Nhận file miễn phí nhắn tin zalo 03838.288.54. Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
TRẦN THỊ THU HIỀN
NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ LOÀI GIỔI ĂN HẠT
(Micheliaspp.) Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI
VÀ PHÂN TỬ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
M SỐ 42 02 01
LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS VŨ QUANG NAM
2. PGS. TS BÙI VĂN THẮNG
Hà Nội – 2018

2. i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng
dẫn khoa học của giảng viên PGS.TS Vũ Quang Nam và PGS.TS Bùi Văn
Thắng – Viện Công nghệ sinh học trường Đại học Lâm nghiệp. Các nội dung
nghiên cứu, kết quả nêu trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác.
Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài
liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ.
Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kì công trình nghiên
cứu nào khác đã được công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ
kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa học.
N i g y 6 th g 8
Người cam đoan
Trần Thị Thu Hiền

3. ii
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Lâm
nghiệp, bản thân tôi đã l nh hội được rất nhiều kiến thức qu báu và nhận
được sự quan tâm, giúp đ từ phía nhà trường, gia đình và bạn b đồng
nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm n chân thành nhất đến toàn th qu Thầy Cô giáo
trong, ngoài nhà trường, đến gia đình, bạn b và đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đ ,
tạo điều kiện về vật chất, tinh thần cho tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Luận văn tốt nghiệp này được sự hỗ trợ về mọi phư ng diện từ đề tài
nghiên cứu khoa học c bản, được sự tài trợ của Quỹ Phát tri n khoa học và
công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), giai đoạn 2017 – 2020, Mã số: 106.03–
2017.16 do PGS.TS Vũ Quang Nam làm Chủ trì với tên “Nghiên cứu giám
định các loài Giổi hạt ở Việt Nam (Michelia spp.) bằ g phươ g ph p hì h
thái, phân tử v si h th i”. Tôi xin chân thành cảm n sự giúp đ qu báu đó!
Tôi xin bày tỏ lòng biết n sâu sắc tới các giáo viên hướng dẫn:
PGS.TS Vũ Quang Nam và PGS.TS Bùi Văn Thắng – Viện Công nghệ sinh
học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo
mọi điều kiện thuận lợi giúp đ tôi từ khi hình thành tưởng, trong quá trình
thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này. Đặc biệt, tôi xin cảm
n các cô giáo Th.S Nguyễn Thị Hải Hà và cô giáo Th.S Nguyễn Thị Th của
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện thí
nghiệm phân tử, phân tích số liệu đ bản luận văn được hoàn thành.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học
của tôi chắc h n không tránh khỏi nh ng thiếu sót. Kính mong nhận được sự
đóng góp kiến của qu Thầy Cô giáo, bạn b đồng nghiệp đ đề tài nghiên
cứu khoa học của tôi được hoàn thiện h n.
Tôi xin trân trọng cảm n!
N i g y 6 th g 8
Học vi n
Trần Thị Thu Hiền

4. iii
MỤC LỤC
Trang
TRANG PHỤ BÌA
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................i
LỜI CẢM ƠN..................................................................................................ii
MỤC LỤC.......................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH.............................................................................vii
Đ T VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU.................................................... 4
1.1. Khái quát về đối tượng nghiên cứu............................................................ 4
Ng (Magnoliaceae).................................................................. 4
h h Ng (Magnolioideae)……………………………………5
1.1.3. Chi iổi (Michelia L.)............................................................................. 6
4 Lo i iổi hạt (Michelia spp.)............................................................. 7
1.2. Tổng quan về DNA mã vạch (DNA barcode)..........................................12
iới thiệu về DNA ã vạ h ..................................................................12
C đặ điể ơ bả ủ trì h tự DNA ã vạ h……………………..14
3 M t số o us đượ sử dụ g tro g phươ g ph p DNA ã vạ h ở thự vật ..16
1.3. Một số DNA mã vạch được sử dụng trong nghiên cứu ở thực vật..........19
1.4. Một số thành tựu nghiên cứu về DNA mã vạch ở thực vật .....................24
1.5. Một số nghiên cứu về các loài Giổi ăn hạt...............................................25
5 M t số ghiê ứu ở go i ướ ……………………………………...25
5 M t số ghiê ứu tại Việt N ............................................................26

5. iv
Chƣơng 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................30
2.1. Nội dung nghiên cứu................................................................................30
2.2. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................30
2.3. Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu..................................31
2.3 ó hất................................................................................................31
2.3.2. Các thiết bị sử dụ g tro g ghiê ứu..................................................32
2.4. Phư ng pháp nghiên cứu..........................................................................33
2.4 hươ g ph p ghiê ứu hì h th i v vị trí ph oại.........................33
2.4 hươ g ph p ghiê ứu ph tử.........................................................34
Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................39
3.1. Kết quả nghiên cứu giám định các loài Giổi ăn hạt.................................39
3.1.1. Về ph oại v hệ thố g h thự vật hi iổi. ………………………39
3.1.2. Đặ trư g ơ bả về hì h th i ủ o i tro g hi iổi..………… 42
3.1.3. Đặ điể hì h th i ơ bả ủ o i iổi hạt……………………42
3.1.4. Khóa tra phân loại cho m t số loài Giổi ở Việt Nam...........................52
3.2. Kết quả nghiên cứu giám định các loài Giổi ăn hạt bằng chỉ thị phân tử 53
3.2.1. Kết quả x đị h đoạ DNA ã vạ h ủ o i iổi hạt 53
3.2.2. X đị h v ph tí h trì h tự u eotide ủ đoạ DNA ã vạ h .....58
3.2.3 X y dự g y ph t si h hủ g oại.......................................................67
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................71
1. Kết luận .......................................................................................................71
2. Kiến nghị.....................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO

6. v
DANH MỤC BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Viết đầy đủ
Bp base pair
CBOL Consortium for the Barcode of Life
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
ITS Internal Transcribed Spacer
kb kilobase
NCBI National Centre for Biotechnology Information
PCR Polymerase Chain Reaction
PVP Polyvinyl pyrrolidone
rDNA ribosome deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
Rnase Ribonuclease
RUBISCO. Rubilose – 1,5 – bisphosphate cacboxylase/oxygenase
SDS Sodium dodecyl sulphate
TAE Tris – Acetic acid – EDTA
TE Tris – Ethylenediaminetetraacetic acid
UV Ultra Violet
v/p vòng/phút
VNTR Variable number tandem repeat
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms
LSC Large single – copy region
SSC Small single – copy region

7. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
TT T n bảng Trang
1.1 Phân bố một số loài thuộc chi Giổi ở Việt Nam 9
2.1 Các mẫu Giổi ăn hạt ở Việt Nam trong nghiên cứu 30
2.2 Thành phần đệm tách A 31
2.3 Thành phần đệm tách B 32
2.4 Thành phần đệm TE (TE Buffer) 32
2.5 Trình tự và thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu 36
2.6 Thành phần một phản ứng PCR 36
2.7 Chu kỳ phản ứng PCR 37
3.1 Kết quả đo hàm lượng và độ sạch các mẫu DNA tổng số 54
3.2
Trình tự nucleotide của gen atpB – rbcL phân lập từ các mẫu Giổi
ăn hạt
59
3.3
Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen atpB – rbcL của các
mẫu Giổi ăn hạt với trình tự nucoleotide gen atpB – rbcL của loài
Michelia alba với mã số trên Genbank là AB623323.1
61
3.4
Trình tự nucleotide của gen trnH – psbA phân lập từ các mẫu Giổi
ăn hạt
62
3.5
Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnH – psbA của các
mẫu Giổi ăn hạt nghiên cứu với trình tự nucoleotide gen trnH –
psbA của loài Magnolia insignis (KY921716.1)
63
3.6
Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnL intron của các
mẫu Giổi ăn hạt với trình tự nucoleotide gen trnL intron của các loài
Michelia champaca (AY009041.1), Michelia baillonii
(AY009042.1), Magnolia laevifolia (MF583748.1)
64
3.7
So sánh trình tự nucleotide của gen trnL – trnF của các mẫu Giổi ăn
hạt nghiên cứu
66

8. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
TT Tên hình Trang
1.1 Cây Giổi xanh trong rừng tự nhiên ở Kon Hà Nừng Gia Lai 10
3.1A
Một phần cây Phylogeny hình thái th hiện mối quan hệ phát sinh
của các loài Michelia
41
3.1B
Một phần cây Phylogeny phân tử (ndhF sequences) th hiện
mối quan hệ phát sinh của các loài Michelia
41
3.2 Cành mang hoa của loài Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis) 42
3.3 Một số đặc trưng hình thái ở chi Michelia L. 43
3.4A
Hình thái lá và lá non trong chồi búp ở các loài thuộc chi
Michelia L.
44
3.4B
Một số đặc trưng hình thái của vết sẹo ở các loài thuộc chi
Michelia L.
44
3.5 Giản đồ về sự phát sinh chồi cành syllepsis và prolepsis 45
3.6 Hình thái c quan sinh sản ở các loài thuộc chi Michelia 46
3.7 Hình thái loài Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis A.Chev) 49
3.8
Đặc đi m hình thái của bộ nhụy hoa và quả của một số loài
Giổi ăn hạt
53
3.9
DNA tổng số của mẫu Giổi ăn hạt tách chiết được điện di trên
gel agarose 1%
54
3.10
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen atpB – rbcL được điện di trên
gel agarose 1%
55
3.11
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnH – psb A được điện di trên
gel agarose 1%
56
3.12
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL intron được điện di trên
gel agarose 1%
57

9. viii
3.13
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL – trn F được điện di trên
gel agarose 1%
58
3.14
Cây phân loại dựa trên đoạn gen atpB – rbcL xây dựng bằng
MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining)
67
3.15
Cây phân loại dựa trên đoạn gen trnH – psbA xây dựng bằng
MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining)
68
3.16
Cây phân loại dựa trên đoạn gen trnL intron xây dựng bằng
MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining)
69
3.17
Cây phân loại dựa trên đoạn gen trnL – trnF xây dựng bằng
MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining)
39

10. 1
Đ T VẤN ĐỀ
1. Lí do chọn đề tài
Đất nước Việt Nam nổi tiếng với rất nhiều hệ sinh thái cùng môi trường
sống đa dạng, được thiên nhiên ưu đãi bởi có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm gió
mùa, đất đai màu m , là n i có điều kiện tự nhiên và khí hậu rất thích hợp cho
nhiều loài cây cối phát tri n. Một quốc gia có hệ thực vật vô cùng phong phú
và mang lại nhiều giá trị kinh tế cao, trong đó có loài Giổi ăn hạt, một trong
nh ng loài cây mang nhiều giá trị không chỉ trong nghiên cứu khoa học mà cả
trong thực tiễn đời sống.
Loài Giổi ăn hạt đã được đề cập đến trong một số tài liệu về phân loại
thực vật, về cây thuốc, về cây lâm đặc sản,... Trong các tài liệu đó, chúng
được nhắc đến là loài có phân bố ở các khu vực miền núi phía Bắc như các
tỉnh: Hòa Bình, Phú Thọ, V nh Phúc, Tuyên Quang, Hà T nh và một số tỉnh
khác ở Việt Nam. Loài Giổi ăn hạt cũng là một trong nh ng loài cây được
một số c quan tổ chức đã và đang nghiên cứu phát tri n bảo tồn như: Vườn
quốc gia Bến En (Thanh Hóa), Vườn quốc gia Xuân S n (Phú Thọ), Vườn
quốc gia Tam Đảo (V nh Phúc) hay Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Hòa
Bình, v.v… Từ nh ng nghiên cứu trên, cộng thêm các thông tin từ các tài liệu
liên quan đã chỉ ra rằng Giổi ăn hạt là loài có giá trị, có th dùng làm thuốc và
gia vị, đã và đang được nghiên cứu, phát tri n. Tuy nhiên, nh ng nghiên cứu
hay sự phát tri n nguồn gen về loài Giổi vẫn dừng lại ở quy mô hẹp, chưa đưa
ra được nh ng khuyến cáo hoặc c sở khoa học cần thiết cho việc bảo tồn và
phát tri n nguồn gen quý của loài này trên quy mô rộng. H n thế n a, hầu hết
nguồn hạt Giổi hiện nay xuất phát từ một số hộ gia đình ở một số địa phư ng,
mang tính tự phát, nhỏ lẻ hoặc đến từ sự thu gom lẻ tẻ của một số bà con vùng
núi cao; trong khi đó nhu cầu về hạt Giổi ngày càng lớn.
Trong hầu hết các tài liệu chính thống hoặc không chính thống về thực

11. 2
vật hay trong báo cáo của các nghiên cứu về loài Giổi ăn hạt thì tên khoa học
và vị trí phân loại của chúng vẫn là vấn đề cần phải bàn luận và tiếp tục cần
nghiên cứu. Một câu hỏi đặt ra cần giải quyết là: Ở Việt Nam có bao nhiêu
loài Giổi mà hạt có th ăn được và làm gia vị được? Tên khoa học chính xác
của chúng ra sao? Vị trí của chúng trong hệ thống phân loại như thế nào? Đáp
án của các câu hỏi đó sẽ là tiền đề rất quan trọng cho khoa học và thực tiễn,
đ từ đó có th đưa ra được nh ng đề xuất hay khuyến nghị cho việc bảo tồn
và phát tri n nguồn gen của loài cây Giổi ăn hạt có giá trị này ở Việt Nam.
Ngày nay, cùng với sự phát tri n vượt bậc của công nghệ sinh học, sự
ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp ích rất nhiều trong quá trình
đánh giá mối quan hệ di truyền gi a các cá th , quần th hay các xuất xứ phân
loại một cách nhanh chóng, đặc biệt trong việc giám định các loài mà dựa trên
nh ng đặc đi m hình thái còn chưa chắc chắn hoặc chưa rõ, nhất là trong
trường hợp các mẫu vật thu được chỉ có cành lá mà không có hoa, quả, hạt.
Xuất phát từ lý luận và thực tiễn nói trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu giám định một số loài Giổi ăn hạt (Michelia spp.) ở Việt Nam bằng chỉ
thị hình thái và phân tử”. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp nh ng c sở d
liệu, chính xác về chỉ thị hình thái và phân tử, từ đó góp phần quan trọng
trong việc bảo tồn và phát tri n loài/các loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam.
2. Mục tiêu nghiên cứu
 Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu giám định được một số loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam dựa
trên chỉ thị hình thái và phân tử đ làm c sở khoa học cho việc bảo tồn và
phát tri n các loài cây này ở Việt Nam.
 Mục tiêu cụ thể
- Xác định được nh ng đặc đi m c bản về hình thái và vị trí phân loại
của một số loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam.

