SlideShare a Scribd company logo

Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

•
•
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620

Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Đánh giá sự lưu hành và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại một số quận nội thành Hà Nội Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net

Education
1 of 104
    BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM   HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ‫־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־‬ Tạ Thị Yến ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU ĂN SỐNG TẠI MỘT SỐ QUẬN NỘI THÀNH HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội – 2019
    BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM   HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ‫־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־‬ Tạ Thị Yến ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU ĂN SỐNG TẠI MỘT SỐ QUẬN NỘI THÀNH HÀ NỘI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Hướng dẫn 2: PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo Hà Nội - 2019
    Lời cam đoan Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Chu Hoàng Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Học viên Tạ Thị Yến
    Lời cảm ơn Luận văn thạc sĩ được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia dưới sự dẫn dắt của: PGS.TS. Chu Hoàng Hà – Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ. Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các đồng nghiệp trong khoa Vi sinh vật – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong khoảng thời gian thực hiện luận văn. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên của Học Viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập tại học viện. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình thân yêu của tôi, cảm ơn bạn bè những người đã luôn sát cánh bên tôi, chia sẻ và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Người viết Tạ Thị Yến
    Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Chữ viết tắt Tiếng Anh đầy đủ Tiếng Việt đầy đủ ADN Deoxyribonucleic acid axit Deoxyribonucleic AmpC Plasmid-mediated AmpC β- lactamases Enzym β-lactamase AmpC CXM cefuroxime Kháng sinh cephalosporin thế hệ 2, cefuroxime CTX cefotaxime Kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, cefotaxime CAZ ceftazidime Kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, ceftazidime CRO ceftriaxone Kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, ceftriaxzone CAL ceftazidime + clavulanic acid ceftazidime kết hợp axit clavulanic CTL cefotaxime + clavulanic acid cefotaxime kết hợp axit clavulanic CAC ceftazidime + cloxacillin ceftazidime kết hợp cloxacillin CTC cefotaxime + cloxacillin cefotaxime kết hợp cloxacillin CLSI Clinical Laboratory Standard Institute Viện Tiêu chuẩn thử nghiệm lâm sàng Hoa Kỳ EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit Ethylenediaminetetraacetic ESBL Extended spectrum beta- lactamase β-lactamase phổ rộng ESC Extended spectrum Cephalosporin cephalosporin phổ rộng EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Ủy ban châu Âu về thử nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh
    FOX Cefoxitin Kháng sinh Cephalosporin thế hệ 2, cefoxitin FSIS United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service Tổ chức an toàn và kiểm tra thực phẩm của bộ Nông nghiệp Mỹ ISO International Standard Organisation Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế KZ Cefazolin Kháng sinh Cephalosprorin thế hệ 1, cefazoline Omp Outer membrane porin Porin màng ngoài OmpA Outer membrane protein A protein A màng ngoài vi khuẩn PAI Pathogenicity island Vùng gây bệnh UTI Urinary tract infection Vi khuẩn lây nhiễm đường tiết niệu WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới
    Danh mục các bảng Bảng biểu Nội dung Trang Bảng 1.1 Sự phân bố của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae 9 Bảng 1.2 Các thế hệ cephalosporin 14 Bảng 2.1 Kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ 40 Bảng 2.2 Vi khuẩn sinh enzym ESBL 41 Bảng 2.3 Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase 42 Bảng 2.4 Xác định vi khuẩn sinh enzym Carbapenemase 42 Bảng 2.5 Trình tự mồi của gen mã hóa enzym β-lactamase 44 Bảng 3.1 Mật độ vi sinh vật log CFU/g theo loại hình kinh doanh 51 Bảng 3.2 Tỉ lệ kháng kháng sinh Cephalosporin 56 Bảng 3.3 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL và AmpC β-lactamase 62 Bảng 3.4 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 66 Bảng 3.5 Vi khuẩn Enterobacteriaceae mang gen kháng kháng sinh 73
    Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình Nội dung Trang Hình 1.1. Phân nhóm trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae 8 Hình 1.2. Các bệnh do vi khuẩn Enterobacteriaceae gây ra trên người 10 Hình 1.3 Lịch sử ra đời các loại kháng sinh 12 Hình 1.4 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn 15 Hình 1.5 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa vi sinh vật 16 Hình 1.6 Các cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn 17 Hình 1.7 Cơ chế tác động lên tế bào của kháng sinh 18 Hình 1.8 Con đường lây nhiễm và phát tán mầm bệnh ra cộng đồng 19 Hình 1.9 Các nhóm enzym β-lactamase 24 Hình 1.10 Con đường lây truyền Enterobacteriaceae lên người 29 Hình 2.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội 36 Hình 2.2 Rau ăn sống được bày bán tại các chợ và siêu thị 36 Hình 2.3 Nguyên lý cơ bản định danh vi khuẩn bằng hệ thống VITEK MS 43 Hình 3.1 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trung bình trong rau ăn sống 51 Hình 3.2 Kháng sinh đồ trên chủng vi khuẩn đối chiếu 53 Hình 3.3 Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng với cephalosporin thế hệ 1, 2 53-54 Hình 3.4 Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng Cephalosporin thế hệ 1, 2 và 3 54 Hình 3.5 Khuẩn lạc phân lập trên môi trường Macconkey 57 Hình 3.6 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactam phổ rộng 58
    Hình 3.7 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym AmpC β- lactamase 59 Hình 3.8 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL và AmpC β-lactamase 60 Hình 3.9 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 65 Hình 3.10 Định danh Leclercia adecaboxylata bằng kỹ thuật MALDI TOF 65 Hình 3.11 Sản phẩm khuếch đại gen được sử dụng để giải trình tự 68 Hình 3.12 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla TEM với dữ liệu ngân hàng gen 69 Hình 3.13 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla OXA với dữ liệu ngân hàng gen 69 Hình 3.14 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla CTX-M với dữ liệu ngân hàng gen 69 Hình 3.15 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla DHA với dữ liệu ngân hàng gen 70 Hình 3.16 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla CMY với dữ liệu ngân hàng gen 70 Hình 3.17 Đoạn khuếch đại gen bla TEM 71 Hình 3.18 Đoạn khuếch đại gen bla OXA 71 Hình 3.19 Đoạn khuếch đại gen bla CTX-M 72 Hình 3.20 Đoạn khuếch đại gen bla DHA 72 Hình 3.21 Đoạn khuếch đại gen bla CMY 72
  1   MỤC LỤC MỞ ĐẦU........................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 7 1.1. HỌ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE.............. 7 1.1.1. Enterobacteriaceae........................................................................... 7 1.1.2. Sự phân bố của Enterobacteriaceae................................................. 8 1.1.3. Khả năng gây bệnh của Enterobacteriaceae .................................... 9 1.1.3.1. Viêm màng não và viêm nhiễm hệ Thần kinh.......................... 10 1.1.3.2. Nhiễm trùng đường tiết niệu..................................................... 10 1.1.3.4. Gây bệnh đường ruột................................................................ 11 1.2. KHÁNG SINH...................................................................................... 12 1.2.1. Lịch sử ra đời kháng sinh................................................................ 12 1.2.1.1. Cephalosporin........................................................................... 13 1.2.1.2. Các kháng sinh β-lactam khác.................................................. 14 1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh................................................................ 14 1.2.2.1. Kháng kháng sinh ..................................................................... 14 1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn.................................... 18 1.2.3. Hiện tượng kháng cephalosporine ở vi khuẩn gram âm................. 22 1.2.4. Enzym β-lactamase......................................................................... 23 1.2.4.1. Enzym β-lactamase phổ rộng ................................................... 25 1.2.4.2. β-lactamase AmpC ................................................................... 27 1.2.4.3. Carbapenemase......................................................................... 28 1.3. THỰC PHẨM – NGUỒN CHỨA ENTEROBACTERIACEAE........... 29 1.3.1. Rau ăn sống – vật chủ chứa Enterobacteriaceae ........................... 30 1.3.2. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau trên thế giới......... 32 1.3.3. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau tại Việt Nam........ 34 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 36 2.1. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............ 36
  2   2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU .......................................................................... 37 2.2.1. Dụng cụ........................................................................................... 37 2.2.2. Thiết bị............................................................................................ 37 2.2.3. Hóa chất .......................................................................................... 38 2.2.4. Chủng chuẩn ................................................................................... 38 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 38 2.3.1. Chuẩn bị và xử lý mẫu.................................................................... 38 2.3.2. Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae................................ 39 2.3.3. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh............................................ 39 2.3.3.1. Thử tính kháng kháng sinh β-lactam........................................ 39 2.3.3.2. Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase ................................................................................................................ 40 2.3.4. Kỹ thuật MALDI – TOF định danh vi sinh vật.............................. 43 2.3.5. Phương pháp xác định gen kháng kháng sinh ................................ 44 2.4. CHỦNG ĐỐI CHỨNG......................................................................... 45 2.6. XỬ LÝ KẾT QUẢ................................................................................ 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 47 3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU SỐNG................................................................................... 47 3.1.1. Đánh giá tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau sống 47 3.1.2. Đánh giá mật độ nhiễm Enterobacteriaceae theo loại hình kinh doanh......................................................................................................... 49 3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CEPHALOSPORIN VÀ KHẢ NĂNG SINH ENZYM β-LACTAMASE CỦA VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE.......................................................................... 52 3.2.1. Đánh giá khả năng kháng kháng sinh cephalosporin ..................... 52 3.2.2. Đánh giá sự lưu hành vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β- lactamase................................................................................................... 57 3.3. ĐỊNH DANH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE SINH ENZYM β-LACTAMASE VÀ XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG KHÁNG SINH............ 64
  3   3.3.1. Định danh vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 64 3.3.2 Xác định gen mã hóa enzym β-lactamase ....................................... 67 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................... 75 4.1. KẾT LUẬN........................................................................................... 75 4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 76      
  4   MỞ ĐẦU Enterobacteriaceae là vi khuẩn gây bệnh đường ruột phổ biến trên toàn thế giới. Bệnh lây truyền qua thực phẩm gây ra bởi Enterobacteriaceae đang là mối quan tâm của cộng đồng toàn cầu. Hầu hết các vụ bùng phát dịch Enterobacteriaceae trên người có liên quan đến việc tiêu thụ sản phẩm thực phẩm mang nguồn bệnh [1]. Hai vấn đề chính trong dịch tễ về vi khuẩn Enterobacteriaceae tại các nước phát triển và đang phát triển trong nửa sau của thế kỷ 20 là sự bùng phát của các ca bệnh do Enterobacteriaceae lây truyền qua thực phẩm lên người và các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae kháng nhiều kháng sinh. Trong thế kỷ 21, tình trạng kháng kháng sinh đã trở nên được quan tâm trên toàn cầu với sự kháng carbapenem và cephalosporin thế hệ 3 của các vi khuẩn Enterobacteriaceae [2]. Sự gia tăng về mức độ kháng kháng sinh của Enterobacteriaceae là một vấn đề quan ngại trên toàn cầu trong những thập kỷ gần đây bởi sự lạm dụng kháng sinh trong điều trị trên người và trong chăn nuôi. Sự cùng tồn tại của nhiều loài vi khuẩn trong đường ruột của động vật và con người đã tạo điều kiện cho việc truyền gen kháng kháng sinh giữa các loài vi khuẩn với nhau. Bên cạnh đó con đường đi của chuỗi thức ăn cũng góp phần làm gia tăng tỉ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh lên người [3]. Cũng như một số nước trên toàn thế giới, Việt Nam đang phải đối mặt với khó khăn trong quá trình điều trị do sự gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh. Thực tế cho thấy hiện tượng dễ dàng mua bán kháng sinh cho điều trị bệnh ở người và sử dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam mà không cần đơn của thầy thuốc là một trong những nguyên nhân chính thúc đẩy tình trạng kháng kháng sinh [4]. Rau là nguồn thực phẩm phổ biến trong cuộc sống hằng ngày của người Việt Nam. Theo báo cáo của Ngân hàng thế giới vào năm 2017, tỉ lệ tiêu thụ rau tại Việt Nam là 0,4 kg rau mỗi ngày trên người và tỉ lệ tiêu thụ rau tại Hà Nội là 2,800 tấn mỗi ngày. Năng suất sản xuất rau tại Hà Nội là 600,000 tấn mỗi năm và trung bình là 1,644 tấn mỗi ngày. Với sức tiêu thụ khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, Hà Nội phải sử dụng nguồn cung từ các tỉnh thành thuộc đồng
  5   bằng sông Hồng như Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, Hòa Bình [5]. Từ đó cho thấy rau là nguồn tiêu thụ chính cho nhu cầu ăn uống hằng ngày của người dân Hà Nội. Cũng như các loại thực phẩm khác, rau ăn sống là nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và khả năng lây truyền vi khuẩn kháng lên người. Tuy nhiên cho đến nay có rất ít báo cáo đã công bố về tình trạng vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống chứa các gen mã hóa enzym β-lactamase có khả năng kháng kháng sinh β-lactam. Đặc biệt hơn, tại Việt Nam chưa có công bố nào về tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống được bán tại các quán ăn. Để có những bằng chứng cụ thể về thực trạng ô nhiễm và kháng kháng sinh của Enterobacteriaceae trong rau ăn sống, chúng tôi quyết định tiến hành thực hiện luận văn “Đánh giá sự lưu hành và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại một số quận nội thành Hà Nội” Mục đích 1. Xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống (Nhóm Enterobacteriaceae lên men glucose, nhóm Enterobacteriaceae lên men lactose – Coliform- và Escherichia coli), và xác định tính kháng kháng sinh cephalosporin của các chủng vi khuẩn đã thu thập; 2. Xác định loài vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae sinh enzym β- lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase và carbapenemase và gen mã hóa enzym β-lactamase trong các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase đã thu thập. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện trên sản phẩm thực phẩm là rau ăn sống thu thập tại các loại hình kinh doanh là chợ, siêu thị và các quán ăn có phục vụ rau ăn sống.
  6   Ý nghĩa khoa học Luận văn đã cung cấp thêm số liệu về sự lưu hành và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại ba loại hình kinh doanh là chợ, siêu thị và quán ăn có phục vụ rau sống. Luận văn là bước khởi đầu cho các nghiên cứu về thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn hiện diện trong thực phẩm. Ý nghĩa thực tiễn Luận văn cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea trong rau ăn sống, qua đó cho thấy thực tiễn hiện diện của các vi khuẩn kháng kháng sinh trong thực phẩm đang được tiêu thụ tại chợ, siêu thị và quán ăn.
  7   CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HỌ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE 1.1.1. Enterobacteriaceae Họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae bao gồm một nhóm lớn các vi khuẩn gram âm không tạo bào tử, thường có độ dài 1-5 μm, sinh trưởng trong điều kiện kị khí và hiếm khí tùy ý (ngoại trừ Saccharobacter fermentans và một số loài thuộc chi Yersinia và Erwinia) và có khả năng di chuyển bằng long, ngoại trừ chi Shigella và Tatumella. Một đặc điểm chung của Enterobacteriaceae, giúp phân biệt với các vi khuẩn khác là thiếu cytochrome C oxidase dẫn đến tạo phản ứng âm tính với oxidase, trừ Plesiomonas spp. Enterobacteriaceae lên men nhiều loại carbohydrate, trong đó khả năng sản xuất axit và sinh khí từ quá trình lên men glucose D là một đặc tính chẩn đoán quan trọng và thường được sử dụng là cơ sở để phát hiện và định lượng Enterobacteriaceae. Một số thành viên của Enterobacteriaceae (ví dụ Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter spp.và Klebsiella spp.) có thể được phát hiện và định lượng dựa trên khả năng lên men lactose nhanh chóng (thường trong vòng 24-48 giờ) tạo ra axít và sinh khí. Nhóm vi khuẩn này được gọi chung là vi khuẩn Coliform và thường được sử dụng như là các vi sinh vật chỉ điểm nhiễm phân bởi ngành công nghiệp thực phẩm và nước bởi vì môi trường sống bình thường của Coliform là đường tiêu hóa của động vật có vú [6]. Tên gọi họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae lần đầu tiên được đề xuất bởi Rahn vào năm 1937, với chi Escherichia. Sơ đồ phân loại của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae phức tạp và nhanh chóng thay đổi khi áp dụng các kỹ thuật tiên tiến xác định loài vi khuẩn dựa trên trình tự axit nucleic. Số lượng chi và loài Enterobacteriaceae đã tăng từ 12 chi và 36 loài năm 1974 lên ít nhất 34 chi, 149 loài và 21 phân loài trong năm 2006 [7]. Năm 2011, họ vi khuẩn đường ruột đã tăng lên ít nhất 48 chi, 219 loài và 41 loài phụ. Theo cơ sở dữ liệu phân loại của Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ vào năm 2015 thì có 63 chi đã được xác định với hơn 210 loài [1], tuy nhiên họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có ý nghĩa lâm sàng chỉ bao gồm 20-25 loài, và
  8   các loài khác thì không thường gặp. Số lượng các chi và loài có thể được tăng lên theo thời gian dựa trên các số liệu chưa được công bố [7]. Enterobacteriaceae được xem là các vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh cung cấp các bằng chứng về vệ sinh an toàn thực phẩm trong chuỗi thức ăn cũng như trong ngành công nghiệp thực phẩm. Vi khuẩn thuộc họ đường ruột Enterobacteriaceae được chia thành 3 nhóm, trong đó chủ yếu là nhóm vi khuẩn không lên men đường lactose bao gồm một số chi như Proteus, Cronobacter, Shigella; nhóm lên men lactose chậm hoặc do đột biến; nhóm còn lại thường được phát hiện bởi khả năng lên men lactose nhanh chóng và gọi là nhóm Coliform bao gồm các chi: Escherichia, Enterobacter, Klebsia, Serratia, Citrobacter (xem Hình 1.1) [6]. Hình 1.1. Phân nhóm trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [6] 1.1.2. Sự phân bố của Enterobacteriaceae Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và môi trường. Một số loài là mầm bệnh ở người và động vật, trong khi một số loài khác gây bệnh cho cây cối và côn trùng. Môi Lên men lactose chậm  hoặc do biến đổi  Không lên menlactose   Lên men lactose   h h hó
  9   trường sống tự nhiên của một số chi thuộc họ Enterobacteriaceae và có nguồn gốc phân lập từ môi trường tự nhiên, thực phẩm và con người được đưa ra trong Bảng 1.1. Do sự phân bố rộng rãi của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae do đó không thể tránh khỏi một số thành viên của họ Enterobacteriaceae sẽ xâm nhập vào chuỗi thức ăn, gây ra sự hư hỏng thực phẩm và mang mầm bệnh [8]. Bảng 1.1 Sự phân bố của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [8] Chi Sự phân bố và vị trí phân lập Citrobacter Phân người, mẫu bệnh phẩm, nước thải, đất, nước, thực phẩm Enterobacter Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đất, nước ngọt (sông, suối), rau, nước thải, phân người, mẫu bệnh phẩm và đường hô hấp Escherichia Đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng nước, thực phẩm và đất thông qua sự nhiễm phân) Klebsiella Đường tiêu hóa và đường hô hấp ở người và các động vật khác, phân, đất, nước, hoa quả và rau, ngũ cốc và các mẫu bệnh phẩm ở người Proteus Đường tiêu hóa ở người và động vật, đất, nguồn nước ô nhiễm Salmonella Người và động vật, thực phẩm, nước, môi trường Serratia Mẫu bệnh phẩm, khu vực sản xuất, đất, nước, môi trường, đường tiêu hóa của động vật có móng Shigella Đường tiêu hóa của người và linh trưởng Yersinia Phân bố rộng rãi ở người và động vật, thực phẩm, đất và nước Leclercia  Thực phẩm, nước, máu 1.1.3. Khả năng gây bệnh của Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae gây ra các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa và nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết,viêm phổi, nhiễm trùng vùng bụng hoặc vùng chậu, nhiễm trùng nơi phẫu thuật, viêm màng não và các áp xe khác nhau bao gồm nhiễm khuẩn vết thương (xem Hình 1.2) [1].
  10   Hình 1.2. Các bệnh do vi khuẩn Enterobacteriaceae gây ra trên người [1] 1.1.3.1. Viêm màng não và viêm nhiễm hệ Thần kinh Một số loài E. coli có thể gây viêm màng não liên quan đến gram âm (viêm màng não sơ sinh E. coli) ở trẻ sơ sinh với tỷ lệ tử vong có thể lên đến 40%, và những người sống sót thường bị di chứng thần kinh. Sự sống sót của vi khuẩn trong máu được tạo điều kiện bởi một màng bao axit polysialic antiphagocytic và protein A màng ngoài vi khuẩn (OmpA). Trong hệ thống thần kinh trung ương, vi khuẩn có thể gây ra phù nề, viêm và tổn thương thần kinh [1]. 1.1.3.2. Nhiễm trùng đường tiết niệu Nhóm vi khuẩn gây nhiễm trùng đường tiết niệu (UTI) là một trong những loài vi khuẩn phổ biến nhất gây nhiễm trùng ở người, gây các triệu chứng bệnh nghiêm trọng và tốn kém về kinh tế cho việc chữa trị. Escherichia coli gây nhiễm trùng đường tiết niệu (UPEC) chiếm khoảng 80% các ca UTIs, gây viêm bàng quang ở bàng quang và viêm thận thận cấp tính ở thận [1].
  11   Loài Enterobacteriaceae phổ biến khác có liên quan đến UTIs là Klebsiella pneumoniae. Loài này gây nhiễm trên các nhóm bệnh nhân đặc trưng, như bệnh nhân đái tháo đường hoặc bàng quang rối loạn chức năng và ống thông tiểu. K. pneumoniae, một tác nhân gây bệnh phổ biến trên các bệnh nhân do nhiễm trùng bệnh viện, có một số yếu tố quyết định độc lực, bao gồm khả năng bám dính, hoạt tính phân giải ure và các hệ thống bất hoạt sắt [1]. 1.1.3.3. Nhiễm khuẩn huyết Nhiễm khuẩn huyết là một biến chứng chính của nhiễm trùng Enterobacteriaceae vì nó có thể dẫn đến nhiễm trùng huyết nặng với suy nội tạng cấp tính và sốc nhiễm trùng. Trong những năm gần đây, bệnh nhiễm khuẩn E. coli đã tăng lên và ở Anh, loài này hiện chiếm hơn 30% bệnh nhiễm khuẩn huyết ở những người trên 75 tuổi [1]. Cũng có sự gia tăng đáng kể về nhiễm khuẩn huyết do các mầm bệnh gram âm khác gây ra như Leclercia adecarboxylata. L. adecarboxylata ngoài gây nhiễm khuẩn huyết có thể gây nhiễm trùng vết thương, đặc biệt trên các bệnh nhân mắc các bệnh nguyên phát như ung thư, bệnh bạch cầu, suy thận và xơ gan [9]. Nguồn chủ yếu của nhiễm khuẩn huyết là các vi khuẩn gây bệnh đường tiết niệu. Các nguồn lây nhiễm máu cổ điển khác bao gồm đường tiêu hóa, liên quan đến cả mầm bệnh đường ruột cụ thể và vi khuẩn đường ruột cơ hội, có thể chuyển từ lòng ruột sang máu trong vật chủ với các tình trạng tiềm ẩn (ví dụ như khối u rắn tiêu hóa, viêm túi mật hoặc điều trị ức chế miễn dịch) [1]. 1.1.3.4. Gây bệnh đường ruột Các mầm bệnh gây bệnh đường ruột quan trọng nhất là Salmonella enterica, một số phân typ thuộc loài E. coli, Shigella và Yersinia. Mặc dù các Enterobacteriaceae khác đôi khi có liên quan đến nhiễm trùng đường tiêu hóa, nhưng ý nghĩa lâm sàng đôi khi gây tranh cãi (ví dụ đối với Plesiomonas shigelloides hoặc Klebsiella pneumoniae liên quan đến tiêu chảy) [1].
  12   1.2. KHÁNG SINH 1.2.1. Lịch sử ra đời kháng sinh Kháng sinh được phát hiện vào năm 1928. Fleming ghi nhận một khuẩn lạc khác thường của nấm mốc trong một số đĩa petri có chứa vi khuẩn Staphylococcus. Các khuẩn lạc mốc đã khuếch tán các hợp chất xung quanh nó dẫn tới không có khuẩn lạc Staphylococcus mọc xung quanh khuẩn lạc mốc. Fleming đã viết bài báo đầu tiên của ông về penicillin trong năm 1929, đề cập đến việc sử dụng các chất bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để chọn lọc và phân lập vi khuẩn Haemophilus influenzae, được cho là nguyên nhân gây ra bệnh cúm. Theo thời gian, Fleming đã chứng minh rằng penicillin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn và thậm chí là diệt khuẩn. Tuy nhiên trong giai đoạn này penicillin đã không được sử dụng rộng rãi. Tiếp đó, sulfonamidochrysoidine (KI-730, prontosil), được tổng hợp bởi các nhà hóa học Josef Klarer và Fritz Mietzsch và đã được thử nghiệm bởi nhà vi khuẩn học người Đức Gerhard Domagk về hoạt tính kháng khuẩn trên các loại bệnh khác nhau [10]. Trong các khoảng thời gian tiếp theo, rất nhiều họ kháng sinh và thế hệ kháng sinh mới ra đời, nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị bệnh trên người và động vật (xem Hình 1.3) [11]. Hình 1.3 Lịch sử ra đời các loại kháng sinh [11]
  13   1.2.1.1. Cephalosporin Họ kháng sinh cephalosporin được phát hiện đầu tiên vào năm 1945, tuy nhiên phải mất gần 2 thập kỷ để đưa các kháng sinh này vào điều trị. Một thập kỷ sau phát hiện ban đầu, các chất cephalosporin đã được phân lập và xác định là sản phẩm lên men của nấm mốc. Các nhà khoa học tại Oxford, bao gồm Florey và Abraham, với các thiết bị đầy đủ đã nghiên cứu ra đặc điểm cấu trúc của các cephalosporin, như họ đã làm đối với penicillin một thập kỷ trước đó. Ba chất cephalosporin P, N, và C đã được xác định. Mỗi sản phẩm đều hoạt động kháng khuẩn nhưng chỉ cephalosporin C kháng cả vi khuẩn gram âm và gram dương. cephalosporin C đã trở thành nền tảng để phát triển các dòng cephalosporin tiếp theo. Dược phẩm cephalosporin đầu tiên là cephalothin, đã được giới thiệu để sử dụng lâm sàng vào năm 1964. Và đến nay đã có hơn 20 thuốc kháng sinh cephalosporin được sử dụng trong điều trị. Cephalosporin là một trong những họ kháng sinh được các nhà điều trị kê toa rộng rãi nhất vì độc tính thấp và khả năng hoạt động phổ rộng của chính kháng sinh này [12]. Về phân loại, cephalosporin gồm 5 thế hệ, dựa vào phổ hoạt động của kháng sinh (xem Bảng 1.2). Thế hệ đầu hoạt động cephalosporin tập trung chủ yếu vào các vi khuẩn gram dương. Các thế hệ thứ hai thuốc đã tăng cường hoạt động chống trực khuẩn gram âm nhưng duy trì mức độ khác nhau của hoạt động đối với cầu khuẩn gram dương. Các cephalosporin thế hệ thứ ba đã tăng lên rõ rệt tiềm năng chống lại vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên, đối với một số hợp chất trong nhóm 3, hoạt động chống lại cầu khuẩn gram dương lại giảm. Trong nhóm thế hệ thứ ba, một vài hợp chất, chẳng hạn như ceftazidime và ceftolozane, được xem xét riêng biệt cho hoạt động chống lại P. aeruginosa. Thế hệ thứ tư có phổ hoạt động rộng nhất trong năm nhóm. Các loại thuốc thứ ba và thứ tư kết hợp cũng được gọi là Cephalosporin rộng phổ. Nhóm thứ năm được gọi là cephalosporin kháng tụ cầu kháng methicillin bao gồm ceftaroline và ceftobiprole [12].
