Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGÔ ĐỨC DUY
PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ
BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGÔ ĐỨC DUY
PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ
BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS HOÀNG QUỐC KHÁNH
Thành phố Hồ Chí Minh- 2019

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những thông tin đƣợc viết trong luận văn này là do tôi
thực hiện và sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts Hoàng Quốc Khánh. Mọi kết quả
nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng, cùng với các thông tin nghiên cứu khác đƣợc
trích dẫn rõ ràng, cụ thể trong luận văn.
Nội dung trong đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ bất cứ
Hội đồng khoa học bảo vệ luận văn Thạc sĩ nào và chƣa đƣợc công bố. Tôi xin
chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan trên.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019
Ngƣời cam đoan
Ngô Đức Duy

ii
LỜI CẢM ƠN
Luận văn đƣợc hoàn thành nhờ vào sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts
Hoàng Quốc Khánh và tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Thầy.
Cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi
nhất hoàn thành khóa học, Thầy cô Giảng viên và Học Viện Khoa học và
Công nghệ.
Cảm ơn Gs Yasuo Igarashi, Gs Masahura Ishii của Trƣờng GSALS
(The Graduate School of Agricultural and Life Sciences), Đại học Tokyo
Nhật Bản, đã hỗ trợ kỹ thuật và tài chính cho nghiên cứu này thuộc dự án
“Kết hợp bền vững nền nông nghiệp địa phƣơng với công nghiệp chế biến
biomass” của JICA (Japan International Cooperation Agency), JST (Japan
Science and Technology Agency) và Đại học Bách Khoa TP.HCM. Lời
cảm ơn những Anh Chị đồng nghiệp; Ts Kouji Yoshida, Ts Mannix Pedro,
Makoto Ato, Chihaya Yamada, Đào Thị Thu Hiền, Hoàng Ngọc Phƣơng
Thảo, Nguyễn Hoàng An, Nguyễn Ngọc Liên, Ts Nguyễn Hoàng Dũng và
các Em trong phòng Vi sinh đã hỗ trợ nhiều trong nghiên cứu. Với những
chia sẽ vui buồn từ các bạn Học viên Cao học là động lực cho tôi hoàn
thành luận văn.
Đặc biệt gửi lời cảm ơn tới Mẹ Cha, vợ Trần Thị Hồng Vân, con
Ngô Đức Anh, Ngô Đức Dũng rất nhiều và Anh Chị trong Gia đình đã
luôn ủng hộ tôi trong mọi điều kiện.
Ngô Đức Duy

iii
LỜI NÓI ĐẦU
Hiện nay định danh chủng vi sinh không còn nhiều khó khăn nhƣ trƣớc,
vì sự phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với những phƣơng pháp
đa dạng và độ chính xác cao. Phần lớn định loại loài trƣớc đây luôn dựa vào
quá trình phân lập thuần chủng hoặc sàng lọc đặc tính quan trọng cho mục
đích nghiên cứu. Tuy nhiên có những nghiên cứu đỏi hỏi biết rõ các thành
phần loài vi sinh tồn tại trong mẫu vật, quá trình thay đổi thành phần, số
lƣợng chủng loài phụ thuộc nhiều vào thành phần cơ chất, điều kiện sống và
quá trình trao đổi chất. Trong tự nhiên vi sinh vật rất đa dạng, mức độ thay
đổi theo điều kiện môi trƣờng, phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh
thông qua việc xác định gene trƣớc tiên dựa trên các kỹ thuật sinh học phân
tử.
Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã và đang đƣợc sử dụng trong hầu hết
các lĩnh vực nghiên cứu về gene của công nghệ sinh học, trong đó có kỹ thuật
phân tích PCR-DGGE cơ bản tách độc lập riêng biệt mỗi trình tự gene với độ
chuẩn xác khác biệt 1 nuclotide. Chính vì vậy mà có thể sử dụng kỹ thuật
DGGE xác định cộng đồng vi khuẩn trong mẫu mà không cần giai đoạn phân
lập làm thuần chủng, bên cạnh đó có thể kết hợp với kỹ thuật Tạo dòng trong
nghiên cứu sẽ giúp hiệu suất nghiên cứu cao hơn và tăng tính ứng dụng đa
dạng phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân tích cộng đồng vi sinh vật.
Mục tiêu nội dung của nghiên cứu là sử dụng phƣơng pháp PCR-
DGGE và tạo dòng để xác định cộng đồng vi khuẩn trong rơm trƣớc và sau ủ.
Nhằm phân tích đánh giá khả năng biến động đa dạng vi khuẩn có trong
nguồn rơm ủ dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử . Tạo nền tảng cho việc phân
lập, tuyển chọn những loài vi khuẩn nhƣ chịu nhiệt, sinh cellulase và các định
hƣớng nghiên cứu ứng dụng cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học trong tƣơng
lai.

iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
APS: Ammonium Persulfate
BA: Bis-Acrylamine
bp: base pairs
CTAB: Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide
DFB: Diffusion buffer
DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
DNA: Deoxylribonucleic acid
dNTPs: Deoxyrinonucleotide triphosphates
EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
PCR: Polymerase Chain Reaction
PFGE: Pulse Field Gel Electrophoresis
RAPD: Random amplified polymorphic DNA
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms
RNA: Ribonucleic acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
TAE: Tris Acetic
TEMED: Tetramethyl ethylene diamine
UF: Urea Formamide
UV: Ultra violet

v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới. .............................. 1
Bảng 1.2. Thành phần cấu tạo chung của rơm rạ.............................................. 4
Bảng 1.3. Thành phần hóa học chính của rơm rạ. ............................................ 4
Bảng 1.4. Số liệu thống kê sản lƣợng gạo và rơm rạ trên thế giới. .................. 7
Bảng 1.5. Phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt xác định một số bệnh trên
lúa mì...............................................................................................................17
Bảng 2.1. Các cặp mồi cho vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu. ...................23
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................27
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR. ......................................................27
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR vùng gene V3.....................................28
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gene V3. ...........................................29
Bảng 2.6. Chuẩn bị cách pha nồng độ bảng gel polyacrylamine....................30
Bảng 2.7. Tỷ lệ phối trộn nồng độ gel polyacrylamide vào hai xilanh...........31
Bảng 2.8: Thành phần Big – dye PCR............................................................35

vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1.Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Việt Nam……….3
Hình 1.2. Qui trình phân giải cellulose thành glucose....................................10
Hình 2.1. Một số hình ảnh thu nhận lấy mẫu rơm. .........................................22
Hình 2.2. Qui trình thực hiện trong nghiên cứu..............................................25
Hình 2.3. Qui trình ly trích và thu nhận DNA từ mẫu rơm. ...........................26
Hình 2.4. Qui trình thu nhận gene V3 từ gel polyacrylamdie.........................33
Hình 2.5. Cấu trúc pGEM@
-T Easy vector của hãng Omega.........................34
Hình 3.1. Biểu đồ thay đổi nhiệt độ trong qúa trình ủ rơm.............................38
Hình 3.2. Kết quả ly trích thu nhận DNA bộ gene vi sinh trong mẫu R. .......39
Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu R.........40
Hình 3.4. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu R. ......................................41
Hình 3.5. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu Rn.......43
Hình 3.6. Kết quả thu nhận sản phẩm tạo dòng. ............................................44
Hình 3.7. Kết quả 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 ......................................45
Hình 3.8. Kết quả 30 sản phẩm DGGE chạy trên hệ thống BioRad ..............46
Hình 3.9. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu Rn. ....................................47
Hình 3.10. Thử khả năng sinh cellulase trên đĩa CMC của mẫu Rn. .............48

vii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii
LỜI NÓI ĐẦU ................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT......................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ.......................................................vi
MỤC LỤC......................................................................................................vii
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 1
1.RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ.............. 1
1.1. Rơm rạ ............................................................................................... 1
1.2. Thành phần cấu tạo rơm rạ................................................................ 3
1.3. Giá trị kinh tế của rơm rạ .................................................................. 6
1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM 9
1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose ........................... 9
1.2.2. Hệ vi sinh phân giải cellulose ...........................................................11
1.3.KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH...............12
1.3.1. Các phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật...................12
1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh ................................14
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR trong trong định danh vi khuẩn........................................................ 16
1.3.2.2. Kỹ thuật PCR-DGGE trong định danh vi khuẩn..................................................... 18
1.3.2.3. Kỹ thuật tạo dòng.................................................................................................... 20
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................21
2.1.VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ...................22
Hóa chất.......................................................................................................23
Thiết bị và dụng cụ......................................................................................24
2.2.CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................24

viii
2.2.1.Phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA ............................................26
2.2.2. Phƣơng pháp PCR nhân bản gene 16S rDNA và vùng gene V3......27
2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm gene V3 .......................................29
2.2.4. Phƣơng pháp thực hiện kỹ thuật DGGE ...........................................30
2.2.4.1. Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine và thực hiện DGGE................................... 30
2.2.4.2. Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide.................................. 32
2.2.4.3. PCR gene V3 sau khi thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F và 517R.................... 33
2.2.5. Phƣơng pháp tạo dòng ......................................................................34
2.2.6. Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài ......................35
2.3. Khảo sát sinh cellulase phƣơng pháp đĩa CMC...................................36
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................38
3.1. Kết quả kiểm tra nhiệt độ.....................................................................38
3.2. Kết quả thu nhận DNA genome của vi sinh vật trong mẫu rơm .........39
3.3. Kết quả thu nhận gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu R..................40
3.4. Kết quả phân tích dữ liệu cộng đồng vi khuẩn của mẫu R..................41
3.5. Kết quả DNA, gene 16S rDNA và gene V3 mẫu Rn...........................42
3.6. Kết quả tạo dòng trên vector pGEM@
-T Easy của hãng Promega ......43
3.7. Kết quả thu nhận vùng gene V3 sau khi đã tạo dòng ..........................44
3.8. Kết quả kiểm tra gene V3 sau khi tạo dòng bằng kỹ thuật DGGE......45
3.9. Kết quả sơ bộ định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn ....................48
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................50
4.1. Kết luận ................................................................................................50
4.2. Kiến nghị..............................................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................51

1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ
1.1. Rơm rạ
Theo thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng của Liên Hợp Quốc (FAO-
Food and Agriculture Organization) [1], sản xuất lúa gạo trên thế giới chạm
mức kỷ lục 759,6 triệu tấn lúa (503,9 triệu tấn gạo) trong năm 2017 và năm
2018 tiếp tục tăng sản lƣợng thêm 10,3 triệu tấn lên mức cao mới 769,9 triệu
tấn lúa (510,6 triệu tấn gạo). Dự báo sản lƣợng sẽ tăng trƣởng 1,4% trong
năm 2019, khu vực sản xuất lúa gạo tập trung ở Châu Á là chính, trong đó 2
vùng sản xuất lớn là Nam Á và Đông Nam Á với mức tăng sản lƣợng tuyệt
đối lớn nhất đƣợc dự đoán sẽ là Ấn Độ, sản xuất tăng đáng kể ở các nƣớc nhƣ
Bangladesh, Sri Lanka, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal,
Philippines và Thái Lan, Việt Nam xem bảng 1.1. Tƣơng ứng với việc tăng
trƣởng sản xuất lúa gạo hàng năm thì sản lƣợng rơm rạ đƣợc thải ra ngoài
đồng ruộng trên toàn cầu cực kỳ lớn, nhƣng tới nay chƣa có thống kê chính
xác về lƣợng rơm rạ thải ra sau thu hoạch lúa, vì tùy thuộc vào văn hóa bản
địa, loại giống lúa trồng trọt, vùng canh tác và điều kiện thổ nhƣỡng. Nhƣng
tổng thể ƣớc lƣợng trung bình sản xuất ra 1 tấn gạo thì sẽ thải ra khoảng 1,5
tấn rơm rạ.
Bảng 1.1. Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới.
Khu vực/Quốc gia Số lƣợng gạo
(triệu tấn)
Khu vực/Quốc gia Số lƣợng gạo
(triệu tấn)
Thế giới 758.9 Châu Phi 30.7
Châu á 686.4 Ai Cặp 6.2
Trung Quốc 210.1 Nigeria 5.3
Ấn Độ 165.3 Madagascar 3.5
Indonesia 74.2 Tanzania 3.1
Bangladesh 53.1 Mali 2.8
Việt Nam 44 Guinea 2.2
Thai Lan 33.3 Nam Mỹ 24.9

2
Myanmar 28.3 Brazil 11.9
Philippines 18.6 Colombia 2.6
Nhật Bản 10.7 Peru 3.1
Pakistan 10.3 Bắc Mỹ 9.1
Camphuchia 9.7 Mỹ 9.1
Triều Tiên 5.5 Trung Mỹ 2.9
Nepal 5.4 Châu Âu 4.1
Lào 4 Nga 1.1
Malaysia 3.1 Úc 0.9
Sri Lanka 3
Việt Nam đã trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu gạo đứng đầu
trên thế giới hiện nay, tốc dộ tăng trƣởng sản xuất lúa gạo từ những năm 2012
đạt sản lƣợng 43,7 triệu tấn lúa. Đến năm 2018, sản lƣơng tăng lên khoảng 55
triệu tấn, xuất khẩu gạo đạt 6,1 triệu tấn, nâng giá trị 3,06 tỷ USD. Theo dữ
liệu thống kê những năm gần đây của Bộ Nông nghiệp Phát Triển Nông thôn
Việt Nam, vụ mùa 2015/16 đạt 44,13 triệu tấn lúa, vụ mùa 2016/17 đạt 44,52
triệu tấn và vụ mùa 2017/18 đạt đƣợc 44,96 triệu tấn. Dự kiến năm 2019 diện
tích trồng lúa trên cả nƣớc là 7,53 triệu ha, sản lƣợng gạo dự kiến tƣơng
đƣơng năm 2018. Bên cạnh đó thống kê của tổ chức GAIN (Global
Agriculture Information Network) của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ về diện tích
gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Viêt Nam từ năm 1993 đến 2017 tăng
trƣởng liên tục cả về diện tích và năng suất xem hình 1.1.
Những nỗ lực đem lại lợi ích từ sản xuất lúa gạo ngày càng gia tăng và
tăng thu nhập cho nông dân, nhƣng song song với đó là lƣợng rơm rạ thải ra
hàng năm ở nƣớc ta trung bình khoảng 55 triệu tấn. Đây cũng là một thách
thức cho việc xử lý giảm thiểu ô nhiễm rơm, bên cạnh đó tận dụng nguồn tài
nguyên phế phụ phẩm nông nghiệp ở nƣớc ta. Trong 55 triệu tấn Rơm thải ra
hàng năm có khoảng 20% đƣợc sử dụng cho gia sức gia cầm, trồng nấm rơm,
phân ủ, còn lại là đốt hoặc bỏ lại trên đồng ruộng gây ô nhiễm môi trƣờng
đồng ruộng và lãng phí nguồn tài nguyên tái sinh dồi dào.