12. 3
- Xác định một số chỉ thị DNA mã vạch (DNA barcoding) của số loài
Giổi ăn hạt ở Việt Nam.
- Xây dựng cây phát sinh hình thái và cây phân loại dựa trên nh ng
đoạn gen phân lập từ các mẫu thu thập của loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghi n cứu
3.1. Đối tƣợng nghi n cứu
Nghiên cứu một số loài Giổi ăn hạt (Michelia spp.) ở Việt Nam
3.2. Phạm vi nghi n cứu
- Phạm vi nội dung
Đề tài tập trung nghiên cứu: Các đặc đi m hình thái, lập matrix, giải
trình tự một số vùng gen phân lập được, xác định một số chỉ thị DNA mã
vạch và xây dựng cây phát sinh chủng loại của một số loài Giổi ăn hạt ở Việt
Nam.
- Phạm vi thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2018
- Phạm vi không gian
- Đề tài nghiên cứu các mẫu Giổi ăn hạt thu thập tại một số khu vực ở
Việt Nam như: Hà Nội, Hòa Bình, Thanh Hóa, S n La, Điện Biên và Gia Lai.
- Đề tài được tiến hành thực hiện tại Viện CNSH Lâm nghiệp (Trường
Đại học Lâm nghiệp).
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong l nh
vực hóa phân tích các hợp chất tự nhiên, trong l nh vực Lâm nghiệp và quan
trọng là cung cấp nh ng c sở d liệu, chính xác về tên khoa học của các loài
Giổi ăn hạt ở Việt Nam, góp phần quan trọng trong việc đưa ra nh ng khuyến
nghị về việc bảo tồn và phát tri n loài/các loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam.

13. 4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. Khái quát về đối tƣợng nghi n cứu
. . . Ng c an (Magnoliaceae)
- Họ Ngọc lan (danh pháp khoa học: Magnoliaceae) là một họ thực vật
có hoa thuộc bộ Mộc lan (Magnoliales). Họ này bao gồm 2 phân họ đó là:
Phân họ Magnolioideae có chi Ngọc lan (Magnolia ) được biết đến nhiều nhất
và phân họ Liriodendroidae, một phân họ đ n ngành, có chi Liriodendron
(cây tulip cây hoàng dư ng hoặc cây áo cộc) [3
- Họ Ngọc lan là một họ cổ, các hóa thạch thực vật được xác định thuộc
về họ này có niên đại từ 80 đến 95 triệu năm. Các đặc đi m nguyên thủy của
họ Ngọc lan là các hoa lớn, hình dáng tựa như đài hoa và thiếu các đặc đi m
của cánh hoa hay đài hoa thực thụ. Các bộ phận lớn không chuyên biệt của
hoa, tư ng tự như cánh hoa, được gọi trong tiếng Anh là tepal. Không giống
như phần lớn thực vật hạt kín mà các bộ phận có hoa của chúng sắp xếp thành
vòng, các loài trong họ Ngọc lan có nhị và nhụy hoa sắp xếp thành hình xoắn
ốc trên đế hoa hình nón. Sự phân bổ như thế cũng được tìm thấy trong các
thực vật cổ hóa thạch và người ta tin rằng nó là c sở hay nguyên thủy cho
các loài thực vật hạt kín. Hoa của chúng cũng không có sự phân biệt rõ ràng
gi a lá đài và cánh hoa như hầu hết các loài thực vật có hoa tiến hóa muộn
h n; bộ phận "hai mục đích" này xuất hiện ở cả hai vị trí được biết đến như là
một phần của bao hoa. Họ Ngọc lan được công nhận có khoảng 225 loài trong
7 chi, mặc dù một số hệ thống phân loại đưa toàn bộ phân họ Magnoioideae
vào trong chi Magnolia. Sự phân bố của các loài thuộc họ này phổ biến ở miền
đông Bắc Mỹ, Mexico, Trung Mỹ, Tây Ấn, khu vực nhiệt đới Nam Mỹ, đông và
nam Ấn Độ, Sri Lanka, Đông Dư ng, Malaysia, Trung Quốc, Triều Tiên và Nhật
Bản. Họ Ngọc lan phần lớn có hoa lư ng tính (ngoại trừ Kmeria và một số

14. 5
loài Magnolia đoạn Gynopodium) trên đế hoa đối xứng. Cụm hoa đ n độc, hoa
sặc s với các lá đài và cánh hoa không th phân biệt, có mùi th m. Các lá đài
này nằm trong khoảng từ 6 tới nhiều nhị hoa với các chỉ nhị ngắn, phân dị
k m từ bao phấn. Lá noãn thường là nhiều, phân biệt nằm trên đế hoa thuôn
dài. Hình dạng lá đ n mọc so le, đôi khi xẻ thùy. Quả là dạng quả hợp từ
các quả đại thông thường bị p gần khi chúng chín và mở dọc theo bề mặt xa
trục. Hạt có vỏ dày cùi thịt màu đỏ, hay da cam (trừ Liriodendron). Hoa của
Magnoliaceae thụ phấn nhờ bọ cánh cứng, ngoại trừ Liriodendron nhờ ong.
Các lá noãn của hoa chi Ngọc lan rất dày đ tránh tổn thư ng do bọ cánh
cứng khi chúng đậu, bò và kiếm ăn trên đó. Hạt thường phát tán nhờ chim
trong khi hạt của chi Liriodendron phát tán nhờ gió. Do xuất hiện sớm nên sự
phân bố địa l của họ Ngọc lan trở thành rời rạc hay phân mảng do kết quả
của các sự kiện địa chất lớn như các thời kỳ băng hà, trôi dạt lục địa và kiến
tạo s n. Ki u phân bố này đã cô lập một số loài trong khi gi cho một số loài
chỉ ở gần nhau. Các loài còn sinh tồn của họ này phân bố rộng khắp trong
vùng ôn đới và nhiệt đới châu Á, từ Himalaya tới Nhật Bản và đông nam qua
Malaysia tới New Guinea. Châu Á là n i có khoảng 2 3 số loài trong họ Ngọc
lan phần còn lại trải rộng khắp châu Mỹ với các loài ôn đới phân bố từ miền
nam Hoa Kỳ và các loài nhiệt đới trải rộng từ Brasil tới Tây Ấn [8].
. . . hân h Ng c lan (Magnolioideae)
Phân họ Ngọc lan được phân loại theo hai tông [23].
* Tông Magnolieae
- Kmeria: có 5 loài (có th gộp trong chi Magnolia theo ngh a rộng)
- Magnolia: có 128 loài (theo ngh a hẹp). Nếu coi là chi theo ngh a
rộng sẽ chứa 218 loài.
- Manglietia: có 29 loài (có th gộp trong chi Magnolia ngh a rộng).
- Pachylarnax: có 2 loài (có th gộp trong chi Magnolia ngh a rộng).

15. 6
* Tông Michelieae
- Elmerrillia: có 4 loài (có th gộp trong chi Magnolia ngh a rộng).
- Michelia (gồm cả Paramichelia, Tsoongiodendron): có 49 loài (có th
gộp trong chi Magnolia ngh a rộng) [3 .
1.1.3. hi Giổi (Michelia)
Chi Giổi (Michelia L.) thuộc họ Mộc lan (Magnoliaceae), Chi này có
khoảng 50 loài cây thân gỗ và cây bụi thường xanh, có nguồn gốc ở miền
nhiệt đới và cận nhiệt đới của Nam Á và Đông Nam Á (miền Ấn Độ – Mã
Lai). Hình dạng, lá của chi Giổi tư ng tự chi Mộc lan (Magnolia), nhưng hoa
của chi Giổi mọc thành cụm gi a các nách lá, h n là mọc đ n ở đầu cành như
chi Mộc lan. Tên khoa học của chi này được đặt theo tên của một nhà thực vật
học người Firenze, Italy là Pietro Antonio Micheli (1679 – 1737) [23].
Joannis De Loureiro, một nhà truyền giáo và nhà tự nhiên học Bồ Đào
Nha, là người đầu tiên công bố các loài thuộc họ Ngọc lan ở Việt Nam. Trong
công trình Flora cochichinensis I (1790) ông đã mô tả 4 loài thuộc hai chi
Michelia và chi Liriodendron. Tiếp đó, năm 1907 trong tập 1 của bộ thực vật
chí đại cư ng Đông Dư ng (Flore Gesesneerale de L‟Indo - Chine) do
Lecomte, theo Finet A. Eva F. Gagnepain đã mô tả họ Ngọc lan (Magnoliaceae)
với 7 chi, 15 loài, một số loài thu mẫu tại Việt Nam trong đó chi Michelia gồm 4 loài:
Michelia figo Spreng (mẫu thu ở Nam Định) Michelia baviensis Finet et
Gagnepain (mẫu thu ở Ba Vì), Michelia champaca (mẫu thu ở Hà Nội) và
Michelia baillonii (Pierre) Finet et Gagn (mẫu thu ở campuchia). Chevalier
bổ sung vào họ Ngọc lan ở Việt Nam 2 loài mới là Talauma gioi và Michelia
tonkinensis. Dandy đã mô tả nhiều loài mới từ Châu Á, trong đó có 18 loài từ
Việt Nam, đặc biệt là có 11 loài thuộc chi Michelia là: Michelia balansae,
Michelia aenea, Michelia chapensis, Michelia tignifea, Michelia constricta,
Michelia subulife, Michelia ribundavar tonkinensis, Michelia hypolampra,

16. 7
Michelia mediocris, Michelia fulgens và Michelia masticata.
Tiếp đó, năm 1938, 1939 theo Gagnepain mô tả hai loài mới là
Michelia braianensis và Manglietia blaoensis đưa tổng số loài thuộc họ Ngọc
lan cho hệ thực vật Việt Nam đến năm 1939 là 3 chi và 39 loài, trong đó có 3
chi và 22 loài mới được mô tả. Đến năm 2003, trong danh lục các loài thực
vật Việt Nam [1] họ Ngọc lan được bổ sung thêm 1 chi Alcimandra và một loài
mới là Manglietia hainanensis Dandy. Như vậy, tại Việt Nam họ Magnoliaceae
có 9 chi, 46 loài, với chi Giổi có 18 loài và một thứ [7].
. .4. oài Giổi ăn hạt (Michelia spp.)
4 Vị trí ph oại o i iổi hạt
Theo danh pháp thực vật từ nh ng năm 1753, năm đầu tiên xuất hiện
công trình Species Plantarum của Carl Linnaeus. Sau đó các quy tắc về danh
pháp được kh ng định qua các hội nghị quốc tế về thực vật học trên thế giới,
bắt đầu từ hội nghị Paris (1867) trở đi cho tới ngày nay.
Loài Giổi ăn hạt(Michelia spp.) trong phân loại học thực vật loài này
thuộc chi Giổi (Michelia L.), thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), cụ th có vị
trí trong hệ thống phân loại như sau:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae)
Bộ Ngọc lan (Magnoliales)
Họ Ngọc lan (Magnoliaceae)
Chi Giổi (Michelia L.)
Loài Giổi ăn hạt (Michelia spp.)