  14   Bảng 1.2 Các thế hệ kháng sinh cephalosporin Thế hệ 1 Thế hệ 2 Thế hệ 3 Thế hệ 4 Thế hệ 5 cephazolin cefamandole cefoperazone cefepime ceftaroline cephalothin cefonicid cefotaxime cefpirome ceftobiprole cephapirin cefuroxime ceftazidime cephradin ceftizoxime ceftraexone moxalactam 1.2.1.2. Các kháng sinh β-lactam khác Ngoài họ cephalosporin, penincillin, bốn loại kháng sinh carbapenems - imipenem, meropenem, ertapenem, và doripenem hiện đang được đưa vào trong điều trị tại một số nước phát triển như Mỹ. Carbapenem hoạt động kháng nhiều vi khuẩn gram dương, gram âm kị khí và hiếu khí bởi sự thâm nhập hiệu quả của carbapenem thông qua màng ngoài tế bào, có ái lực cao với các protein liên kết penicillin, và sự ổn định của chúng chống lại hầu hết các enzym β- lactamase phổ rộng (ESBLs) lớp A và enzym β-lactamase lớp C (AmpCs) [13]. 1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh 1.2.2.1. Kháng kháng sinh Kháng sinh đã được con người phát hiện và đưa vào quá trình trị liệu từ giai đoạn bắt đầu của loài người. Thuốc kháng sinh cơ bản đã được xác nhận bởi cơ quan quản lý của Mỹ như là loại thuốc được sản xuất bởi một loài sinh vật để ức chế sự tăng trưởng hoặc để giết chết một loài vi sinh vật khác. Dưới tác dụng của kháng sinh, một số chủng vi khuẩn đã dần thích nghi và kháng lại các kháng sinh. Sự xuất hiện của các mầm bệnh kháng nhiều loại thuốc khác nhau đã làm gia tăng lo ngại về những hậu quả và tác động của hiện tượng này lên sức khỏe con người và quá trình điều trị bệnh trên người.
  15   Sự kháng thuốc được định nghĩa là sức đề kháng của vi khuẩn đối với một tác nhân kháng khuẩn mà trước đây chúng chỉ biểu hiện sự nhạy cảm. Đầu tiên hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn là quá trình tiến hóa tự nhiên, sau đó hiện tượng kháng thuốc ngày càng gia tăng trong các loài vi sinh vật gây bệnh bởi sử dụng sai thuốc kháng sinh và sự lây lan toàn cầu của vi khuẩn kháng thuốc, chủ yếu ảnh hưởng đến bệnh nhân có hệ miễn dịch kém hoặc sức khỏe yếu. Sự kháng thuốc đã tiêu tốn nhiều chi phí hơn trong quá trình chữa trị và trong hoạt động nghiên cứu về ngăn ngừa tình trạng kháng kháng sinh. Một loạt các loại thuốc kháng sinh đã bị kháng bởi các vi sinh vật gây bệnh trong những thập kỷ gần đây, nhân tố kháng thuốc có thể được tạo ra và lan truyền từ vi sinh vật này sang vi sinh vật khác, từ loài vi khuẩn này sang loài vi khuẩn khác theo nhiều cách khác nhau [10]. Thông qua hoạt động chuyển gen, ví dụ, integron, nhân tố axit nucleic (ADN) di động có thể bắt giữ và mang các gen, được vận chuyển bởi các gen nhảy (transposon), cho phép các vi sinh vật gây bệnh trao đổi cơ chế kháng kháng sinh (xem Hình 1.4). Một trường hợp đề kháng tự nhiên được thấy thường xuyên bởi các tỷ lệ đột biến tự nhiên trong gen nằm trên nhiễm sắc thể mà sau đó nhân tố đột biến được lan truyền bởi sự nhân lên của vi khuẩn. Một trong những cơ chế kháng là sự tích hợp của ADN trên hệ gen từ vi khuẩn chết và plasmid của các tế bào sống, mà cũng có thể xảy ra với integrons đến từ phẩy khuẩn. Đột biến xảy ra tất cả các thời điểm, thay đổi nucleotid duy nhất có thể làm thay đổi gen và chuyển gen kháng lên vi sinh vật. Các plasmid từ một loại vi khuẩn, với bất kỳ integron, có thể dễ dàng chuyển sang vi khuẩn khác thông qua chuyển gen ngang bởi sự tiếp hợp [10].
  16   Hình 1.4 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn [10] Vật liệu di truyền được trao đổi giữa các vi sinh vật qua ba con đường chính: (i) Tải nạp ADN, ví dụ: từ Streptococcus mitisto sang Streptococcus pneumoniae, (ii) biến nạp, ví dụ kháng Methycillin trong Staphylococcus aureus đã được phân lập trong các mẫu phân ở các trang trại và cơ sở giết mổ; và (iii) sự tiếp hợp, ví dụ là các plamid chịu trách nhiệm cho sự phổ biến toàn cầu của các gen mã hóa enzym carbapenemase hoặc β-lactamase, đặc biệt phổ biến trong các vi khuẩn gram âm và tụ cầu (xem Hình 1.5) [14].
  17   Hình 1.5 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa vi sinh vật [14] Sự hình thành tính kháng của vi khuẩn lên kháng sinh đã được ghi nhận sớm nhất vào giai đoạn đầu của kỷ nguyên kháng sinh. Trong vòng 20 năm qua, sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm và khả năng kháng của chúng đã liên tiếp phát triển. Nguyên nhân chính là sự thiếu hiểu biết của người sử dụng về kháng sinh, dẫn đến lạm dụng kháng sinh trong điều trị. Rõ ràng, tự dùng thuốc ảnh hưởng đến hiệu quả của liệu pháp điều trị và gây nguy hiểm cho sức khỏe người bệnh cũng như nguy hại đến cộng đồng. Sự lạm dụng kháng sinh đã gây ra áp lực chọn lọc tự nhiên cho vi khuẩn và thúc đẩy quá trình tiến hóa nhanh của vi khuẩn. Hơn nữa, các hợp chất trong hệ sinh thái và điều kiện môi trường sống cũng góp phần tạo áp lực chọn lọc bổ sung lên vi sinh vật. Bên cạnh đó, nguyên nhân khác thúc đẩy hiện tượng kháng kháng sinh ở vi khuẩn là việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích trị bệnh và kích thích tăng trưởng. Hiện nay, kháng kháng sinh đã là vấn đề toàn cầu, và các nước phát triển hiện đã xây dựng các chương trình để hạn chế tình trạng kháng kháng sinh. Ví dụ, ở các nước Bắc Âu, đã nghiên cứu việc sử dụng hợp lý thuốc kháng
  18   sinh, cùng với loại bỏ các chất kích thích tăng trưởng cho động vật nuôi. Từ năm 2006, các nước Liên minh châu Âu khác đã và đang áp dụng các biện pháp tương tự để hạn chế sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp [10]. 1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Có rất nhiều cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn, trong số đó năm cơ chế thường thấy nhất là: enzym ức chế hoạt động của kháng sinh, biến đổi trong protein liên kết penicillin (PBP), đột biến Porin, bơm đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào và thay đổi mục tiêu của kháng sinh (thay đổi thành tế bào) (xem Hình 1.6) [10]. Hình 1.6 Các cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn [10] Để ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, kháng sinh có xu hướng tác động lên mục tiêu cụ thể như ức chế tổng hợp protein cụ thể, tổng hợp ADN và ARN, can thiệp vào sự tổng hợp thành tế bào, phá vỡ các cấu trúc màng thấm, và ức chế sự tổng hợp chất chuyển hóa thiết yếu (xem Hình 1.7) [15]. Do cấu trúc sinh học khác nhau của kháng sinh, các mục tiêu tấn công của kháng sinh có thể khác nhau tùy thuộc vào từng đối tượng vi khuẩn đang tiếp xúc với chính
  19   kháng sinh. Ví dụ, penicillin và cephalosporin ức chế vi khuẩn tổng hợp vách tế bào bằng cách can thiệp tới các enzym liên quan đến tổng hợp lớp peptidoglycan; trong khi tetracycline và streptogramin ức chế vi khuẩn bằng cách phá vỡ sự tổng hợp protein. Một vi khuẩn được xem là kháng với một kháng sinh đặc biệt khi các kháng sinh không còn hiệu quả để điều trị một căn bệnh gây ra bởi một tác nhân gây bệnh của vi khuẩn đặc biệt [16]. Hình 1.7 Cơ chế tác động lên tế bào của kháng sinh [15] Enzym ức chế hoạt động của kháng sinh Cơ chế kháng phổ biến nhất của vi khuẩn là enzym ức chế. Cơ chế này được dựa trên một số chiến lược để thay đổi cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn: thủy phân, một loại phản ứng xảy ra chủ yếu với các kháng sinh β- lactam; thay đổi các nhóm chức năng (acyl, phosphoryl, thiol, nucleotidil, ADP-ribosyl, glycosyl), xảy ra với rất nhiều chất kháng khuẩn, chẳng hạn như mminoglycoside, chloramphenicol, rifamycin, và lincosamide; và oxi hóa khử , xảy ra với tetracycline, rifamycin, và streptogramin. Hơn nữa enzym có thể sửa đổi các hợp chất kháng khuẩn, β-lactamase là một vấn đề lớn trong việc
  20   điều trị các vi khuẩn gram âm. Enzym β-lactamase bao gồm enzym penicillinases, chống lại các kháng sinh penicillin, hoặc enzym AmpC cephalosporinases (ví dụ, MOXs, MIR, FOX). Có nhiều enzym β-lactamase phổ rộng (ví dụ, SHV-1, TEM-1, TEM-2, CTX), có khả năng thủy phân các penicillin và các cephalosporin và kháng lại các chất ức chế lactamase (ví dụ, axit clavulanic, sulbactam và tazobactam). Nhóm enzym kháng penicillin và cephalosporin, bao gồm cefotaxime và ceftazidime; Hơn nữa, nhiều vi khuẩn sản sinh enzym TEM và SHV còn đồng kháng với tetracycline, sulfonamides, và aminoglycosid. Phần lớn các vi khuẩn sinh enzym CTX-M kháng với fluoroquinolones. Cuối cùng, enzym carbapenemases (ví dụ, IMP, VIM, KPCs, OXAs), là các enzym có khả năng bất hoạt tất cả các kháng sinh β-lactam trừ aztreonam [10]. Biến đổi các protein liên kết penicillin (PBP) PBPs là protein quan trọng có liên quan trong việc xây dựng các peptidoglycan, là thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn. Các enzym này xúc tác các sợi glycan và liên kết ngang giữa các chuỗi glycan. Các vị trí hoạt động của sợi glycan là mục tiêu của kháng sinh β-lactam. Các hợp chất này bắt chước sợi peptit đôi D-Ala-D-Ala trong peptidoglycan và tạo thành một phức acyl-enzym rất ổn định, dẫn đến enzym bị bất hoạt. Khi các PBP thay đổi vị trí hoạt động, thì các kháng sinh β-lactam sẽ để mất hoặc làm giảm ái lực của chúng với các protein mục tiêu, dẫn đến sự kháng thuốc [10]. Biến đổi Porin Vi khuẩn gram âm có một lớp màng bên ngoài vách tế bào, màng ngoài, trong đó bao gồm một lớp lipid kép. Các thành phần chính của lớp đôi này là lipopolysaccharide, là hợp chất kị nước, nên các hợp chất ưa nước rất khó khăn để đi qua. Do đó, porins hoặc porins màng ngoài (OMP), là các protein hỗ trợ trong việc thông qua các chất hòa tan thấm qua màng lipid kép. Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng của thuốc để vượt qua porins, chẳng hạn như hình dạng, kích thước. Có một số porins điển hình, chẳng hạn như OmpF, OmpC, và OmpE. Mỗi loài vi khuẩn sản xuất các porins cụ thể và sự mất mát hoặc giảm hoạt động của một hoặc nhiều OMP là một yếu tố góp phần phổ biến
  21   trong việc xây dựng sức đề kháng (ví dụ, mất OprD) của P. aeruginosa đối với Imipenem và Meropenem. Ở các loài khác, mất OmpF có thể dẫn đến các sinh vật kháng với nhiều loại kháng sinh (đa kháng). Trong một số chủng vi khuẩn, sự giảm hoặc mất ái lực của thuốc với các protein (porin), dẫn đến mất khả năng để vượt qua các màng ngoài và không thể xâm nhập vào tế bào. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng áp lực chọn lọc tác dụng bởi việc sử dụng kéo dài thuốc kháng sinh là một yếu tố quan trọng trong sự xuất hiện của vi khuẩn đa kháng và việc sửa đổi các porins là một yếu tố quan trọng sự hình thành đa kháng thuốc [10]. Protein bơm Một cơ chế hiệu quả cao của kháng kháng sinh là sự sản sinh hệ thống protein bơm kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn. Tất cả các thành viên của họ protein này bao gồm 3 dạng không thay đổi sau: Dạng A, đóng vai trò như cửa vào và ra của tế bào chất, kiểm soát sự di chuyển của các chất nền đến và đi từ các tế bào chất; dạng B, đó là tham gia vào các khớp nối năng lượng; và dạng C, định hướng vị trí và đề xuất hướng vận chuyển. Các protein đặc trưng nhất trong họ này là protein vận chuyển tetracycline (TetB), đã được tìm thấy trong E. coli [10]. Sửa đổi phân tử mục tiêu của các kháng sinh Hầu hết các kháng sinh ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein đều nhằm vào các ribosome mục tiêu và sự khác biệt giữa cấu trúc của ribosome này cho các hành động chọn lọc của thuốc kháng sinh trong vi khuẩn, vi khuẩn cổ và các tế bào nhân chuẩn. Ngay cả giữa các loài, sự thay đổi nhỏ trong cấu trúc ribosome có thể dẫn đến sự tương tác đặc hiệu mang tính chất của loài lên kháng sinh. Do đó các kháng sinh nhắm vào ribosome là chất diệt khuẩn rất mạnh. Tuy nhiên, qua nhiều thập kỷ sử dụng, các tác nhân gây bệnh đã trở nên đề kháng với thuốc kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein. Một cơ chế đáng chú ý của sự kháng là việc sửa đổi các mục tiêu của kháng sinh. Ví dụ, những thay đổi nhỏ trong một chuỗi axit amin, dẫn đến thay đổi cấu trúc protein đủ để cản trở kháng sinh. Các báo cáo đầu tiên của sự thay đổi cấu trúc ribosome
  22   trong đột biến erythromycin kháng E. coli mô tả sự thay đổi protein ribosome, đáng chú ý là các protein L4 và L22 [10]. 1.2.3. Hiện tượng kháng cephalosporine ở vi khuẩn gram âm Escherichia coli và Acinetobacter spp. là tác nhân gây bệnh quan trọng ở người. Các trường hợp nhiễm khuẩn nặng do các vi sinh vật nói trên thường được điều trị bằng cephalosporin phổ rộng (ESC). Tuy nhiên, trong hai thập kỷ qua, hoạt động điều trị đã phải đối mặt với sự gia tăng nhanh chóng các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi sự kháng cephalosporin phổ rộng của các chủng vi khuẩn gây bệnh do sự hình thành enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL), plamid trung gian AmpCs và các enzym carbapenemase. Tình trạng này làm hạn chế đáng kể quá trình điều trị và gây nguy hiểm đến sức khỏe con người. Gia cầm được xem như là nguồn chứa các vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc. Chính việc sử dụng tự do các kháng sinh trong chăn nuôi đã góp phần vào sự thích nghi và tính chọn lọc của vi khuẩn trong quá trình kháng lại kháng sinh cephalosporin phổ rộng của vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Ngày nay, sự phổ biến của thức ăn có nguồn gốc từ động vật có chứa các vi khuẩn Enterobacteriaceae và E. coli mang gen kháng kháng sinh cephalosporin phổ rộng (đặc biệt là các chủng vi khuẩn có chứa gen CTX-M và CMY-2 AmpC mã hóa enzym β-lactamase) đã gây ra lo ngại cho việc điều trị bệnh. Hơn nữa, gần đây với sự xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng carbapenem (vi khuẩn đường ruột sản sinh VIM-1, NDM-1 hay OXA-23) đang là mối quan tâm lớn của cả cộng đồng [17]. Việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y đã góp phần vào việc lựa chọn và lây lan của các vi khuẩn gram âm đa kháng kháng sinh, đặc biệt là E. coli và Klebsiella pneumoniae kháng cephalosporin phổ rộng đã được phân lập trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật và từ môi trường nước. Nguy cơ trước mắt của tình trạng này là sự lây truyền các chủng vi khuẩn kháng cephalosporin phổ rộng hay ESBL từ thực phẩm lên người do tiêu thụ thực phẩm có mang mầm bệnh, hơn nữa sự lây lan từ người sang người qua chất thải (phân) thông qua môi trường và bệnh viện cũng được xem là môi trường lý
  23   tưởng cho sự phát tán các mầm bệnh kháng kháng sinh ra cộng đồng thông qua hệ thống nước thải (xem Hình 1.8) [16, 17, 18] Hình 1.8 Con đường lây nhiễm và phát tán mầm bệnh ra cộng đồng [19] 1.2.4. Enzym β-lactamase Sự kháng kháng sinh β-lactam trong các vi khuẩn gây bệnh gram âm có xu hướng liên quan đến sự sinh enzym β-lactamase. Báo cáo tổng hợp gần đây về β-lactamase theo cấu trúc và chức năng cho thấy có hơn 950 enzym với cấu trúc tự nhiên được mô tả. Các enzym này tồn tại dưới dạng β-lactamases đặc trưng cho cá thể, ví dụ là loài Klebsiella oxytoca, enzym có thể được tạo ra bởi các thành phần ngoài nhiễm sắc thể với tám enzym β-lactamase khác nhau xuất hiện trong một cá thể. Mối quan tâm lớn của các nhà nghiên cứu là khả năng thay đổi ngày càng tăng của vi khuẩn để sản sinh các enzym β-lactamase phân giải tất cả các kháng sinh β-lactam [2].
  24   β-lactamase gồm 4 nhóm chính có thể được xác định dựa trên các đặc tính của kháng sinh: penicillinase, cephalosporinase kiểu AmpC, β-lactamases phổ rộng (ESBLs) và carbapenemases (xem Hình 1.9), ESBLs, cephalosporinase có thể thủy phân cephalosporin phổ rộng như cefotaxime hoặc ceftazidime. Các vi khuẩn Enterobacteriacease sản sinh ra các enzym này với khả năng thuỷ phân hầu hết các kháng sinh penicillin và cephalosporin, dẫn đến việc sử dụng kháng sinh carbapenem thường xuyên hơn. Tuy nhiên, các báo cáo cũng cho thấy các vi khuẩn gram âm sinh enzym carbapenemases cũng đạt được tỷ lệ cao. Enzym carbapenemase này có tỷ lệ bất hoạt cao đối với kháng sinh carbapenems, các kháng sinh lactam phổ rộng đang được sử dụng để chống lại vi khuẩn gram sinh enzym β-lactamase [2]. Hình 1.9 Các nhóm enzym β-lactamase [2] Dựa trên sự phân loại của Ambler, enzym β-lactamase có thể được phân loại vào bốn lớp, lớp A đến D, dựa trên axit amin chuỗi giống nhau và cấu trúc phân tử. Lớp A, C, D gồm các cấu trúc giống penicillin và liên quan đến protein liên kết penicillin. Các lớp này khác nhau bởi trọng lượng của protein liên kết penicillin. Lớp B β-lactamase, mặc dù cũng thủy phân vòng β-lactam, nhưng cấu trúc không liên quan đến các protein liên kết penicillin. Các enzym β- lactamase thường thấy trong điều trị lâm sàng là lớp A hoặc lớp C. Loại A enzym thủy phân thường ưu tiên penicillin, nhưng cũng có thể phân giải
  25   cephalosporin hoặc carbapenemase. Thông thường họ các enzym β-lactamase bị ức chế bởi axit clavulanic.Tuy nhiên điểm đột biến có thể khiến các enzym kháng với các chất ức chế hoặc mở rộng phổ hoạt động bao gồm các cephalosporin thế hệ thứ ba và aztreonam (gọi là β-lactam phổ rộng). Lớp enzym β-lactamase C ưu tiên thủy phân cephalosporin và không bị ức chế bởi axit clavulanic. Các β-lactamase thường được mã hóa trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Enzym loại B là các enzym hoạt động phổ rộng, và có thể thủy phân tất cả các kháng sinh β-lactam trừ aztreonam [20]. 1.2.4.1. Enzym β-lactamase phổ rộng Nhóm enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL), là enzym có tác dụng kháng cephalosporin thế hệ ba và thế hệ 4, carbapenem và monobactam. Hiện tượng kháng các kháng sinh trên đã được ghi nhận vào thập niên 1980, tại Đức, năm 1983, ca bệnh đầu tiên đã được mô tả là có sự xuất hiện vi sinh vật sản sinh enzym β-lactamase. Vi khuẩn sinh enzym ESBL thường đa kháng do các gen qui định tính kháng lên các loại kháng sinh khác nhau đều nằm trên cùng 1 plasmid. Một số vi khuẩn sinh enzym ESBL kháng với nhóm aminoglycosides, 4-quinolon. Bên cạnh đó nhiều vi khuẩn sinh enzym beta-lactamase phổ rộng đang hoạt động chống lại hầu hết các kháng sinh β-lactam, bao gồm oxyimino- betalactams, ceftazidime, ceftiofur, aztreonam, có thể bị bất hoạt bởi axit clavulanic [21]. Nhóm enzym ESBL được phân loại dựa trên cấu tạo, kết cấu phân tử của enzym và nhóm kháng sinh mà các enzym này ức chế. Năm 2010, dựa trên cấu trúc phân tử, các enzym β-lactamase được chia làm 4 nhóm: nhóm 1 (lớp C) bao gồm các enzym kháng cephalosporin; nhóm 2 (lớp A và D) bao gồm ESBL và các enzym carbapenemase; nhóm 3 gồm metallo-β-lactamase; nhóm 4 là các enzym penicillinase kháng axit clavulanic [21]. ESBL còn được định nghĩa là các enzym β-lactamase có thể bị ức chế bởi axit clavulanic, tazobactam hoặc sulbactam, và được mã hóa bởi các một số gen có thể được trao đổi giữa các vi khuẩn như sau:
  26   Enzym SHV Tập hợp các enzym SHV của nhóm β-lactamase dường như được bắt nguồn từ Klebsiella spp. Khởi nguồn của tập hợp enzym SHV, là SHV-1, tìm thấy đầu tiên trong chủng vi khuẩn gây bệnh K. pneumoniae. Trong nhiều chủng K. pneumoniae, các gen mã hóa SHV 1, LEN-1, cư trú trên các nhiễm sắc thể của vi khuẩn, sau đó được kết hợp vào một plasmid và đã phát tán gen này đến các vi khuẩn đường ruột khác. SHV-1 kháng với penicillin phổ rộng như ampicillin, tigecycline và piperacillin. Các enzym SHV-1 β-lactamase chịu trách nhiệm trong 20% trường hợp kháng ampicillin liên quan đến plasmid trong K. pneumonia [22]. Enzym TEM Enzym TEM-1, lần đầu tiên được báo cáo từ một chủng E. coli phân lập vào năm 1965, có khả năng kháng kháng sinh tương tự như enzym SHV-1. TEM-1 có khả năng thủy phân penicillin và cephalosporin thế hệ đầu tiên nhưng không thể tấn công các cephalosporin oxyimino. Tuy nhiên sau đó đã xuất hiện các biến thể TEM đầu tiên gia tăng hoạt động chống lại các cephalosporin phổ rộng là TEM-3. TEM-3, lần đầu được báo cáo vào năm 1989, là enzym TEM β-lactamase đầu tiên hiển thị các kiểu hình ESBL. Hiện nay các biến thể của TEM ngày càng mở rộng về số lượng và phổ biến trong các vi khuẩn đường ruột [22]. Enzym CTX Một nhóm enzym β-lactamase mới là CTX, ưu tiên thủy phân cefotaxime. Nhóm enzym này đã được tìm thấy trên một số chủng vi khuẩn như Salmonella Typhimurium, E. coli và một số loài Enterobacteriaceae khác. Đây là nhóm enzym không liên quan rất chặt chẽ với TEM hoặc SHV β-lactamase. CTX-M β-lactamase được cho là bắt nguồn từ gen trên nhiễm sắc thể trong loài Kluyvera spp., một tác nhân gây bệnh cơ hội của thuộc vi khuẩn Enterobacteriaceae được tìm thấy trong môi trường. Protein CTX-M đã được phát hiện vào cuối những năm 1980 và ngày nay hơn 100 biến thể đã được giải trình tự [21].
  27   Enzym OXA Các Enzym β-lactamase OXA được đặt tên dựa trên khả năng thủy phân Oxacillin. Các β-lactamase này được đặc trưng bởi tỷ lệ thủy phân cloxacillin và oxacillinlớn hơn 50% đối với penicillin G. Chúng chủ yếu xảy ra ở P. aeruginosa nhưng đã được phát hiện trong nhiều vi khuẩn gram âm khác. Trong thực tế, phổ biến nhất trong các Enzym β-lactamase OXA, là OXA-1 đã được tìm thấy trong 1-10%. Các enzym OXA ESBL ban đầu được phát hiện trong khuẩn lạc P. aeruginosa từ bệnh viện ở Ankara, Thổ Nhĩ Kỳ. Sự tiến hóa của enzym ESBL OXA có nhiều điểm tương đồng với sự tiến hóa của enzym ESBL SHV- và TEM [22]. Các enzym ESBL khác Một số enzym ESBL khác như PER, GES, BES, CME, SFO, GES, PSE đã được tìm thấy và phân lập trên vi sinh vật gây bệnh ở khắp nơi trên thế giới [23]. 1.2.4.2. β-lactamase AmpC AmpC β-lactamase chủ yếu là các enzym được mã hóa bởi gen nằm trên nhiễm sắc thể tạo ra tính kháng với penicillin, cephalosporin phổ hẹp, oxymino- lactam, và cephamycin và không nhạy cảm với các chất ức chế-lactamase như nhóm axit clavulanic. Sự sản sinh AmpC trong trực khuẩn gram âm thường bị ức chế. Tuy nhiên, sự gia tăng tạm thời trong sản xuất enzym AmpC (gấp 10 đến 100 lần) có thể xảy ra với sự hiện diện của kháng sinh β-lactam ở các loài sau đây: Enterobacter, Citrobacter freundii, Serratia, M. morganii, Providencia và P. aeruginosa. Quá trình sản xuất β-lactamase của AmpC trở lại mức thấp sau khi ngừng tiếp xúc với kháng sinh, trừ khi đột biến tự phát xảy ra ở locus ampD của gen, dẫn đến sự sản xuất vĩnh viễn enzym ở những loài này. Sử dụng Cephalosporin thế hệ thứ ba trong điều trị bệnh do Enterobacter spp. là cơ hội cho vi khuẩn lựa chọn và sản sinh các đột biến, dẫn đến sự xuất hiện hiện tượng kháng kháng sinh trong quá trình điều trị [22].
  28   Hơn 20 enzym AmpC qua trung gian plasmid, có nguồn gốc từ các gen được mã hóa bởi nhiễm sắc thể trong Enterobacteriaceae hoặc Aeromonas spp., đã được tìm thấy trong E. coli, K. pneumoniae, Salmonella enterica và Proteus mirabilis [22]. Thành viên thường gặp nhất của nhóm này là enzym beta- lactamase CMY 2 trong vi khuẩn Salmonella phân lập từ động vật, gia cầm và trên vi khuẩn Shigella, E. coli O157 từ các vụ dịch [24]. 1.2.4.3. Carbapenemase Carbapenemase là tập hợp gồm các enzym có Serin trong vị trí hoạt động và enzym Metallo β-lactamase (MBLs) mà sử dụng ít nhất 1 nguyên tố kẽm cho hoạt động phân giải kháng sinh. Các enzym carbapenemases Serine lần đầu tiên được xác định vào giữa những năm 1980 với số lượng hạn chế trên vi khuẩn E. coli, nhưng bây giờ đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới. Điều quan trọng nhất là enzym Klebsiella pneumoniae carbapenemase - KPCs, được các plasmid truyền phát tán khắp các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và các loài vi khuẩn không sản sinh enzym này. Hai enzym tương đương về sinh hóa KPC-2 và KPC-3 là phổ biến nhất, sự khác biệt giữa các isoenzym này là sự thay thế amino axit đơn (His272 đổi thành Tyr) [22]. Enzym Metallo-β-lactamases (MBLs) hiện nay được tìm thấy trên toàn cầu do sự lan truyền bởi plasmid ở nhiều loài vi khuẩn. Hơn 80 MBL khác nhau đã được xác định trên toàn thế giới, với hơn 75% số enzym này xuất hiện như các enzym mã hoá từ plasmid. Các họ chính của các MBL đã bao gồm enzym IMP và VIM β-lactamase, ban đầu được tìm thấy trong P. aeruginosa, nhưng bây giờ chúng đã được tìm thấy trong Enterobacteriaceae. Việc sản xuất MBL trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae được ghi nhận từ năm 1994 khi IMP-1 mã hoá từ plasmid được xác định trong loài Serratia marcescens tại Nhật Bản [22].
  29   1.3. THỰC PHẨM – NGUỒN CHỨA ENTEROBACTERIACEAE Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có thể lây nhiễm lên thực phẩm theo con đường trực tiếp hoặc gián tiếp từ nhiều nguồn khác nhau hoặc tự chúng có thể đại diện cho hệ vi sinh vật tự nhiên của thực phẩm. Một số chi thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea thường xuất hiện rộng rãi và phổ biến trong thực phẩm bao gồm Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia, Yersinia, Escherichia, Proteus và Salmonella, có thể xâm nhập vào chuỗi thức ăn hoặc có thể liên quan đến các loại thực phẩm thông qua nhiễm phân (xem Hình 1.10) [1, 24]. Ô nhiễm thực phẩm bởi mầm bệnh đường ruột (Enterobacteriaceae) có thể xảy ra từ trang trại nếu nước thải của con người được sử dụng để bón cho đất hoặc nếu nước thải được sử dụng để tưới cho cây trồng. Trái cây tươi và rau quả có thể trở nên bị ô nhiễm trước hoặc sau khi thu hoạch. Những rủi ro như vậy sẽ tăng thêm nếu thực phẩm bị xử lý sai trong quá trình chế biến và chuẩn bị, trong chuỗi thức ăn các mầm bệnh có thể nhân lên theo cấp số nhân trong điều kiện thuận lợi [26]. Hình 1.10 Con đường lây truyền Enterobacteriaceae lên người [25]
  30   1.3.1. Rau ăn sống – vật chủ chứa Enterobacteriaceae Trong các sản phẩm thực phẩm thì con người có xu hướng tiêu thụ các sản phẩm tươi, cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể khỏe mạnh. Trong các sản phẩm được tiêu thụ thì rau ăn sống là thực phẩm giàu dinh dưỡng cung cấp vitamin, khoáng và chất xơ, nên mức tiêu thụ các sản phẩm rau đã tăng lên trong thập kỷ gần đây. Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO) việc tiêu thụ quá ít rau quả đã dẫn tới sự tử vong của 1,7 triệu người trên toàn thế giới. WHO và tổ chức Nông Lương (FAO) cũng khuyến cáo con người cần bổ sung ít nhất 400 g trái cây và rau mỗi ngày (không bao gồm các loại cây trồng có nguồn gốc tinh bột) để phòng tránh các bệnh mãn tính như bệnh tim, tiểu đường, béo phì và ngăn ngừa các bệnh khác do thiếu vi chất [27]. Rau ăn sống thường chứa các vi sinh vật không gây bệnh, nhưng trong quá trình trồng trọt, thu hoạch, vận chuyển và xử lý, sản phẩm có thể bị nhiễm mầm bệnh từ nguồn nước, chất thải của động vật và con người. Hầu hết các sản phẩm này có thể tiêu thụ trực tiếp mà không cần chế biến thêm hoặc không cần xử lý nhiệt, do đó các vi sinh vật gây bệnh có trong rau sống có thể là nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe của người tiêu dùng và nảy sinh vấn đề an toàn thực phẩm cần kiểm soát. Sự nhiễm bẩn có thể là kết quả của việc xử lý đất với các chất hữu cơ phân bón, như bùn thải và phân chuồng, và từ nước tưới, cũng như từ khả năng của mầm bệnh để tồn tại và phát triển trong rau. Dịch tễ học của bệnh lây truyền qua thực phẩm đã thay đổi nhanh chóng trong những thập kỷ gần đây, ngay sau khi một số mầm bệnh chủ yếu của con người được công nhận là lây lan từ các trang trại nuôi động vật, thì rau ăn sống đã nổi lên như một nguồn chứa nguy cơ mới để truyền các mầm bệnh lên người. Bên cạnh đó mức tiêu thụ rau ăn sống cũng đã tăng lên trong những năm gần đây, song song đó, kể từ đầu những năm 1990, các vụ ngộ độc liên quan đến việc tiêu thụ rau ăn sống cũng đã tăng lên nhanh chóng. Hầu hết các báo cáo về triệu chứng dạ dày- ruột kết do ăn rau ăn sống đều có liên quan đến ô nhiễm vi khuẩn, đặc biệt là với các thành viên họ Enterobacteriaceae [28]. Tiêu thụ rau ăn sống cũng là con đường mà qua đó con người tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh mang gen kháng kháng sinh. Ngoài ra, sự hiện diện của