3
Hình 1.1. Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Việt Nam
Vấn đề đặt ra làm nhƣ thế nào và làm sao để tận dụng nguồn tài nguyên
tái tạo và dồi dào nhƣ rơm rạ. Để đạt hiệu quả cao thì trƣớc tiên sẽ phân tích
phân tích về thành phần cấu tạo và dinh dƣỡng trong rơm.
1.2. Thành phần cấu tạo Rơm
Thành phần cellulose, lignocellulose và lignin là nguồn sinh khối
chính của tế bào thực vật nói chung và rơm rạ nói riêng. Rơm là nguồn
nguyên liệu đƣợc tái sinh trong tự nhiên, các thành phần cấu tạo rơm có sự
thay đổi dựa vào sự phát triển trong các chủng loại lúa, điều kiện thổ nhƣỡng
canh tác khác nhau, các yếu tố môi trƣờng khắc nghiệt, côn trùng và mầm
bệnh. Thành phần hóa học của rơm tính theo khối lƣợng khô gồm cellulose
60%, lignin 14%, đạm hữu cơ (protein) 3%, chất béo (lipid) 2%. Nếu tính
theo nguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hydro (H) 5%, oxygen (O) 49%,
nitơ (N) khoảng 0,92%, một lƣợng rất nhỏ photpho (P), lƣu huỳnh (S) và kali
(K). Theo kết quả phân tích thành phần đƣờng cơ bản chính trong rơm bao

4
gồm hexose (glucose, galactose, mannose), pentose (xyloza, arabinose), lignin
(cả axit hòa tan và không hòa tan), tro, silica. Ngoài ra còn có các thành phần
phi cấu trúc chủ yếu bao gồm protein (khoảng 3%) và pectin (khoảng 2,8%)
cùng với một lƣợng nhỏ đƣờng tự do, diệp lục, chất béo, dầu và sáp đƣợc nêu
trong bảng Bảng 1.2 và 1.3 [2, 3, 4, 5] .
Bảng 1.2. Thành phần cấu tạo chung của rơm rạ.
Thành phần Hàm lƣợng (w/w%)
Glucose 34.0 - 43.7
Xylose 19.0 - 22.0
Arabinose 2.0 - 3.6
Mannose 1.8 -2.0
Galactose 0.4
Acid soluble lignin 2.2 - 6.0
Acid insoluble lignin 13.0 - 22.7
Ash and silica 7.8 - 20.3
Extractive (i.e., protein, pectin,) 16.1- 19.3
other nonstructural components)
Bảng 1.3. Thành phần hóa học chính của Rơm.
Thành phần Đơn vị tính Hàm lƣợng
Carbon wt% 47.92
Hydrogen wt% 6.54
Nitrogen wt% 0.53
Sulphur wt% 0.09
Oxygen wt% 44.80
Tổng wt% 100.00
Thành phần hóa học
Nguyên tố halogen
Chlorine (Cl) mg/kg 1,109.4
Bromine (Br) mg/kg 0.0
Fluorine (F) mg/kg 0.0
Nguyên tố chính
Aluminium (Al) mg/kg (dry) 143.0
Potassium (K) mg/kg (dry) 8,668.0
Sodium (Na) mg/kg (dry) 162.0
Calcium (Ca) mg/kg (dry) 3,899.0

5
Silicon (Si) mg/kg (dry) 6,734.0
Magnesium (Mg) mg/kg (dry) 571.0
Iron (Fe) mg/kg (dry) 100.0
Phosphorus (P) mg/kg (dry) 558.0
Titanium (Ti) mg/kg (dry) 3.6
Nguyên tố phụ
Cadmium (Cd) mg/kg (dry) 0.0
Cobalt (Co) mg/kg (dry) 15.0
Chromium (Cr) mg/kg (dry) 1.7
Copper (Cu) mg/kg (dry) 3.0
Manganese (Mn) mg/kg (dry) 17.0
Nickel (Ni) mg/kg (dry) 1.5
Lead (Pb) mg/kg (dry) 1.0
Vanadium (V) mg/kg (dry) 0.3
Zinc (Zn) mg/kg (dry) 6.6
Barium (Ba) mg/kg (dry) 22.5
Nguyên tố khác
Strontium (Sr) mg/kg (dry) 26.0
Boron (B) mg/kg (dry) 2.7
Tungsten (W) mg/kg (dry) 13.0
Những kết quả đã phân tích cho thấy rằng thành phần chất xơ trong
rơm rạ chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin. Cellulose gồm nhiều
chuỗi thẳng ghép nhau thành bó dài nhờ mạch nối hydrogen tạo cấu tạo dạng
sợi, có cấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một
disaccharide gọi là cellobiose, có cấu tạo từ hai phân tử D-glucose.
Các đơn vị D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 và đƣợc giữ
chặt bởi liên kết hydro liên chuỗi và liên chuỗi mạnh để tạo thành các vi sợi.
Chúng cung cấp độ bền cơ học cho thành tế bào thực vật và có thể dài vài µm
trong rơm và đƣờng kính khoảng 12-35nm [6, 7]. Các công bố cho thấy mức
độ trùng hợp D-glucose của rơm rạ cao hơn một chút so với dƣ lƣợng nông
nghiệp khác nhƣ rơm lúa mì và bã mía nhƣng nó thấp hơn đáng kể so với gỗ
cứng và gỗ mềm [8].
Hemicellulose là những heteropolysaccharide cùng với cellulose có ở
màng tế bào thực vật, không hòa tan đƣợc trong nƣớc nhƣng hòa tan đƣợc
trong dung dịch kiềm và bị thủy phân bởi acid dễ dàng hơn so với cellulose.

6
Hemicellulose liên kết một phần với lignin bởi các liên kết cộng hóa trị, trong
khi đó mối liên kết giữa hemicelluloses và cellulose là thông qua liên kết
hydro. Trong dạ cỏ loài động vật nhai lại có những vi khuẩn đặc biệt chứa
enzyme cellulase phân giải đƣợc cellulose. Cellulose và hemicellulose là
những hợp chất có thể tiêu hóa đƣợc.Nhƣng cấu tạo cellulose trong của vách
tế bào rơm rạ qua nhiều liên kết và cấu trúc không gian phức tạp, nên enzyme
của hệ vi sinh vật không dễ dàng tác động đƣợc. Lớp ngoài thành tế bào đƣợc
tạo thành chủ yếu từ các phức chất lignohemicellulose mà các enzyme vi sinh
dạ cỏ phân giải chậm làm cản trở những lớp cellulose bị tác động của hệ
enzyme vi sinh vật. Để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa của rơm rạ và các chất xơ khác,
các nhà nghiên cứu đã tiến hành xử lý rơm bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ: lý
học, hóa học, vi sinh vật [9, 10].
Thành phần thứ ba đáng chú ý trong xơ là lignin, lignin luôn đi kèm với
cellulose và hemicellulose trong thành phần tế bào, không hòa tan trong nƣớc,
trong các dung môi hữu cơ bình thƣờng và rất bền vững bởi enzyme của hệ
sinh vật dạ cỏ. Nhƣng dƣới tác dụng của kiềm thì lignin một phần bị phân giải
và chuyển vào dung dịch. Lignin là polymer có nhiều thứ hai trên trái đất sau
cellulose, lignin chủ yếu bao gồm ba loại cấu trúc chủ yếu là monolignols,
hydroxycinnamyl (p- coumaryl, coniferyl và rƣợu sinapyl) liên kết với nhau
bằng các loại liên kết ether và carbon-carbon khác nhau nhƣ β-O-4, 4-O- 5, -,
β- 1 và β- 5 để tạo ra các đơn vị phenylpropanoid nhƣ p - hydroxyphenyl (H),
guaiacyl (G) và syringyl (S). Trong số này, liên kết β-O-4 là liên kết ether
chiếm ƣu thế nhất (khoảng 40 - 60%) trong rơm rạ. Lignin đƣợc gắn vào
carbohydrate bởi este benzyl, ete benzen và phenyl glycoside. Do các mối liên
kết hóa học và liên kết vật lý chặt chẽ này, rất khó để loại bỏ lignin ở dạng
nguyên sinh của nó [11].
1.3. Giá trị kinh tế của rơm rạ
Thành phần đã phân tích ở trên cho thấy nguồn giá trị từ rơm chƣa
đƣợc quan tâm đúng mức trong thời gian dài, phần lớn rơm rạ thƣờng để mục,
tự phân hủy ở ngoài đồng ruộng hay đốt tại chỗ để trả lại khoáng chất cho
ruộng, phần còn lại đƣợc đem về làm thức ăn cho gia súc, phục vụ đun nấu

7
trong gia đình hay trồng nấm rơm. Hơn 20% rơm đƣợc sử dụng trong khi
khoảng 50% rơm bị đốt cháy hoặc để lại trên đồng ruộng, họ sẵn sàng cho vụ
mùa tiếp theo. Đốt rơm không những ảnh hƣởng khí nhà kính mà còn ô nhiễm
độc hại đã đƣợc báo cáo mà còn góp phần đến hen suyễn và các rối loạn hô
hấp khác ở trẻ nhỏ và ngƣời già [12, 13]. Do đó, cần phải phát triển các giải
pháp nghiên cứu mới nhằm tận dụng rơm để nông dân nhận đƣợc lợi nhuận
cao hơn cho việc thu gom từ ruộng và kềm chế đốt rơm gây thêm ô nhiễm
môi trƣờng.
Năm 2009, dữ liệu báo cáo của Tổ chức Nông Lƣơng của Liên Hợp
Quốc lúa đƣợc trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, tuy
nhiên một số ít sản xuất lúa ở vùng khí hậu Địa Trung Hải. Khu vực sản xuất
lúa gạo tập trung ở Châu Á là chính, trong đó 2 vùng sản xuất lớn là Nam Á
và Đông Nam Á. Đối với lúa mì, các nhà sản xuất chính đƣợc đặt tại Nam Á,
Đông Âu, Bắc Mỹ và Đông và Trung Á. Đối với Liên minh châu Âu, lúa mì
là loại cây trồng chiếm ƣu thế hơn so với trồng lúa gạo.Thống kê sản lƣợng
lúa gạo và sản lƣợng rơm đƣợc tạo ta trên toàn thế giới nêu trong bảng 1.4.
Bảng 1.4. Số liệu thống kê sản lƣợng gạo và rơm rạ trên thế giới (FAO).
Diện tích(ha) Gạo (tấn) Rơm rạ (tấn)
Thế giới 158,511 684,595 727,400
Nam Á 59,449 202,889 215,600
Đông Nam Á 48,203 197,777 210,100
Tây Á 32,999 216,630 230,200
Đông Á 5,114 10,392 11,000
Nam Mỹ 5,253 25,568 27,200
Đông Phi 3,147 6,701 7,100
Trung Phi 691 663 700
Bắc Phi 590 5,593 6,000
Liên Minh Châu
462 3,152 3,350

