Khảo Sát Khả Năng Thay Thế Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Của Oligochitosan Trên Hai Môi Trưởng MURASHIGE & SKOOG

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
************
Giảng viên hướng dẫn:
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THAY THẾ CHẤT ĐIỀU HÒA
SINH TRƯỞNG CỦA OLIGOCHITOSAN TRÊN HAI
MÔI TRƯỞNG MURASHIGE & SKOOG VÀ
KNUDSON C TRONG NUÔI CẤY INVITRO LAN
DENDROBIUM THONGCHAI GOLD
Th.S LÊ THỊ MỸ PHƯỚC

Luận văn tốt nghiệp Mục lục
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC
TRANG
Trang tựa
Lời cảm ơn
Mục lục...............................................................................................................i
Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................v
Danh sách các hình............................................................................................vi
Danh sách các bảng ..........................................................................................vii
Danh sách các biểu đồ .....................................................................................viii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................1
1.2 MỤC ĐÍCH.................................................................................................2
1.3 YÊU CẦU ...................................................................................................2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1 SƠ LƯỢC VỀ CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN...................3
2.1.1 Giới thiệu chung về Chitin, Chitosan và Oligochitosan..........................3
2.1.1.1 Chitin............................................................................................3
2.1.1.2 Chitosan........................................................................................6
2.1.1.3 Oligochitosan................................................................................9
2.1.2 Nguồn của Chitin, Chitosan, Oligochitosan............................................9
2.1.3 Phương pháp chế tạo Chitin, Chitosan, Oligochitosan..........................10
2.1.3.1 Phương pháp chế tạo Chitin ........................................................10
2.1.3.2 Phương pháp chế tạo Chitosan ....................................................11
2.1.3.3 Phương pháp chế tạo Oligochitosan ............................................12
2.1.4 Ứng dụng của Chitin, Chitosan, Oligochitosan....................................17
2.1.4.1 Ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và công nghệ sinh học......17
2.1.4.2 Tác nhân cationic trong xử lý nước .............................................19
2.1.4.3 Chitosan dùng trong y học...........................................................19
2.2 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ LAN DENDROBIUM THONGCHAI GOLD 21
2.2.1 Giới thiệu họ lan ................................................................................21
2.2.1.1 Đặc điểm chung ..........................................................................21
2.2.1.2 Đặc điểm về phân loại.................................................................23
2.2.2 Giới thiệu về Dendrobium thongchai gold .........................................25
2.2.2.1 Vị trí phân loại ............................................................................25

ii
2.2.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố ............................................................25
2.2.2.3 Phân loại .....................................................................................25
2.2.2.4 Đặc điểm về hình thái..................................................................26
2.2.2.5 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium sp................28
2.2.2.6 Giá trị kinh tế..............................................................................31
2.2.2.7 Giới thiệu về lan Dendrobium thongchai gold.............................31
2.3 SƠ LƯỢC VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO ............................34
2.3.1 Sơ lược về các phương pháp nhân giống truyền thống .......................31
2.3.2 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô thực vật.......34
2.3.3 Mục đích và ứng dụng thực tiễn.........................................................36
2.3.3.1 Mục đích.....................................................................................36
2.3.3.2 Ứng dụng thực tiễn......................................................................37
2.3.4 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô thực vật..........................................38
2.3.4.1 Ý nghĩa sinh học căn bản ............................................................38
2.3.4.2 Ý nghĩa thực tiễn.........................................................................38
2.3.5 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật..............................................39
2.3.5.1 Nước...........................................................................................39
2.3.5.2 Agar............................................................................................39
2.3.5.3 Nguồn carbon..............................................................................40
2.3.5.4 Chất khoáng................................................................................40
2.3.5.5 Vitamin.......................................................................................41
2.3.5.6 Các chất điều hòa sinh trưởng .....................................................41
2.3.5.7 Chất trích từ cây trồng.................................................................42
2.3.5.8 Amino acid..................................................................................42
2.3.5.9 Than hoạt tính .............................................................................42
2.3.6 Những vấn đề trong nhân giống in vitro..............................................43
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ......................44
3.1.1 Địa điểm .............................................................................................44
3.1.2 Thời gian ............................................................................................44
3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.....................................................................44
3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM........................................................................44
3.3.1 Mẫu cấy mô thực vật..........................................................................44
3.3.2 Mẫu Oligochitosan.............................................................................46
3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm............................................................................46
3.3.4 Môi trường nuôi cấy mô thực vật.......................................................46
3.4 ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM......................................................................47

iii
3.5 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ..............................................................47
3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường MS bổ sung
OligoChitosan có Mw ~ 3,5 kDa ở các nồng độ khác nhau trong nuôi cấy in vitro
lan Dendrobium................................................................................................47
3.5.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường KC bổ sung
lan Dendrobium................................................................................................48
3.5.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường MS bổ sung
OligoChitosan có Mw ~ 7,5 ở các nồng độ khác nhau trong nuôi cấy in vitro lan
Dendrobium .....................................................................................................49
3.5.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường KC bổ sung
lan Dendrobium................................................................................................50
3.6 XỬ LÝ THỐNG KÊ................................................................................52
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Ảnh hưởng của Oligochitosan có khối lượng phân tử 3,5 KDa được bổ sung
vào môi trường MS lên khả năng tạo chồi ở các nồng độ khác nhau trong nuôi
cấy in vitro lan Dendrobium.............................................................................53
vào môi trường KC lên khả năng tạo chồi ở các nồng độ khác nhau trong nuôi
4.3 So sánh hiệu ứng kích của Oligochitosan có cùng khối lượng phân tử Mw
~3,5 KDa lên khả năng tạo chồi trên hai môi trường khác nhau........................64
4.4 So sánh hiệu ứng kích thích chiều cao chồi của hai loại môi trường MS và
KC khi bổ sung Oligochitosan (Mw~3,5) vào môi trường nuôi cấy in vitro lan
Dendrobium .....................................................................................................65
vào môi trường MS lên khả năng tạo chồi ở các nồng độ khác nhau trong nuôi
vào môi trường KC lên khả năng tạo chồi ở các nồng độ khác nhau trong nuôi
4.7 So sánh hiệu ứng kích của Oligochitosan có cùng khối lượng phân tử Mw
~7,5 KDa lên khả năng tạo chồi trên hai môi trường khác nhau........................77
4.8 So sánh hiệu ứng kích thích chiều cao chồi của hai loại môi trường MS và
KC khi bổ sung Oligochitosan (Mw~7,5) vào môi trường nuôi cấy in vitro lan
Dendrobium .....................................................................................................78

iv
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN...............................................................................................79
5.2 KIẾN NGHỊ ..............................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................81
PHỤ LỤC........................................................................................................84

Luận văn tốt nghiệp Danh mục bảng biểu
v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Mw : Molecular weight
KDa : Kilo Dalton
ĐC : Đối chứng
SVĐC : So với đối chứng
EDTA : Ethylene diamin-tetra-acetic acid
Chất điều hoà tăng trưởng
BA : 6-benzyl adenin
GA3 : Gibberellin
IAA : Indole-3-acetic acid
NAA : Naptalen Acetic Acid
2,4 D : Acid 2,4 – Dichlorophenoxy Acetic
Môi trường
MS : Murashige và Skoog (1962)
KC : Knudson C

vi
DANH MỤC HÌNH
HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của chitin............................................................4
Hình 2.2 Chitin và vỏ tôm............................................................................5
Hình 2.3 Cấu trúc phân tử của chitosan........................................................6
Hình 2.4 Một số giống hoa đẹp của họ Orchidaceae..................................24
Hình 2.5 Lan Dendrobium thongchaigold.................................................24
Hình 2.6 Một số dạng hoa đẹp của Dendrobium .......................................33
Hình 2.7 Tổng quan về lan Dendrobium. ..................................................33
Hình 3.1 Chồi Lan Dendrobium được sử dụng ở các thí nghiệm................45
Hình 4.1 Một số hình ảnh thu được từ các nghiệm thức đối với
Oligochitosan(Mw~3,5 KDa) , môi trường MS ...........................58
Oligochitosan(Mw~3,5 KDa) , môi trường KC ..........................63
Oligochitosan(Mw~7,5 KDa) , môi trường MS ...........................71
Oligochitosan (Mw~7,5 KDa) , môi trường KC ............................76

vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ
TRANG
Biểu Đồ 2.1 Ảnh hưởng của liều xạ trên khối lượng phân tử của chitosan chiếu
xạ trong tình trạng rắn ......................................................................................16
Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của các nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử
3,5 KDa lên khả năng tạo chồi (a) và chiều cao chồi (b) trong nuôi cấy in vitro
lan Dendrobium trên môi trường MS................................................................54
Biểu Đồ 4.2 Ảnh hưởng của các nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử
lan Dendrobium trên môi trường KC................................................................60
Biểu đồ 4.3 Sự gia tăng chồi của hai loại môi trường MS và KC khi bổ sung
Oligochitosan ( Mw~3,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy in vitro
lan Dendrobium ở những nồng độ khác nhau....................................................64
Biểu đồ 4.4 Sự gia tăng chiều cao chồi của hai loại môi trường MS và KC khi
bổ sung Oligochitosan ( Mw~3,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy
in vitro lan Dendrobium ở những nồng độ khác nhau .......................................66
lan Dendrobium trên môi trường MS................................................................68
lan Dendrobium trên môi trường KC................................................................73
Biểu đồ 4.7 Sự gia tăng chồi của hai loại môi trường MS và KC khi bổ sung
Oligochitosan ( Mw~7,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy in vitro
lan Dendrobium ở những nồng độ khác nhau....................................................77
Biểu đồ 4.8 Sự gia tăng chiều cao chồi của hai loại môi trường MS và KC khi
bổ sung Oligochitosan (Mw~7,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy
in vitro lan Dendrobium ở những nồng độ khác nhau .......................................78

viii
DANH MỤC BẢNG
BẢNG
TRANG
Bảng 2.1. Enzyme thủy phân các polysaccharide tương ứng ...........................13
Bảng 3.1 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 3,5
KDa được bổ sung vào môi trường ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo
chồi trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium.....................................................48
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 3,5 kDa được bổ sung vào
môi trường MS ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo chồi trong nuôi cấy in
vitro lan Dendrobium .......................................................................................53
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 3,5 KDa được bổ sung vào
môi trường KC ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo chồi trong nuôi cấy in
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 7,5 KDa được bổ sung vào
môi trường MS ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo chồi trong nuôi cấy in
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~7,5 KDa được bổ sung vào
môi trường KC ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo chồi trong nuôi cấy in

