thời gian dài và tỷ lệ sàng lọc được chủng vi
nấm paclitaxel thấp. Gần đây, sự phát triển của công nghệ giải trình tự gen
bằng Sanger và thế hệ mới (next generation of sequencing-NGS) đã hỗ trợ
đắc lực trong việc sàng lọc các chủng nấm tiềm năng sinh paclitaxel. Hơn
nữa, cơ chế chuyển gen ngang được chứng minh là nguyên nhân chính dẫn tới
khả năng sinh paclitaxel của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ. Chính vì vậy,
các gen mã hóa enzym tham gia chính trong con đường sinh tổng hợp

34
paclitaxel, chẳng hạn như taxadiene synthase (ts), 10 deacetylbaccatin III- 10-
O-acetyl transferase (dbat) và C-13 phenylpropanoid-CoA acyltransferase
(bapt) được sử dụng làm chỉ thị phân tử nhằm sàng lọc các chủng vi nấm tiềm
năng. Trong nghiên cứu này, 4 chủng vi nấm gồm TQF6, TQF25, TDF6 và
TDF7 sinh chất ức chế vi sinh vật kiểm định và tế bào ung thư cao được đánh
giá khả năng sinh paclitaxel bằng chỉ thị phân tử.
Hình 3.5. Điên di DNA tổng số của các chủng vi nấm tuyển chọn trên gel
agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 1 kb (Thermo scientific, Mỹ).
DNA tổng số của 4 chủng tuyển chọn được tách bằng bộ kit DNeasy
Plant Mini cho băng DNA tổng số sắc nét trên gel agarose (Hình 3.5) và đủ
nồng độ DNA thực hiện phản ứng PCR khuếch đại 3 gen dbat, bapt, ts. Sản
phẩm PCR có kích thước đạt 550 bp, 500 bp và 450 bp được dự đoán tương
ứng với kích thước mong đợt của gen dbat, bapt và ts. Kết quả âm tính ghi
nhận cho sản phẩm PCR không xuất hiện băng và có dải băng không đúng với
kích thước dự đoán.
Kết quả hình 3.6 cho thấy, gen dbat với kích thước 550 được khuếch
đại thành công ở 3 chủng vi nấm TQF6, TQF25 và TDF6. Gen dbat mã hoá
10-deacetyl-baccatin III-10-O-acetyltransferase tham gia xúc tác chuyển hoá
10-deacetyl baccatin III thành baccatin III, tiền chất quan trọng để sinh tổng
hợp paclitaxel ở cây thông đỏ.

35
Bên cạnh gen dbat, gen bapt với kích thước 500 bp cũng được khuếch
đại thành công ở chủng TQF25 (Hình 3.6). Với 2 gen chính tham gia con
đường sinh tổng hợp paclitaxel xuất hiện trên chromosome, chủng TQF25
nhiều khả năng sinh tổng hợp paclitaxel. Đối với chủng TDF7, không có gen
mã hoá dbat, bapt và ts được khuếch đại. Điều này khẳng định chủng này
không sinh paclitaxel nhưng vẫn có tiềm năng khai thác các chất kháng sinh
và kháng ung thư mới. Trong những nghiên cứu xa hơn, tối ưu môi trường,
điều kiện lên men và quy trình tách chiết paclitaxel là cần thiết để khẳng định
khả năng sinh paclitaxel của 3 chủng TQF6, TQF25 và TDF6.
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen tham gia sinh tổng hợp
paclitaxel của 4 chủng tuyển chọn trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA
chuẩn 100 bp (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm.