8
Âu
Caribbean 456 1,246 1,300
Nam Âu 418 2,906 3,100
Trung Mỹ 326 1,228 1,300
Đông Âu 225 1,183 1,250
Trung Á 193 696 740
Tây Á 153 927 990
Tây Âu 24 138 150
Châu Đại Dƣơng 14 82 90
Nam Phi 1 3 3
Lƣợng lớn rơm hàng năm trên toàn cầu xem nhƣ là nguồn nhiên liệu vô
cùng lớn. Nhiều khía cạnh phân tích đã công bố về thành phần rơm đã cho
thấy những giá trị kinh tế nguồn phụ phẩm nông nghiệp đem lại rất lớn và đa
dạng để sản xuất dầu sinh học, than sinh học và khí sinh học từ rơm rạ. Dầu
sinh học rơm rạ đã đƣợc báo cáo bao gồm một số thành phần phụ nhƣ ketone,
aldehyd, axit carboxylic, phenol, furfural và levoglucosan, ngoài ra than sinh
học đƣợc sản xuất từ rơm tạo độ phì của đất, tăng lƣu trữ carbon và giảm phát
thải khí nhà kính. Năng suất, chất dinh dƣỡng, hàm lƣợng chất dễ bay hơi,
khả năng trao đổi ion dƣơng, kali và phốtpho có sẵn hàm lƣợng than sinh học
giảm khi tăng nhiệt độ nhiệt phân, độ kềm và hàm lƣợng chất thơm. Than
sinh học có nguồn gốc từ rơm cho thấy khả năng hấp thụ ion Cu (II) và
cyromazine, một loại thuốc trừ sâu hữu cơ [14, 15, 16]. Quá trình khí hóa rơm
rạ để xử lý chất thải gần đây đã thu hút đƣợc sự quan tâm để sản xuất khí
Hydro và Metan. Rơm cũng đƣợc sử dụng làm nhiên liệu cho nồi hơi để sản
xuất điện và phân tích kinh tế kỹ thuật cho thấy rằng đó là một lựa chọn khả
thi để tạo ra điện nông thôn dựa trên lƣới điện nhỏ ở vùng sâu vùng xa và các
Quốc gia đang phát triển.
Khi mà vấn đề biến đổi khí hậu toàn cầu trở nên nóng bỏng thì việc sử
dụng khối lƣợng lớn rơm cho hợp lí là điều mà các nhà khoa học đang quan

9
tâm đến, trong đó các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc tận dụng nguồn
nhiên liệu cellulose trong rơm để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học
(biofuels) cho tƣơng lai nhằm thay thế nguồn tài nguyên dầu mỏ ngày cạng
kiệt.
Trong thành phần chính của rơm chủ yếu vẫn là cellulose và sản phẩm
phân giải cuối cùng có giá trị là D-glucose, cho nên việc phân giải và thu
nhân sản phẩm glucose làm nguồn nguyên liệu khác đã đƣợc quan trong nhiều
nghiên cứu. Trong đó có phƣơng pháp hóa học là phân hủy và thu nhận
cellulose mà còn phƣơng pháp sinh học là sử dụng sự phân giải tự nhiên của
hệ enzyme đƣợc sinh ra từ hệ vi sinh vật đƣợc quan tâm nhiều hơn.
1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM RẠ
1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật trong
điều kiện yếm khí và hiếu khí trong thời gian dài và sản phẩm phân giải cuối
cùng là glucose. Quá trình này diễn ra do nhiều nhóm vi sinh vật sinh tổng
hợp các loại enzyme có trong phức hệ enzyme cellulase phân giải cellulose.
Chính vì thế, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thƣờng rất chậm
và không triệt để. Sự tham gia enzyme phân hủy cellulose đƣợc các nhà khoa
học chia ra làm ba nhóm chủ yếu nhƣ sau [17, 18].
1,4 β-D-Glucan cellobiohydrolase: enzyme cắt đầu không khử của
chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có một loạt tên khác
nhƣ: cellobiosehydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và
avicellase. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh
mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme
endocellulase phân giải chúng.
1,4β-D-glucan 4 glucanohydrolase: enzyme này tham gia phân giải liên
kết β-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin và β-Dglucan. Sản phẩm của
quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose.Chúng tham gia tác
động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh.

10
Enzyme này còn có tên khác nhƣ: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase và C-
cellulase.
β-D-glucoside glucohydrolase: enzyme này tham gia phân hủy
cellobiose, tạo thành glucose. Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là
cellobiase và β-glucosidase.
Sự thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme
exoglucanase, endoglucanase, β-glucosidase. Trong những nghiên cứu riêng
rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme
cellulase, nhiều tác giả đều đƣa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase
sẽ thay nhau thủy phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose
xem hình 1.2.
Hình 1.2. Qui trình phân giải cellulose thành glucose.
Phân giải cellulose cơ bản là quá trình sinh học đƣợc tạo ra và kiểm
soát bởi các enzyme cellulase. Cellulase là enzyme đa dạng với chức năng
xúc tác cho một phản ứng đơn, nó đóng vai trò trong phản ứng thủy phân cầu

11
nối β-1, 4 giữa hai phân tử glucose cấu tạo nên cellulose. Hệ thống enzyme
cellulase bao gồm ba lớp enzyme ngoại bào có thể hòa tan là: 1, 4-β-
endoglucanase, 1, 4-β-exoglucanase, và β-glucosidase (β-D-glucoside,
glucohydrolase hoặc cellobiase). Endoglucanase chịu trách nhiệm trong sự
phân cắt ngẫu nhiên liên kết β-1, 4-glycosidic dọc theo chuỗi cellulose.
Exoglucanase thì cần thiết cho sự phân cắt đoạn cuối chuỗi không biến đổi và
phân tách các sợi cơ bản của tinh thể cellulose, và β-1, 4-glucosidase thủy
phân cellubiose và cellodextrin hòa tan thành glucose. Trên thực tế, mặc dù
đều sử dụng cơ chất cellulose nhƣng cơ chế phân giải cellulose của các loài vi
sinh vật rất khác nhau [19, 20, 21].
1.2.2. Hệ vi sinh phân giải cellulose
Nhiều nghiên cứu phân lập dòng vi sinh sản sinh enzyme cellulase và
khả năng phân giải cellulose từ các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm là chủ
yếu. Đa số các nghiên cứu tập trung vào nhóm vi sinh vật phân giải cellulose
chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ nhƣ bò, trâu, cừu, dê và
côn trùng nhƣ bọ cánh cứng, mối, trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nƣớc thải
[22, 23, 24].
Nhóm Vi khuẩn phân giải cellulose tập trung ở các loài vi khuẩn yếm
khí, chúng đƣợc phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng
nguồn thức ăn chính là cỏ, cây, rơm rạ các nhóm chính sau; Clostridium,
Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus,
Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae,
Cellulosimicrobium funkei, Pseudomonas nitroreducens. Ngoài ra còn một số
nhóm đƣợc phân lập từ đất nhƣ; Brevibacillus, Paenibacillus, Bacillus, và
Geobacillus [25, 26].
Nhóm Xạ khuẩn đƣợc biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc
hai, nổi bật là các loại kháng sinh nhƣ streptomycin, gentamicin, rifamycin và
erythomycin. Bên cạnh đó xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công
nghiệp dƣợc phẩm cũng nhƣ trong nông nghiệp. Trong đó số loài đáng chú ý
thuộc giống này nhƣ Streptomyces lividans, Streptomyces reticuli,
Streptomyces drozdowiczii. Còn nhóm thu nhận từ trầm tích nhƣ

12
Thermoactimnomyces, Streptosporangium cũng là những loài có khà năng
phân hủy cellulose [27, 28, 29, 30, 31].
Nhóm Nấm đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy
cellulose do các cellulase từ nấm thƣờng có hoạt lực cao hơn và ít có các dạng
vật lý phức tạp nhƣ enzyme này từ vi khuẩn nhƣ; Acremonium sp.,
Chaetomium sp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Penicillium
pinophilum, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii,
Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus và Rhizopus
oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy cellulose ở nhiều điều
kiện môi trƣờng khác nhau. Trong đó nhóm đáng chú ý nhất là nhóm
Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Mucor hầu nhƣ các loài này sống hoại
sinh trong xác thực vật nhƣ trên tre, nứa, gỗ tạo thành lớp mốc màu xanh phá
hủy các vật liệu trên. Mỗi nhóm tiết ra mỗi loại enzyme trong hệ enzyme
cellulase, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong mối quan hệ hỗ
sinh [32].
1.3. KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH
1.3.1. Các phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc
thu nhận một lƣợng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí
nghiệm tiếp theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic
acid là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị
phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay
hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi
trƣờng khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần đƣợc tách chiết trong điều
kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào
(Desoxyribonuclease - DNase và Ribonuclease- RNase) [33, 34].
Nhiều phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA bộ gene của vi sinh vật,
nhằm mục đích phục vụ cho các nghiên cứu ở cấp độ gene. Tuy nhiên đa số
các mẫu ly trích thu nhận DNA bộ gene của mỗi chủng loài dựa trên dòng
thuần chủng nhằm trách sự tạp nhiễm gene của các loài với nhau. Do đó, giai

13
đoạn tách chiết và thu nhận DNA vi sinh vật phục vụ cho nghiên cứu và ứng
dụng là rất cần thiết. Quá trình này cần phải đảm bảo về độ tinh khiết, nguyên
vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện đƣợc các khâu nghiên cứu tiếp theo. Tùy
thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phƣơng pháp ly trích thu nhận
DNA cho phù hợp.
Phƣơng pháp Benzyl Chloride: Đây là phƣơng pháp ly trích DNA
tƣơng đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia
nhiệt đến 650
C. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là đơn giản, nhanh chóng và
mang lại kết quả khá cao. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để ly trích DNA
của cả thực vật, nấm và vi khuẩn [35].
Phƣơng pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): đƣợc xem là phƣơng
pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật
với hiệu quả cao, ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyl
trimethyl ammonium bromide, proteinase K.
Bên cạnh đó phƣơng pháp sốc nhiệt: Phƣơng pháp này sử dụng kỹ
thuật đóng băng và tan băng ở - 650
C trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ
vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận
lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trƣờng tự nhiên [36].
Phƣơng pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là
phƣơng pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là
dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic với nồng độ muối cao (1,5 M
NaCl). vì vậy mà CTAB đƣợc dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết
acid nucleic và độ phá hủy vách tế bào rất cao, tuy nhiên CTAB mang tính
chất độc với môi trƣờng và sức khỏe. [37].
So sánh các phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn trong đất, vùng rễ,
phƣơng pháp SDS cho kết quả tốt nhất cả về khối lƣợng lẫn độ tinh sạch.
Phƣơng pháp SDS cho kết quả tốt là do sử dụng proteinase K phá vỡ hiệu quả
thành tế bào của vi sinh vật để giải phóng DNA dễ dàng. Phƣơng pháp CTAB
mặc dù không làm giảm khối lƣợng DNA chiết xuất từ đất vùng rễ nhƣng độ
tinh sạch chƣa cao và DNA bị ảnh hƣởng bởi nồng độ muối cao. Phƣơng pháp

14
đóng băng và tan băng it gây đứt gãy DNA nhƣng hiệu quả ly trích lại thấp.
báo cáo rằng sự kết hợp giữa việc nghiền, phƣơng pháp đóng băng và tan
băng, và phƣơng pháp SDS có thể thu đƣợc khối lƣợng DNA cao hơn nhiều
mà không ảnh cũng loại hƣởng đến độ nguyên vẹn về cấu trúc DNA [38].
Nhiều nghiên cứu phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA bộ gene vi
khuẩn trực tiếp từ mẫu rơm nhằm để giữ nguyên cộng đồng vi sinh hiện diện
trong mẫu, trong các điều kiện hiều khí và yếm khí đang đƣợc các nhà khoa
học quan tâm nghiên cứu. Việc ủ rơm và phân tích trong các giai đoạn khác
nhau sẽ cho ra các kết quả về cộng đồng vi sinh khác nhau. Ngoài ra, pH của
mẫu cũng làm thay đổi cộng đồng vi sinh đã đƣợc kiểm tra bằng cách sử dụng
phƣơng pháp in vitro [39, 40]. DNA vi khuẩn có trong rơm trƣớc khi ủ và
trong các giai đoạn ủ dài ngày, sử dụng kết hợp các phƣơng pháp nghiền mẫu
trong nitơ lỏng, dùng đệm ly trích CTAB, đóng băng và tan băng, sau đó bổ
sung proteinase K và SDS [41]. DNA tổng số thu đƣợc đem tinh sạch bằng
phƣơng pháp của sử dụng Sephadex G-200. Một nghiên cứu khác về ly trích
DNA của vi sinh vật phân giải cellulose bằng phƣơng pháp Benzyl Chloride,
sau đó để loại bỏ thành phần tạp có trong mẫu chiết xuất bằng cách sử dụng
Genclean spin kit (BIO101, Carlsbad, Calif.) ở giai đoạn tinh sạch [42].
1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử và vùng gene trong định danh
Để xác định tất cả các loài đã sống hoặc tồn tại trên hành tinh trái đất
này, một số tiêu chí ban đầu nhƣ đặc điểm hình thái hình thành nên cơ sở của
nhận dạng nhƣng sau đó các tính năng khác nhƣ sinh hóa, sinh lý và sinh học
phân tử đƣợc ghi nhận phải có. Cho đến nay, hơn 1,5 triệu loài động vật, thực
vật và vi sinh vật đã đƣợc định danh và ƣớc tính số lƣợng các loài sống chƣa
đƣợc mô tả có thể là hơn 3 triệu, đa số là nhóm vi sinh vật. Các nhà phân loại
học cho rằng ít nhất 50 triệu loài sinh vật khác nhau đã bị tuyệt chủng trong
quá trình tiến hóa. Mỗi loài sinh vật có thể tồn tại ở nhiều dạng khác nhau,
chúng có thể đƣợc tìm thấy ở hai giới tính khác nhau, nhóm tuổi, hình thức
theo mùa và các biến thể kiểu hình khác.
Trong phân loại phân tử, có thể nghiên cứu cả DNA và RNA, các kỹ
thuật chính đã đƣợc sử dụng trong hệ thống bao gồm xây dựng bản đồ giới