Luận văn tốt nghiệp Giới thiệu
1
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ:
Trong những năm gần đây với chính sách mở rộng đầu tư về mọi mặt của
Nhà nước, đời sống vật chất và tinh thần của người dân ngày càng được cải thiện
và nâng cao. Song song với nhu cầu về vật chất thì nhu cầu tinh thần đặc biệt
không thể thiếu được. Từ lâu con người đã thích trồng hoa, cây cảnh vừa để trang
trí cho đẹp, vừa để giải trí tinh thần. Mỗi người thích trồng một loài hoa khác
nhau, việc lựa chọn loài hoa nào thường tuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu của
vùng đó, vẻ đẹp của hoa, cũng như là hoa đó có dễ trồng và chăm sóc hay không.
Hoa lan được nhiều người ưa thích, bởi lẽ hoa lan có cấu trúc kiêu kì và phức tạp,
nhất là bộ phận môi có những nét chạm trổ rất tinh vi, lại rất phù hợp với điều
kiện khí hậu của Việt Nam, dễ chăm sóc và mỗi người có thể chọn loại hoa lan
mình thích tuỳ theo túi tiền của mình mà vẫn thoả mãn được thú vui tao nhã.
Phong lan ở nước ta rất phong phú và đa dạng, có nhiều giống khác nhau
như: Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… chúng
đều cho hoa rất đẹp và mang nhiều màu sắc khác nhau. Nó có thể dùng để trang
trí, trưng bày, làm đẹp, dùng trong các buổi lễ… hay người ta có thể bán hoa cắt
cành - kinh doanh. Trong số đó có lẽ Dendrobium là giống đặc sắc nhất từ màu
sắc, dạng hoa cho đến giống loài. Mặt khác, Dendrobium cũng rất dễ trồng, rất
siêng hoa và lâu tàn. Do đó nó rất được ưa chuộng và được trồng phổ biến nhất
nước ta hiện nay nhằm phục vụ cho nhu cầu cuộc sống.
Ngày nay, việc nhân giống cây trồng in vitro đã không còn xa lạ nữa. Với
những đóng góp vào nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực nhân giống cây trồng,
có thể nói đây là phương pháp tốt nhất và hiệu quả nhất hiện nay để nhân giống
thực vật. Bằng phương pháp này chúng ta có thể tạo ra nhiều cây giống với thời
gian rất ngắn, trong đó đa phần các giống lan thương phẩm đều được nhân giống
bằng phương pháp nuôi cấy mô. Trước đây, người ta thường dùng môi trường
dinh dưỡng có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng để nuôi cấy in vitro tế bào
thực vật. Tuy nhiên, hiện nay các chất điều hòa sinh trưởng này vẫn còn rất đắt

Luận văn tốt nghiệp Giới thiệu
2
tiền. Việc nghiên cứu bổ sung các chất mới vào môi trường nhằm làm tăng tính
kích thích tăng trưởng, giảm thời gian nuôi cấy và giảm chi phí nuôi cấy mô cũng
là một vấn đề đáng quan tâm.
Từ lâu Oligosacharide nói chung và Oligochitosan nói riêng được biết đến
bởi rất nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như nông nghiệp, lâm
nghiệp, y học…. Một trong những ứng dụng được nghiên cứu gần đây là khả
năng kích thích sự sinh trưởng và phát triển mô thực vật. Nhiều nghiên cứu đã
chứng minh Oligochitosan đóng vai trò như là một chất có khả năng kích thích sự
hấp thu các chất dinh dưỡng của mô thực vật, đồng thời còn có tác dụng gia tăng
hiệu ứng phytoalexin của mô cây giúp cho cây không chỉ tăng trưởng nhanh mà
còn kháng lại một số loại bệnh do vi sinh vật gây nên. Hơn nữa, nguồn chế biến
Oligochitosan hiện nay rất dễ tìm và rẻ tiền vì là sản phẩm phế liệu của ngành
thủy sản.
Từ những vấn đề đã đặt ra, chúng tôi tiến hành thực hiện thử nghiệm đề tài:
“Khảo sát khả năng thay thế chất điều hòa sinh trưởng của Oligochitosan trên hai
môi trường Murashige & Skoog (MS) và Knudson C (KC) trong nuôi cấy in vitro
lan Dendrobium thongchai gold”.
1.2 MỤC ĐÍCH
Nuôi cấy mô cây lan Dendrobium thongchai gold để tạo nguồn nguyên liệu
phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất.
Xác định ảnh hưởng của Oligochitosan trong nuôi cấy in vitro lan
Dendrobium thongchai gold trên hai môi trường khác nhau.
1.3 YÊU CẦU
Xác định được nồng độ thích hợp của Oligochitosan được bổ sung vào môi
trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sinh trưởng và phát triển của lan
Dendrobium thongchai gold trên hai môi trường Murashige và Skoog (MS) và
Knudson C (KC).

Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu
3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 SƠ LƯỢC VỀ CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN
2.1.1 Giới thiệu chung về Chitin, Chitosan và Oligochitosan
2.1.1.1 Chitin
Giống như cellulose, chitin là một glycan chứa liên kết  (1-4), nhưng được
cấu tạo bởi các đơn vị 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose, hay còn gọi là các đơn vị
N-acetylglucosamine. Chitin là một polymer tự nhiên nhiều thứ hai sau cellulose.
Các phân tử chitin sau khi tổng hợp liên kết với nhau bằng liên kết hydrogen giữa
các nhóm –NH- trong phân tử này với các nhóm C=O của mạch lân cận. Chitin
có 3 dạng là: α, β, γ – chitin. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác
nhau về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch (Sydney,
London, 1965).
Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi
tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ-
chitin được mô tả như sau:
α - Chitin β - Chitin γ – Chitin
α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên
ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các
lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp
đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng
phổ biến trong tự nhiên.
β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và
hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết
hydro. Dạng γ - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình
acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn.

4
Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm đặc
thì ngườ ta nhận thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer đươc tạo thành từ
các đơn vị N-Acetyl- β-D- Glucosamin liện kết với nhau bỡi liên kết β-(1-4)
glucoside.
Chitin có mật độ liên kết hydrogen cao khi ở trạng thái rắn vì vậy hoàn toàn
không tan trong nước, trong hầu hết các dung môi hữu cơ, các acid loãng và dung
dịch kiềm đặc. Nhưng lại tan trong acid formic và trong dung dịch đặc của một
số muối.
Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của chitin
Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột,
không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng
và các dung môi hữu cơ như eter, rượu… nhưng tan trong dung dịch đặc nóng
của muối thiocyanate liti (LiSCN) và thiocyanate canxi (Ca(SCN)2) tạo thành
dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid – LiCl 8% (Phạm Lê Dũng và
ctv, 1997), tan trong hexafluoro-isopropy alcohol (CF3CHOHCH3) và
hexafluoracetonesesquihydrata (CF3COCF3H2O) (Kim.S.S và ctv, 1996). Chitin
có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 cm-1
.
Chitin ổn định với các chất oxy hóa mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxy già
(H2O2); nước javel (NaOCl – NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử
dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin.

5
Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ cao
thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan.
- CH2OH -CH2OH
Chitin - OH chitosan -OH
- NHCOCH3 - NH2
Khi đun nóng trong acid HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt
mạch thu được glucosamin:
- CH2OH -CH2OH
Chitin - OH glucosamin -OH
- NHCOCH3 - NH2
Phản ứng este hóa :
- Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat.
- Chitin tác dụng với anhydrit sulfuric trong pyrydin, dioxan và N,N -
dimetylanilin cho sản phẩm chitin sulfonat.
Hình 2.2: Chitin và vỏ tôm
NaOH 40 – 50%
T0
cao
HCl 36%
T0
cao

6
2.1.1.2 Chitosan
Chitosan là một polymer tự nhiên được hình thành từ N-deacetyl chitin,
mang điện tích dương, không có độc tính, có khả năng phân hủy sinh học, và
tương hợp sinh học. Chitosan có cấu tạo từ các đơn vị glucosamine, hay các 2-
amino-2-deoxy-D-glucose liên kết với nhau bởi nối  (1-4) glucoside.
Thuật ngữ chitosan được dùng khi hàm lượng Nitơ cao hơn 7% khối lượng
phân tử hay khi độ deacetyl cao hơn 60%. Sự khác biệt cơ bản của chitin và
chitosan là khả năng hòa tan của chúng trong dung dịch acid loãng, chitosan hòa
tan nhiều trong các dung dịch còn chitin hầu như không tan.
 Tính chất và cấu tạo hóa họa của chitosan:
Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất
quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế.
Chitosan là dẫn xuất N - deacetyl hóa của chitin. Uridin - diphosphat - N -
acetyl - D - glucosamin được polymer hóa thành chitin nhờ enzyme synthetase,
chitin N - deacetylase xúc tác cho phản ứng N - deacetyl hóa chitin thành
chitosan. Chitinase và lysozyme xúc tác phản ứng thủy phân chitosan tạo thành
oligosaccharide tương ứng. Những enzyme này có nhiều trong mô thực vật, động
vật, côn trùng, và các vi sinh vật trong đất, thủy quyển và sinh quyển.
Tên hóa học của Chitosan là poly - β - (1  4) - D - glucosamin. Hay còn
gọi là poly - β - (1 - 4) - 2 - amino - 2 - desoxy - D – glucosamin.
Hình 2.3 Cấu trúc phân tử chitosan
Công thức phân tử: [C6H11O4N]n
Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

7
Qua cấu trúc của chitin - chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt
động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2
trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2, do đó
chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin. Trong thực tế các mạch
chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách
và phân tích chúng rất phức tạp.
Chitin tan trong dung dịch acid HCl 12N hoặc tan trong dung dịch
LiCl/dimetylacetamide, chitosan hoàn tan trong dung dịch acid yếu CH3COOH.
Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế
nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2).
Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các
mắt xích N -acetyl -D - glucosamin và nhóm -OH, nhóm -NH2 trong các mắt xích
D - glucosamin có nghĩa chúng vừa là alcol, vừa là amin, vừa là amid. Các nhóm
chức này có khả năng phản ứng để tạo ra các dẫn xuất khác nhau của chitosan.
Chitosan là polymer mà các monomer được nối với nhau bới các liên kết β -
(1 - 4) - glucoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như:
acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân.
 Tính chất lý hoá của chitosan
Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc vảy,
không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 – 3110
C. Trọng lượng phân tử
chitosan phụ thuộc vào điều kiện sản xuất thường nằm trong khoảng 10.000 –
1.000.000 Daltons.
Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hòa tan
được trong dung dịch acid hữu cơ loãng như acid acetic, acid fomic, acid lactic…
tạo thành dung dịch keo trong suốt. Chitosan hòa tan trong dung dịch acetic 1-
1,5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch acid loãng liên quan đến kích thước
và khối lượng trung bình của chitosan đây cũng là tính chất chung của tất cả các
dung dịch polyme ( Nguyễn Thị Huệ và Bùi Thị Huyền, 2005). Chitosan kết hợp
với aldehyd trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế
bào, enzyme. Chitosan phản ứng với acid đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan
tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím.