17. 8
1.1.4.2. Sự ph bố ủ o i iổi hạt
* Trên thế giới
Trên thế giới Giổi ăn hạt là loài được mô tả lần đầu bởi nhà thực vật
học người Pháp Auguste Jean Baptiste Chevalier từ mẫu chuẩn thu được từ
tỉnh Tuyên Quang của Việt Nam tháng 5 năm 1918 và đến tháng 10 cùng năm
đó được công bố trên tạp chí Bulletin Economique (de l'Indochine). Loài Giổi
ăn hạt thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), có khoảng 300 loài phân bố chủ
yếu ở nhiệt đới và á nhiệt đới Bắc bán cầu, thường tập trung ở Đông Nam Á
và Đông Nam Mỹ. Giổi ăn hạt được phân bố chủ yếu ở các ki u rừng á nhiệt
đới thường xanh độ cao trên 700 – 1500 m. Loài Giổi ăn hạt thuộc chi
Giổi(Michelia L.) có nguồn gốc ở miền nhiệt đới và cận nhiệt đới của Nam Á
và Đông Nam Á, bao gồm cả miền nam Trung Quốc [23].
* Ở Việt N
Ở Việt Nam chi Giổi có khoảng 21 loài [15], các loài Giổi ăn hạt (Hình
1.1) được ghi nhận là cây bản địa của nước ta, phân bố rộng khắp từ Lào Cai
đến các tỉnh Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên [6 . Loài Giổi ăn hạt tập trung
nhiều ở các tỉnh phía Bắc như: Lào Cai, Yên Bái, Phú Thọ, Tuyên Quang,
Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà T nh, Điện Biên, Gia Lai, và Kon Tum
[22]. Giổi ăn hạt là loài cây gỗ đa tác dụng, toàn bộ thân cây, cành, lá, rễ, hoa
quả và hạt đều có giá trị, đặc biệt là hạt Giổi có mùi th m đặc trưng, có chứa
tinh dầu và là loại gia vị truyền thống, nhất là nhân dân vùng núi phía Bắc
(cùng với hạt cây Mắc kh n, giống như hạt tiêu ở các tỉnh phía Nam); hạt còn
được dùng làm thuốc ch a đau bụng, xoa bóp khi đau nhức, tê thấp; vỏ cây
dùng làm thuốc ch a sốt, ăn uống không tiêu …[14].
Theo nghiên cứu hiện nay, ở Việt Nam có nhiều loài thuộc chi Giổi đã được
công nhận và trình bày cụ th trong bảng sau: (bảng 1.1).

18. 9
Bảng 1.1. Phân bố một số loài thuộc chi Giổi ở Việt Nam [70]
STT T n khoa học T n địa phƣơng Tình hình phân bố
1
Michelia balansae
(A.DC) Dandy
Giổi lông, Giổi bà
Yên Bái, Hà Giang, Tuyên
Quang, Phú Thọ, V nh
Phúc, Hà Nội, Thanh Hoá
Nghệ An, Quảng Bình...
2 Michelia braianensis
Gagnep.
Giổi nhung Gia Lai, Đắk Nông,
Lâm Đồng…
3 Michelia citrata (Noot.
& Chalermglin) Q. N.
Vu & N. H Xia
Giổi chanh, Giổi
xanh quả to
Hà Giang, Gia Lai,
Lâm Đồng...
4 Michelia foribunda
Finet & Gagnep.
Giổi nhiều hoa Hà Giang, Lào Cai,
Lâm Đồng…
5 Michelia foveolata
Merril ex Dandy
Giổi lá láng Hà Nội, S n La, Lào Cai,
Yên Bái, Hà Giang, Huế…
6 Michelia fulva HungT.
Chang & B. L. Chen
Giổi lông hung Hà Giang, Cao Bằng, Huế,
Đà Nẵng…
7 Michelia lacei
W.W.Smith
Giổi quản hoa Lào Cai, Hà Giang…
8 Michelia macclurei
Dandy
Giổi tàu V nh Phúc, Quảng Ninh,
Lâm Đồng, Gia Lai…
9 Michelia martinii Giổi martin
Lào Cai, Tuyên Quang,
Quảng Bình, Cao Bằng,
S n La…
10 Michelia masticata
Dandy
Giổi mastica Đui Tuyên Quang, Bắc Kạn,
Hoà Bình, Điện Biên, Hà
Giang, Quảng Bình…
11 Michelia mediocris
Dandy
Giổi xanh Hà Nội, Hoà Bình,
Hà Giang…
12 Michelia coriacea
(Hung T. Chang &
B.L. Chen)
Giổi lá dai Cao Bằng, S n La,
Hà Giang...
13 Michelia champaca Hoàng ngọc lan Hà Nội, Đà Lạt…

19. 10
1.1.4.3. i trị ki h tế kho h v bảo tồ ủ loài Giổi hạt
- Giổi ăn hạt là loài cây lâm sản ngoài gỗ đặc h u của Việt Nam. Giổi
thuộc loại cây thân gỗ lớn (Hình 1.1), cây trưởng thành có th cao h n 30m,
đường kính thân cây tới h n 1m. Thân cây th ng tắp, tròn đều, phân cành cao,
gỗ có mùi th m, có giác lõi phân biệt: giác màu vàng nhạt và lõi vàng nâu,
thớ gỗ mịn, có vân đẹp, sắc n t, không cong vênh, ít bị mối mọt, gỗ nhẹ (th
tích 580 kg/m3
gỗ khô) và khá bền. Chính vì thế gỗ Giổi được nhân dân ưa
chuộng dùng trong xây dựng nhà cửa (làm nhà gỗ, sàn gỗ), đóng đồ đạc nội
thất hay làm nh ng sản phẩm mỹ nghệ… [10].
Hình 1.1 Cây Giổi xanh trong rừng tự nhi n ở Kon Hà Nừng tỉnh Gia Lai
- Hiện nay, số lượng loài Giổi ăn hạt trong tự nhiên đã bị giảm sút
rất nhiều vì bị khai thác, chặt đ lấy gỗ. Do vậy cần đưa loài Giổi ăn hạt thành
một loài cây gỗ bản địa chính trong công tác trồng rừng ở một số vùng, đặc
biệt là vùng Trung tâm Bắc Bộ và Bắc Trường S n [6, 10].
- Gỗ Giổi qu như vậy nhưng thứ quý nhất của loài Giổi sở h u giá trị
kinh tế cao nhất lại là hạt Giổi, được mệnh danh là “vàng đen” hay “gia vị
vàng” của núi rừng Tây Bắc. Cây Giổi càng lâu năm sẽ cho càng nhiều hạt và
hạt càng th m ngon. Quả Giổi khi chín sẽ bung ra cho nh ng hạt Giổi chín đỏ
căng mọng. Hạt Giổi khi đem ph i khô chuy n sang màu cánh gián hoặc đen

20. 11
bóng. Hạt Giổi khô được sử dụng chủ yếu làm gia vị tư ng tự như ta dùng hạt
tiêu (nhưng th m h n rất nhiều), hay thảo quả Sa Pa (nhưng không hắc), hay
hạt mắc khén của người Thái (nhưng ngon h n)… Người ta có th thu hạt
Giổi trực tiếp trên cây hoặc hạt rụng trên mặt đất rừng dưới tán cây mẹ. Hạt
thu về đãi sạch lớp nội nhũ bao quanh, bảo quản hạt trong điều kiện khô. Nếu
dùng trong gia đình thường cho vào ống tre và đ n i khô ráo, khi ăn mang
hạt ra giã nát, có th trộn với muối đ chấm hoặc rắc lên thức ăn như hạt tiêu.
Hạt Giổi là một gia vị tuyệt vời trong các món ăn mang hư ng vị truyền thống
mà chỉ đến vùng núi phía Bắc ta mới được thưởng thức loại gia vị này.
- Mặt khác, hạt Giổi có chứa tinh dầu, năm 1997 theo phân tích của
Nguyễn Xuân Dũng thì trong tinh dầu từ thịt quả và hạt có chứa safrol: 70,2%
(thịt quả) – 72,9% (hạt) và methyl eugenol: 24,2% (thịt quả) – 18,5% (hạt).
Tinh dầu ở thân chủ yếu chứa camphor 23,8% và ngoài vỏ thân chứa camphor
15,7%, safrol 14,3%, α – caryophyllen 15,6% và elemicin 13,7% [22].
Đánh giá về tiềm năng thị trường của loài Giổi ăn hạt, theo nghiên cứu
về cây giống Lâm nghiệp cho rằng sản lượng, giá trị và nhu cầu sử dụng hạt
Giổi ngày càng tăng lên nhanh chóng trong thời gian vừa qua bởi chúng cung
cấp nguồn dược liệu và thực phẩm gi vai trò quan trọng trong sản xuất và
đời sống thực tiễn. Qua đó một lần n a có th kh ng định giá trị kinh tế của
loài cây Giổi ăn hạt là rất cao, có th coi đây là một trong nh ng loài cây Lâm
nghiệp có tiềm năng rất lớn vừa mang lại hiệu quả kinh tế cao vừa giúp xóa
đói giảm ngh o cho người dân khu vực miền núi phía Bắc [14].
1.2. Tổng quan về DNA mã vạch (DNA barcode)
. . . Giới thiệu về DNA mã vạch
Nghiên cứu về giới thực vật thì phư ng pháp phân loại thực vật dựa
trên nh ng đặc đi m hình thái từ lâu đã chứng minh được vai trò quan trọng
làm nền tảng cho các nghiên cứu về sinh thái, tiến hóa và đa dạng. Phân loại

21. 12
thực vật căn cứ vào hình thái thì chủ yếu dựa vào sự khác biệt về các đặc
đi m của các c quan, bộ phận đặc biệt là c quan sinh sản của thực vật, đây
là cách thức phân loại truyền thống đã được xây dựng và phát tri n từ rất xưa
cho tới ngày nay. Tuy nhiên, thực tế đã cho thấy nếu chỉ dựa trên hình thái
chưa phải là phư ng pháp tối ưu trong việc phân loại các mẫu đang trong giai
đoạn phát tri n, các mẫu có đặc đi m giống nhau do hiện tượng tiến hóa đồng
quy, hay các mẫu không có đủ các bộ phận [13]. Thậm chí hiện nay phư ng
pháp phân loại hình thái thường chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia về
hình thái học, việc phân loại đôi khi tốn nhiều thời gian và công sức [42].
Một phư ng pháp phân loại mới dựa trên l nh vực sinh học phân tử đã
được ra đời từ gi a nh ng năm 1990, đã khắc phục nh ng hạn chế của
phư ng pháp phân loại thực vật dựa trên hình thái được gọi với thuật ng
“DNA mã vạch” lần đầu tiên được sử dụng vào nh ng năm 1993. Đó là
phư ng pháp dựa trên các d liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân
(hay DNA) hoặc sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng
nghiên cứu, người ta có th lựa chọn các gen hoặc các sản phẩm khác nhau
của hệ gen [67].
Trong phư ng pháp phân loại sinh học phân tử, các kỹ thuật thường
được ứng dụng đ nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa
gi a các loài, xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng như giúp nhận dạng đến
cấp phân loại chi hoặc loài. Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trên thế
giới như VNTR (số lượng thay đổi các chuỗi lặp lại liền kề), RFLP (đa hình
độ dài đoạn cắt hạn chế), DNA barcode (DNA mã vạch) [49].
Thực tiễn đã chứng minh DNA mã vạch bắt đầu có tầm ảnh hưởng từ
nh ng năm 2002 nghiên cứu của Hebert và cs, kết quả của nhóm nghiên cứu
đã chỉ ra rằng các cá th từ bộ sưu tập của 200 loài có quan hệ gần gũi với
nhau thuộc bộ cánh vảy có th xác định với độ chính xác 100% bằng cách sử