15
hạn và phân tích RAPD, RFLP, lai DNA-DNA, lai DNA-RNA và giải trình
tự bộ gene. Kỹ thuật RFLP đƣợc coi là phƣơng pháp nhạy cảm nhất để xác
định chủng và một số sinh vật đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi bằng cách sử dụng
kỹ thuật này. RFLP là một kỹ thuật khai thác các biến thể trong chuỗi DNA
tƣơng đồng. Phƣơng pháp PFGE và PCR đƣợc sử dụng để mô tả các loài sinh
vật, trong đó PFGE sử dụng các enzyme cắt giới hạn phân tử DNA để tạo ra
một kiểu đặc trƣng nhằm so sánh hai loài khác nhau dựa trên tính tƣơng đồng
hoặc không giống nhau giữa chúng. Phƣơng pháp PCR, một đoạn DNA duy
nhất đƣợc khuếch đại có thể là một gen mã hóa protein hoặc gen rRNA cụ thể
hoặc một phần của nó trong vùng gene bảo tồn phân loại. Lai phép DNA với
DNA dựa trên mức độ tái tổ hợp hai mạch với nhau với các thành viên của
cùng một loài cho thấy sự lai tạo cao nhất và xa loài cho tỷ lệ lai ít hơn. Trình
tự RNA cũng cung cấp cơ sở cho việc xác định hai loài riêng biệt, 16S rRNA
và 18 SrRNA là một phần của tiểu đơn vị ribosome của tế bào nhân sơ và tế
bào nhân chuẩn đƣợc phân lập và giải trình tự [43, 44].
Phân loại gene RNA ribosome là tiêu chuẩn vàng cho nghiên cứu phân
loại phân tử trong nhiều thập kỷ. Đặc biệt, gene tiểu đơn vị ribosome 16S
(16S rRNA), đã đƣợc sử dụng rộng rãi để nghiên cứu và mô tả các thành phần
cộng đồng vi khuẩn trong nhiều loại hệ sinh thái bao gồm các cộng đồng liên
kết với vật chủ, nhƣ hệ vi sinh vật nội sinh của con ngƣời, vật chủ các cộng
đồng tự do, nhƣ môi trƣờng đất và đại dƣơng. Đầu tiên, nó có mặt khắp nơi
trong cuộc sống thuộc nhóm Prokaryotic. Thứ hai, kích thƣớc và mức độ bảo
tồn chức năng cao của nó dẫn đến tỷ lệ đột biến trong suốt quá trình tiến hóa
của sinh vật nhân sơ. Thứ ba, và quan trọng nhất, gen 16S rRNA bao gồm cả
các khu vực đƣợc bảo tồn, có thể đƣợc sử dụng để thiết kế các đoạn mồi
khuếch đại trên khắp các đơn vị phân loại, cũng nhƣ 9 khu vực (V1 - V9), có
thể đƣợc sử dụng một cách hiệu quả để phân biệt giữa các đơn vị phân loại.
Hiện nay các nghiên cứu hiện đại thƣờng dựa vào phân tích các chuỗi
RNA ribosome 16S để xác định phân loại các chủng vi khuẩn, loại phân tích
này đã trở thành một tiêu chuẩn thực tế cho phân loại sinh vật nhân sơ. Trong
đó gene rRNA 16S dài khoảng 1600bp và bao gồm 9 vùng có khả năng bảo

16
tồn khác nhau (V1-V9). Trong đó các khu vực bảo thủ hơn rất hữu ích để xác
định các phân loại cao hơn, trong khi các khu vực tiến hóa nhanh hơn có thể
giúp xác định chi hoặc loài. Phân tích so sánh các cộng đồng vi khuẩn từ các
vùng sinh thái riêng biệt ở hồ Baikal đƣợc tiết lộ bằng phân tích siêu dữ liệu
sử dụng các đoạn V2-V3 và V3-V4 của gen rRNA 16S. Tổng DNA đƣợc
chiết xuất từ các mẫu sinh học, đƣợc khuếch đại độc lập bằng cách sử dụng
các cặp mồi đƣợc thiết kế cho các đoạn V2-V3 và V3-V4 và đƣợc giải trình
tự, sau đó ƣớc tính thành phần cộng đồng và đa dạng vi khuẩn bằng phƣơng
pháp tin sinh học. Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng để ƣớc tính cộng
đồng vi khuẩn đa dạng phân loại bằng cách sử dụng 16S rRNA, trong đó đoạn
V2-V3 có độ phân giải cao nhất cho các phân loại bậc thấp (loài và chi). Điều
này cho biết rằng các công bố sự dụng gene 16S rRNA và vùng gene V3 cho
việc định danh loài có độ chính xác cao [73].
Kỹ thuật sinh học phân tử ngày nay đã phát triển mạnh và giúp đƣa
những nghiên cứu đi sau vào vai trò chứng năng nguồn gốc của gene, trong
đó đóng góp rất lớn trong định danh loài ngày càng chính xác hơn ở các vùng
gene phân loại loài.
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR trong trong định danh vi khuẩn
Ở lĩnh vực sinh học phân tử thì PCR là một kỹ thuật có mặt khắp nơi
đƣợc sử dụng rộng rãi cho mục đích chẩn đoán và nghiên cứu sinh học phân
tử. PCR là sự khuếch đại trong ống nghiệm của các chuỗi axit nucleic cụ thể
bằng enzyme DNA polymerase. Kỹ thuật PCR đƣợc Kary Mullis chuyển đổi
vào năm 1983, khi ông mở rộng việc sử dụng một loại polymerase bền nhiệt
với chu kỳ nhiệt độ. Phổ biến của PCR là nó khuếch đại một lƣợng nhỏ các
chuỗi axit nucleic mục tiêu, thu đƣợc một lƣợng sản phẩm có thể phát hiện
đƣợc bằng các phƣơng pháp trực tiếp quan hóa axit nucleic trên gel agarose
và kết quả là hàng triệu bản sao của mẫu gốc [45, 46].
Kỹ thuật PCR ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu
sinh học và cả y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, nhƣ phát hiện các
bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA, phát hiện vi khuẩn hay virus ở nồng
độ thấp trong các mẫu môi trƣờng và bệnh phẩm, tách dòng gen, và xác định

17
huyết thống. Đó là những ƣu điểm mà từ khi kỹ thuật PCR đƣợc ứng dụng
cho tới ngày nay.
Trong một số trƣờng hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện đƣợc với
nhiều loài vi sinh vật hoặc virus hoặc trong trƣờng hợp khác là cần thời gian
nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho việc lai hoặc xác định loài. PCR ra đời
đã khắc phục đƣợc những khó khăn này, khuếch đại những đoạn gen đặc
trƣng của các loài vi sinh vật nghiên cứu dựa trên những cặp mồi đặc trƣng
của từng loài vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật đều có những cặp mồi chuyên biệt
để có thể dựa vào đó chúng ta có thể dễ dàng xác định đƣợc chúng. Ví dụ
phƣơng pháp PCR xác định một số bệnh nấm trên lúa mì đƣợc nêu trong bảng
1.5 [47].
Bảng 1.5. Phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt xác định một số loài gây
bệnh trên lúa mì.
Cặp mồi
Gene mục
tiêu Trình tự đoạn mồi
Chiều dài
gene Tác giả
Fusarium graminearum
UBC85F410 SCAR GCAGGGTTTGAATCCGAGAC 332
Schilling et
al., 1996
UBC85R410 AGAATGGAGCTACCAACGGC
Fg16F SCAR CTCCGGATATGTTGCGTCAA
400 –
500
Nicholson et
al., 1998
Fg16R GGTAGGTATCCGACATGGCAA
Fgr-F IGS GTTGATGGGTAAAAGTGTG 500
Jurado et al.,
2005
Fgc-R CTCTCATATACCCTCCG
GOFW gaoA ACCTCTGTTGTTCTTCCAGACGG 435
Biazio et al.,
2008
GORV CTGGTCAGTATTAACCGTGTGTG
Fusarium culmorum
OPT18F470 SCAR ATGGTGAACTCGTCGTGGC 472
Schilling et
al., 1996
OPT18R470 CCCTTCTTACGCCAATCTCG
Fc01F SCAR ATGGTGAACTCGTCGTGGC 570
Nicholson et
al., 1998
Fc01R CCCTTCTTACGCCAATCTCG
Fcg17F SCAR TCGATATACCGTGCGATTTCC 340
Nicholson et
al., 1998
Fcg17R TACAGACACCGTCAGGGGG
175F ITS TTTTAGTGGAACTTCTGAGTAT 245 Mishra et al.,

18
2003
430R AGTGCAGCAGGACTGCAGC
Fcu-F IGS GACTATCATTATGCTTGCGAGAG 200
Jurado et al.,
2005
Fgc-R CTCTCATATACCCTCCG
Fc03 SCAR TTCTTGCTAGGGTTGAGGATG 144
Sanoubar et
al., 2015
Fc02 GACCTTGACTTTGAGCTTCTTG
Tƣơng tự ứng dụng PCR cho định danh trên nhóm vi khuẩn, sử cặp mồi
27F và 1495R để khảo sát vùng 16S-rDNA của các dòng vi khuẩn nội sinh
phân lập từ nho [48], cũng sử dụng cặp mồi này khảo sát vùng 16S-rDNA của
họ vi khuẩn Azotobacteraceae gồm 7 loài thuộc chi Azotobacter và 3 loài
thuộc chi Azomonas [49]. PCR với một cặp mồi, U1 (5’- CCA GCA GCC
GCG GTA ATA CG-3’) và U2 (5’- ATC GG(C/T) TAC CTT GTT CAG
ACT TC-3’) có khả năng khuếch đại một phần của gen 16S rRNA của
Eubacteria [50]. Với cặp mồi Xan1330 đƣợc thiết kế trên vùng 16S-23S xác
định Xanthomonas sp [51]. Tuy nhiên phƣơng pháp PCR cũng còn nhiều hạn
chế vì tính đặc hiệu phân loại chƣa cao, cùng với nhiều phƣơng pháp mới có
độ đặc hiệu cao hơn.
1.3.2.2. Kỹ thuật PCR-DGGE trong định danh vi khuẩn
PCR-DGGE là kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản, đƣợc công bố lần đầu
đầu tiên bởi Fischer và Lerman [52], phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi về
nucleotide trong cấu trúc mạch DNA. Phƣơng pháp PCR-DGGE là sự kết hợp
của kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại các gene đặc hiệu và kỹ thuật DGGE
điện di biến đổi liên tục nồng độ gel acrylamide cho phép phân tách các sản
phẩm PCR có sự thay đổi nucleotides trong mạch DNA. Kỹ thuật DGGE cho
phép phân tách các sản phẩm đoạn gene có cùng kích thƣớc nhƣng có sự thay
đổi nucleotides trong mạch gene đó. Phƣơng pháp này cũng đã đƣợc ứng
dụng khá phổ biến trong việc xác định đa dạng cộng đồng vi sinh vật trong
môi trƣờng với các điều kiện sinh thái khác nhau.
Phân tích cộng đồng vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE đƣợc áp dụng rộng
rãi để nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn bằng sinh học phân tử liên quan đến
đoạn gen 16S-rDNA, những đoạn gen thể hiện cả cộng đồng vi sinh nên tránh