36
Trong những năm gần đây, ngày càng nhiều nghiên cứu tập trung sàng
lọc các chủng vi nấm tiềm năng sinh paclitaxel bằng sử dụng các chỉ thị phân
tử. Trong tổng số 19 gen mã hoá enzym tham gia sinh tổng hợp paclitaxel,
các gen ts, dbat, và bapt được chú ý hơn cả. Poopa và cộng sự đã phân lập
được 43 loài nấm nội sinh từ cây Salacia oblonga - một loài cây bụi thân gỗ
nhiệt đới ở Ấn Độ. Trong số đó, có 7 chủng cho kết quả dương tính với gen
dbat, trong khi đó chỉ có một chủng dương tính với bapt. Xiong và cộng sự
(2013) đã thiết kế chỉ thị phân tử bapt nhằm sàng lọc vi nấm sinh paclitaxel
trên cây thông đỏ Anglojap (T. x media) [68]. Trên tổng số 11 chủng vi nấm,
3 chủng vi nấm chứa gen bapt có kích thước 530 bp. Năm 2020, El-Bialy và
cộng sự đã khuếch đại thành công gen bapt với kích thước 582 bp từ
Acremonium sp. KM 677335. Ở nghiên cứu khác, bapt với kích thước 450 bp
được khuếch đại thành công từ 2 chủng vi nấm Colletotrichum
gloesporioides, Alternaria alternata. Trong nghiên cứu này, kích thước gen
bapt được ghi nhận từ chủng TQF25 là 500 bp. Chất chiết thô từ dịch lên men
các chủng vi nấm trên đều được chứng minh chứa hàm lượng paclitaxel đáng
kể > 5.2 μg/L. Các kết quả trên góp phần chứng minh rằng PCR khuếch đại
các gen liên quan đến sinh tổng hợp paclitaxel là một phương pháp hiệu quả
và đáng tin cậy để sàng lọc trước các loại nấm sản xuất paclitaxel.
So sánh với các nghiên cứu trên thế giới, sản phẩm PCR cho gen dbat
và bapt có thích thước dao động. Kích thước gen bapt thu nhận được thường
dao động từ 450 - 600 bp, trong khi đó gen dbat có kích thước nằm trong
khoảng 153 - 650 bp. Trong nghiên cứu này, gen dbat, bapt từ 4 chủng nấm
tiềm năng được khuếch đại thành công với kích thước đạt 550 bp và 500 bp.
Sự khác biệt này phụ thuộc vào trình tự mồi thiết kế và kích thước đoạn gen
bapt trên chromosome của chủng vi nấm. Những phát hiện này như một minh
chứng quan trọng cho quá trình sinh tổng hợp paclitaxel được di truyền về
mặt di truyền. Sự hiện diện của gen dbat hoặc bapt trong vi nấm nội sinh có
thể kết luận rằng chúng có các enzym độc lập chịu trách nhiệm sinh tổng hợp
paclitaxel. Sự vắng mặt của gen ts có thể do tiến hoá di truyền vi nấm dẫn đến
sự hình thành con đường sinh tổng hợp khác tạo tiền chất taxa-4(5),11(12)-
diene.

37
3.5. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI
NẤM NỘI SINH TQF6, TQF25, TDF6, TDF7
3.5.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và cuống sinh bào
tử của các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn
Quan sát hình thái cho thấy, các khuẩn lạc của chủng TQF6 phát triển
mạnh trên môi trường thạch PDA với tốc độ tăng trưởng 2,5 ± 0,15 cm/ ngày
và đạt tới 9,0 cm sau 3-4 ngày. Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng đến trắng đục
chuyển sang màu xám đen sau khi già đi, dày vừa phải, sợi nấm có độ dày đặc
không đều, mặt sau màu trắng sang màu vàng nhạt (Hình 3.7a,b). Bào tử hình
elip có đỉnh tròn và đáy phẳng, đơn bào, bào tử già trở thành không màu có
1–2 ngăn, hoặc màu nâu nhạt với tế bào giữa và sẫm hơn tế bào ở đầu tận
cùng của sợi nấm (Hình 3.7c). Dựa vào đặc điểm hình thái tế bào và mô tả
của Crous và Phillips (2006), chủng TQF6 nhiều khả năng thuộc chi
Neofusicoccum.
Khuẩn lạc TQF25 sau khi nuôi cấy trên PDA ở 28°C có tốc độ tăng
trưởng đạt 1,9 ± 0,12 cm/ngày và đạt tới 9,0 cm sau 4-5 ngày. Khuẩn lạc ban
đầu có màu hơi trắng chưa hình thành bào tử; sau chuyển dần màu nâu nhạt
và hình thành bào tử. Mặt sau màu vàng nâu đậm ở trung tâm (Hình 3.7d,e).
Sợi nấm mịn như nhung. Cuống sinh bào tử đơn bội dạng chổi phân nhánh về
phía đỉnh; bào tử elip hoặc hình trứng có màu nâu nhạt đến nâu (Hình 3.7f).
Dựa theo phân tích hình thái và mô tả của Lee và Whalley (2000), chủng vi
nấm TQF25 được phân loại thuộc chi Hypoxylon.
Khuẩn lạc chủng TDF6 phát triển nhanh trên môi trường thạch PDA
với tốc độ tăng trưởng 1,5 ± 0,15 cm/ ngày và đạt tới 9,0 cm sau 6 -7 ngày.
Sợi nấm phát triển mạnh và ăn đều từ tâm ra xung quanh. Sợi nấm ban đầu có
màu trắng hơi ngả hồng, dạng sợi bông xốp. Mặt sau khuẩn lạc có màu hồng
nhạt (Hình 3.8a,b). Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần đỉnh
sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, bào tử trần hình bầu dục (Hình 3.8c). Dựa
theo phân tích hình thái và mô tả của Booth (1971), chủng TDF6 được phân
loại thuộc chi Fusarium.