  31   vi khuẩn kháng kháng sinh trong rau ăn sống có thể góp phần làm lan rộng tính kháng kháng sinh giữa các quần thể vi khuẩn theo chiều ngang giữa các chủng, loài và chi khác nhau. Sự hiện diện của các gen kháng trên các yếu tố di truyền di động tạo điều kiện cho sự phân bố và lan truyền tính kháng kháng sinh và việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh trong điều trị đã góp phần hình thành nhân tố kháng trong vi khuẩn. Việc sử dụng một lượng lớn thuốc kháng sinh trong nông nghiệp có thể dẫn đến việc thích nghi của các vi khuẩn kháng thuốc; bên cạnh đó sử dụng phân từ chăn nuôi động vật sang nông nghiệp hoặc sử dụng nước bị ô nhiễm để tưới rau cũng có thể lây lan vi khuẩn kháng bệnh cho rau trồng. Từ đó lây lan sang người qua con đường tiêu thụ rau. Do đó, sự hiện diện của vi khuẩn kháng thuốc trong rau ăn sống đã làm dậy lên mối nguy về an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng [28]. Một trong những mối quan tâm liên quan đến kháng kháng sinh trên toàn thế giới là việc phổ biến các vi khuẩn gram âm đặc biệt là Enterobacteriaceae có khả năng kháng với cephalosporin thế hệ thứ 3 (3GCs). Khả năng kháng đối với 3GCs thường do sự sản sinh enzym β-lactamases phổ rộng (ESBLs) hoặc AmpC β-lactamases và thường liên quan đến các vi khuẩn Enterobacteriaceae hiện diện trong phân như Citrobacter spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, và Klebsiella spp. Những vi khuẩn này có thể tồn tại trong đất nông nghiệp thông qua việc sử dụng phân chuồng gia súc hoặc nước mặt bị nhiễm bẩn do tưới tiêu. Vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae thuộc chi Kluyvera, Serratia và Rahnella có trong đất và nước, là dạng vi khuẩn tự nhiên chứa enzym ESBL, là yếu tố quyết định về khả năng kháng 3GC. Trong quá trình canh tác trong đất (thay đổi phân chuồng) và / hoặc khi được tưới bằng nước bị ô nhiễm, rau có thể có thể bị nhiễm vi khuẩn sinh enzym ESBL. Đặc biệt, việc tiêu thụ rau ăn sống có thể dẫn đến việc nhiễm vi khuẩn kháng 3GC và trao đổi gen kháng kháng sinh với vi khuẩn đường ruột trong suốt quá trình tiêu hóa, do đó có thể ảnh hưởng tới sức khoẻ cộng đồng. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về sự hiện diện của vi khuẩn đường ruột trên rau sống và tính kháng kháng sinh của các vi khuẩn này, tuy nhiên chỉ có một số ít vài nghiên cứu tiến hành khảo sát sự hiện diện của Enterobacteriaceae kháng 3GC trên rau [17, 28].
  32   1.3.2. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau trên thế giới Theo các báo cáo của nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới thì Enterobacteriaceae thường được tìm thấy phổ biến trong các nguồn sống khác nhau như đất, nước, thực vật và động vật và trong các chuỗi thức ăn. Và rau sống được xem là nguồn chứa các vi khuẩn Enterobacteriaceae. Nghiên cứu tại Hà Lan được thực hiện bởi Hoek và cộng sự, tổng số 1216 rau quả thu được từ các cửa hàng tại Hà Lan trong năm 2012 và 2013 đã được phân tích để xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae, trong đó Rau diếp (n = 137), rau diếp xoăn (n = 96), rau diếp băng (n = 193) đã cho thấy sự hiện diện của nhiều loài vi khuẩn đường ruột như Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter freundii [29]. Trong đó, Enterobacteriaceae kháng 3GC được phát hiện trên 5.2% mẫu rau đã thu thập. Dựa trên môi trường sống và cơ chế kháng 3GC, những vi khuẩn này có thể được chia thành hai nhóm: sinh ra ESBL (Escherichia Coli, Enterobodie spp.), sản sinh AmpC (Citrobacter freundii, Enterobodie spp.). Sự nhiễm bẩn vi khuẩn có khả năng kháng 3GC trong rau lá xanh là 0,6% [29]. Bên cạnh đó, trong những năm gần đây, trái cây tươi và rau quả có liên quan đến nhiều bệnh do thực phẩm bùng phát ở các vùng khác nhau trên thế giới, bao gồm cả ở Canada. Cơ quan Thanh tra Thực phẩm Canada tiến hành khảo sát một loạt các sản phẩm có sẵn trong thị trường Canada (rau địa phương so với rau nhập khẩu, rau hữu cơ so với rau thông thường). 31.329 mẫu được thu thập trên khắp Canada trong bốn năm (2009-2013) bao gồm các loại rau lá (n = 12.073), các loại thảo mộc lá (n = 6.032), hành xanh (n = 3,381), dưa đỏ (n = 3,230), cà chua (n = 4,837) và quả (n = 1,776). Nhìn chung, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriacea trong các loại sản phẩm được nghiên cứu là khoảng 0 - 1,01%, tỉ lệ bắt gặp cao nhất trong các loại thảo mộc lá (0,79-1,30%), tiếp theo là các loại rau lá (0,30 - 0,53%), dưa đỏ (0,07 - 0,36%), hành xanh (0,03 - 0,26%), quả (0 - 0.22%) và cà chua (0 - 0.08%) [30]. Một nghiên cứu khác được thực hiện tại Phần Lan trên các loại rau được bán lẻ tại các cửa hàng gồm các loại rau cho rễ như củ cải, rau mùi tây, cà rốt và rau xanh như xà lách, hẹ, rau diếp băng, rau cần tây, cải bắp cải cho thấy sự xuất hiện của 114 vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae. Sau khi nhận dạng, các vi khuẩn được phân loại như sau: Citrobacter freundii - 21
  33   chủng, Enterobacter aerogenes - 41 chủng, Erwinia carotovora - 5 chủng, Escherichia coli - 5 chủng, Hafnia spp. - 30 chủng, Klebsiella spp. - 1 chủng, Proteus vulgaris - 9 chủng, Providencia spp. - 2 chủng, và Serratia marcescens - 1 chủng. Đặc biệt từ mẫu rau diếp là loại rau ăn sống, 22 vi khuẩn đã được phân lập và phân loại vào các chi sau: Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Hafnia spp. và Escherichia coli [31]. Một nghiên cứu khác của Odigie và cộng sự thực hiện vào năm 2015 trên 100 mẫu rau được thu thập từ các thị trường ở Calabar, Nigeria đã phân lập được 105 vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Ba mươi vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae được phân lập từ mẫu đã được rửa bằng nước và giấm, trong đó 75 chủng vi khuẩn đã được thu thập từ các mẫu rau chưa rửa. Các loài vi khuẩn chủ yếu thuộc chi Klebsiella, Proteus và Escherichia [18]. Trong một nghiên cứu của Kim và cộng sự nhằm xác định sự hiện diện của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae sinh enzym và β-lactamase trên rau ăn sống. Tổng cộng 189 mẫu rau (91 rau mầm và 98 mẫu salad trộn) được thu thập tại thị trường bán lẻ ở Hàn Quốc từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 2 năm 2013. Sự phổ biến của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae sinh enzym ESBL là 10,1%, trong đó 94,7% là từ các mẫu rau mầm. Tất cả các chủng vi khuẩn đều kháng với cefotaxime, và nhiều vi khuẩn sinh ESBL cũng kháng với các kháng sinh khác, bao gồm gentamicin, trimethoprim/sulfamethoxazole, và Ciprofloxacin (lần lượt là 73,7%, 63,2% và 26,3%). Enzym β-lactamase TEM-1, SHV-1, -2, -11, -12, -27, -28 và-61, và CTX-M-14, -15 và-55 được phát hiện dưới dạng đơn lẻ hoặc dạng kết hợp. Đây là báo cáo đầu tiên về sự phổ biến về loài Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae sinh enzym ESBL trên rau tại Hàn Quốc. Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng rau ăn sống, đặc biệt là rau mầm, có thể đóng vai trò trong việc phát tán các vi khuẩn sinh ESBL lên người [32]. Bên cạnh đó sự xuất hiện và lan rộng trên toàn thế giới của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae sản xuất enzym carbapenemase là mối quan tâm lớn đối với sức khoẻ cộng đồng. Chuỗi cung ứng thực phẩm ngày càng được quan tâm vì đó có thể là nguồn chứa và phát tán gen kháng kháng sinh.
  34   Tuy nhiên rất ít nghiên cứu tập trung vào họ vi khuẩn đường ruột sinh enzym carbapenemase, đặc biệt là trên rau. Từ tháng 1 đến tháng 4 năm 2016, tổng cộng có 87 mẫu rau tươi (rau diếp, cà chua, cà rốt, dưa chuột, bí xanh và rau mùi tây) được mua từ các chợ và cửa hàng ở thành phố Béjaia, Algeria. Trong số 87 mặt hàng thực phẩm được phân tích, 3 (3.4%) chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem thu được từ ba loại rau được mua ở hai cửa hàng khác nhau ở Béjaia, Algeria [33]. Trong nghiên cứu thực hiện tại Thụy Sĩ trên các loại rau được nhập khẩu từ Việt Nam, Zurfluh và cộng sự khi thực hiện nghiên cứu vào năm 2015 đã phát hiện ra các chủng Enterobacteriaceae sinh ESBL. 169 mẫu rau được thu thập để phân tích, trong đó có 20 mẫu rau nhập khẩu từ Việt Nam, bao gồm rau húng, rau canh giới, mồng tơi. Kết quả cho thấy sự hiện diện của 3 loài vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella pneumonie và Enterobacter cloacae sinh ESBL [34]. Trong một nghiên cứu khác của Zurfluh và cộng sự trong năm 2015, trên mẫu rau trộn từ Việt Nam đã phát hiện loài vi khuẩn Klebsiella variicola sinh enzym OXA-181carbapenemase. Tiếp tục nghiên cứu về Enterobacteriaceae trên rau sống được nhập từ châu Á, Năm 2016 Zurfluh đã phát hiện chủng Escherichia coli DH5-alph sinh enzym ESBL đồng thời chứa gen mcr-1 kháng Colistin trên mẫu rau từ Việt Nam . 1.3.3. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau tại Việt Nam Sự lưu hành của Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại Việt Nam có sự thay đổi về tỉ lệ giữa các nghiên cứu giữa các vùng miền khác nhau thuộc các tác giả khác nhau vào từng thời điểm khác nhau, tuy nhiên Enterobacteriaceae vẫn hiện diện với tỉ lệ cao trên các mẫu rau ăn sống đã thu thập, thường lên tới 100%. Kết quả phân tích Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương năm 2011 cho thấy 96 mẫu rau được lấy tại chợ Hoàng Liệt và 118 mẫu lấy từ quận Long Biên (Hà Nội) đều nhiễm vi khuẩn Coliforms và các vi khuẩn gây ra bệnh tiêu chảy (những loại vi khuẩn có trong phân người và gia súc) [35]. Kết quả xét nghiệm nước dùng để tưới rau cho thấy có quá nhiều mầm bệnh, đặc biệt là vi khuẩn Coliforms (nguồn nước tưới chủ yếu là ao chứa nước mưa hoặc nước giếng ở hộ gia đình). Điều này chứng tỏ nguồn nước tưới tiêu đóng
  35   vai trò quan trọng, có ảnh hưởng tới việc lan truyền các vi sinh vật gây bệnh. Trong nghiên cứu của Lương Đức Phẩm, trên hầu hết các loại rau cải chứa 106 - 107 tế bào Coliforms/g và phân hữu cơ không sạch mầm bệnh có thể gây ô nhiễm trên đất và cây trồng sau khi được sử dụng, nhất là đối với loại rau ăn thân và ăn lá [36]. Trong khi đó Nghiên cứu thực hiện tại Thành Phố Hồ Chí Minh và khu vực đồng bằng sông Mê Công cũng cho tỉ lệ nhiễm Enterobacteriaceae trong rau ăn sống là cao. Một nghiên cứu khác của đại học Cần Thơ thực hiện năm 2011-2012 (n=25) cho thấy Coliforms và E.coli hiện diện trong các mẫu rau với hàm lượng cao [35]. Gần đây nhất nghiên cứu về Enterobacteriaceae của Ho Le Quynh Chau và cộng sự thực hiện 2013-2014 tại Huế cho thấy 100% (n=108) mẫu rau bán ở chợ nhiễm E. coli [37]. Từ các nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam trong những năm gần đây cho thấy rau ăn sống là một trong các nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và có khả năng lây truyền vi khuẩn kháng lên người. Cùng với sự hiện diện của các loài vi khuẩn gây bệnh, thì con người đã sản xuất và áp dụng nhiều thế hệ kháng sinh vào quá trình chữa trị, tuy nhiên dần dần các vi khuẩn gây bệnh đã thể hiện tính kháng kháng sinh. Bên cạnh đó việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi (gia cầm, thủy hải sản) và sự lây nhiễm vi khuẩn do tiêu thụ thực phẩm vô hình chung đã gây khó khăn cho quá trình điều trị.Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới, kháng kháng sinh đang là thực trạng đáng báo động, đặc biệt là tại các nước đang phát triển, nơi mà quá trình sử dụng kháng sinh không được kiểm soát chặt chẽ. Tuy nhiên cho đến nay có rất ít công bố về sự lưu hành vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống chứa các gen mã hóa enzym β-lactamase có khả năng kháng kháng sinh β-lactam. Đặc biệt hơn, tại Việt Nam chưa có công bố nào về tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau sống được bán tại các quán ăn.
  36   CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Thời gian thu thập mẫu được tiến hành vào cuối tháng 8 đến tháng 10 năm 2018. Chín mươi mẫu rau được thu thập tại các chợ, siêu thị và quán ăn phục vụ đồ ăn kèm rau ăn sống trên địa bàn 5 quận nội thành: Cầu Giấy, Nam Từ Liêm, Hà Đông, Long Biên, Hoàng Mai. Rau ăn sống (rau mùi ta, mùi tàu, bạc hà, húng quế, húng láng, ngổ, xà lách, diếp) được thu thập tại các chợ và siêu thị và cửa hàng ăn (xem Hình 2.1 & Hình 2.2). Hình 2.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội Hình 2.2 Rau ăn sống được bày bán tại các chợ và siêu thị Mỗi mẫu rau ăn sống (khối lượng khoảng 0.5 kg) được thu thập, bảo quản trong túi nilon vô trùng và được vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm.
  37   Các mẫu rau ăn sống sau đó được bảo quản mẫu tại phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 4o C – 80 C và được phân tích trong ngày hoặc vào ngày hôm sau. Phương pháp lấy mẫu:  Các mẫu rau ăn sống được thu thập ngẫu nhiên tại 5 Quận (theo phụ lục 1): Cầu Giấy, Nam Từ Liêm, Hà Đông, Hoàng Mai, Long Biên.  Thời gian thu thập mẫu: Tháng 8-Tháng 10/2018.  Tại mỗi sạp hàng mỗi loại rau ăn sống chỉ thu thập 1 mẫu. Mẫu sau khi thu thập được tiến hành phân tích tại Khoa Vi sinh vật – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia – Số 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.2.1. Dụng cụ Túi vô trùng (Biomerieux, Pháp) Ống nghiệm thủy tinh vô trùng (Duran, Đức) Que cấy nhựa (Biologix, Mỹ) Pipettman (Effendorf, Đức) Tăm Bông vô trùng (Việt Nam) Đĩa petri (Gosselin, Pháp) Bàn dập kháng sinh (Oxoid, Mỹ) Giấy parafilm (Sigma, Đức) Hộp để chủng (Việt Nam) 2.2.2. Thiết bị Nồi hấp (Hymaraya, Nhật) Tủ sấy (Sanyo, Nhật) Cân kỹ thuật D = 0,1 ML802 (Metter Toledor, Thụy Sĩ) Tủ ấm (Memert, Đức) Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Bio II, Anh) Máy đồng nhất mẫu (Anh)
  38   2.2.3. Hóa chất Buffer Peptone water (Merck, Đức) TSA agar (Merck, Đức) VRB (BD, Mỹ) VRBG agar (BD, Mỹ) TBX agar (Oxoid, Mỹ) Mueller Hinton agar (Merck, Đức) Macconkey agar (Sigma, Đức) Khoanh giấy kháng sinh: cefazolin, cefoxitin, cefuroxime, ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime, cefotaxime/calvulanic axit, ceftazidime/clavulanic axit (Liofilchem, Ý) McFaland (BaCl2 – Sigma, Mỹ ; H2SO4 – Merck, Đức) 2.2.4. Chủng chuẩn Sử dụng chủng chuẩn: Escheriachia coli ATCC 25922 Salmonella 572 đã được công bố trong bài báo quốc tế năm 2014 [38] Escherichia coli ATCC 8739 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Ba mươi mẫu rau ăn sống được thu thập tại 5 chợ, mỗi chợ 6 mẫu tại các sạp hàng khác nhau. Thời gian thu thập tháng 8-9/2018; Ba mươi mẫu rau ăn sống được thu thập tại 30 quán bán đồ ăn sẵn có kèm rau ăn sống (quán vịt nướng, quán phở). Thời gian thu thập tháng 8- 9/2018; Ba mươi mẫu rau ăn sống được thu thập tại 8 siêu thị và cửa hàng rau sạch. Thời gian thu thập tháng 8-10/2018. 2.3.1. Chuẩn bị và xử lý mẫu Cân mẫu: Cân 25 g (từ 0.5 kg rau đã được đồng nhất) cho vào túi vô trùng, bổ sung 225 mL đệm peptone.
  39   2.3.2. Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae ISO 21528-2:2017: Enterobacteriaceae: Định lượng các loài vi khuẩn Enterobacteriaceae lên men glucose. Các khuẩn lạc đặc trưng có màu hồng đến màu đỏ hoặc đỏ tía (có hoặc không có quầng tủa), lên men glucose và cho phản ứng oxidase âm tính được xác định là Enterobacteriaceae [39]. TCVN 7429-2:2008 (ISO 16649-2:2001): E. coli: các khuẩn lạc màu xanh lục đến xanh lam trên môi trường trypton-mật-glucuronid (TBX) được xem là E. coli [40]. TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2006): Coliform : Định lượng các loài vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea lên men lactose. Các khuẩn lạc đặc trưng là các khuẩn lạc màu đỏ ánh tía có đường kính 0,5 mm hoặc lớn hơn (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh) được xem là khuẩn lạc Coliform điển hình [41]. Cách thức tiến hành: Mẫu sau khi được đồng nhất trong đệm peptone thu được huyền phù 10-1 , hút 1mL từ dịch huyền phù 10-1 cho vào 9mL nước peptone muối thu được dịch pha loãng mẫu 10-2 . Tiến hành các nồng độ pha loãng tiếp theo. Hút 1 mL dịch huyền phù chứa mẫu từ các nồng độ pha loãng, cho vào đĩa petri vô trùng, đổ 15mL thạch VRBG/VRB/TBX. Để đông trong 15 phút. Lật ngược các đĩa, đem nuôi tại nhiệt độ phù hợp: 37o C/24h đối với phép thử định lượng coliform và Enterobacteriaceae; 44o C/24h đối với phép thử định lượng E. coli. Khuẩn lạc màu đỏ tía trên thạch VRB được xem là coliform; Khuẩn lạc màu xanh lục - lam trên thạch TBX được xem là E. coli; Các khuẩn lạc màu hồng – đỏ tía trên thạch VRBG, âm tính oxidase và lên men đường glucose được đếm là Enterobacteriaceae. 2.3.3. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh 2.3.3.1. Thử tính kháng kháng sinh β-lactam Tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae được thử nghiệm bằng các khoanh giấy kháng sinh theo qui trình hướng dẫn của tổ chức Y tế thế giới [42]:
  40   Bước 1: Chuẩn bị dung dịch McFaland và tạo dung dịch chủng Enterobacteriaceae: 106 – 108 Bước 2: Sử dụng bông tăm vô trùng dàn dịch chủng Enterobacteriaceae lên đĩa thạch Muller Hinton agar Bước 3: Hong khô ở nhiệt độ phòng và đặt khoanh giấy kháng sinh có chứa kháng sinh (nồng độ và các kháng sinh được thể hiện trong Bảng 2.1) Bước 4: Đo kích thước vòng kháng, đối chiếu với kích thước của chủng đối chiếu (E. coli ATCC 25922) theo hướng dẫn của tổ chức CLSI về chuẩn kháng sinh theo Bảng 2.1 [43]. Bước 5: Đọc kết quả: kháng, nhạy cảm, không kháng. Bảng 2.1 Kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ [43] Kháng sinh Tên viết tắt Nồng độ kháng sinh (µg) Điểm đọc tiêu chuẩn S I R Cephalosporin thế hệ 1 Cefazolin KZ 30 ≥15 - ≤14 Cephalosporin thế hệ 2 cefuroxime cefoxitin CXM FOX 30 30 ≥18 ≥18 15-17 15-17 ≤14 ≤14 Cephalosporin thế hệ 3 ceftriaxone cefotaxime ceftazidime CRO CTX CAZ 30 30 30 ≥23 ≥26 ≥21 20-22 23-25 18-20 ≤19 ≤22 ≤17 Chú thích: S: nhạy cảm; I: Trung gian; R: kháng 2.3.3.2. Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase Phân lập các chủng Enterobacteriacea có khả năng sinh enzym β- lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase, carbapenemase [44]. Các mẫu rau được tăng sinh trong đệm peptone, ủ tại 37o C/24h Ria chuyển lên môi trường Macconkey/ chứa 100 µ/L cefotaxime
  41   Các chủng Enterobacteriacea vi khuẩn mọc trên môi trường Macconkey chứa 100 µ/g cefotaxime, được tiến hành xác định trên môi trường đặc trưng cho vi khuẩn Enterobacteriaceae (nhóm lên men đường lactose và nhóm lên men đường glucose) Chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae sẽ được tiến hành xác định sinh enzym β-lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase, carbapenemase trong các thử nghiệm kháng sinh tương ứng với từng loại enzym. Tạo dịch vi khuẩn xác định tính kháng kháng sinh: thực hiện 4 bước tương tự như đã trình bày trong mục 2.4.3.1 Đo kích thước vòng kháng, đối chiếu với kích thước theo hướng dẫn của tổ chức CLSI và EUCAST về chuẩn kháng sinh [43, 45]. Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase phổ rộng Khẳng định sự có mặt của enzym β-lactamase phổ rộng bằng thử nghiệm kháng sinh đồ trên 4 khoanh giấy kháng sinh là cefotaxime (CTX), cefotaxime kết hợp clavulanic axit (CTL), ceftazidime (CAZ) và ceftazidime kết hợp axit clavulanic (CAL). Quá trình thử nghiệm được tiến hành song song cùng với chủng Salmonella 572. Với kích thước vòng kháng CTL và CAL lớn hơn hoặc bằng 5mm so với vòng kháng CTX và/hoặc CAZ thì khẳng định chủng vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng theo hướng dẫn của tổ chức CLSI thể hiện trong Bảng 2.2 [43]. Bảng 2.2 Vi khuẩn sinh enzym ESBL [43] vi khuẩn sinh enzym ESBL Kháng sinh Khẳng định cefotaxime (CTX), CTX và clavulanic axit (CTL, 40µg) vòng kháng CTL, CAL ≥5mm so với vòng kháng CTX, CAZ ceftazidime (CAZ), CAZ và clavulanic axit (CAL, 40µg)
  42   Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym AmpC β-lactamase Khẳng định sự có mặt của enzym AmpC β-lactamase bằng thử nghiệm kháng sinh đồ trên 4 khoanh giấy kháng sinh là cefotaxime (CTX), cefotaxime kết hợp cloxacillin (CTC), ceftazidime (CAZ) và ceftazidime kết hợp cloxacillin (CAC). Quá trình thử nghiệm được tiến hành song song cùng với chủng Salmonella 572. Với kích thước vòng kháng CTC và CAC lớn hơn hoặc bằng 5mm so với vòng kháng CTX và CAZ thì khẳng định chủng vi khuẩn sinh AmpC β-lactamase theo hướng dẫn của CLSI thể hiện trong Bảng 2.3 [43]. Bảng 2.3 Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase [43] Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase Kháng sinh Khẳng định cefotaxime (CTX), CTX và cloxacillin (CTC) vòng kháng CTL, CAL ≥5mm so với vòng kháng CTX, CAZ ceftazidime (CAZ), CAZ và cloxacillin (CAC) Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym carbapenemase Khẳng định sự có mặt của enzym carbapenemase bằng thử nghiệm kháng sinh đồ trên 5 khoanh giấy kháng sinh là meropenem (MRP), meropenem + phenylboronic axit (MR+BO), meropenem + cloxacillin (MR+CL), meropenem + EDTA (MR+ED) và temocillin (TMO). Chủng sinh enzym carbapenemase được khẳng định theo hướng dẫn của EUCAST thể hiện trong Bảng 2.4 [45]. Bảng 2.4 Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym carbapenemase [45] Kích thước vòng kháng của Meropenem và các kháng sinh khác phenylboronic axit (MR+BO) EDTA (MR+ED) cloxacillin (MR+CL) temocillin (TMO) β- lactamases ≥4 mm < 5 mm < 5 mm --- KPC < 4 mm ≥5 mm < 5 mm --- MBL ≥4 mm < 5 mm ≥5 mm --- AmpC < 4 mm < 11 mm OXA < 5 mm < 5 mm <11 OXA -48
  43   Đọc kết quả: vi khuẩn sinh hay không sinh enzym β-lactamase, AmpC β-lactamase, carbapenemase. 2.3.4. Kỹ thuật MALDI – TOF định danh vi sinh vật Thiết bị VITEK MS là máy đo khối phổ MALDI-TOF sử dụng kỹ thuật MALDI (Kỹ thuật ion hóa theo cơ chế giải hấp phụ sử dụng nguồn laser với sự trợ giúp của chất nền), dựa trên sử dụng công nghệ khối phổ protein. VITEK® MS là hệ thống định danh vi khuẩn tự động, tiên tiến, sử dụng công nghệ MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of- Flight) định danh các loài vi khuẩn được thực hiện bằng ghi nhận các dải quang phổ và phân tích các dải quang phổ với cơ sở dữ liệu của VITEK® MS (xem Hình 2.3). So sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu của gần 6000 loài vi sinh vật khác nhau. MALDI-TOF MS cho kết quả nhanh trong vài phút cho 1 mẫu, yêu cầu thể tích mẫu ít và chi phí hóa chất thấp và cho kết quả thu được là loài vi sinh vật được xác định. Hình 2.3 Nguyên lý cơ bản định danh vi khuẩn dựa trên VITEK MS  Các bước tiến hành định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật MALDI TOF trên thiết bị VITEK MS theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị [46]. Bước 1: vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA ở 37o C/24h
  44   Bước 2: Vi khuẩn được phết lên từng giếng của khay Bước 3: Nhỏ 0.1 µL dung dịch CHCA Bước 4: Quét mã khay, nhập mã mẫu vào phần mềm Malditof preparation Bước 5: Chạy máy Bước 6: Đăng nhập phần mềm Myla, đọc kết quả 2.3.5. Phương pháp xác định gen kháng kháng sinh Xác định gen mã hóa enzym β-lactamase bằng kỹ thuật PCR dựa trên độ dài đoạn gen khuếch đại. Thu ADN mẫu bằng xử lý nhiệt 100o C/15’. Ly tâm 13000v/4’. Thu dịch nổi. Sử dụng các cặp mồi đã được công bố bởi tác giả Li và cộng sự vào năm 2013 [47]. Tiến hành phản ứng PCR với các trình tự mồi theo Bảng 2.5
  45   Bảng 2.5 Trình tự mồi của gen mã hóa enzym β-lactamase [47] TT Gen kháng Trình tự mồi (5’-3’) Đoạn khuếch đại (bp) 1. blaTEM CAGCGGTAAGATCCTTGAGA TTCATCCATAGTTGCCTGACT 661 2. blaCMY-2 ACAGAACAACAGATTGCCGATA TGTCGCTGCCGTTGATGA 856 3. blaSHV TTCGCCTGTGTATTATCTCC TTTGCTGATTTCGCTCGG 807 4. blaOXA ACCAGATTCAACTTTCAA TCTTGGCTTTTATGCTTG 590 5. blaPSE GCTCGTATAGGTGTTTCCGTTT CGATCCGCAATGTTCCATCC 575 6. BlaDHA GCCGTCTCCGTAAAGGGTAAGC GCCAGAATCACAATCGCCACCT 926 7. Bla CTX- M CGATGTGCAGTACCAGTAA AGTGACCAGAATCAGCGG  585 Chu trình phản ứng PCR: Biến tính DNA: 94°C/5 phút; 30 chu kỳ: Biến tính DNA 94°C/30s, gắn mồi 55°C/30s; kéo dài chuỗi 72°C/50s; và giai đoạn ổn định 72 °C/7 phút. Chạy điện di với gel 1.5%, chụp gel Sản phẩm PCR đại diện cho mỗi gen được tiến hành tinh sạch và giải trình tự để xác định sự chính xác của sản phẩm. Trình tự ADN của mỗi gen được tiến hành so sánh với dữ liệu của ngân hàng gen Mỹ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Các chủng Enterobacteriaceae mang gen đặc trưng sau đó được sử dụng làm đối chứng dương cho phản ứng PCR xác định gen đích. 2.4. CHỦNG ĐỐI CHỨNG Phát hiện Enterobacteriaceae trên rau, sử dụng chủng E. coli ATCC 25922.
  46   Định danh vi khuẩn, sử dụng chủng E. coli ATCC 8739 Phân tích kháng sinh: sử dụng chủng Salmonella 572, được phân lập từ năm 2012 và công bố trên tạp chí Journal of Food Protection [38]. 2.6. XỬ LÝ KẾT QUẢ Số liệu được nhập vào bảng Excel và được phân tích bằng sử dụng phần mềm STATA 11.0 (StataCorp, College, TX, USA) với các biến là địa điểm thu thập mẫu và các thời điểm thu thập mẫu. Giá trị P<0.05 được sử dụng để đánh giá sự khác biệt về mặt thống kê giữa các biến. Các phép tính thống kê về sự ô nhiễm Enterobacteriaceae trên rau ăn sống theo các loại hình kinh doanh được tiến hành theo phương pháp phân tích bảng với mỗi biến nghiên cứu được kiểm tra bằng 2xn chi square trong Stata.
  47   CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU SỐNG 3.1.1. Đánh giá tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau sống Chín mươi mẫu rau sống được thu thập tại 03 loại hình kinh doanh là các chợ, quán bán đồ ăn có kèm rau ăn sống, và siêu thị thuộc 5 Quận nội thành Hà Nội (Phụ lục 1) (n=30 đối với mỗi loại hình kinh doanh) và tiến hành phân tích phát hiện và định lượng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae gồm Coliform (nhóm vi khuẩn Enterobacteriacea lên men lactose), Enterobacteriaceae (nhóm vi khuẩn Enterobacteriacea lên men glucose) và Escherichia coli với tỉ lệ dương tính tương ứng là 100% (90 mẫu, n=90), 100% (90 mẫu, n=90), 86% (77 mẫu, n=90). Kết quả phân tích của nghiên cứu này tương đồng với các kết quả được thực hiện tại Long Biên và Hoàng Mai năm 2011 của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương với 100% mẫu rau nhiễm Coliform (n=204) [35]. Kết quả này cũng tương đương với phát hiện Coliform trên rau trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự thực hiện tại Cần Thơ năm 2011-2012 (n=25) và nghiên cứu của Ho Le Quynh Chau và cộng sự thực hiện tại Huế năm 2013-2014 (n=108) [35], [37]. Mức nhiễm E. coli là 100% trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thu Hà và Ho Le Quynh Chau, cao hơn kết quả nghiên cứu của chúng tôi do có sự khác biệt trong thiết kế thí nghiệm từ địa điểm lấy mẫu đến số lượng mẫu. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sự tương đồng về sự hiện diện của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae với các nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới, tuy khác nhau về tỉ lệ nhiễm. Nghiên cứu của Ljevaković- Musladin và cộng sự thực hiện thu thập 243 mẫu rau ăn sống tại khách sạn, nhà hàng và các cửa hàng bán lẻ từ năm 2011-2018 tại Croatia cho thấy có 39,5% mẫu nhiễm Enterobacteriaceae [48]. Một nghiên cứu khác được thực hiện tại Ấn Độ bởi Al-Kharousi và cộng sự trong năm 2014 cho thấy tỉ lệ nhiễm Enterobacteriaceae trong rau là 91% và E. coli là 22% [49].
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620
Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