22. 13
dụng gen ty th cytochrome c oxidase ti u đ n vị I (COI) (enzyme cuối cùng
trong đường hô hấp chuỗi vận chuy n của ty th , màng) [69, 71].
DNA mã vạch là trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn, có cùng
nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và vùng thay
đổi theo quá trình tiến hóa [42, 52]. Ngoài ra, việc lựa chọn một vùng trình tự
làm mã vạch còn cần phải mang nh ng đặc đi m sau: có độ dài thích hợp
(không quá ngắn đ có độ đa hình về trình tự gi a các taxon, không quá dài đ
có th giải trình tự theo cách thông thường, thậm c hí cả khi trong điều kiện
chưa được tối ưu), không phải vùng dị hợp đ có th nhân bản trực tiếp trình tự
mà không cần tách dòng và thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị trí
khác biệt gi a các base và không có đoạn trình tự chưa chắc chắn như một vài
đoạn lặp microsatellite làm giảm chất lượng trình tự [44].
Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự DNA đ đánh giá sự sai khác di
truyền gi a các sinh vật, tư ng tự như máy quét mã vạch trong siêu thị. Hai
mẫu vật của hai loài có th có hình thái bên ngoài rất giống nhau, song chúng
có th được phân biệt bằng sử dụng DNA mã vạch. Do đó, DNA mã vạch có
th được sử dụng cho hai mục đích chính: nhận dạng về mặt phân tử cho các
loài đã được mô tả và tìm ra các loài mới chưa được mô tả [29].
Việc giải mã toàn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn công
sức và nhiều kinh phí nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có th trang
bị đ thực hiện được. Thay vào đó, việc xác định một đoạn DNA đã biết, đặc
trưng cho loài (thậm chí cá th ) đ làm căn cứ phân biệt loài này với loài
khác, cá th này với cá th khác. Đây có th là giải pháp hiệu quả trong phân
tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen, xác định nguồn gốc, xuất xứ của
sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học. Vì vậy, hướng nghiên cứu DNA
mã vạch đang được phát tri n mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều l nh vực khác nhau như: nghiên cứu về đa dạng sinh vật, giám định loài,

23. 14
giám định mẫu vật, x t nghiệm bệnh, bản quyền sản phẩm (giống cây trồng,
vật nuôi, sản phẩm nông – lâm – thủy sản) [50].
Có th thấy, DNA mã vạch là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các
nghiên cứu về phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm,
vi sinh vật và virus [41, 43, 64 . Việc xác định loài bằng DNA mã vạch có
hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài sinh vật khi nh ng quan sát hình
thái, sinh trưởng và phát tri n chưa đủ c sở đ định danh hoặc phân biệt loài
[66]. Cho nên, việc sử dụng DNA mã vạch đ nhận dạng các loài trên quy mô
toàn cầu có ngh a rất quan trọng. Cho đến nay, sau h n 10 năm nghiên cứu
đã có trên 6000 công trình khoa học được công bố với khoảng 5 triệu trình tự
DNA mã vạch ở các loài sinh vật. Đ chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử
dụng DNA mã vạch, cộng đồng các nhà khoa học đã rất nỗ lực trong việc tìm
kiếm được các vùng trình tự DNA mã vạch đ có th phân biệt đồng thời nhiều
loài [47, 56, 78].
. . . ác đặc điểm cơ bản của trình tự DNA mã vạch.
Mỗi đoạn DNA mã vạch có nh ng đặc trưng riêng và có khả năng phân
biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau như: chi, họ, loài hay dưới loài. Các
đoạn DNA mã vạch có th là nh ng đoạn nằm trong hệ gen nhân (18S, 5.8S,
26S, ITS…) [26, 35, 36, 63], trong hệ gen ty th (Cytb, CO1…) [26, 29, 43],
hay trong hệ gen lục lạp (matK, rbcL, trnH – psbA...) [44,46, 57, 69].
Tuy nhiên, chưa có đoạn DNA nào được sử dụng làm mã vạch chung
cho tất cả các loài sinh vật, thay vào đó cần lựa chọn nh ng đoạn DNA đặc
trưng và việc phối hợp các đoạn DNA mã vạch sẽ đem lại hiệu quả cao h n
[38, 40 . Tùy vào đối tượng giám định mà các đoạn DNA mã vạch sẽ được sử
dụng một cách hợp l [33, 47].
Khi sử dụng trình tự DNA mã vạch trong nghiên cứu thì đặc đi m quan
trọng nhất của chúng là phải phổ biến, đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng

24. 15
sử dụng. Điều này có ngh a là các đoạn gen được sử dụng như một mã vạch
nên thích hợp cho nhiều đ n vị phân loại, có sự biến đổi gi a các loài nhưng
ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng k . Do vậy,
DNA mã vạch l tưởng là một đoạn DNA có trình tự ngắn, bắt cặp được với
cặp mồi được thiết kế đặc hiệu đ dễ dàng khuếch đại bằng phản ứng PCR.
Một DNA mã vạch đi n hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau: có tính phổ
biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự), trình tự có tính đặc hiệu cao và
có khả năng phân biệt được nhiều loài [47].
Đối với thực vật thì quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho tất
cả các loài gặp nhiều khó khăn bởi hệ gen lục lạp mang nhiều đặc đi m thích
hợp với chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm gi a các gen hay còn
gọi là ITS thường được sử dụng làm chỉ thị DNA trong một số nghiên cứu
[31, 65, 73 . Trong nh ng năm gần đây, rất nhiều vùng gen đã được nghiên
cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật [34, 52, 69 . Mặc dù, chưa có chỉ
thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp
nhận [34, 61, 68]. Song cuối cùng các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan
đi m thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA mã vạch đ sử
dụng định danh loài thực vật [34, 52, 69].
. .3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA mã vạch ở thực vật
1.2.3.1.Trình tự gen nhân
Trình tự DNA mã vạch được nhân bản từ đoạn DNA hệ gen của bố mẹ
dự kiến sẽ cung cấp nhiều h n thông tin về các loài cần xác định. Bao gồm
kết quả lai giống, cho đến khi phiên mã nội vùng đệm (ITS) của DNA
ribosome (rDNA), DNA trong nhân đã được ki m nghiệm như một mã vạch
trong định danh ở thực vật. Tuy nhiên, khó khăn trong việc khuếch đại PCR
từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đ n gen hoặc có bản sao gen thấp, đặc biệt
từ sự suy thoái chất lượng DNA gennome và khả năng phân biệt dưới loài do

25. 16
bảo toàn gen chức năng qua các giống quy mô lớn có th hạn chế số lượng
các gen nhân được thử nghiệm trong việc xác định loài bằng phư ng pháp
DNA mã vạch [73, 77].
1.2.3.2.Vùng gen mã hóa ribosome
Gen mã hoá ribosome là hệ thống đa gen mã hóa cho axit nucleic của
ribosome. Các gen DNA ribosome mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có
tính đa dạng thích hợp đ phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA
được sắp xếp như các đ n vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm vùng mã hóa
18S, 5.8S, 26S và xen gi a các trình tự không mã hoá ITS1 và ITS2 nằm ở hai
bên sườn của vùng 5.8S. Vùng mã hoá của ba gen rDNA nói trên được bảo
tồn cao h n hai vùng ITS. Thông thường các đ n vị rDNA được lặp lại hàng
nghìn lần và hình thành một khối lớn sắp xếp tập trung trong nhiễm sắc th .
Một trong nh ng tính năng đáng chú nhất là các đ n vị riêng lẻ của hệ
thống đa gen không tiến hoá độc lập mà thay vào đó tất cả các đ n vị tiến hoá
một cách phối hợp nhờ vậy nên rDNA đạt mức ổn định cao h n trong cùng
loài nhưng khác biệt gi a các loài. Một số nghiên cứu gần đây ở thực vật sinh
sản h u tính và sinh sản vô tính cho thấy một số mức độ biến đổi nội bộ trong
số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần,
phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức
năng dẫn đến nh ng thay đổi đó, với các locus khác trong thực vật như là mã
vạch được sử dụng đ phân định chính xác hiệu quả sinh học – thực vật trong
cùng loài với đặc đi m lịch sử đời sống khác nhau (một năm hay lâu năm,
trên cạn hoặc dưới nước…) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [71, 77].
1.2.3.3 Trình tự gen lục lạp
Ở các loài thực vật bậc cao, hệ gen lục lạp gồm phân tử DNA cấu trúc
vòng có kích thước 120 – 160 kb chia làm hai bản sao đ n một bản sao đ n
lớn LSC ( large single – copy region) và bản sao đ n nhỏ SSC ( small single –

26. 17
copy region). Hai bản sao được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo ngược
nhau (Ira và Irb) có độ dài trung bình 20 – 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả
các gen RNA ribosome – rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao) và RNA vận
chuy n – tRNA và các gen khác mã hoá cho các protein tổng hợp trong lục
lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng. Hệ gen lục lạp mang
tính bảo thủ cao và tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả
phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài hay phân loại thực vật
được các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên nh ng thông tin có sẵn từ các
nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu ki m nghiệm gần đây, với một
số lượng hạn chế các locus là các đoạn gen hay các gen được chọn đ nghiên
cứu làm chỉ thị mã vạch tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất. Có
khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) được sử dụng trong
nghiên cứu phát sinh loài. Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá khác
nhau vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [71, 72, 79].
1.2.3.4. Trình tự gen rbcL
Trong gen lục lạp, rbcL là trình tự gen đặc trưng nhất, mã hóa các ti u
đ n vị lớn của RUBISCO. Đây là gen đầu tiên được giải trình tự từ thực vật
đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật
với h n 10.000 trình tự rbcL có sẵn trong Gen Bank. Do sự dễ dàng trong
khuếch đại PCR qua một loạt các nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công
nhận rbcL là một trong nh ng trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu
DNA mã vạch ở thực vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp nên hầu
hết các nhóm điều tra của rbcL cho rằng nên sử dụng kết hợp với các đánh
dấu khác. Do đó, CBOL đề nghị kết hợp rbcL với chỉ thị mã vạch khác như
matK sẽ là hai locus mã vạch chuẩn cho thực vật [71, 74].

27. 18
1.2.3.5. Trình tự gen matK
Trong số các gen lục lạp, matK là một trong nh ng gen nghiên cứu
nhiều nhất tiến hoá nhanh nhất. Nó có kích thước khoảng 1.550 bp và mã hóa
cho enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong
quá trình phiên mã RNA. Do gen matK tiến hoá nhanh và có mặt trong hầu
hết các loài thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu
mối quan hệ gi a các loài và phát sinh loài ở thực vật. Gen matK đầu tiên xác
định loài ở thực vật hạt kín, CBOL đã thử nhiệm matK trên gần 550 loài thực
vật, thấy rằng 90% mẫu cây hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử
dụng một cặp mồi đ n và đề nghị sử dụng matK kết hợp với rbcL [71, 79].
1.2.3.6. Trình tự hai gen trnH – psbA
Gen trnH – psbA có kích thước dao động 296 đến 1.120 bp và trung
bình khoảng 450 bp, là gen được minh chứng có khả năng xác định loài cao.
Locus trnH – psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và
hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín gen trnH – psbA lại có kích
thước rất ngắn (~ 300 bp). Kích thước của gen này thay đổi lớn do sự có mặt
của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm gi a hai gen trnH và psbA. Trong nhiều
nghiên cứu đề xuất việc sử dụng trnH – psbA như chỉ thị mã vạch độc lập cho
thực vật hay kết hợp với matK. CBOL nghiên cứu thấy rằng khả năng phân
biệt loài của trnH–psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm
và được đề nghị gen này như là chỉ thị mã vạch bổ sung ưu tiên nhất. Các gen
trnH – psbA có th sử dụng trong hệ thống mã vạch ba locus, khi hệ thống mã
vạch hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [69, 71, 79].
1.2.3.7. Trình tự hai gen trnL (UAA) – trnF (GAA)
Locus trnL (UAA) – trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron
và vùng nằm gi a hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA). Taberlet là nhóm
nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật

28. 19
chứng minh có th đại diện tốt cho một khu vực mục tiêu, ứng dụng đ xây
dựng mối quan hệ chặt chẽ gi a loài hoặc đ xác định các loại thực vật và
được sử dụng cho nghiên cứu phát sinh phân tử loài của một số đ n vị phân
loại các cấp. Vùng không mã hóa trnL (UAA) – trnF (GAA) không phải là
vùng có sự biến đổi lớn nhất của DNA lục lạp nhưng có ưu thế như cấu trúc
bậc hai với vùng biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau. Điều này tạo điều
kiện thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo
thủ đ thiết kế mồi và sử dụng k thuật PCR đ khuếch đại các đoạn gen ở
vùng biến đổi. Do đó, gen trnL –trnF được xem là một DNA mã vạch tiềm
năng cho phân tích, xác định các loài thực vật [69, 72, 79].
1.3. Một số DNA mã vạch đƣợc sử dụng trong nghi n cứu ở thực vật
Theo nghiên cứu cho thấy hệ gen ty th ở thực vật không phù hợp đ lựa
chọn ra các đoạn DNA mã vạch do hệ gen này tiến hóa chậm ở thực vật [39,
44]. Thay vào đó, một số vùng trình tự trong hệ gen lục lạp đã được nghiên
cứu và chứng minh có khả năng phân biệt tốt ở các loài thực vật và nghiên
cứu phát sinh loài [28, 44 . Hệ gen lục lạp được phát hiện lần đầu tiên vào
năm 1962, lượng DNA ở hệ gen lục lạp tư ng đối lớn, chiếm khoảng 15%
tổng lượng DNA của tế bào. Phần lớn các hệ gen ở lục lạp là một phân tử
DNA dạng mạch vòng, dài khoảng 120000 – 170000 bp với khoảng 100 gen
mã hóa protein và các gen mã hóa tRNA và rRNA [37, 65 . Một đặc đi m của
hệ gen lục lạp đó là có các trình tự lặp đảo ngược với chiều dài có th lên tới
25000 bp [51]. Trừ một vài trường hợp ngoại lệ, hệ gen lục lạp thường bao
gồm hai trình tự lặp đảo ngược như hai tấm gư ng phản chiếu lẫn nhau. Hai
vùng trình tự này được ngăn cách bởi vùng trình tự đ n bản lớn và nhỏ.
Nghiên cứu thực nghiệm đã cho thấy tỷ lệ nucleotide thay thế ở vùng đ n bản
thường cao gấp 2,3 lần so với vùng lặp lại đảo ngược, do đó phần lớn các
nghiên cứu về DNA mã vạch thường tập trung ở vùng trình tự đ n bản [65].