38
Hình 3.7. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử dưới
kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TQF6 (a, b, c) và
TQF25 (d, e, f)
Hình 3.8. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử dưới
kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TDF6 (a, b, c) và
TDF7 (d, e, f)
Khuẩn lạc chủng TDF7 phát triển nhanh trên môi trường thạch PDA
với tốc độ tăng trưởng 1,4 ± 0,17 cm/ ngày và đạt tới 9,0 cm sau 6 -7 ngày.
Sợi nấm phát triển mạnh và ăn đều từ tâm ra xung quanh. Sợi nấm ban đầu có
màu trắng sau chuyển hồng tím nhạt, dạng sợi bông xốp. Mặt sau khuẩn lạc
có màu hồng nhạt (Hình 3.8d,e). Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh,

39
phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, bào tử trần hình bầu dục (Hình
3.8f). Hình thái sợi, bào tử và cuống sinh bào tử khẳng định chủng TDF7 có
đặc điểm giống với chủng Fusarium sp. TDF6 ở trên và được định danh tạm
thời là Fusarium sp. TDF7.
3.5.2. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn bằng giải và phân
tích trình tự ITS
Để phân loại đến loài, trình tự ITS đã được khuếch đại và phân tích về
độ tương đồng trình tự với các trình tự trên cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng công
cụ BLAST. Ở hình 3.9, các sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS có băng
sáng, rõ nét với kích thước khoảng 550 - 600 bp. Sản phẩm PCR được tinh
sạch và gửi đến First BASE Laboratories Sdn. Bhd. (Malaysia) để giải trình
tự.
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS trên gel agarose 1,0%.
Giếng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm
Phân tích trình tự ITS cho thấy chủng TQF6 có độ tương đồng cao với
các chủng vi nấm Neofusicoccum italicum MFLUCC 15-0900 (99,17%), N.
ningerense CGMCC 3.20078 (97,69%) và N. magniconidium CGMCC
3.20077 (97,5%) (Bảng 3.2). Quan sát cây phát sinh loài cho thấy, chủng
TQF6 có quan hệ gần với các chủng thuộc loài N. italicum (Hình 3.10). Dựa
vào kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, đặc điểm bào tử và phân tích
trình tự gen ITS, chủng TQF6 được định danh là Neofusicoccum italicum
TQF6. Neofusicoccum là chi nấm thuộc họ Botryosphaeriaceae sinh trưởng ở
mạch gỗ và gây bệnh đóng vảy và chết ở các cây thân gỗ trên toàn thế giới,

40
đặc biệt cây nho và bạch đàn. Chất neofusnaphthoquinone B thuộc nhóm
naphthoquinone tách chiết từ vi nấm Neofusicoccum australe có hoạt tính ức
chế MRSA mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 16 µg/mL [69]. Ngoài
ra, một số các hợp chất có hoạt tính sinh học như kháng sinh, kháng tế bào
ung thư, chống tăng sinh tế bào ung thư máu đã được tách chiết từ dịch lên
men chủng N. australe như myrtucommulones, naphthalenones,
cyclobotryoxides, Melleins [70]. Tuy nhiên, các chất gây độc tế bào ung thư
từ chủng N. australe có hoạt tính thấp và chưa có nghiên cứu khả năng sinh
paclitaxel của loài này.
Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự ITS cho thấy chủng TQF25
có độ tương đồng thấp với các chủng nấm tham khảo thuộc chi Hypoxylon:
H. griseobrunneum CBS 331.73 (91,22%), H. liviae CBS 115282 (87,61%)
và H. papillatum ATCC 58729 (87,3%). Quan sát cây phát sinh loài cho thấy,
chủng vi nấm H. griseobrunneum và H. liviae CBS 115282 tạo nhóm riêng
biệt với chủng TQF25 (Bảng 3.3; Hình. 3.10). Do vậy, chủng TQF25 được
định danh là Hypoxylon sp. TQF25. Chi Hypoxylon thuộc ngành Ascomycota
được nhà sinh vật học Carlos Spegazzini phát hiện vào từ năm 1880 – 1922.
Hypoxylon là chi lớn nhất với hơn 200 loài được định danh. Do vậy, để phân
loại đến loài cần những nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm hình thái như: bào tử
ngoài, thành bào tử, sắc tố, khe mầm. Kết hợp với đặc điểm hình thái, phương
pháp sinh học phân tử dựa trên trình tự gen β-tubulin cần được bổ sung bên
cạnh trình tự ITS [71]. Hypoxylon được biết đến với khả năng sản xuất một
loạt các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học như kháng nấm, gây độc tế
bào, tiêu diệt côn trùng, kháng khuẩn và các hợp chất phytotoxic [72]. Bốn
hợp chất azaphilones mới là ultiformins A-D phân lập từ H. multiforme được
báo cáo có khả năng kháng khuẩn rất mạnh. Năm 2007, hai chất mới
daldinone A và C được tách chiết từ H. truncatum IFB-18 phân lập từ cây
thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư
SW1116 với giá trị MIC đạt 49.5 và 41 µM. Hiện chưa có công bố nào đánh
giá khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 và A-549 cũng như sinh
paclitaxel từ chi trên. Do chủng nấm TQF25 chứa 2 gen chính tham gia sinh
tổng hợp paclitaxel nên đánh giá khả năng sinh paclitaxel là hướng đi đầy hứa
hẹn trong tương lai.