8
 Tính chất sinh học của chitosan
Chitosan không độc, dùng an toàn cho người. Chúng có tính hòa hợp sinh
học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học.
Chitosan có nhiều tác dụng đa sinh học như: tính kháng nấm, tính kháng
khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế
bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng
cầm máu, chống sưng u.( Mosbay.M.và Deral.T. Pat, 1998).
Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ
huyết áp, chống rối loạn nội tiết ( Jing. S. B. và ctv, 1997).
Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptid – insulin, kích thích việc tiết
ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan được dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều
công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ
thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển của tế bào u,
ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan ( Yao
Kangde và ctv, 1999)
 Độc tính của chitosan
Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc,
chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và
người.
Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kết
luận: chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ
thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm
bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô (Shigehiro Hirano và
ctv, 1990).
Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch,
không thấy có tích luỹ ở gan. Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷ
sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh
chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách. Nhiều
tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ
tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những đối với

9
động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết
thương ( Inui Hiroshi Appl. Biol. Sci, 1997)
2.1.1.3 Oligochitosan
Oligochitosan là một phân đoạn có phân tử lượng trung bình nhỏ hơn 20
KDa và độ polymer hóa dp < 100. Trong đó phần Oligomer tan trong môi trường
trung tính có phân tử lượng nhỏ hơn 5 KDa .
Oligochitosan là đoạn mạch polymer của  -D-glucosamine liên kết với
nhau bằng liên kết 1,4 glucoside.
2.1.2 Nguồn gốc của chitin, chitosan, oligochitosan
Chitin - chitosan là một polysacharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượng
rất lớn (đứng thứ hai sau cellulose). Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động
vật và thực vật
Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một
số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn.
Trong động vật bậc cao monomer của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô
da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin
có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại
tảo...(Đặng Văn Luyến, 1995).
Hàm lượng chitin trong các loài giáp xác vào khoảng từ 2 - 12% trọng lượng
cơ thể. Hàm lượng chitin trong vỏ thay đổi phụ thuộc vào quy trình điều chế,
mùa thu hoạch, độ tuổi, chế độ môi trường dinh dưỡng của loài giáp xác. Thông
thường vỏ của các loài giáp xác như tôm, cua, chứa khoảng 13% - 42% chitin .
Mai mực cũng là một nguồn cung cấp chitin được chú ý . Nguồn chitin thu
được từ mai mực hàng năm vào khoảng 0,7 triệu tấn. Vì thông thường vỏ chitin
được chế tạo từ vỏ giáp xác thì phải xử lý bằng acid để loại khoáng, calcium
nhưng đối với mai mực thì hàm lượng khoáng và calcium ít hơn và trong nhiều
trường hợp có thể bỏ qua bước loại khoáng. Sự thay đổi này trong quy trình điều
chế chitin làm hạ chi phí sản xuất cũng như giảm sự thủy phân acid của chitin
trong suốt quá trình điều chế. Do đó, chitin được chiết xuất từ mai mực sẽ có chất
lượng tốt hơn chitin được chiết từ vỏ các loài giáp xác.

10
Chitin - chitosan là polysacharide có đạm không độc, có khối lượng phân tử
lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharide (N-acetyl-β-D-
glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucoside và hình thành một
mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu
như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và
các hợp chất hữu cơ khác.
2.1.3 Phương pháp chế tạo Chitin, Chitosan và Oligochitosan
2.1.3.1 Phương pháp chế tạo Chitin
Hiện nay có rất nhiều quy trình khác nhau được áp dụng để sản xuất chitin.
Các phương pháp này phải đạt yêu cầu loại bỏ hiệu quả các thành phần khác, và
nếu có thể thì sử dụng luôn các thành phần đó cho những mục đích khác. Thông
thường việc cô lập chitin bao gồm khử khoáng, loại protein và tẩy trắng
(J.Synowiecki, 2003).
Việc khử khoáng có thể đạt được sau 1 giờ đến 3 giờ chiết suất bằng dung
dịch acid HCl loãng nồng độ từ 1% đến 8% ở nhiệt độ phòng. Sự khử khoáng có
thể thực hiện hoàn toàn khi lượng acid sử dụng lớn hơn hàm lượng khoáng. Để
tránh xảy ra sự cắt mạch của chitin người ta có thể dùng ethylene diamin-tetra-
acetic acid (EDTA) để loại khoáng (J.Synowiecki, 2003). Để hàm lượng khoáng
còn lại ít có thể kéo dài thời gian phản ứng lên đến 24 giờ song điều đó cũng gây
nên sự cắt mạch chitin.
Việc loại protein được thực hiện với dung dịch NaOH hoặc KOH. Hiệu quả
của việc khử protein bằng kiềm phụ thuộc vào nhiệt độ phản ứng, nồng độ kiềm,
và tỉ lệ dung dịch kiềm với lượng vỏ giáp xác. Thông thường, khoảng nồng độ
của dung dịch kiềm là từ 1% - 10%, nhiệt độ từ 650
C đến 1000
C. Hầu như tất cả
protein chứa trong vỏ tôm và cua được loại bỏ hết khi sử dụng nhiệt độ 900
C và tỉ
lệ khối lượng vỏ đối với dung dịch là 1/20 (khối lượng/thể tích). Khoảng thời
gian phản ứng từ 0.5 giờ đến 6 giờ. Kéo dài thời gian sẽ dẫn đến sự cắt mạch và
deacetyl hóa polysaccharide. Người ta cũng có thể dùng enzyme để loại các
protein từ vỏ các loài giáp xác. Hiện nay enzyme thương mại alacalase có thể thu
được chitin chỉ chứa khoảng 4,5% tạp chất protein (J.Synowiecki, 2003). Tuy

11
nhiên chitin được dùng để sản xuất chitosan, thì lượng protein còn lại có thể được
loại bỏ dễ dàng trong khi xử lý kiềm ở quá trình điều chế tiếp theo.
Việc loại các chất còn lại trong chitin có thể được làm bằng cách chiết xuất ở
nhiệt độ phòng với acetone, chloroform, ethyl acetate hay cồn và hỗn hợp ether.
Việc tẩy trắng thường được thực hiện bằng việc xử lý với dung dịch NaOCl
hay H2O2.
Ngày nay có rất nhiều công ty đang sản xuất chitin và chitosan ở mức độ
công nghiệp. Đa số chúng tập trung ở Hoa Kỳ và Nhật Bản, từ đây một lượng lớn
chitin và chitosan được sản xuất hằng năm từ vỏ các loài tôm và cua.
2.1.3.2 Phương pháp chế tạo Chitosan
Chitosan được điều chế bằng cách N-deacetyl chitin thu được từ vỏ tôm
và cua. Việc tạo ra nhóm acetamindodeoxy carbohydrate có thể được thực hiện
trong các điều kiện acid hoặc kiềm nhưng một số trở ngại về mặt lập thể có thể
gây cản trở phản ứng. Nhiều nổ lực đã đưa ra nhưng nhóm N-acetyl không thể
được loại bỏ bằng acid nếu không kèm theo sự thủy phân mạch polysaccharide
(A. Tolaimate, 2000).
Có rất nhiều người đề nghị quy trình điều chế chitosan khác nhau, song
nhìn chung điều này được thực hiện ở những sự kết hợp khác nhau của nhiệt độ
(800
C đến 1400
C), nồng độ kiềm (30% đến 60%) và thời gian lên đến 10 giờ.
Những thông số này phải được kiểm soát chặt chẽ bởi những ảnh hưởng của
chúng tới độ deacetyl, khối lượng phân tử, sự phân bố khối lượng, cũng như sự
phân bố của các đơn vị deacetyl dọc theo mạch polymer. Và những tính chất này
phản ánh sự hữu ích của chitosan trong nhiều ứng dụng, đặc biệt trong công nghệ
dược.
Các thí nghiệm được thực hiện trên  -chitin thu được từ vỏ tôm cho thấy
kết quả là: Sự điều chế chitosan ở nồng độ kiềm không cao, nhiệt độ thấp, và kéo
dài thời gian sẽ làm cho các phần được deacetyl hóa trong mạch polymer phân bố
một cách ngẫu nhiên, nếu quá trình thực hiện ở nhiệt độ cao làm tăng độ deacetyl
hóa nhưng mặc khác cũng làm giảm kích thước của phân tử (A. Tolaimate, 2000;
J.Synowiecki, 2003).