19
việc phân tích một hệ vi sinh quá rộng, ngƣời ta thƣờng thực hiện nghiên cứu
trên đoạn ngắn đặc hiệu hơn cho vi khuẩn là vùng V3 của đoạn 16S-rDNA
đƣợc chọn trong phân tích DGGE [53]. Các nghiên cứu cộng đồng vi khuẩn
liên quan đến các vùng biến đổi trên đoạn gen16S-rDNA với những cặp mồi
đã đƣợc ứng dụng rất đa dạng nhƣ phân tích cộng đồng vi sinh vật trong hồ
chứa dầu nhiệt độ cao [54]. Một số nghiên cứu gần đây nhƣ, xác định cộng
đồng xạ khuẩn trong đất Antarctic từ vùng Barrientos của Island bằng PCR-
DGGE [55]. Phân tích cộng đồng tuyến trùng từ đất bằng kỹ thuật DGGE
[56]. So sánh trực tiếp phƣơng pháp SSCP và DGGE tới đặc điểm cộng đồng
vi sinh dựa trên đọan gene 16S rRNA [57]. Khảo sát sự đa dạng hệ vi sinh vật
trong biểu mô dạ cỏ của bò bằng phƣơng pháp DGGE [58]. Sử dụng DGGE
phân tích đoạn 16S rDNA cộng đồng vi sinh vật cổ sinh khí methan từ đất
ruộng [58]. Ngoài ra tác giả Cheon đã ứng dụng phƣơng pháp Tạo dòng ngẫu
nhiên phân tích cộng đồng vi khuẩn trong phân giải kỵ khí ở quy mô công
nghiệp [59]. Một nghiên cứu của đã thành công khi sử dụng kỹ thuật PCR -
DGGE phân tích hệ vi sinh vật lên men kỵ khí rơm rạ. Cùng nghiên cứu về hệ
vi sinh phân giải rơm rạ có báo cáo cũng đã sử dụng kỹ thuật này xác định và
giải trình tự các chủng vi khuẩn lên men kỵ khí rơm rạ trong quá trình phát
triển của chúng [60]. Sử dụng cặp mồi 357F-GC và 517R xây dựng cây di
truyền cộng đồng vi khuẩn có trong mẫu rơm rạ trƣớc khi ủ và trong quá trình
ủ lâu ngày [61]. Còn nhiều nghiên cứu cặp mồi 341F-GC và 581R cho sản
phẩm khuếch đại ở cả 6 dòng vi khuẩn nuôi thuần chủng. Sau đó, cặp mồi này
đƣợc dùng để nghiên cứu về cộng đồng vi khuẩn có trong thức ăn, ruột và
phân giun. Kích thƣớc trung bình của sản phẩm khuếch đại là 600bp có thể
quá dài để phân tích DGGEđạt hiệu quả, cho nên việc dùng cặp mồi 341F-GC
và 581R là phù hợp hơn cho kỹ thuật này vì sản phẩm khuếch đại khoảng
240bp của vùng V3 trên đoạn gen 16S-rDNA.Từ những nghiên cứu tƣơng tự
đó, có thể so sánh hệ vi khuẩn trong các nghiên cứu và làm tiền đề cho các
nghiên cứu tiếp theo.
Các công trình công bố trong nƣớc hiện nay về kỹ thuật DGGE trong
những năm gần đây đã đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng vi sinh ở các
mẫu vật và hệ sinh cảnh khác nhau cũng nhƣ; xác định đa dạng vi khuẩn trong

20
bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ
thuật PCR-DGGE [62], sử dụng kỹ thuật điện di trên gel gradient biến tính để
nghiên cứu đa dạng vi sinh vật [63], sử dụng phƣơng pháp điện di gel gradient
biến tính để xác định mức độ đa dạng của vi sinh vật trong các công thức thử
nghiệm xử lý đất ô nhiễm chất độc hóa học [64], phân tích cộng đồng vi
khuẩn trong phân ủ bằng phƣơng pháp DGGE và sử dụng kỹ thuật PCR-
DGGE phân tích cộng đồng vi khuẩn trong Rơm rạ tại huyện Lai Vung, tỉnh
Đồng Tháp [65,66]. Những dữ liệu nghiên cứu đã công bố trên đây cho thấy
tính hữu dụng của phƣơng pháp DGGE ngày càng đƣợc nhiều sự quan tâm
nghiên cứu ứng dụng đa dạng hơn, trong đó có ứng dụng trong định loài tính
đa dạng của cộng đồng vi sinh.
1.3.2.3. Kỹ thuật tạo dòng
Phƣơng pháp tạo dòng chủ yếu tập trung vào các nghiên cứu phân lập
và kiểm tra sự biểu hiện gene. Xác định thành phần, cấu trúc của protein đƣợc
mã hóa bởi đoạn DNA cụ thể, biểu hiện gen của eukaryote trong tế bào
prokaryote, nghiên cứu sự biểu hiện của mRNA, cDNA (complementary
DNA, copy DNA) đƣợc tạo từ mRNA trƣởng thành (mature mRNA) sử dụng
enzyme phiên mã ngƣợc là Reverse transcriptase.
Thƣ viện cDNA nhất thiết phải tạo dòng cDNA tức là tạo số lƣợng lớn
bản sao cDNA dựa vào cấu trúc của mRNA hoặc lƣợng nhỏ cDNA. Việc thực
hiện công việc tổng hợp cDNA nguồn từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR, chủ
yếu dựa vào 2 phƣơng pháp tạo dòng cDNA: phƣơng pháp tạo dòng cDNA
bằng plasmid với vật chủ là E.coli, và phƣơng pháp tạo dòng cDNA bằng
bacteriophage lambda [67].
Ứng dụng tạo dòng trong nhân bản gen đã tạo ra một tác động to lớn
đến tốc độ nghiên cứu sinh học và nó đang gia tăng sự hiện diện của nó trong
một số lĩnh vực của cuộc sống hàng ngày nhƣ; nhân bản vô tính là phƣơng
pháp tạo ra các gen giống hệt nhau. Ứng dụng y tế nhƣ trong y học, trị liệu
ung thƣ, sinh học phân tử, lập bản đồ gen và genom ở động vật, di truyền cây
và bộ gen, bộ gen chuột, nghiên cứu bộ gen, tiến bộ trong hóa học protein và
sinh học cấu trúc, tổng hợp vitamin, hormone và kháng sinh. Ứng dụng nông

21
nghiệp: nhân bản vô tính trong vi khuẩn tạo điều kiện cố định đạm trong cây,
chuyển gene kháng bệnh.
Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tạo dòng hiện
nay chủ yếu dùng vào việc chuyển gene nhằm sản xuất sản phẩm thứ cấp hay
kiểm tra biểu hiệu gene mục tiêu là chủ yếu. Hiện nay sự kết nghiên cứu sử
dụng kỹ thuật tạo dòng và PCR-DGGE để phân tích cộng đồng vi khuẩn chƣa
công bố. Mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng cả hai kỹ thuật PCR- DGGE
và tạo dòng trong cùng một phân tích cộng đồng vi khuẩn trong rơm rạ. Nhằm
định hƣớng sử dụng các công cụ sinh học phân tử hiện đại phân tích cộng
đồng vi khuẩn, đánh giá sự hiện diện và biến động đa dạng vi khuẩn trong
mẫu.

22
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Vi sinh Ứng dụng của Viện Sinh học
Nhiệt Đới, số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, Khu phố 6, phƣờng Linh Trung, quận Thủ
Đức, Tp. Hồ Chí Minh và Phòng nghiên cứu GSALS, Đại Học Tokyo, Nhật
Bản.
Vật liệu nghiên cứu: Mẫu rơm rạ dùng làm cơ chất trồng nấm Rơm thu
nhận tại ấp Định Mỹ, xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp.
Một số hình ảnh thu nhận mẫu rơm chƣa ủ ngay sau thu hoạch và gom
lại trong ngày xem hình 2.1.A và thu nhận mẫu rơm sau khi ủ và trƣớc khi lên
luống trồng nầm Rơm ở hình 2.1E ở độ sau trong ụ rơm ủ khoảng 50cm.
Các thông số diện tích của ụ rơm ủ có chiều dài khoảng 17-20m, chiều
rộng 5-6m và chiều cao 1.2-1.5m xem hình 2.1C. Nhiệt độ đo ụ rơm ủ trong
suốt giai đoạn ủ.
Hình 2.1. Một số hình ảnh thu nhận lấy mẫu Rơm.
A. Hình ảnh thu mẫu Rơm trƣớc khi ủ.

23
B. Hình ảnh ngƣời dân chuyển Rơm từ ghe lên nơi ủ.
C. Hình ảnh ụ rơm chuẩn bị ủ.
D. Hình ảnh đo nhiệt độ suốt trong giai đoạn ủ.
E. Hình ảnh thu mẫu Rơm sau hoàn tất giai đoạn ủ trƣớc khi trồng Nấm
Rơm.
F. Hình ảnh luống Rơm chuẩn bị cấy meo Nấm rơm.
Hóa chất
Agar CMC 1% (Carboxymethylcellelose Sodium Salt): CMC 10g,
Agar 20g, Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml. Thuốc nhuộm Congo red 0.1%: Congo
red 0,5 g/500ml H2O.
Các hóa chất dùng trong ly trích DNA: Lysis buffer (100 mM Tris HCl,
pH = 8; 100 mM sodium EDTA, pH = 8; 100 mM, sodium phosphate, pH =
8; 1,5 M NaCl và 1% CTAB), Proteinase K (10 mg/ml), SDS 20%,
Chloroform/isoamyl alcohol (24:1), isopropanol, ethanol 70% lạnh, nƣớc cất
2 lần.
Các hóa chất dùng trong tinh sạch DNA: Bộ Kit QIAquick PCR
Purification Kit (hãng QIAGEN) tinh sạch sản phẩm PCR vùng V3 của đoạn
gen 16S-rDNA. Bộ Kit Gel Extraction of QIAEX II Kit (hãng QIAGEN) tinh
sạch và thu nhận DNA từ gel polyacrylamide.
Các hóa chất dùng trong điện di: Agarose, TAE (Tris, Acid acetic,
EDTA), Ethidium bromide, loading dye 6X.
Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR: Nƣớc khử ion, dNTPs, Buffer
10X, MgCl2, Taq polymerase.
Các mồi đƣợc sử dụng trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các cặp mồi cho vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu.
Gene Tên mồi Trình tự Tác giả

24
16S-
rDNA
27F
1492R
5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3’
5’- GGTTACCTTGTTACGACTT - 3’
Lane,
1991
V3
357F-
GC
517R
5’-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGG
GCGGGGGCACGGGGGCCTACGGGA
GGCAGCAG - 3’
5’ - ATTACCGCGGCTGCTGG - 3’
Muyzer,
1993
V3
357F
517R
5’ - CCTACGGGAGGCAGCAG - 3’
5’ - ATTACCGCGGCTGCTGG - 3’
Muyzer,
1993
Các hóa chất dùng trong kỹ thuật DGGE: Gel polyacrylamide, TAE,
thuốc nhuộm SYBR Green, chất làm đông tụ gel TEMED, APS 10%, loading
dye 6X.
Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ đƣợc sử dụng trong thí nghiệm sau:
Máy khuấy từ, lò điện, máy vortex, máy đo pH, bể ổn nhiệt, tủ sấy
Prolabo, máy ly tâm lạnh của hãng JiCa, bộ điện di, hộp đèn soi UV Uvitec,
tủ lạnh, tủ đông -200
C Alaska, lò viba, hệ thống chụp hình điện di BioRad,
máy PCR Sprint Thermo Cycle, bộ điện di trong phân tích DGGE của hãng
BioRad gồm các tấm kính dùng làm khuôn gel, lƣợc, buồng điện di và bộ
nguồn.
Các dụng cụ đƣợc sử dụng: Các loại pipetteman có dung tích từ 0,5 -
1.000 µl và các đầu type tƣơng ứng, cân phân tích, ống ly tâm lớn, ống tube
loại 1 ml và 1,5 ml, các loại dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt, buồng điện di, găng
tay, khẩu trang, đồ bảo hộ.
2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Qui trình chung thực hiện các phƣơng pháp và kỹ thuật cho nghiên cứu
xem hình 2.2.

25
Hình 2.2. Qui trình thực hiện trong nghiên cứu.

26
2.2.1.Phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA
Quy trình ly trích và thu nhận DNA bộ gene vi sinh vật từ mẫu Rơm
nghiên cứu thực hiện theo hình 2.3.
Hình 2.3. Qui trình ly trích và thu nhận DNA từ mẫu Rơm.