29. 20
Các gen thuộc cpDNA có tính bảo tồn cao và có th được chia thành 3
nhóm như sau: Nhóm 1 là các gen mã hóa nh ng yếu tố thuộc hệ thống quang
hợp như phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB...), cytochrome b6f (petA,
petB...), ATP synthase (atpA, atpB...), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H
dehydrogenease (ndhA, ndhB...); Nhóm 2 là các gen mã hóa cho các rRNA
(rrn16, rrn5...), trnA (trnH, trnK...), RNA polymerase (rpoA, rpoB...), các
gen ti u phần ribosome (rps2, rps3...); và nhóm 3 gồm các khung đọc mở
ORF gọi là ycfs (chưa rõ chức năng) và các gen mã hóa protein như matK,
cemA. Mỗi đoạn DNA mã vạch có nh ng đặc trưng riêng và có khả năng
phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau. Ví dụ các đoạn DNA như: 18S,
16S, 5,6S có khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chi; các đoạn DNA
như: 26S, rbcL, ndnF, atpβ có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các đoạn
DNA như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và
dưới loài [68 . Đến nay đã có 7 dấu chuẩn gen lục lạp được sử dụng rộng rãi làm
mã vạch cho thực vật gồm 4 đoạn trình tự mã hóa là: matK, rbcL, rpoB, rpoC1 và
3 đoạn không mã hóa là: atpF – atpH, trnH – psbA, psbK – psbI [41, 44, 47].
Ngoài các đoạn mã vạch trong hệ gen lục lạp, một đoạn trình tự khác
trong hệ gen nhân cũng được sử dụng rộng rãi làm dấu chuẩn nhận biết ở thực
vật đó là đoạn ITS. Đây là đoạn trình tự cho thấy mức độ khác biệt tư ng đối
lớn gi a các loài bên cạnh các trình tự trong hệ gen lục lạp [46, 47 . Mỗi đoạn
mã vạch đều có ưu đi m và nhược đi m riêng, do đó tùy vào từng trường hợp
đ có th lựa chọn đoạn DNA mã vạch cho phù hợp hoặc kết hợp nhiều đoạn
mã vạch với nhau nhằm nâng cao hiệu quả trong việc giám định và nghiên
cứu phát sinh loài ở thực vật [53, 55].
Đoạn trình tự gen matK là một trong nh ng đoạn trình tự tiềm năng
nhất được sử dụng làm mã vạch ở thực vật [53 . Đoạn matK có độ dài xấp xỉ
1570 bp và mã hóa cho protein maturase K. Trình tự này nằm bên trong đoạn

30. 21
intron của đoạn gen trnK ở lục lạp và nằm trên vùng trình tự đ n bản lớn
[78]. Ở loài cây mô hình Arabidopsis thaliana đoạn mã vạch matK có độ dài
801 bp, nằm ở vị trí 205-1046 của đoạn gen [47 . Với mức độ tiến hóa cao,
đoạn matK được sử dụng đ xây dựng nên hệ thống phát sinh của nh ng
taxon bậc cao như bộ và họ, một vài trường hợp ở nh ng bậc thấp h n là chi
và loài [78].
Đ khắc phục nhược đi m trên của trình tự matK, nhóm nghiên cứu
CBOL đã đề xuất một mã vạch cốt lõi bao gồm hai vùng trình tự trong hệ gen
lục lạp là matK + rbcL [41 . Đoạn trình tự rbcL mã hóa cho enzyme Rubisco
tham gia vào quá trình cố định carbon ở thực vật, có chiều dài khoảng 599 bp
ở đầu 5‟ của gen trong hệ gen lục lạp của loài Arabidopsis thaliana [47 . Ưu
đi m của đoạn trình tự này là dễ khuếch đại ở phần lớn thực vật và được biết
đến như một locus chuẩn trong nghiên cứu hệ thống phát sinh loài bởi nó đưa
ra một vị trí đáng tin cậy cho taxon trong các họ hay chi thực vật [52 . Mặc dù
tiến hóa chậm và khả năng phân biệt khiêm tốn, nhưng khi kết hợp với đoạn
trình tự matK, bộ đôi rbcL và matK đã cho thấy ưu thế như một mã vạch cốt
lõi dựa trên sự khuếch đại đ n giản của đoạn rbcL và khả năng phân biệt cao
của đoạn matK [30, 41].
Một đoạn DNA mã vạch khác nằm trong hệ gen lục lạp được sử dụng
rộng rãi ở các loài thực vật có hoa là đoạn trình tự không mã hóa trnH – psbA
[27, 44 . Đây là đoạn trình tự có chiều dài thay đổi ở các loài khác nhau,
khoảng 286 bp – 504 bp [74]. Với ưu đi m là dễ dàng nhân lên bằng một cặp
mồi ở 95% các loài, đoạn trình tự này cho thấy được ưu thế so với matK khi
cùng với trình tự ITS là hai vùng có khả năng phân biệt tốt nhất [52, 62]. Tuy
nhiên, việc sử dụng đoạn mã vạch trnH – psbA như một mã vạch tiêu chuẩn
gặp phải khó khăn khi đọc trình tự do thường xuyên có nh ng đ n nucleotide
lặp lại dẫn đến việc đọc bị dừng lại sớm. Nhằm hạn chế nhược đi m đó,

31. 22
các thử nghiệm sử dụng các enzyme polymerase mới đã được nghiên cứu
và đem lại hiệu quả đáng k khi có th chạy được đoạn trình tự dài 13 đ n
nucleotide lặp lại [47].
Giống như trnH – psbA, hai đoạn trình tự liên gen atpF – atpH và psbK
– psbI cũng có chiều dài thay đổi gi a các loài, khoảng 579 bp – 622 bp với
đoạn atpF – atpH và 185 bp – 576 bp đối với psbK – psbI [74 . Hai trình tự
này trước đó không được sử dụng rộng rãi trong hệ thống học và phân loại
học thực vật nên không có nhiều kết quả được công bố. Theo nghiên cứu của
nhóm nghiên cứu thực vật CBOL, psbK – psbI cho kết quả phân biệt tốt, song
chất lượng trình tự và tính phổ biến không cao, trong khi đó atpF – atpH cho
kết quả khiêm tốn nhất trong việc phân biệt các loài và mức độ phổ biến cũng
như chất lượng trình tự chỉ ở ngư ng trung bình [41, 47]. Một số nghiên cứu
gần đây cung cấp nh ng kết quả khả quan cho cả hai đoạn atpF – atpH [59, 74]
đối với các loài thuộc chi Ceratozamia cùng một số loài trong họ Lemnaceae và
psbK – psbI đối với các loài thuộc chi Dioon và Zamia ( >50%) [58].
Đoạn trnL intron được sử dụng rộng rãi trong hệ thống học và phân loại
học thực vật từ trước nh ng năm 1990. Vùng trình tự này nhìn chung tư ng đối
dễ đọc, mặc dù đôi khi các trình tự đ n nucleotide lặp lại có th gây ảnh
hưởng ở một số taxon. Ưu đi m của đoạn trình tự này là có th được nhân bởi
một cặp mồi và trình tự cặp mồi này đã được thiết kế từ khoảng h n 15 năm
trước, sau đó đã được sử dụng rộng rãi. Đây là vùng trình tự duy nhất nằm
trong nhóm I intron ở lục lạp thực vật, có ngh a là có cấu trúc bậc hai với các
vùng thay thế và bảo tồn xen kẽ nhau. Đoạn minibarcode rất ngắn này đã cho
thấy tính khả dụng cao trong nghiên cứu về DNA suy biến của các nhà sinh
thái học, đồng thời giúp đánh giá sự đa dạng của các phức mẫu trong môi
trường [47].
Trong các nghiên cứu về hệ thống học và phân loại học thực vật dựa

32. 23
trên dấu chuẩn về mặt phân tử, các nhà nghiên cứu thường kết hợp các đoạn
DNA mã vạch với nhau đ mang lại hiệu quả phân biệt cao nhất. Mỗi một
đoạn trình tự lại có ưu nhược đi m khác nhau, do vậy có th bổ sung cho các
khiếm khuyết của nhau như: rpoB, rpoC1 và rbcL có trình tự bảo thủ, dễ dàng
nhân bản và so sánh trình tự nhưng độ đa hình không cao, matK có khả năng
phân biệt tốt nhưng lại khó khuếch đại, trnH – psbA, atpF – atpH và psbK –
psbI có tốc độ tiến hóa nhanh song lại có độ dài thay đổi gi a các taxon, ITS
và ITS2 có khả năng phân biệt tốt song dễ gặp phải các vấn đề bên ngoài như
nhiễm nấm. Mức độ phổ biến (khả năng nhân bản và giải trình tự) của các
DNA mã vạch ở đối tượng thực vật trên cạn như sau: rpoC1 (100%), rbcL
(97%), trnH – psbA (79%), rpoB/matK (65%), psbK – psbI (50%), atpF –
atpH (49%), ITS (41%), khả năng nhân bản bởi một cặp mồi phổ biến nhất
của các đoạn rpoC1, trnH – psbA, rbcL, psbK – psbI, atpF – atpH, rpoB và
matK lầnlượt là 100%, 79%, 78%, 50%, 49%, 32% và 27% [44, 47].
Nhóm nghiên cứu về DNA mã vạch ở thực vật đã công bố kết quả về
việc sử dụng kết hợp các mã vạch trên. Theo đó, việc kết hợp 2 mã vạch có
th đem là hiệu quả phân biệt từ khoảng 59 – 75% (kết hợp rpoB + rpoC1
đem lại hiệu quả thấp nhất là 59%, psbK – psbI + rbcL ~75%, matK + rbcL
~72%), sử dụng kết hợp 3 mã vạch là 65– 76% (atpF–atpH+rpoB+rpoC1 là
65%, rpoC1 + psbK–psbI+rbcL là76%). Nhóm các đoạn mã vạch phát huy tối
đa chức năng khi kết hợp với các trình tự khác bao gồm rbcL, psbK – psbI,
matK và trnH – psbA. Khi sử dụng kết hợp cả 7 đoạn mã vạch trong hệ gen lục
lạp nói trên, hiệu quả phân biệt đạt 73%. Tuy nhiên, so sánh khả năng phân
biệt khi kết hợp ba đoạn mã vạch và hai đoạn mã vạch không có sự khác nhau
nhiều, nên nhóm nghiên cứu mã vạch thực vật đã khuyến nghị nên dùng kết
hợp hai đoạn trình tự nhằm tiết kiệm chi phí và giảm thi u các rủi ro khi nhân
bản và giải trình tự [41].

33. 24
1.4. Một số thành tựu nghi n cứu về DNA mã vạch ở thực vật
Thành công việc ứng dụng trong nghiên cứu khoa học của DNA mã
vạch không chỉ dừng lại ở việc nhận diện nhanh các mẫu mà còn mở rộng
nghiên cứu sắp xếp theo nhóm nh ng loài còn m hồ hoặc phức tạp. Trong hệ
sinh thái, DNA mã vạch phát huy tính h u dụng trong việc tìm mối quan hệ
gi a các mẫu vật dù chúng có th không giống nhau về mặt hình thái. Ngoài
ra, trong đời sống, DNA mã vạch cũng hỗ trợ xác định nguồn gốc của sinh vật
sống hoặc hàng nhập khẩu do tính chất nhận dạng được cả với lượng mẫu nhỏ,
bị biến dạng. Các ứng dụng nổi bật có th k đến của DNA mã vạch là ki m
soát các tác nhân gây hại trong nông nghiệp, nhận diện các tác nhân gây bệnh,
bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên, bảo vệ các loài nguy cấp, quản lý chất
lượng nước, xác định các sản phẩm tốt cho sức khỏe từ tự nhiên, nhận biết các
cây dược liệu [50]. Việc quản lý khai thác nguồn gen quý hiếm này đã được
Chính phủ quan tâm từ nh ng năm 2010 thông qua việc hình thành quỹ gene
cấp Quốc gia đ định hướng, nghiên cứu, khai thác, ứng dụng và bảo tồn các
nguồn gen qu hiếm. Ứng dụng DNA mã vạch đ nhận dạng các mẫu sinh vật
trước khi tiến hành các công tác nghiên cứu sâu h n là điều kiện tiên quyết đ
đảm bảo tính chuẩn mực và thành công của các nghiên cứu khai thác, phát
tri n, bảo tồn nguồn gen [5].
Ngày nay, nghiên cứu về DNA mã vạch ở thực vật thực chất là nghiên
cứu so sánh sự khác biệt của các đoạn trình tự, từ đó ứng dụng ra thực tiễn với
các mục đích khác nhau, có th chia ra làm hai hướng chính là:
Thứ hất, cung cấp cái nhìn sâu h n về phân loại học ở cấp độ loài và
đóng góp vào tiến trình phân định rõ đặc đi m và ranh giới các loài.
Thứ hai, hỗ trợ quá trình nhận diện các mẫu vật chưa biết vào các loài
đã biết hoặc xác định loài mới [47].
Có rất nhiều ngành nghề liên quan đến DNA mã vạch hiện nay, bao

34. 25
gồm nhận dạng và ứng dụng nhận dạng các loài thực vật như phân loại học,
sinh thái học, bảo tồn thiên nhiên, nông lâm nghiệp, khoa học pháp y, ki m
dịch… [45 . Khi sử dụng DNA mã vạch đ nhận dạng các loài thực vật, cần
thiết phải nắm v ng kỹ thuật sinh học phân tử. Trong nhiều trường hợp, các
DNA mã vạch thu được cho kết quả nhận dạng của một nhóm loài thay vì một
loài. Tuy nhiên, với một số ứng dụng, thậm chí ngay cả khi DNA mã vạch có
khả năng phân biệt khiêm tốn nhất cũng có th h u ích (đối với các trường
hợp nghiên cứu tập trung vào sự khác biệt về mặt địa l , phân biệt loài mục tiêu
với các loài khác trong thư ng mại hay thu hẹp giới hạn nhận dạng các loài hoàn
toàn xa lạ) [47].
1.5. Một số nghi n cứu về các loài Giổi ăn hạt
.5. . Một số nghiên cứu ở ngoài nước
- Trong các công trình nghiên cứu về phân loại và hệ thống học họ Ngọc
lan phải k đến tác phẩm „Species Plantarum‟ của Linnaeus năm 1753, ông đã
kế thừa và đề xuất hệ thống họ Ngọc lan gồm 8 loài thuộc 3 chi: Liriodenron
L. (L. tulipifera L.), Magnolia L. và Michelia L. (M. chamaca L.); đây là nền
móng cho các nhà thực vật học sau này nghiên cứu thêm. Nh ng năm sau đó,
nhiều nhà thực vật, đặc biệt là ở nước Anh và nước Pháp đã bổ sung thêm
nh ng taxa mới và phát tri n hệ thống phân loại của Linnaeus theo các hướng
khác nhau.
- Tiếp đến là thời kỳ áp dụng rộng khắp hệ thống học họ Ngọc lan của
Dandy trong suốt nửa đầu thế kỷ 20, khởi đầu trong tác phẩm của ông năm
1927 „The Genera of Magnoliaceae‟. Trong đó, có chi mới mà ông mô tả hoặc
công nhận trong hệ thống phân loại hiện tại là synonym của chi Giổi như:
Elmerrillia, Aromadendron, Paramichelia Hu H. H. (1940), các công trình
tiếp theo phải k đến là Cheng (1951) với Paramanglietia, Gvới
Manglietiastrum Law (1979) và Woonyoungia Law (1997). Đây là thời kỳ

35. 26
hoàng kim của hệ thống học họ Ngọc lan và nó vẫn lan tỏa và ngày nay vẫn
được nhiều nhà thực vật học kế thừa và áp dụng (Nooteboom, 1985; Chen &
Nooteboom, 1993; Xia et al. 2008). Đây cũng là thời kỳ mà nhiều taxa được
mô tả mới cho khoa học và cung cấp rất nhiều nh ng thông tin về đa dạng
loài và về phân loại [48, 54, 60, 75].
- Trong nh ng năm gần đây, khi điều kiện kỹ thuật đã phát tri n, các
nghiên cứu trong phân loại thực vật không chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu
và phân tích hình thái ngoài mà đã có nhiều nghiên cứu có sử dụng các kỹ
thuật của sinh học phân tử. Phư ng pháp nghiên cứu sinh học phân tử không
th thay thế phư ng pháp hình thái so sánh, tuy nhiên lại đóng góp rất lớn khi
nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của các loài trong các nhóm taxon. Một loạt
các nghiên cứu về phân tử và hệ thống phát sinh của tác giả Nie et al (2008)
đã cung cấp các khía cạnh khác nhau về mối quan hệ của các taxon trong họ,
tuy nhiên các kết quả cũng còn hạn chế vì các giá trị „supporting values‟ còn
thấp, cây nguồn gốc còn bị phân tán hay „basal group‟ trong Magnolioideae
còn chưa chắc chắn. Nie et al. (2008) đã sử dụng 3 gen nhân PHYA, LFY và
GAI1 đ xây dựng mối quan hệ phát sinh và lịch sử địa l sinh học của họ
Ngọc lan và kết quả chỉ ra rằng có 12 nhóm là đ n nguồn (monophyletic) rõ
rệt trong họ. Bên cạnh đó một số các nghiên cứu khác cũng đã cung cấp thêm
nhiều dẫn liệu về mối liên hệ phát sinh chủng loại các loài trong họ và đó chính
là nền tảng gợi cho sự hình thành các hệ thống phân loại trong thời kỳ mới.
.5. . Một số nghiên cứu tại Việt Nam
- Nh ng công trình do các tác giả người Việt Nam nghiên cứu về loài
Giổi ăn hạt cũng như ứng dụng mã vạch ADN trong việc giám định loài còn
rất ít. Tuy nhiên, chỉ có th k đến một số công trình của các nhà thực vật học
người nước ngoài nghiên cứu tại Việt Nam như: Loureiro (1790), Finet and
Gagnepain (1906, 1907), Chevalier (1918), Dandy (1927, 1928, 1929, and

36. 27
1930), Gagnepain (1938, 1939). Năm 1790, Joannis De Loureiro – nhà truyền
giáo và tự nhiên học người Bồ Đào Nha, đã có nhiều công trình về thực vật tại
miền Nam Việt Nam (Cochinchina). Ông đã có nh ng ghi nhận đầu tiên về
các loài thực vật thuộc họ Ngọc lan ở Việt Nam trong tác phẩm „Flora
Cochinchinensis‟. Trong đó có ghi nhận 4 loài thuộc 2 chi: Liriodendron
lilifera, Liriodendron figo, Liriodendron coco và Michelia champaca (sau này
được nhận diện là Magnolia lilifera, Michelia figo, Magnolia coco và
Michelia champaca).
- Theo Finet and Gagnepain (1906, 1907) trong 'Flore de L'Asie
Orientale' and 'Flore Générale de L'Indo–Chine' cũng đã ghi nhận 4 loài:
Michelia champaca, M. figo, Magnolia pumila, Manglietia glauca) và mô tả 2
loài mới: Talauma fistulosa và Michelia baviensis cho hệ thực vật Việt Nam.
- Chevalier (1918) đã tiếp tục mô tả 2 loài mới từ các mẫu vật thu từ
Việt Nam là Talauma gioi và Michelia tonkinensis. Ngoài ra, ông còn xác
nhận sự phân bố tự nhiên của 4 loài mà được các tác giả công bố trước đó.
- Dandy (1927, 1928, 1929 và 1930), người đã bỏ ra nhiều công sức
đóng góp cho khoa học phân loại và hệ thống học thế giới về họ Ngọc lan, đã
mô tả nhiều loài mới cho thế giới, trong đó có nhiều loài thuộc chi giổi hiện
tại như: Michelia aenea, Michelia balansae (comb.nov.), Michelia chapensis,
Michelia constricta, Michelia floribunda var. tonkinensis (var.nov.), Michelia
fulgens, Michelia hypolampra, Michelia masticata, Michelia mediocris,
Michelia subulifera, Michelia tignifera. Theo Gagnepain (1938, 1939) đã mô
tả 2 loài mới cho khoa học từ các mẫu vật Việt Nam, đó là: Manglietia
blaoensis và Michelia braianensis.
Hai tác giả nổi bật nhất ở Việt Nam khi nghiên cứu về họ Ngọc lan là
Phạm Hoàng Hộ (1991, 1999) và Nguyễn Tiến Bân (2003). Trong công trình
Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ có 50 loài thuộc 8 chi được ông ghi

37. 28
nhận k m theo phần mô tả gắn gọn về loài. Nguyễn Tiến Bân với công trình
„Checklist of Plant Species of Vietnam: Angiosperm II‟ đã thống kê được 46
loài và 3 thứ thuộc 9 chi. Trong đó, ông có ghi về một loài còn chưa rõ có tồn
tại ở Việt Nam hay không, loài Talauma gioi. [1, 6].
Trong cuốn “Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ Lâm nghiệp”
(1991 1995), Nguyễn Bá và Nguyễn Đình Hưng đã xác định một số loài cây
trong họ Ngọc lan (Magnoliaceae) bao gồm cả Giổi ăn hạt, thuộc nhóm gỗ
không cần bảo quản bằng hóa chất khi sử dụng thông thường. Nguyễn Bá và
Nguyễn Đình Hưng cũng đề cập đến cấu tạo giải phẫu gỗ của một số đại diện
trong họ Ngọc lan. Các tác giả đưa ra nhận xét gi a các đại diện của họ này
nói chung rất khó phân biệt với nhau về cấu tạo giải phẫu gỗ, điều này có liên
quan tới tính chất đồng nhất về hình thái [11].
Một số nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền loài Giổi Xư ng
(Michelia baillonii (Pierre) Fin. et Gagnep.) bằng chỉ thị phân tử RAPD và
cpSSR, Nguyễn Hoàng Ngh a và cs (2010) đã cho thấy các mẫu các xuất xứ
Giổi có mối quan hệ di truyền rất khác nhau (hệ số tư ng đồng di truyền
30%) và chia thành 4 nhóm chính, quan hệ di truyền khác nhau tới 45% [20].
Kế tiếp là Xingfeng Zhao và cs (2012) đã nghiên cứu về loài Michelia
coriacea, loài cây bị đe doạ nghiêm trọng tại tỉnh Vân Nam – Trung Quốc
bằng chỉ thị ISSR và SSR cho thấy sự đa dạng di truyền các loài này duy trì ở
mức độ di truyền tư ng đối cao, tỷ lệ các dải đa hình PPB = 96,36% từ ISSR,
tỉ lệ loci đa hình PPL = 95,56% từ SSRs. Mức độ khác biệt về di truyền thấp
gi a các quần th M. coriacea đã được phát hiện bởi Gst của Nei = 0,187 đối
với ISSR và Wright's Fst = 0,090 đối với các đi m đánh dấu SSR [76]. Một
nghiên cứu mới đây của tác giả Zhang và cs (2017) sử dụng kỹ thuật DNA lục
lạp và kỹ thuật đánh dấu Microsatellite Markers nghiên cứu sự đa dạng di truyền
của loài Michelia yunnanensis Franch ở tỉnh Vân Nam – Trung Quốc, đã sử

38. 29
dụng 3 cặp dấu hiệu cpADN và 10 cặp đánh dấu Microsatellite đ đánh giá đa
dạng di truyền, tổng số 88 allele cho 10 vị trí đa hình và 10 haplotypes cho tổng
hợp 2,089 bp cpADN. Các quần th M. yunnanensis cho thấy sự đa dạng di truyền
cao và sự khác biệt về di truyền thấp (FST = 0.058) [80].
Mặc dù, hiện nay hệ thống DNA mã vạch sử dụng cho thực vật chưa
hoàn chỉnh. Tuy nhiên, với các trình tự DNA mã vạch, các nhà khoa học đã
có nh ng nghiên cứu thực hiện trên nhiều thực vật, nhưng trên đối tượng là
loài Giổi ăn hạt thì vẫn còn hạn chế. Sử dụng DNA mã vạch trong nghiên cứu
trên thực vật mở ra một tri n vọng mới đầy hứa hẹn cho công tác đánh giá,
phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học ở các loài Giổi ăn hạt tại Việt Nam.

39. 30
Chƣơng 2
NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu các đặc đi m hình thái và vị trí phân loại một số loài
thuộc chi Giổi và một số loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam.
- Thu thập và tách chiết DNA tổng số từ mẫu Giổi ăn hạt.
- Nhân bản các đoạn DNA mã vạch của các mẫu Giổi ăn hạt bằng kỹ
thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
- Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA mã vạch
của các mẫu Giổi ăn hạt.
- Xây dựng cây phát sinh chủng loại của các mẫu Giổi ăn hạt.
2.2. Vật liệu nghi n cứu
Tám mẫu Giổi ăn hạt gồm: thân, cành, lá, hoa, quả, hạt được thu thập
ngẫu nhiên tại các khu vực khác nhau trong quần th Giổi ăn hạt thuộc một số
khu vực ở Việt Nam (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các mẫu Giổi ăn hạt ở Việt Nam trong nghi n cứu
Stt Loài Ký hiệu Số hiệu Nơi thu mẫu
1
Michelia
tonkinensis
Mi.t.HN LN 01 Rừng núi luốt, ĐHLN, Hà Nội
2
Michelia
tonkinensis
Mi.t.HB LS 01 Lư ng S n, Hòa Bình
3
Michelia
tonkinensis
Mi.t.TH
Nam
18818.4
Xuân Liên, Thanh Hóa
4
Michelia
citrata
Mi.c.GL
Nam
210111.3
Kon Hà Nừng, KBang, Gia Lai

40. 31
5
Michelia
tonkinensis
Mi.t.GL
Nam
210111.5
Kon Hà Nừng, KBang, Gia Lai
6
Michelia
macclurei
Mi.m.GL
Nam
210111.4
Kon Hà Nừng, KBang, Gia Lai
7
Michelia
sonlaensis
Mi.s.SL
Nam
152018.5
Mường Lựm, Yên Châu, S n La
8
Michelia
xianianhei
Mi x ĐB
Nam
311210.2
Mường Phăng, Điện Biên
2.3. Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
2.3. . óa chất
- Hóa chất sử dụng đ tách chiết DNA bao gồm: Nit lỏng, Tris HCl,
EDTA, 20% SDS (Sodium doecyl sulphate), 3M CH3COOK (pH 5,2), 70%
ethanol, Isopropanol, chloroform : isoamylalcohol (24:1)
- Đệm tách A, đệm tách B, đệm TE, đệm rửa.
+ Đệm tách A (EBA – Extraction Bufer A): pha 100 ml (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Thành phần đệm tách A (100 ml)
TT Hóa chất
Khối lƣợng/
thể tích
1 2% (w/v) CTAB 2 g
2 100 mM Tris (pH 8,0) 10 ml
3 20 mM EDTA 1 ml
4 1,4 M NaCl 8,2 g
5 4% (w/v) PVP 4 g
6 0,1% (w/v) ascobic acid 0,1 g
7 10 mM -mereaptoethanol 70 µl
8 Định mức H2O deion đến 100 ml

41. 32
+ Đệm tách B (EBB – Extraction buffer B): pha 100 ml (bảng 2.3)
Bảng 2.3. Thành phần đệm tách B (100ml)
TT Hóa chất
Khối lƣợng/
thể tích
1 1111
100 mM Tris HCl (pH 8,0) 10 ml
2 50 mM EDTA 2,5 ml
3 100 mM NaCl 0,6 g
4 10mM – mereaptoethanol 70 µl
5 Định mức H2O deion đến 100 ml
+ Đệm TE: pha 100 ml (bảng 2.4)
Bảng 2.4. Thành phần đệm TE ( 100 ml)
TT Hóa chất
Khối lƣợng/
thể tích
1 10 mM Tris (pH 8,0) 1 ml
2 1mM EDTA 50 ml
3 Định mức H2O deion đến 100 ml
- Hóa chất dùng cho điện di gel agarose 1%: đệm TAE 1X, agarose, 6x
loading dye, thuốc nhuộm Redsafe của hãng iNtRON, Hàn Quốc.
- Hóa chất PCR: H2O deion, Master Mix PCR, các cặp mồi (Bảng 2.5).
- Hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR: Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR
của Norgen – Canada.
2.3.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di
Powerpac300 (Bio – Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini – transllumminatior,

42. 33
Bio – Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ
Đi n), máy vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, cùng với các
trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm Công nghệ gen – Viện Công nghệ
Sinh học Lâm nghiệp.
2.4. Phƣơng pháp nghi n cứu
2.4. . hương pháp nghiên cứu hình thái và vị trí phân loại
- Nghiên cứu tất cả các tài liệu có liên quan đến chi Giổi trên thế giới và
trong nước, tập trung vào hệ thống phân loại; về vị trí phân loại của các loài
Giổi ăn hạt. Dựa trên các tài liệu chuyên ngành về họ Ngọc lan trong và ngoài
nước bao gồm các tài liệu về phân tử và sinh thái có liên quan đến phân loại
và hệ thống học.
- Lựa chọn địa đi m điều tra: Các taxon còn tranh cãi hay nghi ngờ được
biết thông qua các kết quả từ nghiên cứu tài liệu và tiêu bản, sẽ lựa chọn
nghiên cứu tại thực địa. Địa đi m điều tra được thực hiện trên các tỉnh, thành
phố có xuất hiện thông tin về loài Giổi ăn hạt như: Hà Nội, Hòa Bình, Gia
Lai, Điện Biên v.v… Kết hợp điều tra thực địa với việc phỏng vấn người dân
địa phư ng, ki m lâm và nh ng người có kinh nghiệm đ tìm hi u về các loài
Giổi ăn hạt. Từ các thông tin được ghi nhận, qua các đợt điều tra thực địa
được tri n khai nhằm thu các mẫu tiêu bản và mẫu phân tử [25]. Thời gian
điều tra tập trung chủ yếu vào mùa hoa (tháng 3 – tháng 6) và mùa quả (tháng
7 – tháng 12) hàng năm. Các mẫu vật cùng các hình ảnh chụp tư liệu về vùng
phân bố, về vị trí phân loại và các đặc đi m khác của loài Giổi ăn hạt được
ghi ch p làm c sở cho nghiên cứu tiếp theo trong phòng thí nghiệm.
- Thu thập mẫu vật cho nghiên cứu hình thái và phân tử: Thu thập tất cả
các mẫu tiêu bản của các loài Giổi ăn hạt trong quá trình điều tra nhằm phục
vụ cho các nghiên cứu về hình thái. Cách xử l mẫu vật ngoài thực địa và
trong phòng thí nghiệm được thực hiện theo phư ng pháp truyền thống áp

43. 34
dụng rộng rãi trên thế giới và Việt Nam. Đối với các mẫu vật sử dụng cho các
nghiên cứu về phân tử, chúng tôi sử dụng lấy các phần thịt lá bánh tẻ của các
loài, cho vào từng bao giấy nhỏ, có đánh số hiệu tư ng ứng với số hiệu của
tiêu bản hình thái, dùng Silica – gel bảo quản các mẫu đ nghiên cứu. Đông
thời nghiên cứu các tiêu bản khô đang được lưu gi tại các phòng tiêu bản của
Việt Nam như HN, HNU, VNF, VNM v.v… Các thông tin thu thập về hình
thái, sinh thái và phân bố của loài được xây dựng thành bộ c sở d liệu ban
đầu về loài Giổi ăn hạt tại Việt Nam.
- Xây dựng Khóa tra phân loại cho một số loài Giổi ăn hạt được thực
hiện theo nguyên tắc khóa Lư ng phân [18].
2.4. . hương pháp nghiên cứu phân tử
2.4.2.1. hươ g ph p t h hiết DNA tổ g số
Phư ng pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và
Doyle (1987), có cải tiến theo điều kiện phòng thí nghiệm.
Bướ : Cân 0,2 g mẫu lá, nghiền trong nit lỏng bằng cối chày sứ vô
trùng thành bột mịn, chuy n ngay bột mịn vào ống eppendorf 2 ml.
Bướ : Bổ sung 600 l đệm A, 900 l đệm B và 100 l SDS 20%,
voltex tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ 1 giờ 30 phút ở 650
C thỉnh thoảng trộn
đều. Lấy ra bổ sung 400 l CH3COOK đ ở trên đá 5 phút.
Bướ 3: Ly tâm 13000 vòng phút trong thời gian 10 phút ở 40
C, thu
dịch chuy n sang ống 2,0 ml mới.
Bướ 4: Bổ sung 800 l chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều
tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 13000 vòng phút trong 15 phút ở 40
C, hút
dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

44. 35
Bướ 5: Hút dịch nổi trên cùng, bổ sung 1 lần th tích isopropanol đảo
đều đ ở tủ - 200
C trong thời gian 1 giờ. Ly tâm 12000 vòng phút trong 15
phút ở 40
C, loại bỏ dịch nổi thu kết tủa.
Bướ 6: Rửa tủa bằng ethanol 70%. Ly tâm 12000 vòng phút trong 5
phút ở 40
C (lặp lại 2 lần).
Bướ 7: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hoà tan DNA trong 50 l
TE.
Bướ 8: Bảo quản mẫu ở -200
C đ nghiên cứu.
2.4.2.2. hươ g ph p điện di trêngel agarose 1%
- Ki m tra DNA tổng số bằng phư ng pháp điện di trên gel agarose 1%,
sử dụng đệm TAE 1X, nhuộm gel bằng RedsafeTM Nucleic Acid gel Stain,
thực hiện trên thiết bị điện di của hãng Biorab được tiến nhành như sau:
+ Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 1g agarose cho vào 100 ml
dung dịch TAE 1X, đun sôi bằng lò vi sóng cho agarose tan đều.
+ Đ hỗn hợp khi nhiệt độ xuống còn 50 – 600
C, bổ sung Redsafe, trộn
đều và đổ vào khay điện di.
+ Đổ gel, chờ agarose đông và tháo lược nhẹ nhàng tránh làm nứt, v
giếng (trước khi đổ bản gel lau sạch giấy đổ bằng giấy thấm mềm dễ hút ẩm
sau đó cài lược, lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của b điện di, tiến
hành cân bằng mặt ph ng của giá b bằng giọt nước sao cho giọt nước ở chính
gi a hình tròn trên giá).
+ Đổ dung dịch TAE 1X vào b điện di, th tích TAE cần thay đổi sao
cho phù hợp đ đặt bản gel vào trong b . Đặt bản gel vào b điện di, dung
dịch TAE trong b sao cho bản gel ngập khoảng 1mm so với bề mặt dung
dịch điện di.

45. 36
+ Lấy 8 µl ở các mẫu DNA được tách chiết và trộn với 2 µl Dye trên bề
mặt giấy parafilm. Cho hỗn hợp trên vào giếng điện di bằng micropipet. Ghi
ch p lại thứ tự tra các mẫu DNA vào giếng, chạy điện di ở 80V trong 60 phút.
- Sau khi điện di trên gel agarose 1%, lấy bản gel từ b soi trực tiếp dưới
đ n UV và chụp ảnh.
2.4.2.3. Kĩ thuật CR
 Thự hiệ phả ứ g CR
Với tổng th tích là 20 µl/mẫu trong đó chứa các thành phần và nồng
độ các chất tham gia phản ứng PCR (bảng 2.5; bảng 2.6; bảng 2.7).
Bảng 2.5. Trình tự và thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu
Gen Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Nhiệt
độ gắn
mồi
trnL–F
trnL–F CGAAATCGGTAGACGCTACG
540
C
trnF –R ATTTGAACTGGTGACACGAG
trnH–
psbA
trnH –F CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
500
C
psbA–R GTTATGCATGAACGTAATGCTC
trnL
intron
trnL– F CGAAATCGGTAGACGCTACG
540
C
trnL –R GGGGATAGAGGGACTTGAAC
atpB–
rbcL
atpB–F
rbcL–R
ACATCTAGTACCGGACCAATGA
AACACCAGCTTTGAATCCAA
520
C
Bảng 2.6. Thành phần một phản ứng PCR
STT Thành phần phản ứng Nồng độ (µl) Thể tích (µl)
1 H2O deion 7
2 Master Mix PCR 2X 10

46. 37
3 Mồi xuôi (Primer F) 10 pM 1
4 Mồi ngược (Primer R) 10 pM 1
5 DNA khuôn 50 ng/µl 1
Tổng th tích 20
Bảng 2.7. Chu kỳ phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng T ºC Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút
40
2 Biến tính 94 30 giây
3 Gắn mồi 50 - 54 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 5 phút
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
(Ghi chú: Nhiệt đ gắn mồi th y đổi tuỳ thu c vào từng cặp mồi hư
thể hiện trong các bảng 2.5).
 Kiể tr sả ph điệ di
Sau khi PCR ki m tra sản phẩm bằng phư ng pháp điện di: tra mẫu vào
gel agarose 1% có bổ sung Redsafe, thêm 1 giếng cho marker đ đo độ dài
bằng DNA, chạy điện di ở hiệu điện thế 90V trong 50 phút. Soi gel dưới đ n
UV và chụp kết quả.
 Ti h sạ h sả ph CR
Thực hiện tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ Kit "PCR Purification Kit"
của hãng NORGEN – Canada, theo quy trình tinh sạch như sau:
 Chuẩn bị mẫu và thực hiện bám dính vào cột

47. 38
- Thêm 5 lần th tích Binding Buffer C vào ống eppendorf chưa sản
phẩm PCR, mix bằng vortex.
- Chuẩn bị cột spin k m ống colection. chuy n mẫu sang cột spin, ly
tâm 1 phút (lưu th tích lớn nhất cho cột spin là 750 l, nếu th tích mẫu
vượt quá số lượng trên, tách làm 2 lần thực hiện).
- Sau khi ly tâm, loại bỏ dịch.
 Rửa liên kết DNA
- Thêm 500 l Wash Solution A vào cột, ly tâm 10000 v p trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch sau ly tâm.
- Ly tâm 14000 v p trong 2 phút đ loại hoàn toàn dịch cho mẫu.
 Thu sản phẩm DNA tinh sạch
- Chuy n cột spin chứa mẫu sang ống eppendorf 1,7 ml (được cung
cấp trong bộ Kit).
- Thêm 50 l Elution Buffer B vào chính gi a cột spin.
- Đ nguyên ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
- Ly tâm 14000 v p trong 2 phút.
- Bảo quản sản phẩm tinh sạch ở – 200
C, đ gửi đi đọc trình tự.
 Điệ di kết quả ti h sạ h
Điện di ki m tra kết quả sản phẩm DNA trên gel Agarose với mẫu
DNA được trộn với Loading Buffer như điện di DNA tổng số.
2.5 iải trì h tự ge
Sản phẩm PCR sau tinh sạch được gửi đi giải trình tự tại Apical
Scientific Sdn Bhd, Selangor, Malaysia.
2.6. hương pháp phân tích số liệu phân tử
Trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu được xử l , phân tích bằng
các phần mềm chuyên dụng như BioEdit, DNA Club, MEGA6 và các công cụ
hỗ trợ online trên các ngân hàng gen NCBI.

48. 39
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghi n cứu giám định các loài Giổi ăn hạt bằng chỉ thị hình
thái
- Qua nghiên cứu, tìm hi u các thông tin liên quan đến vùng phân bố, vị
trí phân loại của loài Giổi ăn hạt đăng trên các website của huyện Kim Bôi và
Lạc S n thuộc tỉnh Hòa Bình; Tam Đảo thuộc tỉnh V nh Phúc; Vườn quốc gia
Chư Yang Sin thuộc tỉnh Đăk Lăk; Khu rừng thực nghiệm Kon Hà Nừng
thuộc tỉnh Gia Lai v.v… Kết hợp điều tra thu thập mẫu ngoài thực địa cho
một số kết quả giám định về hình thái các loài Giổi ăn hạt nghiên cứu.
3.1.1. Về phân loại và hệ thống học thực vật chi Giổi (Michelia L.)
- Chi Giổi (Michelia L.) được thiết lập bởi Carl von Linnaeus - người
Thụy Đi n năm 1753, dựa trên loài gốc (typus) Michelia champaca L. và
được công bố trong công trình "Species Plantarum" 1: 536 (1753). Đặc đi m
chính dễ dàng được nhận biết của chi này bởi hoa luôn sinh ra từ nách lá
(axillary), bộ nhụy có cuống (gynophore) và bao phấn trên các nhị mở hướng
bên (latrorse). Cũng trong công trình này, ông cũng đã đề xuất hai chi mới đó
là chi Ngọc lan – Magnolia L. (Typus: Michelia virginiana L.) và chi Áo cộc
– Liriodendron L. (Typus: L. tulipifera L.). Vị trí của chi Michelia độc lập
tiếp đó được nhiều tác giả sử dụng trong các công trình của họ như: Jussieus
(1789), Loureiro (1790), Candolle (1824), Blume (1823, 1825), Spach (1839),
Hooker và Thomson (1855). Tuy nhiên, Baillon (1866) trong công trình
„Recueil r riodique d'observations botaniques: M noire sur la Famille des
Magnolic es‟ cho rằng các đặc trưng hình thái đ phân chia 4 chi: Magnolia,
Manglietia, Michelia và Talauma là chưa đủ mạnh, vì vậy ông đã hạ bậc
chúng thành các nhánh (section) trong một chi duy nhất: Magnolia L. Quan
đi m của Baillon (1866) không được nhiều nhà thực vật học sử dụng lúc bấy

49. 40
giờ và cụ th là Prantl (in Engler and Prantl, 1891), King (1891) và Dandy
(1927) vẫn coi Michelia L. như một chi độc lập trong các tác phẩm của họ.
- Năm 1940, Hsu Hsen Hu – nhà thực vật học người Trung Quốc đã
dựa trên loài gốc (basionym) Michelia baillonii Pierre đ tổ hợp thành một chi
mới Paramichelia (Pierre) Hu với loài gốc (type species) là P. baillonii
(Pierrre) Hu (Sunyatsenia 4: 142. 1940). Đặc đi m hình thái c bản đ phân
tách chi mới từ chi Michelia L. đó là dạng quả tụ (freshy syncarp) thay vì
dạng quả đại (follice) ở chi Michelia L. Dạng quả tụ này khi già phần thịt quả
rụng đi, chỉ còn lại 'bộ xư ng đặc biệt'. Cũng dựa trên quan đi m phân loại
này, năm 1963 một nhà thực vật khác người Trung Quốc – Woon Young
Chun đã thiết lập một chi mới là Tsoongiodendron Chun dựa trên loài gốc là
T. odorum Chun (Acta Phytotax. Sin. 8: 283. 1963). Chi so sánh gần nhất đ
thiết lập chi mới mà Chun sử dụng là Talauma Juss. Ông cho rằng đặc đi m
dạng quả tụ (woody syncarp), khi già các phần thịt quả rụng đi theo cánh đặc
biệt và các hạt thường được gi lại bởi các sợi nhỏ trên đế quả (torus) là đặc
đi m chung của hai chi. Tuy nhiên, ở Tsoongiodendron có hoa phân bố ở
nách lá (vs. đầu cành ở Talauma), bộ nhụy có cuống (vs. không cuống), noãn
nhiều h n 2 (vs. 2) trong mỗi lá noãn là các đặc đi m đủ mạnh đ thành lập
chi mới (và đây cũng chính là các đặc đi m của chi Michelia). Hai chi mới
này được nhiều nhà phân loại thực vật chấp nhận như Dandy (1964, 1974), và
các thế hệ nhà thực vật học Trung Quốc như Law (1984), Law, Lo & Wu
(1996) và các nhà thực vật học Việt Nam như: Phạm Hoàng Hộ (1972, 1991,
1999), Nguyễn Tiến Bân (1995, 2003) v.v…
- Năm 1985, trong công trình 'Notes on Magnoliaceae', Hans P.
Nooteboom – nhà thực vật học người Hà Lan, người đã có nhiều công sức
nghiên cứu Magnoliaceae, đã sắp xếp lại và đưa hai chi mới thành lập trên của
Hu (1940) và Chun (1963) thành hai chi đồng loại (synonym) của Michelia L.

50. 41
Quan đi m sắp xếp này cũng được th hiện trong các bộ chuyên khảo về thực
vật như „Notes on Magnoliaceae III: The Magnoliaceae of China‟ của Chen
và Nooteboom (1993), Thực vật chí Trung Quốc của Xia et al. (2008).
Hình 3.1A. Một phần cây
Phylogeny hình thái thể hiện mối
quan hệ phát sinh của các loài
Michelia (Li & Conran, 2003)
Hình 3.1B. Một phần cây Phylogeny
phân tử (ndhF sequences) thể hiện mối
quan hệ phát sinh của các loài Michelia
(Kim et al. 2001).
- Trong các công trình nghiên cứu hệ thống phát sinh (phylogeny)
dựa trên các dẫn liệu về hình thái (Li & Conran, 2003) và phân tử (Kim et
al., 2001; Nie et al. 2008) đã chỉ ra rằng hai loài Paramichelia baillonii và
Tsoongiodendron odorum đều tụ họp trong một cụm (cluster) với các loài
khác trong Michelia. Điều này càng kh ng định rằng hai loài trên nên được
xử l và đưa về chi Michelia L. Trong bài viết này tác giả chỉ dừng lại ở
mức phân tích vị trí của hai loài trên trong mối quan hệ phát sinh chủng loại
gi a các loài trong chi Michelia và nh ng đưa ra một số dẫn liệu về việc nên
xem x t chuy n loài Paramichelia baillonii và Tsoongiodendron odora
thành các loài trong cùng một chi: Michelia baillonii và Michelia odora, trên
phư ng diện phân loại truyền thống với hiện đại, kết hợp quan đi m riêng
của tác giả trong bối cảnh phức tạp về quan đi m hệ thống học họ Ngọc lan
(Magnoliaceae) trên thế giới.

51. 42
3.1.2. Đặc trƣng cơ bản về hình thái của các loài trong chi Giổi
3.1.2. . Dạng sống và một số đặc trưng về hình thái
- Hầu hết các loài thuộc chi Giổi ở Việt Nam là các loài cây thân gỗ, phân
cành cao; chiều cao trung bình thường khoảng 20 – 30 m, đường kính khoảng
25 – 50 cm, ngoại trừ loài Tử tiêu (Michelia figo) là cây bụi cao từ 2 – 3 m.
Loài Tử tiêu này cùng 2 loài Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba) và Ngọc lan
hoa vàng (Michelia champaca) thường được trồng làm cảnh khá phổ biến ở
Việt Nam. Các loài này rất hiếm gặp trong tự nhiên (tác giả chưa từng gặp
trong các đợt điều tra khảo sát). Các bộ phận lá, hoa v.v… của đa số các loài
trong chi Giổi đều có hư ng th m hấp dẫn (hư ng th m ngọc lan!) (hình 3.2).
Hình 3.2. Cành mang hoa của loài Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis)
[Ảnh Vũ Quang Nam]
- Vị trí mọc của chồi, sẹo đ lại quanh cành là nh ng đặc đi m phân loại
quan trọng đ nhận biết các chi trong họ Ngọc lan. Một đặc đi m dễ dàng
nhận biết là các vết sẹo quanh cành (annual scars) được đ lại sau khi các lá
k m bao chồi rụng đi, ngay cả trên cuống của hoa và quả các vết sẹo này cũng
rất rõ. Tuy nhiên, chúng là các vết sẹo do các lá bắc dạng spathe đ lại sau khi
rụng. Bên cạnh đó, nhiều loài trong chi Giổi có lá k m bao chồi dính với
cuống lá, sau này rụng đi đ lại các vết sẹo dài ngắn khác nhau trên cuống lá.
Các chồi hoa, thậm chí cả các chồi sinh dư ng của các loài Giổi đều mọc ở

52. 43
nách lá và đây là một đặc trưng phân loại quan trọng của chi Giổi. Vỏ cây
không bị nứt, có màu xám loang lổ, gỗ trong (khi ch m bỏ lớp vỏ) màu vàng
tư i, th m và dễ nhận biết ngoài thực địa (hình 3.3).
Hình 3.3. Một số đặc trƣng hình thái ở chi Giổi
A. Dạng sống và vỏ cây; B. Sự sinh trƣởng của chồi cành (nét liền
năm trƣớc; nét đứt năm hiện tại); C. Đặc trƣng hình thái về sẹo
quanh cành, sẹo tr n cuống lá và vị trí mọc ở nách lá của chồi hoa.
[Ảnh Vũ Quang Nam]
- Các loài Giổi có lá đ n, mọc cách xoắn, có lá kèm (lá kèm bao chồi);
mép lá nguyên, có th có uốn lượn hoặc cuộn nhẹ xuống khi khô. Phiến lá
thường dạng xoan, bầu dục gần tròn hay có th dạng trứng ngược; gốc lá dạng
nêm từ hẹp tới rộng, gần tròn hoặc tròn (Michelia foveolata, Michelia odora,
Michelia citrata), chót lá đa dạng, nhưng hầu hết là nhọn và thuôn dài, đôi khi
có mũi hoặc tù hay tròn; mặt dưới lá có th là bạc (Michelia floribunda,
Michelia fulva) hay không bạc (Michelia alba, Michelia citrata, Michelia
lacei,...), hay đôi khi có phủ lớp lông xám trắng, mượt (Michelia baillonii)
hoặc nâu đồng (Michelia foveolata). Hệ gân chủ yếu có dạng lông chim, các