12
Vì  -chitin có hoạt tính sinh học cao hơn dạng  -chitin trong các phản
ứng hóa học đặc biệt trong quá trình deacetyl hóa nên quy trình điều chế sẽ khác
đi đôi chút (A. Tolaimate, 2000). Điều này được giải thích là do  -chitin có cấu
trúc mở (sự sắp xếp song song của các sợi chitin) hơn dạng anpha của nó làm cho
liên kết hydrogen yếu hơn vì vậy  -chitin có khả năng hòa tan và trương tốt hơn
(P. Methacanon, 2003).
Theo các nghiên cứu của Kurita và cộng sự để thu được  -chitin có độ
deacetyl hóa 80% có thể sử dụng dung dịch NaOH 40%, nhiệt độ 800
C trong điều
kiện khí nitrogen trong 3 giờ. Theo Kurita, sự deacetyl hóa dị thể diễn ra ưu tiên
trong vùng vô định hình của chitin, sau đó diễn biến từ ngoài vào trong vùng tinh
thể. Chang và cộng sự cho rằng sự cắt mạch diễn ra đồng thời với sự deacetyl
hóa, cản trở sự cạnh tranh với deacetyl (P. Methacanon,2003). Chang cũng cho
rằng cơ chế của sự deacetyl hóa dị thể chitin có thể được kiểm soát bởi điều kiện
phản ứng và khả năng khuyếch tán. Tolaimate cho rằng sử dụng quy trình của
Kurita ít xảy ra hiện tượng cắt mạch chitosan do đó có thể thu được chitosan có
khối lượng phân tử cao và sản phẩm có độ deacetyl hóa rộng .
2.1.3.3 Các phương pháp chế tạo Oligochitosan
Các Oligochitosan tự nhiên có thể được thu nhận trực tiếp bằng cách tách
chiết và tinh chế chúng nhưng chủ yếu chế tạo từ các polychitosan. Có rất nhiều
phương pháp khác nhau để điều chế Oligochitosan từ chitosan đã được các tác
giả trong và ngoài nước sử dụng như dùng các tác nhân hóa học (acid HCl,
H3PO4, HNO2 v.v…), các tác nhân oxy hóa (K2S2O8, NaNO3, H2O2 v.v…), dùng
enzyme sinh học và phương pháp vật lý (bức xạ UV, gamma Co-60, sóng siêu
âm, nồi hấp áp suất cao v.v…). Tuy nhiên, hiện tại có ba phương pháp chế tạo
Oligochitosan được sử dụng phổ biến đó là: Phương pháp sinh học, phương pháp
hóa học và phương pháp bức xạ.
 Phương pháp sinh học
Đây là quá trình thủy phân các phân tử polysaccharide có mạch dài hơn nhằm
tạo nên các Oligochitosan có mạch ngắn hơn nhờ tác dụng của các enzyme.
Phương pháp dùng enzyme để chế tạo Oligochitosan đã được con người áp dụng
từ rất lâu trong công nghệ lên men, điển hình là quá trình chế tạo mạch nha từ
tinh bột nhờ hoạt động của thủy phân của enzyme amylase tách từ các mầm của
hạt ngũ cốc.

13
Bảng 2.1. Enzyme thủy phân các polysaccharide tương ứng
Enzyme Nguồn gốc thu nhận Polysaccharide
Amylase Mầm lúa, vi khuẩn và
tụy
Tinh bột, glucogen
Phosphorylase Vi khuẩn, nấm men,
động vật và thực vật
Amylose, amylopectin
Lysozyme Sản phẩm tiết của động
vật, lòng trắng trứng
Polysaccharide của thành
tế bào
Alginate-lyase Vi khuẩn Aliginate
Chitinnase Nấm Chitin
Chitosanase Nấm Chitosan
Động học của phản ứng xúc tác enzyme trong quá trình lên men diễn ra khá
phức tạp và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như nồng độ enzyme, nồng độ
cơ chất, điều kiện của môi trường phản ứng (nhiệt độ, pH v.v…) và cấu trúc của
polymer. Điều đặc trưng cho phản ứng xúc tác là phản ứng có độ đặc hiệu cao,
mỗi loại enzyme chỉ có tác dụng đối với một hoặc một số loại cơ chất nhất định,
thậm chí đối với một loại cấu trúc hay một loại liên kết nhất định.
Người ta có thể thu nhận enzyme từ các nguồn khác nhau như thực vật, động
vật hay vi sinh vật. Các enzyme cùng loại có phản ứng đặc hiệu là giống nhau
nhưng tốc độ của phản ứng xúc tác là khác nhau và điều kiện tối ưu của môi
trường phản ứng như nhiệt độ, pH v.v… cũng khác nhau.
Quá trình thủy phân polymer tự nhiên nói chung và polysaccharide nói riêng
được tiến hành trong dung dịch với sự có mặt của hệ đệm tương ứng cho từng
loại enzyme. Các enzyme có bản chất là protein và rất nhạy cảm với nhiệt độ,
thường là chúng bị bất hoạt ở nhiệt độ cao và không có khả năng phục hồi, vì vậy
khi muốn dùng phản ứng trong công nghệ enzyme người ta nâng nhiệt độ phản
ứng lên 1000
C trong vòng 3 đến 10 phút. Điều đáng chú ý ở đây là trong sản
phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân polysaccharide bằng enzyme luôn luôn
là một hỗn hợp bao gồm các oligosaccharide có khối lượng phân tử khác nhau.
Các phân đoạn (fraction) này được tách bằng phương pháp sắc ký cột

14
(fractionation) và khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chúng được xác định
bằng sắc ký gel (GPC) hoặc là sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Bằng phương pháp
enzyme, Izume đã thủy phân 2,27g chitosan bằng chitosanase trong 6 giờ đã thu
được hỗn hợp Oligo D-glucosamine bao gồm di, tri, tetra, và panda D-
glucosamin với hàm lượng tương đương như sau: 238 mg, 719mg và 207mg.
Tương tự, Rochas và Heyraud (1981) đã thủy phân K-caraghinan bằng K-
caraghinase đã thu được hỗn hợp oligoneocarabio từ mono đến penta. Mặc khác
theo kết quả của Chabrecek (1991) khi tiến hành thủy phân Natri hyaluronate
bằng enzyme hyaronidase theo thời gian từ 30 - 2880 phút đã thu được các hỗn
hợp các sản phẩm oligohyaluronate có Mw khác nhau. Điều đáng chú ý ở đây là
độ phân bố khối lượng phân tử (D = Mw/Mn) tăng dần và đạt giá trị cao nhất sau
180 phút xử lý (D0 = 1,28, D180 = 2,34) và sau đó giảm xuống (D2880 = 1,4). Như
vậy thời gian phản ứng càng dài thì giá trị Mw càng giảm và độ phân bố càng
đồng nhất hơn.
Nói chung phương pháp thủy phân bằng enzyme thủy phân thích hợp cho
mục đích chế tạo Oligosaccharide có khối lượng phân tử rất thấp (di hoặc mono)
nếu thời gian phản ứng đủ dài.
 Phương pháp hóa học
Cũng giống như phương pháp enzyme là thủy phân các polysaccharide mạch
dài thành các oligosaccharide có mạch ngắn hơn, nhưng khác nhau ở chỗ là trong
quá trình này tác nhân thủy phân không phải là enzyme mà là tác nhân hóa học.
Phương pháp này đơn giản hơn nhiều so với phương pháp enzyme, giá thành
thấp và cũng được con người từ lâu sử dụng để chế tạo một số loại đường
maltose.
Trong quá trình chế tạo bằng phương pháp hóa học thì các tác nhân thủy
phân thường được dùng là các acid vô cơ mạnh như HCl, HNO3 v.v… hoặc các
chất kiềm mạnh như NaOH, KOH v.v… ở nhiệt độ cao (thường là 80 - 1000
C).
Các tác nhân này chủ yếu có tác dụng thủy phân các liên kết glucoside trong
mạch của phân tử polysaccharide. Nếu như enzyme thủy phân các liên kết này
một cách đặc hiệu thì các tác nhân hóa học thủy phân chúng hoàn toàn không đặc
hiệu. Môi trường phản ứng trong phương pháp này là dung dịch nước, nhưng quá

15
trình xảy ra không phụ thuộc nghiêm ngặt vào điều kiện môi trường như độ pH,
đệm v.v…như trong trường hợp của enzyme. Điều đáng chú ý ở đây là tốc độ
của phản ứng thủy phân thường phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ cũng như nồng
độ của các tác nhân hóa học. Thông thường khi tăng nhiệt độ hoặc tăng nồng độ
của các tác nhân thủy phân thì tốc độ phản ứng sẽ xảy ra nhanh hơn và triệt để
hơn.
J.Zhishen và S.Dongfeng đã nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ và thời
gian phản ứng lên việc chế tạo chitosan trọng lượng phân tử thấp bởi tác nhân
acid phosphoric. Chitosan khối lượng phân tử thấp được phân hủy bởi acid
phosphoric 85% với thời gian và nhiệt độ phản ứng khác nhau. Ở nhiệt độ phòng,
khối lượng phân tử trung bình của các chitosan có khối lượng phân tử thấp từ 71
KDa đến 214 KDa sau 35 ngày xử lý. Tốc độ giảm cấp giảm khi gia tăng thời
gian thủy phân, sản lượng chitosan cũng giảm từ 68,4% đến 40,2% sau 35 ngày.
Tại nhiệt độ 400
C, 600
C, 800
C, khối lượng phân tử giảm dần theo thứ tự là từ 37
KDa, 35 KDa, 20 KDa trong 8 giờ thủy phân, sản lượng chitosan còn lại ở mức
độ cao so với nhiệt độ phòng là 86,5%, 71,4% và 61,3 % khi xử lý theo thứ tự ở
400
C, 600
C, và 800
C. Thời gian phản ứng khác nhau đã tạo ra những sản phẩm
chitosan có khối lượng phân tử khác nhau. Ở 600
C khối lượng phân tử của sản
phẩm giảm từ 214 KDa xuống còn 74 KDa trong thời gian là 4 giờ, sau đó giảm
một cách chậm dần và đạt 19 KDa trong 15 giờ. Một điều được nhận thấy là tính
tan trong nước của chitosan cũng được gia tăng khi khối lượng phân tử giảm
xuống. Từ kết quả cho thấy năng suất của phản ứng và khối lượng phân tử của
chitosan phụ thuộc khá lớn vào nhiệt độ và thời gian phản ứng. Như vậy nhiệt độ
và thời gian thủy phân của chitosan trong dung dịch acid phosphoric 85% được
xác định rõ là: nhiệt độ 600
C và thời gian là 15 giờ có thể thu được chitosan có
khối lượng phân tử từ 19 KDa đến 20 KDa. Độ hòa tan trong nước của chitosan
cũng gia tăng khi khối lượng phân tử giảm. Những chitosan có khối lượng phân
tử thấp này có thể rất hữu dụng như là một hợp chất có hoạt tính sinh học
(J.Zinshen and S. Dongfeng, 2002).
Năm 1931, Bermann và Siberkweit đã thủy phân chitin bằng acid HCl đã chế
tạo được oligo N-acetylglucosamine. Đến năm 1957, Horoweit và cộng sự đã

