Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu sự tạo mô sẹo và khả năng tạo dịch treo tế bào từ giống lúa một bụi đỏ (oryza sativa l.), cho các bạn tham khảo

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Bùi Trọng Duy
NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ
KHẢ NĂNG TẠO DỊCH TREO TẾ
BÀO TỪ GIỐNG LÚA MỘT BỤI ĐỎ
(ORYZA SATIVA L.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh - 2013

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Bùi Trọng Duy
NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ
KHẢ NĂNG TẠO DỊCH TREO TẾ
BÀO TỪ GIỐNG LÚA MỘT BỤI ĐỎ
(ORYZA SATIVA L.)
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. BÙI TRANG VIỆT
TS. LÊ THỊ TRUNG
Thành phố Hồ Chí Minh - 2013

3. 1
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận văn
Ký tên
Bùi Trọng Duy

4. 2
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
• Thầy PGS. TS. Bùi Trang Việt, người thầy đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi
trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này.
• Cô TS. Lê Thị Trung, người thầy đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn, động viên
giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn.
• Cô TS. Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS. Nguyễn Thị Mong, cô TS. Trần Thanh
Hương, thầy PGS. TS. Bùi Văn Lệ, thầy TS. Đỗ Minh Sĩ, cô TS. Trần Lê Bảo Hà,
thầy TS. Chung Anh Dũng và cô PGS. TS. BS. Vũ Thị Nhung.
• Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa Sinh học và Bộ môn Sinh lý
Thực vật Trường ĐH Sư Phạm Tp. HCM, Quý thầy cô Tổ Bộ môn Sinh lý Thực vật
Trường ĐH KHTN – ĐH Quốc gia Tp. HCM đã tạo điều kiện cho thuận lợi cho tôi
trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm, học tập và làm luận văn.
• Quý Thầy, Cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp ý kiến cho luận
văn của tôi.
• Em Hồ Thị Mỹ Linh, bạn Nguyễn Thị Thanh Phượng đã đồng hành, chia sẻ, đóng
góp ý kiến giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và làm đề tài.
• Các Cô, Chú làm việc tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tặng
vật liệu giống lúa Một Bụi Đỏ để thực hiện đề tài.
• Cuối cùng cảm ơn Vợ và Con trai đã luôn bên cạnh ủng hộ động viên và cùng chia
sẻ các khó khăn trong hành trình vất vả vừa qua.
Bùi Trọng Duy

5. 3
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 2
MỤC LỤC .................................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT......................................................................... 5
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 6
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................... 7
1.1. Sơ lược về cây lúa ........................................................................................................7
1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................................7
1.1.2. Đặc điểm hình thái và sinh học của cây lúa............................................................7
1.1.3. Đặc điểm nông học của giống lúa Một Bụi Đỏ ......................................................9
1.2. Nuôi cấy tế bào.............................................................................................................9
1.2.1. Lược sử nuôi cấy tế bào..........................................................................................9
1.2.2. Nuôi cấy mô và tế bào ..........................................................................................10
1.2.3. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ..............................................11
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 15
2.1. Vật liệu........................................................................................................................15
2.1.1. Vật liệu dùng trong nuôi cấy.................................................................................15
2.1.2. Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm ...................................................................15
2.2. Phương pháp ..............................................................................................................15
2.2.1. Khảo sát sự tạo mô sẹo từ hạt ...............................................................................15
2.2.2. Khảo sát sự tăng trưởng kích thước mô sẹo .........................................................15
2.2.3. Khảo sát sự tăng trọng lượng tươi mô sẹo............................................................16
2.2.4. Khảo sát sự sinh cơ quan từ mô sẹo .....................................................................16
2.2.5. Bước đầu tạo dịch treo tế bào ...............................................................................16
2.2.6. Quan sát các biến đổi hình thái học, giải phẫu học ..............................................17
2.2.7. Đo cường độ hô hấp của mô sẹo...........................................................................18
2.2.8. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ............................................18
2.2.9. Xử lý thống kê ......................................................................................................22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 23
3.1. Kết quả........................................................................................................................23
3.1.1. Khảo sát sự tạo mô sẹo từ hạt ...............................................................................23

6. 4
3.1.2. Khảo sát kích thước mô sẹo..................................................................................31
3.1.3. Khảo sát trọng lượng tươi của mô sẹo..................................................................31
3.1.4. Cường độ hô hấp của mô sẹo................................................................................32
3.1.5. Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của mô sẹo ................32
3.1.6. Quan sát giải phẫu hình thái mô sẹo.....................................................................33
3.1.7. Khả năng phát sinh cơ quan từ mô sẹo.................................................................44
3.1.8. Bước đầu tạo dịch treo tế bào ...............................................................................53
3.2. Thảo luận....................................................................................................................63
3.2.1. Sự tạo mô sẹo từ hạt..............................................................................................63
3.2.2. Khả năng sinh cơ quan từ mô sẹo.........................................................................66
3.2.3. Bước đầu tạo dịch treo tế bào ...............................................................................70
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 71
4.1. Kết luận.......................................................................................................................71
4.2. Đề nghị........................................................................................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 72
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 78

7. 5
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4 - D : Acid 2,4 - dichlorophenoxyacetic
ABA : Acid Abscisic
AIA : Acid indol acetic
BA : N6
- Benzyladenine
GA3 : Giberelic acid
NAA : Naphtalene acetic acid
SAM : Shoot apical meristem
FAA : Formaldehyde – acetic acid – ethanol
MS : Murashige và Skoog
TDZ : Thidiazuron

8. 6
MỞ ĐẦU
Sự tạo mô sẹo rất quan trọng để có vật liệu dùng trong các công trình nghiên cứu cải
tiến di truyền ở lúa (Libin và cs., 2012). Ở lúa, kiểu gen, loại và tuổi mô cấy và nồng độ
auxin tổng hợp có ảnh hưởng quan trọng trong sự hình thành mô sẹo và sự tạo phôi soma từ
mô sẹo (Roy và cs., 2012).
Vật liệu nuôi cấy để tạo mô sẹo và dịch treo tế bào luôn được các nhà nghiên cứu
quan tâm. Hạt lúa trưởng thành thường được dùng để tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ mô
sẹo và, sau đó, phôi soma được tạo từ mô sẹo hay dịch treo tế bào (Nguyễn Trần Đông
Phương, 2006).
Cùng với hạt lúa trưởng thành (chứa phôi hợp tử trưởng thành), khúc cắt chứa mô
phân sinh ngọn chồi (SAM), nguồn tế bào cho sự hình thành cơ quan trong suốt quá trình
phát triển hậu phôi của thực vật, và lớp tế bào thuẫn (scutellum) cũng được dùng để tạo mô
sẹo (Joyia và Khan, 2012; Wagiran, 2008). Ở cây chuối, vật liệu cụm chồi tăng sinh cao
(CHP, cultures hautement proliférantes) giúp tạo dịch treo tế bào trực tiếp, không qua giai
đoạn tạo mô sẹo trên môi trường rắn (Trần Thanh Hương, 2011) rất được chú ý để có các
dịch treo tế bào có khả năng sinh phôi.
Giống Một Bụi Đỏ là loại lúa mùa, chịu ảnh hưởng của quang kỳ, đặc sản của huyện
Hồng Dân tỉnh Bạc Liêu. Giống lúa này có năng suất cao, ngoại hình đẹp, ít sâu bệnh,
chống chịu được điều kiện khô hạn, phèn hay mặn (Nguyễn Hữu Hiệp và Trần Văn Chiêu,
2009). Với mục đích đóng góp thêm cho sự chọn lựa vật liệu trong các hệ thống nuôi cấy
tế bào lúa, đề tài “NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG TẠO DỊCH TREO
TẾ BÀO TỪ GIỐNG LÚA MỘT BỤI ĐỎ (ORYZA SATIVA L.)” được thực hiện.

9. 7
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về cây lúa
1.1.1. Vị trí phân loại
Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan)
Lớp: Liliopsida (lớp Hành)
Phân lớp: Liliidae (Hành)
Bộ: Poales (Lúa)
Họ: Poaceae (Lúa)
Loài: Oryza sativa L.
(Võ Văn Chi, 2007).
Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới ẩm của Châu Phi, Nam và
Đông Nam Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung Mỹ và một phần Úc Châu. Trong đó, chỉ có
hai loại lúa trồng Cây lúa thuộc loài Lúa trồng Oryza sativa L. và Oryza glaberrima Steud.,
lại là lúa hằng niên và lúa đa niên. Loài lúa quan trọng nhất, thích nghi rộng rãi và chiếm đại
bộ phận diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L.. Loài Oryza glaberrima Steud. chỉ được
trồng giới hạn ở một số quốc gia Tây Phi và hiện nay đang bị thay thế dần bởi Oryza sativa
L. (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
1.1.2. Đặc điểm hình thái và sinh học của cây lúa
1.1.2.1. Hạt lúa
Theo Nguyễn Ngọc Đệ (2008) hạt lúa là một quả. Hoa lúa sau khi thụ phấn, thụ tinh
phát triển và hình thành nên hạt lúa. Quả lúa gồm vỏ trấu và hạt gạo. Hạt gạo gồm hai
phần: nội nhũ và phôi. Nội nhũ chiếm phần lớn hạt gạo, chứa chất dự trữ, chủ yếu là tinh
bột. Bên ngoài hạt gạo được bao bọc bởi một lớp vỏ lụa mỏng chứa nhiều vitamin nhóm B.
Phần phôi hay mầm nằm góc dưới hạt gạo, chỗ phía cuống hạt thóc, khi nảy mầm phát triển
thành mầm và rễ.
Trong hạt lúa trưởng thành, phôi gồm trục phôi và lớp thuẫn (scutellum). Lớp thuẫn
được gắn vào trục phôi và được xem là lá mầm duy nhất trong phôi cây một lá mầm. Trục

10. 8
phôi là nơi bắt nguồn của rễ, thân, lá của cây mới. Lớp thuẫn nằm giữa trục phôi và nội nhũ,
có vai trò cung cấp nguồn năng lượng nhanh để hỗ trợ cho quá trình phát triển cây mầm ,
giúp cho sự vận chuyển các sản phẩm thủy phân từ nội nhũ đến trục phôi, nội nhũ cung cấp
nguồn năng lượng cho các giai đoạn phát triển sau (Hédia, 2012).
1.1.2.2. Mầm lúa
Hạt có hai đặc điểm nổi bật là tiềm sinh và chứa chất dự trữ. Ở trạng thái tiềm sinh
hàm lượng nước của hạt rất thấp (chiếm 10 % chất khô), mọi hoạt động sống ở mức tối
thiểu (giúp hạt kháng với các điều kiện bất lợi). Hạt chứa các chất dự trữ trong phôi nhũ hay
từ tử diệp là nguồn chất dinh dưỡng cho phôi lúc nảy mầm, trong khi chờ phôi tự dưỡng
(Bùi Trang Việt, 2008).
Nảy mầm là một giai đoạn của chu kỳ sống thực vật, lúc đó phôi từ trạng thái nghỉ
ngơi bắt đầu sản xuất rễ chức năng và chồi. Nảy mầm được bắt đầu từ khi hạt hấp thụ đủ
nước. Chất dự trữ trong nội nhũ được thủy phân bởi các enzyme để hỗ trợ cho sự phát triển
sớm của phôi. Sự nảy mầm được hoàn thành với sự kéo dài của trục phôi dẫn đến sự phá vỡ
bao rễ mầm (coleozhiza) (Hédia, 2012).
1.1.2.3. Rễ lúa
Bộ rễ lúa gồm nhiều rễ gọi là rễ chùm. Rễ đầu tiên mọc ra từ hạt lúa gọi là rễ mầm,
thường chỉ có một rễ. Rễ mầm không ăn sâu, ít phân nhánh, chỉ có lông ngắn thường dài
khoảng 10 - 15cm. Rễ mầm hút nước cung cấp cho phôi phát triển trong thời gian đầu rồi
sau đó chết đi. Các rễ phụ sau này mọc ra hợp thành một bộ rễ. Đối với rễ chính từ rễ mầm
cũng như rễ thứ cấp phân nhánh từ các rễ chính, sự tăng trưởng theo chiều dài được thực
hiện nhờ mô phân sinh ngọn nằm dưới chóp rễ (Bùi Trang Việt, 1998).
1.1.2.4. Thân lúa
Thân lúa có nhiệm vụ giúp cây đứng vững, tích lũy và vận chuyển các chất trong cây.
Cây lúa có thân giả và thân thật. Thân giả do các bẹ lá kết lại với nhau bao lấy thân thật.
Thân thật gồm các lóng nối tiếp nhau qua các đốt, phần cuối của thân là bông lúa (Đinh Văn
Lữ, 1978).

11. 9
1.1.2.5. Lá lúa
Lúa là cây đơn tử diệp. Lá lúa mọc hai bên thân lúa, lá ra sau nằm về phía đối diện với
lá trước đó. Lá cuối cùng (lá trước khi trổ bông) gọi là lá cờ hay lá đòng. Lá lúa gồm phiến
lá, cổ lá, bẹ lá (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
1.1.3. Đặc điểm nông học của giống lúa Một Bụi Đỏ
Giống Một Bụi Đỏ là loại lúa mùa, chịu ảnh hưởng của quang kỳ, đặc sản của huyện
Hồng Dân tỉnh Bạc Liêu. Giống lúa này có chiều cao cây trung bình 73,2 cm, khả năng nở
bụi tốt (trung bình 35 chồi/bụi), cứng cây, ngoại hình đẹp, ít sâu bệnh, chống chịu được điều
kiện khô hạn, phèn hay mặn, có chu kỳ sống 180 ngày, năng suất 4,4 tấn/ha (Nguyễn Hữu
Hiệp và Trần Văn Chiêu, 2009).
1.2. Nuôi cấy tế bào
1.2.1. Lược sử nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy mô thực vật hay nuôi cấy tế bào trong điều kiện vô trùng là một công cụ
quan trọng trong nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng. Cơ sở lý thuyết của nuôi cấy mô
thực vật được đề xuất bởi Gottlieb Haberlandt trong bài viết của ông cho Viện Hàn lâm
Khoa học Đức vào năm 1902, ông là người nêu ra khái niệm về tính toàn năng và chỉ ra
rằng các kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là một phương pháp thực nghiệm mới cho phép
nghiên cứu các vấn đề quan trọng (Thorpe, 2007).
Giai đoạn từ 1940 đến 1960 là giai đoạn phát triển chủ yếu của hầu hết kỹ thuật nuôi
cấy mô ngày nay. Sau đó, Miller và Skoog phát hiện tỷ lệ của auxin/kinetin cao thích hợp
cho tạo rễ, ngược lại dẫn đến sự hình thành chồi, và ở mức trung bình giúp mô sẹo gia tăng
(Thorpe, 2007).
Trong những năm 1990 và sau đó, công nghệ in vitro tiếp tục mở rộng cho ngày càng
nhiều các loài thực vật, bao gồm ngũ cốc và cỏ (Vasil và Vasil, 1994), các loại đậu (Davey
và cs., 1994), rau (Reynolds, 1994), khoai tây (Jone, 1994), củ và cây có củ khác (Krikorian,
1994).

12. 10
1.2.2. Nuôi cấy mô và tế bào
1.2.2.1. Sự tạo mô sẹo
Mô sẹo là đám tế bào không biệt hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra
do sự xáo trộn trong quá trình sinh cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ. Do đó, cây non (nguyên
vẹn hay cắt đoạn) hay những mảnh thân non của cây trưởng thành (đang trong quá trình tạo
các mô và cơ quan) dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro dưới tác động của một
auxin mạnh (như 2,4 - D) được áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin. Mô sẹo chính
là nguồn vật liệu lý tưởng cho các nghiên cứu về phát sinh phôi soma gián tiếp qua mô sẹo
hoặc sử dụng mô sẹo để thu hợp chất thứ cấp hay dùng làm nguyên liệu để nuôi cấy dịch
treo tế bào (Bùi Trang Việt, 2000). Các loại mô của lúa (hạt, rễ, chồi, bao phấn) trong nuôi
cấy in vitro khi xử lý auxin là yếu tố quyết định sự biệt hóa và phản biệt hóa (Nishi, 1973).
1.2.2.2. Sự tạo dịch treo tế bào
Dịch treo tế bào là dịch chứa các tế bào cô lập và các nhóm nhỏ tế bào phân tán và
tăng trưởng trong một môi trường lỏng di động. Dịch treo tế bào được khởi phát bằng cách
đặt mô sẹo (được tạo trên môi trường đặc) vào môi trường lỏng được lắc 30 - 150
vòng/phút, tuy nhiên cũng có thể từ cây con, phôi hay vùng mô phân sinh ngọn. Giống như
đối với mô sẹo, môi trường dịch treo tế bào có một hay vài auxin (thường ở nồng độ thấp
hơn) có kết hợp với citokinin hay không (Bùi Trang Việt, 2000).
Trong dịch nuôi cấy tế bào, tế bào phát sinh phôi là những tế bào nhỏ tròn, vách tế bào
mỏng, tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ gồm nhiều túi nhỏ chứa tinh bột (Vasil và cs.,
1980). Các giai đoạn của sự tăng sinh trong nuôi cấy dịch treo được nghiên cứu bởi Valdez
(1997). Ohira và cs. (1973) lập ra công thức cho môi trường dinh dưỡng lỏng đơn giản để
nuôi cấy tế bào lúa. Wagiran (2008) nuôi cấy thuẫn trong môi trường lỏng và kết luận rằng
sự tạo mô sẹo phụ thuộc vào kiểu gen.
Sự tăng trưởng của dịch treo tế bào được đo bởi số tế bào, khối lượng hay thể tích tế
bào. Đường cong tăng trưởng của dịch treo tế bào có dạng hình chữ S bình thường. Sau một
thời gian nuôi cấy, dịch treo tế bào là một hỗn hợp gồm các tế bào đơn, các cụm tế bào với
kích thước khác nhau, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. Mức độ tách rời tế
bào tùy thuộc nguồn gốc mô sẹo, quá trình nuôi cấy mô sẹo, hàm lượng các chất điều hòa

13. 11
tăng trưởng thực vật trong mô và trong môi trường, và các thành phần khác của môi trường
(Bùi Trang Việt, 2000).
1.2.3. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Phytohormone chiếm vị trí trung tâm trong việc điều tiết tăng trưởng và biệt hóa tế
bào. Tương tự với kích thích tố ở động vật, phytohormone là chất được sản xuất trong một
số mô ở các giai đoạn phát triển nhất định của thực vật, và sau đó được phân phối bởi hệ
thống mạch dẫn, thường thực hiện chức năng tại các mô từ xa ở nồng độ rất thấp. Trên thực
tế, phytohormone là một loại tín hiệu phối hợp sự tăng trưởng và phát triển thực vật. Ở thực
vật, hoạt động của phytohormone thường liên quan đến trạng thái sinh lý hoặc vị trí của mô
đích. Bình thường, một phản ứng cụ thể được gây ra bởi một số phytohormone, và một
phytohormone có thể gây ra nhiều phản ứng (Neuman và cs., 2009).
1.2.3.1. Auxin
Trong nuôi cấy mô lúa, tỷ lệ auxin/cytokinin cao thường được sử dụng để bắt đầu
quá trình tạo mô sẹo, trong khi tỷ lệ thấp được sử dụng cho sự tái sinh của cây con. Chất
điều hòa tăng trưởng thực vật có chức năng làm trung gian truyền dòng tín hiệu dẫn đến tái
lập trình của sự biểu hiện của gen của phôi (Rafique và cs., 2011). Sự tương tác giữa auxin
và cytokinin đặc biệt quan trọng để kiểm soát vài quá trình phát triển, như sự hình thành và
duy trì các mô phân sinh cần thiết để tạo nên cơ thể thực vật (Su và cs., 2011).
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của auxin tùy thuộc vào
nồng độ và sự tương tác với các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác. Một số hoạt động
chính của auxin là kích thích mạnh sự kéo dài ở tế bào ngọn chồi, sự phân chia tế bào tượng
tầng nhưng hầu như không tác động lên mô phân sinh sơ cấp (Bùi Trang Việt, 1998).
Sự duy trì nồng độ auxin tối ưu của tế bào có thể được kiểm soát ở nhiều cấp độ: sinh
tổng hợp, vận chuyển, nhận biết, và truyền tín hiệu. Cho đến nay, quá trình sinh tổng hợp
auxin được nghiên cứu ở Arabidopsis gồm một con đường độc lập với tryptophan và bốn
con đường phụ thuộc tryptophan (Zhao và cs., 2010). Sự vận chuyển hữu cực của auxin
hướng dòng chảy auxin và hình thành gradient auxin ở thực vật cần cho sự hình thành và
phát triển mô (Su và cs., 2011).
Auxin nhân tạo 2,4 - D là chất quan trọng để bắt đầu và duy trì sự tăng trưởng của
mô sẹo có khả năng sinh phôi ở lúa (Rafique và cs., 2011). Nghiên cứu của Yinxia và cs.
(2012) trên giống lúa Kra Dang Ngah cho rằng, nếu trong môi trường nuôi cấy không bổ

14. 12
sung auxin, thì mô sẹo không thể hình thành, và nồng độ tối ưu của 2,4 - D cần cho sự cảm
ứng mô sẹo thay đổi tùy vào mẫu cấy và kiểu gen lúa. Nếu tăng nồng độ 2,4 - D khi nuôi
cấy sẽ giảm tỷ lệ hóa nâu của mô sẹo và làm tăng tần số cảm ứng mô sẹo, tuy nhiên xử lý
này làm giảm tỷ lệ tái sinh cây con, ức chế khả năng sinh phôi của mô sẹo. Như vậy, nồng
độ auxin, loại và kiểu gen của mô cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự khởi đầu và hình
thành mô sẹo (Roy và cs., 2012). Nếu chỉ sử dụng 2,4 - D để cấy chuyền thì tỷ lệ hóa nâu
mô sẹo ngày càng cao. Sự kết hợp hai loại auxin với nồng độ thích hợp cải thiện khả năng
cảm ứng mô sẹo và tăng cường tỷ lệ tái sinh cây con (Yinxia và cs., 2012).
Để cảm ứng tạo mô sẹo ở lúa, 2,4 - D được dùng riêng rẽ hoặc phối hợp với một loại
auxin khác (Nguyễn Đức Lượng, 2001). Khi nuôi cấy mô sẹo lúa trong môi trường kết hợp
2,4 - D và NAA thì mô sẹo tăng trưởng ở mức cao hơn so với môi trường chỉ có 2,4 - D.
Hơn nữa, sự kết hợp này làm xuất hiện trên bề mặt mô sẹo các nốt hình cầu đường kính
khoảng 1 mm (Rahman và cs., 2010; Shahsavari và cs., 2010).
Ở nồng độ cao auxin cần thiết cho sự sinh phôi, nhưng dư lượng auxin trong các tế
bào phôi lại ức chế sự tái sinh cây con. Sau bốn tuần nuôi cấy hạt lúa trưởng thành với 2,4 -
D, mô sẹo có khả năng sinh phôi thường có màu vàng hơi trắng, nhỏ, gọn và thường có
nhiều nốt, còn loại mô sẹo không có khả năng sinh phôi thường mềm, vàng hơi nâu và
không có nốt (Hoque và cs., 2007). Nuôi cấy hạt ở nồng độ 2,4 - D thấp thì hạt nảy mầm
sinh rễ và chồi trong 3 ngày đầu, nếu tăng dần nồng độ 2,4 - D thì sự nảy mầm bị ức chế và
tần số mô sẹo tăng lên (Al-khayri và cs., 1996).
Auxin tác động lên DNA, làm cho các tế bào đã chuyên hóa trở về trạng thái phản
biệt hóa và có thể phân chia (LoSchiavo và cs., 1989). Các tế bào mô sẹo này sau đó lại có
thể phát sinh hình thái (tái sinh) hoặc tạo phôi (Terzi và LoSchiavo, 1990). Meneses và cs.
(2005) cho rằng 2,4 - D tạo ra sự methyl hóa DNA và duy trì sự phân bào ở mức độ cao.
1.2.3.2. Cytokinin
Cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng cũng có sự đối kháng giữa auxin
(giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi). Sự cân bằng giữa hai kiểu hormone này là
một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển (Bùi Trang Việt, 2000). Các cytokinin nội
sinh có thể được vận chuyển hướng ngọn trong xylem, vào các chồi nách và thúc đẩy sự
tăng trưởng nhanh của chúng. Do đó, cytokinin có tính đối kháng với auxin trong hiện
tượng trội đỉnh. Cytokinin được tổng hợp trên toàn bộ cây, và các adenosine phosphate
isopentenyltransferase (IPTS) là enzyme xúc tác cho bước đầu tiên của quá trình tổng hợp

15. 13
cytokinin. Thí nghiệm ở Pisum sativum cho thấy các gen sinh tổng hợp cytokinin
ISOPENTENYLTRANSFERASE1 (PsIPT1) và ISOPENTENYLTRANSFERASE2 (PsIPT2)
biểu hiện trong các mấu thân, rất nhanh sau 3 giờ ngắt ngọn (Müller và Leyser, 2011). Tác
động qua lại giữa auxin và cytokinin có vai trò điều hòa quá trình tạo mô phân sinh ở giai
đoạn sớm của quá trình sinh phôi và sự phát triển của mô phân sinh chồi (Su và cs., 2011).
Trong các mô phân sinh chồi, cytokinin thúc đẩy sự tăng sinh tế bào gốc và ức chế sự
phân hóa tế bào gốc, trong khi auxin kích hoạt sự hình thành sơ khởi cơ quan (primordium)
do ức chế sinh tổng hợp cytokinin. Cytokinin kích hoạt gen WUS biểu hiện trong mô sẹo, và
sự cảm ứng tái sinh chồi xảy ra khi WUS biểu hiện đủ (Gordon và cs., 2009). Gen
WUSCHEL có chức năng duy trì trạng thái đa năng của các tế bào trong trung tâm tổ chức
và xác định các tế bào gốc (Trần Thanh Hương, 2011).
Buechel và cs. (2009) thấy rằng sự biểu hiện quá mức của ARR7 và ARR15 ngăn
chặn tái sinh chồi. Xử lý auxin ngoại sinh kích hoạt các quá trình sinh cơ quan, đi kèm với
việc sản xuất các cytokinin nội sinh (Pernisova' và cs., 2009). Tỷ lệ cytokinin/auxin tác
động trên gen WUS trong sự hình thành cụm hoa từ mẫu cấy nhụy hoa Arabidopsis (Cheng
và cs., 2010). Kết quả Su và cs. (2011) cho thấy tỷ lệ cao của cytokinin / auxin thúc đẩy sự
tái sinh chồi thông qua sự biểu hiện WUS.
Trong nuôi cấy mô lúa, tăng dần nồng độ auxin từ 0 đến 4 mg/l làm tăng tần số hình
thành mô sẹo nhưng nếu kết hợp auxin và cytokinin thì tần số hình thành mô sẹo giảm dần
(Khan và cs., 2000). Cytokinin cũng không cần thiết cho việc tái biệt hóa cơ quan từ mô sẹo
(Nishi, 1973).
1.2.3.3. Gibberellin và acid abscisic
Gibberellin kích thích sự kéo dài lóng, vừa do kéo dài vừa do phân chia tế bào thân,
làm tăng hàm lượng auxin trong mô. Tuy nhiên gibberellin không phải là tác nhân làm tăng
khả năng hoạt động của auxin. Gibberellin chỉ kích thích các lóng trong nuôi cấy nếu được
cung cấp auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Sự tăng trưởng của lóng hoàn toàn phụ thuộc vào sự
hiện diện của gibberellin. Khi nuôi cấy lúa trong điều kiện ngập nước thì acid abscisic giảm
và gibberellin tăng, thúc đẩy sự tăng trưởng lóng (Benning và cs., 1992).
Acid abscisic là sesquiterpen (2 đơn vị isopren), một acid yếu, vượt qua màng tế bào
dễ dàng khi ở dạng trung tính (gắn proton). Acid abscisic hiện diện ở tỷ lệ 70 % trong lục
lạp, 15 % trong không bào và 5 % trong apoplast. Dạng liên kết với glucose chỉ gặp trong

16. 14
không bào. Acid abscisic cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của chồi và hạt, làm chậm sự kéo
dài lóng và điều tiết trạng thái đóng mở khí khổng. Acid abscisic cản sự tăng trưởng của
diệp tiêu và của các mô nuôi cấy (Bùi Trang Việt, 2000).

17. 15
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu dùng trong nuôi cấy
Hạt lúa trưởng thành giống Một Bụi Đỏ (Oryza sativa L.) do Viện Khoa học Kỹ thuật
Nông nghiệp miền Nam tặng.
2.1.2. Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm
Hạt lúa (Oryza sativa L.) giống Nàng Thơm chợ Đào.
Hạt xà lách (Lactuca sativa L.).
Hạt dưa chuột (Cucumis sativus L.).
2.2. Phương pháp
Môi trường dinh dưỡng khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962) có thành phần
khoáng đa lượng giảm một nửa (môi trường MS ½) được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm
trong đề tài (Phụ lục).
2.2.1. Khảo sát sự tạo mô sẹo từ hạt
Hạt lúa bóc vỏ, xử lý cồn 70o
trong 1 phút, ngâm trong dung dịch NaClO 8 % trong 30
phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng trong 10 lần; cấy hạt vào ống nghiệm chứa 10 ml môi
trường gồm MS ½ để làm môi trường đối chứng và MS ½ bổ sung 2,4 D ở các nồng độ
khác nhau (1 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 2,5 mg/l; 3 mg/l; 3,5 mg/l; 4 mg/l; 4,5 mg/l). Các
ống nghiệm được đặt trong phòng nuôi cấy vô trùng, nhiệt độ 27 ± 2 o
C. Che tối hoàn toàn.
Theo dõi sự tăng trưởng mô sẹo bằng cách quan sát hình thái, trọng lượng tươi, kích thước
mô sẹo sau mỗi tuần để chọn môi trường thích hợp cho sự tạo mô sẹo.
2.2.2. Khảo sát sự tăng trưởng kích thước mô sẹo
Mô sẹo hình thành do xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật 2,4 - D ở các nồng độ
khác nhau (1 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 2,5 mg/l; 3 mg/l; 3,5 mg/l; 4 mg/l; 4,5 mg/l) dùng
giấy thấm để loại lớp agar và được sử dụng để đo kích thước. Đường kính mô sẹo được đo
bằng khoảng cách của chiều ngang (so với hạt gạo). Quá trình đo lặp lại 3 lần mỗi lần 3 khối
mô sẹo để lấy số liệu thống kê.

18. 16
2.2.3. Khảo sát sự tăng trọng lượng tươi mô sẹo
Mô sẹo hình thành do xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật 2,4 - D ở các nồng độ
khác nhau (1 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 2,5 mg/l; 3 mg/l; 3,5 mg/l; 4 mg/l; 4,5 mg/l) dùng
giấy thấm để loại lớp agar và đặt trên cân phân tích 4 số Sartorius TE 124S để cân trọng
lượng tươi. Quá trình cân lặp lại 3 lần mỗi lần 3 khối mô sẹo để lấy số liệu thống kê.
2.2.4. Khảo sát sự sinh cơ quan từ mô sẹo
Từ kết quả trên, mô sẹo 2 tuần tuổi hình thành trên các môi trường
2,4 - D 2 mg/l và 3 mg/l được cấy chuyền sang môi trường MS ½ có bổ sung BA và
NAA với các nồng độ khác nhau (bảng 2.1). Nhiệt độ phòng nuôi được điều chỉnh ở 27 ± 2
o
C. Ánh sáng 2500 ± 500 lux (12/24h). Sự thay đổi hình thái được quan sát dưới kính hiển
vi quang học.
Bảng 2.1. Nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bổ sung vào môi trường MS ½
để khảo sát sự sinh cơ quan từ mô sẹo hạt lúa.
Nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (mg/l)
NAA BAA
0,0 0,0
0,10 1,0
0,25 1,0
0,50 1,0
1,00 1,0
2.2.5. Bước đầu tạo dịch treo tế bào
2.2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng mô sẹo đến sự tạo dịch treo tế bào
Các khối mô sẹo 2 tuần tuổi có trọng lượng lần lượt là 0,1 g; 0,5 g; 1 g; 1,5 g được
chuyển vào trong Erlen dung tích 50 ml chứa 2 ml môi trường MS ½ có nồng độ 2,4 - D
tương tự với môi trường tạo mô sẹo, pH được điều chỉnh ở 5,8. Sự nuôi cấy được thực hiện
ở ở nhiệt độ 27 ± 2 o
C. Lắc liên tục 120 vòng/phút. Che tối hoàn toàn. Theo dõi sự thay đổi

19. 17
cụm tế bào sau 1 tuần và 4 tuần nuôi cấy bằng cách đếm số cụm tế bào trên mỗi đơn vị thể
tích.
2.2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
đến quá trình tạo dịch treo tế bào
Từ kết quả trên, các khối mô sẹo 2 tuần tuổi có trọng lượng 1,5 g được chuyển vào
Erlen dung tích 50 ml chứa 2 ml môi trường có nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật
thay đổi (bảng 2.2). Sự nuôi cấy được thực hiện ở nhiệt độ
27 ± 2 o
C. Lắc liên tục 120 vòng/phút. Che tối hoàn toàn. Theo dõi sự thay đổi dịch
treo tế bào nuôi cấy bằng cách đếm số cụm tế bào trên mỗi đơn vị thể tích.
Bảng 2.2. Nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bổ sung vào môi trường MS ½
để khảo sát sự tạo dịch treo tế bào.
Nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật (mg/l)
BA 2,4 - D
0,0 2,0
0,5 2,0
1,0 2,0
1,5 2,0
2,0 2,0
2.2.6. Quan sát các biến đổi hình thái học, giải phẫu học
Hạt lúa trưởng thành qua xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật tạo mô sẹo được cắt
dọc hay cắt ngang bằng tay hay máy cắt microtome, sau đó được nhuộm bằng đỏ carmine –
xanh iot và quan sát dưới kính hiển vi quang học.
2.2.6.1. Giải phẫu bằng tay
Mẫu được cắt ngang hay cắt dọc thành từng lát nhỏ sau đó tẩy bằng javel trong 30
phút, rửa sạch nhiều lần bằng nước cất, dùng giấy thấm rút cho hết nước. Ngâm mẫu trong
acid acetic 20 % trong 5 phút, rửa sạch bằng nước cất. Cuối cùng nhuộm bằng phẩm nhuộm
hai màu đỏ carmine - xanh iod trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất. Quan sát mẫu dưới
kính hiển vi quang học.

20. 18
2.2.6.2. Giải phẫu bằng máy cắt microtome
Mẫu được cố định ngay trong môi trường FAA (formaldehyde – acetic acid – ethanol)
sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700
, sau đó loại nước bằng cách đặt mẫu lần lượt trong
ethanol có nồng độ là 70o
, 95o
, 100o
mỗi nồng độ ngâm 3 lần, mỗi lần 15 - 30 phút. Bước
tiếp theo loại ethanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong butanol 1, 2, 3, 4 mỗi dung dịch
ngâm trong thời gian 30 phút để loại ethanol, riêng butanol 4 để trong 10 giờ hoặc qua đêm.
Sau khi loại ethanol mẫu được cho vào parafin tan ở 54 o
C (Merck) 3 lần mỗi lần 1 giờ để
loại butanol. Cuối cùng đặt mẫu vào khuôn để đúc parafin. Mẫu được cắt dọc thành từng lát
mỏng 5 - 7 µm nhờ máy vi phẫu (microtome). Băng paraffin có chứa mẫu được cắt thành
từng đoạn ngắn và được dán lên lam chứa dung dịch gelatin 1 %. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt
độ 40 o
C. Mẫu dãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 30 o
C trong hai ngày để cho
mẫu thật khô.
Loại parafin bằng cách đặt mẫu lần lượt vào methylcyclohexan hai lần mỗi lần 10
phút. Rửa mẫu bằng etanol 1000
. Sau đó đặt mẫu lần lượt trong ethanol có nồng độ là 100o
,
95o
, 70o
mỗi lần 5 phút. Rửa lại bằng nước cất. Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ
carmine - xanh iod trong 15 phút, rửa sạch bằng nước cất và quan sát dưới kính hiển vi
quang học (Lê Thị Trung, 2003).
2.2.7. Đo cường độ hô hấp của mô sẹo
Cường độ hô hấp của mô sẹo, được đo bằng máy leaflab 2 (Hansatech) với điện cực
oxygen. Nhiệt độ của hệ thống được duy trì ổn định ở 27 ± 2 o
C, trong tối. Buồng kín chứa
mẫu hạt của máy có một lớp vải đệm thấm NaHCO3 để hấp thu cacbondioxide. Sai biệt giữa
tốc độ hấp thu oxigene ở 3 - 5 phút đầu tiên biểu thị cường độ hô hấp của hạt (µmol
O2/gTLT/phút) và được biểu thị trên màn hình. Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần.
2.2.8. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh được li trích và phân đoạn theo Ley và
cs. (1963), Loveys và Van Dijk (1988), Meidner (1984) và Yokota và cs. (1980). Hạt lúa
trưởng thành được nuôi bốn ngày trên môi trường MS ½ đối chứng và MS ½ bổ sung 2,4 -
D 3 mg/l với điều kiện tối, nhiệt độ 27 ± 2 o
C, ánh sáng 2500 ± 200 lux sẽ được ly trích và
đo các chất điều hòa tăng trưởng thực vật.

21. 19
2.2.8.1. Ly trích và phân lập
Để ly trích và phân lập các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, người ta thay đổi pH
của dịch hòa tan và dùng các dung môi thích hợp (ete, butanol bão hòa nước), trước khi áp
dụng phương pháp sắc ký.
Nghiền 1 g hạt lúa (đối chứng) hay 1 g hạt lúa (xử lý 2,4 - D 3 mg/l trong bốn ngày),
thêm 50 ml metanol 80 %, để trong tối ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc. Sau 24 giờ, lọc
hỗn hợp thu lấy dịch lọc I. Thêm vào bã 20 ml methanol 80 % lắc 20 phút, lọc hỗn hợp thu
dịch lọc II. Lặp lại như trên một lần nữa và thu dịch lọc III. Hòa chung 3 dịch lọc I, II, III,
đem cô cạn dịch lọc dưới quạt còn khoảng 1 ml.
Thêm 5 ml nước cất vào phần dịch cô cạn, chỉnh pH 2,5 bằng dung dịch HCl
1 %. Dịch lọc được chấm trên giấy sắc kí. Sơ đồ ly trích và phân lập như sau:

22. 20
Hình 2.1. Sơ đồ ly trích và phân lập các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
2.2.8.2. Sắc ký
Bản silicagel 60 F254 (20 x 20 cm) (Merck) chấm dịch lọc được đặt vào thùng sắc ký
chứa dung môi di chuyển chloroform : metanol : acid acetic (80 : 15 : 5 theo thể tích). Khi
mức dung môi di chuyển còn cách mép trên của bản sắc ký khoảng

23. 21
1 cm, quá trình chạy sắc ký kết thúc. Đèn UV 254 nm và 320 nm được sử dụng để xác
định vị trí chất điều hòa tăng trưởng thực vật chuẩn. Từ đó xác định vị trí các chất điều hòa
tăng trưởng thực vật đã được ly trích.
2.2.8.3. Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng sinh trắc
nghiệm
Sau sắc ký, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được xác định tương ứng với mỗi
băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf của mỗi chất chuẩn. Các ô tương ứng với từng mẫu
trên mỗi băng được cắt riêng, cạo, ngâm với nước cất sau 24 giờ, được dùng trong sinh trắc
nghiệm. Dung dịch chứa mỗi loại hormone thực vật/mẫu được chia làm ba phần. Mỗi phần
là một lần lặp lại trên một Erlen hoặc đĩa Petri.
Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic
Hoạt tính auxin và acid abcisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa
(Oryza sativa L.). Hạt lúa được ngâm trong nước ấm 24 giờ và gieo trên gòn ẩm, trong tối.
Sau 72 giờ, diệp tiêu (chưa bị xé) được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc
nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc cắt diệp tiêu được cho vào Petri chứa 5 ml dung
dịch ly trích ở điều kiện tối, nhiệt độ 30 ± 1 o
C. Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo
sau 24 giờ. Hoạt tính tương đương của auxin và acid abcisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch
với sự sai biệt chiều dài của diệp tiêu so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh các
chỉ số tăng trưởng chiều dài của diệp tiêu giữa các dịch trích, nước cất, dung dịch AIA 1
mg/l và ABA 1 mg/l.
Sinh trắc nghiệm cytokinin
Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa leo (Cucumis sativus
L.). Hạt dưa leo được ngâm trong nước ấm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm
nhú ra khoảng 2 mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm
thức gồm 5 tử diệp dưa leo, đặt mặt úp xuống lam kính đã được bao bằng giấy lọc thấm 10
ml dung dịch ly trích / đĩa Petri. Các đĩa này được đậy lại và được đặt dưới ánh sáng 24/24
giờ với cường độ 3000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 10C, ẩm độ 65 ± 5 %. Sau 48 giờ, hoạt tính
tương đương của cytokinin được xác định dựa vào sự sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp
dưa chuột giữa các mẫu dịch trích, nước cất và dung dịch zeatin 1 mg/l .
Sinh trắc nghiệm gibberellin

24. 22
Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách (Lactuca sativa
L.). Hạt xà lách được ngâm trong nước ấm 2 giờ và cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt
độ 30 ± 1 o
C, ẩm độ 65 ± 5 %. Sau 24 giờ các hạt với rễ mầm nhú ra 1 mm, đặt 10 hạt xà
lách này vào mỗi Erlen chứa 5 ml dung dịch ly trích chứa trong hai mảnh giấy lọc. Các
Erlen được đặt dưới ánh sáng 24/24 giờ với cường độ 3000 ± 200 lux, nhiệt độ 28 ± 2 o
C.
Sau 72 giờ, hoạt tính tương đương của gibberellin được xác định dựa vào sự sai biệt về
chiều cao của trụ hạ diệp xà lách giữa các mẫu dịch trích, nước cất và với dung dịch GA3 10
mg/l.
Sự ly trích, phân đoạn và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được
thực hiện trong ba lần riêng biệt và tính giá trị trung bình.
2.2.9. Xử lý thống kê
Số liệu trong các bảng kết quả được phân tích thống kê nhờ chương trình Statistical
Program Scientific System (SPSS) phiên bản 11.5 cho windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở
mức xác suất 0,05 của các giá trị được thể hiện bởi các chữ số khác nhau kèm theo.
Các thí nghiệm trong đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 9 năm
2013 tại phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật Đại học Sư Phạm Tp. HCM và phòng thí
nghiệm ĐH KHTN ĐH Quốc gia Tp. HCM

25. 23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả
3.1.1. Khảo sát sự tạo mô sẹo từ hạt
Kết quả thu được cho thấy tỷ lệ hình thành mô sẹo thay đổi (từ 6,7 % đến
100 %) khi có sự thay đổi nồng độ 2,4 - D. Sau bốn ngày nuôi cấy, tỷ lệ tạo mô sẹo
cao nhất xảy ra khi xử lý hạt ở nồng độ 3 mg/l và 3,5 mg/l (100 %), khi nồng độ xử lý 2,4 -
D tăng đến 4 mg/l và 4,5 mg/l tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo giảm (80,00 % và 73,30 %), tỷ lệ
cảm ứng tạo mô sẹo cũng giảm khi nồng độ xử lý 2,4 - D giảm xuống 2 mg/l và 2,5 mg/l
(73,30 % và 85,70 %), sự sai biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mô sẹo hình thành bắt đầu
xuất hiện từ nồng độ 2 mg/l, tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo thấp nhất ở nồng độ xử lý 2,4 - D 1
mg/l (6,7 %), trên môi trường đối chứng (MS ½) không thấy mô sẹo xuất hiện (bảng 3.1).
Ở ngày nuôi cấy thứ tư, hạt xử lý 2,4 - D từ nồng độ 2 mg/l trở lên cho thấy sự hình
thành mô sẹo của hạt bắt đầu ở vùng thuẫn. Mô sẹo màu vàng tươi, bóng, sáng, rễ mầm
phát triển (về sau rễ mầm thoái hóa) (hình 3.1, hình 3.2B). Ở giai đoạn nuôi cấy này, các mô
sẹo khác nhau không nhiều về hình dạng và màu sắc khi xử lý
2,4 - D ở các nồng độ khác nhau. Tuy nhiên, ở môi trường đối chứng(môi trường
không có chất điều hòa tăng trưởng thực vật), hạt không hình thành mô sẹo chỉ có rễ mầm
phát triển (hình 3.2A).
Theo thời gian nuôi cấy, màu sắc và hình thái của mô sẹo có sự thay đổi đáng kể. Ở
tuần thứ nhất, xử lý 2,4 - D nồng độ 2 mg/l, mô sẹo có rễ mầm phát triển, sẹo xuất hiện màu
vàng tươi và hơi đậm ở vùng thuẫn, phần mô sẹo gần rễ mầm màu trắng hơi trong suốt và
sần sùi (hình 3.3). Tuần nuôi cấy thứ hai, có thể quan sát khối mô sẹo tăng sinh mạnh ở
vùng thuẫn, có màu vàng tươi đến vàng đậm, sần sùi, hơi khô, trên bề mặt có xuất hiện các
nốt, vùng mô sẹo tiếp giáp với nội nhũ màu vàng hơi sậm (hình 3.4), sự tăng sinh mô sẹo
bắt đầu có dấu hiệu thoái hóa khi sang tuần nuôi cấy thứ ba, sự thoái hóa và hóa nâu bắt đầu
từ rễ mầm, sau đó lan dần đến vùng biểu mô nằm giữa thuẫn và nội nhũ (hình 3.5), sang
tuần nuôi cấy thứ tư nếu không được cấy chuyền, khối mô sẹo gần như hóa nâu hoàn toàn,
các mảng tế bào chết có màu nâu đến nâu đen trên khối mô sẹo bốn tuần tuổi (hình 3.6). Các
mô sẹo xử lý 2,4 - D ở nồng độ cao hơn (từ 2,5 mg/l - 4,5 mg/l) cũng có sự thay đổi màu sắc
và hình thái gần giống như mô tả trên. Tuy nhiên, ở nồng độ các nồng độ xử lý cao (4 mg/l

26. 24
và 4,5 mg/l), ở tuần thứ tư nuôi cấy cũng xảy ra sự hóa nâu khối mô sẹo nhưng không hòa
toàn, phần rễ mầm phát sinh trong nuôi cấy lại tiếp tục hình thành mô sẹo (hình 3.7).
Quan sát hình thái mô sẹo giữa các nồng độ 2,4 - D khác nhau ở tuần nuôi cấy thứ hai
cho thấy khi xử lý 2,4 - D ở nồng độ 1 mg/l và 1,5 mg/l tỷ lệ mô sẹo hình thành thấp, số
lượng mẫu thu được không đạt ý nghĩa thống kê, ở các nồng độ từ 2 mg/l - 4,5 mg/l, có sự
khác nhau về màu sắc và hình thái mô sẹo tạo thành.
Sau hai tuần nuôi cấy, trên bề mặt mô sẹo xuất hiện các nốt sần nhỏ, màu trắng trong
hoặc màu vàng, hơi ướt, bề mặt bóng sáng, các nốt xuất hiện rõ dễ quan sát ở nồng độ 2
mg/l và 2,5 mg/l (hình 3.8, hình 3.9), các nốt ít xuất hiện ở các nồng độ 2,4 - D cao hơn và ở
nồng độ 2,4 - D cao thì bề mặt mô sẹo càng khô và trở nên sần sùi (hình 3.10 đến hình
3.12).

27. 25
Hình 3.1. Mô sẹo xuất hiện ở vùng thuẫn, sần sùi, hơi ướt, màu vàng tươi. Hạt bốn ngày
tuổi xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh ngang 1 mm).
Hình 3.2. Hạt trưởng thành bốn ngày tuổi. (A) Nuôi cấy trên môi trường MS ½ (đối chứng)
không xuất hiện sẹo. (B) Nuôi cấy trên môi trường MS ½ bổ sung 2,4 - D 2 mg/l, mô sẹo
xuất hiện vùng thuẫn có màu vàng tươi, hơi ướt.

28. 26
Hình 3.3. Sau 1 tuần xử lý 2,4 - D 2 mg/l, hạt trưởng thành tạo mô sẹo có màu vàng tươi và
màu trắng trong, chỉ có một rễ mầm phát triển. (thanh ngang 3 mm).
Hình 3.4. Sau 2 tuần xử lý 2,4 - D 2 mg/l, hạt trưởng thành tạo mô sẹo có màu vàng tươi và
màu trắng trong, tăng sinh mạnh vùng thuẫn. (thanh ngang 1 mm).

29. 27
Hình 3.5. Sau 3 tuần xử lý 2,4 - D 2 mg/l, hạt trưởng thành có mô sẹo vàng sậm dần, sự
thoái hóa bắt đầu ở rễ mầm đầu tiên và ở vùng tiếp giáp giữa phôi với nội nhũ rễ đầu tiên
bắt đầu có màu vàng sậm và thoái hóa. (thanh ngang 1 mm).
Hình 3.6. Hạt xử lý 2,4 - D 2 mg/l sau bốn tuần, nếu không được cấy chuyền, sự hóa nâu
gần như hoàn toàn. (thanh ngang 2 mm).

30. 28
Hình 3.7. Hạt xử lý 2,4 - D 4,5 mg/l sau bốn tuần, mô sẹo có sự hóa nâu, một số trường
hợp có phần rễ mầm tiếp tục hình thành mô sẹo. (thanh ngang 2 mm).
Hình 3.8. Mô sẹo 2 tuần tuổi, vàng hơi trắng, bề mặt ướt, có nhiều nốt nhỏ vàng hoặc trắng.
Xử lý hạt trưởng thành với 2,4 - D 2,5 mg/l. (thanh ngang 1 mm).

31. 29
Hình 3.9. Mô sẹo 2 tuần tuổi vàng hơi nâu, bề mặt khô, có nhiều nốt nhỏ vàng hoặc nâu. Xử
lý hạt trưởng thành với 2,4 - D 3 mg/l. (thanh ngang 2 mm).
Hình 3.10. Mô sẹo 2 tuần tuổi, bề mặt vàng hơi trắng, rất ít nốt, hơi khô. Xử lý hạt trưởng
thành với 2,4 - D 3,5 mg/l. (thanh ngang 1 mm).

32. 30
Hình 3.11. Mô sẹo 2 tuần tuổi, bề mặt hơi khô, sần sùi, vàng hơi đậm rất ít nốt nhỏ trên bề
mặt. Xử lý hạt trưởng thành với 2,4 - D 4 mg/l. (thanh ngang 2 mm).
Hình 3.12. Mô sẹo 2 tuần tuổi khô, sần sùi, bề mặt hầu như không có các nốt. Xử lý hạt
trưởng thành với 2,4 - D 4,5 mg/l. (thanh ngang 1 mm).

33. 31
3.1.2. Khảo sát kích thước mô sẹo
Đường kính trung bình của khối mô sẹo được đo theo chiều ngang của hạt. Ở nồng độ
2,4 - D 1,0 mg/l mô sẹo có đường kính trung bình nhỏ nhất (0,10 cm), mô sẹo lớn nhất có
đường kính trung bình 0,30 cm. Ở các nồng độ khác, đường kính trung bình của khối mô
sẹo sai khác không nhiều (bảng 3.1).
Bảng 3.1. Tỷ lệ tạo mô sẹo từ hạt của lúa Một Bụi Đỏ sau bốn ngày nuôi cấy trên các môi
trường có bổ sung 2,4 - D ở các nồng độ (mg/l)
Nồng độ 2,4 - D
(mg/l)
Tỷ lệ
(%)
Đường kính
trung bình
(cm)
Đối chứng 0,00 ± 0,00a
0,00 ± 0,00
a
1,0 6,70 ± 4,60a
0,10 ± 0,01
b
1,5 6,70 ± 4,60a
0,10 ± 0,01
b
2,0 73,30 ± 11,80b
0,14 ± 0,01
c
2,5 85,70 ± 9.70b
0,13 ± 0,01
c
3,0 100,00 ± 0,00b
0,28 ± 0,01
de
3,5 100,00 ± 0,00b
0,30 ± 0,02
e
4,0 80,00 ± 10,6b
0,17 ± 0,01
c
4,5 100.00 ± 11,80b
0,18 ± 0,01
c
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.
3.1.3. Khảo sát trọng lượng tươi của mô sẹo
Trọng lượng tươi của mô sẹo tăng dần theo thời gian. Ở nồng độ 2,4 - D 2 mg/l mô sẹo
tăng sinh ở tuần thứ nhất và thứ hai, bắt đầu tăng nhanh ở tuần thứ ba, thứ tư và giảm dần
trọng lượng ở tuần thứ năm. Ở các nồng độ cao hơn (2,5 mg/l; 3,0 mg/l; 3,5 mg/l) sự tăng
trọng diễn ra nhanh hơn. Từ tuần thứ hai trọng lượng bắt đầu tăng, ổn định dần ở tuần thứ
ba, thứ tư, trọng lượng giảm vào tuần thứ năm. Ở các nồng độ 2,4 - D cao hơn (4 mg/l; 4,5
mg/l) trọng lượng mô sẹo trong 2 tuần đầu có sự ổn định, bắt đầu tăng vào tuần thứ ba và
đến tuần thứ năm vẫn chưa có dấu hiệu giảm trọng lượng (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Trọng lượng tươi (mg) của mô sẹo trên môi trường MS ½ có bổ sung 2,4 -
D ở các nồng độ khác nhau (mg/l) theo thời gian (tuần)

34. 32
2,4 - D
(mg/l)
Trọng lượng tươi của mô sẹo (mg)
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5
Đối chứng 0 ± 0 1a
0 ± 0 1a
0 ± 0 1a
0 ± 0 1a
0 ± 0 1a
2,0 52 ± 52bc
60 ± 132bc
73 ± 72b
123 ± 253b
90 ± 1923b
2,5 51 ± 62bc
94 ± 83c
95 ± 163bc
103 ± 93b
96 ± 73bc
3,0 60 ± 412c
92 ± 3723bc
114 ± 1523c
146 ± 353b
126 ± 3023bc
3,5 49 ± 412bc
68 ± 82bc
107 ± 1023bc
143 ± 323b
157 ± 313c
4,0 48 ± 62bc
45 ± 42bc
85 ± 103bc
104 ± 193b
107 ± 203bc
4,5 41 ± 32b
42 ± 82ab
85 ± 63bc
115 ± 104b
124 ± 64bc
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. Các số trung
bình trong hàng với các số khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.
3.1.4. Cường độ hô hấp của mô sẹo
Từ kết quả trên bảng 3.1 cho thấy ở ngày nuôi cấy thứ tư, tỷ lệ mô sẹo hình thành đạt
tới 100 % ở nồng độ 2,4 - D 3 mg/l. Khi khảo sát hoạt động hô hấp của mô sẹo ở giai đoạn
này cho thấy cường độ hô hấp (0,0067 µmol O2/g) giảm rõ rệt so với đối chứng (0,5926
µmol O2/g). Kết quả trên cho thấy trong quá trình hình thành mô sẹo hoạt động hô hấp của
các tế bào giảm rõ (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Cường độ hô hấp của mô sẹo bốn ngày tuổi
Môi trường Cường độ hô hấp (µmol O2/g trọng lượng tươi/phút)
Đối chứng 0,5926 ± 0,0145 b
2,4 - D 3 mg/l 0,0067 ± 0,0002 a
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.
3.1.5. Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của mô sẹo
Các mô sẹo thu được khi xử lý 2,4 - D ở nồng độ 3 mg/l sau bốn ngày nuôi cấy, được
sử dụng đo hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh. Kết quả cho thấy trong
số các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được khảo sát, hàm lượng auxin và gibberellin nội
sinh tăng rõ rệt, lượng acid abscisic tăng nhẹ, và hàm lượng cytokinin thay đổi không đáng
kể từ ngày thứ nhất cho đến ngày thứ tư
(bảng 3.4)

35. 33
Bảng 3.4. Hoạt tính của chất điều hòa tăng trưởng nội sinh của khối mô sẹo trên môi trường
MS ½ + 2,4 - D 3 mg/l ở một và bốn ngày tuổi.
Thời gian
(ngày)
Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật (mg/l)
Auxin Cytokinin Gibberellin Acid abscisic
1 0,07 ± 0,01a
0,12 ± 0,01 a
0,02 ± 0,00 a
0,21 ± 0,10a
4 0,12 ± 0,03b
0,13 ± 0,03b
0,13 ± 0,01b
0,31 ± 0,10b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.
3.1.6. Quan sát giải phẫu hình thái mô sẹo
Từ kết quả trên, môi trường MS ½ có bổ sung 2,4 - D ở nồng độ 3 mg/l và 3,5 mg/l
cho tỷ lệ hình thành mô sẹo 100 % . Tuy nhiên, tỷ lệ này không sai biệt có ý nghĩa so với
nồng độ 2,4 - D 2 mg/l. Do đó, mẫu của môi trường này dùng quan sát về mặt giải phẫu để
xem nguồn gốc hình thành mô sẹo. Mô sẹo được giải phẫu theo thời gian để xác định nguồn
gốc phát sinh. Trên lát cắt dọc hạt trưởng thành sau một ngày xử lý 2,4 - D 2mg/l quan sát
được các tế bào của vùng thuẫn ở vị trí giữa phôi và nội nhũ xếp sát nhau, bắt màu sậm,
vùng thuẫn phía trên mang các tế bào lớn hơn nhưng bắt màu nhạt hơn. Lớp biểu mô bao
quanh thuẫn vẫn còn bao bọc quanh phôi (hình 3.13, hình 3.14). Xuất hiện sự kéo dài các tế
bào (hình 3.15), nhưng lớp biểu mô và các tế bào sát lớp biểu mô phân chia ít, trên lát cắt
ngang quan sát được các tế bào biểu mô hình chữ nhật tròn cạnh, nhân sậm màu (hình 3.16,
hình 3.17). Sau bốn ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l, lớp thuẫn bao phía ngoài phôi, các tế bào trở
nên tròn, một số có tế bào chất đậm đặc, tế bào lớn (hình 3.18), ớlớp thuẫn phủ phía ngoài
chóp rễ, các tế bào phân chia mạnh, tế bào chất đậm đặc, từ lớp biểu mô thuẫn trở vào trong
các tế bào lớn dần ( hình 3.19, hình 3.20), một số tế bào kéo dài, không bào lớn (hình 3.21).
Vùng thuẫn tiếp giáp giữa phôi và nội nhũ các tế bào bên trong phát triển mạnh nhô ra đẩy
sơ khởi chồi lên phía trên (hình 3.22, hình 3.23), lớp biểu mô thuẫn tăng sinh ít, các tế bào
sát lớp biểu mô có không bào lớn, nhân nhỏ (hình 3.24). Trên lát cắt ngang sớm của hạt 4
ngày tuổi, các tế bào biểu mô tăng sinh mạnh vượt ra khỏi bề mặt cấu trúc bình thường tạo
khối mô sẹo gồm các tế bào đang phân chia (hình 3.25).
Sau hai tuần nuôi cấy, các mô sẹo được xử lý 2,4 - D ở nồng độ 2 mg/l hình thành
các khối mô sẹo lớn, giữa các khối mô sẹo là các khoảng trống không khí (hình 3.26), có thể
các khối mô sẹo đó phát triển thành các cấu trúc có biểu bì hóa tạo nên các nốt nhỏ trên bề
mặt khối mô sẹo (hình 3.27, hình 3.28). Ở nồng độ

36. 34
2,4 - D 3mg/l các tế bào tăng sinh mạnh, mô sẹo cũng tạo thành các khối mô sẹo,
giữa các khối là các khoang khí, nhưng không quan sát được sự biểu bì hóa cũng như các
cấu trúc nốt trên bề mặt khối mô sẹo (hình 3.29).
Hình 3.13. Vùng thuẫn khác biệt ít so với vùng phôi. Lát cắt dọc hạt trưởng thành sau một
ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh ngang 50 µm).

37. 35
Hình 3.14. Các tế bào vùng thuẫn phía trên có tế bào lớn, bắt màu nhạt. Lát cắt dọc hạt
trưởng thành sau một ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh ngang 30 µm).
Hình 3.15. Các tế bào vùng thuẫn bắt đầu kéo dài. Lát cắt ngang hạt trưởng thành sau một
ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh ngang 30 µm).

38. 36
Hình 3.16. Lớp tế bào biểu mô và sát biểu mô thuẫn bao quanh phôi chưa phân chia mạnh,
nhân sậm màu. Lát cắt ngang hạt trưởng thành sau một ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh
ngang 30 µm).
Hình 3.17. Lớp thuẫn bao quanh phôi chưa phân chia mạnh, các tế bào bắt đầu kéo dài. Lát
cắt ngang hạt trưởng thành sau một ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh ngang 30 µm).

39. 37
Hình 3.18. Thuẫn phân chia mạnh, các tế bào bắt màu đậm. Lát cắt dọc hạt trưởng
thành sau bốn ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh ngang 30µm).

40. 38
Hình 3.19. Các tế bào phía ngoài lớp thuẫn phân chia mạnh, tế bào chất đậm đặc, từ lớp
biểu bì vào trong các tế bào lớn dần. Hạt xử lý 2,4 - D 2 mg/l ngày thứ tư. (thanh ngang 30
µm).
Hình 3.20. Các tế bào phủ chóp rễ của lớp thuẫn phân chia mạnh, tế bào chất đậm đặc, từ
lớp biểu bì vào trong các tế bào lớn dần. Hạt xử lý 2,4 - D 2 mg/l ngày thứ tư. (thanh ngang
30 µm).

41. 39
Hình 3.21. Các tế bào vùng thuẫn sát lớp biểu bì có tế bào chất đậm đặc, các tế bào nhu mô
bên trong có không bào lớn, nhân bắt màu đậm. Cắt dọc hạt trưởng thành sau bốn ngày xử
lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh ngang 30 µm)
Hình 3.22. Thuẫn phân chia mạnh, các tế bào vùng thuẫn sát lớp nội nhũ phân chia mạnh
đẩy sơ khởi chồi lên phía trên (mũi tên). Lát cắt dọc hạt trưởng thành sau bốn ngày xử lý 2,4
- D 2 mg/l. (thanh ngang 30 µm).

42. 40
Hình 3. 23. Thuẫn phân chia mạnh, các tế bào vùng thuẫn sát lớp nội nhũ phân chia mạnh
đẩy sơ khởi chồi lên phía trên. Lát cắt dọc hạt trưởng thành sau bốn ngày xử lý 2,4 - D 2
mg/l. (thanh ngang 30 µm).

43. 41
Hình 3.24. Các tế bào lớp biểu bì và lớp nhu mô bên trong vùng thuẫn phủ phân chia
mạnh, các tế bào tăng sinh với không bào lớn, nhân nhỏ. Lát cắt dọc hạt trưởng thành sau
bốn ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh ngang 30 µm).
Hình 3.25. Các tế bào vùng thuẫn phân chia mạnh ra khỏi lớp thuẫn. Lát cắt ngang sớm của
hạt trưởng thành sau bốn ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh ngang 30 µm).

44. 42
Hình 3.26. Các tế bào trong mô sẹo tập trung thành khối, giữa các khối có các khoang
trống. Sau 2 tuần xử lý 2,4 - D ở nồng độ 2 mg/l. (thanh ngang 30 µm).
Hình 3.27. Sau 2 tuần xử lý 2,4 - D ở nồng độ 2 mg/l tăng trưởng mạnh và có sự biểu bì
hóa trong các cụm tế bào mô sẹo. (thanh ngang 30 µm).

45. 43
Hình 3.28. Xuất hiện sự biểu bì hóa mô sẹo 2 tuần tuổi, nồng độ 2 mg/l (thanh ngang 30
µm).
Hình 3.29. Mô sẹo hai tuần tuổi tăng trưởng mạnh nhưng không xuất hiện các cụm mô sẹo
biểu bì hóa. Hạt trưởng thành xử lý 2,4 - D ở nồng độ 3 mg/l. (thanh ngang 30 µm).

46. 44
3.1.7. Khả năng phát sinh cơ quan từ mô sẹo
Sau hai tuần xử lý hạt trưởng thành bằng 2,4 - D, mô sẹo thu được ở nồng độ
2 mg/l và 3 mg/l được chuyển sang môi trường sinh cơ quan gồm BA và NAA với các
nồng độ khác nhau để đánh giá khả năng sinh cơ quan của mô sẹo. Với mô sẹo thu được ở
nồng độ 2 mg/l chuyển sang môi trường sinh cơ quan thu được kết quả trên bảng 3.5. Khả
năng sinh cơ quan cao nhất thu được từ mô sẹo có nguồn gốc từ 2,4 - D 2 mg/l khi xử lý kết
hợp BA và NAA ở tỷ lệ BA 1 mg/l : NAA 0,25 mg/l (chồi 63,3 % và rễ 56,7 %), số chồi
và rễ trung bình cũng chiếm tỷ lệ cao hơn so với các nồng độ khác (chồi 1,52 và rễ 7,7). Tuy
nhiên, ở sự kết hợp này, mô sẹo mới chiếm tỷ lệ thấp (1,7 %). Ở kết hợp khác của BA và
NAA, tỷ lệ hình thành chồi và rễ thấp hơn.
Bảng 3.5. Tỷ lệ chồi và rễ phát sinh trên mỗi cụm mô sẹo cấy chuyền từ môi trường 2,4 - D
2 mg/l sang nuôi cấy môi trường có bổ sung BA và NAA (mg/l)
BA NAA
Tỷ lệ (%) Số chồi
trung bình
(chồi/cụm
mô)
Số rễ
trung bình
(chồi/cụm
mô)
Tỷ lệ mô sẹo
tạo mới (%)
Chồi Rễ
0,00 0,00 16,7 ± 6,9a
16,7 ± 0,0a
1,00 ± 0,0a
3,7 ± 0,3a
0,0 ± 0,0a
1,00 0,10 50,0 ± 9,2bc
30,0 ± 1,2ab
1,33 ± 0,1ab
7,0 ± 0,7a
0,0 ± 0,0a
1,00 0,25 63,3 ± 8,9c
56,7 ± 1,5c
1,52 ± 0,1b
7,7 ± 0,7a
1,7 ± 0,1 b
1,00 0,50 43,3 ± 9,2bc
53,3 ± 1,2bc
1,23 ± 0,1ab
7,3 ± 1,2b
6,7 ± 0,0ab
1,00 1,00 26,6 ± 8,2ab
40,0 ± 0,0abc
1,00 ± 0,0a
4,4 ± 1,6ab
6,7 ± 0,1ab
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.
Với mô sẹo thu được ở nồng độ 3 mg/l chuyển sang môi trường sinh cơ quan thu được
kết quả trên bảng 3.6. Nhìn chung mô sẹo thu được khi xử lý 2,4 - D ở nồng độ 3 mg/l sau
đó xử lý kết hợp BA và NAA cho tỷ lệ sinh cơ quan tương đối thấp hơn so với mô sẹo thu
được từ xử lý 2,4 - D nồng độ 2 mg/L.
Kết quả bảng 3.6 cho thấy, ở sự kết hợp BA 1 mg/l và NAA 0,50 mg/l cho tỷ lệ tạo
chồi cao nhất (20,0 %) và tỷ lệ tạo rễ cao nhất có được ở sự kết hợp BA
1 mg/l và NAA 1 mg/l

47. 45
Bảng 3.6. Tỷ lệ chồi và rễ phát sinh trên mỗi cụm mô sẹo cấy chuyền từ môi trường 2,4 - D
3 mg/l sang nuôi cấy môi trường có bổ sung BA và NAA (mg/l)
BA NAA
Tỷ lệ (%) Số chồi
trung bình
(chồi/cụm
mô)
Số rễ trung
bình
(chồi/cụm
mô)
Tỷ lệ tạo mô
sẹo mới (%)Chồi Rễ
0,00 0,00 3,3 ± 0,0b
0,0 ± 0,0a
1,0 ± 0,0a
0,0 ± 0,0a
0,0 ± 0,0a
1,00 0,10 26,6 ± 0,1b
0,0 ± 0,0a
1,0 ± 0,0a
0,0 ± 0,0a
0,0 ± 0,0a
1,00 0,25 20,0 ± 0,1ab
0,0 ± 0,0a
1,0 ± 0,0 a
0,0 ± 0,0a
26,7 ± 0,1b
1,00 0,50 23,3 ± 0,1ab
16,7 ± 0,1b
1,0 ± 0,1 a
10,4 ± 2,6c
40,0 ± 0,1b
1,00 1,00 13,3 ± 0,1ab
36,7 ± 0,1c
1,0 ± 0,0 a
15,0 ± 1,5b
36,7 ± 0,1b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.
Kết quả giải phẫu cho thấy khi xử lý kết hợp BA và NAA ở các nồng độ, mô sẹo thu
được khi xử lý 2,4 - D 2mg/l thể hiện năng lực sinh phôi thể hệ (somatic embryogenesis).
Quan sát trên lát cắt một tuần tuổi cho thấy sự hình thành phôi thể hệ ở các giai đoạn khác
nhau: phôi hình cầu giai đoạn muộn (hình 3.30), phôi hình tim với các tế bào đang kéo dài
hình thành hệ mạch dẫn (hình 3.31), phôi hình cầu với đám tế bào dây treo (hình 3.32, hình
3.33), phôi hình núi lửa, phôi hình tim và hình tim kéo dài với đám tế bào dây treo (hình
3.34). Phôi hình tim đang hình thành các sơ khởi cơ quan, quan sát được vùng mô phân sinh
đang trong quá trình hình thành cực chồi và cực rễ (hình 3.35, hình 3.36, hình 3.37).
Trên khối mô sẹo 2 tuần xử lý kết hợp BA và NAA theo tỷ lệ 1 mg/l : 0,25 mg/l xuất
hiện các đốm màu xanh và các rễ nhỏ, về sau phát triển thành chồi và rễ (hình 3.38 đến hình
3.41).

48. 46
Hình 3.30. Phôi hình cầu giai đoạn muộn. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử lý hai tuần trên
2,4 - D 2 mg/l sau đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l). (thanh ngang 30µm).
Hình 3.31. Phôi hình tim các tế bào đang kéo dài. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử lý hai
tuần trên 2,4 - D 2 mg/l sau đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l). (thanh ngang 30 µm).

49. 47
Hình 3.32. Đám tế bào dây treo trên phôi hình cầu. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử lý hai
tuần trên 2,4 - D 2 mg/l sau đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l). (thanh ngang 30 µm).
Hình 3.33. Đám tế bào dây treo của phôi hình cầu. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử lý hai
tuần trên 2,4 - D 2 mg/l sau đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l). (thanh ngang 30µm).

50. 48
Hình 3.34. Các phôi đang hình thành ở các pha; (a) Phôi hình tim (b) Phôi hình tim kéo dài;
(c) Phôi hình núi lửa với đám tế bào dây treo. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử lý hai tuần
trên 2,4 - D 2 mg/l sau đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l). (thanh ngang 30 µm).
Hình 3.35. Phôi hình tim đang hình thành sơ khởi lá và cực rễ, vùng mô phân sinh có màu
đậm ở giữa phôi. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử lý hai tuần trên 2,4 - D 2 mg/l sau đó xử
lý BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l). (thanh ngang 30 µm).

51. 49
Hình 3.36. Phôi hình tim đang hình thành sơ khởi chồi và rễ, sơ khởi lá không đều đặc
trưng ở cây một lá mầm. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử lý hai tuần trên 2,4 - D 2 mg/l
sau đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l). (thanh ngang 30µm).

52. 50
Hình 3.37. Phôi hình tim với vùng mô phân sinh giữa phôi . Nguồn gốc từ mô sẹo hai tuần
tuổi trên môi trường 2,4 - D 2 mg/l chuyển sang môi trường BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l).
(thanh ngang 30 µm).

53. 51
Hình 3.38. Các đốm chồi màu xanh lá xuất hiện trên mô sẹo hai tuần tuổi. Nguồn gốc từ hạt
trưởng thành xử lý 2,4 - D 2 mg/l hai tuần sau đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l).
(thanh ngang 2mm).
Hình 3.39. Đốm chồi xuất hiện trên mô sẹo hai tuần tuổi. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử
lý 2,4 - D 3 mg/l hai tuần sau đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,5 mg/l). (thanh ngang 1 mm).

54. 52
Hình 3.40. Chồi phát triển. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử lý 2,4 - D 2 mg/l hai tuần sau
đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l). (thanh ngang 5 mm).
Hình 3.41. Chồi phát triển. Nguồn gốc từ hạt trưởng thành xử lý hai tuần 2,4 - D 3 mg/l sau
đó xử lý BA : NAA (1 mg/l : 0,5 mg/l). (thanh ngang 1 mm).

55. 53
3.1.8. Bước đầu tạo dịch treo tế bào
3.1.8.1. Khảo sát khối lượng mô sẹo ảnh hưởng đến sự tạo dịch treo của tế bào
Các mô sẹo với trọng lượng khác nhau, có màu vàng tươi, không hóa nâu, dễ tách rời
thu được từ hạt trưởng thành sau xử lý hai tuần bằng 2,4 - D 2 mg/l trên môi trường rắn
được chuyển vào nuôi cấy trong các Erlen có chứa 2ml dịch nuôi cấy với nồng độ 2,4 - D
tương tự ở môi trường rắn để khảo sát ảnh hưởng của khối lượng mô sẹo đến sự tạo dịch
treo tế bào.
Sau tuần nuôi cấy đầu tiên, số cụm tế bào đếm được có sự tăng tỷ lệ thuận với khối
lượng mô sẹo ban đầu. Sau bốn tuần nuôi cấy, ở khối lượng mô sẹo ban đầu 1,5g (mật độ
1,5g/2ml), quan sát được số cụm tế bào tăng cao nhất (1064,77 cụm). Số cụm tế bào ở mức
tiếp theo là 418,55 cụm thu được ở mật độ 1,0 g/2ml. Ở mật độ 0,5 g/2ml và 0,1 g/2ml số
cụm tế bào cũng như số tế bào trong mỗi cụm giảm (bảng 3.7)
Bảng 3.7. Sự tăng trưởng dịch treo tế bào theo khối lượng mô sẹo ban đầu (số cụm tế
bào/ml)
Khối lượng ban
đầu (g)
Số cụm tế bào (cụm) Số cụm tế bào biểu bì
hóa (cụm)Tuần 1 Tuần 4
0,1 104,88 ± 20,29
a
94,55 ± 18,26
a
0,00 ± 0,00a
0,5 227,22 ± 26,72
a
159,66 ± 10,13
a
0,00 ± 0,00a
1,0 352,88 ± 13,41
b
418,55 ± 23,75
b
16,88 ±2,12b
1,5 446,77 ± 21,96
c
1064,77 ± 67,12
c
71,66 ± 3,05c
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.
Sau một tuần nuôi cấy, quan sát được ban đầu các tế bào rời rạc về sau kết hợp thành
cụm, có ba dạng tế bào xuất hiện trên môi trường nuôi cấy gồm loại các tế bào đơn, các tế
bào hợp thành cụm và các tế bào hình sợi (hình 3.42), và có sự tách rời tế bào ra khỏi mô
mẹ, các tế bào kết hợp thành cụm, các tế bào trong cụm chủ yếu là các tế bào có hình dạng
kéo dài, số cụm tế bào tròn xuất hiện ít xuất hiện ở mật độ nuôi 0,5 g/2 ml và 1,0 g/2 ml
(hình 3.43, hình 3.44, hình 3.46), quan sát ở mật độ 1,5 g/2 ml thấy số cụm tế bào xuất hiện
nhiều và số tế bào trong mỗi cụm lớn hơn (hình 3.45). So với mật độ 0,5 g/2 ml, ở mật độ
1,0 g/2 ml số cụm tế bào tăng cao hơn, đồng thời có xuất hiện các cụm tế bào mang cấu trúc

56. 54
giống biểu bì hóa (hình 3.47). Có sự thay đổi về hình thái tế bào ở mật độ 1,5 g/2 ml ở tuần
tuổi thứ tư, nhiều tế bào tròn xuất hiện và có sự hiện diện của phôi hình cầu (hình 3.48, hình
3.49).

57. 55
Hình 3.42. Tế bào đơn, tế bào tập hợp cụm, và tế bào hình sợi.(a) Tế bào đơn; (b) Tế bào
hình sợi; (c) Tế bào cụm. Dịch treo mô sẹo lúa sau bảy ngày xử lý 2,4 - D 2 mg/l. (thanh
ngang 30 µm).
Hình 3.43. Cụm tế bào sau bảy ngày nuôi cấy, từ mô mẹ các tế bào rời nhau bắt đầu kết hợp
thành cụm. Xử lý 2,4 - D 2 mg/l với mật độ nuôi ban đầu 0,5 g/2ml. (thanh ngang 30 µm).

58. 56
Hình 3.44. Cụm tế bào sau bảy ngày nuôi cấy, các tế bào có sự kết lại thành cụm. Xử lý 2,4
- D 2 mg/l với mật độ nuôi ban đầu 0,5 g/ml. (thanh ngang 30 µm).
Hình 3.45. Cụm tế bào sau bảy ngày nuôi cấy, số cụm nhiều và số tế bào trong mỗi cụm
lớn. Xử lý 2,4 - D 2 mg/l với mật độ nuôi ban đầu 1,5 g/2ml. (thanh ngang 30 µm).

59. 57
Hình 3.46. Cụm tế bào sau bốn tuần nuôi cấy, các tế bào vẫn rời rạc, số cụm ít và số tế bào
trong mỗi cụm thấp. Xử lý 2,4 - D 2 mg/l với mật độ nuôi ban đầu 0,5 g/2ml. (thanh ngang
30 µm).
Hình 3.47. Cụm tế bào sau bốn tuần nuôi cấy, số tế bào trong cụm tăng cao, xuất hiện cụm
có sự biểu bì hóa. Xử lý 2,4 - D 2 mg/l với mật độ nuôi ban đầu 1,0 g/2ml. (thanh ngang 30
µm).

60. 58
Hình 3.48. Cụm phôi cầu giai đoạn muộn sau bốn tuần nuôi cấy. Xử lý 2,4 - D 2 mg/l với
mật độ nuôi ban đầu 1,5 g/2ml. (thanh ngang 30 µm).
Hình 3.49. Phôi cầu ở giai đoạn muộn sau bốn tuần nuôi cấy, các tế bào ngoại vi tiếp tục
phân bào. Xử lý 2,4 - D 2 mg/l với mật độ nuôi ban đầu 1,5 g/2ml. (thanh ngang 30 µm).

61. 59
3.1.8.2. Khảo sát nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thực vật hưởng đến quá
trình tạo dịch treo tế bào
Từ kết quả trên cho thấy với khối lượng mô sẹo ban đầu 1,5 g/2 ml cho dịch treo có
khả năng sinh phôi. Do đó chọn khối lượng mô sẹo 1,5 g/2 ml để nuôi cấy trên môi trường
có sự kết hợp nồng độ BA và 2,4 - D với các nồng độ khác nhau (bảng 3.8) để khảo sát ảnh
hưởng nồng độ của chất điều hòa tăng trưởng thực vật đến dịch treo tế bào. Các mô sẹo có
màu vàng tươi, không hóa nâu, dễ tách rời thu được từ hạt trưởng thành xử lý sau hai tuần
với 2,4 - D 2 mg/l được chọn để nuôi cấy.
Sau bốn tuần nuôi cấy, các cụm tế bào cũng như số tế bào trong mỗi cụm giảm ở các
kết hợp khác nhau của BA và 2,4 - D (bảng 3.8), kết quả đều thấp hơn so với môi trường đối
chứng (1064,77 cụm). Ban đầu các tế bào rời rạc về sau kết hợp thành cụm, các tế bào trong
cụm chủ yếu kéo dài, sau một tuần tuổi số cụm tế bào tròn xuất hiện ít xuất hiện. Quan sát
dịch treo ở nồng độ kết hợp BA 0,5 mg/l;
1 mg/l; 1,5 mg/l với 2,4 - D 2 mg/l sau bốn tuần nuôi, có số cụm tế bào tăng cao và số
tế bào trong mỗi cụm cũng tăng cao (hình 3.50, hình 3.51, hình 3.52), về hình thái tế bào ở
nồng độ BA 2 mg/l và 2,4 - D 2 mg/l quan sát được nhiều tế bào tròn xuất hiện và xuất hiện
cụm tế bào biểu bì hóa và bắt đầu có sự hiện diện của cấu trúc giống phôi hình cầu (hình
3.53), tuy nhiên ở sự kết hợp xử lý này số cụm tế bào thấp nhất (269,77 cụm). Ở sự kết hợp
BA 0,5 mg/l và 2,4 - D 2 mg/l có số cụm tế bào cao nhất nhưng ở nồng độ này không có các
cụm tế bào biểu bì hóa.

62. 60
Bảng 3.8. Sự tăng trưởng dịch treo mật độ 0,75g/ml xử lý kết hợp BA và 2,4 - D ở
các nồng độ sau bốn tuần nuôi cấy
Nồng độ chất điều hòa (mg/l) Số cụm tế bào
(cụm/ml)
Số cụm tế bào biểu bì
hóa (cụm/ml)BA 2,4 - D
0,0 2,0 1064,77 ± 67,12d
71,66 ± 9,16 d
0,5 2,0 503,44 ± 9,60c
0,00 ± 0,00 a
1,0 2,0 406,11 ± 10,18b
0,00 ± 0,00 a
1,5 2,0 332,22 ± 18,45ab
0,00 ± 0,00 a
2,0 2,0 269,77 ± 9,24a
38,88 ± 5,90 c
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.

63. 61
Hình 3.50. Cụm tế bào sau bốn tuần nuôi cấy, số cụm nhiều và số tế bào trong mỗi cụm lớn.
Nồng độ 2,4 - D 2 mg/l : BA 0,5 mg/l. (thanh ngang 30 µm).
Hình 3.51. Cụm tế bào sau bốn tuần nuôi cấy, số cụm nhiều và số tế bào trong mỗi cụm lớn.
Nồng độ 2,4 - D 2 mg/l : BA 1,0 mg/l. (thanh ngang 30 µm).

64. 62
Hình 3.52. Cụm tế bào sau bốn tuần nuôi cấy, số cụm nhiều và số tế bào trong mỗi cụm lớn.
Nồng độ 2,4 - D 2 mg/l : BA 1,5 mg/l. (thanh ngang 30 µm).
Hình 3.53. Cụm tế bào sau bốn tuần nuôi cấy, số cụm nhiều và số tế bào trong mỗi cụm lớn.
Nồng độ 2,4 - D 2 mg/l : BA 2,0 mg/l. (thanh ngang 30 µm).

65. 63
3.2. Thảo luận
3.2.1. Sự tạo mô sẹo từ hạt
3.2.1.1. Môi trường nuôi cấy
Trong nghiên cứu này hạt trưởng thành sau khi khử trùng được cấy trên môi trường
MS ½ khi kết hợp xử lý chất điều hòa tăng trưởng đã thể hiện kết quả sinh mô sẹo cao, mô
sẹo có khả năng sinh cơ quan và sinh phôi (hình 3.34). Panjaitan và cs. (2009) đã nghiên
cứu sự phát sinh mô sẹo và sinh phôi thể hệ trên môi trường N6 và môi trường MS ½ kết
luận rằng môi trường MS có khả năng hình thành mô sẹo và sinh phôi cao hơn so với môi
trường N6. Chứng minh môi trường MS có khả năng sinh mô sẹo, sinh cơ quan và sinh
phôi.
3.2.1.2. Mẫu cấy
Hạt trưởng thành xử lý 2,4 - D 2 mg/l sau một ngày không có sự khác biệt nhiều giữa
các tế bào của vùng phôi và vùng thuẫn (hình 3.13 đến hình 3.17). Sau bốn ngày nuôi cấy sự
hình thành mô tạo mô sẹo diễn ra ở lớp thuẫn của hạt, trên lát cắt dọc và lắt cắt ngang phôi
trưởng thành tăng sinh rộng ở vùng thuẫn, bắt đầu từ lớp tế bào biểu bì của thuẫn các tế bào
tăng sinh mạnh và lớn dần từ ngoài vào trong cho đến vùng phôi (hình 3.18), các tế bào sát
lớp biểu bì phân chia mạnh hơn, các tế bào lớp nhu mô phía trong có không bào lớn, nhân
nhỏ bắt màu đậm (hình 3.19 đến hình 3.21), vùng thuẫn tiếp giáp với nội nhũ phát triển
nhanh đẩy sơ khởi chồi lên phía trên (hình 3.22 và hình 3.23), trên lát cắt ngang sớm của
hạt các tế bào ngoại vi của vùng thuẫn phân chia phá vỡ lớp tế bào biểu bì bao quanh (hình
3.12), về hình thái mô sẹo có hình dạng sần sùi, hơi ướt, từ cứng đến mềm bở, vùng mô sẹo
tăng sinh mang màu vàng tươi đến trắng trong, phát triển theo hướng ra ngoài so với phôi,
trên môi trường đối chứng hạt nảy mầm, không tạo mô sẹo (hình 3.1, hình 3.2). Sau hai tuần
nuôi cấy trên môi trường 2,4 - D 2 mg/l, sự biểu bì hóa bắt đầu từ những cụm tế bào ở khu
vực ngoại biên của khối mô sẹo hình thành các khối mô sẹo tiền sinh phôi (hình 3.14), một
số tế bào mang không bào lớn phía trong bị phá vỡ dẫn đến sự hình thành không gian bên
trong của khối mô sẹo kết quả này phù hợp với báo cáo của Vega và cs. (2009) cho rằng mô
sẹo phát triển từ lớp thuẫn. Báo cáo của Panjaitan và cs. (2009) cho rằng nuôi cấy trên hạt
trưởng thành mô sẹo hình thành từ lớp thuẫn và sau đó hình thành các nốt và các cấu trúc
hình cầu giống như phôi soma và kết luận rằng việc lựa chọn mẫu cấy đặc biệt cần thiết cho

66. 64
sự hình thành và biệt hóa mô sẹo sinh phôi. Mariani và cs. (2002) cho rằng sự hình thành
mô sẹo bắt đầu từ sự cảm ứng 2,4 - D ở lớp tế bào biểu bì của thuẫn, auxin có ảnh hưởng
đến sự tương tác bên trong tế bào, có thể tạo ra các tế bào tiền sinh phôi, sự kiện đầu tiên
trong sự cảm ứng hình thành phôi thể hệ là sự phá vỡ tính toàn vẹn của tế bào, điều này diễn
ra do sự cô lập của các tế bào hoặc các nhóm của các tế bào và việc cắt đứt các cầu liên bào
(plasmodesmata), làm cho tế bào kết nối giữa các tế bào lân cận trở thành gián đoạn. Các tế
bào bị cô lập hoặc nhóm tế bào có thể không bị ảnh hưởng từ các mô xung quanh. Theo
Hédia (2012) cho rằng chức năng chính của của lớp thuẫn là phục vụ hấp thụ dinh dưỡng từ
nội nhũ, đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa nội nhũ trong quá trình nảy mầm. Do đó
có thể cho rằng các hoạt động trao đổi chất cao của lớp thuẫn là cơ sở cho quá trình phản
biệt hóa gây nên sự hình thành mô sẹo (Vega và cs., 2009)
3.2.1.3. Tác động của auxin và cytokinin
Trong nghiên cứu này, 2,4-D ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để đánh giá hiệu
quả cảm ứng tạo mô sẹo trên giống lúa Một Bụi Đỏ: mô sẹo của lúa Một Bụi Đỏ hình thành
khá nhanh vào ngày thứ tư sau khi chuyển hạt trưởng thành vào môi trường nuôi cấy.
Trên môi trường MS ½ được làm rắn bằng agar với sự bổ sung 2,4 - D ở nồng độ 3
mg/l và 3.5 mg/l cho tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất (100 %) điều này cho thấy rằng nồng
độ từ 3,0 mg/l đến 3,5 mg/l là tối ưu cho sự cảm ứng tạo mô sẹo từ hạt của giống lúa Một
Bụi Đỏ, tuy nhiên hiệu quả sinh cơ quan và sinh phôi cao nhất đạt được xử lý hạt trưởng
thành ở nồng độ 2,4 - D 2 mg/l, kết quả này thống nhất với kết quả của Libin và cs. (2012)
và Rafique và cs. (2011) cho rằng ở nồng độ 2 mg/l là tối ưu cho sự cảm ứng tạo mô sẹo.
Nồng độ 2,4 - D 1 mg/l cho tỷ lệ hình thành mô sẹo thấp nhất (6.7 %) của giống lúa. So với
ngày nuôi cấy thứ nhất, trên lát cắt dọc qua vùng phôi của mô sẹo ở ngày thứ tư cho thấy
các tế bào ở vùng thuẫn bắt màu đậm, hầu như không có khoảng gian bào, các tế bào bắt
đầu phân chia mạnh (từ hình 3.3 đến 3.11). Bắt đầu từ nồng độ 2,4 - D 1 mg/l hạt có khả
năng cảm ứng tạo mô sẹo, tỷ lệ này tăng lên ở các nồng độ cao hơn. Ở nồng độ 2,4 - D
1 mg/l hạt có năng lực cảm ứng hình thành mô sẹo nhưng với tỷ lệ rất thấp (6,7 %), tỷ
lệ tạo mô sẹo tăng dần và đạt tỷ lệ 100 % ở nồng độ 3 mg/l và 3,5 mg/l của 2,4 - D, bắt đầu
từ nồng độ 2,4 - D 2 mg/l, mô sẹo ở nồng độ này bề mặt có mang các cấu trúc nhỏ hình cầu
dưới 1 mm, bóng sáng. Ở nồng độ 4 - 4,5 mg/l của 2,4 - D tỷ lệ hình thành mô sẹo thấp dần
(80,00 %), mô sẹo có màu trắng đục, bề mặt nhám và khô (bảng 3.1). Như vậy, khả năng