27
2.2.2. Phƣơng pháp PCR nhân bản gene 16S rDNA và vùng gene V3
Phản ứng khuếch đại đoạn gen16S-rDNA đƣợc thực hiện với cặp mồi
chuyên biệt cho nhóm vi khuẩn là 27F và 1492R. Thành phần phản ứng PCR
với tổng thể tích 25µl và chu trình nhiệt ở bảng 2.2và bảng 2.3.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR.
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Buffer 10X 2,5
MgCl2 (25 mM)
dNTPs (2,5 mM)
2
2
Primer 27F (100 µM) 0,1
Primer 1492R (100 µM)
DNA khuôn (200ng/µl)
0,1
1
Nƣớc khử ion 17,3
Tổng thể tích 25
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR.
Số chu kì lặp lại Nhiệt độ (0
C) Thời gian (phút)
1 95 15
30
95
54
72
1
1
2
1 72 10

28
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra qua bộ điện di trong gel agarose 1% và
dƣới ánh sáng UV.
Bƣớc 1. Chuẩn bị bộ điện di.
Bƣớc 2. Chuẩn bị gel agarose 1%; Cân 1g agarose cho vào chai thủy
tinh có chứa 100ml TAE 1X. Đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn, lắc đều,
để nguội cho đến khoảng 50 - 600
C thì đổ vào khuay gel.
Bƣớc 3. Cho gel vào bồn điện di và nạp mẫu vào giếng gel với thể tích
2µl Loading dye và 5µl mẫu, chạy điện di 45 phút với nguồn điện 110Volt.
Bƣớc 4. Sau điện di, thực hiện nhuộm gel với Ethidium Bromide trong
15 phút.
Bƣớc 5. Quan sát kết quả sản phẩm PCR dƣới hộp đèn UV.
Nhân bản vùng gene V3: Vùng V3 thuộc đoạn 16S-rDNA đƣợc khuếch đại
với cặp mồi chuyên biệt cho nhóm vi khuẩn là 517R và 357F - GC. Thành
phần phản ứng với tổng thể tích 25µl và chu trình nhiệt đƣợc trình bày ở bảng
2.4 và bảng 2.5.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR vùng gene V3.
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Buffer 10X 2,5
MgCl2 (25 mM)
dNTPs (2,5 mM)
2
2
Primer 357F-GC (100 µM) 0,1
Primer 517R (100 µM)
DNA khuôn
0,1
0,5
Nƣớc khử ion 17,8
Tổng thể tích 25

29
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gene V3.
Số chu kì lặp lại Nhiệt độ (0
C) Thời gian
1 94 3 phút
30
94
55
72
1 phút
1 phút
1 phút 30 giây
1 72 8 phút
Tƣơng tự nhƣ ở kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra qua bộ điện di
nhƣ trong gel agarose 2% và dƣới ánh sáng UV.
2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm gene V3
Trƣớc khi phân tích DGGE đoạn gen đã đƣợc khuếch đại, mẫu DNA
đƣợc tinh sạch nhằm loại bỏ các tạp chất còn lại sau phản ứng PCR bằng bộ
kit QIAGen PCR Purification Kit.
Quy trình tinh sạch nhƣ sau:
Bƣớc 1. Chuyển sản phẩm PCR vào ống tube 1.5ml, thêm buffer PB
vào mẫu với tỉ lệ 5:1(v/v) rồi trộn đều (vortex). Nếu màu của hỗn hợp là màu
cam hay tím thì thêm 10µl Sodium Acetate 3M, pH 5,0 và trộn đều cho hỗn
hợp chuyển về màu vàng.
Bƣớc 2. Sau khi trộn đều chuyển toàn bộ dịch vào ống spin column
tube 2ml, ly tâm 13.000rpm/1phút ở 40
C.
Bƣớc 3. Chuyển cột lọc sau ly tâm sang ống tube 2ml mới, thêm vào
cột spin column thể tích 750µl buffer PE. Ly tâm 13.000rp/1phút ở 40
C, sau
đó tiếp tục chuyển cột spin column sang ống tube 2ml mới và ly tâm
13.000prm/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn PE.
Bƣớc 4. Cho thêm 500µl dung dịch đệm Capture vào cột spin column,
ly tâm 13.000rpm/phút trong 30 giây ở 40
C.

30
Bƣớc 5. Loại bỏ phần dịch và thu cột spin column.
Bƣớc 6. Thêm 500µl dung dịch Wash buffer vào giữa cột spin column,
ly tâm 13.000rpm/phút trong 30 giây ở 40
C.
Bƣớc 6. Tiếp tục loại bỏ phần dịch, thu cột spin column và đặt vào ống
tube mới.
Bƣớc 7. Thêm 50µl Tris - HCl 10mM hoặc nƣớc khử ion.
Bƣớc 8. Ủ trong khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Bƣớc 9. Ly tâm 6.000rpm/phút trong 30 giây.
Bƣớc 10. Thu dịch chứa sản phẩm DNA.
2.2.4. Phƣơng pháp thực hiện kỹ thuật DGGE
2.2.4.1. Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine và thực hiện DGGE
Chuẩn bị bộ gel polyacrylamine dùng trong kỹ thuật DGGE với nồng
độ gel polyacrylamine đƣợc pha theo bảng 2.6.
Bảng 2.6. Chuẩn bị cách pha nồng độ bảng gel polyacrylamine.
Thành phần trong
gel
0% UF
6% BA
50% UF
6% BA
0% UF
12% BA
80% UF
12% BA
50X TAE (ml) 2 1 1 2
Acrylamine (g) 6 3 6 12
Bis-Acrylamine (g) 0,162 0,081 0,162 0,324
Urea (g) 0 10,5 0 33,6
Formamide (ml) 0 10 0 32
Tổng thể tích (ml) 100 50 50 100

31
Sau khi pha gel polyacrylamide theo bảng 2.6, tiến hành phối trộn các
nồng độ trên vào hai xilanh:
- Xilanh 1: Tƣơng ứng với nồng độ polyacrylamide thấp.
- Xilanh 2: Tƣơng ứng với nồng độ polyacrylamide cao.
Tỷ lệ phối trộn vào 2 xilanh nhƣ bảng 2.7.
Bảng 2.7. Tỷ lệ phối trộn nồng độ gel polyacrylamide vào hai xilanh.
Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật DGGE.
Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và pha gel polyacrylamide.
Dung dịch đệm thƣờng sử dụng trong bản gel polyacrylamide là TAE
0,5X. Gel polyacrylamide đƣợc pha theo tỷ lệ phối trộn nhƣ bảng 3.7, sau đó
lọc qua màng lọc có kích thƣớc khoảng 0.2µl và chất làm đông gel 10µl
TEMED với 50µlAPS. Hút vào ống xilanh với hai nồng độ khác nhau, sau đó
lắp vào hệ thống phân phối gel tiến hành đổ gel, sau hoàn tất nạp gel vào
bảng gel chờ khoảng 3 giờ để gel đông tụ.
Bƣớc 2: Lắp gel vào bồn điện di, nhiệt độ ổn định trong bể là 600
C.
Nạp mẫu vào mỗi giếng gel theo tỉ lệ 20µl mẫu: 6µl loading dye.
Bƣớc 3: Chạy điện di với điện áp 200volt trong 300phút và nhiệt độ
600
C.
Bƣớc 4: Kết thúc quá trình điện di, tách các tấm gel, sau đó cho vào
khay để nhuộm gel bằng thuốc nhuộm SYBR Green.
Thành
phần
0% UF
6% BA
50% UF
6% BA
0% UF
12% BA
80% UF
12% BA
Thể tích
Xilanh 1 9,6 ml 6,4 ml 16 ml
Xilanh 2 4 ml 12 ml 16 ml

32
Bƣớc 5: Quan sát kiểm tra kết quả sản phẩm DGGE trong bảng gel
dƣới UV, sau đó tiến hành cắt band có sản phẩm cần nghiên cứu, ly trích và
thu nhận sản phẩm.
Có thể thực hiện phƣơng pháp DGGE nhiều lần cho đến khi tách hoàn
toàn từng gene riêng rẽ và các bƣớc thực hiện tƣơng tự nhƣ trên cho đến khi
thu đƣợc các đoạn gene riêng biệt từ mẫu nghiên cứu ban đầu.
2.2.4.2. Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide
Sản phẩm gene V3 thu đƣợc trong gel polyacrylamide sẽ đƣợc thu hồi
bằng cách sử dụng bộ Kit: Gel Extraction Kit of QIAEX II để tinh sạch và thu
nhận DNA từ gel polyacrylamide, đƣợc thực hiện theo quy trình các bƣớc
xem hình 2.4.

33
Hình 2.4. Qui trình thu nhận gene V3 từ gel polyacrylamdie.
2.2.4.3. PCR gene V3 sau khi thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F và
517R
Sau khi thu nhận đƣợc gene V3 từ DGGE sẽ tiếp tục tiến hành PCR lại
vùng V3 với cặp mồi 517R và 357F và thành phần phản ứng nhƣ bảng 3.5.

34
2.2.5. Phƣơng pháp tạo dòng
Vector và quy trình thực hiện đƣợc sử dụng trong kỹ thuật Tạo dòng là
pGEM@
-T Easy vector của hãng Promega có kích thƣớc là 3.015bp, bao gồm
3 vùng gene chính là: Ampicillin gene, Ori gene và Lac Z gene xem hình ảnh
cấu trúc của vector hình 2.5.
Hình 2.5. Cấu trúc pGEM@
-T Easy vector của hãng Promega.
Quá trình tách chiết và thu nhận plasmid thực hiện theo protocol của
hãng Nippon Genetics. Chủng vi khuẩn dùng cho việc cloning là E.coli
JM109. Qui trình thực hiện theo protocol của hãng Promega nhƣ sau;

35
Biến nạp pGEM@
-T Easy vector tái tổ hợp mang sản phẩm gene V3
vào tế bào E.coli JM109: Hỗn hợp phản ứng gắn các gene V3 và pGEM@
-T
Easy vector (Promega) đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli JM109 bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt ở 420
C trong 45-50 giây và làm lạnh nhanh trong đá 2
phút. Sau đó tế bào khả biến đƣợc nuôi trên đĩa petri chứa môi trƣờng LB
agar (1,5%), bổ sung với 0,5mM IPTG và 80g/ml X-Gal ở 370
C qua đêm.
Chọn khuẩn lạc đơn màu xanh để nuôi cấy lắc trên môi trƣờng LB lỏng ở
370
C lắc 150 rpm/phút trong khoảng 16-24 giờ, sau đó thu sinh khối tế bào để
tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp. Thu sản phẩm vùng gene V3 trong vector
bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi 357F và 517R các qui trình kỹ thuật
tƣơng tự trên.
2.2.6. Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài
Sau khi tinh sạch và thu nhận đƣợc DNA từ gel polyacrylamide bằng
Gel Extraction Kit of QIAEX II, tiến hành giải trình tự vùng gene V3 đƣợc
giải mã trên máy ABI Genetic Analyzer tự động với bộ hóa chất chuẩn Big –
Dye PCR với cặp mồi 357F/517R. Thành phần của Big – Dye PCR đƣợc thể
hiện trong bảng 2.8. Sản phẩm gene V3 đƣợc giải trình tự tại Lab của trƣờng
GSALS của Đại học và Cty Nam Khoa thành phố Hồ Chí Minh.
Bảng 2.8: Thành phần Big – dye PCR.
Thành phần Thể tích
DNA 13 µl
Primer 357F (3,2 pmol) hoặc
Primer 517R (3,2 pmol)
1 µl
Taq buffer for sequencing 2 µl
Big – dye solution 4 µl
Tổng 20 µl

36
Sau khi có thành phần Big – Dye PCR là 20 µl, quy trình thực hiện
với các bƣớc tiếp:
Bƣớc 1. Thêm 5µl EDTA 125 mM vào dung dịch Big – dye.
Bƣớc 2. Thêm 60 µl Ethanol 100%, tổng cộng thể tích dung dịch phản
ứng là 85µl.
Bƣớc 3. Giữ mẫu ở - 200
C trong 20 phút.
Bƣớc 4. Ly tâm 13000rpm/phút trong 30 phút ở 40
C.
Bƣớc 5. Loại Aluminm seal và bọc lại gel bằng giấy.
Bƣớc 6. Ly tâm 13000rpm/phút trong 10 giây, loại bỏ cồn.
Bƣớc 7. Thêm 85µl Ethanol 70% với tỷ lệ 1:1 (v/v).
Bƣớc 8. Ly tâm 13000 vòng trong 15 phút ở 40
C.
Bƣớc 9. Loại aluminm seal và bọc lại gel bằng giấy.
Bƣớc 10. Ly tâm 13000rpm/phút trong 10 giây và loại cồn.
Bƣớc 11. Làm khô mẫu trong 15 phút bằng nhiệt.
Bƣớc 12.Thêm 18µl HiDi – formamide trên mỗi mẫu và vortex.
Bƣớc 13. Ly tâm 13000rpm/phút trong 10 giây.
Bƣớc 14. Thiết lập mẫu vào thiết bị và đọc kết quả sau khi máy
giải trình tự.
Hiệu chỉnh trình tự gene trong công cụ BLAST so sánh với các đoạn
gen tƣơng đồng trong ngân hàng dữ liệu gen NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Sử dụng các chƣơng trình và phần mềm
BioEdit xây dựng cây phát sinh loài.
2.3. Khảo sát định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn
Kiểm tra định tính enzyme cellulase trong mẫu rơm Rn nhằm xác định
sự hiện diện của của enzyme cellulase phân giải cellulose rơm trong suốt quá
trình ủ đƣợc sinh ra và tồn tại trong mẫu, nhằm đánh giá khả năng sinh
enzyme cellulase phân hủy rơm rạ của vi khuẩn trong mẫu. Thực hiện kiểm

37
tra sơ bộ mẫu sinh enzyme cellulase trong quá trình ủ bằng phƣơng pháp đĩa
thạch CMC với thuốc thử Congo Red 0,1%. Chuẩn bị môi trƣờng CMC khử
trùng và đổ đĩa, tiến hành tạo các giếng trên mặt thạch, bơm 20 l dịch thu
nhận trực tiếp từ mẫu vào giếng, đem ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sau 30 phút, loại bỏ dung dich thuốc thử và thực hiện bƣớc giải nhuộm
với 5ml NaCl 1M, sau 15 phút loại bỏ NaCl và đọc kết quả. Mẫu nào có sự
phân giải CMC sẽ tạo vòng phân giải nhạt màu hơn so với màu của thuốc thử
Congo red.