16
nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng HCl ở nhiệt độ cao và đã thành công cho mục
đích chế tạo D-glucosamine oligosaccharide. Sản phẩm hoàn thành được tách
phân đoạn bằng sắc ký cột, kết quả cho thấy hỗn hợp oligo-D-glucosamine gồm
ít nhất sáu phân đoạn có khối lượng phân tử khác nhau. Bằng phương pháp
HPLC tác giả đã tách được hỗn hợp sản phẩm có oligomer từ dimmer đến
hexamer. Tuy nhiên khi so sánh với phương pháp cắt mạch chitosan bằng
enzyme, Isome cho rằng phương pháp cắt mạch chitosan bằng tác nhân hóa học
cho hiệu suất thấp và sản phẩm có Mw cao hơn.
 Phương pháp bức xạ
Theo nghiên cứu của Lê Hải (2002) và cộng sự lên sự cắt mạch chitosan ở
trạng thái rắn bởi bức xạ gamma sau đó sử dụng hệ dung môi gồm methanol -
nước và acetone để tách các Oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp ra khỏi
hỗn hợp chitosan chiếu xạ. Chitosan 8B (có độ deacetyl hóa là 90%) và chitosan
10B (có độ deacetyl hóa là 99%) dạng bột chứa trong bao polyethylene và chiếu
xạ bằng bức xạ gamma Co - 60 (suất liều chiếu là 1,4KGy/giờ) ở điều kiện nhiệt
độ phòng với liều chiếu từ 10 đến 500KGy đã thu được kết quả như trong hình
sau:
0
1
2
3
4
5
6
7
0 100 200 300 400 500
Liều chiếu [KGy]
10B
8B
Biểu Đồ 2.1 : Ảnh hưởng của liều xạ trên khối lượng phân tử của chitosan
chiếu xạ trong tình trạng rắn
Từ kết quả khảo sát ta có thể nhận thấy rằng phân tử chitosan đã bị cắt mạch
làm cho phân tử của chitosan nhỏ lại. Dựa vào liều chiếu xạ có thể thu được

17
những polymer khác nhau có Mw nhỏ hơn, độ dài của chuổi polymer ngắn hơn.
Ulanski và Rosiak cũng đã nghiên cứu về các thay đổi của chitosan dưới dạng
ảnh hưởng của bức xạ và kết luận rằng chitosan bị chiếu xạ trong môi trường rắn
chỉ bị giảm cấp và sự khâu mạch (crosslinking) là không đáng kể. Nghiên cứu
tiếp theo của Wenwei và cộng sự lên quá trình biến đổi cấu trúc hóa học của
chtosan chiếu xạ cho thấy bức xạ gamma (Co-60) hầu như chỉ có tác dụng cắt đứt
các liên kết C-O-C trong cấu trúc vòng glucopyranose (Lê Hải, 2002).
Như vậy, kết quả trên cho ta thấy rằng so với phương pháp hóa học thì
phương pháp bức xạ có thể kiểm soát được khối lượng phân tử của chitosan sau
khi được chiếu xạ một cách tương đối chính xác và dễ dàng. Ngoài ra, phương
pháp này không thải ra các hóa chất đã sử dụng hay phải tinh chế chúng như
phương pháp hóa học. Còn phương pháp enzyme là phương pháp tạo ra sản
phẩm phân cắt đặc hiệu tuy nhiên đòi hỏi nhiều bước, tính kỹ lưỡng từng bước và
sự chuẩn bị và tinh sạch các enzyme. Đây chính là vấn đề trở ngại khi tiến hành
sản xuất qui mô lớn (Lê Hải, 2002).
Như vậy qua các phương pháp trên ta thấy phương pháp chế tạo
Oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ, đặc biệt là bức xạ gamma có thể có những
ưu điểm như có thể điều chỉnh trọng lượng Oligomer như mong muốn, sản phẩm
có độ phân bố trọng lượng phân tử đồng nhất hơn, thời gian nhanh hơn v.v…
Đây là một phương pháp tốt cho sự sản xuất Oligochitosan với số lượng lớn ở
quy mô công nghiệp.
2.1.4 Ứng dụng của Chitin, Chitosan và Oligochitosan
Chitosan mang nhiều đặc tính như tương hợp sinh học, khả năng tự phân
hủy sinh học, khả năng phân hủy với các nhóm amino đã deacetyl hóa, khả năng
tạo màng, tính thẩm thấu chọn lọc của màng chitosan, khả năng tạo phức chelate,
khả năng hấp thụ v.v…. Do đó polysaccharide này được ứng dụng nhiều trong
lĩnh vực khác nhau.
2.1.4.1 Ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và công nghệ sinh học
Trong lĩnh vực nông nghiệp, chitin và chitosan làm tăng hàm lượng
chitinolytic có trong các vi sinh vật và giúp chúng sinh sôi trong đất, từ đó làm
hạn chế các mầm bệnh trong đất và trong hệ thống mạch dẫn của cây trồng thông

18
qua sự thủy phân thành tế bào nấm bằng enzyme chitinolytic tiết ra từ các vi sinh
đối kháng. Do đó, chitosan được sử dụng để bọc nang các hạt giống nhằm mục
đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố
định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt. Qua nghiên
cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh
hóa, sinh lí của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy các
enzyme như: amylase, catalase và peroxidase cũng tăng lên. Ngoài ra chitosan
còn dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích
tăng trưởng.
Chitosan còn được dùng làm chất mang (carrier) để cố định enzyme và cố
định tế bào. Hiện nay trên thế giới đã thành công trong việc sử dụng chitosan làm
chất mang để cố định enzyme tế bào. Enzyme cố định cho phép mở ra việc sử
dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích.
Hiện nay Oligochitosan với độ polymer hóa từ > 6 được ghi nhận là có hiệu
ứng chống lại sự xâm nhiễm của nhiều loại nấm gây bệnh thực vật thông qua cơ
chế kích thích việc tạo kháng sinh thực vật (phytoalexin). Lê Hải và cộng sự (J.
Synowiecki, 2003) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các phân đoạn Oligochitosan
lên sự phát triển của giống nấm Aspergilus nidudants Wint đã thu được kết quả là
các Oligochitosan có Mw~20 KDa có thể ngăn cản sự phát triển của nấm ở nồng
độ 100 ppm.
Ngoài ra ở Việt Nam và trên thế giới còn sử dụng Oligochitosan như là một
chất kích thích tăng trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật. Theo
V.T.T.Hà và nhóm nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan cắt mạch bức xạ lên sự
phát triển của cây cúc (Chrysanthemum morifolium) invitro đã đưa ra kết quả
sau: Dung dịch chitosan có độ deacetyl hóa 80% và nồng độ 10% được chiếu xạ
ở liều xạ 100 KGy đã biểu hiện hiệu ứng tăng trưởng cao nhất lên cây cúc trong
nuôi cấy mô. Nồng độ thích hợp cho hiệu ứng nhân chồi là 50 - 100mg/l và tạo
cây non là 100mg/l. Chitosan chiếu xạ không những làm gia tăng hiệu quả nhân
chồi lên 30,5% mà còn kích thích sự phát triển chiều cao của cây (19,4%), chiều
dài rễ (40,6%) và sinh khối tươi (61,8%) của cây non. Ngoài ra sự bổ sung

19
chitosan chiếu xạ cũng làm tăng tỷ lệ sống của cây hoa cúc sau khi thuần hóa
trong ống nghiệm lên 18% so với đối chứng (Võ Thị Thu Hà và ctv, 2006).
Chitosan với trọng lượng phân tử thấp có rất nhiều ứng dụng và một trong
những ứng dụng được nghiên cứu gần đây là khả năng kích thích sinh trưởng và
phát triển thực vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Oligochitosan đóng
vai trò như một chất có khả năng kích thích sự hấp thụ các chất dinh dưỡng của
mô thực vật đồng thời còn có tác dụng gia tăng hiệu ứng phytoalexin của mô cây
giúp cho cây không chỉ tăng trưởng nhanh mà còn kháng lại một số bệnh do vi
sinh vật gây nên đồng thời giúp cho cây trồng chống chịu tốt với các stress của
môi trường.
2.1.4.2 Tác nhân cationic trong xử lý nước thải
Chitosan cationic tạo thành những phức hợp đa điện ly với những polymer
polyanionic và tạo chelate với ion kim loại để tạo kết tủa. các phản ứng này sử
dụng để làm trong nước thải ô nhiễm. Chitosan acetate lần đầu tiên được một
công ty Nhật giới thiệu như một tác nhân cationic tự nhiên để đông tụ và loại các
chất thải trong nước cống. Hiện này hệ thống này vẫn còn đang được sử dụng để
xử lý nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước thải (vd nước hồ bơi), thu hồi protein
và khoáng từ nước thải công nghiệp, phân lập các chất có hoạt tính sinh học
trong nước tiểu, tách các chất độc nội bào từ dung dịch loãng. Chitosan cũng có
thể sử dụng như một chất hấp phụ để tách các đồng vị phóng xa từ nước ô nhiễm
và thu hồi uranium từ nước biển và nước ngọt (Nguyễn Văn Uyển và tác giả,
2003).
2.1.4.3 Chitosan dùng trong y học
 Tác nhân hạ cholesterol:
Chitosan có tính chất như chất xơ thực phẩm không bị phân hủy ở đường dạ
dày ruột trong cơ thể, vì nó thiếu enzyme chitonase đặc hiệu. Về sinh lý học,
chức năng chính của chitosan là làm giảm sự hấp thu lipid ở ruột, do vậy nó có
đặc tính làm giảm cholesterol và giúp cho việc giảm trọng lượng cơ thể một cách
đáng kể do sự hấp thụ lipid.
Chitosan có tác dụng làm giảm lượng cholesterol theo cơ chế như hầu hết
các chất xơ thực phẩm khác (không tiêu hóa được phần trên ống tiêu hóa, độ nhớt

20
cao, khả năng ngậm nước cao ở phần dưới ống tiêu hóa…). Tuy nhiên, thêm vào
đó chúng có khả năng tạo liên kết ion ở pH thấp mà vì vậy chúng có khả năng
liên kết với các ion âm như acid mật và acid béo tự do.
Chitosan cho thấy có chức năng hạ cholesterol trong ruột động vật. Thỏ
được cho ăn thức ăn giàu cholesterol 0.9% trong 39 ngày, lượng cholesterol
huyết thanh tăng từ 79 lên 650 mg/dL. Trong trường hợp với khẩn phần ăn như
trên nhưng có bổ sung 2% chitosan, lượng cholesterol huyết thanh giảm tới 300
mg/dL, trong khi đó lượng HDL - cholesterol có ích giảm không đáng kể. Nhưng
hiện tượng giảm cholesterol khi tiêm chitosan - oligosaccharide vào thỏ thì
không thấy, điều đó cho thấy sự giảm cholesterol chỉ xảy ra ở ruột động vật
(Ascher M. and Hestrin S, 1946).
 Các vật liệu y sinh học và dược phẩm:
Chitin và chitosan có thể kết hợp sinh học với mô, cơ quan, tế bào,… và có
thể sử dụng trong việc cấy vào mô. Chitin và các dẫn xuất của nó có thể tiêu đi
trong mô động vật, dẫn đến gia tăng sự cảm ứng các protein bảo vệ sinh học gồm
lysozyme, chitinase. Tốc độ thủy phân enzyme với chitin cũng được điều khiển
bới cấu trúc của một nhóm N - acetyl và dẫn xuất của nó. Do những tính chất đặc
trưng này, chitin và các dẫn xuất được sử dụng như những vật liệu y sinh học hay
vật liệu dùng để bao các loại thuốc tan chậm.
Hoạt độ lipoprotein lipase trong máu tăng lên khi tiêm N,O - sulfate
chitosan và hoạt động miễn dịch được tăng cường khi cấy chitin N - deacetyl một
phần vào mô động vật.
Film chitosan bao thuốc (thấm qua được) cũng công dụng như các dạng con
nhộng thương phẩm và chitosan được sử dụng như một vật liệu dùng để cấy giải
phóng chậm các loại thuốc uống chống ung thư. Chitosan cũng dựa vào công
thức các loại thuốc uống, chúng làm gia tăng sự hấp phụ thuốc vào máu.
 Vật liệu và vết thương:
Các vết thương ở mô động vật, thực vật có thể được bao bằng một tấm màng
hay một miếng xốp chitin và chitosan, hay dạng bong hoặc bột mịn. Các vết
thương cũng có thể trị liệu bằng các dung dịch hay kem chitin và chitosan. Kết
quả là sự phát triển của các tế bào ở vùng mô bị thương được kích thích,

21
chitinase hay lysozyme được tăng cường, dẫn đến mau lành vết thương và ngăn
sự nhiễm trùng.
 Những chất chống nghẽn mạch và đông máu:
Dẫn xuất N - octanoyl và N - hexanoyl của chitosan có chức năng chống
nghẽn mạch, chitosan có chức năng cầm máu. Dẫn xuất sulfate hóa của chitin và
chitosan có hoạt tính chống tụ máu. Khi được phân tích bằng thời gian
thromboplastin hoạt hóa một phần, N,O - sulfated chitosan có hoạt tính chống
đông tụ thấp hơn heparin, nhưng O - oligosulfated chitin thì cao hơn, mặc dù nó
không có nhóm N - sulfated trong phân tử. Nhóm N - sulfated trong heparin quan
trọng cho hoạt tính. O - sulfated chitin có mức độ độc thấp LD50 1.25 - 3.25 g/kg,
trong khi đó heparin có LD50 1.59 - 2.0 g/kg. Các dẫn xuất sulfated này của chitin
và chitosan có thể được sử dụng như một heparin mới lạ (Ascher M. and Hestrin
S, 1946).
 Thành phần mỹ phẩm:
Các muối hữu cơ của chitosan phân tử thấp hòa tan trong etanol loãng và
được sử dụng như một thành phần của keo xịt tóc. CM - chitin anionic và HP -
chitosan cationic hòa tan trong nước và bền trong một khoảng pH rộng, chúng
được sử dụng như một thành phần của mỹ phẩm chăm sóc da. Chitosan, CM -
chitin và HP - chitosan có chức năng tạo độ ẩm cho da, ngăn cản sự hủy hoại cơ
học của tóc. Đặc tính giữ độ ẩm tương ứng với dung dịch propylenglycol 20% và
dung dịch hyaluronic loãng. Những dẫn xuất chitosan này ngăn chặn sự nhiễm
khuẩn trên da và hoạt hóa tế bào da dẫn đến ngăn chặn sự lão hóa da.
2.2 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ DENDROBIUM THONGCHAI GOLD
2.2.1 Giới thiệu họ lan
2.2.1.1 Đặc điểm chung
Các họ lan được đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong vương
quốc thảo mộc, bao gồm hơn 25000 loài khác nhau, cùng với những loài mới
khám phá và mô tả theo từng năm. Do chúng phân bố vùng rộng lớn, trải dài từ
đường xích đạo cho đến Bắc cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng tuyết,
các loài lan rất khác biệt nhau: Lan đất (phát triển mọc trong đất kháng nước);

22
thực vật biểu sinh hoặc thực vật phụ sinh (phát triển phía trên mặt đất hoặc sống
bám trên các loại thảo mộc khác, thu hút chất dinh dưỡng và nước từ môi trường
xung quanh); thực vật phát triển trên mặt đá hoặc ngay cả dưới mặt đất (phát
triển dưới bề mặt của môi trường cấy trồng).
Những nhà sáng lập ngành Lan học đáng kể là triết gia người Hy Lạp
Theophrastus (372-287 trước Công nguyên) và sau này là nhà thực vật học người
Thụy Điển Linnaeus (1707-1778). Chính Theophrastus là người đầu tiên sử dụng
từ Hy Lạp “Orchis” để chỉ nhóm Lan.
Trong số những cây cho hoa có hơn 16.000 loài và 700-800 giống thuộc họ
Orchidaceae đã được xác định (Begum, 2000), và có rất nhiều loài được lai
giống nhân tạo. Họ lan (Orchidaceae) chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc
(Asteraceae) và là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm. Riêng ở Việt Nam lan rừng
được biết gồm hơn 750 loài khác nhau. Khác với các cây trồng cạn, trồng trong
môi trường nước (thủy sinh), các loài phong lan (họ lan Orchidaceae) lại có đời
sống kí sinh, bì sinh (không cần đất) nhờ bộ rễ “ăn nổi” bám vào vỏ cây rừng
nhiệt đới hoặc hút chất dinh dưỡng từ mùn hữu cơ đang hoai mục (Trần Hợp,
1998). Nhìn chung, họ Orchidaceae bao gồm các loài cây thân thảo, sống lâu
năm (đôi khi hoá gổ một phần ở gốc). Chúng sống ở đất, nơi hốc, vách đá, hoặc
sống phụ, sống hoại.... (Trần Hợp, 1998). Căn cứ vào cấu trúc, Pfitzer sắp xếp đa
số lan tập trung vào hai nhóm: nhóm đơn thân (monopodial) như các giống
Vanda, ...và nhóm đa thân (sympodial) như các giống Cattleya, Dendrobium,
Cymbium...(Nguyễn Công Nghiệp, 1998). Ngoài ra cây lan còn mang một số đặc
tính đặc biệt như: hạt vô cùng nhỏ, số lượng nhiều và hầu hết không có chất nuôi
dưỡng; việc nảy mầm và phát triển phải nhờ vào một loài nấm mang tính kí sinh
hơn là cộng sinh trong tự nhiên; mỗi hoa lan có 3 lá đài, 3 cánh hoa, trong 3 cánh
hoa có một cánh ở giữa, phía dưới mang dáng đặc biệt như một cái lưỡi gọi là
môi. Môi hoa lan mịn như nhung, có khi kéo dài ra hay uốn cong lên, cùng với
đài và cánh hoa tạo thành nhiều hình thái đặc biệt (Trần Văn Bảo, 1999).

23
2.2.1.2 Đặc điểm về phân loại
 Orchidaceae là một họ rất lớn thuộc lớp Đơn tử diệp, phân bố khắp nơi
trên thế giới
- Ở vùng ôn đới, ta gặp nhiều loài sống ở đất như địa lan; một số loài hoại
sinh không diệp lục và sống nhờ vào chất mục nát trong đất; có loài ở Úc Châu
có thể sống ngầm dưới đất như nấm.
- Ở vùng nhiệt đới, ta sẽ gặp nhiều loài phụ sinh sống trên cây khác như
Cattleya, Oncidium, Laelia tập trung nhiều ở vùng Trung Mỹ; ở Đông Nam Á
đặc sắc nhất là Dendrobium và còn có Cypripedium, Phalaenopsis, Cymbidium
có nguồn gốc ở Indonesia.
- Một số loài lan sống trên đá như thạch lan.
Cây lan có thể chia làm hai nhóm :
- Nhóm đơn thân: đây là nhóm chỉ tăng trưởng về chiều cao làm cây dài ra
mãi. Nhóm đơn thân chia làm hai nhóm phụ:
Nhóm phụ lá mọc đối (Sarcanthinae): nhóm này lá được xếp thành 2 hàng
mọc đối nhau, lá trên một hàng xen kẻ với lá của hàng kia. Gồm các giống như:
Vanda, Aerides, Phalaenopsis…
Nhóm phụ lá dẹp thẳng hay tròn (Campylocentrinae): Papilionanthe,
Luisia…
- Nhóm đa thân: đây là nhóm gồm những cây tăng trưởng liên tục. Căn cứ
vào cách ra hoa nhóm này chia thành 2 nhóm phụ:
Nhóm ra hoa phía trên như: Cymbidium, Dendrobium, Oncidium…
Nhóm ra hoa ở đỉnh: Cattleya, Laelia, Epidendrum…
- Ngoài ra còn có một số giống mang tính chất trung gian như:
Centropetatum, Phachyphllum, Dichaea…

24
Hình 2.4: Một số giống hoa đẹp của họ Orchidaceae.
Hình 2.5 Lan Dendrobium thongchaigold

25
2.2.2 Giới thiệu về Dendrobium thongchai gold
2.2.2.1 Vị trí phân loại
Ngành: Magnoliophyta (hiển hoa bí tử)
Lớp: Monocotyledones (đơn tử diệp)
Bộ: Orchiddales
Họ: Orchidaceae
Chi: Dendrobium
Loài: Dendrobium sp
2.2.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố:
Giống lan này được đặt tên vào năm 1799. Chữ Dendrobium có nguồn gốc
của chữ Hy Lạp. Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sống, vì tất cả các
loài của Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ.
Dendrobium rất phong phú về chủng loại, nay lớn thứ nhì của họ Lan với
khoảng 1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều
nhất ở Đông Nam Á và Úc châu.
Điều kiện sinh thái của Dendrobium cũng rất đa dạng có nhiều loài chỉ mọc
và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở trung gian, và cũng có loài
thích nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào.
2.2.2.3 Phân loại
Dendrobium được chia ra làm 2 nhóm theo dạng thân của chúng:
- Dạng thòng hay Nobile là dạng thân mềm thường ở vùng hơi lạnh như Đà
Lạt.
- Dạng đứng hay Phalaenopsis là dạng thân cứng thường sống ở vùng có
khí hậu nóng hơn.
Cả Dendrobium nobile và Dendrobium phalaenopsis đều có chung đặc
điểm trong việc tạo lập các giả hành mới và trong sự biệt hóa chồi sơ khởi ở nách
lá dọc theo giả hành; nhưng chúng lại rất khác biệt trong việc trong việc tạo lập
chồi hoa.
- Ở Dendrobium nobile ra hoa từ chồi sơ khởi của giả hành đã trưởng
thành. Như Long tu, Giả hạc chúng chỉ ra hoa với giả hành đã rụng hết lá.