67. 65
tăng trưởng mô sẹo nói chung tỷ lệ thuận với nồng độ 2,4 - D, nhưng tỷ lệ mô sẹo vàng
tươi, mềm ướt giảm dần và mô sẹo có bề mặt khô tăng, và các nốt nhỏ trên bề mặt ít xuất
hiện khi tăng nồng độ 2,4 - D. Panjaitan và cs. (2009) cũng cho rằng khi xử lý hạt với nồng
độ 2,4 - D tỷ lệ mô sẹo hình thành sẽ tăng dần đến mức cực đại và sau đó giảm dần nếu vẫn
tiếp tục tăng nồng độ 2,4 - D. Nhiều kết quả chứng minh 2,4 - D khi sử dụng một mình có
năng lực cảm ứng tạo mô sẹo hơn so với khi kết hợp với auxin khác (Rahman và cs., 2010;
Sahsavari và cs., 2010; Yinxia và cs., 2012).
Ở các nồng độ 2,4 - D khác nhau mô sẹo tăng trọng khác nhau nhưng sự sai khác
không nhiều trên các môi trường nuôi cấy (bảng 3.2), đặc điểm chung của sự tăng trọng ở
các nồng độ là trọng lượng tăng nhanh ở tuần thứ hai và có sự biểu bì hóa ở mô sẹo ở nồng
độ 2,4 - D 2 mg/l (hình 3.12, hình 3.13, hình 3.14).
Các hình thái đặc trưng của mô sẹo xuất hiện rõ vào cuối tuần thứ nhất, mô sẹo có màu
vàng và trắng trong, rễ mầm xuất hiện trong thời gian đầu, sau đó thoái hóa rễ vào tuần thứ
hai. Sự thoái hóa mô sẹo gần như hoàn toàn ở tuần thứ tư nếu không được cấy chuyền (hình
3.15 đến hình 3.18). Vào tuần thứ hai mô sẹo tăng trưởng cực đại, ở các nồng độ 2,4 - D
khác nhau ít có sự sai khác về hình thái (hình 3.19 đến hình 3.23) kết quả này phù một số
nghiên cứu báo cáo gần đây cho rằng 2,4 - D là chất điều hòa tăng trưởng thực vật thích hợp
nhất cho nuôi cấy mô ở lúa (Libin và cs., 2012; Rafique và cs., 2011; Rattana và cs., 2012;
Sahsavari và cs., 2010; Yinxia và cs., 2012) và ở cây một lá mầm khác.
Auxin được sử dụng như một chất hoạt hóa để kích thích sự phản biệt hóa tế bào và có
thể gián tiếp gây ra sự sinh phôi, ở mức phân tử 2,4 - D tạo ra sự methyl hóa DNA trong đó
duy trì sự phân bào ở mức độ cao do đó hỗ trợ giai đoạn phôi (Meneses và cs., 2005). Dù
2,4 - D rất cần thiết cho cảm ứng và phát triển của các mô sẹo, ngăn chặn sự tái sinh và do
đó có thể dẫn đến việc mất năng lực mô sẹo trong quá trình sinh phôi (Rafique và cs., 2011).
Có lẽ đây là lý do mà hiệu quả tạo mô sẹo cao nhất ở các nồng độ cao 3 mg/l và 3,5 mg/l
của 2,4 - D, nhưng sinh cơ quan và sinh phôi cao nhất đạt được khi xử lý hạt trưởng thành ở
nồng độ thấp
2 mg/l. Nồng độ tối ưu của 2,4 - D đối với năng lực cảm ứng tạo mô sẹo khác nhau
tùy thuộc vào kiểu gen, loại và tuổi mẫu cấy (Libin và cs., 2012; Roy và cs., 2012; Yinxia
và cs., 2012).

68. 66
3.2.2. Khả năng sinh cơ quan từ mô sẹo
3.2.2.1. Sự phát sinh chồi và rễ
Các mô sẹo hai tuần tuổi hình thành từ hạt trưởng thành được xử lý 2,4 - D ở nồng độ
2 mg/l và 3 mg/l được chuyển sang môi trường bổ sung BA và NAA để nghiên cứu khả
năng sinh cơ quan. Khi nghiên cứu sự sinh cơ quan của lúa Rahman và cs. (2010) cho rằng
khi cấy chuyền sang môi trường mới chỉ có 2,4 - D thì sau 3 - 4 tuần nuôi cấy mô sẹo ở tất
cả cảc nồng độ xử lý đều hóa nâu, do đó xử lý riêng rẽ 2,4 - D không phải là cách tốt nhất
để tạo ra mô sẹo sinh phôi ở lúa. Rahman và cs. (2010) cũng đánh giá chung cho sự xử lý
liên tục 2,4 - D từ 6 - 8 tuần trong nuôi cấy có ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình sinh phôi và
sinh cơ quan ở lúa, do đó sử dụng phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật với nồng
độ thích hợp là phương pháp hiệu quả cho sự sinh cơ quan và sinh phôi.
Sinh cơ quan là một quá trình phát triển của cây thông qua mẫu cấy là các mô trong
các cơ quan khác nhau của cây, do đó việc lựa chọn môi trường thích hợp nhất và đánh giá
cho các phản ứng in vitro là yêu cầu cần thiết cho mục đích trên (Rafique và cs., 2011).
Auxin và cytokinin có thể có một sự tương tác qua lại theo con đường tín hiệu trong sinh cơ
quan in vitro. Cho đến nay, cơ chế phân tử của sự tương tác như vậy giữa auxin và cytokinin
trong nuôi cấy các mô phân sinh in vitro vẫn chưa rõ (Su và cs., 2011). Trong nghiên cứu
này, NAA được thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau kết hợp với BA 1 mg/l để đánh giá
khả năng sinh cơ quan từ mô sẹo được hình thành từ môi trường MS ½ bổ sung 2,4 - D 2
mg/l và 3 mg/l. Nồng độ NAA tối ưu nhất khi kết hợp với BA 1 mg/l là 0,25 mg/l đã thể
hiện khả năng sản xuất chồi và rễ của loại mô sẹo hình thành từ môi trường 2,4 - D 2 mg/l
(chồi 63,33 % và rễ 56,7 %), từ kết quả này cho thấy tần số sản xuất chồi và rễ của mô sẹo
cũng giảm. Rahman và cs. (2010) cũng cho rằng nồng độ cao của NAA có thể ngăn chặn sự
tích lũy cytokinin làm ngăn chặn sự phát sinh hình thái. Gordon và cs. (2009) đã báo cáo
trong quá trình thực hiện nuôi cấy in vitro của mô phân sinh chồi từ mẫu rễ nuôi cấy,
cytokinin kích hoạt làm cho WUS biểu hiện trong các mô sẹo, khi WUS biểu hiện làm sự tái
sinh chồi diễn ra.
Khi xử lý auxin trước, gen AHK4 biểu hiện trong sự hình thành mô sẹo từ mẫu cấy rễ
cây Arabidopsis. Sự gia tăng phiên mã của gen AHK4 cần thiết cho WUS trong thời gian
cảm ứng tạo chồi. Hoạt động quá mức của các gen ARR7 và ARR15 ngăn chặn tái sinh chồi,
trong khi sự mất chức năng của hai gen này kích thích mạnh mẽ sự hình thành mô sẹo trên

69. 67
môi trường giàu auxin, và thúc đẩy sự cảm ứng tạo chồi trên môi trường giàu cytokinin. Các
nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng auxin ngoại sinh đã có tác động điều hòa lên sự biểu hiện
của AHK4 trong môi trường giàu auxin (gây cảm ứng mô sẹo). Sau đó, AHK4 tăng cường
đáp ứng với cytokinin ngoại sinh khi mô sẹo được chuyển giao cho môi trường giàu
cytokinin (gây cảm ứng chồi), do đó ARR7 và ARR15 có vai trò nhất định trong tái sinh
chồi (Buechel và cs. 2009). Qua đó thấy rằng phản ứng cytokinin cao thúc đẩy WUS biểu
hiện, điều này cần thiết cho sự hình thành mô phân sinh chồi. Pernisová và cs. (2009) dựa
trên một nghiên cứu tác dụng của auxin đối với sự sinh cơ quan trên mẫu cấy trụ hạ diệp,
cho rằng xử lý bằng ngoại sinh auxin kích hoạt các quá trình sinh cơ quan, đi kèm với việc
sản xuất các cytokinin nội sinh và kích hoạt một loại mô đặc biệt của cytokinin tín hiệu.
Cytokinin nội sinh điều chỉnh sự phát sinh cơ quan cảm ứng auxin thông qua một điều hòa
âm tính khi protein PIN hoạt động, dẫn đến sự phân bố auxin tối ưu từ đó kết luận rằng
cytokinin phân phối hợp lý auxin thông qua sự điều tiết lượng auxin đi ra trong quá trình
phát sinh cơ quan kiểu này. Su và cs. (2011) cũng báo cáo rằng auxin quy định sự biểu hiện
của WUS là cần thiết cho sự hình thành của mô phân sinh ngọn chồi (SAM) trong quá trình
sinh phôi. Việc tạo ra sự chêch lệch nồng độ auxin tương quan với sự biểu hiện gen WUS và
hình thành SAM tiếp theo và cho thấy sự tương tác qua lại theo con đường tín hiệu (cross -
talk) giữa auxin và cytokinin đóng vai trò quan trọng trong sự điều hòa hình thành chồi và
rễ trong quá trình sinh phôi. Pernisová và cs. (2009) đã đề xuất mô hình phát sinh cơ quan
gây ra do auxin (AIO) biểu hiện cho đặc tính tương tác giữa cytokinin và auxin trong sự
điều hòa phát triển thực vật, trong đó auxin kích hoạt sự phát sinh cơ quan và cytokinin điều
chỉnh dòng auxin ra ngoài thông qua ảnh hưởng của nó lên sự phân phối auxin. Sự điều hòa
cytokinin phụ thuộc vào sự xuất hiện của những yếu tố vận chuyển auxin, và sự ảnh hưởng
này diễn ra trong suốt thời gian diễn ra sự phát sinh cơ quan. Ở nồng độ ngưỡng auxin gây
ra sự tạo thành các cấu trúc mang những đặc điểm của sơ khởi rễ, khi kết hợp với cytokinin
thì sự tăng dần nồng độ dẫn đến sự mất dần các cấu trúc này, nếu tiếp tục tăng nồng độ
cytokinin sẽ dẫn đến sự hình thành mô khối mô sẹo, sự duy trì trong một thời gian dài các
mô trong trạng thái này sẽ dẫn đến sự chuyển thành màu xanh của các mô sẹo và đôi khi có
sự hình thành chồi mới, tuy nhiên nếu chỉ xử lý riêng ở nồng độ dưới ngưỡng thì cytokinin
thì không gây ra bất kỳ phản ứng sinh cơ quan nào. Từ đó cho thấy auxin có tác dụng kích
hoạt sự phát sinh cơ quan dưới sự điều hòa của cytokinin, kết luận này phù hợp với các công
nhận gần đây cho rằng gradient nồng độ của auxin được xem như là sự kích hoạt chung cho

70. 68
sự thay đổi chương trình phát triển ở cơ thể thực vật, nghiên cứu trên cũng cho thấy rằng
ngoài sự tương tác giữa auxin và cytokinin ở mức độ tín hiệu, cytokinin còn điều hòa phân
phối auxin thông qua sự điều chỉnh dòng auxin ra ngoài tế bào do đó sự thay đổi cytokinin
nội sinh là một phần của quá trình sinh cơ quan do auxin gây ra.
3.2.2.2. Sự hình thành phôi thể hệ (somatic embryogenesis)
Mô sẹo hai tuần tuổi được xử lý 2,4 - D ở 2 nồng độ 2 mg/l và 3 mg/l được chuyển
sang môi trường kết hợp BA và NAA để khảo sát khả năng sinh phôi, kết quả cho thấy khi
xử lý hạt trưởng thành bằng 2,4 - D ở nồng độ 2 mg/l sau đó tiếp tục xử lý kết hợp BA :
NAA (1 mg/l : 0,25 mg/l và 1 mg/l : 0,5 mg/l) thì mô sẹo của lúa Một Bụi Đỏ có năng lực
sinh phôi còn ở nồng độ 3 mg/l không quan sát thấy phôi (hình 3.30 đến hình 3.37) kết quả
trên phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu gần đây cho rằng mô sẹo khi xử lý kết hợp
auxin và cytokinin với nồng độ thích hợp sẽ làm cho mô sẹo có năng lực sinh phôi
(Shahsavari và cs., 2010; Shanthi và cs., 2010 ; Yinxia và cs., 2012). Panjaitan và cs. (2009)
cũng thể hiện trong kết quả nghiên cứu rằng khi tăng nồng độ 2,4 - D tỷ lệ cảm ứng tạo mô
sẹo sinh phôi giảm dần, tỷ lệ mô sẹo sinh phôi khi xử lý kết hợp BAP và NAA môi trường
MS cao hơn môi trường N6. Tuy nhiên nghiên cứu này không thống nhất với báo cáo của
Rafique và cs.(2011) kết luận khả năng tái sinh của mô sẹo đối với lúa cần có sự xử lý kết
hợp của BAP, NAA và GA3, đi đến kết luận rằng sự có mặt của GA3 tăng đáng kể tần số tái
sinh của mô sẹo.
Sau hai tuần nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo, sự biểu bì hóa bắt đầu từ
những cụm tế bào ở khu vực ngoại biên của khối mô sẹo hình thành các khối mô sẹo tiền
sinh phôi (hình 3.26), khi chuyển sang môi trường cảm ứng sinh phôi, sau bảy ngày các
khối mô sẹo tiền sinh phôi này tiếp tục phân chia tế bào, có sự thay đổi kích thước và hình
thái ở các tế bào ngoại vi, các cấu trúc tiền sinh phôi dần dần tách biệt với mô mẹ, sự liên
kết với các mô mẹ trở nên không rõ ràng và cuối cùng mất sự liên kết, dẫn đến hình thành
các cấu trúc phôi ở các giai đoạn khác nhau , đầu tiên là phôi hình cầu (hình 3.30), có sự
hiện diện của đám tế bào dây treo (hình 3.32, 3.33), ở cấu trúc phôi hình tim ở phía đỉnh trở
nên phẳng, lớp biều bì ở đỉnh đang trong giai đoạn hình thành lớp biểu bì của mô phân sinh
ngọn (protoderm), phía bên trong các tế bào ở đang phân chia kéo dài hình thành sơ khởi bó
mạch theo chiều dọc của phôi (hình 3.31), phôi hình núi lửa với đám tế bào dây treo và phôi
đang kéo dài (hình 3.34), sau khi xác lập trục đỉnh - đáy ở ngày nuôi cấy thứ bảy cũng quan