Recommended

Sequencing lý thuyết
Sequencing lý thuyếtSequencing lý thuyết
Sequencing lý thuyếtLam Nguyen
 
Bài báo cáo hướng dẫn thí nghiệm hóa phân tích, Trương Dục Đức.pdf
Bài báo cáo hướng dẫn thí nghiệm hóa phân tích, Trương Dục Đức.pdfBài báo cáo hướng dẫn thí nghiệm hóa phân tích, Trương Dục Đức.pdf
Bài báo cáo hướng dẫn thí nghiệm hóa phân tích, Trương Dục Đức.pdfMan_Ebook
 
Phuong phap dinh luong (so luong vsv) 2
Phuong phap dinh luong (so luong vsv) 2Phuong phap dinh luong (so luong vsv) 2
Phuong phap dinh luong (so luong vsv) 2Thanh Truc Dao
 
Co so ly thuyet cua phuong phap sac ky ban mong
Co so ly thuyet cua phuong phap sac ky ban mongCo so ly thuyet cua phuong phap sac ky ban mong
Co so ly thuyet cua phuong phap sac ky ban mongNguyen Thanh Tu Collection
 
Báo cáo hóa sinh
Báo cáo hóa sinhBáo cáo hóa sinh
Báo cáo hóa sinhThao Truong
 
Dinh luong vsv
Dinh luong vsvDinh luong vsv
Dinh luong vsvTran Duc Viet
 
HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT KHÁC
HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT KHÁCHÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT KHÁC
HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT KHÁCdinhson169
 
Enzyme và ứng dụng Enzyme trong chế biến
Enzyme và ứng dụng Enzyme trong chế biếnEnzyme và ứng dụng Enzyme trong chế biến
Enzyme và ứng dụng Enzyme trong chế biếnwww. mientayvn.com
 

Recommended

Sequencing lý thuyết
Sequencing lý thuyếtSequencing lý thuyết
Sequencing lý thuyếtLam Nguyen
 
Bài báo cáo hướng dẫn thí nghiệm hóa phân tích, Trương Dục Đức.pdf
Bài báo cáo hướng dẫn thí nghiệm hóa phân tích, Trương Dục Đức.pdfBài báo cáo hướng dẫn thí nghiệm hóa phân tích, Trương Dục Đức.pdf
Bài báo cáo hướng dẫn thí nghiệm hóa phân tích, Trương Dục Đức.pdfMan_Ebook
 
Phuong phap dinh luong (so luong vsv) 2
Phuong phap dinh luong (so luong vsv) 2Phuong phap dinh luong (so luong vsv) 2
Phuong phap dinh luong (so luong vsv) 2Thanh Truc Dao
 
Co so ly thuyet cua phuong phap sac ky ban mong
Co so ly thuyet cua phuong phap sac ky ban mongCo so ly thuyet cua phuong phap sac ky ban mong
Co so ly thuyet cua phuong phap sac ky ban mongNguyen Thanh Tu Collection
 
Báo cáo hóa sinh
Báo cáo hóa sinhBáo cáo hóa sinh
Báo cáo hóa sinhThao Truong
 
Dinh luong vsv
Dinh luong vsvDinh luong vsv
Dinh luong vsvTran Duc Viet
 
HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT KHÁC
HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT KHÁCHÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT KHÁC
HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT KHÁCdinhson169
 
Enzyme và ứng dụng Enzyme trong chế biến
Enzyme và ứng dụng Enzyme trong chế biếnEnzyme và ứng dụng Enzyme trong chế biến
Enzyme và ứng dụng Enzyme trong chế biếnwww. mientayvn.com
 
CHUYỂN HÓA PROTEIN
CHUYỂN HÓA PROTEINCHUYỂN HÓA PROTEIN
CHUYỂN HÓA PROTEINSoM
 
Chương 7 lipid
Chương 7 lipidChương 7 lipid
Chương 7 lipidNhat Tam Nhat Tam
 
Tách dòng gene
Tách dòng gene Tách dòng gene
Tách dòng gene Hạnh Hiền
 
Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)
Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)
Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)Richard Trinh
 
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả NhàuĐánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàunhuphung96
 
Bao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitamin
Bao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitaminBao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitamin
Bao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitaminĐức Anh
 
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcNghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Hóa Phân Tích Định Lượng
Hóa Phân Tích Định LượngHóa Phân Tích Định Lượng
Hóa Phân Tích Định LượngDanh Lợi Huỳnh
 
173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd
173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd
173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cdkimqui91
 
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAYĐặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh TríBài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh TríTài liệu sinh học
 
Chuyển hóa protein 1
Chuyển hóa protein 1Chuyển hóa protein 1
Chuyển hóa protein 1Lam Nguyen
 
Saponin duoc lieu chua saponin
Saponin duoc lieu chua saponinSaponin duoc lieu chua saponin
Saponin duoc lieu chua saponinNguyen Thanh Tu Collection
 
Tcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc phamTcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc phamhopchuanhopquy
 
PCR nguyên tắc và ứng dụng
PCR nguyên tắc và ứng dụngPCR nguyên tắc và ứng dụng
PCR nguyên tắc và ứng dụngLam Nguyen
 
Hoá sinh enzym
Hoá sinh enzymHoá sinh enzym
Hoá sinh enzymBongpet
 
PROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEIN
PROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEINPROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEIN
PROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEINSoM
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố Chính
Nghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố ChínhNghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố Chính
Nghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố ChínhMan_Ebook
 
SPSS TRẮC NGHIỆM
SPSS TRẮC NGHIỆM SPSS TRẮC NGHIỆM
SPSS TRẮC NGHIỆM nataliej4
 
Gene, dien di, pcr
Gene, dien di, pcrGene, dien di, pcr
Gene, dien di, pcrHạnh Hiền
 
Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...
Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...
Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lậpCăn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lậpDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 

More Related Content

What's hot

CHUYỂN HÓA PROTEIN
CHUYỂN HÓA PROTEINCHUYỂN HÓA PROTEIN
CHUYỂN HÓA PROTEINSoM
 
Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)
Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)
Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)Richard Trinh
 
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả NhàuĐánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàunhuphung96
 
Bao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitamin
Bao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitaminBao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitamin
Bao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitaminĐức Anh
 
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcNghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Hóa Phân Tích Định Lượng
Hóa Phân Tích Định LượngHóa Phân Tích Định Lượng
Hóa Phân Tích Định LượngDanh Lợi Huỳnh
 
173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd
173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd
173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cdkimqui91
 
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh TríBài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh TríTài liệu sinh học
 
Chuyển hóa protein 1
Chuyển hóa protein 1Chuyển hóa protein 1
Chuyển hóa protein 1Lam Nguyen
 
Tcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc phamTcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc phamhopchuanhopquy
 
PCR nguyên tắc và ứng dụng
PCR nguyên tắc và ứng dụngPCR nguyên tắc và ứng dụng
PCR nguyên tắc và ứng dụngLam Nguyen
 
Hoá sinh enzym
Hoá sinh enzymHoá sinh enzym
Hoá sinh enzymBongpet
 
PROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEIN
PROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEINPROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEIN
PROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEINSoM
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố Chính
Nghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố ChínhNghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố Chính
Nghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố ChínhMan_Ebook
 
SPSS TRẮC NGHIỆM
SPSS TRẮC NGHIỆM SPSS TRẮC NGHIỆM
SPSS TRẮC NGHIỆM nataliej4
 

What's hot (20)

CHUYỂN HÓA PROTEIN
CHUYỂN HÓA PROTEINCHUYỂN HÓA PROTEIN
CHUYỂN HÓA PROTEIN
 
Chương 7 lipid
Chương 7 lipidChương 7 lipid
Chương 7 lipid
 
Tách dòng gene
Tách dòng gene Tách dòng gene
Tách dòng gene
 
Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)
Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)
Kiem Nghiem Vi Sinh Vat (part1)
 
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả NhàuĐánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
 
Bao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitamin
Bao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitaminBao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitamin
Bao cao thuc_hanh_hoa_sinh_ protein & vitamin
 
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcNghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
 
Hóa Phân Tích Định Lượng
Hóa Phân Tích Định LượngHóa Phân Tích Định Lượng
Hóa Phân Tích Định Lượng
 
173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd
173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd
173083723 bai-giang-lt-phan-tich-vi-sinh-dh-cd
 
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAYĐặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY
 
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh TríBài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí
 
Chuyển hóa protein 1
Chuyển hóa protein 1Chuyển hóa protein 1
Chuyển hóa protein 1
 
Saponin duoc lieu chua saponin
Saponin duoc lieu chua saponinSaponin duoc lieu chua saponin
Saponin duoc lieu chua saponin
 
Tcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc phamTcvn ve cac san pham thuc pham
Tcvn ve cac san pham thuc pham
 
PCR nguyên tắc và ứng dụng
PCR nguyên tắc và ứng dụngPCR nguyên tắc và ứng dụng
PCR nguyên tắc và ứng dụng
 
Hoá sinh enzym
Hoá sinh enzymHoá sinh enzym
Hoá sinh enzym
 
PROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEIN
PROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEINPROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEIN
PROTEIN VÀ CHUYỂN HÓA PROTEIN
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố Chính
Nghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố ChínhNghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố Chính
Nghiên cứu quy trình sản xuất trà hòa tan cây sâm Bố Chính
 
SPSS TRẮC NGHIỆM
SPSS TRẮC NGHIỆM SPSS TRẮC NGHIỆM
SPSS TRẮC NGHIỆM
 
Gene, dien di, pcr
Gene, dien di, pcrGene, dien di, pcr
Gene, dien di, pcr
 

Similar to Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...
Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...
Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuô...
Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuô...Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuô...
Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuô...jackjohn45
 
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...Viết thuê trọn gói ZALO 0934573149
 
Tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano bảo vệ cây trồng, 9đ - Gửi miễn...
Tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano bảo vệ cây trồng, 9đ - Gửi miễn...Tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano bảo vệ cây trồng, 9đ - Gửi miễn...
Tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano bảo vệ cây trồng, 9đ - Gửi miễn...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh esbl từ các mẫu bệnh phẩm được...
Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh esbl từ các mẫu bệnh phẩm được...Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh esbl từ các mẫu bệnh phẩm được...
Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh esbl từ các mẫu bệnh phẩm được...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

Similar to Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620 (20)

Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...
Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...
Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên câ...
 
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lậpCăn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu của chủng vi khuẩn phân lập
 
Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuô...
Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuô...Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuô...
Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuô...
 
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
 
Luận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn lao
Luận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn laoLuận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn lao
Luận văn: Thử nghiệm hạt nano kim loại chẩn đoán vi khuẩn lao
 
Luận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đ
Luận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đLuận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đ
Luận văn: Hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, HOT, 9đ
 
Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn ...
Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn ...Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn ...
Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn ...
 
Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY
Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAYLuận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY
Luận văn: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ, HAY
 
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
 
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
 
Tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano bảo vệ cây trồng, 9đ - Gửi miễn...
Tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano bảo vệ cây trồng, 9đ - Gửi miễn...Tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano bảo vệ cây trồng, 9đ - Gửi miễn...
Tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano bảo vệ cây trồng, 9đ - Gửi miễn...
 
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang k...
 
Tỷ lệ kháng Clarithromycin, Levofloxacin của Helicobacter pylori bằng Epsilom...
Tỷ lệ kháng Clarithromycin, Levofloxacin của Helicobacter pylori bằng Epsilom...Tỷ lệ kháng Clarithromycin, Levofloxacin của Helicobacter pylori bằng Epsilom...
Tỷ lệ kháng Clarithromycin, Levofloxacin của Helicobacter pylori bằng Epsilom...
 
Nghiên cứu đặc tính sinh học của các vi sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn ...
Nghiên cứu đặc tính sinh học của các vi sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn ...Nghiên cứu đặc tính sinh học của các vi sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn ...
Nghiên cứu đặc tính sinh học của các vi sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn ...
 
Luận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tía
Luận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tíaLuận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tía
Luận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tía
 
Luận án: Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt N...
Luận án: Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt N...Luận án: Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt N...
Luận án: Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt N...
 
Nghiên cứu tỷ lệ kháng Clarithromycin, Levofloxacin của Helicobacter pylori
Nghiên cứu tỷ lệ kháng Clarithromycin, Levofloxacin của Helicobacter pyloriNghiên cứu tỷ lệ kháng Clarithromycin, Levofloxacin của Helicobacter pylori
Nghiên cứu tỷ lệ kháng Clarithromycin, Levofloxacin của Helicobacter pylori
 
Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh esbl từ các mẫu bệnh phẩm được...
Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh esbl từ các mẫu bệnh phẩm được...Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh esbl từ các mẫu bệnh phẩm được...
Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh esbl từ các mẫu bệnh phẩm được...
 
Luận án: Hình thái, phân tử Sán lá phổi Paragonimus heterotremus - Gửi miễn p...
Luận án: Hình thái, phân tử Sán lá phổi Paragonimus heterotremus - Gửi miễn p...Luận án: Hình thái, phân tử Sán lá phổi Paragonimus heterotremus - Gửi miễn p...
Luận án: Hình thái, phân tử Sán lá phổi Paragonimus heterotremus - Gửi miễn p...
 
Luận văn: Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin
Luận văn: Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân taninLuận văn: Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin
Luận văn: Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin
 

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620

Danh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới NhấtDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm CaoDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620 (20)

Danh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Về Bảo Hiểm Xã Hội Mới Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Nguồn Nhân Lực, 9 Điểm
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Nguồn Nhân Lực, 9 ĐiểmDanh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Nguồn Nhân Lực, 9 Điểm
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Nguồn Nhân Lực, 9 Điểm
 
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Lý Văn Hóa Giúp Bạn Thêm Ý Tưởng
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Lý Văn Hóa Giúp Bạn Thêm Ý TưởngDanh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Lý Văn Hóa Giúp Bạn Thêm Ý Tưởng
Danh Sách 200 Đề Tài Luận Văn Thạc Sĩ Quản Lý Văn Hóa Giúp Bạn Thêm Ý Tưởng
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quản Lý Giáo Dục Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quản Lý Giáo Dục Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quản Lý Giáo Dục Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quản Lý Giáo Dục Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quan Hệ Lao Động Từ Sinh Viên Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quan Hệ Lao Động Từ Sinh Viên GiỏiDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quan Hệ Lao Động Từ Sinh Viên Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Quan Hệ Lao Động Từ Sinh Viên Giỏi
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Nuôi Trồng Thủy Sản Dễ Làm Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Nuôi Trồng Thủy Sản Dễ Làm NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Nuôi Trồng Thủy Sản Dễ Làm Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Nuôi Trồng Thủy Sản Dễ Làm Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Sư, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Sư, Mới Nhất, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Sư, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Sư, Mới Nhất, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phòng, Chống Hiv, Mới Nhất, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phá Sản, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phá Sản, Mới NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phá Sản, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Phá Sản, Mới Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Nhà Ở, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Nhà Ở, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Nhà Ở, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Nhà Ở, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Ngân Hàng, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Ngân Hàng, Mới NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Ngân Hàng, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Ngân Hàng, Mới Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Môi Trường, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Môi Trường, Mới NhấtDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Môi Trường, Mới Nhất
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Môi Trường, Mới Nhất
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hộ Tịch, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hộ Tịch, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hộ Tịch, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hộ Tịch, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hình Sự , Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hình Sự , Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hình Sự , Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hình Sự , Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hành Chính, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hành Chính, Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hành Chính, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Hành Chính, Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Giáo Dục, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Giáo Dục, Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Giáo Dục, Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Giáo Dục, Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đấu Thầu, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đấu Thầu, Từ Sinh Viên Khá GiỏiDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đấu Thầu, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đấu Thầu, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư, Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư, Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư Công, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư Công, Dễ Làm Điểm CaoDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư Công, Dễ Làm Điểm Cao
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đầu Tư Công, Dễ Làm Điểm Cao
 
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đất Đai, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đất Đai, Từ Sinh Viên Khá GiỏiDanh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đất Đai, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
Danh Sách 200 Đề Tài Báo Cáo Thực Tập Luật Đất Đai, Từ Sinh Viên Khá Giỏi
 

Recently uploaded

TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TOÁN 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯỜNG...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TOÁN 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯỜNG...TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TOÁN 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯỜNG...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TOÁN 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯỜNG...Nguyen Thanh Tu Collection
 
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Luận văn 2024 Thực trạng và giải pháp nâng cao hiệu quả công tác quản lý hành...
Luận văn 2024 Thực trạng và giải pháp nâng cao hiệu quả công tác quản lý hành...Luận văn 2024 Thực trạng và giải pháp nâng cao hiệu quả công tác quản lý hành...
Luận văn 2024 Thực trạng và giải pháp nâng cao hiệu quả công tác quản lý hành...lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...
GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...
GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
TUYỂN TẬP 50 ĐỀ LUYỆN THI TUYỂN SINH LỚP 10 THPT MÔN TOÁN NĂM 2024 CÓ LỜI GIẢ...
TUYỂN TẬP 50 ĐỀ LUYỆN THI TUYỂN SINH LỚP 10 THPT MÔN TOÁN NĂM 2024 CÓ LỜI GIẢ...TUYỂN TẬP 50 ĐỀ LUYỆN THI TUYỂN SINH LỚP 10 THPT MÔN TOÁN NĂM 2024 CÓ LỜI GIẢ...
TUYỂN TẬP 50 ĐỀ LUYỆN THI TUYỂN SINH LỚP 10 THPT MÔN TOÁN NĂM 2024 CÓ LỜI GIẢ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdfGiáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf4pdx29gsr9
 
Luận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng Hà
Luận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng HàLuận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng Hà
Luận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng Hàlamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...Nguyen Thanh Tu Collection
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hộiTrắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hộiNgocNguyen591215
 
MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...
MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...
MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
Mở rộng hoạt động cho vay tiêu dùng tại Ngân hàng TMCP Hàng Hải Việt Nam (Mar...
Mở rộng hoạt động cho vay tiêu dùng tại Ngân hàng TMCP Hàng Hải Việt Nam (Mar...Mở rộng hoạt động cho vay tiêu dùng tại Ngân hàng TMCP Hàng Hải Việt Nam (Mar...
Mở rộng hoạt động cho vay tiêu dùng tại Ngân hàng TMCP Hàng Hải Việt Nam (Mar...lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...
20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...
20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Hoàn thiện hoạt động kiểm soát rủi ro tín dụng trong cho vay doanh nghiệp tại...
Hoàn thiện hoạt động kiểm soát rủi ro tín dụng trong cho vay doanh nghiệp tại...Hoàn thiện hoạt động kiểm soát rủi ro tín dụng trong cho vay doanh nghiệp tại...
Hoàn thiện hoạt động kiểm soát rủi ro tín dụng trong cho vay doanh nghiệp tại...lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
60 CÂU HỎI ÔN TẬP LÝ LUẬN CHÍNH TRỊ NĂM 2024.docx
60 CÂU HỎI ÔN TẬP LÝ LUẬN CHÍNH TRỊ NĂM 2024.docx60 CÂU HỎI ÔN TẬP LÝ LUẬN CHÍNH TRỊ NĂM 2024.docx
60 CÂU HỎI ÔN TẬP LÝ LUẬN CHÍNH TRỊ NĂM 2024.docxasdnguyendinhdang
 
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...Nguyen Thanh Tu Collection
 
NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...
NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...
NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025
XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025
XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
NHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.ppt
NHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.pptNHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.ppt
NHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.pptphanai
 

Recently uploaded (20)

TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TOÁN 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯỜNG...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TOÁN 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯỜNG...TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TOÁN 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯỜNG...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TOÁN 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯỜNG...
 
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...
 
Luận văn 2024 Thực trạng và giải pháp nâng cao hiệu quả công tác quản lý hành...
Luận văn 2024 Thực trạng và giải pháp nâng cao hiệu quả công tác quản lý hành...Luận văn 2024 Thực trạng và giải pháp nâng cao hiệu quả công tác quản lý hành...
Luận văn 2024 Thực trạng và giải pháp nâng cao hiệu quả công tác quản lý hành...
 
GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...
GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...
GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...
 
TUYỂN TẬP 50 ĐỀ LUYỆN THI TUYỂN SINH LỚP 10 THPT MÔN TOÁN NĂM 2024 CÓ LỜI GIẢ...
TUYỂN TẬP 50 ĐỀ LUYỆN THI TUYỂN SINH LỚP 10 THPT MÔN TOÁN NĂM 2024 CÓ LỜI GIẢ...TUYỂN TẬP 50 ĐỀ LUYỆN THI TUYỂN SINH LỚP 10 THPT MÔN TOÁN NĂM 2024 CÓ LỜI GIẢ...
TUYỂN TẬP 50 ĐỀ LUYỆN THI TUYỂN SINH LỚP 10 THPT MÔN TOÁN NĂM 2024 CÓ LỜI GIẢ...
 
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdfGiáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
 
Luận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng Hà
Luận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng HàLuận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng Hà
Luận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng Hà
 
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 11 - CÁN...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hộiTrắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
 
MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...
MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...
MỘT SỐ GIẢI PHÁP GÓP PHẦN BẢO TỒN VÀ PHÁT HUY CA TRÙ (CỔ ĐẠM – NGHI XUÂN, HÀ ...
 
Mở rộng hoạt động cho vay tiêu dùng tại Ngân hàng TMCP Hàng Hải Việt Nam (Mar...
Mở rộng hoạt động cho vay tiêu dùng tại Ngân hàng TMCP Hàng Hải Việt Nam (Mar...Mở rộng hoạt động cho vay tiêu dùng tại Ngân hàng TMCP Hàng Hải Việt Nam (Mar...
Mở rộng hoạt động cho vay tiêu dùng tại Ngân hàng TMCP Hàng Hải Việt Nam (Mar...
 
20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...
20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...
20 ĐỀ DỰ ĐOÁN - PHÁT TRIỂN ĐỀ MINH HỌA BGD KỲ THI TỐT NGHIỆP THPT NĂM 2024 MÔ...
 
Hoàn thiện hoạt động kiểm soát rủi ro tín dụng trong cho vay doanh nghiệp tại...
Hoàn thiện hoạt động kiểm soát rủi ro tín dụng trong cho vay doanh nghiệp tại...Hoàn thiện hoạt động kiểm soát rủi ro tín dụng trong cho vay doanh nghiệp tại...
Hoàn thiện hoạt động kiểm soát rủi ro tín dụng trong cho vay doanh nghiệp tại...
 
60 CÂU HỎI ÔN TẬP LÝ LUẬN CHÍNH TRỊ NĂM 2024.docx
60 CÂU HỎI ÔN TẬP LÝ LUẬN CHÍNH TRỊ NĂM 2024.docx60 CÂU HỎI ÔN TẬP LÝ LUẬN CHÍNH TRỊ NĂM 2024.docx
60 CÂU HỎI ÔN TẬP LÝ LUẬN CHÍNH TRỊ NĂM 2024.docx
 
Trích dẫn theo Harvard với Microsoft Word
Trích dẫn theo Harvard với Microsoft WordTrích dẫn theo Harvard với Microsoft Word
Trích dẫn theo Harvard với Microsoft Word
 
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...
ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 BIÊN SOẠN THEO ĐỊNH HƯỚNG ĐỀ BGD 2025 MÔN TOÁN 10 - CÁN...
 
NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...
NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...
NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...
 
XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025
XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025
XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025
 
NHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.ppt
NHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.pptNHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.ppt
NHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.ppt
 

Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae - Gửi miễn phí qua zalo=> 0909232620

  • 1.     BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM   HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ‫־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־‬ Tạ Thị Yến ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU ĂN SỐNG TẠI MỘT SỐ QUẬN NỘI THÀNH HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội – 2019
  • 2.     BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM   HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ‫־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־‬ Tạ Thị Yến ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU ĂN SỐNG TẠI MỘT SỐ QUẬN NỘI THÀNH HÀ NỘI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Hướng dẫn 2: PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo Hà Nội - 2019
  • 3.     Lời cam đoan Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Chu Hoàng Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Học viên Tạ Thị Yến
  • 4.     Lời cảm ơn Luận văn thạc sĩ được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia dưới sự dẫn dắt của: PGS.TS. Chu Hoàng Hà – Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ. Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các đồng nghiệp trong khoa Vi sinh vật – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong khoảng thời gian thực hiện luận văn. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên của Học Viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập tại học viện. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình thân yêu của tôi, cảm ơn bạn bè những người đã luôn sát cánh bên tôi, chia sẻ và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Người viết Tạ Thị Yến
  • 5.     Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Chữ viết tắt Tiếng Anh đầy đủ Tiếng Việt đầy đủ ADN Deoxyribonucleic acid axit Deoxyribonucleic AmpC Plasmid-mediated AmpC β- lactamases Enzym β-lactamase AmpC CXM cefuroxime Kháng sinh cephalosporin thế hệ 2, cefuroxime CTX cefotaxime Kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, cefotaxime CAZ ceftazidime Kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, ceftazidime CRO ceftriaxone Kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, ceftriaxzone CAL ceftazidime + clavulanic acid ceftazidime kết hợp axit clavulanic CTL cefotaxime + clavulanic acid cefotaxime kết hợp axit clavulanic CAC ceftazidime + cloxacillin ceftazidime kết hợp cloxacillin CTC cefotaxime + cloxacillin cefotaxime kết hợp cloxacillin CLSI Clinical Laboratory Standard Institute Viện Tiêu chuẩn thử nghiệm lâm sàng Hoa Kỳ EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit Ethylenediaminetetraacetic ESBL Extended spectrum beta- lactamase β-lactamase phổ rộng ESC Extended spectrum Cephalosporin cephalosporin phổ rộng EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Ủy ban châu Âu về thử nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh
  • 6.     FOX Cefoxitin Kháng sinh Cephalosporin thế hệ 2, cefoxitin FSIS United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service Tổ chức an toàn và kiểm tra thực phẩm của bộ Nông nghiệp Mỹ ISO International Standard Organisation Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế KZ Cefazolin Kháng sinh Cephalosprorin thế hệ 1, cefazoline Omp Outer membrane porin Porin màng ngoài OmpA Outer membrane protein A protein A màng ngoài vi khuẩn PAI Pathogenicity island Vùng gây bệnh UTI Urinary tract infection Vi khuẩn lây nhiễm đường tiết niệu WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới
  • 7.     Danh mục các bảng Bảng biểu Nội dung Trang Bảng 1.1 Sự phân bố của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae 9 Bảng 1.2 Các thế hệ cephalosporin 14 Bảng 2.1 Kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ 40 Bảng 2.2 Vi khuẩn sinh enzym ESBL 41 Bảng 2.3 Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase 42 Bảng 2.4 Xác định vi khuẩn sinh enzym Carbapenemase 42 Bảng 2.5 Trình tự mồi của gen mã hóa enzym β-lactamase 44 Bảng 3.1 Mật độ vi sinh vật log CFU/g theo loại hình kinh doanh 51 Bảng 3.2 Tỉ lệ kháng kháng sinh Cephalosporin 56 Bảng 3.3 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL và AmpC β-lactamase 62 Bảng 3.4 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 66 Bảng 3.5 Vi khuẩn Enterobacteriaceae mang gen kháng kháng sinh 73
  • 8.     Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình Nội dung Trang Hình 1.1. Phân nhóm trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae 8 Hình 1.2. Các bệnh do vi khuẩn Enterobacteriaceae gây ra trên người 10 Hình 1.3 Lịch sử ra đời các loại kháng sinh 12 Hình 1.4 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn 15 Hình 1.5 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa vi sinh vật 16 Hình 1.6 Các cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn 17 Hình 1.7 Cơ chế tác động lên tế bào của kháng sinh 18 Hình 1.8 Con đường lây nhiễm và phát tán mầm bệnh ra cộng đồng 19 Hình 1.9 Các nhóm enzym β-lactamase 24 Hình 1.10 Con đường lây truyền Enterobacteriaceae lên người 29 Hình 2.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội 36 Hình 2.2 Rau ăn sống được bày bán tại các chợ và siêu thị 36 Hình 2.3 Nguyên lý cơ bản định danh vi khuẩn bằng hệ thống VITEK MS 43 Hình 3.1 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trung bình trong rau ăn sống 51 Hình 3.2 Kháng sinh đồ trên chủng vi khuẩn đối chiếu 53 Hình 3.3 Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng với cephalosporin thế hệ 1, 2 53-54 Hình 3.4 Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng Cephalosporin thế hệ 1, 2 và 3 54 Hình 3.5 Khuẩn lạc phân lập trên môi trường Macconkey 57 Hình 3.6 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactam phổ rộng 58
  • 9.     Hình 3.7 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym AmpC β- lactamase 59 Hình 3.8 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL và AmpC β-lactamase 60 Hình 3.9 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 65 Hình 3.10 Định danh Leclercia adecaboxylata bằng kỹ thuật MALDI TOF 65 Hình 3.11 Sản phẩm khuếch đại gen được sử dụng để giải trình tự 68 Hình 3.12 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla TEM với dữ liệu ngân hàng gen 69 Hình 3.13 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla OXA với dữ liệu ngân hàng gen 69 Hình 3.14 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla CTX-M với dữ liệu ngân hàng gen 69 Hình 3.15 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla DHA với dữ liệu ngân hàng gen 70 Hình 3.16 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla CMY với dữ liệu ngân hàng gen 70 Hình 3.17 Đoạn khuếch đại gen bla TEM 71 Hình 3.18 Đoạn khuếch đại gen bla OXA 71 Hình 3.19 Đoạn khuếch đại gen bla CTX-M 72 Hình 3.20 Đoạn khuếch đại gen bla DHA 72 Hình 3.21 Đoạn khuếch đại gen bla CMY 72
  • 10.   1   MỤC LỤC MỞ ĐẦU........................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 7 1.1. HỌ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE.............. 7 1.1.1. Enterobacteriaceae........................................................................... 7 1.1.2. Sự phân bố của Enterobacteriaceae................................................. 8 1.1.3. Khả năng gây bệnh của Enterobacteriaceae .................................... 9 1.1.3.1. Viêm màng não và viêm nhiễm hệ Thần kinh.......................... 10 1.1.3.2. Nhiễm trùng đường tiết niệu..................................................... 10 1.1.3.4. Gây bệnh đường ruột................................................................ 11 1.2. KHÁNG SINH...................................................................................... 12 1.2.1. Lịch sử ra đời kháng sinh................................................................ 12 1.2.1.1. Cephalosporin........................................................................... 13 1.2.1.2. Các kháng sinh β-lactam khác.................................................. 14 1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh................................................................ 14 1.2.2.1. Kháng kháng sinh ..................................................................... 14 1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn.................................... 18 1.2.3. Hiện tượng kháng cephalosporine ở vi khuẩn gram âm................. 22 1.2.4. Enzym β-lactamase......................................................................... 23 1.2.4.1. Enzym β-lactamase phổ rộng ................................................... 25 1.2.4.2. β-lactamase AmpC ................................................................... 27 1.2.4.3. Carbapenemase......................................................................... 28 1.3. THỰC PHẨM – NGUỒN CHỨA ENTEROBACTERIACEAE........... 29 1.3.1. Rau ăn sống – vật chủ chứa Enterobacteriaceae ........................... 30 1.3.2. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau trên thế giới......... 32 1.3.3. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau tại Việt Nam........ 34 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 36 2.1. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............ 36
  • 11.   2   2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU .......................................................................... 37 2.2.1. Dụng cụ........................................................................................... 37 2.2.2. Thiết bị............................................................................................ 37 2.2.3. Hóa chất .......................................................................................... 38 2.2.4. Chủng chuẩn ................................................................................... 38 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 38 2.3.1. Chuẩn bị và xử lý mẫu.................................................................... 38 2.3.2. Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae................................ 39 2.3.3. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh............................................ 39 2.3.3.1. Thử tính kháng kháng sinh β-lactam........................................ 39 2.3.3.2. Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase ................................................................................................................ 40 2.3.4. Kỹ thuật MALDI – TOF định danh vi sinh vật.............................. 43 2.3.5. Phương pháp xác định gen kháng kháng sinh ................................ 44 2.4. CHỦNG ĐỐI CHỨNG......................................................................... 45 2.6. XỬ LÝ KẾT QUẢ................................................................................ 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 47 3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU SỐNG................................................................................... 47 3.1.1. Đánh giá tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau sống 47 3.1.2. Đánh giá mật độ nhiễm Enterobacteriaceae theo loại hình kinh doanh......................................................................................................... 49 3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CEPHALOSPORIN VÀ KHẢ NĂNG SINH ENZYM β-LACTAMASE CỦA VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE.......................................................................... 52 3.2.1. Đánh giá khả năng kháng kháng sinh cephalosporin ..................... 52 3.2.2. Đánh giá sự lưu hành vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β- lactamase................................................................................................... 57 3.3. ĐỊNH DANH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE SINH ENZYM β-LACTAMASE VÀ XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG KHÁNG SINH............ 64
  • 12.   3   3.3.1. Định danh vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 64 3.3.2 Xác định gen mã hóa enzym β-lactamase ....................................... 67 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................... 75 4.1. KẾT LUẬN........................................................................................... 75 4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 76      
  • 13.   4   MỞ ĐẦU Enterobacteriaceae là vi khuẩn gây bệnh đường ruột phổ biến trên toàn thế giới. Bệnh lây truyền qua thực phẩm gây ra bởi Enterobacteriaceae đang là mối quan tâm của cộng đồng toàn cầu. Hầu hết các vụ bùng phát dịch Enterobacteriaceae trên người có liên quan đến việc tiêu thụ sản phẩm thực phẩm mang nguồn bệnh [1]. Hai vấn đề chính trong dịch tễ về vi khuẩn Enterobacteriaceae tại các nước phát triển và đang phát triển trong nửa sau của thế kỷ 20 là sự bùng phát của các ca bệnh do Enterobacteriaceae lây truyền qua thực phẩm lên người và các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae kháng nhiều kháng sinh. Trong thế kỷ 21, tình trạng kháng kháng sinh đã trở nên được quan tâm trên toàn cầu với sự kháng carbapenem và cephalosporin thế hệ 3 của các vi khuẩn Enterobacteriaceae [2]. Sự gia tăng về mức độ kháng kháng sinh của Enterobacteriaceae là một vấn đề quan ngại trên toàn cầu trong những thập kỷ gần đây bởi sự lạm dụng kháng sinh trong điều trị trên người và trong chăn nuôi. Sự cùng tồn tại của nhiều loài vi khuẩn trong đường ruột của động vật và con người đã tạo điều kiện cho việc truyền gen kháng kháng sinh giữa các loài vi khuẩn với nhau. Bên cạnh đó con đường đi của chuỗi thức ăn cũng góp phần làm gia tăng tỉ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh lên người [3]. Cũng như một số nước trên toàn thế giới, Việt Nam đang phải đối mặt với khó khăn trong quá trình điều trị do sự gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh. Thực tế cho thấy hiện tượng dễ dàng mua bán kháng sinh cho điều trị bệnh ở người và sử dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam mà không cần đơn của thầy thuốc là một trong những nguyên nhân chính thúc đẩy tình trạng kháng kháng sinh [4]. Rau là nguồn thực phẩm phổ biến trong cuộc sống hằng ngày của người Việt Nam. Theo báo cáo của Ngân hàng thế giới vào năm 2017, tỉ lệ tiêu thụ rau tại Việt Nam là 0,4 kg rau mỗi ngày trên người và tỉ lệ tiêu thụ rau tại Hà Nội là 2,800 tấn mỗi ngày. Năng suất sản xuất rau tại Hà Nội là 600,000 tấn mỗi năm và trung bình là 1,644 tấn mỗi ngày. Với sức tiêu thụ khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, Hà Nội phải sử dụng nguồn cung từ các tỉnh thành thuộc đồng
  • 14.   5   bằng sông Hồng như Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, Hòa Bình [5]. Từ đó cho thấy rau là nguồn tiêu thụ chính cho nhu cầu ăn uống hằng ngày của người dân Hà Nội. Cũng như các loại thực phẩm khác, rau ăn sống là nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và khả năng lây truyền vi khuẩn kháng lên người. Tuy nhiên cho đến nay có rất ít báo cáo đã công bố về tình trạng vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống chứa các gen mã hóa enzym β-lactamase có khả năng kháng kháng sinh β-lactam. Đặc biệt hơn, tại Việt Nam chưa có công bố nào về tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống được bán tại các quán ăn. Để có những bằng chứng cụ thể về thực trạng ô nhiễm và kháng kháng sinh của Enterobacteriaceae trong rau ăn sống, chúng tôi quyết định tiến hành thực hiện luận văn “Đánh giá sự lưu hành và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại một số quận nội thành Hà Nội” Mục đích 1. Xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống (Nhóm Enterobacteriaceae lên men glucose, nhóm Enterobacteriaceae lên men lactose – Coliform- và Escherichia coli), và xác định tính kháng kháng sinh cephalosporin của các chủng vi khuẩn đã thu thập; 2. Xác định loài vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae sinh enzym β- lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase và carbapenemase và gen mã hóa enzym β-lactamase trong các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase đã thu thập. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện trên sản phẩm thực phẩm là rau ăn sống thu thập tại các loại hình kinh doanh là chợ, siêu thị và các quán ăn có phục vụ rau ăn sống.
  • 15.   6   Ý nghĩa khoa học Luận văn đã cung cấp thêm số liệu về sự lưu hành và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại ba loại hình kinh doanh là chợ, siêu thị và quán ăn có phục vụ rau sống. Luận văn là bước khởi đầu cho các nghiên cứu về thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn hiện diện trong thực phẩm. Ý nghĩa thực tiễn Luận văn cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea trong rau ăn sống, qua đó cho thấy thực tiễn hiện diện của các vi khuẩn kháng kháng sinh trong thực phẩm đang được tiêu thụ tại chợ, siêu thị và quán ăn.
  • 16.   7   CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HỌ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE 1.1.1. Enterobacteriaceae Họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae bao gồm một nhóm lớn các vi khuẩn gram âm không tạo bào tử, thường có độ dài 1-5 μm, sinh trưởng trong điều kiện kị khí và hiếm khí tùy ý (ngoại trừ Saccharobacter fermentans và một số loài thuộc chi Yersinia và Erwinia) và có khả năng di chuyển bằng long, ngoại trừ chi Shigella và Tatumella. Một đặc điểm chung của Enterobacteriaceae, giúp phân biệt với các vi khuẩn khác là thiếu cytochrome C oxidase dẫn đến tạo phản ứng âm tính với oxidase, trừ Plesiomonas spp. Enterobacteriaceae lên men nhiều loại carbohydrate, trong đó khả năng sản xuất axit và sinh khí từ quá trình lên men glucose D là một đặc tính chẩn đoán quan trọng và thường được sử dụng là cơ sở để phát hiện và định lượng Enterobacteriaceae. Một số thành viên của Enterobacteriaceae (ví dụ Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter spp.và Klebsiella spp.) có thể được phát hiện và định lượng dựa trên khả năng lên men lactose nhanh chóng (thường trong vòng 24-48 giờ) tạo ra axít và sinh khí. Nhóm vi khuẩn này được gọi chung là vi khuẩn Coliform và thường được sử dụng như là các vi sinh vật chỉ điểm nhiễm phân bởi ngành công nghiệp thực phẩm và nước bởi vì môi trường sống bình thường của Coliform là đường tiêu hóa của động vật có vú [6]. Tên gọi họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae lần đầu tiên được đề xuất bởi Rahn vào năm 1937, với chi Escherichia. Sơ đồ phân loại của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae phức tạp và nhanh chóng thay đổi khi áp dụng các kỹ thuật tiên tiến xác định loài vi khuẩn dựa trên trình tự axit nucleic. Số lượng chi và loài Enterobacteriaceae đã tăng từ 12 chi và 36 loài năm 1974 lên ít nhất 34 chi, 149 loài và 21 phân loài trong năm 2006 [7]. Năm 2011, họ vi khuẩn đường ruột đã tăng lên ít nhất 48 chi, 219 loài và 41 loài phụ. Theo cơ sở dữ liệu phân loại của Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ vào năm 2015 thì có 63 chi đã được xác định với hơn 210 loài [1], tuy nhiên họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có ý nghĩa lâm sàng chỉ bao gồm 20-25 loài, và
  • 17.   8   các loài khác thì không thường gặp. Số lượng các chi và loài có thể được tăng lên theo thời gian dựa trên các số liệu chưa được công bố [7]. Enterobacteriaceae được xem là các vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh cung cấp các bằng chứng về vệ sinh an toàn thực phẩm trong chuỗi thức ăn cũng như trong ngành công nghiệp thực phẩm. Vi khuẩn thuộc họ đường ruột Enterobacteriaceae được chia thành 3 nhóm, trong đó chủ yếu là nhóm vi khuẩn không lên men đường lactose bao gồm một số chi như Proteus, Cronobacter, Shigella; nhóm lên men lactose chậm hoặc do đột biến; nhóm còn lại thường được phát hiện bởi khả năng lên men lactose nhanh chóng và gọi là nhóm Coliform bao gồm các chi: Escherichia, Enterobacter, Klebsia, Serratia, Citrobacter (xem Hình 1.1) [6]. Hình 1.1. Phân nhóm trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [6] 1.1.2. Sự phân bố của Enterobacteriaceae Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và môi trường. Một số loài là mầm bệnh ở người và động vật, trong khi một số loài khác gây bệnh cho cây cối và côn trùng. Môi Lên men lactose chậm  hoặc do biến đổi  Không lên menlactose   Lên men lactose   h h hó
  • 18.   9   trường sống tự nhiên của một số chi thuộc họ Enterobacteriaceae và có nguồn gốc phân lập từ môi trường tự nhiên, thực phẩm và con người được đưa ra trong Bảng 1.1. Do sự phân bố rộng rãi của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae do đó không thể tránh khỏi một số thành viên của họ Enterobacteriaceae sẽ xâm nhập vào chuỗi thức ăn, gây ra sự hư hỏng thực phẩm và mang mầm bệnh [8]. Bảng 1.1 Sự phân bố của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [8] Chi Sự phân bố và vị trí phân lập Citrobacter Phân người, mẫu bệnh phẩm, nước thải, đất, nước, thực phẩm Enterobacter Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đất, nước ngọt (sông, suối), rau, nước thải, phân người, mẫu bệnh phẩm và đường hô hấp Escherichia Đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng nước, thực phẩm và đất thông qua sự nhiễm phân) Klebsiella Đường tiêu hóa và đường hô hấp ở người và các động vật khác, phân, đất, nước, hoa quả và rau, ngũ cốc và các mẫu bệnh phẩm ở người Proteus Đường tiêu hóa ở người và động vật, đất, nguồn nước ô nhiễm Salmonella Người và động vật, thực phẩm, nước, môi trường Serratia Mẫu bệnh phẩm, khu vực sản xuất, đất, nước, môi trường, đường tiêu hóa của động vật có móng Shigella Đường tiêu hóa của người và linh trưởng Yersinia Phân bố rộng rãi ở người và động vật, thực phẩm, đất và nước Leclercia  Thực phẩm, nước, máu 1.1.3. Khả năng gây bệnh của Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae gây ra các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa và nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết,viêm phổi, nhiễm trùng vùng bụng hoặc vùng chậu, nhiễm trùng nơi phẫu thuật, viêm màng não và các áp xe khác nhau bao gồm nhiễm khuẩn vết thương (xem Hình 1.2) [1].
  • 19.   10   Hình 1.2. Các bệnh do vi khuẩn Enterobacteriaceae gây ra trên người [1] 1.1.3.1. Viêm màng não và viêm nhiễm hệ Thần kinh Một số loài E. coli có thể gây viêm màng não liên quan đến gram âm (viêm màng não sơ sinh E. coli) ở trẻ sơ sinh với tỷ lệ tử vong có thể lên đến 40%, và những người sống sót thường bị di chứng thần kinh. Sự sống sót của vi khuẩn trong máu được tạo điều kiện bởi một màng bao axit polysialic antiphagocytic và protein A màng ngoài vi khuẩn (OmpA). Trong hệ thống thần kinh trung ương, vi khuẩn có thể gây ra phù nề, viêm và tổn thương thần kinh [1]. 1.1.3.2. Nhiễm trùng đường tiết niệu Nhóm vi khuẩn gây nhiễm trùng đường tiết niệu (UTI) là một trong những loài vi khuẩn phổ biến nhất gây nhiễm trùng ở người, gây các triệu chứng bệnh nghiêm trọng và tốn kém về kinh tế cho việc chữa trị. Escherichia coli gây nhiễm trùng đường tiết niệu (UPEC) chiếm khoảng 80% các ca UTIs, gây viêm bàng quang ở bàng quang và viêm thận thận cấp tính ở thận [1].
  • 20.   11   Loài Enterobacteriaceae phổ biến khác có liên quan đến UTIs là Klebsiella pneumoniae. Loài này gây nhiễm trên các nhóm bệnh nhân đặc trưng, như bệnh nhân đái tháo đường hoặc bàng quang rối loạn chức năng và ống thông tiểu. K. pneumoniae, một tác nhân gây bệnh phổ biến trên các bệnh nhân do nhiễm trùng bệnh viện, có một số yếu tố quyết định độc lực, bao gồm khả năng bám dính, hoạt tính phân giải ure và các hệ thống bất hoạt sắt [1]. 1.1.3.3. Nhiễm khuẩn huyết Nhiễm khuẩn huyết là một biến chứng chính của nhiễm trùng Enterobacteriaceae vì nó có thể dẫn đến nhiễm trùng huyết nặng với suy nội tạng cấp tính và sốc nhiễm trùng. Trong những năm gần đây, bệnh nhiễm khuẩn E. coli đã tăng lên và ở Anh, loài này hiện chiếm hơn 30% bệnh nhiễm khuẩn huyết ở những người trên 75 tuổi [1]. Cũng có sự gia tăng đáng kể về nhiễm khuẩn huyết do các mầm bệnh gram âm khác gây ra như Leclercia adecarboxylata. L. adecarboxylata ngoài gây nhiễm khuẩn huyết có thể gây nhiễm trùng vết thương, đặc biệt trên các bệnh nhân mắc các bệnh nguyên phát như ung thư, bệnh bạch cầu, suy thận và xơ gan [9]. Nguồn chủ yếu của nhiễm khuẩn huyết là các vi khuẩn gây bệnh đường tiết niệu. Các nguồn lây nhiễm máu cổ điển khác bao gồm đường tiêu hóa, liên quan đến cả mầm bệnh đường ruột cụ thể và vi khuẩn đường ruột cơ hội, có thể chuyển từ lòng ruột sang máu trong vật chủ với các tình trạng tiềm ẩn (ví dụ như khối u rắn tiêu hóa, viêm túi mật hoặc điều trị ức chế miễn dịch) [1]. 1.1.3.4. Gây bệnh đường ruột Các mầm bệnh gây bệnh đường ruột quan trọng nhất là Salmonella enterica, một số phân typ thuộc loài E. coli, Shigella và Yersinia. Mặc dù các Enterobacteriaceae khác đôi khi có liên quan đến nhiễm trùng đường tiêu hóa, nhưng ý nghĩa lâm sàng đôi khi gây tranh cãi (ví dụ đối với Plesiomonas shigelloides hoặc Klebsiella pneumoniae liên quan đến tiêu chảy) [1].
  • 21.   12   1.2. KHÁNG SINH 1.2.1. Lịch sử ra đời kháng sinh Kháng sinh được phát hiện vào năm 1928. Fleming ghi nhận một khuẩn lạc khác thường của nấm mốc trong một số đĩa petri có chứa vi khuẩn Staphylococcus. Các khuẩn lạc mốc đã khuếch tán các hợp chất xung quanh nó dẫn tới không có khuẩn lạc Staphylococcus mọc xung quanh khuẩn lạc mốc. Fleming đã viết bài báo đầu tiên của ông về penicillin trong năm 1929, đề cập đến việc sử dụng các chất bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để chọn lọc và phân lập vi khuẩn Haemophilus influenzae, được cho là nguyên nhân gây ra bệnh cúm. Theo thời gian, Fleming đã chứng minh rằng penicillin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn và thậm chí là diệt khuẩn. Tuy nhiên trong giai đoạn này penicillin đã không được sử dụng rộng rãi. Tiếp đó, sulfonamidochrysoidine (KI-730, prontosil), được tổng hợp bởi các nhà hóa học Josef Klarer và Fritz Mietzsch và đã được thử nghiệm bởi nhà vi khuẩn học người Đức Gerhard Domagk về hoạt tính kháng khuẩn trên các loại bệnh khác nhau [10]. Trong các khoảng thời gian tiếp theo, rất nhiều họ kháng sinh và thế hệ kháng sinh mới ra đời, nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị bệnh trên người và động vật (xem Hình 1.3) [11]. Hình 1.3 Lịch sử ra đời các loại kháng sinh [11]
  • 22.   13   1.2.1.1. Cephalosporin Họ kháng sinh cephalosporin được phát hiện đầu tiên vào năm 1945, tuy nhiên phải mất gần 2 thập kỷ để đưa các kháng sinh này vào điều trị. Một thập kỷ sau phát hiện ban đầu, các chất cephalosporin đã được phân lập và xác định là sản phẩm lên men của nấm mốc. Các nhà khoa học tại Oxford, bao gồm Florey và Abraham, với các thiết bị đầy đủ đã nghiên cứu ra đặc điểm cấu trúc của các cephalosporin, như họ đã làm đối với penicillin một thập kỷ trước đó. Ba chất cephalosporin P, N, và C đã được xác định. Mỗi sản phẩm đều hoạt động kháng khuẩn nhưng chỉ cephalosporin C kháng cả vi khuẩn gram âm và gram dương. cephalosporin C đã trở thành nền tảng để phát triển các dòng cephalosporin tiếp theo. Dược phẩm cephalosporin đầu tiên là cephalothin, đã được giới thiệu để sử dụng lâm sàng vào năm 1964. Và đến nay đã có hơn 20 thuốc kháng sinh cephalosporin được sử dụng trong điều trị. Cephalosporin là một trong những họ kháng sinh được các nhà điều trị kê toa rộng rãi nhất vì độc tính thấp và khả năng hoạt động phổ rộng của chính kháng sinh này [12]. Về phân loại, cephalosporin gồm 5 thế hệ, dựa vào phổ hoạt động của kháng sinh (xem Bảng 1.2). Thế hệ đầu hoạt động cephalosporin tập trung chủ yếu vào các vi khuẩn gram dương. Các thế hệ thứ hai thuốc đã tăng cường hoạt động chống trực khuẩn gram âm nhưng duy trì mức độ khác nhau của hoạt động đối với cầu khuẩn gram dương. Các cephalosporin thế hệ thứ ba đã tăng lên rõ rệt tiềm năng chống lại vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên, đối với một số hợp chất trong nhóm 3, hoạt động chống lại cầu khuẩn gram dương lại giảm. Trong nhóm thế hệ thứ ba, một vài hợp chất, chẳng hạn như ceftazidime và ceftolozane, được xem xét riêng biệt cho hoạt động chống lại P. aeruginosa. Thế hệ thứ tư có phổ hoạt động rộng nhất trong năm nhóm. Các loại thuốc thứ ba và thứ tư kết hợp cũng được gọi là Cephalosporin rộng phổ. Nhóm thứ năm được gọi là cephalosporin kháng tụ cầu kháng methicillin bao gồm ceftaroline và ceftobiprole [12].
  • 23.   14   Bảng 1.2 Các thế hệ kháng sinh cephalosporin Thế hệ 1 Thế hệ 2 Thế hệ 3 Thế hệ 4 Thế hệ 5 cephazolin cefamandole cefoperazone cefepime ceftaroline cephalothin cefonicid cefotaxime cefpirome ceftobiprole cephapirin cefuroxime ceftazidime cephradin ceftizoxime ceftraexone moxalactam 1.2.1.2. Các kháng sinh β-lactam khác Ngoài họ cephalosporin, penincillin, bốn loại kháng sinh carbapenems - imipenem, meropenem, ertapenem, và doripenem hiện đang được đưa vào trong điều trị tại một số nước phát triển như Mỹ. Carbapenem hoạt động kháng nhiều vi khuẩn gram dương, gram âm kị khí và hiếu khí bởi sự thâm nhập hiệu quả của carbapenem thông qua màng ngoài tế bào, có ái lực cao với các protein liên kết penicillin, và sự ổn định của chúng chống lại hầu hết các enzym β- lactamase phổ rộng (ESBLs) lớp A và enzym β-lactamase lớp C (AmpCs) [13]. 1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh 1.2.2.1. Kháng kháng sinh Kháng sinh đã được con người phát hiện và đưa vào quá trình trị liệu từ giai đoạn bắt đầu của loài người. Thuốc kháng sinh cơ bản đã được xác nhận bởi cơ quan quản lý của Mỹ như là loại thuốc được sản xuất bởi một loài sinh vật để ức chế sự tăng trưởng hoặc để giết chết một loài vi sinh vật khác. Dưới tác dụng của kháng sinh, một số chủng vi khuẩn đã dần thích nghi và kháng lại các kháng sinh. Sự xuất hiện của các mầm bệnh kháng nhiều loại thuốc khác nhau đã làm gia tăng lo ngại về những hậu quả và tác động của hiện tượng này lên sức khỏe con người và quá trình điều trị bệnh trên người.
  • 24.   15   Sự kháng thuốc được định nghĩa là sức đề kháng của vi khuẩn đối với một tác nhân kháng khuẩn mà trước đây chúng chỉ biểu hiện sự nhạy cảm. Đầu tiên hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn là quá trình tiến hóa tự nhiên, sau đó hiện tượng kháng thuốc ngày càng gia tăng trong các loài vi sinh vật gây bệnh bởi sử dụng sai thuốc kháng sinh và sự lây lan toàn cầu của vi khuẩn kháng thuốc, chủ yếu ảnh hưởng đến bệnh nhân có hệ miễn dịch kém hoặc sức khỏe yếu. Sự kháng thuốc đã tiêu tốn nhiều chi phí hơn trong quá trình chữa trị và trong hoạt động nghiên cứu về ngăn ngừa tình trạng kháng kháng sinh. Một loạt các loại thuốc kháng sinh đã bị kháng bởi các vi sinh vật gây bệnh trong những thập kỷ gần đây, nhân tố kháng thuốc có thể được tạo ra và lan truyền từ vi sinh vật này sang vi sinh vật khác, từ loài vi khuẩn này sang loài vi khuẩn khác theo nhiều cách khác nhau [10]. Thông qua hoạt động chuyển gen, ví dụ, integron, nhân tố axit nucleic (ADN) di động có thể bắt giữ và mang các gen, được vận chuyển bởi các gen nhảy (transposon), cho phép các vi sinh vật gây bệnh trao đổi cơ chế kháng kháng sinh (xem Hình 1.4). Một trường hợp đề kháng tự nhiên được thấy thường xuyên bởi các tỷ lệ đột biến tự nhiên trong gen nằm trên nhiễm sắc thể mà sau đó nhân tố đột biến được lan truyền bởi sự nhân lên của vi khuẩn. Một trong những cơ chế kháng là sự tích hợp của ADN trên hệ gen từ vi khuẩn chết và plasmid của các tế bào sống, mà cũng có thể xảy ra với integrons đến từ phẩy khuẩn. Đột biến xảy ra tất cả các thời điểm, thay đổi nucleotid duy nhất có thể làm thay đổi gen và chuyển gen kháng lên vi sinh vật. Các plasmid từ một loại vi khuẩn, với bất kỳ integron, có thể dễ dàng chuyển sang vi khuẩn khác thông qua chuyển gen ngang bởi sự tiếp hợp [10].
  • 25.   16   Hình 1.4 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn [10] Vật liệu di truyền được trao đổi giữa các vi sinh vật qua ba con đường chính: (i) Tải nạp ADN, ví dụ: từ Streptococcus mitisto sang Streptococcus pneumoniae, (ii) biến nạp, ví dụ kháng Methycillin trong Staphylococcus aureus đã được phân lập trong các mẫu phân ở các trang trại và cơ sở giết mổ; và (iii) sự tiếp hợp, ví dụ là các plamid chịu trách nhiệm cho sự phổ biến toàn cầu của các gen mã hóa enzym carbapenemase hoặc β-lactamase, đặc biệt phổ biến trong các vi khuẩn gram âm và tụ cầu (xem Hình 1.5) [14].
  • 26.   17   Hình 1.5 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa vi sinh vật [14] Sự hình thành tính kháng của vi khuẩn lên kháng sinh đã được ghi nhận sớm nhất vào giai đoạn đầu của kỷ nguyên kháng sinh. Trong vòng 20 năm qua, sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm và khả năng kháng của chúng đã liên tiếp phát triển. Nguyên nhân chính là sự thiếu hiểu biết của người sử dụng về kháng sinh, dẫn đến lạm dụng kháng sinh trong điều trị. Rõ ràng, tự dùng thuốc ảnh hưởng đến hiệu quả của liệu pháp điều trị và gây nguy hiểm cho sức khỏe người bệnh cũng như nguy hại đến cộng đồng. Sự lạm dụng kháng sinh đã gây ra áp lực chọn lọc tự nhiên cho vi khuẩn và thúc đẩy quá trình tiến hóa nhanh của vi khuẩn. Hơn nữa, các hợp chất trong hệ sinh thái và điều kiện môi trường sống cũng góp phần tạo áp lực chọn lọc bổ sung lên vi sinh vật. Bên cạnh đó, nguyên nhân khác thúc đẩy hiện tượng kháng kháng sinh ở vi khuẩn là việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích trị bệnh và kích thích tăng trưởng. Hiện nay, kháng kháng sinh đã là vấn đề toàn cầu, và các nước phát triển hiện đã xây dựng các chương trình để hạn chế tình trạng kháng kháng sinh. Ví dụ, ở các nước Bắc Âu, đã nghiên cứu việc sử dụng hợp lý thuốc kháng
  • 27.   18   sinh, cùng với loại bỏ các chất kích thích tăng trưởng cho động vật nuôi. Từ năm 2006, các nước Liên minh châu Âu khác đã và đang áp dụng các biện pháp tương tự để hạn chế sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp [10]. 1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Có rất nhiều cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn, trong số đó năm cơ chế thường thấy nhất là: enzym ức chế hoạt động của kháng sinh, biến đổi trong protein liên kết penicillin (PBP), đột biến Porin, bơm đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào và thay đổi mục tiêu của kháng sinh (thay đổi thành tế bào) (xem Hình 1.6) [10]. Hình 1.6 Các cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn [10] Để ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, kháng sinh có xu hướng tác động lên mục tiêu cụ thể như ức chế tổng hợp protein cụ thể, tổng hợp ADN và ARN, can thiệp vào sự tổng hợp thành tế bào, phá vỡ các cấu trúc màng thấm, và ức chế sự tổng hợp chất chuyển hóa thiết yếu (xem Hình 1.7) [15]. Do cấu trúc sinh học khác nhau của kháng sinh, các mục tiêu tấn công của kháng sinh có thể khác nhau tùy thuộc vào từng đối tượng vi khuẩn đang tiếp xúc với chính
  • 28.   19   kháng sinh. Ví dụ, penicillin và cephalosporin ức chế vi khuẩn tổng hợp vách tế bào bằng cách can thiệp tới các enzym liên quan đến tổng hợp lớp peptidoglycan; trong khi tetracycline và streptogramin ức chế vi khuẩn bằng cách phá vỡ sự tổng hợp protein. Một vi khuẩn được xem là kháng với một kháng sinh đặc biệt khi các kháng sinh không còn hiệu quả để điều trị một căn bệnh gây ra bởi một tác nhân gây bệnh của vi khuẩn đặc biệt [16]. Hình 1.7 Cơ chế tác động lên tế bào của kháng sinh [15] Enzym ức chế hoạt động của kháng sinh Cơ chế kháng phổ biến nhất của vi khuẩn là enzym ức chế. Cơ chế này được dựa trên một số chiến lược để thay đổi cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn: thủy phân, một loại phản ứng xảy ra chủ yếu với các kháng sinh β- lactam; thay đổi các nhóm chức năng (acyl, phosphoryl, thiol, nucleotidil, ADP-ribosyl, glycosyl), xảy ra với rất nhiều chất kháng khuẩn, chẳng hạn như mminoglycoside, chloramphenicol, rifamycin, và lincosamide; và oxi hóa khử , xảy ra với tetracycline, rifamycin, và streptogramin. Hơn nữa enzym có thể sửa đổi các hợp chất kháng khuẩn, β-lactamase là một vấn đề lớn trong việc
  • 29.   20   điều trị các vi khuẩn gram âm. Enzym β-lactamase bao gồm enzym penicillinases, chống lại các kháng sinh penicillin, hoặc enzym AmpC cephalosporinases (ví dụ, MOXs, MIR, FOX). Có nhiều enzym β-lactamase phổ rộng (ví dụ, SHV-1, TEM-1, TEM-2, CTX), có khả năng thủy phân các penicillin và các cephalosporin và kháng lại các chất ức chế lactamase (ví dụ, axit clavulanic, sulbactam và tazobactam). Nhóm enzym kháng penicillin và cephalosporin, bao gồm cefotaxime và ceftazidime; Hơn nữa, nhiều vi khuẩn sản sinh enzym TEM và SHV còn đồng kháng với tetracycline, sulfonamides, và aminoglycosid. Phần lớn các vi khuẩn sinh enzym CTX-M kháng với fluoroquinolones. Cuối cùng, enzym carbapenemases (ví dụ, IMP, VIM, KPCs, OXAs), là các enzym có khả năng bất hoạt tất cả các kháng sinh β-lactam trừ aztreonam [10]. Biến đổi các protein liên kết penicillin (PBP) PBPs là protein quan trọng có liên quan trong việc xây dựng các peptidoglycan, là thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn. Các enzym này xúc tác các sợi glycan và liên kết ngang giữa các chuỗi glycan. Các vị trí hoạt động của sợi glycan là mục tiêu của kháng sinh β-lactam. Các hợp chất này bắt chước sợi peptit đôi D-Ala-D-Ala trong peptidoglycan và tạo thành một phức acyl-enzym rất ổn định, dẫn đến enzym bị bất hoạt. Khi các PBP thay đổi vị trí hoạt động, thì các kháng sinh β-lactam sẽ để mất hoặc làm giảm ái lực của chúng với các protein mục tiêu, dẫn đến sự kháng thuốc [10]. Biến đổi Porin Vi khuẩn gram âm có một lớp màng bên ngoài vách tế bào, màng ngoài, trong đó bao gồm một lớp lipid kép. Các thành phần chính của lớp đôi này là lipopolysaccharide, là hợp chất kị nước, nên các hợp chất ưa nước rất khó khăn để đi qua. Do đó, porins hoặc porins màng ngoài (OMP), là các protein hỗ trợ trong việc thông qua các chất hòa tan thấm qua màng lipid kép. Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng của thuốc để vượt qua porins, chẳng hạn như hình dạng, kích thước. Có một số porins điển hình, chẳng hạn như OmpF, OmpC, và OmpE. Mỗi loài vi khuẩn sản xuất các porins cụ thể và sự mất mát hoặc giảm hoạt động của một hoặc nhiều OMP là một yếu tố góp phần phổ biến
  • 30.   21   trong việc xây dựng sức đề kháng (ví dụ, mất OprD) của P. aeruginosa đối với Imipenem và Meropenem. Ở các loài khác, mất OmpF có thể dẫn đến các sinh vật kháng với nhiều loại kháng sinh (đa kháng). Trong một số chủng vi khuẩn, sự giảm hoặc mất ái lực của thuốc với các protein (porin), dẫn đến mất khả năng để vượt qua các màng ngoài và không thể xâm nhập vào tế bào. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng áp lực chọn lọc tác dụng bởi việc sử dụng kéo dài thuốc kháng sinh là một yếu tố quan trọng trong sự xuất hiện của vi khuẩn đa kháng và việc sửa đổi các porins là một yếu tố quan trọng sự hình thành đa kháng thuốc [10]. Protein bơm Một cơ chế hiệu quả cao của kháng kháng sinh là sự sản sinh hệ thống protein bơm kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn. Tất cả các thành viên của họ protein này bao gồm 3 dạng không thay đổi sau: Dạng A, đóng vai trò như cửa vào và ra của tế bào chất, kiểm soát sự di chuyển của các chất nền đến và đi từ các tế bào chất; dạng B, đó là tham gia vào các khớp nối năng lượng; và dạng C, định hướng vị trí và đề xuất hướng vận chuyển. Các protein đặc trưng nhất trong họ này là protein vận chuyển tetracycline (TetB), đã được tìm thấy trong E. coli [10]. Sửa đổi phân tử mục tiêu của các kháng sinh Hầu hết các kháng sinh ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein đều nhằm vào các ribosome mục tiêu và sự khác biệt giữa cấu trúc của ribosome này cho các hành động chọn lọc của thuốc kháng sinh trong vi khuẩn, vi khuẩn cổ và các tế bào nhân chuẩn. Ngay cả giữa các loài, sự thay đổi nhỏ trong cấu trúc ribosome có thể dẫn đến sự tương tác đặc hiệu mang tính chất của loài lên kháng sinh. Do đó các kháng sinh nhắm vào ribosome là chất diệt khuẩn rất mạnh. Tuy nhiên, qua nhiều thập kỷ sử dụng, các tác nhân gây bệnh đã trở nên đề kháng với thuốc kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein. Một cơ chế đáng chú ý của sự kháng là việc sửa đổi các mục tiêu của kháng sinh. Ví dụ, những thay đổi nhỏ trong một chuỗi axit amin, dẫn đến thay đổi cấu trúc protein đủ để cản trở kháng sinh. Các báo cáo đầu tiên của sự thay đổi cấu trúc ribosome
  • 31.   22   trong đột biến erythromycin kháng E. coli mô tả sự thay đổi protein ribosome, đáng chú ý là các protein L4 và L22 [10]. 1.2.3. Hiện tượng kháng cephalosporine ở vi khuẩn gram âm Escherichia coli và Acinetobacter spp. là tác nhân gây bệnh quan trọng ở người. Các trường hợp nhiễm khuẩn nặng do các vi sinh vật nói trên thường được điều trị bằng cephalosporin phổ rộng (ESC). Tuy nhiên, trong hai thập kỷ qua, hoạt động điều trị đã phải đối mặt với sự gia tăng nhanh chóng các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi sự kháng cephalosporin phổ rộng của các chủng vi khuẩn gây bệnh do sự hình thành enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL), plamid trung gian AmpCs và các enzym carbapenemase. Tình trạng này làm hạn chế đáng kể quá trình điều trị và gây nguy hiểm đến sức khỏe con người. Gia cầm được xem như là nguồn chứa các vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc. Chính việc sử dụng tự do các kháng sinh trong chăn nuôi đã góp phần vào sự thích nghi và tính chọn lọc của vi khuẩn trong quá trình kháng lại kháng sinh cephalosporin phổ rộng của vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Ngày nay, sự phổ biến của thức ăn có nguồn gốc từ động vật có chứa các vi khuẩn Enterobacteriaceae và E. coli mang gen kháng kháng sinh cephalosporin phổ rộng (đặc biệt là các chủng vi khuẩn có chứa gen CTX-M và CMY-2 AmpC mã hóa enzym β-lactamase) đã gây ra lo ngại cho việc điều trị bệnh. Hơn nữa, gần đây với sự xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng carbapenem (vi khuẩn đường ruột sản sinh VIM-1, NDM-1 hay OXA-23) đang là mối quan tâm lớn của cả cộng đồng [17]. Việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y đã góp phần vào việc lựa chọn và lây lan của các vi khuẩn gram âm đa kháng kháng sinh, đặc biệt là E. coli và Klebsiella pneumoniae kháng cephalosporin phổ rộng đã được phân lập trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật và từ môi trường nước. Nguy cơ trước mắt của tình trạng này là sự lây truyền các chủng vi khuẩn kháng cephalosporin phổ rộng hay ESBL từ thực phẩm lên người do tiêu thụ thực phẩm có mang mầm bệnh, hơn nữa sự lây lan từ người sang người qua chất thải (phân) thông qua môi trường và bệnh viện cũng được xem là môi trường lý
  • 32.   23   tưởng cho sự phát tán các mầm bệnh kháng kháng sinh ra cộng đồng thông qua hệ thống nước thải (xem Hình 1.8) [16, 17, 18] Hình 1.8 Con đường lây nhiễm và phát tán mầm bệnh ra cộng đồng [19] 1.2.4. Enzym β-lactamase Sự kháng kháng sinh β-lactam trong các vi khuẩn gây bệnh gram âm có xu hướng liên quan đến sự sinh enzym β-lactamase. Báo cáo tổng hợp gần đây về β-lactamase theo cấu trúc và chức năng cho thấy có hơn 950 enzym với cấu trúc tự nhiên được mô tả. Các enzym này tồn tại dưới dạng β-lactamases đặc trưng cho cá thể, ví dụ là loài Klebsiella oxytoca, enzym có thể được tạo ra bởi các thành phần ngoài nhiễm sắc thể với tám enzym β-lactamase khác nhau xuất hiện trong một cá thể. Mối quan tâm lớn của các nhà nghiên cứu là khả năng thay đổi ngày càng tăng của vi khuẩn để sản sinh các enzym β-lactamase phân giải tất cả các kháng sinh β-lactam [2].
  • 33.   24   β-lactamase gồm 4 nhóm chính có thể được xác định dựa trên các đặc tính của kháng sinh: penicillinase, cephalosporinase kiểu AmpC, β-lactamases phổ rộng (ESBLs) và carbapenemases (xem Hình 1.9), ESBLs, cephalosporinase có thể thủy phân cephalosporin phổ rộng như cefotaxime hoặc ceftazidime. Các vi khuẩn Enterobacteriacease sản sinh ra các enzym này với khả năng thuỷ phân hầu hết các kháng sinh penicillin và cephalosporin, dẫn đến việc sử dụng kháng sinh carbapenem thường xuyên hơn. Tuy nhiên, các báo cáo cũng cho thấy các vi khuẩn gram âm sinh enzym carbapenemases cũng đạt được tỷ lệ cao. Enzym carbapenemase này có tỷ lệ bất hoạt cao đối với kháng sinh carbapenems, các kháng sinh lactam phổ rộng đang được sử dụng để chống lại vi khuẩn gram sinh enzym β-lactamase [2]. Hình 1.9 Các nhóm enzym β-lactamase [2] Dựa trên sự phân loại của Ambler, enzym β-lactamase có thể được phân loại vào bốn lớp, lớp A đến D, dựa trên axit amin chuỗi giống nhau và cấu trúc phân tử. Lớp A, C, D gồm các cấu trúc giống penicillin và liên quan đến protein liên kết penicillin. Các lớp này khác nhau bởi trọng lượng của protein liên kết penicillin. Lớp B β-lactamase, mặc dù cũng thủy phân vòng β-lactam, nhưng cấu trúc không liên quan đến các protein liên kết penicillin. Các enzym β- lactamase thường thấy trong điều trị lâm sàng là lớp A hoặc lớp C. Loại A enzym thủy phân thường ưu tiên penicillin, nhưng cũng có thể phân giải
  • 34.   25   cephalosporin hoặc carbapenemase. Thông thường họ các enzym β-lactamase bị ức chế bởi axit clavulanic.Tuy nhiên điểm đột biến có thể khiến các enzym kháng với các chất ức chế hoặc mở rộng phổ hoạt động bao gồm các cephalosporin thế hệ thứ ba và aztreonam (gọi là β-lactam phổ rộng). Lớp enzym β-lactamase C ưu tiên thủy phân cephalosporin và không bị ức chế bởi axit clavulanic. Các β-lactamase thường được mã hóa trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Enzym loại B là các enzym hoạt động phổ rộng, và có thể thủy phân tất cả các kháng sinh β-lactam trừ aztreonam [20]. 1.2.4.1. Enzym β-lactamase phổ rộng Nhóm enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL), là enzym có tác dụng kháng cephalosporin thế hệ ba và thế hệ 4, carbapenem và monobactam. Hiện tượng kháng các kháng sinh trên đã được ghi nhận vào thập niên 1980, tại Đức, năm 1983, ca bệnh đầu tiên đã được mô tả là có sự xuất hiện vi sinh vật sản sinh enzym β-lactamase. Vi khuẩn sinh enzym ESBL thường đa kháng do các gen qui định tính kháng lên các loại kháng sinh khác nhau đều nằm trên cùng 1 plasmid. Một số vi khuẩn sinh enzym ESBL kháng với nhóm aminoglycosides, 4-quinolon. Bên cạnh đó nhiều vi khuẩn sinh enzym beta-lactamase phổ rộng đang hoạt động chống lại hầu hết các kháng sinh β-lactam, bao gồm oxyimino- betalactams, ceftazidime, ceftiofur, aztreonam, có thể bị bất hoạt bởi axit clavulanic [21]. Nhóm enzym ESBL được phân loại dựa trên cấu tạo, kết cấu phân tử của enzym và nhóm kháng sinh mà các enzym này ức chế. Năm 2010, dựa trên cấu trúc phân tử, các enzym β-lactamase được chia làm 4 nhóm: nhóm 1 (lớp C) bao gồm các enzym kháng cephalosporin; nhóm 2 (lớp A và D) bao gồm ESBL và các enzym carbapenemase; nhóm 3 gồm metallo-β-lactamase; nhóm 4 là các enzym penicillinase kháng axit clavulanic [21]. ESBL còn được định nghĩa là các enzym β-lactamase có thể bị ức chế bởi axit clavulanic, tazobactam hoặc sulbactam, và được mã hóa bởi các một số gen có thể được trao đổi giữa các vi khuẩn như sau:
  • 35.   26   Enzym SHV Tập hợp các enzym SHV của nhóm β-lactamase dường như được bắt nguồn từ Klebsiella spp. Khởi nguồn của tập hợp enzym SHV, là SHV-1, tìm thấy đầu tiên trong chủng vi khuẩn gây bệnh K. pneumoniae. Trong nhiều chủng K. pneumoniae, các gen mã hóa SHV 1, LEN-1, cư trú trên các nhiễm sắc thể của vi khuẩn, sau đó được kết hợp vào một plasmid và đã phát tán gen này đến các vi khuẩn đường ruột khác. SHV-1 kháng với penicillin phổ rộng như ampicillin, tigecycline và piperacillin. Các enzym SHV-1 β-lactamase chịu trách nhiệm trong 20% trường hợp kháng ampicillin liên quan đến plasmid trong K. pneumonia [22]. Enzym TEM Enzym TEM-1, lần đầu tiên được báo cáo từ một chủng E. coli phân lập vào năm 1965, có khả năng kháng kháng sinh tương tự như enzym SHV-1. TEM-1 có khả năng thủy phân penicillin và cephalosporin thế hệ đầu tiên nhưng không thể tấn công các cephalosporin oxyimino. Tuy nhiên sau đó đã xuất hiện các biến thể TEM đầu tiên gia tăng hoạt động chống lại các cephalosporin phổ rộng là TEM-3. TEM-3, lần đầu được báo cáo vào năm 1989, là enzym TEM β-lactamase đầu tiên hiển thị các kiểu hình ESBL. Hiện nay các biến thể của TEM ngày càng mở rộng về số lượng và phổ biến trong các vi khuẩn đường ruột [22]. Enzym CTX Một nhóm enzym β-lactamase mới là CTX, ưu tiên thủy phân cefotaxime. Nhóm enzym này đã được tìm thấy trên một số chủng vi khuẩn như Salmonella Typhimurium, E. coli và một số loài Enterobacteriaceae khác. Đây là nhóm enzym không liên quan rất chặt chẽ với TEM hoặc SHV β-lactamase. CTX-M β-lactamase được cho là bắt nguồn từ gen trên nhiễm sắc thể trong loài Kluyvera spp., một tác nhân gây bệnh cơ hội của thuộc vi khuẩn Enterobacteriaceae được tìm thấy trong môi trường. Protein CTX-M đã được phát hiện vào cuối những năm 1980 và ngày nay hơn 100 biến thể đã được giải trình tự [21].
  • 36.   27   Enzym OXA Các Enzym β-lactamase OXA được đặt tên dựa trên khả năng thủy phân Oxacillin. Các β-lactamase này được đặc trưng bởi tỷ lệ thủy phân cloxacillin và oxacillinlớn hơn 50% đối với penicillin G. Chúng chủ yếu xảy ra ở P. aeruginosa nhưng đã được phát hiện trong nhiều vi khuẩn gram âm khác. Trong thực tế, phổ biến nhất trong các Enzym β-lactamase OXA, là OXA-1 đã được tìm thấy trong 1-10%. Các enzym OXA ESBL ban đầu được phát hiện trong khuẩn lạc P. aeruginosa từ bệnh viện ở Ankara, Thổ Nhĩ Kỳ. Sự tiến hóa của enzym ESBL OXA có nhiều điểm tương đồng với sự tiến hóa của enzym ESBL SHV- và TEM [22]. Các enzym ESBL khác Một số enzym ESBL khác như PER, GES, BES, CME, SFO, GES, PSE đã được tìm thấy và phân lập trên vi sinh vật gây bệnh ở khắp nơi trên thế giới [23]. 1.2.4.2. β-lactamase AmpC AmpC β-lactamase chủ yếu là các enzym được mã hóa bởi gen nằm trên nhiễm sắc thể tạo ra tính kháng với penicillin, cephalosporin phổ hẹp, oxymino- lactam, và cephamycin và không nhạy cảm với các chất ức chế-lactamase như nhóm axit clavulanic. Sự sản sinh AmpC trong trực khuẩn gram âm thường bị ức chế. Tuy nhiên, sự gia tăng tạm thời trong sản xuất enzym AmpC (gấp 10 đến 100 lần) có thể xảy ra với sự hiện diện của kháng sinh β-lactam ở các loài sau đây: Enterobacter, Citrobacter freundii, Serratia, M. morganii, Providencia và P. aeruginosa. Quá trình sản xuất β-lactamase của AmpC trở lại mức thấp sau khi ngừng tiếp xúc với kháng sinh, trừ khi đột biến tự phát xảy ra ở locus ampD của gen, dẫn đến sự sản xuất vĩnh viễn enzym ở những loài này. Sử dụng Cephalosporin thế hệ thứ ba trong điều trị bệnh do Enterobacter spp. là cơ hội cho vi khuẩn lựa chọn và sản sinh các đột biến, dẫn đến sự xuất hiện hiện tượng kháng kháng sinh trong quá trình điều trị [22].
  • 37.   28   Hơn 20 enzym AmpC qua trung gian plasmid, có nguồn gốc từ các gen được mã hóa bởi nhiễm sắc thể trong Enterobacteriaceae hoặc Aeromonas spp., đã được tìm thấy trong E. coli, K. pneumoniae, Salmonella enterica và Proteus mirabilis [22]. Thành viên thường gặp nhất của nhóm này là enzym beta- lactamase CMY 2 trong vi khuẩn Salmonella phân lập từ động vật, gia cầm và trên vi khuẩn Shigella, E. coli O157 từ các vụ dịch [24]. 1.2.4.3. Carbapenemase Carbapenemase là tập hợp gồm các enzym có Serin trong vị trí hoạt động và enzym Metallo β-lactamase (MBLs) mà sử dụng ít nhất 1 nguyên tố kẽm cho hoạt động phân giải kháng sinh. Các enzym carbapenemases Serine lần đầu tiên được xác định vào giữa những năm 1980 với số lượng hạn chế trên vi khuẩn E. coli, nhưng bây giờ đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới. Điều quan trọng nhất là enzym Klebsiella pneumoniae carbapenemase - KPCs, được các plasmid truyền phát tán khắp các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và các loài vi khuẩn không sản sinh enzym này. Hai enzym tương đương về sinh hóa KPC-2 và KPC-3 là phổ biến nhất, sự khác biệt giữa các isoenzym này là sự thay thế amino axit đơn (His272 đổi thành Tyr) [22]. Enzym Metallo-β-lactamases (MBLs) hiện nay được tìm thấy trên toàn cầu do sự lan truyền bởi plasmid ở nhiều loài vi khuẩn. Hơn 80 MBL khác nhau đã được xác định trên toàn thế giới, với hơn 75% số enzym này xuất hiện như các enzym mã hoá từ plasmid. Các họ chính của các MBL đã bao gồm enzym IMP và VIM β-lactamase, ban đầu được tìm thấy trong P. aeruginosa, nhưng bây giờ chúng đã được tìm thấy trong Enterobacteriaceae. Việc sản xuất MBL trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae được ghi nhận từ năm 1994 khi IMP-1 mã hoá từ plasmid được xác định trong loài Serratia marcescens tại Nhật Bản [22].
  • 38.   29   1.3. THỰC PHẨM – NGUỒN CHỨA ENTEROBACTERIACEAE Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có thể lây nhiễm lên thực phẩm theo con đường trực tiếp hoặc gián tiếp từ nhiều nguồn khác nhau hoặc tự chúng có thể đại diện cho hệ vi sinh vật tự nhiên của thực phẩm. Một số chi thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea thường xuất hiện rộng rãi và phổ biến trong thực phẩm bao gồm Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia, Yersinia, Escherichia, Proteus và Salmonella, có thể xâm nhập vào chuỗi thức ăn hoặc có thể liên quan đến các loại thực phẩm thông qua nhiễm phân (xem Hình 1.10) [1, 24]. Ô nhiễm thực phẩm bởi mầm bệnh đường ruột (Enterobacteriaceae) có thể xảy ra từ trang trại nếu nước thải của con người được sử dụng để bón cho đất hoặc nếu nước thải được sử dụng để tưới cho cây trồng. Trái cây tươi và rau quả có thể trở nên bị ô nhiễm trước hoặc sau khi thu hoạch. Những rủi ro như vậy sẽ tăng thêm nếu thực phẩm bị xử lý sai trong quá trình chế biến và chuẩn bị, trong chuỗi thức ăn các mầm bệnh có thể nhân lên theo cấp số nhân trong điều kiện thuận lợi [26]. Hình 1.10 Con đường lây truyền Enterobacteriaceae lên người [25]
  • 39.   30   1.3.1. Rau ăn sống – vật chủ chứa Enterobacteriaceae Trong các sản phẩm thực phẩm thì con người có xu hướng tiêu thụ các sản phẩm tươi, cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể khỏe mạnh. Trong các sản phẩm được tiêu thụ thì rau ăn sống là thực phẩm giàu dinh dưỡng cung cấp vitamin, khoáng và chất xơ, nên mức tiêu thụ các sản phẩm rau đã tăng lên trong thập kỷ gần đây. Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO) việc tiêu thụ quá ít rau quả đã dẫn tới sự tử vong của 1,7 triệu người trên toàn thế giới. WHO và tổ chức Nông Lương (FAO) cũng khuyến cáo con người cần bổ sung ít nhất 400 g trái cây và rau mỗi ngày (không bao gồm các loại cây trồng có nguồn gốc tinh bột) để phòng tránh các bệnh mãn tính như bệnh tim, tiểu đường, béo phì và ngăn ngừa các bệnh khác do thiếu vi chất [27]. Rau ăn sống thường chứa các vi sinh vật không gây bệnh, nhưng trong quá trình trồng trọt, thu hoạch, vận chuyển và xử lý, sản phẩm có thể bị nhiễm mầm bệnh từ nguồn nước, chất thải của động vật và con người. Hầu hết các sản phẩm này có thể tiêu thụ trực tiếp mà không cần chế biến thêm hoặc không cần xử lý nhiệt, do đó các vi sinh vật gây bệnh có trong rau sống có thể là nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe của người tiêu dùng và nảy sinh vấn đề an toàn thực phẩm cần kiểm soát. Sự nhiễm bẩn có thể là kết quả của việc xử lý đất với các chất hữu cơ phân bón, như bùn thải và phân chuồng, và từ nước tưới, cũng như từ khả năng của mầm bệnh để tồn tại và phát triển trong rau. Dịch tễ học của bệnh lây truyền qua thực phẩm đã thay đổi nhanh chóng trong những thập kỷ gần đây, ngay sau khi một số mầm bệnh chủ yếu của con người được công nhận là lây lan từ các trang trại nuôi động vật, thì rau ăn sống đã nổi lên như một nguồn chứa nguy cơ mới để truyền các mầm bệnh lên người. Bên cạnh đó mức tiêu thụ rau ăn sống cũng đã tăng lên trong những năm gần đây, song song đó, kể từ đầu những năm 1990, các vụ ngộ độc liên quan đến việc tiêu thụ rau ăn sống cũng đã tăng lên nhanh chóng. Hầu hết các báo cáo về triệu chứng dạ dày- ruột kết do ăn rau ăn sống đều có liên quan đến ô nhiễm vi khuẩn, đặc biệt là với các thành viên họ Enterobacteriaceae [28]. Tiêu thụ rau ăn sống cũng là con đường mà qua đó con người tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh mang gen kháng kháng sinh. Ngoài ra, sự hiện diện của
  • 40.   31   vi khuẩn kháng kháng sinh trong rau ăn sống có thể góp phần làm lan rộng tính kháng kháng sinh giữa các quần thể vi khuẩn theo chiều ngang giữa các chủng, loài và chi khác nhau. Sự hiện diện của các gen kháng trên các yếu tố di truyền di động tạo điều kiện cho sự phân bố và lan truyền tính kháng kháng sinh và việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh trong điều trị đã góp phần hình thành nhân tố kháng trong vi khuẩn. Việc sử dụng một lượng lớn thuốc kháng sinh trong nông nghiệp có thể dẫn đến việc thích nghi của các vi khuẩn kháng thuốc; bên cạnh đó sử dụng phân từ chăn nuôi động vật sang nông nghiệp hoặc sử dụng nước bị ô nhiễm để tưới rau cũng có thể lây lan vi khuẩn kháng bệnh cho rau trồng. Từ đó lây lan sang người qua con đường tiêu thụ rau. Do đó, sự hiện diện của vi khuẩn kháng thuốc trong rau ăn sống đã làm dậy lên mối nguy về an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng [28]. Một trong những mối quan tâm liên quan đến kháng kháng sinh trên toàn thế giới là việc phổ biến các vi khuẩn gram âm đặc biệt là Enterobacteriaceae có khả năng kháng với cephalosporin thế hệ thứ 3 (3GCs). Khả năng kháng đối với 3GCs thường do sự sản sinh enzym β-lactamases phổ rộng (ESBLs) hoặc AmpC β-lactamases và thường liên quan đến các vi khuẩn Enterobacteriaceae hiện diện trong phân như Citrobacter spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, và Klebsiella spp. Những vi khuẩn này có thể tồn tại trong đất nông nghiệp thông qua việc sử dụng phân chuồng gia súc hoặc nước mặt bị nhiễm bẩn do tưới tiêu. Vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae thuộc chi Kluyvera, Serratia và Rahnella có trong đất và nước, là dạng vi khuẩn tự nhiên chứa enzym ESBL, là yếu tố quyết định về khả năng kháng 3GC. Trong quá trình canh tác trong đất (thay đổi phân chuồng) và / hoặc khi được tưới bằng nước bị ô nhiễm, rau có thể có thể bị nhiễm vi khuẩn sinh enzym ESBL. Đặc biệt, việc tiêu thụ rau ăn sống có thể dẫn đến việc nhiễm vi khuẩn kháng 3GC và trao đổi gen kháng kháng sinh với vi khuẩn đường ruột trong suốt quá trình tiêu hóa, do đó có thể ảnh hưởng tới sức khoẻ cộng đồng. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về sự hiện diện của vi khuẩn đường ruột trên rau sống và tính kháng kháng sinh của các vi khuẩn này, tuy nhiên chỉ có một số ít vài nghiên cứu tiến hành khảo sát sự hiện diện của Enterobacteriaceae kháng 3GC trên rau [17, 28].
  • 41.   32   1.3.2. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau trên thế giới Theo các báo cáo của nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới thì Enterobacteriaceae thường được tìm thấy phổ biến trong các nguồn sống khác nhau như đất, nước, thực vật và động vật và trong các chuỗi thức ăn. Và rau sống được xem là nguồn chứa các vi khuẩn Enterobacteriaceae. Nghiên cứu tại Hà Lan được thực hiện bởi Hoek và cộng sự, tổng số 1216 rau quả thu được từ các cửa hàng tại Hà Lan trong năm 2012 và 2013 đã được phân tích để xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae, trong đó Rau diếp (n = 137), rau diếp xoăn (n = 96), rau diếp băng (n = 193) đã cho thấy sự hiện diện của nhiều loài vi khuẩn đường ruột như Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter freundii [29]. Trong đó, Enterobacteriaceae kháng 3GC được phát hiện trên 5.2% mẫu rau đã thu thập. Dựa trên môi trường sống và cơ chế kháng 3GC, những vi khuẩn này có thể được chia thành hai nhóm: sinh ra ESBL (Escherichia Coli, Enterobodie spp.), sản sinh AmpC (Citrobacter freundii, Enterobodie spp.). Sự nhiễm bẩn vi khuẩn có khả năng kháng 3GC trong rau lá xanh là 0,6% [29]. Bên cạnh đó, trong những năm gần đây, trái cây tươi và rau quả có liên quan đến nhiều bệnh do thực phẩm bùng phát ở các vùng khác nhau trên thế giới, bao gồm cả ở Canada. Cơ quan Thanh tra Thực phẩm Canada tiến hành khảo sát một loạt các sản phẩm có sẵn trong thị trường Canada (rau địa phương so với rau nhập khẩu, rau hữu cơ so với rau thông thường). 31.329 mẫu được thu thập trên khắp Canada trong bốn năm (2009-2013) bao gồm các loại rau lá (n = 12.073), các loại thảo mộc lá (n = 6.032), hành xanh (n = 3,381), dưa đỏ (n = 3,230), cà chua (n = 4,837) và quả (n = 1,776). Nhìn chung, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriacea trong các loại sản phẩm được nghiên cứu là khoảng 0 - 1,01%, tỉ lệ bắt gặp cao nhất trong các loại thảo mộc lá (0,79-1,30%), tiếp theo là các loại rau lá (0,30 - 0,53%), dưa đỏ (0,07 - 0,36%), hành xanh (0,03 - 0,26%), quả (0 - 0.22%) và cà chua (0 - 0.08%) [30]. Một nghiên cứu khác được thực hiện tại Phần Lan trên các loại rau được bán lẻ tại các cửa hàng gồm các loại rau cho rễ như củ cải, rau mùi tây, cà rốt và rau xanh như xà lách, hẹ, rau diếp băng, rau cần tây, cải bắp cải cho thấy sự xuất hiện của 114 vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae. Sau khi nhận dạng, các vi khuẩn được phân loại như sau: Citrobacter freundii - 21
  • 42.   33   chủng, Enterobacter aerogenes - 41 chủng, Erwinia carotovora - 5 chủng, Escherichia coli - 5 chủng, Hafnia spp. - 30 chủng, Klebsiella spp. - 1 chủng, Proteus vulgaris - 9 chủng, Providencia spp. - 2 chủng, và Serratia marcescens - 1 chủng. Đặc biệt từ mẫu rau diếp là loại rau ăn sống, 22 vi khuẩn đã được phân lập và phân loại vào các chi sau: Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Hafnia spp. và Escherichia coli [31]. Một nghiên cứu khác của Odigie và cộng sự thực hiện vào năm 2015 trên 100 mẫu rau được thu thập từ các thị trường ở Calabar, Nigeria đã phân lập được 105 vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Ba mươi vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae được phân lập từ mẫu đã được rửa bằng nước và giấm, trong đó 75 chủng vi khuẩn đã được thu thập từ các mẫu rau chưa rửa. Các loài vi khuẩn chủ yếu thuộc chi Klebsiella, Proteus và Escherichia [18]. Trong một nghiên cứu của Kim và cộng sự nhằm xác định sự hiện diện của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae sinh enzym và β-lactamase trên rau ăn sống. Tổng cộng 189 mẫu rau (91 rau mầm và 98 mẫu salad trộn) được thu thập tại thị trường bán lẻ ở Hàn Quốc từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 2 năm 2013. Sự phổ biến của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae sinh enzym ESBL là 10,1%, trong đó 94,7% là từ các mẫu rau mầm. Tất cả các chủng vi khuẩn đều kháng với cefotaxime, và nhiều vi khuẩn sinh ESBL cũng kháng với các kháng sinh khác, bao gồm gentamicin, trimethoprim/sulfamethoxazole, và Ciprofloxacin (lần lượt là 73,7%, 63,2% và 26,3%). Enzym β-lactamase TEM-1, SHV-1, -2, -11, -12, -27, -28 và-61, và CTX-M-14, -15 và-55 được phát hiện dưới dạng đơn lẻ hoặc dạng kết hợp. Đây là báo cáo đầu tiên về sự phổ biến về loài Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae sinh enzym ESBL trên rau tại Hàn Quốc. Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng rau ăn sống, đặc biệt là rau mầm, có thể đóng vai trò trong việc phát tán các vi khuẩn sinh ESBL lên người [32]. Bên cạnh đó sự xuất hiện và lan rộng trên toàn thế giới của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae sản xuất enzym carbapenemase là mối quan tâm lớn đối với sức khoẻ cộng đồng. Chuỗi cung ứng thực phẩm ngày càng được quan tâm vì đó có thể là nguồn chứa và phát tán gen kháng kháng sinh.
  • 43.   34   Tuy nhiên rất ít nghiên cứu tập trung vào họ vi khuẩn đường ruột sinh enzym carbapenemase, đặc biệt là trên rau. Từ tháng 1 đến tháng 4 năm 2016, tổng cộng có 87 mẫu rau tươi (rau diếp, cà chua, cà rốt, dưa chuột, bí xanh và rau mùi tây) được mua từ các chợ và cửa hàng ở thành phố Béjaia, Algeria. Trong số 87 mặt hàng thực phẩm được phân tích, 3 (3.4%) chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem thu được từ ba loại rau được mua ở hai cửa hàng khác nhau ở Béjaia, Algeria [33]. Trong nghiên cứu thực hiện tại Thụy Sĩ trên các loại rau được nhập khẩu từ Việt Nam, Zurfluh và cộng sự khi thực hiện nghiên cứu vào năm 2015 đã phát hiện ra các chủng Enterobacteriaceae sinh ESBL. 169 mẫu rau được thu thập để phân tích, trong đó có 20 mẫu rau nhập khẩu từ Việt Nam, bao gồm rau húng, rau canh giới, mồng tơi. Kết quả cho thấy sự hiện diện của 3 loài vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella pneumonie và Enterobacter cloacae sinh ESBL [34]. Trong một nghiên cứu khác của Zurfluh và cộng sự trong năm 2015, trên mẫu rau trộn từ Việt Nam đã phát hiện loài vi khuẩn Klebsiella variicola sinh enzym OXA-181carbapenemase. Tiếp tục nghiên cứu về Enterobacteriaceae trên rau sống được nhập từ châu Á, Năm 2016 Zurfluh đã phát hiện chủng Escherichia coli DH5-alph sinh enzym ESBL đồng thời chứa gen mcr-1 kháng Colistin trên mẫu rau từ Việt Nam . 1.3.3. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau tại Việt Nam Sự lưu hành của Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại Việt Nam có sự thay đổi về tỉ lệ giữa các nghiên cứu giữa các vùng miền khác nhau thuộc các tác giả khác nhau vào từng thời điểm khác nhau, tuy nhiên Enterobacteriaceae vẫn hiện diện với tỉ lệ cao trên các mẫu rau ăn sống đã thu thập, thường lên tới 100%. Kết quả phân tích Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương năm 2011 cho thấy 96 mẫu rau được lấy tại chợ Hoàng Liệt và 118 mẫu lấy từ quận Long Biên (Hà Nội) đều nhiễm vi khuẩn Coliforms và các vi khuẩn gây ra bệnh tiêu chảy (những loại vi khuẩn có trong phân người và gia súc) [35]. Kết quả xét nghiệm nước dùng để tưới rau cho thấy có quá nhiều mầm bệnh, đặc biệt là vi khuẩn Coliforms (nguồn nước tưới chủ yếu là ao chứa nước mưa hoặc nước giếng ở hộ gia đình). Điều này chứng tỏ nguồn nước tưới tiêu đóng
  • 44.   35   vai trò quan trọng, có ảnh hưởng tới việc lan truyền các vi sinh vật gây bệnh. Trong nghiên cứu của Lương Đức Phẩm, trên hầu hết các loại rau cải chứa 106 - 107 tế bào Coliforms/g và phân hữu cơ không sạch mầm bệnh có thể gây ô nhiễm trên đất và cây trồng sau khi được sử dụng, nhất là đối với loại rau ăn thân và ăn lá [36]. Trong khi đó Nghiên cứu thực hiện tại Thành Phố Hồ Chí Minh và khu vực đồng bằng sông Mê Công cũng cho tỉ lệ nhiễm Enterobacteriaceae trong rau ăn sống là cao. Một nghiên cứu khác của đại học Cần Thơ thực hiện năm 2011-2012 (n=25) cho thấy Coliforms và E.coli hiện diện trong các mẫu rau với hàm lượng cao [35]. Gần đây nhất nghiên cứu về Enterobacteriaceae của Ho Le Quynh Chau và cộng sự thực hiện 2013-2014 tại Huế cho thấy 100% (n=108) mẫu rau bán ở chợ nhiễm E. coli [37]. Từ các nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam trong những năm gần đây cho thấy rau ăn sống là một trong các nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và có khả năng lây truyền vi khuẩn kháng lên người. Cùng với sự hiện diện của các loài vi khuẩn gây bệnh, thì con người đã sản xuất và áp dụng nhiều thế hệ kháng sinh vào quá trình chữa trị, tuy nhiên dần dần các vi khuẩn gây bệnh đã thể hiện tính kháng kháng sinh. Bên cạnh đó việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi (gia cầm, thủy hải sản) và sự lây nhiễm vi khuẩn do tiêu thụ thực phẩm vô hình chung đã gây khó khăn cho quá trình điều trị.Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới, kháng kháng sinh đang là thực trạng đáng báo động, đặc biệt là tại các nước đang phát triển, nơi mà quá trình sử dụng kháng sinh không được kiểm soát chặt chẽ. Tuy nhiên cho đến nay có rất ít công bố về sự lưu hành vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống chứa các gen mã hóa enzym β-lactamase có khả năng kháng kháng sinh β-lactam. Đặc biệt hơn, tại Việt Nam chưa có công bố nào về tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau sống được bán tại các quán ăn.
  • 45.   36   CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Thời gian thu thập mẫu được tiến hành vào cuối tháng 8 đến tháng 10 năm 2018. Chín mươi mẫu rau được thu thập tại các chợ, siêu thị và quán ăn phục vụ đồ ăn kèm rau ăn sống trên địa bàn 5 quận nội thành: Cầu Giấy, Nam Từ Liêm, Hà Đông, Long Biên, Hoàng Mai. Rau ăn sống (rau mùi ta, mùi tàu, bạc hà, húng quế, húng láng, ngổ, xà lách, diếp) được thu thập tại các chợ và siêu thị và cửa hàng ăn (xem Hình 2.1 & Hình 2.2). Hình 2.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội Hình 2.2 Rau ăn sống được bày bán tại các chợ và siêu thị Mỗi mẫu rau ăn sống (khối lượng khoảng 0.5 kg) được thu thập, bảo quản trong túi nilon vô trùng và được vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm.
  • 46.   37   Các mẫu rau ăn sống sau đó được bảo quản mẫu tại phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 4o C – 80 C và được phân tích trong ngày hoặc vào ngày hôm sau. Phương pháp lấy mẫu:  Các mẫu rau ăn sống được thu thập ngẫu nhiên tại 5 Quận (theo phụ lục 1): Cầu Giấy, Nam Từ Liêm, Hà Đông, Hoàng Mai, Long Biên.  Thời gian thu thập mẫu: Tháng 8-Tháng 10/2018.  Tại mỗi sạp hàng mỗi loại rau ăn sống chỉ thu thập 1 mẫu. Mẫu sau khi thu thập được tiến hành phân tích tại Khoa Vi sinh vật – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia – Số 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.2.1. Dụng cụ Túi vô trùng (Biomerieux, Pháp) Ống nghiệm thủy tinh vô trùng (Duran, Đức) Que cấy nhựa (Biologix, Mỹ) Pipettman (Effendorf, Đức) Tăm Bông vô trùng (Việt Nam) Đĩa petri (Gosselin, Pháp) Bàn dập kháng sinh (Oxoid, Mỹ) Giấy parafilm (Sigma, Đức) Hộp để chủng (Việt Nam) 2.2.2. Thiết bị Nồi hấp (Hymaraya, Nhật) Tủ sấy (Sanyo, Nhật) Cân kỹ thuật D = 0,1 ML802 (Metter Toledor, Thụy Sĩ) Tủ ấm (Memert, Đức) Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Bio II, Anh) Máy đồng nhất mẫu (Anh)
  • 47.   38   2.2.3. Hóa chất Buffer Peptone water (Merck, Đức) TSA agar (Merck, Đức) VRB (BD, Mỹ) VRBG agar (BD, Mỹ) TBX agar (Oxoid, Mỹ) Mueller Hinton agar (Merck, Đức) Macconkey agar (Sigma, Đức) Khoanh giấy kháng sinh: cefazolin, cefoxitin, cefuroxime, ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime, cefotaxime/calvulanic axit, ceftazidime/clavulanic axit (Liofilchem, Ý) McFaland (BaCl2 – Sigma, Mỹ ; H2SO4 – Merck, Đức) 2.2.4. Chủng chuẩn Sử dụng chủng chuẩn: Escheriachia coli ATCC 25922 Salmonella 572 đã được công bố trong bài báo quốc tế năm 2014 [38] Escherichia coli ATCC 8739 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Ba mươi mẫu rau ăn sống được thu thập tại 5 chợ, mỗi chợ 6 mẫu tại các sạp hàng khác nhau. Thời gian thu thập tháng 8-9/2018; Ba mươi mẫu rau ăn sống được thu thập tại 30 quán bán đồ ăn sẵn có kèm rau ăn sống (quán vịt nướng, quán phở). Thời gian thu thập tháng 8- 9/2018; Ba mươi mẫu rau ăn sống được thu thập tại 8 siêu thị và cửa hàng rau sạch. Thời gian thu thập tháng 8-10/2018. 2.3.1. Chuẩn bị và xử lý mẫu Cân mẫu: Cân 25 g (từ 0.5 kg rau đã được đồng nhất) cho vào túi vô trùng, bổ sung 225 mL đệm peptone.
  • 48.   39   2.3.2. Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae ISO 21528-2:2017: Enterobacteriaceae: Định lượng các loài vi khuẩn Enterobacteriaceae lên men glucose. Các khuẩn lạc đặc trưng có màu hồng đến màu đỏ hoặc đỏ tía (có hoặc không có quầng tủa), lên men glucose và cho phản ứng oxidase âm tính được xác định là Enterobacteriaceae [39]. TCVN 7429-2:2008 (ISO 16649-2:2001): E. coli: các khuẩn lạc màu xanh lục đến xanh lam trên môi trường trypton-mật-glucuronid (TBX) được xem là E. coli [40]. TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2006): Coliform : Định lượng các loài vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea lên men lactose. Các khuẩn lạc đặc trưng là các khuẩn lạc màu đỏ ánh tía có đường kính 0,5 mm hoặc lớn hơn (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh) được xem là khuẩn lạc Coliform điển hình [41]. Cách thức tiến hành: Mẫu sau khi được đồng nhất trong đệm peptone thu được huyền phù 10-1 , hút 1mL từ dịch huyền phù 10-1 cho vào 9mL nước peptone muối thu được dịch pha loãng mẫu 10-2 . Tiến hành các nồng độ pha loãng tiếp theo. Hút 1 mL dịch huyền phù chứa mẫu từ các nồng độ pha loãng, cho vào đĩa petri vô trùng, đổ 15mL thạch VRBG/VRB/TBX. Để đông trong 15 phút. Lật ngược các đĩa, đem nuôi tại nhiệt độ phù hợp: 37o C/24h đối với phép thử định lượng coliform và Enterobacteriaceae; 44o C/24h đối với phép thử định lượng E. coli. Khuẩn lạc màu đỏ tía trên thạch VRB được xem là coliform; Khuẩn lạc màu xanh lục - lam trên thạch TBX được xem là E. coli; Các khuẩn lạc màu hồng – đỏ tía trên thạch VRBG, âm tính oxidase và lên men đường glucose được đếm là Enterobacteriaceae. 2.3.3. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh 2.3.3.1. Thử tính kháng kháng sinh β-lactam Tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae được thử nghiệm bằng các khoanh giấy kháng sinh theo qui trình hướng dẫn của tổ chức Y tế thế giới [42]:
  • 49.   40   Bước 1: Chuẩn bị dung dịch McFaland và tạo dung dịch chủng Enterobacteriaceae: 106 – 108 Bước 2: Sử dụng bông tăm vô trùng dàn dịch chủng Enterobacteriaceae lên đĩa thạch Muller Hinton agar Bước 3: Hong khô ở nhiệt độ phòng và đặt khoanh giấy kháng sinh có chứa kháng sinh (nồng độ và các kháng sinh được thể hiện trong Bảng 2.1) Bước 4: Đo kích thước vòng kháng, đối chiếu với kích thước của chủng đối chiếu (E. coli ATCC 25922) theo hướng dẫn của tổ chức CLSI về chuẩn kháng sinh theo Bảng 2.1 [43]. Bước 5: Đọc kết quả: kháng, nhạy cảm, không kháng. Bảng 2.1 Kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ [43] Kháng sinh Tên viết tắt Nồng độ kháng sinh (µg) Điểm đọc tiêu chuẩn S I R Cephalosporin thế hệ 1 Cefazolin KZ 30 ≥15 - ≤14 Cephalosporin thế hệ 2 cefuroxime cefoxitin CXM FOX 30 30 ≥18 ≥18 15-17 15-17 ≤14 ≤14 Cephalosporin thế hệ 3 ceftriaxone cefotaxime ceftazidime CRO CTX CAZ 30 30 30 ≥23 ≥26 ≥21 20-22 23-25 18-20 ≤19 ≤22 ≤17 Chú thích: S: nhạy cảm; I: Trung gian; R: kháng 2.3.3.2. Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase Phân lập các chủng Enterobacteriacea có khả năng sinh enzym β- lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase, carbapenemase [44]. Các mẫu rau được tăng sinh trong đệm peptone, ủ tại 37o C/24h Ria chuyển lên môi trường Macconkey/ chứa 100 µ/L cefotaxime
  • 50.   41   Các chủng Enterobacteriacea vi khuẩn mọc trên môi trường Macconkey chứa 100 µ/g cefotaxime, được tiến hành xác định trên môi trường đặc trưng cho vi khuẩn Enterobacteriaceae (nhóm lên men đường lactose và nhóm lên men đường glucose) Chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae sẽ được tiến hành xác định sinh enzym β-lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase, carbapenemase trong các thử nghiệm kháng sinh tương ứng với từng loại enzym. Tạo dịch vi khuẩn xác định tính kháng kháng sinh: thực hiện 4 bước tương tự như đã trình bày trong mục 2.4.3.1 Đo kích thước vòng kháng, đối chiếu với kích thước theo hướng dẫn của tổ chức CLSI và EUCAST về chuẩn kháng sinh [43, 45]. Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase phổ rộng Khẳng định sự có mặt của enzym β-lactamase phổ rộng bằng thử nghiệm kháng sinh đồ trên 4 khoanh giấy kháng sinh là cefotaxime (CTX), cefotaxime kết hợp clavulanic axit (CTL), ceftazidime (CAZ) và ceftazidime kết hợp axit clavulanic (CAL). Quá trình thử nghiệm được tiến hành song song cùng với chủng Salmonella 572. Với kích thước vòng kháng CTL và CAL lớn hơn hoặc bằng 5mm so với vòng kháng CTX và/hoặc CAZ thì khẳng định chủng vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng theo hướng dẫn của tổ chức CLSI thể hiện trong Bảng 2.2 [43]. Bảng 2.2 Vi khuẩn sinh enzym ESBL [43] vi khuẩn sinh enzym ESBL Kháng sinh Khẳng định cefotaxime (CTX), CTX và clavulanic axit (CTL, 40µg) vòng kháng CTL, CAL ≥5mm so với vòng kháng CTX, CAZ ceftazidime (CAZ), CAZ và clavulanic axit (CAL, 40µg)
  • 51.   42   Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym AmpC β-lactamase Khẳng định sự có mặt của enzym AmpC β-lactamase bằng thử nghiệm kháng sinh đồ trên 4 khoanh giấy kháng sinh là cefotaxime (CTX), cefotaxime kết hợp cloxacillin (CTC), ceftazidime (CAZ) và ceftazidime kết hợp cloxacillin (CAC). Quá trình thử nghiệm được tiến hành song song cùng với chủng Salmonella 572. Với kích thước vòng kháng CTC và CAC lớn hơn hoặc bằng 5mm so với vòng kháng CTX và CAZ thì khẳng định chủng vi khuẩn sinh AmpC β-lactamase theo hướng dẫn của CLSI thể hiện trong Bảng 2.3 [43]. Bảng 2.3 Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase [43] Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase Kháng sinh Khẳng định cefotaxime (CTX), CTX và cloxacillin (CTC) vòng kháng CTL, CAL ≥5mm so với vòng kháng CTX, CAZ ceftazidime (CAZ), CAZ và cloxacillin (CAC) Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym carbapenemase Khẳng định sự có mặt của enzym carbapenemase bằng thử nghiệm kháng sinh đồ trên 5 khoanh giấy kháng sinh là meropenem (MRP), meropenem + phenylboronic axit (MR+BO), meropenem + cloxacillin (MR+CL), meropenem + EDTA (MR+ED) và temocillin (TMO). Chủng sinh enzym carbapenemase được khẳng định theo hướng dẫn của EUCAST thể hiện trong Bảng 2.4 [45]. Bảng 2.4 Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym carbapenemase [45] Kích thước vòng kháng của Meropenem và các kháng sinh khác phenylboronic axit (MR+BO) EDTA (MR+ED) cloxacillin (MR+CL) temocillin (TMO) β- lactamases ≥4 mm < 5 mm < 5 mm --- KPC < 4 mm ≥5 mm < 5 mm --- MBL ≥4 mm < 5 mm ≥5 mm --- AmpC < 4 mm < 11 mm OXA < 5 mm < 5 mm <11 OXA -48
  • 52.   43   Đọc kết quả: vi khuẩn sinh hay không sinh enzym β-lactamase, AmpC β-lactamase, carbapenemase. 2.3.4. Kỹ thuật MALDI – TOF định danh vi sinh vật Thiết bị VITEK MS là máy đo khối phổ MALDI-TOF sử dụng kỹ thuật MALDI (Kỹ thuật ion hóa theo cơ chế giải hấp phụ sử dụng nguồn laser với sự trợ giúp của chất nền), dựa trên sử dụng công nghệ khối phổ protein. VITEK® MS là hệ thống định danh vi khuẩn tự động, tiên tiến, sử dụng công nghệ MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of- Flight) định danh các loài vi khuẩn được thực hiện bằng ghi nhận các dải quang phổ và phân tích các dải quang phổ với cơ sở dữ liệu của VITEK® MS (xem Hình 2.3). So sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu của gần 6000 loài vi sinh vật khác nhau. MALDI-TOF MS cho kết quả nhanh trong vài phút cho 1 mẫu, yêu cầu thể tích mẫu ít và chi phí hóa chất thấp và cho kết quả thu được là loài vi sinh vật được xác định. Hình 2.3 Nguyên lý cơ bản định danh vi khuẩn dựa trên VITEK MS  Các bước tiến hành định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật MALDI TOF trên thiết bị VITEK MS theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị [46]. Bước 1: vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA ở 37o C/24h
  • 53.   44   Bước 2: Vi khuẩn được phết lên từng giếng của khay Bước 3: Nhỏ 0.1 µL dung dịch CHCA Bước 4: Quét mã khay, nhập mã mẫu vào phần mềm Malditof preparation Bước 5: Chạy máy Bước 6: Đăng nhập phần mềm Myla, đọc kết quả 2.3.5. Phương pháp xác định gen kháng kháng sinh Xác định gen mã hóa enzym β-lactamase bằng kỹ thuật PCR dựa trên độ dài đoạn gen khuếch đại. Thu ADN mẫu bằng xử lý nhiệt 100o C/15’. Ly tâm 13000v/4’. Thu dịch nổi. Sử dụng các cặp mồi đã được công bố bởi tác giả Li và cộng sự vào năm 2013 [47]. Tiến hành phản ứng PCR với các trình tự mồi theo Bảng 2.5
  • 54.   45   Bảng 2.5 Trình tự mồi của gen mã hóa enzym β-lactamase [47] TT Gen kháng Trình tự mồi (5’-3’) Đoạn khuếch đại (bp) 1. blaTEM CAGCGGTAAGATCCTTGAGA TTCATCCATAGTTGCCTGACT 661 2. blaCMY-2 ACAGAACAACAGATTGCCGATA TGTCGCTGCCGTTGATGA 856 3. blaSHV TTCGCCTGTGTATTATCTCC TTTGCTGATTTCGCTCGG 807 4. blaOXA ACCAGATTCAACTTTCAA TCTTGGCTTTTATGCTTG 590 5. blaPSE GCTCGTATAGGTGTTTCCGTTT CGATCCGCAATGTTCCATCC 575 6. BlaDHA GCCGTCTCCGTAAAGGGTAAGC GCCAGAATCACAATCGCCACCT 926 7. Bla CTX- M CGATGTGCAGTACCAGTAA AGTGACCAGAATCAGCGG  585 Chu trình phản ứng PCR: Biến tính DNA: 94°C/5 phút; 30 chu kỳ: Biến tính DNA 94°C/30s, gắn mồi 55°C/30s; kéo dài chuỗi 72°C/50s; và giai đoạn ổn định 72 °C/7 phút. Chạy điện di với gel 1.5%, chụp gel Sản phẩm PCR đại diện cho mỗi gen được tiến hành tinh sạch và giải trình tự để xác định sự chính xác của sản phẩm. Trình tự ADN của mỗi gen được tiến hành so sánh với dữ liệu của ngân hàng gen Mỹ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Các chủng Enterobacteriaceae mang gen đặc trưng sau đó được sử dụng làm đối chứng dương cho phản ứng PCR xác định gen đích. 2.4. CHỦNG ĐỐI CHỨNG Phát hiện Enterobacteriaceae trên rau, sử dụng chủng E. coli ATCC 25922.
  • 55.   46   Định danh vi khuẩn, sử dụng chủng E. coli ATCC 8739 Phân tích kháng sinh: sử dụng chủng Salmonella 572, được phân lập từ năm 2012 và công bố trên tạp chí Journal of Food Protection [38]. 2.6. XỬ LÝ KẾT QUẢ Số liệu được nhập vào bảng Excel và được phân tích bằng sử dụng phần mềm STATA 11.0 (StataCorp, College, TX, USA) với các biến là địa điểm thu thập mẫu và các thời điểm thu thập mẫu. Giá trị P<0.05 được sử dụng để đánh giá sự khác biệt về mặt thống kê giữa các biến. Các phép tính thống kê về sự ô nhiễm Enterobacteriaceae trên rau ăn sống theo các loại hình kinh doanh được tiến hành theo phương pháp phân tích bảng với mỗi biến nghiên cứu được kiểm tra bằng 2xn chi square trong Stata.
  • 56.   47   CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU SỐNG 3.1.1. Đánh giá tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau sống Chín mươi mẫu rau sống được thu thập tại 03 loại hình kinh doanh là các chợ, quán bán đồ ăn có kèm rau ăn sống, và siêu thị thuộc 5 Quận nội thành Hà Nội (Phụ lục 1) (n=30 đối với mỗi loại hình kinh doanh) và tiến hành phân tích phát hiện và định lượng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae gồm Coliform (nhóm vi khuẩn Enterobacteriacea lên men lactose), Enterobacteriaceae (nhóm vi khuẩn Enterobacteriacea lên men glucose) và Escherichia coli với tỉ lệ dương tính tương ứng là 100% (90 mẫu, n=90), 100% (90 mẫu, n=90), 86% (77 mẫu, n=90). Kết quả phân tích của nghiên cứu này tương đồng với các kết quả được thực hiện tại Long Biên và Hoàng Mai năm 2011 của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương với 100% mẫu rau nhiễm Coliform (n=204) [35]. Kết quả này cũng tương đương với phát hiện Coliform trên rau trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự thực hiện tại Cần Thơ năm 2011-2012 (n=25) và nghiên cứu của Ho Le Quynh Chau và cộng sự thực hiện tại Huế năm 2013-2014 (n=108) [35], [37]. Mức nhiễm E. coli là 100% trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thu Hà và Ho Le Quynh Chau, cao hơn kết quả nghiên cứu của chúng tôi do có sự khác biệt trong thiết kế thí nghiệm từ địa điểm lấy mẫu đến số lượng mẫu. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sự tương đồng về sự hiện diện của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae với các nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới, tuy khác nhau về tỉ lệ nhiễm. Nghiên cứu của Ljevaković- Musladin và cộng sự thực hiện thu thập 243 mẫu rau ăn sống tại khách sạn, nhà hàng và các cửa hàng bán lẻ từ năm 2011-2018 tại Croatia cho thấy có 39,5% mẫu nhiễm Enterobacteriaceae [48]. Một nghiên cứu khác được thực hiện tại Ấn Độ bởi Al-Kharousi và cộng sự trong năm 2014 cho thấy tỉ lệ nhiễm Enterobacteriaceae trong rau là 91% và E. coli là 22% [49].