26
- Ở Dendrobium phalaenopsis thì hoa mọc ở giả hành cũ lẫn giả hành mới.
Ơ giả hành mới, chồi non nhất ở gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành vòi
hoa.
Hình dạng của Dendrobium cũng rất biến thiên:
- Nhóm có giả hành rất dài và mang lá dọc theo chiều dài của giả hành ấy,
thường rụng hết lá khi ra hoa như Long tu (Dendrobium primulinum), Ý thảo
(Dendrobium gratio sissimum)…
- Nhóm giả hành to ngắn, tận cùng thường có 2 - 3 lá dai, bền, không rụng.
Phát hoa tập trung ở phần này tạo thành chùm đứng hay thòng như: Thủy tiên
trắng (Dendrobium farmeri), Thủy tiên vàng (Dendrobium thyrisflorum), Vảy cá
(Dendrobium lindleyi)…
- Nhóm cá giả hành rất mảnh mai, dài hay ngắn, có lá dọc theo chiều dài
của chúng, dai bền không rụng. Hoa thường cô độc ở nách như Hương duyên
(Dendrobium revolutum)…
Ngoài ra còn có một số loài Dendrobium khác cũng thường được trồng:
- Kim điệp (Dendrobium chysotosum var delacuorii): Hoa vàng tươi, môi
vàng dưới trung tâm đậm.
- Nhất điểm hồng (Dendrobium dracoins): Hoa trắng bóng như sáp với
môi sọc đỏ ở đáy.
- Thạch hộc (Dendrobium crumenatum): Hoa trắng, môi có bớt vàng, thơm
nhưng mau tàn, ít hoa nhưng nở rộ cùng lúc.
- Giả hạc (Dendrobium anosmum, Dendrobium superbum): Hoa màu
hường, có hai bớt đậm màu trắng hay tuyền. Rất thơm
2.2.2.4 Đặc điểm về hình thái
 Rễ:
Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp với
nhiều điều kiện sống như:
- Khi sống ở đất thì rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn (Trần hợp, 2000).
- Ở một số loài có lối sống bám lơ lửng trên võ thân cây gỗ khác, nên thân
rễ dài hay ngắn, mập hay mảnh mai giúp đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành
các bụi dày. Hệ rễ vừa làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng trên vỏ cây gỗ, hấp

27
thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi một lớp mô hút ẩm dày, bao gồm
những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc. Ngoài
ra, nó còn có nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ cây khỏi bị gió cuốn đi. Hệ rễ
phát triển nhiều hay ít phụ thuộc vào hình dạng chung của cả cơ thể (Trần hợp,
2000; Nguyễn Công Nghiệp, 2000).
- Ở loài sống hoại thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặc các vòi hút ngắn hút chất
dinh dưỡng từ đám xác thực vật (sau khi được nấm phân hủy). Nhiều loài lại có
hệ rễ đan thẳng thành một búi chằng chịt, nó là nơi thu gom mùn của vỏ cây để
làm nguồn dự trữ chất dinh dưỡng. (Trần hợp, 2000; Nguyễn Công Nghiệp,
2000).
 Thân :
Dendrobium thuộc nhóm đa thân (sympodial). Đây là nhóm gồm những
cây tăng trưởng liên tục mà có những chu kỳ nghỉ sau những mùa tăng trưởng.
Dendrobium vừa có thân thật vừa có giả hành. Giả hành tuy là thân nhưng lại
chứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển
giả hành mới. Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía
ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước
do mặt trời hun nóng. Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên cùng với lá, nó
cũng làm nhiệm vụ quang hợp. Thường các loài thuộc giống Dendrobium dùng
cho mục đích kinh doanh là lan đa thân với nhiều giả hành (Trần Hợp, 2000).
 Lá:
Phong lan đều là cây tự dưỡng, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống
lá, có rất nhiều kiểu lá khác nhau, có mỏng mềm, có dai cứng và cũng có cả
mọng nước..., có lá dẹt, lá dài và lá hình trụ. Về màu sắc, phiến lá thường có màu
xanh bóng, nhưng đôi khi hai mặt lá có màu sắc khác nhau (thường mặt dưới lá
có màu xanh đậm hay tía), mặt trên lại khảm thêm nhiều màu sặc sỡ (Trần Hợp,
2000).
 Hoa:
Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hay từng hoa cô độc. Các chồi
hoa không những mọc trên các giả hành mới mà có thể mọc trên các giả hành củ.
Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính giữa hoa, mang phần đực ở phía trên và

28
phần cái (đầu nhụy) ở mặt trước. Cột này thường dài, thẳng hay cong về phía
trước. Nhị đực gồm hai phần, bao phấn và hốc phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị
nhụy. Còn hốc phấn thì lõm lại, mang khối phấn và thường song song với bao
phấn. Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng do có tinh bột,
sáp hay chất sừng. Vì thế giống Dendrobium khi ra hoa nó cho một số lượng
cành hoa nhiều hơn bất kỳ một loài lan nào khác. Chính vì thế ngày nay nó chiếm
ưu thế trên thị trường hoa cắt cành. Hầu như dòng họ của giống Dendrobium là
những loài hoa rất lâu tàn, trung bình từ 1÷2 tháng. (Trần Hợp, 2000; Nguyễn
Công Nghiệp, 1998).
 Quả:
Quả phong lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc. Khi
chín quả mở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Ở một
số loài quả chỉ mở theo 1 - 2 khía dọc, thậm chí không nứt ra, và hạt chỉ ra khỏi
vỏ quả khi vỏ này mục nát.
 Hạt:
Hạt chỉ cấu tạo bởi một phôi chưa phân hoá, trên một máng lưới nhỏ,
xốp chứa đầy không khí. Hạt rất nhiều và nhỏ bé, trọng lượng toàn bộ hạt trong
một quả nặng chỉ bằng 1 phần mười đến một phần ngàn milligam (Trần Hợp,
2000).
2.2.2.5 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium sp.:
 Nhiệt độ.
Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ
quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợp
tăng lên gấp đôi. Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loài lan như lan
Bạch câu Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-6o
C trong vài
giây thì 9 ngày sau chúng sẽ nở hoa đồng loạt. Ở 18,5o
Dendrobium nobile chỉ
tăng trưởng mà
không ra hoa nhưng chúng sẽ ra hoa khi nhiệt độ hạ xuống 13o
C hay thấp hơn.
Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, có thể tạm chia Dendrobium thành hai nhóm
chính:

29
- Nhóm ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng là 15o
C,
gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên ở độ cao trên 1.000m. các loài
này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25o
C, thì cây vẫn sống, thì cây
vẫn sống nhưng hiếm khi ra hoa.
- Nhóm ưa nóng, nhiệt độ thích hợp cho các loài của nhóm này là 25o
C,
gồm đa số các giống Dendrobium ở vùng nhiệt đới, và các loài của giống
Dendrobium lai hiện đang trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía
Nam…
- Ngoài ra, còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng
lạnh và vùng nóng, nhưng ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn như
Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý tưởng của các loài này
là 20o
C.
 Ẩm độ.
Các cây lan, nhất là phong lan, sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước
từ các trận mưa, từ hơi nước trong không khí. Chính ẩm độ quyết định sự hiện
diện của các loài phong lan .
Thông thường ẩm độ tương đối tối thiểu 70% thích hợp cho sự tăng trưởng
của nhiều loài. Tuy nhiên ẩm độ lý tưởng vẫn là ẩm độ của vùng bản xứ mà loài
lan đó được tìm thấy.
Dendrobium cũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong
không khí ẩm và thoáng. Ẩm độ tương đối cần thiết là 40 - 70%. Cấu tạo giá thể
quá ẩm và úng thì bộ rễ sẽ bị thối và biểu hiện là cây con keiki mọc ra từ phần
ngọn của thân.
 Ánh sáng.
Ánh sáng là điều kiện cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lan
thông qua quá trình quang hợp. Đây là yếu tố quyết định sự trổ hoa của lan.
Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp
hay khuếch tán.
Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70%. Nếu thừa ánh sáng, cây
sẽ bị vàng lá, giả hành bị teo lại, cây xấu đi nhưng cây sẽ thích nghi dần, vẫn ra

30
hoa nhiều và đẹp. Nếu thiếu ánh sáng, cây sẽ bị thoái hóa rõ rệt, cây èo uột và số
lượng hoa sẽ ít đi.
 Nhu cầu phân bón.
Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất nhiều phân
bón và có thể dùng nhiều dạng phân bón khác nhau. Còn các loại Dendrobium
thân thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng.
Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu
bò khô… có thể dùng rất tốt bằng cách pha loãng với nước rồi tưới, hoặc vò chặt
từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được
phóng thích qua quá trình tưới nước.
Các loại phân vô cơ được dùng thường có công thức 30-10-10 dùng 3
lần/tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4lít. Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón
phân 10-20-30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước
vào mùa nghỉ. Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thay phân 30-10-10
bằng phân 10-20-20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa tàn.
Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn
giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kì tăng trưởng
hằng năm của nó.
Không nên dùng các loại phân riêng rẽ, thường phân bón được dùng ở dạng
hỗn hợp và bổ sung thêm các chất phụ gia là các sinh tố và các nguyên tố vi
lượng.
 Sâu bệnh và các vấn đề khác.
Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và
môi trường sơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng. Đây là 2
nguyên nhân gây ra nhiều sâu bệnh hại.
Một loại rệp dính màu vàng, kích thước rất bé thường xuất hiện trên bề mặt
lá. Loại này gây tác hại trên cây qua việc hút nhựa.
Đối với các loài côn trùng cắn phá Dendrobium thì loại trừ chúng tương
đối dễ dàng bằng Serpa, Bassa, nồng độ 1/500.
Mặc dù Dendrobium là cây kháng bệnh rất mạnh, tuy nhiên cây vẫn bị nấm
và virus tấn công nếu điều kiện vệ sinh quá kém. Nguy hiểm nhất là bệnh khô

31
thân gần gốc giả hành do một loài virus thâm nhập làm cho các giả hành bị khô
và chết. Có thể ngừa bệnh bằng cách nửa tháng xịt Topsil, Zineb, Benomyl với
nồng độ 1/400 (tài liệu internet:http://agriviet.com/dd/86-nhan-giong-lan-bang-
phuong-phap-gieo-hat-invitro/)
2.2.2.6 Giá trị kinh tế
 Nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên toàn thế giới và
Việt Nam ngày càng tăng. Do vậy mà nuôi trồng lan đã trở thành một ngành kinh
tế của nhiều nước và vùng lãnh thổ trên thế giới và đang phát triển mạnh mẽ ở
khu vực Đông Nam Á.
 Từ lâu, cây lan đã được sử dụng trong y học và thực phẩm:
- Được liệt kê trong dược cổ điển Hy Lạp, Trung Quốc và vùng Tiểu Á,
chúng được phơi khô, xắt nhỏ làm thuốc giảm đau và thuốc kích thích.
- Zao C và các cộng sự (2002) đã tách chiết được copacamphane,
picrotoxane, alloarmadendrane sesquiterpene, glycoside, phenolic glycoside từ
thân của Dendrobium moniliforme Bên cạnh đó, còn ly trích được một nhóm hóa
chất mới là dendromoliside được đánh dấu từ A – D. Bước đầu thử nghiệm cho
thấy các chất này làm tăng số lượng tế bào B và ức chế tăng sinh tế bào I invitro.
- Gao J và cộng sự (2003) đã quan sát mô tuyến ức được nuôi trên môi
trường có chứa dịch chiết từ protocom của Dendrobium thấy rằng trọng lượng
mô tăng, làm tăng khả năng của phagocyte và tốc độ biến đổi của lymphocyte.
- Một bộ tộc ở Indonesia dùng lá Dendrobium sallacense nấu với cơm
như người Việt Nam ở Đồng bằng song Cửu Long nấu cơm với lá dứa. Ngoài ra,
lá và giả hành được dùng làm trà hoặc lấy sợi trong thân phơi khô để làm kiềng
đeo tay (Dương Công Kiên, 2006).
2.2.2.7 Giới thiệu về lan Dendrobium thongchai gold
Rễ Dendrobium phù hợp với nhiều điều kiện sống: rễ mập, thân rễ bò dài
hay ngắn khi sống ở đất. Rễ của chúng không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong
thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết.
Thân có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá hoặc nằm sâu trong đất
gọi là thân rễ. Thân nhẵn hay có nhiều vảy là do thái hóa và một phần thẳng đứng
mang lá. Các lá này bao nhau hợp thành thân giả hay còn gọi là giả hành.

32
Củ lan (giả hành) là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa
dịch nhầy làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy trong
điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao.
Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng
nước, nạc, dài, có màu xanh bóng. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng
cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V.
Hoa mọc thành chum đơn, kép hay từng hoa riêng lẻ, có hoa lâu tàn, trung
bình 1 – 2 tháng. Bao hoa có hai vòng và ba mảnh bao gồm ba nhánh đài và 3
cánh tràng

33
Hình 2.6 Một số dạng hoa đẹp của Dendrobium
Hình 2.7 Tổng quan về lan Dendrobium.

34
2.3 SƠ LƯỢC VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO
2.3.1 Sơ lược về các phương pháp nhân giống truyền thống
Trong nhân giống người ta thường áp dụng hai kỹ thuật truyền thống chính
đó là nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính.
- Nhân giống hữu tính nhờ hạt: Thu hạt từ các phép lai khác nhau sau đó
gieo lên môi trường đất. Tuy nhiên, nhân giống bằng phương pháp này tốn nhiều
thời gian và cây con tạo ra không đồng nhất về mặt di truyền.
- Nhân giống vô tính: Trong vườn ươm người ta tiến hành nhân giống vô
tính bằng cách giâm cành, chiết cành, ghép cành, ghép chồi, nhưng phải mất một
khoảng thời gian dài để thu được kết quả. Phương pháp nhân giống vô tính này
có ưu điểm là duy trì được các đặc tính bố mẹ, đồng thời phương pháp này được
sử dụng để tạo ra các ngân hàng gen cây trồng. Tuy nhiên, phương pháp nhân
giống vô tính này có những trở ngại như: Chậm, khó thực hiện, đắt tiền.
2.3.2 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô thực vật
Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là: Schleident va Schwann đã
đưa ra thuyết tế bào và nêu rõ rằng mọi cơ thể sinh vật cho dù phức tạp đến đâu
cũng đều được tạo nên bỡi sự kết hợp của rất nhiều đơn vị nhỏ, đó là các tế bào.
Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền giống hệt như trong tế
bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, có thể xây
dựng lại toàn bộ cơ thể từ những thông tin di truyền mà nó đã mang.
Haberlandt là người đầu tiên thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật vào năm
1902 và ông đã nhận thấy có sự ảnh hưởng của các khoáng chất và điều kiện môi
trường trên sự chuyển hóa của các tế bào cô lập trên môi trường nuôi cấy. Ông đã
gặp thất bại trong khi cố gắng nuôi cấy các tế bào đã chuyển hóa tách ra từ lá một
số cây một lá mầm như: Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia. Ngày nay,
người ta đã biết rõ những thất bại trên, ông nuôi cấy các tế bào đã mất khả năng
tái sinh (cây một lá mầm là đối tượng khó nuôi cấy invitro).
Năm 1934 White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà
chua trong môi trường lỏng có chứa muôi khoáng, glucose và dịch chiết nấm
men trong một thời gian dài.

35
Năm 1939, Gautheret và Nobercout đã thành công trong việc duy trì sự sinh
trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trong môi trường thạch.
Năm 1941, Overbeek ở Mỹ đã chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng
của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ Cà (Datura) của nước dừa trong quá
trình nuôi cấy. Sau đó, năm 1948 Steward đã xác nhận tác dụng kích thích sinh
trưởng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt. Thời gian này nhiều chất
sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp thành
công bằng phương pháp hóa học .
Năm 1954, Skoog ở Mỹ, tình cờ nhận thấy nếu bổ sung thêm một ít chế
phẩm đã để lâu của acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi
trường nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá thì các mảnh mô này được kích
thích tăng trưởng rõ rệt.
Việc phát hiện ra vai trò của IAA, NAA, 2,4- D và kinetin cùng với các
vitamin và nước dừa có ý nghĩa rất quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô thực
vật. Những phát hiện này giúp cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy mô
thực vật có thành phần hóa học được xác định rõ ràng và ổn định làm cơ sở cho
các bước phát triển tiếp theo của lĩnh vực khoa học này.
Năm 1957, Skoog và Miller ghi nhận được sự hình thành cơ quan từ mô sẹo
thuốc lá chịu sự ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy. Sự
tạo rễ từ mô sẹo sẽ xảy ra khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin và ngược lại nếu tỷ lệ
kinetin/auxin tăng thì sự tạo chồi ở mô sẹo sẽ tăng. Hiện tượng này sau đó được
xác định trên nhiều loại cây khác nhau (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy
Tiên, 2006).
Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân
giống và phục tráng cây trồng. Năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng
của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm.
Cắt các protocorm và đem đi nuôi cấy tiếp thì thu đươc các protocorm mới. Khi
để trong các điều kiện nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan
con.

36
Trong giai đoạn hiện nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ
vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt
tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật cao.
Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được sử dụng trong các chương trình chọn
giống hiện đại. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, nuôi cấy mô đã trở thành
một trong những lĩnh vực được quan tâm rất nhiều trong nhiều ngành trồng trọt.
Nuôi cấy mô đã và đang có những đóng góp to lớn trong việc phục tráng và chọn
giống cây trồng, góp phần vào sự phát triển của ngành khoa học nông, lâm
nghiệp (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
2.3.3 Mục đích và ứng dụng thực tiễn
Tế bào được xem là một đơn vị sinh lý và là một hệ thống hoàn chỉnh mang
đầy đủ đặc tính của sự sống, có khả năng tự điều chỉnh và tự tái sinh, do đó tế
bào có tính toàn năng. Tính toàn năng này có trên lý thuyết, nhưng trên thực tế, tế
bào rất khó biểu lộ tính chất này vì thực vật là loại đa bào, mặc dù phát triển từ
một loại tế bào duy nhất là hợp tử, nhưng khi hợp tử phân cắt để tạo mô và cơ
quan thì rất khác nhau về hình dạng và chức vụ. Do đó, tế bào trong trường hợp
này không biểu hiện tính toàn năng được vì phải chịu ảnh hưởng của tế bào khác.
Nếu ảnh hưởng này bị vô hiệu hóa, thì mỗi tế bào sẽ phản phân hóa tức là non trẻ
lại, rồi phân chia, tăng trưởng, phân hóa tạo cơ quan và thành cây hoàn chỉnh. Do
đó các nhà sinh vật học đã tách các tế bào và mô đem nuôi cấy trong môi trường
dinh dưỡng nhân tạo để quan sát sự phát triển của chúng phương pháp nuôi cấy
mô và tế bào bắt đầu từ đó.
2.3.3.1 Mục đích
Trước kia dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật để nghiên cứu
đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của các hóa
chất đối với tế bào và mô trong môi trường nuôi cấy.
Nhưng hiện nay nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng dụng thực
tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng (cây cảnh, cây lương thực,
cây ăn quả, cây thuốc v.v…) các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này
với các mục đích như sau:

Khảo Sát Khả Năng Thay Thế Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Của Oligochitosan Trên Hai Môi Trưởng MURASHIGE & SKOOG

Khảo Sát Khả Năng Thay Thế Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Của Oligochitosan Trên Hai Môi Trưởng MURASHIGE & SKOOG

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Khảo Sát Khả Năng Thay Thế Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Của Oligochitosan Trên Hai Môi Trưởng MURASHIGE & SKOOG

Similar to Khảo Sát Khả Năng Thay Thế Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Của Oligochitosan Trên Hai Môi Trưởng MURASHIGE & SKOOG (20)

More from nataliej4

More from nataliej4 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Khảo Sát Khả Năng Thay Thế Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Của Oligochitosan Trên Hai Môi Trưởng MURASHIGE & SKOOG