38
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả kiểm tra nhiệt độ
Nhiệt độ đo đƣợc trong suốt quá trình ủ rơm trong nghiên cứu này là 18
ngày vì rơm ủ trồng nấm Rơm nên ngƣời dân chỉ thực hiện ủ trong giai đoạn
ngắn, khi nhiệt độ trong ụ rơm ủ có hƣớng giảm, khác với rơm ủ làm phân
bón. Nhiệt độ đo trong kết quả xem hình 3.1 và 2.1(D) cho thấy. Kết quả từ
ngày thứ 5 đến 11 biên độ nhiệt độ tăng cao khoảng 60-800
C, trong ngày 4, 8,
12 nhiệt độ thay đổi xuống thấp là do lúc này ngƣời dân phải đảo trộn lại ụ
rơm nhằm tăng khả năng ủ đều cho rơm ở bên trong và cả bên ngoài đóng ủ.
Tới ngày thứ 15 thì nhiệt bắt đầu giảm xuống, so sánh sự biến đổi nhiệt và
thời gian tƣơng tự nhƣ công bố của tác giả Mohd L.C.J và Irnis A.Z [68, 69].
Hình 3.1. Biểu đồ thay đổi nhiệt độ trong qúa trình ủ rơm.
Sự gia tăng nhiệt lên khoảng 700
C sẽ làm thay đổi thành phần vi sinh
vật về số lƣợng và số loài, trong đó đặc biệt là nhóm chịu nhiệt có thể tồn tại
và phát triển. Còn đa phần các nhóm vi khuẩn còn lại thì giảm hẳn hoặc có

39
khả năng chết. Vì thế biến đổi nhóm vi khuẩn về số lƣợng, thành phần loài
trong có sự thay đổi. Nhiệt độ ủ ở các độ sâu khác nhau (0, 30, 50 cm) cho
thấy sự tăng nhẹ ở thời điểm ban đầu với các độ sâu khác nhau theo nghiên
cứu Mohamed H.,[70]. Nhƣng sau 20 ngày ủ, nhiệt độ của đống ủ cho thấy sự
gia tăng rõ rệt ở độ sâu 30 và 50 cm tƣơng ứng đạt xấp xỉ 570
C và 690
C, và
thể hiện nhiệt độ tối đa đƣợc ghi lại trong quá trình ủ. Thời gian tại 40 và 60
ngày ủ, nhiệt độ cho thấy sự giảm rõ rệt cho biết nó đạt đến nhiệt độ ban đầu
khi bắt đầu quá trình ủ.
3.2. Kết quả thu nhận DNA genome của vi sinh vật trong mẫu Rơm
Kết quả ly trích và thu nhận DNA bộ gene của cộng đồng vi sinh trực
tiếp theo phƣơng pháp SDS có CTAB của mẫu Rơm chƣa ủ (R) trên gel
agarose 0.8% xem hình 3.2. Cả 03 mẫu sau ly trích điều có DNA và cũng phù
hợp với các công bố của tác giả Muyzer G [53], Wang J [54], Learn H.L.C
[55], Tomoyukihori [57], Cheon J [59], Vila R.C [61], N.Đ.Duy [65]. Do số
lƣợng và hàm lƣợng vi sinh vật trong mẫu tự nhiên ban đầu thƣờng ít.
Hình 3.2. Kết quả ly trích thu nhận DNA bộ gene vi sinh trong mẫu R.
Sản phẩm DNA bộ gene trên hình 3.2 chƣa cho biết thành phần DNA
của thành phần vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm mốc, thực vật, hoặc động vật
nhỏ. Cho nên tiếp tục tiến hành sử dụng cặp mồi chung của nhóm vi khuẩn là
27F và 1492R để mục đích nhân bản và thu nhận gene 16S rDNA thuộc nhóm
vi khuẩn.

40
3.3. Kết quả thu nhận gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu R
Chọn mẫu sản phẩm DNA bộ gene ở giếng đầu tiên ở hình 3.2, thu
nhận gene 16S rDNA dựa trên cặp mồi 27F và 1492R xem hình 3.3(A). Sau
đó tiếp tục lấy sản phẩm PCR trên để nhân bản gene V3 thuộc vùng gene 16S
rDNA dựa trên cặp mồi 357F-GC và 517R với kết quả PCR thu đƣợc ở hình
3.3(B) với kích thƣớc gene V3 trong khoảng 200bp. Tuy nhiên, kết quả này
chƣa cho biết đƣợc gì về các đoạn gene chuyên biệt của từng loài vi khuẩn
trong cùng một mẫu. Chuyển sang kỹ thuật DGGE lần 1 xem hình 3.3(C) cho
thấy trong cùng một sản phẩm PCR gene V3 thì cho ra 5 phân đoạn V3 đƣợc
tách rời nhau trên gel polyacrylamide. Năm vùng gene V3 này đƣợc ly trích
và thu nhận, sau đó tiếp tục DGGE lần 2 trong với mỗi giếng mỗi phân đoạn.
Kết quả DGGE lần 2 xem hình 3.3(D) 5 gene V3 của mẫu R nhằm tách
riêng rẻ theo thời gian, chiều dài bảng gel chạy và vị trí tƣơng ứng với DGGE
lần 1 trong cùng gradient biến tính có nồng độ từ 40% đến 60% của gel
polyacrylamide. Từ kết quả trong bảng gel mẫu R có tồn tại 5 đoạn gene V3
đƣợc ký hiệu là R1, R2, R3, R4 và R5 có thể thuộc các chủng vi khuẩn khác
nhau.
Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu R.
A.Sản phẩm nhân bản gene 16S rDNA của mẫu R trên gel agarose 1%.

41
B. Sản phẩm nhân bản gene V3 thuộc vùng gene 16S rDNA trên gel agaorse
1% điện di trong 100volt/40phút.
C. DGGE lần 1 trên hệ thống BioRad với nguồn điện 200volt/300phút trên
gel polyarylamide 40-60%.
D. DGGE lần 2 tƣơng tự C.
Tiếp tục cắt và thu nhận bảng gel trực tiếp của đoạn gene R1, R2, R3,
R4 và R5 trong gel polyarylamide bằng bộ kit QIAGen và PCR sản phẩm V3
với cặp mồi 517F và 357R và xem kết quả trình tự gene.
3.4. Kết quả phân tích dữ liệu cộng đồng vi khuẩn của mẫu R
Trình tự 5 đoạn gene trên và so sánh mức độ tƣơng đồng gene trong
ngân hàng dữ liệu NCBI với công cụ BLAST và xây dựng cây phân loại loài
xem hình 3.4. Cho thấy tính đa dạng nhóm vi khuẩn trong mẫu rơm chƣa ủ và
có mức độ tƣơng đồng vùng gene V3 tƣơng ứng nhƣ sau; gene R1 tƣơng ứng
với chi Agrobacterium, R2 thuộc chi Clostridium, R3 tƣơng ứng với chi
Bacteroidetes, R4 tƣơng tự chi Thermopolysporasa và R5 thuộc chi Bacillus.

42
Hình 3.4. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu R. Dựa trên phân tích trình tự
vùng gene V3 (R1, R2, R3, R4 và R5) và các chủng vi khuẩn trên ngân hàng
dữ liệu NCBI.
Theo dữ liệu công bố nghiên cứu của Vila R.C [41] đã cho thấy cộng
đồng vi khuẩn trong phân và rơm ủ có Alphaproteobacteria trong mẫu rơm rạ
ban đầu chƣa ủ, Bacillus và Actinomycetes ở giai đoạn ƣa nhiệt, Cytophaga và
Clostridial trong giai đoạn ủ nhiều tuần. Một nghiên cứu khác của Steger K
[60] cũng thấy có thay đổi thành phần trong cộng đồng Actinobacteria trong
quá trình ủ thải hữu cơ theo quy mô của hộ gia đình. So sánh với kết quả thu
đƣợc cho thấy hệ vi khuẩn của mẫu rơm chƣa ủ có sự hiện diện của vài dòng
vi khuẩn giống nhƣ đã công bố. Bên cạnh đó tính đa dạng nhóm vi khuẩn
cũng tùy thuộc vào từng loại rơm rạ, quá trình canh tác và vận chuyển.
3.5. Kết quả thu nhận DNA, gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu Rn
Qui trình và các bƣớc thực hiện kỹ thuật mẫu rơm sau ủ (Rn) cũng
giống nhƣ ở các mục 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4, kết quả thu nhận DNA của cộng
đồng vi sinh vật trực tiếp từ mẫu Rn sử dụng làm nguyên liệu trồng nấm
Rơm. Sản phẩm DNA bộ gene vi khuẩn xem hình 3.5(A), sản phẩm nhân bản
gene V3 xem hình 3.5(B), tách gene V3 chạy DGGE lần 1 cho khoảng 4 đoạn
gene V3 và DGGE lần 2 tách gene riêng biệt từng gene V3 trong hình
3.5(C,D).
Với kết quả của mẫu Rn thu đƣợc khoảng 4 band kí hiệu là Rn1, Rn2,
Rn3 và Rn4 so với mẫu R có 5 band, kết quả này cũng hợp lý vì khoảng 18
ngày ủ và nhiệt độ cao cho nên số lƣợng và số loài có thể giảm so với mẫu
ban đầu.

43
Hình 3.5. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu Rn.
A.Sản phẩm nhân bản gene 16S rDNA của mẫu Rn trên gel agarose 1% điện
di trong 100volt/40phút.
B. Sản phẩm nhân bản gene V3 thuộc vùng gene 16S rDNA trên gel agaorse
1% điện di trong 100volt/40phút.
C. DGGE lần 1 trên hệ thống BioRad với nguồn điện 200volt/300phút trên
gel polyarylamide 40-60%.
D. DGGE lần 2 tƣơng tự C.
3.6. Kết quả tạo dòng trên vector pGEM@
-T Easy của hãng Promega
Chọn sản phẩm gene V3 của mẫu Rn ở mục 3.5 ở trên thực hiện chèn
vào vector pGEM@
-T Easy và biến nạp vào E.coli JM109 theo qui trình kỹ
thuật của hãng sàn xuất Nippon Genetics.
Từ quá trình chuyển những đoạn gene V3 vào vector và biến nạp vào
E.coli JM109 cho thấy sản phẩm thu nhận đƣợc ở hình 3.6 (A,B,C) trong đó
có khuẩn lạc màu xanh và trắng. Điều này cho kết luận rằng khuẩn lạc có màu
trắng đã đƣợc chuyển gene V3 thành công, vì đoạn gene V3 đã chèn vào giữa
vùng gene Lac Z làm cho β-lactamase không tạo ra nên khuẩn lạc trong môi
trƣờng LB để tạo khuẩn lạc có màu xanh mà là khuẩn lạc sẽ có biểu hiện màu
trắng.

44
Hình 3.6. Kết quả thu nhận sản phẩm tạo dòng, khuẩn lạc có màu trắng thì
đoạn gene đã chèn vào vector pGEM@
-T Easy và vetor đã biến nạp vào E.coli
(A, B) và chọn khuẩn lạc có màu trắng cấy chuyền thuần trên môi trƣờng LB
(C) có chứa Ampicillin, PIG và X-Gal.
Kết quả này chứng minh rằng khuẩn lạc nào có màu trắng là khuẩn lạc
đã chuyển thành công vector pGEM@
-T Easy có chứa đoạn gene V3. Tiếp tục
chọn khoảng 30 khuẩn lạc màu trắng thực hiện cấy chuyền lập lại nhằm mục
đích kiểm tra tính ổn định vector đã chuyển vào vi khuẩn E.coli JM109 mà
không bị đào thải qua các vòng đời sinh sản của chủng E.coli JM109.
3.7. Kết quả thu nhận vùng gene V3 sau khi đã tạo dòng
Chọn khoảng 30 khuẩn lạccó màu trắng đã cấy thuần qua nhiều lần và
sử dụng qui trình của QIAGEN plasmid kít tách chiết và thu nhận lại vector
rồi sau đó PCR cho kết quả sản phẩm gene V3 ở hình 3.7(A,B).

45
Hình 3.7. Kết quả 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 thể hiện trên gel agarose
1% đƣợc ly trích và thu nhận từ vi kuẩn E.coli JM109 đã đƣợc chèn vào
vector pGEM@
-T Easy (A và B).
3.8. Kết quả kiểm tra gene V3 sau khi tạo dòng bằng kỹ thuật DGGE
Lấy kết quả sản phẩm PCR ở hình 3.7(A, B) thực hiện phƣơng pháp
DGGE từ kết quả vị trí các mẫu gene V3 cho thấy gene 5 tƣơng ứng với vị trí
gene Rn1, đoạn gene 11, 26 tƣơng ứng gene Rn2, tƣơng tự đoạn gene 6,
8,10,12,14, 21, 23, 25, 27 và 29 tƣơng ứng vị trí gene Rn3, phần còn lại là 1,
2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17,18, 19, 20, 24, 27 và 30 tƣơng ứng với gene Rn4. So
sánh sản phẩm DGGE với hình 3.5D cho thấy vị trí các đoạn gene giữa
phƣơng pháp DGGE và tạo dòng điều cho kết quả giống nhau.