41
Bảng 3.2. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF6 với các chủng tham chiếu
Chủng TQF6
N. italicum MFLUCC
15-0900 (NR_168164)
N. microconidium
CGMCC 3.18750
(NR_161003)
N. ningerense
CGMCC 3.20078
(NR_172860)
N. magniconidium
CGMCC 3.20077
(NR_172859)
N. grevilleae
CPC 16999
(NR_168143)
TQF6 100,00 97,26 97,12 98,06 97,86 97,70
N. italicum
MFLUCC 15-0900
(NR_168164)
97,26 100,00 94,76 95,67 95,47 94,86
N. microconidium
CGMCC 3.18750
(NR_161003)
97,12 94,76 100,00 98,38 98,02 96,95
N. ningerense
CGMCC 3.20078
(NR_172860)
98,06 95,67 98,38 100,00 99,64 96,75
N. magniconidium
CGMCC 3.20077
(NR_172859)
97,86 95,47 98,02 99,64 100,00 96,38
N. grevilleae CPC
16999 (NR_168143)
97,70 94,86 96,95 96,75 96,38 100,00

42
Bảng 3.3. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF25 với các chủng tham chiếu
Chủng TQF25
H. griseobrunneum
CBS 331.73
(NR_155184)
H. bellicolor
UCH 9543
(NR_169971)
H. neosublenormandii
MFLU 15-1193
(NR_155174)
H. liviae CBS
115282
(NR155154)
H. papillatum
ATCC 58729
(NR155153)
TQF25 100,00 84,02 75,20 75,47 78,11 76,76
H. griseobrunneum
CBS 331.73
(NR_155184)
84,02 100 77,69 79,07 80,40 81,72
H. bellicolor UCH
9543 (NR_169971)
75,2 77,69 100 81,35 81,79 82,19
H. neosublenormandii
MFLU 15-1193
(NR_155174)
75,47 79,07 81,35 100 77,03 79,06
H. liviae CBS 115282
(NR_155154)
78,11 80,40 81,79 77,03 100 85,97
H. papillatum ATCC
58729 (NR_155153)
76,76 81,72 82,19 79,06 85,97 100

43
Bảng 3.4. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF6 với các chủng tham chiếu
Chủng TDF6
F. foetens CBS
110286
(NR_15986)
F. inflexum
NRRL 20433
(NR_152941)
F. bactridioides
CBS 100057
(NR_120262)
F. circinatum
CBS 405.97
(NR_120263)
F. pseudocircinatum
CBS 449.97
(NR_163683)
TDF6 100,00 99,58 98,92 98,95 99,16 98,92
F. foetens CBS
110286
(NR_159865)
99,58 100,00 95,99 95,69 95,88 95,59
F. inflexum NRRL
20433 (NR_152941)
98,92 95,99 100,00 98,46 98,65 98,40
F. bactridioides CBS
100057
(NR_120262)
98,95 95,69 98,46 100,00 99,82 99,60
F. circinatum CBS
405.97 (NR_120263)
99,16 95,88 98,65 99,82 100,00 99,80
F. pseudocircinatum
CBS 449.97
(NR_163683)
98,92 95,59 98,40 99,60 99,80 100,00

44
Bảng 3.5. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF7 với các chủng tham chiếu
Chủng TDF7
F. foetens
CBS 110286
(NR_15985)
F. inflexum
NRRL 20433
(NR_152941)
F. pseudoanthophilum
CBS 414.97
(NR_163682)
F. circinatum
CBS 405.97
(NR_120263)
F. bactridioides
CBS 100057
(NR_120262)
TDF7 100,00 92,95 89,92 88,91 87,96 87,80
F. foetens CBS 110286
(NR_159865)
92,95 100,00 95,99 95,50 95,88 95,69
F. inflexum NRRL
20433 (NR_152941)
89,92 95,99 100,00 98,27 98,65 98,46
F. pseudoanthophilum
CBS 414.97
(NR_163682)
88,91 95,50 98,27 100,00 99,63 99,45
F. circinatum CBS
405.97 (NR_120263)
87,96 95,88 98,65 99,63 100,00 99,82
F. bactridioides CBS
100057 (NR_120262)
87,80 95,69 98,46 99,45 99,82 100,00

Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis).pdf

Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis).pdf

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis).pdf

Similar to Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis).pdf (20)

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis).pdf