46
Hình 3.8. Kết quả 30 sản phẩm DGGE chạy trên hệ thống BioRad với
nguồn điện 200volt/300phút trên gel polyarylamide 40-60% (A, B).
Chọn đại diện đoạn gene V3 của sản phẩm tạo dòng tƣơng ứng với vị
trí đoạn gene Rn cho mẫu nhƣ sau; gene 5, 26, 8 và 3 xem hình 3.8 (A,B) của
sản phẩm tạo dòng và Rn1, Rn2, Rn3, Rn4 của sản phẩm DGGE xem hình
3.5(D) giải trình tự gene và so sánh kết quả các dữ liệu gene đoạn V3 trong
ngân hàng dữ liệu NCBI với công cụ BLAST.
Kết quả trình tự của đoạn gene 5 giống Rn1, gene 26 giống Rn2, gene 8
giống Rn3 và tƣơng tự gene 3 với Rn4. Dựa vào so sánh tính tƣơng đồng của
mẫu các trình tự Rn với tham chiếu trong Genbank với từng mức cụ thể nhƣ
sau; Kết quả cho thấy gene 5 (Rn1) tƣơng đồng với chi Agrobacterium là
96%, gene 26 (Rn2) và gene 8 (Rn3) thuộc chi Clostridium với mức độ tƣơng
đồng gần với các chủng Clostridium thermocellum, Clostridium
aurantibutyricum lần lƣợt tƣơng ứng là 99%, 98% và gene 3 (Rn4) có mức độ
tƣơng đồng với loài Agrobacterium là 95% xem hình 1.9.
Thông qua kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng với kết quả thu đƣợc đều
giống nhau ở mẫu Rn, còn lại hai chi Clostridium, Agrobacterium. Vì giai
đoạn rơm ủ nhiệt độ tăng trong khoảng 70-800
C và thời gian ủ kéo dài khoảng
18 ngày, làm cho sự hiện diện tính đa dạng dòng vi khuẩn không còn nhƣ mẫu
rơm ban đầu ở nhƣ kết quả phân tích ở hình 1.1D và 1.2. [70].

47
Hình 3.9. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu Rn. Dựa trên phân tích
trình tự vùng gen V3 (Rn1, Rn2, Rn3 và Rn4) với các chủng vi khuẩn trên
ngân hàng dữ liệu NCBI.
Các vi khuẩn đƣợc xác định phổ biến nhất gặp phải các đống phân ủ ở
giai đoạn đầu tiên và cuối cùng của chu kỳ ủ phân và đại diện cho các vi
khuẩn ƣa ấm, nhiệt độ 10-400
C (mesophilic bacteria) phát triển nhƣ
Staphylococcus sp, Staphylococcus aureus, Bacillus sp. B. subtilis, B. brevis,
B. polymyxa là loài chiếm ƣu thế khi bắt đầu quá trình ủ phân trong tất cả các
loại phân ủ và dần biến mất hoàn toàn sau 20 ngày, chỉ còn lại nhóm vi khuẩn
Bacillus sp có khả năng tạo bào tử. Ngoài ra có nhóm nấm Aspergillus niger,
Fusarium oxysporum, Fusarium moniliforme, Rhizopus nigricans, Penicillium
citrinum nhiều công bố trong các nghiên cứu. [69.70.71].

48
3.9. Kết quả sơ bộ định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn
Xác định khả năng tồn tại enzyme cellulase trong mẫu Rn (Rn1, Rn2
và Rn3) thông qua phƣơng pháp đĩa CMC nhằm kiểm tra kết quả sơ bộ định
tính có sự hiện diện của enzyme cellulase tạo vòng phân giải CMC trong môi
trƣờng thạch đĩa xem hình 3.10.
Hình 3.10. Thử khả năng sinh cellulase trên đĩa CMC của mẫu Rn.
Kết quả trên cho thấy rằng trong mẫu rơm rạ sau có enzyme cellulase.
Chứng tỏ rằng nhóm vi khuẩn tồn tại trong mẫu rơm rạ trong suốt quá trình ủ
có khả năng sinh enzyme cellulase nhằm phân hủy cellulose rơm rạ cung cấp
nguồn glucose cho sự tồn tại và phát triển.
Tóm lại: Mẫu Rơm (Rn) đƣợc thu nhận tại xã Tân Hòa, huyện Lai
Vung, tỉnh Đồng Tháp cho kết quả cùng sản phẩm PCR từ thu nhận DNA bộ
gene và nhân bản đoạn gene V3 thuộc vùng gene 16S rDNA dựa trên cặp mồi
chung là 357F-GC và 517R. Thông qua phân tích cộng đồng vi khuẩn bằng
kỹ thuật DGGE cho 4 đoạn gene V3 là Rn1, Rn2, Rn3, Rn4. Kỹ thuật Tạo
dòng cũng cho 4 phân đoạn gene 5 tƣơng ứng với vị trí gene Rn1, đoạn gene
11, 26 tƣơng ứng gene Rn2, tƣơng tự đoạn gene 6, 8,10,12,14, 21, 23, 25, 27
và 29 tƣơng ứng vị trí gene Rn3, phần còn lại là 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16,
17,18, 19, 20, 24, 27 và 30 tƣơng ứng với gene Rn4. Ngoài ra mẫu Rơm (R)
cho thấy tính đa dạng vi khuẩn trong mẫu chƣa thông qua ủ khoảng 5 chi và
còn lại khoảng 2 chi vi khuẩn sau giai đoạn ủ. Kỹ thuật phân tích PCR-DGGE
và Tạo dòng có thể áp dụng cho việc phân tích cộng đồng vi khuẩn nói riêng

49
và các nhóm vi sinh nói chung trong các loại mẫu khác nhau, trong điều kiện
hệ vi sinh luôn luôn thay đổi và bên cạnh đó giúp các định hƣớng phân lập
giống vi khuẩn và hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo từ kết quả trong phân
tích kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng.

50
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Kết quả phân tích mẫu rơm trƣớc ủ (R) với phƣơng pháp PCR-DGGE
thu đƣợc gene R1 ứng với chi Agrobacterium, R2 thuộc chi Clostridium, R3
tƣơng ứng với chi Bacteroidetes, R4 tƣơng tự chi Thermopolysporasa và R5
thuộc chi Bacillus
Kết quả phân tích mẫu rơm sau ủ (Rn) với phƣơng pháp PCR-DGGE
và tạo dòng cho thấy gene Rn1 (gene 5) và gene Rn4 (gene 3) tƣơng đồng với
chi Agrobacterium, gene Rn2 (gene 26) và gene Rn3 (gene 8) thuộc chi
Clostridium.
Kết quả dữ liệu gene trong mẫu R có đa dạng vi khuẩn khoảng 5 chi,
còn trong mẫu Rn thì tính đa dạng vi khuẩn ít hơn khoảng 2 chi. Điều này cho
thấy sự biến động đa dạng vi khuẩn trong giai đoạn rơm ủ.
Việc sử dụng và so sánh giữa kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng với
mẫu Rn cho kết quả hoàn toàn giống nhau ở vị trí trên gel polyacrylamide và
trình tự gene trong các đoạn gene V3 trên mẫu Rn. Điều này có thể sử dụng
độc lập kỹ thuật PCR-DGGE hoặc tạo dòng trong phân tích cộng đồng vi sinh
vật hoặc kết hợp cả hai phƣơng pháp với nhau.
4.2. Kiến nghị
Cần phân tích các thông số ngoại sinh ảnh hƣởng trực tiếp và gián tiếp
ở ụ rơm ủ nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, pH và kết hợp kiểm tra sự thay đổi cộng đồng
vi khuẩn liên tục theo từng ngày và chất lƣợng rơm trong suốt giai đoạn ủ.

51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2017, Rice
Market Monitor. FAO.
2. Su HJ., Bo SK.,Joo SK., 2008, Production of bio-oil from rice straw
and bamboo sawdust under various reaction conditions in a fast pyrolysis
plant equipped with a fluidized bed and a char separation system, J. Anal.
Appl. Pyrolysis, 82, pp. 240–247.
3. Kapoor M., Soam S., Agrawal R., Gupta RP., Tuli DK and Kumar R.,
2017, Pilot scale dilute acid pretreatment of rice straw and fer-mentable sugar
recovery at high solid loadings, Bioresour Technol, 224, pp.688-693.
4. Wi SG., Choi IS., Kim KH., Kim HM., Bae HJ., 2013, Bioethanol
production from rice straw by popping pretreatment, Biotechnol Biofuel, 6(1).
Pp. 1-7.
5. Belal EB., 2013, Bioethanol production from rice straw residues, Braz
Microbiol, 44(1), pp. 225-234.
6. Yang B., Dai Z., Ding SY., Wyman C E., 2011, Enzymatic hydrolysis
of cellulosic biomass, Biofuels, 2(4), pp.421-449.
7. Abe K., Yano H., 2009, Comparison of the characteristics of cel-lulose
microÞ bril aggregates of wood, rice straw and potato tuber, Cellulose, vol
16(6), pp. 1017-1023.
8. Hallac BB., Ragauskas AJ., 2011, Analyzing cellulose degree of
polymerization and its relevancy to cellulosic ethanol, Biofuels Bioprod
Bioref, 5(2), pp.215-225.
9. Lê Đức Ngoan, 2005, Giáo trình thức ăn gia súc, Nhà xuất bản Nông
nghiệp.
10. Fan G., Wang M., Liao C., Fang T., Li J., Zhou R., 2013, Isolation of
cellulose from rice straw and its conversion into cellulose acetate catalyzed
by phosphotungstic acid, Carbohydr Polym, 94(1), pp.71-76.

52
11. Wang H., Ben H., Ruan H., Zhang L., Pu Y., Feng M., 2017, Effects of
lignin structure on hydrodeoxygenation reactivity of pine wood lignin to
valuable chemicals, ACS Sustain Chem Eng, 5(2), pp.1824-1830.
12. Oladosu Y., RaÞi MY., Abdullah N., Magaji U., Hussin G., Ramli A.,
2016, Fermentation quality and additives: a case of rice straw silage, Biomed
Res Int, p.1-14.
13. Nguyen HV., Nguyen CD., Tran TV., Hau HD., Nguyen NT.,
Gummert M., Energy effciency, greenhouse gas emissions, and cost of rice
straw collection in the mekong river delta of vietnam. Field Crops Res, 198,
pp.16-22.
14. Balagurumurthy B., Srivastava V., Vinit KJ., Biswas B., Singh R.,
2015, Value addition to rice straw through pyrolysis in hydrogen and
nitrogen environments, Bioresour Technol, 188, pp.273-279. (2015).
15. Jung SH., Kang BS., Kim JS., 2008, Production of bio-oil from rice
straw and bamboo sawdust under various reaction conditions in a fast
pyrolysis plant equipped with a ß uidized bed and a char separation system,
J Anal Appl Pyrolysis, 82(2), pp.240-247. (2008).
16. Wu W., Yang M., Feng Q., McGrouther K., Wang H., Lu H., 2012,
Chemical characterization of rice straw-derived biochar for soil amendment,
Biomass Bioenerg, 47, pp.268-276. (2012).
17. Nguyễn Đức Lƣợng, 2010, Công nghệ sản xuất enzyme. Nhà xuất
bản Đại học Quốc Gia, Tp. Hồ Chí Minh.
18. Yang B., 2011, Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass. Biofuels
2, pp.421-449.
19. Shewale J., 1982, β-Glucosidase: its role in cellulase synthesis and
hydrolysis of cellulose, International Journal of Biochemistry, 14, pp.435-
443.

53
20. Wiseman JWA., 1983, Fungal and other β-dglucosidases: their
properties and applications, Enzyme and Microbial Technology, 4, pp. 73–
79.
21. Wilson DB., 2008, Three microbial strategies for plant cell wall
degradation, Annals of the New York Academy of Sciences, 1125, pp.289-
297.
22. Oyeleke S., Okusanmi T., 2008. Isolation and characterization of
cellulose hydrolysing microorganism from the rumen of ruminants, African
Journal of Biotechnology.
23. Huang S., 2012, Isolation and identification of cellulolytic bacteria
from the gut of Holotrichia parallela larvae (Coleoptera: Scarabaeidae),
International journal of molecular sciences, 13, pp.2563-2577.
24. Hu X., 2014, Cellulolytic bacteria associated with the gut of
Dendroctonus armandi Larvae (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae),
Forests, 5, pp.455-465.
25. Schwarz W., 2001, The cellulosome and cellulose degradation by
anaerobic bacteria, Applied microbiology and biotechnology, 56, pp.634-
649.
26. Rastogi G., 2009, Isolation and characterization of cellulose-
degrading bacteria from the deep subsurface of the Homestake gold mine,
Lead, South Dakota, USA, Journal of industrial microbiology &
biotechnology, 36, pp.585-598.
27. Kluepfel D.,1986, Characterization of cellulase and xylanase
activities of Streptomyces lividans, Applied microbiology and
biotechnology, 24, pp.230-234.
28. Semêdo L., 2004, Streptomyces drozdowiczii sp. nov., a novel
cellulolytic streptomycete from soil in Brazil, International journal of
systematic and evolutionary microbiology, 54, pp. 1323-1328.

Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY

Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY

Similar to Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY (20)

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY