SlideShare a Scribd company logo

Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật

•
•
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van Download luận án tiến sĩ ngành hóa hữu cơ với đề tài: Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật, cho các bạn làm luận văn tham khảo

Education
1 of 142
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …………***………… NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …………***………… NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Dương Ngọc Tú 2. PGS.TS. Dương Anh Tuấn HÀ NỘI, NĂM 2019
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Dương Ngọc Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn. Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Hiếu
ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Dương Ngọc Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn, những người Thầy đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới GS. VS. Châu Văn Minh và TS. Nguyễn Văn Lạng, đã giới thiệu, cổ vũ và động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp CNC, Ban Quản lý Khu CNC Hòa Lạc đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Sinh dược, các Thầy, Cô và bạn bè đồng nghiệp tại Viện Hóa học (đặc biệt là PGS. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh, các bạn Đức, Thủy, Minh, Hiền, Dung...), các đồng nghiệp tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học đã tận tình truyền thụ kiến thức, cùng phối hợp cũng như giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành các nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ, luôn là nguồn động viên to lớn cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Hiếu
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii MỤC LỤC.........................................................................................................ii DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi DANH MỤC BẢNG......................................................................................viii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... ix DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................ x CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................... 5 1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật........... 5 1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học7 1.3. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật ........................ 9 1.3.1. Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu............................................................... 9 1.3.2. Thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm bệnh .................................................. 12 1.3.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc BVTV thảo mộc ở Việt Nam ......................................................................................................... 13 1.4. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới ................................................................................................. 14 1.4.1. Khái niệm nấm nội sinh thực vật .......................................................... 14 1.4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội sinh thực vật............................................................................................................ 15 1.5. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa L.) .................................................................................................................... 23 1.5.1. Thực vật học.......................................................................................... 23 1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học............................................ 26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 33 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 33
iv 2.1.1. Mẫu thực vật.......................................................................................... 33 2.1.2. Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên khoa học, lập hồ sơ lưu trữ....................................................................................... 34 2.1.3. Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật............................................. 35 2.1.4. Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật............................. 35 2.1.5. Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự gene vùng ITS .......... 35 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu ......................... 37 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................ 37 2.2.2. Sắc ký cột (CC) ..................................................................................... 37 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ............................................... 38 2.3. Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm................................... 39 2.3.1. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm ................................................................... 39 2.3.2. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ nấm của dịch chiết, phân đoạn chiết, chất sạch trong phòng thí nghiệm ......................................................... 41 2.4. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm nội sinh từ thực vật .................. 42 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 44 3.1. Thực nghiệm phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật ....................... 45 3.1.1. Phân lập nấm nội sinh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.).................. 45 3.1.2. Phân lập nấm nội sinh từ cây ngâu ta (Aglaia dupenrreana) ............... 51 3.1.3. Phân lập nấm nội sinh từ lá cây trầu không (Piper betle L) ................. 55 3.2. Thực nghiệm phân lập thành phần hóa học từ thực vật và nấm nội sinh thực vật............................................................................................................ 56 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana)............ 56 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla)................ 62 3.2.3. Phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa) ................... 63 3.2.4. Phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không (Piper betle L.)................ 65
v 3.2.5. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Ngâu ta (nấm M. hawaiiensis)..................................................................................................... 68 3.2.6. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây nghệ vàng (nấm F. oxysporum)...................................................................................................... 70 3.2.7. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không (nấm F. solani)73 3.3. Thử hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các mẫu dịch chiết, phân đoạn và chất sạch .......................................................................................................... 74 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 76 4.1. Kết quả phân lập thực vật và định danh các chủng nấm nội sinh thực vật76 4.2. Kết quả khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm của các dịch chiết tổng, phân đoạn dịch chiết tổng và chất sạch thực vật, nấm nội sinh thực vật77 4.3. Kết quả nghiên cứu các thành phần hóa học của thực vật và nấm nội sinh thực vật............................................................................................................ 81 4.3.1. Thành phần hóa học cây Ngâu (A. dupperreana) và Gội ổi (A. oligophylla) ..................................................................................................... 81 4.3.2. Thành phần hóa học cây nghệ vàng (Curcuma longa L.).................... 90 4.3.3. Thành phần hóa học của cây Trầu không (Piper betle L.).................... 92 4.3.4. Thành phần hóa học nấm nội sinh M. hawaiiensis từ cây Ngâu .......... 94 4.3.5. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. oxysporum cây Nghệ vàng ........ 97 4.3.6. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. sonani của Trầu không............ 102 4.4. Mối tương quan về thành phần hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học thực vật và nấm nội sinh thực vật ................................................................. 104 4.4.1. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Ngâu và nấm nội sinh cây Ngâu ................................................................... 104 4.4.2. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Nghệ vàng và nấm nội sinh cây Nghệ vàng.................................................. 105 4.4.3. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Trầu không và nấm nội sinh cây Trầu không................................................ 106
vi KẾT LUẬN................................................................................................... 107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................... 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. 111 DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton CC Column chromatography Sắc kí cột COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1 H-1 H DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer Phổ DEPT DMSO Dimethyl sulfoxide ESI-MS Electron spray ionization mass spectra Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử HMBC Heteronuclear mutiple bond connectivity Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HR-ESI-MS High resolution electronspray ionization mass spectrum Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử HSQC Heteronuclear single- Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết
vii quantum coherence NOESY Nuclear overhauser effect Spectroscopy Phổ NOESY IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm RP18 Reserve phase C-18 Silica gel pha đảo RP-18 TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane Tetramethyl silan PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN DNA, Deoxyribonucleic Acid Vật chất di truyền ITS Internal transcribed spacer PDA Potato dextrose agar Môi trường nuôi cấy khuẩn nấm gồm khoai tây, đường, agar MEA Malt extract Agar Môi trường nuôi cấy khuẩn nấm gồm mạch nha và agar rRNA Ribosomal RNA RNA ribosome
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính trừ sâu khoang (Spodoptetra litura) của các mẫu dịch chiết cây ngâu.................................................................................. 77 Bảng 4.2.2. Hoạt tính kháng nấm Botrytis cinerea của các mẫu dịch chiết thực vật.................................................................................................................... 78 Bảng 4.2.3. Hoạt tính ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết F. oxysporum80 Bảng 4.2.4. Khả năng ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết nấm nội sinh thực vật............................................................................................................ 81 Bảng 4.3.1.1 Dữ liệu NMR của hợp chất 7 (CDCl3)...................................... 90 Bảng 4.3.4.1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 13 và 14................................ 96 Bảng 4.3.5.1. Kết quả GC-MS các chất 15-26................................................ 97 Bảng 4.3.5.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 28 và 29................................ 100 Bảng 4.3.5.3 Số liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của chất 30................................ 102 Bảng 4.3.6.1 Dữ liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của chất 31............................... 104
ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.5.1 Cây Ngâu ta................................................................................... 24 Hình 1.5.2. Cây Gội ổi .................................................................................... 24 Hình 1.5.3. Cây Trầu không............................................................................ 25 Hình 1.5.4. Cây Nghệ vàng............................................................................. 26 Hình 2.1. Các bước phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ mẫu thực vật Hình 3.1. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani......... 45 Hình 3.2. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium sp. .............. 46 Hình 3.3. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Trichoderma atroviride47 Hình 3.4. Cây phân loại của chủng Trichoderma atroviride.......................... 48 Hình 3.5. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Fusarium oxysporum... 49 Hình 3.6. Vị trí phân loại của chủng Fusarium oxysporum............................ 51 Hình 3.7. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. gloeosporioides ..... 52 Hình 3.8. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. crassipes................ 52 Hình 3.9. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng M. hawaiiensis ........... 53 Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủng Microdiplodia hawaiiensis................. 54 Hình 3.11. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Colletotrichum sp..... 55 Hình 3.12. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani....... 56 Hình 3.3.1. Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính trừ sâu trong phòng ........ 75 thí nghiệm........................................................................................................ 75 Hình 3.3.2. Một số hình ảnh thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng nấm tại phòng thí nghiệm............................................................................................. 75 Hình 4.2.1. Khả năng ức ché nấm của tinh chất curcumin............................. 79 Hình 4.2.2. Hoạt tính ức chế sự phát triển chủng nấm Botrytis cinera của các cặn chiết F. oxysporum ................................................................................... 80 Hình 4.3.5.1. Phổ sắc ký GC-MS của các chất 15-26.................................... 98
x DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta............................... 57 Sơ đồ 3.2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi .................................. 62 Sơ đồ 3.2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng................................. 64 Sơ đồ 3.2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không.......................... 66 Sơ đồ 3.2.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất từ nấm nội sinh cây ngâu ...................... 68 Sơ đồ 3.2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Nghệ vàng............ 71 Sơ đồ 3.2.7. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không....... 74
1 MỞ ĐẦU Chất lượng cuộc sống của con người ngày càng nâng cao, đòi hỏi các sản phẩm nông nghiệp và môi trường an toàn. Tuy nhiên để giữ vững năng suất, chất lượng nông sản, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, người ta lại phải sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật, chủ yếu là các loại thuốc hóa học độc hại, và cứ như vậy vòng luẩn quẩn tăng sản lượng, tăng đầu vào, nguy cơ sản phẩm không an toàn và ô nhiễm môi trường lại tiếp tục diễn ra. Vì vậy việc tìm kiếm các giải pháp phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ sản phẩm nông nghiệp dễ sử dụng hơn, có hiệu lực trừ dịch hại cao hơn và thân thiện hơn với môi sinh và môi trường đang được đặt ra với toàn thể nhân loại chúng ta. Từ những thập niên cuối của thế kỷ XX, đầu thế kỷ XXI, các biện pháp sinh học (biological control) bảo vệ sản xuất nông nghiệp ngày càng phát huy tác dụng và dần được xác định là hướng biện pháp chủ đạo trong quản lý dịch hại tổng hợp trong thời gian tới. Ưu điểm nổi bật nhất của các biện pháp sinh học (ví dụ, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học) là hầu như không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên, ít gây tình trạng bùng phát dịch hại. Bên cạnh đó, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học (thuốc BVTVSH, bio-pesticide) còn mau phân hủy trong tự nhiên, ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao và thời gian bảo quản, sử dụng ngắn như các loại rau củ, hoa quả… Thêm nữa, các nguyên liệu để tạo thuốc BVTVSH thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc. Chi phí sản xuất thuốc BVTVSH thấp hơn so với thuốc BVTV hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Với những lợi ích mang lại, thuốc BVTVSH sẽ giúp người nông dân “thân thiện” hơn với cánh đồng của mình để có thể thụ hưởng lợi ích kinh tế lâu dài từ chính “người bạn” này.
2 Nấm nội sinh thực vật (nấm NSTV, Plant endophytic fungi) là những vi sinh vật sống trong tế bào thực vật mà không gây ra bất kì tác động tiêu cực nào tới cây chủ. Nấm NSTV cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormones, tổng hợp siderophores, cố định đạm hay qua hỗ trợ phytoremediation...[1]. Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh. Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều hoạt chất được sinh ra từ nấm NSTV cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng các hoạt chất quý giá này do chính cây sản xuất, do nấm NSTV sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các nấm NSTV có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra. Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy một số chất biến dưỡng của nấm NSTV không những tác động trên những mầm bệnh thực vật mà còn có khả năng trị liệu trên vi khuẩn, nấm, virus và những sinh vật đơn bào gây bệnh cho người và động vật. Vì vậy, nấm NSTV hiện đang được nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và được coi như là nguồn tài nguyên vô tận chưa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dược phẩm. Kết quả thống kê gần đây, với ước lượng 51% số hợp chất có hoạt tính được phân lập từ các chủng nấm NSTV là hợp chất mới, đã cho thấy tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng vô cùng to lớn của nấm NSTV. Các hợp chất do nấm NSTV sản sinh ra là con đường quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc mới trong y tế, nông nghiệp vì giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc (xanthones, anthraquinones, pestalotheols, octadrides, dihydroxyanthones, pyrenocine, steroids...) với rất nhiều hoạt tính mới [2,3]. Điều quan trọng nữa là nếu có thể khai thác được nguồn nguyên liệu từ nấm NSTV sẽ tránh được việc khai thác cạn kiệt nguồn
3 tài nguyên thực vật, làm mất sự đa dạng sinh học và đe dọa tuyệt chủng các loài thực vật quý hiếm, gây hậu quả xấu tới môi trường tự nhiên. Việt Nam vẫn nổi tiếng thế giới về tiềm năng đa dạng sinh học cac loài thực vật, với trên 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể các loài nấm, tảo, rêu. rất nhiều loài là đặc hữu của Việt Nam. Những công bố liên tục trong những năm gần đây của các đoàn khảo sát, chuyên gia Việt Nam và quốc tế về việc phát hiện các loài động thực vật mới tại Việt Nam càng khẳng định giá trị tiềm ẩn vô tận của nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá này. Từ kho tàng kinh nghiệm dân gian, chúng ta đã có rất nhiều kinh nghiệm trong việc nghiên cứu, tìm tòi, phát hiện và kết hợp tài tình các nguyên liệu thực vật đa dạng thành các bài thuốc dân gian hết sức quý giá, vô cùng đặc sắc, có hiệu quả đặc biệt trong việc chữa bệnh, năng cao sức khỏe con người, bảo vệ mùa màng, diệt trừ sâu bệnh, côn trùng, động vật gây hại..... Với trình độ phát triển khoa học công nghệ hiện nay, cần thiết phải tiếp tục tim tòi, nghiên cứu, chọn lọc kinh nghiệm dân gian, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên kết hợp với sự hỗ trợ của công nghệ, thiết bị hiện đại để tạo ra các sản phẩm mới, đưa giá trị sử dụng nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam lên tầm cao mới, có giá trị hơn, hiệu quả hơn, được đánh giá cao cả về hàm lượng khoa học công nghệ cũng như giá trị sử dụng. Triển khai tiếp chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Hóa học (Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) và Viện Sinh dược và Công nghệ sinh học (Đại học Tổng hợp Heirich-Heine Duesseldorf, CHLB Đức) về việc nghiên cứu hệ thực vật Việt Nam để sàng lọc, phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, có tiềm năng sử dụng để chế tạo chế phẩm trừ sâu và nấm bệnh hại cây trồng, cũng như mở rộng sang hướng đối tượng nghiên cứu còn rất mới trên Thế giới cũng như tại Việt Nam là nấm nội sinh thực vật, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật” trên
4 bốn (04) loài thực vật Việt Nam bao gồm Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.), Nghệ vàng (Curcuma longa L.) và ba (03) chủng nấm nội sinh phân lập từ cây Ngâu ta, nghệ vàng và trầu không. Đề tài nghiên cứu có tính khoa học, tính thực tiễn và tính thời sự, được thực hiện với mục tiêu là sàng lọc, phát hiện, chiết xuất, xác định cấu trúc các chất có tiềm năng sử dụng làm thuốc trừ sâu và nấm bệnh hại cây. Các nội dung nghiên cứu của Luận án bao gồm: - Chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần của bốn loài thực vật có tiềm năng trừ sâu và nấm bệnh hại cây.. - Phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật, chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần. - Thử nghiệm hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các chiết phẩm và cachợp chất hữu cơ thành phần. - Hoàn thiện quy trình phân lập, nhân nuôi và khai thác nguồn nấm NSTV như là một hướng đi mới nhanh hơn và hiệu quả hơn, một nguồn tài nguyên vô tận mới để phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có giá trị cao tại Việt Nam.
5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật Theo nghiên cứu của nhà côn trùng học Xô viết N. N. Melnikov, có trên 68.000 loài côn trùng có hại cho con người, động vật và thực vật. Số lượng chủng vi sinh vật (nấm bệnh) có hại cũng không ít hơn. Các số liệu thống kê cho thấy côn trùng và vi sinh vật có hại đã gây thiệt hại rất lớn cho sản xuất nông nghiệp, với ước tính khoảng 1/3 tổng sản lượng lương thực toàn cầu đã bị mất hàng năm do côn trùng và nấm bệnh, và thực tế nếu côn trùng và nấm bệnh gây hại đã không được nghiên cứu và khống chế một cách hệ thống thì mức độ thiệt hại còn lớn hơn rất nhiều (ước tính tới 37% tổng sản lượn khoai tây, 22% tổng sản lượng cải bắp, 10% tổng sản lượng táo và 9% sản lượng tổng đào quả toàn cầu sẽ bị hư hại) [1]. Tại Trung quốc, có 1.648 loại tác nhân có hại cho mùa màng, trong đó có 724 loại nhân tố thực vật có hại, 838 loại côn trùng, mối mọt, 64 loại cỏ dại và 22 loài gặm nhấm. Nếu không sử dụng thuốc BVTV, tổng sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc sẽ bị mất tương ứng lần lượt là 78%, 54% và 32%. Sử dụng thuốc BVTV tại Trung Quốc đã góp phần giúp nước này thu được thêm 89,44 triệu tấn ngũ cốc, 1,65 triệu tấn bông, 2,53 triệu tấn hạt lấy dầu và 78 triệu tấn rau màu [2]. Theo đánh giá của Viện Lúa quốc tế (IRRI), côn trùng và nấm bệnh gây thiệt hại khoảng 37% tổng sản lượng lúa thu hoạch hàng năm trên toàn cầu. Một trong những trường hợp nấm gây bênh nổi tiếng nhất, thiệt hại nghiêm trọng nhất trong lịch sử trồng trợt thế giới là bệnh Panama do chủng nấm Fusarium cubense gây ra trên cây chuối. Bệnh Panama đã gần như xóa sổ ngành nông nghiệp trồng chuối tại Châu Mỹ La tinh những năm đầu thế kỷ 20. Những căn bệnh mới do nấm gây ra tiếp tục đe dọa xóa sổ ngành công nghiệp trồng chuối trị giá 11 tỷ USD trên toàn cầu [3].
6 Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đã tạo thêm được 1/3 tổng sản lượng nông sản toàn cầu. Nếu không có thuốc BVTV, sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc toàn cầu có thể bị thiệt hại tới 78%, 54% và 32% [4]. Tại Mỹ, cứ 1 USD bỏ ra cho thuốc BVTV sẽ thu về 4 USD sản lượng thu hoạch. Như vậy, với mức chi phí trung bình hàng năm đạt 10 tỷ USD cho thuốc BVTV, nông dân Mỹ đã thu được thêm 40 tỷ USD nông sản đã có thể bị mất bởi sâu bệnh. Nhờ sử dụng thuốc BVTV để ngăn chặn, tiêu diệt côn trùng, sâu bệnh hại mùa màng, các nước đang phát triển đã có thể sản xuất và xuất khẩu sản lượng lương thực, nông sản nhiều hơn bao giờ hết. Diện tích sản xuất nông nghiệp không ngừng được mở rộng, tới tận khu vực Amazon để trồng ngũ cốc đến rừng nhiệt đới Indonexia để trồng cọ dầu. Theo công bố của FAO, cứ tăng thêm 1% sản lượng lương thực là tương ứng với sự tăng thêm 1,8% lượng sử dụng thuốc BVTV [4]. Theo định nghĩa của Tổ chức Nông Lương Thế giới (FAO), thuốc BVTV là bất kỳ hợp chất hoặc hỗn hợp dùng để ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc khổng chế các nhân tố gây hại (như các vector gây hại cho người và động vật, các loại động thực vật không mong muốn) trong quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển và buôn bán lương thực, sản phẩm nông nghiệp, gỗ và đồ gỗ, thức ăn chăn nuôi hoặc các chất dùng để tiêu diệt côn trùng, nhện, vật gây hại trên và trong cơ thể động vật. Nó còn bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, chất gây rụng lá, chất gây mất nước hay làm quả chín chậm. Nó cũng bao gồm các chất được sử dụng trước và sau khi thu hoạch nông sản để ngăn ngừa sự suy giảm chất lượng sản phẩm trong quá trình bảo quản và vận chuyển [1, 3]. Thuốc BVTV có thể phân loại dựa vào vật đích tác dụng (thuốc diệt cỏ, diệt côn trùng, trừ nấm, trừ động vật gặm nhấm, trừ chấy rận), dựa vào cấu
7 trúc hóa học (hữu cơ, vô cơ, tổng hợp) hoặc có nguồn gốc sinh học (biopesticide), hay trạng thái vật lý (dạng rắn, lỏng, khí hóa lỏng, thuốc xông) [2, 5]. Thuốc diệt côn trùng hóa học (chemical insecticides) có một số nhóm thuốc (dựa theo tên của nhóm gốc có hoạt tính trừ bệnh) tiêu biểu như organochlorine, organophosphate, carbamate,... Nhóm thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học (biopesticide) bao gồm các loại thuốc có nguyên liệu gốc tự nhiên từ vi sinh vật, thực vật hay khoáng tự nhiên, hiện đang có xu hướng phát triển nhanh chóng, gồm có các nhóm pyrethroid, rotenoid, nicotinoid, strychnine, scilliroside. Ngoài ra, thuốc BVTV có thể được phân loại thành loại dễ phân hủy bởi vi sinh vật thành các chất ít gây hại hơn hoặc thuộc loại bền vững, khó phân hủy, tồn tại nhiều năm, tích lũy trong các chuỗi thức ăn, gây độc cho cả hệ sinh thái [2]. Hiện nay, trung bình hàng năm Thế giới tiêu thụ khoảng 3,5 tỷ kg thuốc BVTV hóa học từ giai đoạn gieo trồng đến khi thu hoạch, bảo quản, trong đó 75% tổng tiêu thụ là tại các quốc gia đã phát triển, nhưng nhu cầu tiêu thụ tại các nước đang phát triển đang không ngừng tăng mạnh [5]. 1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học Thực tế phải đối mặt với những vấn đề nguy hiểm, nan giải bới việc sử dụng thuốc BVTV hóa học hiện nay đã đặt Thế giới vào bài toán phải sử dụng thuốc BVTV hợp lý và hiệu quả hơn nữa, được kiểm soát chặt chẽ hơn nữa cũng như hối thúc giới khoa học phải tìm kiếm, thay thế thuốc BVTV hóa học bằng các biện pháp canh tác, các thế hệ thuốc BVTV mới an toàn hơn. Các thế hệ thuốc BVTV trong tương lai sẽ phải có những đặc tính thiết yếu như (1) có hoạt tính sinh học và hiệu lực diệt trừ sâu bệnh cao hơn nữa, để có thể hạn chế tối đa liều lượng thuốc cần sử dụng, giảm thiểu tối đa ô
8 nhiễm môi trường. (2) Không mang độc tính (non toxic); (3) Không gây ô nhiễm, thân thiện môi trường. Theo định nghĩa của Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA), thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học (Bio-pesticide) là các loại thuốc phòng trừ dịch hại có nguồn gốc nguyên liệu tự nhiên (như thực vật, động vật, vi khuẩn, vi rút, nấm và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng). Khái niệm này bao hàm cả các chất sinh ra bởi gene được cấy vào đối tượng cây cần bảo vệ (cây chuyển gene- GMO) nhằm tạo các kháng thể có khả năng phòng trừ dịch hại. Thuốc BVTV sinh học (BVTVSH) hội tụ nhiều đặc tính phù hợp để có thể thay thế thuốc BVTV hóa học, đã được giới khoa học toàn cầu tập trung nghiên cứu, khám phá, sản xuất và sử dụng để khống chế, tiêu diệt, xua đuổi các loại cỏ dại, bệnh dịch do côn trùng, nấm bênh gây ra. So với thuốc BVTV hóa học, thuốc BVTVSH có các đặc tính ưu việt sau: (1) có hiệu lực tiêu diệt sâu bệnh gây hại nhưng an toàn với con người và động vật, không gây ô nhiễm, không tồn dư hóa chất; (2) có tính lựa chọn vật chủ đích cao, an toàn cho các loài sinh vật có lợi, sinh vật thiên địch tự nhiên; (3) từ nguyên liệu đến chất hoạt hóa đều là sản phẩm tự nhiên, do đó có thể sản xuất bền vững, ổn định; (4) có thể hiệu chỉnh để nâng cao chất lượng sản phẩm bằng công nghệ lên men, công nghệ snh học; (5) Hiếm khi xảy ra hiện tượng kháng thuốc [7]. Trên thế giới hiện đã có hàng trăm nghìn loại thuốc BVTVSH được thương mại hóa và sử dụng [8]. Mexico, Mỹ và Canada đang là nhóm quốc gia sử dụng thuốc BVTVSH dẫn đầu, chiếm tới 44% tổng tiêu thụ toàn cầu, tiếp theo lần lượt là Châu Âu, Châu Á, Châu Đại dương, Mỹ La tinh và Châu Phi lần lượt chiếm 20%, 13%, 11%, 9% và 3% [9]. Tại Trung quốc, từ những năm 1990 đến nay, nền công nghiệp thuốc BVTVSH có tốc độ tăng trưởng rất nhanh, trung bình từ 10% đến 20%/năm
9 với hàng nghìn loại sản phẩm được đăng ký bảo hộ, sản xuất và thương mại [10]. Năm 2006, tổng tiêu thụ thuốc BVTVSH tại Trung Quốc đạt 145.000 tấn, trong đó các loại thuốc Bt là 2%, các loại kháng sinh nông nghiệp là 9% và thuốc trừ sâu thảo mộc là 5%. Dự kiến trong tương lai gần, tại Trung Quốc, BVTVSH sẽ thay thế cho 20% tổng tiêu thụ thuốc BVTV hóa học [11]. Tất nhiên, mặc dù có rất nhiều lợi ích như đã neue trên, thuốc BVTVSH vẫn tồn tại nhiều hạn chế cần khắc phục như thời gian phản ứng chậm, giá thành cao, nhanh bị phân hủy, đã làm hạn chế tiềm năng phát triển và ứng dụng thuốc. Cần thiết phải có thêm các giải pháp để cải thiện hình thức sản phẩm và hạ giá thành sản xuất thuốc BVTVSH trong thời gian tới. 1.3. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật 1.3.1. Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu Từ xa xưa, nông dân ở nhiều nước trên thế giới đã biết sử dụng một số loài thực vật chứa chất độc để trừ một số loại côn trùng gây hại trên cây trồng và gia súc bằng cách phun lên cây hay dùng nước chiết để tắm cho gia súc. Trên thế giới có khoảng 2000 loài cây có chất độc, trong đó có 10-12 loài cây được dùng phổ biến. Ở Việt Nam, đã phát hiện khoảng 335 loài cây độc, gần 40 loài cây độc có khả năng trừ sâu (trong đó có 10 loài có khả năng diệt sâu tốt) [12]. Những hợp chất trừ sâu thảo mộc thông dụng như rotenon và rotenoit, arteminisinin, azadirachtin, cnidiadin, matrine, pyrethrin và nicotin đều là những loại ancaloit, este, glucozit v.v... có trong một số bộ phận của một số loài cây. Hàm lượng chất độc phụ thuộc loài cây, bộ phận cây, điều kiện sống và thời gian thu hái chúng. Nói chung, các chất này rất dễ bị phân huỷ dưới tác động của oxy hoá, ánh sáng (đặc biệt các tia cực tím), ẩm độ , nhiệt độ và pH môi trường, nên chúng ít gây độc cho môi sinh môi trường. Nhưng cũng
10 vì đặc tính này, nên điều kiện thu hái, bảo quản và kỹ thuật chế biến ảnh hưởng nhiều đến chất lượng của sản phẩm [13]. Thuốc trừ sâu thảo mộc diệt côn trùng bằng con đường tiếp xúc, vị độc hoặc xông hơi. Phổ tác động thường không rộng. Một số loại còn có khả năng diệt cả nhện hại cây. Sau khi xâm nhập, thuốc nhanh chóng tác động đến hệ thần kinh, gây tê liệt và làm chết côn trùng [13]. Trừ nicotin ( thuốc rất độc với động vật máu nóng, có thể gây ung thư, nên đã bị cấm ở nhiều nước, trong đó có Việt nam) (Ryania và Sabadilla, ), các thuốc thảo mộc nói chung ít độc đối với người và động vật máu nóng, các sinh vật có ích và động vật hoang dã. Do thuốc trừ sâu thảo mộc nhanh bị phân huỷ, nên chúng không tích luỹ trong cơ thể sinh vật, trong môi trường và không gây hiện tượng sâu chống thuốc. Thuốc thảo mộc rất an toàn đối với thực vật, thậm chí trong một số trường hợp chúng còn kích thích cây phát triển. Do việc thu hái bảo quản khó khăn, giá thành đắt, nên trong một thời gian dài, các thuốc trừ sâu thảo mộc đã bị các thuốc trừ sâu hoá học lấn át. Ngày nay, với yêu cầu bảo vệ môi trường ngày càng được nâng cao, cộng với kỹ thuật gia công được phát triển, nên nhiều thuốc trừ sâu thảo mộc được dùng trở lại, đã đem lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần bảo vệ môi trường. Nhiều chất mới được phát hiện dùng làm thuốc trừ sâu như tinh dàu chàm, tinh dàu bạch đàn, tinh dầu tỏi v.v... [13]. Một số hoạt chất thảo mộc được dùng làm thuốc trừ sâu thảo mộc hiện nay như[13]: Pyrethrin: có trong hoa cây cúc sát trùng Chrysanthemun leucanthemun và các cây Chrysanthemun khác. Tác động mạnh đến côn trùng bằng con đường tiếp xúc; tác động yếu hơn đến các loài nhện, bằng cách bịt kênh vận chuyển ion Na+ , kéo dài giai đoạn mở, vì thế, côn trùng bị quật ngã và chết nhanh. Thuốc được dùng trừ côn trùng và nhện trên rau, chè,
11 nhiều cây trồng, cây cảnh; côn trùng ký sinh trên gia súc và động vật trong nhà. Có độ độc rất thấp với người, động vật máu nóng và môi trường. Ngày nay, bắt chước các pyrethrin tự nhiên, người ta đã tổng hợp ra vài chục hợp chất pyrethroid khác, trở thành một nhóm thuốc trừ sâu lớn, có nhiều ưu điểm hơn pyrethrin tự nhiên. Rotenon và các rotenoid: là các alkaloid có trong rễ, thân lá, hạt của một số loài cây thuộc họ Papilionaceae ( đặc biệt có nhiêu trong rễ cây Derris spp., nhất là Derris eleptica). Rotenon và các rotenoid tác động đến côn trùng (rệp muội, bọ trĩ, ngài, các bọ cánh cứng) và nhện bằng con đường tiếp xúc mạnh và vị độc. Ngoài ra còn dùng để trừ kiến lửa, muỗi ở đầm lầy; trừ ve bét, dòi ký sinh trên động vật; trừ côn trùng trong nhà và trừ cá dữ trong ruộng nuôi tôm. Triệu chứng trúng độc thể hiện nhanh. Thuốc ít độc với động vật có vú ngoại trừ thuốc xâm nhập vào cơ thể qua hô hấp và nhiễm độc máu. Rotenon và các rotenoit ít độc với các động vật khác, nhưng rất độc với cá. Ở Đồng bằng sông Cửu Long rễ cây Derris elleptica được băm nhỏ rải xuống ruộng để trừ cá dữ trong ruộng nuôi tôm rất hiệu quả và an toàn. Azadirachtin: là một trong 4 chất chính có tác dụng diệt sâu của dịch chiết hạt (chủ yếu) và lá cây neem, một loài cây có nguồn gốc ở Ân độ, Myanma, sau được trồng ở Tây Phi. Ở Việt nam, cây neem cũng mọc rải rác trong toàn quốc; đặc biệt mọc thành rừng hàng trăm ha ở Nam Trung bộ. Dịch chiết cây neem được dùng rộng rãi ở Ân độ, Trung quốc và nhiêu quốc gia khác. Cấu trúc của Azadirachtin tương tự ecdyson ( một homon lột xác của côn trùng); có thể là chất đối kháng của ecdyson, ngăn cản quá trình lột xác của côn trùng qua các tác động: làm giảm hay ức chế hoàn toàn khả năng sinh sản, hoặc làm giảm khả năng trứng nở; rút ngắn thời gian sống của trưởng thành, ngăn con cái đẻ trứng, trực tiếp diệt trứng; gây ngán cho ấu trùng,
12 trưởng thành; làm sâu non không biến thái, tác động tới sự lột xác giữa các tuổi sâu. Ngoài ra Azadirachtin còn có tác dụng gây ngán và xua đuổi. Bên cạnh tác dụng diệt côn trùng, Azadirachtin còn diệt được cả tuyến trùng và trừ nấm. Thuốc hầu như không độc với cá, động vật thuỷ sinh; ong mật, chim và động vật hoang dã khác. Matrine: hoạt chất có hiệu lực diệt sâu mạnh nhất trong dịch chiết cây khổ sâm. Matrine có phổ tác động rộng, diệt được nhiêu loài côn trùng chích hút và miệng nhai ; ngòai ra còn diệt được cả nhện hại cây. Matrine gây độc bằng cách làm tê liệt hệ thần kinh trung ương, bịt lỗ thở côn trùng làm cho côn trùng không hô hấp được và bị chết nhanh chóng. Ngoài ra, nhờ tác động gây ngán và xua đuổi, nên thuốc có hiệu lực dài. Matrine không có tác dụng nội hấp và xông hơi. Thuốc ít gây độc với người, động vật máu nóng và các loài sinh vật khác. Bị phân huỷ nhanh trong môi trường. Arteminisinin: Có khoảng 0.3 - 0.5% trong thân lá khô của cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.). Arteminisinin được dùng chủ yếu trừ bệnh sốt rét cho người. Gần đây Arteminisinin được dùng để trừ sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang hại rau; rầy xanh hại chè; rệp muội , bọ trĩ hại cam chanh. Thuốc hầu như không ảnh hưởng đến cá và động vật thuỷ sinh; ong mật, chim và động vật hoang dã. Không gây độc cho cây. Cnidiadin: Thuốc có phổ tác động rộng, trừ được nhiêu loài sâu hại thuộc bộ cánh phấn và nhện đỏ. Triệu chứng ngộ độc thể hiện nhanh. Thuốc ít độc với người và động vật máu nóng cũng như các loài sinh vật khác. Eucalyptol: Có trong cây bạch đàn. Phổ tác động rất rộng; trừ được nhiêu loài sâu và nhện. Thuốc ít gây độc với người, động vật máu nóng và các loài sinh vật khác. Bị phân huỷ nhanh trong môi trường. 1.3.2. Thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm bệnh Đã có rất nhiều hợp chất nguồn gốc thảo mộc được dùng để trừ bệnh hại cây trồng, an toàn với cây trồng, con người, môi sinh và môi trường [13].
13 Các hợp chất có hiệu lực kìm hãm sợi nấm phát triển, không để lây lan, trừ nhiều loài nấm và vi khuẩn hại lúa, rau và nhiều loại cây trồng khác như Acide acrylic và Acide ginkgoic. Các tổ hợp dầu thực vật có tác dụng trừ nấm tiếp xúc như Eugenol ( có trong dầu đinh hương Syzygium aromaticum; dầu quế Cinnamomum spp. và hương nhu Ocimum spp.) để trừ bệnh khô vằn hại lúa; giả sương mai và phấn trắng hại dưa chuột, sương mai cà chua; đốm nâu, đốm xám hại chè; phấn trắng hại hoa hồng. TP-Zep (dầu màng tang, dầu xả, dầu hồng, dầu hương nhu, dầu chanh) được dùng để trừ mốc sương cà chua; đốm nâu, đốm xám, thối búp chè; phấn trắng, đốm đen hoa hồng; đạo ôn, bạc lá lúa; nấm muội đen Capnodium sp. hại nhãn [13]. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc BVTV thảo mộc ở Việt Nam Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2009, có 344 sản phẩm được đăng ký vào danh mục các loại thuốc BVTVSH lưu hành tại Việt Nam, trong đó có 221 sản phẩm thuốc trừ sâu và 66 sản phẩm thuốc trừ nấm. Số lượng thuốc BVTVSH được đăng ký gia tăng rất nhanh, nếu năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm, nay đã gấp hơn 150 lần. Tuy vậy, dù số lượng các thuốc BVTVSH tăng nhanh nhưng tổng doanh thu hàng năm chỉ chiếm dưới 5% tổng doanh thu các loại thuốc BVTV nói chung. Nghĩa là hiện nay dù thuốc BVTVSH tốt, an toàn môi trường nhưng người nông dân lại ít sử dụng. Tuy vậy, số loại chế phẩm sinh học (CPSH) dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân bón vi sinh, hiện nay rất đa dạng về chủng loại và số lượng ở Việt Nam. Theo số liệu của Cục Trồng trọt, tính đến tháng 8/2012, Việt Nam đã có 1.694 các loại phân hữu cơ. Tuy nhiên chỉ có một số ít sản phẩm có chất lượng và uy tín, còn lại không thể kiểm soát được chất lượng
14 hay chất lượng không đảm bảo. Điều này đã làm giảm lòng tin của nhà nông vào loại sản phẩm này, làm thiệt thòi cho người sản xuất CPSH nghiêm túc, ảnh hưởng đến xu hướng khuyến khích sử dụng CPSH, nhất là việc dùng phân bón hữu cơ cho cây trồng. Tiềm năng sử dụng các CPSH trong nông nghiệp rất lớn, là hướng đi đúng đắn, hướng tới nền nông nghiệp hữu cơ, sinh thái bền vững và thân thiện với môi trường. Có thể kế đến một số loại thuốc BVTVSH hiện có tại Việt Nam như:  Sản phẩm từ cây neem: VINEEM 1500 EC (Chiết xuất từ nhân hạt neem (azadirachta indica A.Juss) chứa azadirachtin), Neemaza, Neemcide 3000 SP, Neem Cake, trừ nấm, côn trùng trong đất và rễ cây trồng rất tốt.  Hoạt chất rotenone được chiết xuất từ hai giống cây họ đậu là derris elliptica benth và derris trifoliate, dùng để diệt rầy.  Chế phẩm Đầu trâu Bihopper (hoạt chất retonone) đóng vai trò diệt tuyến trùng và chế phẩm Olicide (oligo - sacarit) đóng vai trò tăng sức đề kháng bệnh cây trồng. 1.4. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới 1.4.1. Khái niệm nấm nội sinh thực vật Nấm nội sinh thực vật (Endophytes, Endophytic fungi) là những vi sinh vật sống ở mô sâu thực vật nhưng không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [14, 15]. Endophytes cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormone [16], tổng hợp siderophores [17], cố định đạm [18], hay qua hỗ trợ phytoremediation [19]. Endophytes có thể được truyền từ một thế hệ kế tiếp thông qua các mô của vật chủ, hạt giống hoặc mầm thực vật [20]. Nghiên cứu đã cho thấy rằng các sản phẩm tự nhiên thu được từ vi khuẩn endophytic có chống vi khuẩn, chống ung
15 thư, chống oxy hóa, chống tiểu đường, ức chế miễn dịch, chống huyết khối, chống viêm và chống bệnh Alzheimer và một số bệnh khác [21]. Giữa nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tương sinh, nấm nội sinh xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong quá trình tiến hóa của cây. Sự tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện những đột biến gen từ những vi sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng nấm nội sinh hữu ích. Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh [22,23]. Nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ. Ở một số loài cây cỏ có nấm nội sinh sống, người ta nhận thấy chúng có khả năng gia tăng sức chịu đựng khô hạn hoặc chịu được độc tính của nhôm trong nguồn nước, trong môi trường sống… Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi cho kí chủ như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm tự nhiên được sinh ra từ nấm nội sinh cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng: các hoạt chất quí giá này do chính cây sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các nấm nội sinh có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra [21]. 1.4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội sinh thực vật  Trên thế giới: Nếu năm 1955, trên thế giới chỉ tìm ra được 500 chất kháng sinh thì 20 năm sau, năm 1975 đã tìm ra được 5.000 chất kháng sinh. Đến nay đã biết được hơn 13.000 chất kháng sinh được sản xuất từ thiên nhiên [19]. Từ những năm 1990, Taxomyces andreanae lần đầu tiên được phân lập từ cây Taxus brevifolia, nấm này sản xuất paclitaxel - chất ức chế các thoi
16 phân bào trong quá trình phân chia tế bào, có phổ khối tương tự như paclitaxel chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Một số nhà khoa học đã nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh của các cây thuộc chi Thông đỏ và tìm thấy các hoạt chất taxol (một hoạt chất được sử dụng hiệu quả nhất trong điều trị bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú) do nấm nội sinh tổng hợp. Chi thông đỏ (Taxus) luôn là một nguồn giàu nấm nội sinh [24,25, 26]. Năm 1995 – 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với cây chủ. Những nấm đã được biết là có tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis microspora. Ngoài ra, thông qua những bằng chứng miễn dịch học, người ta cũng đã phát hiện được sự tổng hợp taxol ở nhiều nấm nội sinh khác phân lập từ cây thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng của Penicillium sp., Pestalotiopsis sp. và Truncatella sp. [24,25, 26]. Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn nội sinh Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 được phân lập từ cây Kennedia nigriscans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram (+) như Bacillus anthracis, M. tuberculosis đa kháng và một số vi khuẩn kháng thuốc khác. Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 phát triển trong lá cây Grevilea pteridifolia phát triển ở Úc, sản xuất kháng sinh kakadumicin và echinomycin đều cho tác động kháng P. falciparum với LD50=7-10ng/ml [27, 28, 29]. Năm 2001, Tan và Zou chứng minh rằng nấm nội sinh cũng được công nhận là nguồn phong phú của chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học. Một vật chủ có thể phân lập được rất nhiều các chủng nấm nội sinh khác nhau [30]. Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về chủng nấm nội sinh Cryptospriopsis quercina được phân lập từ cây Tripterigeum wilfordii, nấm
17 này có thể sản xuất cryptocandin và cryptocin. Trong đó, cryptocandin kháng một số nấm gây bệnh cho người như Candida albicans, Trichophyton sp. và chống một số nấm gây bệnh thực vật như Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis cinerea. Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae và một số nấm gây bệnh thực vật [93]. Cùng năm 2003, Taechowisan và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia galanga [28, 29]. Năm 2005, Raviraja đã phân lập được mười tám loài nấm nội sinh được phân lập từ vỏ cây, thân và lá phân đoạn của năm loài cây thuốc ở Tây Ghats của Ấn Độ: Curvularia clavata, C. lunata, C. Pallescens, Fusarium oxysporum... Nấm nội sinh đã được tìm thấy nhiều nhất trong các đoạn lá, chứ không phải là phân khúc thân cây và vỏ cây. Phần lớn các loài nấm nội sinh đã được tìm thấy trong cây Callicarpa tomentosa thuộc chi Tử châu, họ Hoa môi (11 loài), trong khi cây Lobelia nicotinifolia thuộc phân họ Lỗ bình, họ Hoa chuông (5 loài) [31]. Năm 2007, Li và cộng sự đã tìm ra nấm Acremonium (2F09P03B) từ Huperzia serrate có khả năng sản xuất huperzine A có tác dụng là chất ức chế enzyme acetylcholinesterase, và được dùng trong điều trị bệnh Alzheimer [32]. Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập được Fusarium solani từ Camptotheca acuminate có khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất (9- methoxycamptothecin và 10-hydroxycamptothecin) có khả năng chống ung thư [33]. Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte trong cây Nghệ (Curcuma longa). Các chất dinh dưỡng trong thân rễ của cây nghệ là môi trường sống đa dạng cho các nhóm vi khuẩn khác nhau. Một số vi khuẩn nội sinh liên quan có thể thúc đẩy tăng trưởng. Trong nghiên cứu này, hai chủng endophyte Paenibacillus sp. được phân lập từ thân
18 rễ củ nghệ và cả hai chủng đã được tìm thấy có khả năng để sản xuất Indole 3 acetic acid qua phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - high- performance liquid chromatography) [17]. Năm 2012, Cui và cộng sự đã phát hiện nấm nội sinh Fusarium oxysporum phân lập từ cây Ginkgo biloba có khả năng sản xuất ginkgolid B dùng để điều trị bệnh tim mạch [10]. Năm 2014, Lena Hammerschmidt và cộng sự của Viện Sinh dược và Công nghệ Sinh học, Đại học Heinrich-Heine, Duesseldorf, Cộng hòa Liên bang Đức phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các dịch chiết của nấm nội ký sinh Acremonium strictum Gams, phân lập từ cây Đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) thu hái tại Việt Nam. Trong đó có 5 dẫn xuất polyketide mới 60-hydroxypestalotiopsone C (1), acropyrone (2), bicytosporone D (3), waol acid (4), và pestalotiopene C (5) và 7 hợp chất đã biết (6-12). Các hợp chất 6, 7 và 9 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình đối với hai dòng tế bào ung thư ở người là ung thư biểu mô buồng trứng nhạy cảm với cisplatin (A2780) và dòng kháng cisplatin (A2780 CisR), trong khi chỉ có chất 9 biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus với giá trị MIC 14,3 µM [25]. Có thể liệt kê các hoạt tính sinh dược từ sản phẩm thứ cấp khi lên men nấm nội sinh: Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nấm nội sinh phân lập từ cây ngập mặn ở một số vùng địa lý khác nhau có thể tổng hợp được các chất gây độc và tiêu diệt tế bào ung thư. Cyclic depsipeptides bionectriamides A-C được tách chiết từ chủng Bionectria ochroleuca được phân lập từ cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) ở Hải Nam, Trung Quốc [10]. Tiêu diệt vi sinh vật: Các hợp chất mới có tính diệt khuẩn do nấm nội sinh sản xuất có thể sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, giúp khắc phục hiện
19 tượng nhờn thuốc của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều hợp chất có nguồn gốc từ nấm nội sinh có khả năng tiêu diệt một dải rộng các loài vi khuẩn gây bệnh. Fusarium incarnatum được phân lập từ cây Cúc tần (Pluchea indica) ở đảo Hải Nam, Trung Quốc có khả năng sinh ra equisetin [4]. Chất chống oxi hóa: Chất chống oxi hóa thường được tìm thấy ở các cây dược liệu, rau và hoa quả. Chất chống oxi hóa thường được xem như các tác nhân giúp phòng tránh và chữa trị bệnh như ung thư, bệnh tim, tăng huyết áp, tiểu đường, run chân tay và mất trí nhớ, lão hóa… Thành phần phenol từ nấm nội sinh có tác dụng chống oxi hóa cao. Loài nấm Phomopsis amygdale phân lập từ cây ngập mặn ở Karankadu (Ấn Độ), và Trichoderma được tìm thấy trong lá cây ngập mặn Aegiceras corniculatum có thể sinh ra các chất có hoạt tính chống oxy hóa cao. Nấm nội sinh Alternaria sp. R6 phân lập từ rễ cây ngập mặn loài Myoporum bontioides A có khả năng tiết ra các chất chuyển hóa resverratrodehydes A&C chống các gốc tự do ABTS&DPPH [34]. Ức chế α-glucosidase: Các chất ức chế α-glucosidase có thể làm giảm sự hấp thụ carbohydrate từ bữa ăn và ngăn chặn tăng đường huyết sau khi ăn. Các chất này có thể được sử dụng để điều trị tiểu đường, béo phì. Hai chất mới được tìm thấy từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum phân lập từ loài cây ngập mặn Kandelia candel ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc (6’-O- desmethylterphenyllin, 3-hydroxy-6’-O-desmethylterphenyllin) có hoạt tính ức chế α-glycosidase rất mạnh, và có hiệu quả cao hơn cả chất đối chứng dương genistein. Hợp chất 07H239 từ nấm Xylaria sp. BL321 có hoạt tính ức chế α-glucosidase khi thử ở nồng độ cao. Ngoài ra, các chất chuyển hóa của vermistatin, 6-demethylpenisimplicissin và 2-epihydroxyldihydrovermistatin từ nấm nội sinh Penicillium sp. HN29-3B1 (phân lập từ cây Cerbera manghas) cũng biểu hiện hoạt tính kháng cao [25].
20 Ức chế acetylcholinesterase: Chất ức chế acetylcholinesterase (AChE) hiện sử dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ Alzheimer. Tuy nhiên, hiện vẫn chưa tìm được loại chất AChE có tác dụng mạnh, lâu dài mà ít tác dụng phụ nhất. Sporothrin A từ nấm nội sinh Sporothrix sp. có biểu hiện ức chế AChE rất mạnh. Hai terphenyls từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum (ZH4-E2) cũng có hoạt tính ức chế AchE. Ngoài ra, họ đang nghiên cứu các hợp chất do nấm nội sinh của cây ngập mặn sản sinh ra, chủng Penicillium sp. sk5GW1L và Penicillium sp. sk14JW2P, có tác dụng ức chế AChE như arigsugacin I, arigsugacin F và territrem B [25]. Hoạt tính chống viêm: Hợp chất chống viêm không chứa steroid rất cần thiết trong điều trị các bệnh viêm. Nấm nội sinh Irpex hydnoides, Aspergillus flavus, Schizophyllum commune, Neurospora crassa, Hypocrea lixii, Pestalotiopsis microspora, Aspergillus oryzae và Meyerozyma guilliermondi phân lập từ cây ngặp mặn có thể sản sinh ra các chất chống viêm có hoạt tính tương đương thuốc Indomethacin [25]. Tiêu diệt vi khuẩn lao mycobacteria: vi khuẩn Lao phổi đang trở nên rất nguy hiểm khi xuất hiện các dạng vi khuẩn kháng thuốc, do đó việc tìm ra các chất mới thay thế trở thành vấn đề cấp bách. Nấm nội sinh Fusarium sp. DZ- 27 phân lập từ thân cây Kandelia candel (Hải Nam, TQ) có thể sinh ra axit fusaric. Các thử nghiệm chống vi khuẩn lao cho thấy rằng hỗn hợp axit fusaric với muối cadmium và muối đồng của nó thể hiện hoạt tính tiêu diệt rất cao hai chủng vi khuẩn lao Mycobacterium bovis BCG và M.tuberculosis H37Rv [7]. Nấm nội sinh Nigrospora sp. phân lập từ cây Bruguiera sexangula có thể sản sinh anthraquinones có tác dụng phòng bệnh cao chống lại rhino virus [35]. Nhiều nấm nội sinh trong cây đã được phân lập, chúng có khả năng sản sinh những chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kiềm hãm khối u, chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác.
21 Fusarium sp. là nấm phân lập từ cây Selaginella pallescens, được thu nhập từ vùng Bảo vệ thực vật của Guanacaste của Costa Rica, sản xuất được một pentaketide mới là CR 377 cho tác dụng mạnh trên C. albicans [24]. Pestralotiopisis microspora thường gặp ở rừng mưa nhiệt đới, sản xuất nhiều chất có tác dụng sinh học, một trong những chất này là axit ambuic có tác dụng kháng nấm. Ngoài ra, nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã được phân lập từ các nguồn thực vật khác, các chủng nấm này có thể sản xuất các kháng sinh kháng nấm. Muscodor albus là nấm được phân lập từ cành của cây Quế (Cinnamomum zeylanicum), nấm này sản xuất một số chất bay hơi có thể ức chế vi khuẩn và nấm. Thành phần chính của những hợp chất này đã được xác định cấu trúc hóa học bằng sắc ký khí ghép với khối phổ (GC-MS), từ đó được tổng hợp hóa học. Các chất tổng hợp được có hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm, không độc với người [36]. Nodulisporium sp. được phân lập từ cây Bontia daphnoides sản xuất hợp chất nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng của ruồi xanh, nhặng [30].  Ở Việt Nam: Từ năm 1994, các nhà nghiên cứu trong nước đã phân lập được 6 chủng nấm nội sinh từ vỏ cây thông đỏ. Đây là loài thực vật đặc hữu có ở Việt Nam, từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng như một vị thuốc. Trong đó đáng chú ý là chủng nấm Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai. có mặt ở tất cả các mẫu vỏ của cây thông đỏ được lấy mẫu. Chúng phù hợp nhất với hình thái chủng nấm Pestalotiopsis sp. được tìm thấy trong vỏ cây thông đỏ ở Mỹ và được các nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc kí bản mỏng cùng với chất taxol chuẩn [6]. Năm 2005, Lê Mai Hương cùng các cộng sự của mình đã phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của 45 mẫu cây lấy ở vùng Yên
22 Tử, Hà Nội và vườn thuốc Mê Linh thu được 89 chủng nấm nội sinh trong đó có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn (chiếm 22,5% tổng số), 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tổng số), 27 chủng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tổng số chủng phân lập). Từ 32 chủng có hoạt tính, bằng phương pháp lên men tách chiết sơ bộ đã chọn được 9 chủng có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chủng có kí hiệu N2 có hoạt tính cao nhất, kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) và Fusarium oxyporum [20]. Năm 2009, Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về nấm nội sinh trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep.) và bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu được chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho hoạt tính kháng vi sinh vật, độc tế bào, chống oxy hóa và hoạt tính enzym ngoại bào; sorbicillin cho hoạt tính kháng S.aureus với MIC=25mg/ml. Chất ergosterol peroxid biểu hiện hoạt tính độc tế bào mạnh với cả 3 dòng tế bào thử là ung thư gan, ung thư màng tử cung và ung thư màng tim [37]. Năm 2009, Phạm Quang Thu và cộng sự cũng đã nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở các dòng Keo tai tượng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế. Phân lập được 8 chủng vi khuẩn nội sinh và 13 chủng nấm nội sinh từ 35 dòng Keo tai tuợng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế, trong đó có 15 chủng gồm vi khuẩn và nấm nội sinh trên tổng số 21 chủng có hoạt tính ức chế nấm Ceratocystis sp. ở mức độ mạnh và rất mạnh và chỉ có 8 trên tổng số 21 chủng ức chế nấm Corticium salmonicolor ở mức dộ mạnh và rất mạnh [38]. Năm 2010, Nguyễn Đinh Nga và cộng sự sàng lọc các chủng nấm nội sinh thực vật trên cây ngũ sắc (Lanata camara L.) thu được chủng Pseudeurotium NS-T1 kháng C. albicans, trên cây mã đề (Plantago major L.) thu được chủng Fusarium MĐ-TR1 và MĐ-TR3 cho hoạt tính kháng C.
23 albicans và MRSA; tía tô (Perilla ocymoides L.) thu được chủng Trichoderma TT-L1 kháng C. albicans và MRSA; trầu (Piper betle L.) thu được chủng Fusarium TR-T1 kháng C. Albicans [16]. Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã phân lập được rất nhiều nấm nội sinh, nhiều nhất ở lá (50 chủng), thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1 chủng). Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết 68 chủng nấm nội sinh, kết quả có 17 mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với cả 3 dòng tế bào ung thư như mẫu chiết của các chủng SHT4, SHT6, SHT9…Bằng phương pháp phân loại hình thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101 và Gongroniella butleri SHT106. Hợp chất SHT46.1 thể hiện hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư cơ vân với giá trị IC50 là 4,19 μg/ml. Hợp chất SHT 101.1 biểu hiện khả năng kháng mạnh vi khuẩn S. aureus với MIC là 25 μg/ml. Hợp chất SHT 101.2 có hoạt tính gây độc 2 dòng tế bào ung thư phổi và ung thư cơ vân với giá trị IC50 tương ứng là 4,0 và 3,06 μg/ml. Kết quả thực nghiệm cho thấy các chủng nấm lựa chọn đều có khả năng ức chế sâu bệnh với tỉ lệ tương đối cao, từ 11,4-31,4% so với đối chứng [6]. Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã phát hiện ra môi trường nuôi cấy thích hợp cho nấm nội cộng sinh Fusarium oxyporum được phân lập trên Thông đỏ (Taxus wallichiana) tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng và lượng taxol sinh ra ở môi trường nuôi cấy là 250,98 mg/kg khối lượng khô [26]. 1.5. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa L.) 1.5.1. Thực vật học  Cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre):
24 Hình 1.5.1 Cây Ngâu ta (nguồn internet) Đặc điểm thực vật: Cây nhỡ có thể cao 4-7m. Lá kép lông chim lẻ. Hoa mọc thành chùm ở kẽ lá, nhỏ màu vàng, rất thơm. Quả hạch màu đỏ. Hạt có áo hạt. Phân bố: Cây được trồng khắp nơi làm cảnh và lấy hoa để ướp chè. Công dụng: Ngoài công dụng dùng ướp chè cho thơm, hoa và lá ngâu dùng chữa sốt, vàng da, hen suyễn. Lá tươi dùng nấu tắm ghẻ.  Cây Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.): Hình 1.5.2. Cây Gội ổi (nguồn internet) Đặc điểm thực vật: Cây gỗ lớn, cao 20 - 25m. Lá kép lông chim lẻ. Hoa có đường kính khoảng 2mm. Quả gần hình cầu, màu nâu hay vàng, chia 2 ô; mỗi ô chứa 1 hạt có áo hạt trắng hay nâu. Phân bố: Loài phân bố ở Việt Nam, Thái Lan, Malaixia, Inđônêxia và Philippin. Ở Việt Nam có gặp tại Đồng Nai, An Giang và Kiên Giang.
25 Công dụng: Gỗ được sử dụng trong xây dựng và đóng đồ đạc thông thường.  Cây Trầu không (Piper betle L.) họ Hồ tiêu (Piperaceae): Hình 1.5.3. Cây Trầu không (nguồn internet) Đặc điểm thực vật: Cây nhỡ leo nhẵn. Lá có cuống có bẹ, phiến hình trái xoan. Hoa khác gốc, mọc thành bông. Quả mọng lồi, tròn, có những lông mềm ở đỉnh. Phân bố: Cây gốc ở Malaixia, được trồng rộng rãi để lấy lá ăn trầu. Lá thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô, có khi tán bột, dùng dần. Công dụng: Vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm; có tác dụng trung hành khí, khư phong tán hàn, tiêu thũng chỉ thống, hoá đàm, chống ngứa. Trầu không được xem như là thuốc làm săn da, làm chất kích thích, làm chất lợi nước bọt và xem như có tác dụng dự phòng chống bệnh lỵ và sốt rét.  Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.): Đặc điểm thực vật: cao khoảng 70 cm. Thân rễ (thường gọi củ Nghệ) hình trụ hay hình bầu dục, phân nhánh, có màu vàng tươi. Lá đơn, mọc từ thân rễ. Bẹ lá hình lòng máng, dài 18- 28 cm, ôm sát vào nhau tạo thành một thân khí sinh giả có màu xanh.
26 Hình 1.5.4. Cây Nghệ vàng (nguồn internet) Phân bố: Gốc ở Ấn Độ, được trồng phổ biến tại Việt Nam, lấy thân rễ làm gia vị và làm thuốc. Công dụng: Nghệ có vị đắng, cay, mùi thơm hắc, tính ấm; có tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống. Người ta cũng biết được là curcumin có tác dụng tiêu mủ, lên da non, tác dụng thông mật, làm tăng sự bài tiết mật của tế bào gan, phá cholesterol trong máu. Tinh dầu Nghệ có tác dụng diệt nấm ngoài da và cũng như curcumin có tác dụng kháng khuẩn. 1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 1.5.2.1. Cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre) Năm 2007, Bo-Jun Xie và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất: agladupol A–E (đánh số từ 1–5 trong hình dưới đây) [39]. Năm 2012, nghiên cứu của Heng Zhang và cộng sự đã cho biết dịch chiết methanol của cành lá Aglaia duperreana có hoạt tính tiêu diệt ốc bươu vàng Pomacea canaliculata với giá trị LC50 33.4 μg/mL. Trong đó, cặn chiết
27 ehyl acetate (LC50 53.6 μg/mL) thể hiện hoạt tính cao hơn các cặn chiết còn lại. Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của cặn chiết này, nhóm tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất, đánh số thứ tự trong hình minh họa dưới đây: (20R)-3β-hydroxy-lup-28,29-dioic acid (số 6), betulinic acid (số 7), 24(R),25-dihydroxydammar-20-en-3-one (số 8), ursolic acid (số 9), obtusilin (số 10), (24R)-cycloartane-3α,24,25-triol (số 11), cabraleone (số 12), ocotillone (số 13), shoreic acid (số 14), 3-hydroxy-4',5,7- trimethoxyflavone (số 15), 2,3-dihydro-5-hydroxy-4',7-dimethoxyflavone (số 16), naringenin trimethyl ether (số 17), (2R,3R)-(+)-4',5,7- trimethoxydihydroflavonol (số 18), (+)-eudesmin (số 19), (+)-odorine (số 20) và (+)-odorinol (số 21). Naringenin trimethyl ether biểu hiện hoạt tính đáng kể với giá trị LC50 là 3.9 μg /mL, cao hơn so với chất đối chứng saponin ở trà xanh (LC50 = 4.5 μg/mL) [40]. 1.5.2.2. Cây Gội ổi (Aglaia oligophylla) Năm 2003, Gerhard Bringmann và cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất: rocaglamide (số 22), 6-demethoxy-6,7-methylendioxyrocaglamide (số 23), 6-demethoxy-10-hydroxy-11-methoxy-6,7-methylendioxyrocaglamide
28 (số 24) và cyclorocaglamide (số 25). Trong đó hợp chất 3 có tác dụng ức chế ấu trùng bướm đêm Spodoptera littoralis với giá trị LC50 bằng 2,5 ppm [41] Năm 2006, Nantiya Joycharat và cộng sự đã phân lập, xác định cấu trúc của 10 hợp chất từ lá Aglaia oligophylla gồm dipterocarpol (số 26), ocotillone (số 27), cabraleone (số 28), ocotillol (số 29), 20(S),24(S)-dihydroxydammar- 25-en-3-one (số 30), rocaglaol (số 31), odorine (số 32), 20-epi-odorine (số 33), 20S,25-epoxy-24R-hydroxy-3-dammaranone (số 34), 20S,25-epoxy-24R- hydroxydammarane-3α-ol (số 35) [42]. Năm 2016 Yunie Y. và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 4 hợp chất từ thân loài Aglaia oligophylla, gồm 2 hợp chất steroid: stigmasterol (số 36) và β-sitosterol (số 37); 2 hợp chất triterpenoid: oligophyllic acid (số 38) và foveolin B (số 39):
29 Bên cạnh đó, ngoài dược lý đặc hiệu làm thuốc trừ sâu, chống viêm và chống ung thư, Trong xét nghiệm CUPRAC (Cupric giảm năng lực chống oxy hóa), dịch chiết ethyl acetate của thân cây thể hiện khả năng giảm mạnh nhất với giá trị 1543 mg đương lượng Trolox/g và dịch chiết methanol cho thấy khả năng chống oxy hóa giảm mạnh nhất với giá trị 1059 mg đương lượng Trolox/g. [43]. 1.5.2.3. Cây Trầu không (Piper betle L.) Năm 2013, trong nghiên cứu của D. Pradhan và cộng sự đã cho biết thành phần hóa học cây Trầu không (Piper betle L.) rất phong phú và đa dạng với nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm. Một số hợp chất Terpenoid gồm: 1, 8-cineole, cadinene, camphene, caryophyllene, limonene, pinene, chavibetol (số 40), ally pyrocatechol (số 41), carvacrol, safrole, chavibetol acetate (số 42), eugenol (số 43) và piperitol (số 44) là các dẫn xuất phenol chính được xác định trong lá Trầu không. Trong đó, eugenol có hoạt tính chống nấm mạnh. Các hợp chất flavonoid: quercetin (số 45), luteolin (số 46), các hợp chất alkaloid: cepharadione A (số 47), aristololactame (Α-II) (số 48) và cepharadione (số 49). Ngoài ra còn có một số hợp chất khác: ursonic acid (số 50), ellagic acid (số 51),…
30 Lá trầu không như chất chống oxy hóa tự nhiên, có tương quan với hoạt tính sinh hoc khác như bảo vệ gan, trị đái tháo đường, chống viêm, chống đột quỵ và chống ung thư. Bên cạnh đó, lá có phổ rộng kháng khuẩn, chống lại nhiều vi khuẩn khác nhau bao gồm Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Enteritidis, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium, Actinomycetes viscosus, Streptococcus sanguis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia. Hơn nữa, lá có tác dụng chống nấm và chống độc, hoạt động chống lại mầm bệnh gây bệnh thương hàn, dịch tả, bệnh lao,... Nhai lá trầu tăng tiết nước bọt làm tăng enzyme peroxidase, lysozyme và kháng thể để chống lại sự phát triển của vi khuẩn trong khoang miệng. Lá trầu có hoạt tính chống ung thư chất gây ung thư thuốc lá do sự hiện diện của hydroxychavicol và axit chlorogen. Hai hợp chất sau này tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường. Nhai lá trầu kết quả hành động tim mạch bằng cách tăng tốc catecholamine từ vỏ thượng thận đóng góp để tăng sức chịu đựng của cơ tim, nhịp tim, huyết áp và thần kinh giao cảm. Nó cũng có tác dụng ức chế tiểu cầu. Do đó, lá trầu có lợi cho rối loạn tim mạch khác nhau như xung huyết suy tim, bệnh mạch vành, cấp tính nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch [44]
31 1.5.2.4. Cây Nghệ vàng (Curcuma longa) Năm 2017, Ting Yuan và cộng sự của mình đã phân lập được 6 hợp chất: turmerone Q (số 52), bisacurone A (số 53), bisacurone (số 54), bisacurone B (số 55), 1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(4-hydroxyphenyl)- penta-(1E,4E)-1,4-dien-3-one (số 56), cyclocurcumin (số 57) và 1,7-bis(4- hydroxy-phenyl)-3-hydroxy-1,3-heptadien-5-one (số 58). Hợp chất số 57 và số 58 cho thấy hoạt tính ức chế đáng kể về sản xuất NO gây ra bởi lipopolysacarit (LPS) trong các đại thực bào. Cùng năm này, Kamran Ashraf và Sadia Sultan đã phân lập và xác định cấu trúc của 3 hợp chất: curcumin (số 59), demethoxycurcumin (số 60), bisdemethoxycurcumin (số 61) Sự ức chế tăng sinh tế bào ung thư gan HepG2 của curcumin (IC50 41,69 µg/mL) hiệu quả hơn nhiều so với chiết xuất methanolic (IC50 196,12 µg/mL). Bột nghệ khi uống với sữa đun sôi rất hữu ích trong việc chữa bệnh ho và các bệnh liên quan đến đường hô hấp, và bột nghệ rang là một thành
32 phần được sử dụng như thuốc chống động kinh cho trẻ em. Củ nghệ cũng được sử dụng trong điều trị các bệnh về răng miệng, rối loạn tiêu hóa như khó tiêu và axit, khó tiêu, đầy hơi, loét, chống oxy hóa, chống đông cũng như làm giảm bớt tác dụng gây ảo giác của hashish và các thuốc hướng tâm thần khác. Trong thực phẩm và sản xuất, curcumin hiện đang được sử dụng trong nước hoa và như một chất tạo màu vàng tự nhiên, cũng như một phụ gia thực phẩm được phê duyệt cho hương vị khác nhau các loại cà ri và mù tạt [45].
33 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thực vật Vỏ cây Ngâu ta thu tại Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Aglaia duperreana Pierre, họ Xoan (Meliaceae) số tiêu bản AD1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Lá cây Gội ổi thu tại Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Aglaia oligophylla Miq., họ Xoan (Meliaceae) số tiêu bản AO1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Lá cây Trầu không thu tại Trạm đa dạng sinh học Mê Linh (Vĩnh Phúc), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Piper betle L., họ Hồ tiêu (Piperaceae) số tiêu bản PB1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Củ rễ cây Nghệ vàng thu tại Trạm đa dạng sinh học Mê Linh (Vĩnh Phúc), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Curcuma longa L., họ Gừng (Zingiberaceae), số tiêu bản CL1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
34 2.1.2. Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên khoa học lập hồ sơ lưu trữ. Chuẩn bị dụng cụ: Dụng cụ chuẩn bị cần có: túi lưới, báo cũ, dây buộc, túi nilon loại nhỏ, eteket, bút viết kính, khung gỗ ép mẫu, dao cắt chặt mẫu, dao kéo cắt dây và cành mẫu nhỏ, rổ nhửa, máy ảnh,… Tiến hành thu hái thực vật ngoài thực địa: Mẫu thực vật có thể lấy lá, vỏ, rễ, củ. Số lượng mẫu lấy từ 0,5 – 1 kg. Các mẫu thực vật thu được mô tả sơ bộ và ghi chép đầy tình trạng cây (tên cây, mầu sắc, hoa quả). Tại địa điểm lấy mẫu, tiến hành thu hái sơ bộ các bộ phận khác nhau của cây để chung vào 1 túi lưới kèm theo 1 eteket đánh mã số loài. Mẫu thực vật được đánh mã số trên eteket và chụp ảnh mẫu cùng với mã số tương ứng làm tài liệu lưu trữ. Ảnh chụp cần thể hiện được các đặc điểm nhận dạng của loài thực vật: dạng thân cành, cách mọc lá, đặc điểm hoa hoa và quả,... Mẫu thực vật cần tách riêng 1 mẫu tiêu bản dùng để xác định chính xác danh tính của loài thực vật. Mẫu tiêu bản bao gồm 1 lượng nhỏ tất cả các bộ phận loài thực vật đã thu hái. Các mẫu tiêu bản được gắn theo 1 eteket đánh mã số tương ứng của loài thực vật thu hái rồi cho chung trong 1 túi lưới. Xử lý mẫu thực vật, xác định tên khoa học của loài sau khi thu hái: Sau khi thu hái, mẫu thực vật được xử lý từng bộ phận, được tách riêng hay gộp chung thành 1 mẫu tùy thuộc vào khối lượng mẫu được nhiều hay ít, cành và thân được chặt nhỏ (kích thước 5 – 10 mm). Mẫu tiêu bản sau khi được đưa về cơ quan tại nơi thu mẫu cần được ép mẫu bằng khung ép mẫu và giấy báo: các mẫu tiêu bản được ngăn cách nhau bởi các lớp báo. Các lớp báo này có tác dụng ngăn cách và hút hơi nước từ mẫu tiêu bản tránh thối hỏng mẫu. Chuyên gia thực vật dựa vào mẫu tiêu bản và đặc điểm cây được ghi chép ngoài thực địa để xác định tên khoa học của các mẫu thực vật. Mẫu thực vật được băm nhỏ và làm khô sơ bộ tại cơ quan nơi lấy mẫu tránh làm thối hỏng các mẫu thực vật chứa lượng nước nhiều sau đó mang về phòng sấy, mỗi mẫu
35 được cho vào 1 rổ nhựa có ký hiệu mẫu đã phân loại và xếp gọn gàng, sấy khô rồi chuyển vào kho chứa mẫu thực vật. 2.1.3. Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật Các mẫu thực vật đều được xử lý chung như sau: Mẫu được ngâm chiết 3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50 o C thu được cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, diclometan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan, diclometan, etyl axetat và metanol tương ứng. 2.1.4. Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật Các mẫu nấm nội sinh thực vật đều được xử lý chung như sau: Các nấm nội sinh phân lập trong các mẫu thực vật đã định danh sau đó mang đi nuôi cấy với lượng lớn. Sau khi nuôi cấy nấm trong 35 ngày, các sợi nấm đã phát triển kín môi trường gạo sẽ tiến hành diệt nấm bằng tia UV trong box cấy. Nấm được ngâm chiết trong dung môi hữu cơ. Sau khoảng 12h tiến hành chắt lọc dung môi ngâm chiết bằng giấy lọc thu dịch chiết nấm. Quá trình ngâm chiết được làm 3 lần và cô quay thu được cặn chiết. Cặn chiết được chiết phân lớp với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, diclometan, etyl axetat, methanol và nước. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan, etyl axetat và metanol tương ứng 2.1.5. Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự vùng ITS Tách chiết ADN tổng số: phương pháp sử dụng CTAB của J. Doyle và L. Doyle (1987) Phản ứng PCR được thực hiện với dung tích 20 μl: Đệm chứa 2 mM MgCl2, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (Thermo Scientific), 0,2 μM mồi và khoảng 30 ng khuôn mẫu ADN và nước cất dùng cho PCR.
36 Chương trình chạy PCR: Các phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 940 C (5 phút), 35 chu kỳ [940 C (1 phút), 590 C (45s), 720 C (50s)] và kết thúc ở 720 C (5 phút). Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản phẩm PCR được bổ sung 4 μl thuốc nhuộm rồi tiến hành điện di. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen: - Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2 ml. Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3:1. - Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn. - Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút. - Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa. - Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút. - Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1,5 ml sạch. - Để hòa tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH = 7-8,5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút, thu lượng ADN tinh sạch. Phương pháp giải trình tự: Sản phẩm PCR vùng ITS sau khi tinh sạch được đọc trình tự tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Kết quả giải trình tự được so sánh với các trình tự tương đồng trên NCBI. Sau đó các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng chương trình MEGA v6.0 và CLC v8.02 để tạo cây phát sinh loài. Kết quả phân tích các sản phẩm khuếch đại: Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi ITS1/ITS4 và được điện di trên gel agarose 1,5% cho băng đơn hình với kích thước khoảng 750 bp. Sau khi khuếch đại sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành thôi gel bằng việc sử dụng cột QIAquick Spin Columns (USA) nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu.
37 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của mẫu nghiên cứu được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là YMC RP 18 (Merck) và sắc ký ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck). 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (0,25 mm; Merck) và RP-18 F254S (0,25 mm; Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm Các hợp chất được phát hiện trên đèn tử ngoại ở các bước sóng 254nm và 366 nm hoặc được phun thuốc thử anisaldehyde rồi nung nóng ở 110 o C. Công thức: Anisaldehyde/H2SO4 (DAB 10) Anisaldehyde: 5 ml Glacial Acetic Acid: 100 ml Methanol: 85 ml Các thành phần được trộn lẫn rồi sau đó mới thêm 5 ml acid sunfuric đặc, để nguội từ từ sau đó bảo quản vào chai thuỷ tinh có mầu giữ trong tủ lạnh để sử dụng. 2.2.2. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 mesh) của Merck, dung môi rửa giải chủ yếu là loại phân tích, công nghiệp. Sắc ký cột ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20. Sắc ký cột pha đảo sử dụng loại YMC RP-18 có cỡ hạt là 30-50 μm (Fujisilica Chemical Ltd.).
38 Sắc ký lỏng hiệu năng cao-điều chế (HPLC-Preparative): Các cột điều chế (125 x 4 mm, i.d.) đã được nhồi sẵn với eurospher C-18 (Knauer, Berlin, Germany) hoặc Dynmax (250 x 21.4 mm, L.ID). Lượng mẫu được đưa lên cột tuỳ thuộc vào kích thước của cột. Đối với loại cột nhỏ, 3 mg mẫu được hoà tan trong 1ml dung môi hoặc hệ dung môi bắt đầu chạy theo chương trình định trước rồi bơm lên cột. Với loại cột to, lượng mẫu đưa lên cột có thể tích 20 mg. Các hệ dung môi thường được sử dụng là hỗn hợp dung môi methanol hoặc acetonitrile và nước siêu lọc (nanopure) có dùng đệm hoặc không dùng đệm với 0,1 % TFA, và tỉ lệ dòng là 5 ml/phút. Các hợp chất được phát hiện trên UV-VIS diode array detector. Sắc ký lỏng hiệu năng cao - phân tích (HPLC): Đối với kỹ thuật HPLC phân tích, hiệu năng phân tách đạt được dựa trên việc xử dụng bơm áp suất cao để đẩy dung môi pha động qua cột sắc ký. Kỹ thuật phân tích HPLC được sử dụng để nhận dạng các peak từ các dịch chiết hay các phân đoạn. Các thành phần khác nhau trong hỗn hợp được đưa qua cột với các tốc độ dòng tùy theo sự phân bố giữa dung môi pha động và pha tĩnh. Hệ dung môi được dùng dưới dạng gradient là MeOH: Nước (nanopure) có sử dụng đệm pH=2 bằng acid phosphoric với sự tăng dần của MeOH đến 100 % trong thời gian 45 phút. Các hợp chất được phát hiện bằng UV-VIS diode array detector. 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được sử dụng các thiết bị hiện đại. Các thiết bị và phương pháp sử dụng gồm: Điểm nóng chảy (mp): Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ khối lượng (MS): Phổ khối (phun mù điện tử) ESI-MS được đo trên máy Agilent 1200 TRAP. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo
39 trên máy FT-ICR-Mass spectrophotometer tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): Phổ NMR đo trên máy Bruckker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS), tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY. Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d6, CD3OD và CDCl3. Lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo. 2.3. Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm[24] 2.3.1. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm[24]  Chuẩn bị thí nghiệm: Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm: dịch chiết các mẫu cần thử, lá thầu dầu sâu khoang (Spodoptetra litura), đĩa petri, các dụng cụ khác: đũa gỗ, pipetman, bông… Cân 10 mg dịch chiết cho vào lọ penecillin, sau đó cho vào mỗi ống 10 ml cồn hoặc aceton. Chạy siêu âm trong 10 phút để dịch chiết tan hoàn toàn trong dung môi. Kiểm tra bằng mắt thường độ tan của các chất trước khi đưa vào thí nghiệm. Đối với chất sạch, cân 5 mg hòa tan trong 5 ml cồn hoặc axeton. Lá thầu dầu được thu hái về đem rửa sạch, lau khô, bỏ cuống gân. Cắt thành hình tròn đường kính 6 cm. Mỗi đĩa petri cần 2 lá.
40 Sâu khoang: thí nghiệm được thử bằng sâu khoang ở độ tuổi 1,5-2 tuổi, chọn mỗi đĩa 10 con sâu đồng đều lứa tuổi để đưa vào thí nghiệm.  Tiến hành thí nghiệm: Dùng pipetman hút lượng chất được định lượng rồi tia đều lên lá thầu dầu, tán đều lên 2 mặt lá. Hong khô tự nhiên cho cồn (hoặc axeton) bay hơi hết rồi đặt vào đĩa petri có lót giấy thấm, sau đó dùng đũa gỗ gắp thả 10 con sâu vào mỗi đĩa thí nghiệm. Cho 0,5 ml nước cất thấm vào bông và giấy thấm để tạo độ ẩm. Sau 24h kiểm tra số sâu sống. Sau 48h kiểm tra số sâu và thay lá mới không phun thuốc. Sau 72h cân xác định khối lượng sâu sống sót. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu theo công thức Abbott: Tỷ lệ sâu sống được tính theo công thức: Tỷ lệ sâu chết tính theo công thức: Tỷ lệ sâu tăng trưởng tính theo công thức: Hoạt lực trừ sâu tính theo công thức: Trong đó: Ef (%): hiệu lực Ca: Số sâu sống của mẫu đối chứng Ta: Số sâu sống của mẫu thí nghiệm
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật

Recommended

Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đĐề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gaiNghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gaiTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ ...
Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ ...Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ ...
Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóngNghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóngTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương (soy wh...
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương (soy wh...Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương (soy wh...
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương (soy wh...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen n...
Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen n...Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen n...
Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen n...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

Recommended

Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đĐề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gaiNghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gaiTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...
Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu sản xuất trà túi lọc từ lá...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ ...
Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ ...Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ ...
Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóngNghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóngTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương (soy wh...
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương (soy wh...Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương (soy wh...
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương (soy wh...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen n...
Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen n...Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen n...
Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen n...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)
kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)
kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)ljmonking
 
Quá trình chưng cất
Quá trình chưng cấtQuá trình chưng cất
Quá trình chưng cấtBảo Dưỡng Cơ Khí
 
Đề tài: Sản xuất trà túi lọc chùm ngây & cỏ ngọt, HAY
Đề tài: Sản xuất trà túi lọc chùm ngây & cỏ ngọt, HAYĐề tài: Sản xuất trà túi lọc chùm ngây & cỏ ngọt, HAY
Đề tài: Sản xuất trà túi lọc chùm ngây & cỏ ngọt, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...
Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...
Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...
Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...
Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...Nhận Viết Đề Tài Trọn Gói ZALO 0932091562
 
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenolLuận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenolDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...
Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...
Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...Dịch vụ viết thuê Khóa Luận - ZALO 0932091562
 
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đánh giá chất lương thực phẩm
Đánh giá chất lương thực phẩmĐánh giá chất lương thực phẩm
Đánh giá chất lương thực phẩmFood chemistry-09.1800.1595
 
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAYĐề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAYDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
chưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 prochưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 protrietav
 
Bài giảng môn học vi sinh thực phẩm
Bài giảng môn học vi sinh thực phẩmBài giảng môn học vi sinh thực phẩm
Bài giảng môn học vi sinh thực phẩmDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Chuong5
Chuong5Chuong5
Chuong5Lanh Nguyen
 
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAYĐề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAYLuận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nguyễn ngộ - Công nghệ đường mía
Nguyễn ngộ - Công nghệ đường míaNguyễn ngộ - Công nghệ đường mía
Nguyễn ngộ - Công nghệ đường míaHang Bui
 
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của chủng xạ khuẩn Streptomyces
Hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của chủng xạ khuẩn StreptomycesHoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của chủng xạ khuẩn Streptomyces
Hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của chủng xạ khuẩn StreptomycesDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Nghiên cứu làm sạch CO2 từ khí thải đốt than bằng kĩ thuật Xúc tác
Nghiên cứu làm sạch CO2 từ khí thải đốt than bằng kĩ thuật Xúc tácNghiên cứu làm sạch CO2 từ khí thải đốt than bằng kĩ thuật Xúc tác
Nghiên cứu làm sạch CO2 từ khí thải đốt than bằng kĩ thuật Xúc tácDịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562
 

More Related Content

What's hot

kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)
kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)
kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)ljmonking
 
Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...
Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...
Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...
Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...
Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...Nhận Viết Đề Tài Trọn Gói ZALO 0932091562
 
Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...
Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...
Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...Dịch vụ viết thuê Khóa Luận - ZALO 0932091562
 
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
chưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 prochưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 protrietav
 
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nguyễn ngộ - Công nghệ đường mía
Nguyễn ngộ - Công nghệ đường míaNguyễn ngộ - Công nghệ đường mía
Nguyễn ngộ - Công nghệ đường míaHang Bui
 
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...https://www.facebook.com/garmentspace
 

What's hot (20)

kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)
kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)
kĩ thuật phân tích cảm quan thực phẩm (hà duy tư)
 
Quá trình chưng cất
Quá trình chưng cấtQuá trình chưng cất
Quá trình chưng cất
 
Đề tài: Sản xuất trà túi lọc chùm ngây & cỏ ngọt, HAY
Đề tài: Sản xuất trà túi lọc chùm ngây & cỏ ngọt, HAYĐề tài: Sản xuất trà túi lọc chùm ngây & cỏ ngọt, HAY
Đề tài: Sản xuất trà túi lọc chùm ngây & cỏ ngọt, HAY
 
Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...
Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...
Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất xúc xích heo tiệt trùng tại công ty cổ ...
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...
Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai từ thảo mộc thiên nhiên quy...
 
Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...
Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...
Nghiên Cứu Quy Trình Sản Xuất Trà Mãng Cầu Xiêm Bằng Phương Pháp Sấy Bơm Nhiệ...
 
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenolLuận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
 
Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...
Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...
Đề tài: Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất thử nghiệm mứt nhuyễn bí đỏ đón...
 
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzy...
 
Đánh giá chất lương thực phẩm
Đánh giá chất lương thực phẩmĐánh giá chất lương thực phẩm
Đánh giá chất lương thực phẩm
 
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAYĐề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
 
chưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 prochưng cất mới nhất 2015 pro
chưng cất mới nhất 2015 pro
 
Bài giảng môn học vi sinh thực phẩm
Bài giảng môn học vi sinh thực phẩmBài giảng môn học vi sinh thực phẩm
Bài giảng môn học vi sinh thực phẩm
 
Chuong5
Chuong5Chuong5
Chuong5
 
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mầm từ gạo nương đỏ tây nguyên ở hai ...
 
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAYĐề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
 
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAYLuận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY
Luận văn: Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ-amylase, HAY
 
Nguyễn ngộ - Công nghệ đường mía
Nguyễn ngộ - Công nghệ đường míaNguyễn ngộ - Công nghệ đường mía
Nguyễn ngộ - Công nghệ đường mía
 
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
 

Similar to Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật

Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....https://www.facebook.com/garmentspace
 
Thành phần hoạt tính gây độc của ngoại mộc tái, cày ri ta và an điền lá thông
Thành phần hoạt tính gây độc của ngoại mộc tái, cày ri ta và an điền lá thôngThành phần hoạt tính gây độc của ngoại mộc tái, cày ri ta và an điền lá thông
Thành phần hoạt tính gây độc của ngoại mộc tái, cày ri ta và an điền lá thôngDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...
Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...
Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên Cứu Sự Lưu Hành Của Salmonella Typhimurium Và Salmonella Enteritidis T...
Nghiên Cứu Sự Lưu Hành Của Salmonella Typhimurium Và Salmonella Enteritidis T...Nghiên Cứu Sự Lưu Hành Của Salmonella Typhimurium Và Salmonella Enteritidis T...
Nghiên Cứu Sự Lưu Hành Của Salmonella Typhimurium Và Salmonella Enteritidis T...nataliej4
 
Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdf
Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdfNghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdf
Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdfTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...https://www.facebook.com/garmentspace
 

Similar to Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật (20)

Hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của chủng xạ khuẩn Streptomyces
Hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của chủng xạ khuẩn StreptomycesHoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của chủng xạ khuẩn Streptomyces
Hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của chủng xạ khuẩn Streptomyces
 
Nghiên cứu làm sạch CO2 từ khí thải đốt than bằng kĩ thuật Xúc tác
Nghiên cứu làm sạch CO2 từ khí thải đốt than bằng kĩ thuật Xúc tácNghiên cứu làm sạch CO2 từ khí thải đốt than bằng kĩ thuật Xúc tác
Nghiên cứu làm sạch CO2 từ khí thải đốt than bằng kĩ thuật Xúc tác
 
Làm sạch khí CO2 từ khí thải đốt than bằng xúc tác hấp phụ, HAY
Làm sạch khí CO2 từ khí thải đốt than bằng xúc tác hấp phụ, HAYLàm sạch khí CO2 từ khí thải đốt than bằng xúc tác hấp phụ, HAY
Làm sạch khí CO2 từ khí thải đốt than bằng xúc tác hấp phụ, HAY
 
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
 
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
 
Thành phần hoạt tính gây độc của ngoại mộc tái, cày ri ta và an điền lá thông
Thành phần hoạt tính gây độc của ngoại mộc tái, cày ri ta và an điền lá thôngThành phần hoạt tính gây độc của ngoại mộc tái, cày ri ta và an điền lá thông
Thành phần hoạt tính gây độc của ngoại mộc tái, cày ri ta và an điền lá thông
 
Luận văn: Nghiên cứu nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằ...
Luận văn: Nghiên cứu nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằ...Luận văn: Nghiên cứu nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằ...
Luận văn: Nghiên cứu nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằ...
 
Luận văn: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ...
Luận văn: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ...Luận văn: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ...
Luận văn: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ...
 
Luận văn: Thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cây lạc tiên
Luận văn: Thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cây lạc tiênLuận văn: Thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cây lạc tiên
Luận văn: Thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cây lạc tiên
 
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tốLuận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
 
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
 
Luận án: Đặc điểm sinh học của rệp sáp bột hồng hại sắn, HAY
Luận án: Đặc điểm sinh học của rệp sáp bột hồng hại sắn, HAYLuận án: Đặc điểm sinh học của rệp sáp bột hồng hại sắn, HAY
Luận án: Đặc điểm sinh học của rệp sáp bột hồng hại sắn, HAY
 
Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...
Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...
Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...
 
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...
 
Luận án: Biện pháp kỹ thuật đối với giống bưởi Diễn tại Thái Nguyên
Luận án: Biện pháp kỹ thuật đối với giống bưởi Diễn tại Thái NguyênLuận án: Biện pháp kỹ thuật đối với giống bưởi Diễn tại Thái Nguyên
Luận án: Biện pháp kỹ thuật đối với giống bưởi Diễn tại Thái Nguyên
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
 
Nghiên Cứu Sự Lưu Hành Của Salmonella Typhimurium Và Salmonella Enteritidis T...
Nghiên Cứu Sự Lưu Hành Của Salmonella Typhimurium Và Salmonella Enteritidis T...Nghiên Cứu Sự Lưu Hành Của Salmonella Typhimurium Và Salmonella Enteritidis T...
Nghiên Cứu Sự Lưu Hành Của Salmonella Typhimurium Và Salmonella Enteritidis T...
 
Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdf
Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdfNghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdf
Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus).pdf
 
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
 
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAYKhả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
 

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...
Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...
Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...
Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...
Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...
Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...
Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...
Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...
Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Tạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.doc
Tạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.docTạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.doc
Tạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.docDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864 (20)

Yếu Tố Tự Truyện Trong Truyện Ngắn Thạch Lam Và Thanh Tịnh.doc
Yếu Tố Tự Truyện Trong Truyện Ngắn Thạch Lam Và Thanh Tịnh.docYếu Tố Tự Truyện Trong Truyện Ngắn Thạch Lam Và Thanh Tịnh.doc
Yếu Tố Tự Truyện Trong Truyện Ngắn Thạch Lam Và Thanh Tịnh.doc
 
Từ Ngữ Biểu Thị Tâm Lí – Tình Cảm Trong Ca Dao Người Việt.doc
Từ Ngữ Biểu Thị Tâm Lí – Tình Cảm Trong Ca Dao Người Việt.docTừ Ngữ Biểu Thị Tâm Lí – Tình Cảm Trong Ca Dao Người Việt.doc
Từ Ngữ Biểu Thị Tâm Lí – Tình Cảm Trong Ca Dao Người Việt.doc
 
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...
 
Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...
Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...
Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...
 
Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...
Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...
Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...
 
Vaporisation Of Single And Binary Component Droplets In Heated Flowing Gas St...
Vaporisation Of Single And Binary Component Droplets In Heated Flowing Gas St...Vaporisation Of Single And Binary Component Droplets In Heated Flowing Gas St...
Vaporisation Of Single And Binary Component Droplets In Heated Flowing Gas St...
 
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...
 
Tác Giả Hàm Ẩn Trong Tiểu Thuyết Nguyễn Việt Hà.doc
Tác Giả Hàm Ẩn Trong Tiểu Thuyết Nguyễn Việt Hà.docTác Giả Hàm Ẩn Trong Tiểu Thuyết Nguyễn Việt Hà.doc
Tác Giả Hàm Ẩn Trong Tiểu Thuyết Nguyễn Việt Hà.doc
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...
 
Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...
Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...
Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...
 
Song Song Hóa Các Thuật Toán Trên Mạng Đồ Thị.doc
Song Song Hóa Các Thuật Toán Trên Mạng Đồ Thị.docSong Song Hóa Các Thuật Toán Trên Mạng Đồ Thị.doc
Song Song Hóa Các Thuật Toán Trên Mạng Đồ Thị.doc
 
Ứng Dụng Số Phức Trong Các Bài Toán Sơ Cấp.doc
Ứng Dụng Số Phức Trong Các Bài Toán Sơ Cấp.docỨng Dụng Số Phức Trong Các Bài Toán Sơ Cấp.doc
Ứng Dụng Số Phức Trong Các Bài Toán Sơ Cấp.doc
 
Vai Trò Của Cái Bi Trong Giáo Dục Thẩm Mỹ.doc
Vai Trò Của Cái Bi Trong Giáo Dục Thẩm Mỹ.docVai Trò Của Cái Bi Trong Giáo Dục Thẩm Mỹ.doc
Vai Trò Của Cái Bi Trong Giáo Dục Thẩm Mỹ.doc
 
Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...
Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...
Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...
 
Thu Hút Vốn Đầu Tư Vào Lĩnh Vực Nông Nghiệp Trên Địa Bàn Tỉnh Gia Lai.doc
Thu Hút Vốn Đầu Tư Vào Lĩnh Vực Nông Nghiệp Trên Địa Bàn Tỉnh Gia Lai.docThu Hút Vốn Đầu Tư Vào Lĩnh Vực Nông Nghiệp Trên Địa Bàn Tỉnh Gia Lai.doc
Thu Hút Vốn Đầu Tư Vào Lĩnh Vực Nông Nghiệp Trên Địa Bàn Tỉnh Gia Lai.doc
 
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...
 
Tạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.doc
Tạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.docTạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.doc
Tạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.doc
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...
 

Recently uploaded

ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhvanhathvc
 
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...Nguyen Thanh Tu Collection
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfChuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfhoangtuansinh1
 
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoabài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa2353020138
 
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docxTrích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docxnhungdt08102004
 
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...hoangtuansinh1
 
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptxChàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptxendkay31
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...ThunTrn734461
 
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh líKiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh líDr K-OGN
 
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdfNQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdfNguyễn Đăng Quang
 
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdfSơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdftohoanggiabao81
 
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...Nguyen Thanh Tu Collection
 

Recently uploaded (19)

ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
 
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfChuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
 
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
 
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
 
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
 
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoabài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
 
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docxTrích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
 
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
 
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptxChàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
 
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh líKiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
 
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdfNQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
 
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
 
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdfSơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
 
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
 

Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật

  • 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …………***………… NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019
  • 2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …………***………… NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Dương Ngọc Tú 2. PGS.TS. Dương Anh Tuấn HÀ NỘI, NĂM 2019
  • 3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Dương Ngọc Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn. Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Hiếu
  • 4. ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Dương Ngọc Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn, những người Thầy đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới GS. VS. Châu Văn Minh và TS. Nguyễn Văn Lạng, đã giới thiệu, cổ vũ và động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp CNC, Ban Quản lý Khu CNC Hòa Lạc đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Sinh dược, các Thầy, Cô và bạn bè đồng nghiệp tại Viện Hóa học (đặc biệt là PGS. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh, các bạn Đức, Thủy, Minh, Hiền, Dung...), các đồng nghiệp tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học đã tận tình truyền thụ kiến thức, cùng phối hợp cũng như giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành các nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ, luôn là nguồn động viên to lớn cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Hiếu
  • 5. iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii MỤC LỤC.........................................................................................................ii DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi DANH MỤC BẢNG......................................................................................viii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... ix DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................ x CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................... 5 1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật........... 5 1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học7 1.3. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật ........................ 9 1.3.1. Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu............................................................... 9 1.3.2. Thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm bệnh .................................................. 12 1.3.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc BVTV thảo mộc ở Việt Nam ......................................................................................................... 13 1.4. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới ................................................................................................. 14 1.4.1. Khái niệm nấm nội sinh thực vật .......................................................... 14 1.4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội sinh thực vật............................................................................................................ 15 1.5. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa L.) .................................................................................................................... 23 1.5.1. Thực vật học.......................................................................................... 23 1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học............................................ 26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 33 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 33
  • 6. iv 2.1.1. Mẫu thực vật.......................................................................................... 33 2.1.2. Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên khoa học, lập hồ sơ lưu trữ....................................................................................... 34 2.1.3. Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật............................................. 35 2.1.4. Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật............................. 35 2.1.5. Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự gene vùng ITS .......... 35 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu ......................... 37 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................ 37 2.2.2. Sắc ký cột (CC) ..................................................................................... 37 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ............................................... 38 2.3. Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm................................... 39 2.3.1. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm ................................................................... 39 2.3.2. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ nấm của dịch chiết, phân đoạn chiết, chất sạch trong phòng thí nghiệm ......................................................... 41 2.4. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm nội sinh từ thực vật .................. 42 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 44 3.1. Thực nghiệm phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật ....................... 45 3.1.1. Phân lập nấm nội sinh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.).................. 45 3.1.2. Phân lập nấm nội sinh từ cây ngâu ta (Aglaia dupenrreana) ............... 51 3.1.3. Phân lập nấm nội sinh từ lá cây trầu không (Piper betle L) ................. 55 3.2. Thực nghiệm phân lập thành phần hóa học từ thực vật và nấm nội sinh thực vật............................................................................................................ 56 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana)............ 56 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla)................ 62 3.2.3. Phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa) ................... 63 3.2.4. Phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không (Piper betle L.)................ 65
  • 7. v 3.2.5. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Ngâu ta (nấm M. hawaiiensis)..................................................................................................... 68 3.2.6. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây nghệ vàng (nấm F. oxysporum)...................................................................................................... 70 3.2.7. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không (nấm F. solani)73 3.3. Thử hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các mẫu dịch chiết, phân đoạn và chất sạch .......................................................................................................... 74 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 76 4.1. Kết quả phân lập thực vật và định danh các chủng nấm nội sinh thực vật76 4.2. Kết quả khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm của các dịch chiết tổng, phân đoạn dịch chiết tổng và chất sạch thực vật, nấm nội sinh thực vật77 4.3. Kết quả nghiên cứu các thành phần hóa học của thực vật và nấm nội sinh thực vật............................................................................................................ 81 4.3.1. Thành phần hóa học cây Ngâu (A. dupperreana) và Gội ổi (A. oligophylla) ..................................................................................................... 81 4.3.2. Thành phần hóa học cây nghệ vàng (Curcuma longa L.).................... 90 4.3.3. Thành phần hóa học của cây Trầu không (Piper betle L.).................... 92 4.3.4. Thành phần hóa học nấm nội sinh M. hawaiiensis từ cây Ngâu .......... 94 4.3.5. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. oxysporum cây Nghệ vàng ........ 97 4.3.6. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. sonani của Trầu không............ 102 4.4. Mối tương quan về thành phần hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học thực vật và nấm nội sinh thực vật ................................................................. 104 4.4.1. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Ngâu và nấm nội sinh cây Ngâu ................................................................... 104 4.4.2. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Nghệ vàng và nấm nội sinh cây Nghệ vàng.................................................. 105 4.4.3. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Trầu không và nấm nội sinh cây Trầu không................................................ 106
  • 8. vi KẾT LUẬN................................................................................................... 107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................... 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. 111 DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton CC Column chromatography Sắc kí cột COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1 H-1 H DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer Phổ DEPT DMSO Dimethyl sulfoxide ESI-MS Electron spray ionization mass spectra Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử HMBC Heteronuclear mutiple bond connectivity Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HR-ESI-MS High resolution electronspray ionization mass spectrum Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử HSQC Heteronuclear single- Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết
  • 9. vii quantum coherence NOESY Nuclear overhauser effect Spectroscopy Phổ NOESY IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm RP18 Reserve phase C-18 Silica gel pha đảo RP-18 TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane Tetramethyl silan PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN DNA, Deoxyribonucleic Acid Vật chất di truyền ITS Internal transcribed spacer PDA Potato dextrose agar Môi trường nuôi cấy khuẩn nấm gồm khoai tây, đường, agar MEA Malt extract Agar Môi trường nuôi cấy khuẩn nấm gồm mạch nha và agar rRNA Ribosomal RNA RNA ribosome
  • 10. viii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính trừ sâu khoang (Spodoptetra litura) của các mẫu dịch chiết cây ngâu.................................................................................. 77 Bảng 4.2.2. Hoạt tính kháng nấm Botrytis cinerea của các mẫu dịch chiết thực vật.................................................................................................................... 78 Bảng 4.2.3. Hoạt tính ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết F. oxysporum80 Bảng 4.2.4. Khả năng ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết nấm nội sinh thực vật............................................................................................................ 81 Bảng 4.3.1.1 Dữ liệu NMR của hợp chất 7 (CDCl3)...................................... 90 Bảng 4.3.4.1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 13 và 14................................ 96 Bảng 4.3.5.1. Kết quả GC-MS các chất 15-26................................................ 97 Bảng 4.3.5.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 28 và 29................................ 100 Bảng 4.3.5.3 Số liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của chất 30................................ 102 Bảng 4.3.6.1 Dữ liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của chất 31............................... 104
  • 11. ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.5.1 Cây Ngâu ta................................................................................... 24 Hình 1.5.2. Cây Gội ổi .................................................................................... 24 Hình 1.5.3. Cây Trầu không............................................................................ 25 Hình 1.5.4. Cây Nghệ vàng............................................................................. 26 Hình 2.1. Các bước phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ mẫu thực vật Hình 3.1. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani......... 45 Hình 3.2. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium sp. .............. 46 Hình 3.3. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Trichoderma atroviride47 Hình 3.4. Cây phân loại của chủng Trichoderma atroviride.......................... 48 Hình 3.5. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Fusarium oxysporum... 49 Hình 3.6. Vị trí phân loại của chủng Fusarium oxysporum............................ 51 Hình 3.7. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. gloeosporioides ..... 52 Hình 3.8. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. crassipes................ 52 Hình 3.9. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng M. hawaiiensis ........... 53 Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủng Microdiplodia hawaiiensis................. 54 Hình 3.11. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Colletotrichum sp..... 55 Hình 3.12. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani....... 56 Hình 3.3.1. Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính trừ sâu trong phòng ........ 75 thí nghiệm........................................................................................................ 75 Hình 3.3.2. Một số hình ảnh thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng nấm tại phòng thí nghiệm............................................................................................. 75 Hình 4.2.1. Khả năng ức ché nấm của tinh chất curcumin............................. 79 Hình 4.2.2. Hoạt tính ức chế sự phát triển chủng nấm Botrytis cinera của các cặn chiết F. oxysporum ................................................................................... 80 Hình 4.3.5.1. Phổ sắc ký GC-MS của các chất 15-26.................................... 98
  • 12. x DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta............................... 57 Sơ đồ 3.2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi .................................. 62 Sơ đồ 3.2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng................................. 64 Sơ đồ 3.2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không.......................... 66 Sơ đồ 3.2.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất từ nấm nội sinh cây ngâu ...................... 68 Sơ đồ 3.2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Nghệ vàng............ 71 Sơ đồ 3.2.7. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không....... 74
  • 13. 1 MỞ ĐẦU Chất lượng cuộc sống của con người ngày càng nâng cao, đòi hỏi các sản phẩm nông nghiệp và môi trường an toàn. Tuy nhiên để giữ vững năng suất, chất lượng nông sản, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, người ta lại phải sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật, chủ yếu là các loại thuốc hóa học độc hại, và cứ như vậy vòng luẩn quẩn tăng sản lượng, tăng đầu vào, nguy cơ sản phẩm không an toàn và ô nhiễm môi trường lại tiếp tục diễn ra. Vì vậy việc tìm kiếm các giải pháp phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ sản phẩm nông nghiệp dễ sử dụng hơn, có hiệu lực trừ dịch hại cao hơn và thân thiện hơn với môi sinh và môi trường đang được đặt ra với toàn thể nhân loại chúng ta. Từ những thập niên cuối của thế kỷ XX, đầu thế kỷ XXI, các biện pháp sinh học (biological control) bảo vệ sản xuất nông nghiệp ngày càng phát huy tác dụng và dần được xác định là hướng biện pháp chủ đạo trong quản lý dịch hại tổng hợp trong thời gian tới. Ưu điểm nổi bật nhất của các biện pháp sinh học (ví dụ, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học) là hầu như không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên, ít gây tình trạng bùng phát dịch hại. Bên cạnh đó, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học (thuốc BVTVSH, bio-pesticide) còn mau phân hủy trong tự nhiên, ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao và thời gian bảo quản, sử dụng ngắn như các loại rau củ, hoa quả… Thêm nữa, các nguyên liệu để tạo thuốc BVTVSH thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc. Chi phí sản xuất thuốc BVTVSH thấp hơn so với thuốc BVTV hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Với những lợi ích mang lại, thuốc BVTVSH sẽ giúp người nông dân “thân thiện” hơn với cánh đồng của mình để có thể thụ hưởng lợi ích kinh tế lâu dài từ chính “người bạn” này.
  • 14. 2 Nấm nội sinh thực vật (nấm NSTV, Plant endophytic fungi) là những vi sinh vật sống trong tế bào thực vật mà không gây ra bất kì tác động tiêu cực nào tới cây chủ. Nấm NSTV cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormones, tổng hợp siderophores, cố định đạm hay qua hỗ trợ phytoremediation...[1]. Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh. Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều hoạt chất được sinh ra từ nấm NSTV cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng các hoạt chất quý giá này do chính cây sản xuất, do nấm NSTV sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các nấm NSTV có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra. Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy một số chất biến dưỡng của nấm NSTV không những tác động trên những mầm bệnh thực vật mà còn có khả năng trị liệu trên vi khuẩn, nấm, virus và những sinh vật đơn bào gây bệnh cho người và động vật. Vì vậy, nấm NSTV hiện đang được nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và được coi như là nguồn tài nguyên vô tận chưa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dược phẩm. Kết quả thống kê gần đây, với ước lượng 51% số hợp chất có hoạt tính được phân lập từ các chủng nấm NSTV là hợp chất mới, đã cho thấy tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng vô cùng to lớn của nấm NSTV. Các hợp chất do nấm NSTV sản sinh ra là con đường quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc mới trong y tế, nông nghiệp vì giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc (xanthones, anthraquinones, pestalotheols, octadrides, dihydroxyanthones, pyrenocine, steroids...) với rất nhiều hoạt tính mới [2,3]. Điều quan trọng nữa là nếu có thể khai thác được nguồn nguyên liệu từ nấm NSTV sẽ tránh được việc khai thác cạn kiệt nguồn
  • 15. 3 tài nguyên thực vật, làm mất sự đa dạng sinh học và đe dọa tuyệt chủng các loài thực vật quý hiếm, gây hậu quả xấu tới môi trường tự nhiên. Việt Nam vẫn nổi tiếng thế giới về tiềm năng đa dạng sinh học cac loài thực vật, với trên 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể các loài nấm, tảo, rêu. rất nhiều loài là đặc hữu của Việt Nam. Những công bố liên tục trong những năm gần đây của các đoàn khảo sát, chuyên gia Việt Nam và quốc tế về việc phát hiện các loài động thực vật mới tại Việt Nam càng khẳng định giá trị tiềm ẩn vô tận của nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá này. Từ kho tàng kinh nghiệm dân gian, chúng ta đã có rất nhiều kinh nghiệm trong việc nghiên cứu, tìm tòi, phát hiện và kết hợp tài tình các nguyên liệu thực vật đa dạng thành các bài thuốc dân gian hết sức quý giá, vô cùng đặc sắc, có hiệu quả đặc biệt trong việc chữa bệnh, năng cao sức khỏe con người, bảo vệ mùa màng, diệt trừ sâu bệnh, côn trùng, động vật gây hại..... Với trình độ phát triển khoa học công nghệ hiện nay, cần thiết phải tiếp tục tim tòi, nghiên cứu, chọn lọc kinh nghiệm dân gian, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên kết hợp với sự hỗ trợ của công nghệ, thiết bị hiện đại để tạo ra các sản phẩm mới, đưa giá trị sử dụng nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam lên tầm cao mới, có giá trị hơn, hiệu quả hơn, được đánh giá cao cả về hàm lượng khoa học công nghệ cũng như giá trị sử dụng. Triển khai tiếp chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Hóa học (Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) và Viện Sinh dược và Công nghệ sinh học (Đại học Tổng hợp Heirich-Heine Duesseldorf, CHLB Đức) về việc nghiên cứu hệ thực vật Việt Nam để sàng lọc, phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, có tiềm năng sử dụng để chế tạo chế phẩm trừ sâu và nấm bệnh hại cây trồng, cũng như mở rộng sang hướng đối tượng nghiên cứu còn rất mới trên Thế giới cũng như tại Việt Nam là nấm nội sinh thực vật, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật” trên
  • 16. 4 bốn (04) loài thực vật Việt Nam bao gồm Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.), Nghệ vàng (Curcuma longa L.) và ba (03) chủng nấm nội sinh phân lập từ cây Ngâu ta, nghệ vàng và trầu không. Đề tài nghiên cứu có tính khoa học, tính thực tiễn và tính thời sự, được thực hiện với mục tiêu là sàng lọc, phát hiện, chiết xuất, xác định cấu trúc các chất có tiềm năng sử dụng làm thuốc trừ sâu và nấm bệnh hại cây. Các nội dung nghiên cứu của Luận án bao gồm: - Chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần của bốn loài thực vật có tiềm năng trừ sâu và nấm bệnh hại cây.. - Phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật, chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần. - Thử nghiệm hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các chiết phẩm và cachợp chất hữu cơ thành phần. - Hoàn thiện quy trình phân lập, nhân nuôi và khai thác nguồn nấm NSTV như là một hướng đi mới nhanh hơn và hiệu quả hơn, một nguồn tài nguyên vô tận mới để phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có giá trị cao tại Việt Nam.
  • 17. 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật Theo nghiên cứu của nhà côn trùng học Xô viết N. N. Melnikov, có trên 68.000 loài côn trùng có hại cho con người, động vật và thực vật. Số lượng chủng vi sinh vật (nấm bệnh) có hại cũng không ít hơn. Các số liệu thống kê cho thấy côn trùng và vi sinh vật có hại đã gây thiệt hại rất lớn cho sản xuất nông nghiệp, với ước tính khoảng 1/3 tổng sản lượng lương thực toàn cầu đã bị mất hàng năm do côn trùng và nấm bệnh, và thực tế nếu côn trùng và nấm bệnh gây hại đã không được nghiên cứu và khống chế một cách hệ thống thì mức độ thiệt hại còn lớn hơn rất nhiều (ước tính tới 37% tổng sản lượn khoai tây, 22% tổng sản lượng cải bắp, 10% tổng sản lượng táo và 9% sản lượng tổng đào quả toàn cầu sẽ bị hư hại) [1]. Tại Trung quốc, có 1.648 loại tác nhân có hại cho mùa màng, trong đó có 724 loại nhân tố thực vật có hại, 838 loại côn trùng, mối mọt, 64 loại cỏ dại và 22 loài gặm nhấm. Nếu không sử dụng thuốc BVTV, tổng sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc sẽ bị mất tương ứng lần lượt là 78%, 54% và 32%. Sử dụng thuốc BVTV tại Trung Quốc đã góp phần giúp nước này thu được thêm 89,44 triệu tấn ngũ cốc, 1,65 triệu tấn bông, 2,53 triệu tấn hạt lấy dầu và 78 triệu tấn rau màu [2]. Theo đánh giá của Viện Lúa quốc tế (IRRI), côn trùng và nấm bệnh gây thiệt hại khoảng 37% tổng sản lượng lúa thu hoạch hàng năm trên toàn cầu. Một trong những trường hợp nấm gây bênh nổi tiếng nhất, thiệt hại nghiêm trọng nhất trong lịch sử trồng trợt thế giới là bệnh Panama do chủng nấm Fusarium cubense gây ra trên cây chuối. Bệnh Panama đã gần như xóa sổ ngành nông nghiệp trồng chuối tại Châu Mỹ La tinh những năm đầu thế kỷ 20. Những căn bệnh mới do nấm gây ra tiếp tục đe dọa xóa sổ ngành công nghiệp trồng chuối trị giá 11 tỷ USD trên toàn cầu [3].
  • 18. 6 Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đã tạo thêm được 1/3 tổng sản lượng nông sản toàn cầu. Nếu không có thuốc BVTV, sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc toàn cầu có thể bị thiệt hại tới 78%, 54% và 32% [4]. Tại Mỹ, cứ 1 USD bỏ ra cho thuốc BVTV sẽ thu về 4 USD sản lượng thu hoạch. Như vậy, với mức chi phí trung bình hàng năm đạt 10 tỷ USD cho thuốc BVTV, nông dân Mỹ đã thu được thêm 40 tỷ USD nông sản đã có thể bị mất bởi sâu bệnh. Nhờ sử dụng thuốc BVTV để ngăn chặn, tiêu diệt côn trùng, sâu bệnh hại mùa màng, các nước đang phát triển đã có thể sản xuất và xuất khẩu sản lượng lương thực, nông sản nhiều hơn bao giờ hết. Diện tích sản xuất nông nghiệp không ngừng được mở rộng, tới tận khu vực Amazon để trồng ngũ cốc đến rừng nhiệt đới Indonexia để trồng cọ dầu. Theo công bố của FAO, cứ tăng thêm 1% sản lượng lương thực là tương ứng với sự tăng thêm 1,8% lượng sử dụng thuốc BVTV [4]. Theo định nghĩa của Tổ chức Nông Lương Thế giới (FAO), thuốc BVTV là bất kỳ hợp chất hoặc hỗn hợp dùng để ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc khổng chế các nhân tố gây hại (như các vector gây hại cho người và động vật, các loại động thực vật không mong muốn) trong quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển và buôn bán lương thực, sản phẩm nông nghiệp, gỗ và đồ gỗ, thức ăn chăn nuôi hoặc các chất dùng để tiêu diệt côn trùng, nhện, vật gây hại trên và trong cơ thể động vật. Nó còn bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, chất gây rụng lá, chất gây mất nước hay làm quả chín chậm. Nó cũng bao gồm các chất được sử dụng trước và sau khi thu hoạch nông sản để ngăn ngừa sự suy giảm chất lượng sản phẩm trong quá trình bảo quản và vận chuyển [1, 3]. Thuốc BVTV có thể phân loại dựa vào vật đích tác dụng (thuốc diệt cỏ, diệt côn trùng, trừ nấm, trừ động vật gặm nhấm, trừ chấy rận), dựa vào cấu
  • 19. 7 trúc hóa học (hữu cơ, vô cơ, tổng hợp) hoặc có nguồn gốc sinh học (biopesticide), hay trạng thái vật lý (dạng rắn, lỏng, khí hóa lỏng, thuốc xông) [2, 5]. Thuốc diệt côn trùng hóa học (chemical insecticides) có một số nhóm thuốc (dựa theo tên của nhóm gốc có hoạt tính trừ bệnh) tiêu biểu như organochlorine, organophosphate, carbamate,... Nhóm thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học (biopesticide) bao gồm các loại thuốc có nguyên liệu gốc tự nhiên từ vi sinh vật, thực vật hay khoáng tự nhiên, hiện đang có xu hướng phát triển nhanh chóng, gồm có các nhóm pyrethroid, rotenoid, nicotinoid, strychnine, scilliroside. Ngoài ra, thuốc BVTV có thể được phân loại thành loại dễ phân hủy bởi vi sinh vật thành các chất ít gây hại hơn hoặc thuộc loại bền vững, khó phân hủy, tồn tại nhiều năm, tích lũy trong các chuỗi thức ăn, gây độc cho cả hệ sinh thái [2]. Hiện nay, trung bình hàng năm Thế giới tiêu thụ khoảng 3,5 tỷ kg thuốc BVTV hóa học từ giai đoạn gieo trồng đến khi thu hoạch, bảo quản, trong đó 75% tổng tiêu thụ là tại các quốc gia đã phát triển, nhưng nhu cầu tiêu thụ tại các nước đang phát triển đang không ngừng tăng mạnh [5]. 1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học Thực tế phải đối mặt với những vấn đề nguy hiểm, nan giải bới việc sử dụng thuốc BVTV hóa học hiện nay đã đặt Thế giới vào bài toán phải sử dụng thuốc BVTV hợp lý và hiệu quả hơn nữa, được kiểm soát chặt chẽ hơn nữa cũng như hối thúc giới khoa học phải tìm kiếm, thay thế thuốc BVTV hóa học bằng các biện pháp canh tác, các thế hệ thuốc BVTV mới an toàn hơn. Các thế hệ thuốc BVTV trong tương lai sẽ phải có những đặc tính thiết yếu như (1) có hoạt tính sinh học và hiệu lực diệt trừ sâu bệnh cao hơn nữa, để có thể hạn chế tối đa liều lượng thuốc cần sử dụng, giảm thiểu tối đa ô
  • 20. 8 nhiễm môi trường. (2) Không mang độc tính (non toxic); (3) Không gây ô nhiễm, thân thiện môi trường. Theo định nghĩa của Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA), thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học (Bio-pesticide) là các loại thuốc phòng trừ dịch hại có nguồn gốc nguyên liệu tự nhiên (như thực vật, động vật, vi khuẩn, vi rút, nấm và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng). Khái niệm này bao hàm cả các chất sinh ra bởi gene được cấy vào đối tượng cây cần bảo vệ (cây chuyển gene- GMO) nhằm tạo các kháng thể có khả năng phòng trừ dịch hại. Thuốc BVTV sinh học (BVTVSH) hội tụ nhiều đặc tính phù hợp để có thể thay thế thuốc BVTV hóa học, đã được giới khoa học toàn cầu tập trung nghiên cứu, khám phá, sản xuất và sử dụng để khống chế, tiêu diệt, xua đuổi các loại cỏ dại, bệnh dịch do côn trùng, nấm bênh gây ra. So với thuốc BVTV hóa học, thuốc BVTVSH có các đặc tính ưu việt sau: (1) có hiệu lực tiêu diệt sâu bệnh gây hại nhưng an toàn với con người và động vật, không gây ô nhiễm, không tồn dư hóa chất; (2) có tính lựa chọn vật chủ đích cao, an toàn cho các loài sinh vật có lợi, sinh vật thiên địch tự nhiên; (3) từ nguyên liệu đến chất hoạt hóa đều là sản phẩm tự nhiên, do đó có thể sản xuất bền vững, ổn định; (4) có thể hiệu chỉnh để nâng cao chất lượng sản phẩm bằng công nghệ lên men, công nghệ snh học; (5) Hiếm khi xảy ra hiện tượng kháng thuốc [7]. Trên thế giới hiện đã có hàng trăm nghìn loại thuốc BVTVSH được thương mại hóa và sử dụng [8]. Mexico, Mỹ và Canada đang là nhóm quốc gia sử dụng thuốc BVTVSH dẫn đầu, chiếm tới 44% tổng tiêu thụ toàn cầu, tiếp theo lần lượt là Châu Âu, Châu Á, Châu Đại dương, Mỹ La tinh và Châu Phi lần lượt chiếm 20%, 13%, 11%, 9% và 3% [9]. Tại Trung quốc, từ những năm 1990 đến nay, nền công nghiệp thuốc BVTVSH có tốc độ tăng trưởng rất nhanh, trung bình từ 10% đến 20%/năm
  • 21. 9 với hàng nghìn loại sản phẩm được đăng ký bảo hộ, sản xuất và thương mại [10]. Năm 2006, tổng tiêu thụ thuốc BVTVSH tại Trung Quốc đạt 145.000 tấn, trong đó các loại thuốc Bt là 2%, các loại kháng sinh nông nghiệp là 9% và thuốc trừ sâu thảo mộc là 5%. Dự kiến trong tương lai gần, tại Trung Quốc, BVTVSH sẽ thay thế cho 20% tổng tiêu thụ thuốc BVTV hóa học [11]. Tất nhiên, mặc dù có rất nhiều lợi ích như đã neue trên, thuốc BVTVSH vẫn tồn tại nhiều hạn chế cần khắc phục như thời gian phản ứng chậm, giá thành cao, nhanh bị phân hủy, đã làm hạn chế tiềm năng phát triển và ứng dụng thuốc. Cần thiết phải có thêm các giải pháp để cải thiện hình thức sản phẩm và hạ giá thành sản xuất thuốc BVTVSH trong thời gian tới. 1.3. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật 1.3.1. Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu Từ xa xưa, nông dân ở nhiều nước trên thế giới đã biết sử dụng một số loài thực vật chứa chất độc để trừ một số loại côn trùng gây hại trên cây trồng và gia súc bằng cách phun lên cây hay dùng nước chiết để tắm cho gia súc. Trên thế giới có khoảng 2000 loài cây có chất độc, trong đó có 10-12 loài cây được dùng phổ biến. Ở Việt Nam, đã phát hiện khoảng 335 loài cây độc, gần 40 loài cây độc có khả năng trừ sâu (trong đó có 10 loài có khả năng diệt sâu tốt) [12]. Những hợp chất trừ sâu thảo mộc thông dụng như rotenon và rotenoit, arteminisinin, azadirachtin, cnidiadin, matrine, pyrethrin và nicotin đều là những loại ancaloit, este, glucozit v.v... có trong một số bộ phận của một số loài cây. Hàm lượng chất độc phụ thuộc loài cây, bộ phận cây, điều kiện sống và thời gian thu hái chúng. Nói chung, các chất này rất dễ bị phân huỷ dưới tác động của oxy hoá, ánh sáng (đặc biệt các tia cực tím), ẩm độ , nhiệt độ và pH môi trường, nên chúng ít gây độc cho môi sinh môi trường. Nhưng cũng
  • 22. 10 vì đặc tính này, nên điều kiện thu hái, bảo quản và kỹ thuật chế biến ảnh hưởng nhiều đến chất lượng của sản phẩm [13]. Thuốc trừ sâu thảo mộc diệt côn trùng bằng con đường tiếp xúc, vị độc hoặc xông hơi. Phổ tác động thường không rộng. Một số loại còn có khả năng diệt cả nhện hại cây. Sau khi xâm nhập, thuốc nhanh chóng tác động đến hệ thần kinh, gây tê liệt và làm chết côn trùng [13]. Trừ nicotin ( thuốc rất độc với động vật máu nóng, có thể gây ung thư, nên đã bị cấm ở nhiều nước, trong đó có Việt nam) (Ryania và Sabadilla, ), các thuốc thảo mộc nói chung ít độc đối với người và động vật máu nóng, các sinh vật có ích và động vật hoang dã. Do thuốc trừ sâu thảo mộc nhanh bị phân huỷ, nên chúng không tích luỹ trong cơ thể sinh vật, trong môi trường và không gây hiện tượng sâu chống thuốc. Thuốc thảo mộc rất an toàn đối với thực vật, thậm chí trong một số trường hợp chúng còn kích thích cây phát triển. Do việc thu hái bảo quản khó khăn, giá thành đắt, nên trong một thời gian dài, các thuốc trừ sâu thảo mộc đã bị các thuốc trừ sâu hoá học lấn át. Ngày nay, với yêu cầu bảo vệ môi trường ngày càng được nâng cao, cộng với kỹ thuật gia công được phát triển, nên nhiều thuốc trừ sâu thảo mộc được dùng trở lại, đã đem lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần bảo vệ môi trường. Nhiều chất mới được phát hiện dùng làm thuốc trừ sâu như tinh dàu chàm, tinh dàu bạch đàn, tinh dầu tỏi v.v... [13]. Một số hoạt chất thảo mộc được dùng làm thuốc trừ sâu thảo mộc hiện nay như[13]: Pyrethrin: có trong hoa cây cúc sát trùng Chrysanthemun leucanthemun và các cây Chrysanthemun khác. Tác động mạnh đến côn trùng bằng con đường tiếp xúc; tác động yếu hơn đến các loài nhện, bằng cách bịt kênh vận chuyển ion Na+ , kéo dài giai đoạn mở, vì thế, côn trùng bị quật ngã và chết nhanh. Thuốc được dùng trừ côn trùng và nhện trên rau, chè,
  • 23. 11 nhiều cây trồng, cây cảnh; côn trùng ký sinh trên gia súc và động vật trong nhà. Có độ độc rất thấp với người, động vật máu nóng và môi trường. Ngày nay, bắt chước các pyrethrin tự nhiên, người ta đã tổng hợp ra vài chục hợp chất pyrethroid khác, trở thành một nhóm thuốc trừ sâu lớn, có nhiều ưu điểm hơn pyrethrin tự nhiên. Rotenon và các rotenoid: là các alkaloid có trong rễ, thân lá, hạt của một số loài cây thuộc họ Papilionaceae ( đặc biệt có nhiêu trong rễ cây Derris spp., nhất là Derris eleptica). Rotenon và các rotenoid tác động đến côn trùng (rệp muội, bọ trĩ, ngài, các bọ cánh cứng) và nhện bằng con đường tiếp xúc mạnh và vị độc. Ngoài ra còn dùng để trừ kiến lửa, muỗi ở đầm lầy; trừ ve bét, dòi ký sinh trên động vật; trừ côn trùng trong nhà và trừ cá dữ trong ruộng nuôi tôm. Triệu chứng trúng độc thể hiện nhanh. Thuốc ít độc với động vật có vú ngoại trừ thuốc xâm nhập vào cơ thể qua hô hấp và nhiễm độc máu. Rotenon và các rotenoit ít độc với các động vật khác, nhưng rất độc với cá. Ở Đồng bằng sông Cửu Long rễ cây Derris elleptica được băm nhỏ rải xuống ruộng để trừ cá dữ trong ruộng nuôi tôm rất hiệu quả và an toàn. Azadirachtin: là một trong 4 chất chính có tác dụng diệt sâu của dịch chiết hạt (chủ yếu) và lá cây neem, một loài cây có nguồn gốc ở Ân độ, Myanma, sau được trồng ở Tây Phi. Ở Việt nam, cây neem cũng mọc rải rác trong toàn quốc; đặc biệt mọc thành rừng hàng trăm ha ở Nam Trung bộ. Dịch chiết cây neem được dùng rộng rãi ở Ân độ, Trung quốc và nhiêu quốc gia khác. Cấu trúc của Azadirachtin tương tự ecdyson ( một homon lột xác của côn trùng); có thể là chất đối kháng của ecdyson, ngăn cản quá trình lột xác của côn trùng qua các tác động: làm giảm hay ức chế hoàn toàn khả năng sinh sản, hoặc làm giảm khả năng trứng nở; rút ngắn thời gian sống của trưởng thành, ngăn con cái đẻ trứng, trực tiếp diệt trứng; gây ngán cho ấu trùng,
  • 24. 12 trưởng thành; làm sâu non không biến thái, tác động tới sự lột xác giữa các tuổi sâu. Ngoài ra Azadirachtin còn có tác dụng gây ngán và xua đuổi. Bên cạnh tác dụng diệt côn trùng, Azadirachtin còn diệt được cả tuyến trùng và trừ nấm. Thuốc hầu như không độc với cá, động vật thuỷ sinh; ong mật, chim và động vật hoang dã khác. Matrine: hoạt chất có hiệu lực diệt sâu mạnh nhất trong dịch chiết cây khổ sâm. Matrine có phổ tác động rộng, diệt được nhiêu loài côn trùng chích hút và miệng nhai ; ngòai ra còn diệt được cả nhện hại cây. Matrine gây độc bằng cách làm tê liệt hệ thần kinh trung ương, bịt lỗ thở côn trùng làm cho côn trùng không hô hấp được và bị chết nhanh chóng. Ngoài ra, nhờ tác động gây ngán và xua đuổi, nên thuốc có hiệu lực dài. Matrine không có tác dụng nội hấp và xông hơi. Thuốc ít gây độc với người, động vật máu nóng và các loài sinh vật khác. Bị phân huỷ nhanh trong môi trường. Arteminisinin: Có khoảng 0.3 - 0.5% trong thân lá khô của cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.). Arteminisinin được dùng chủ yếu trừ bệnh sốt rét cho người. Gần đây Arteminisinin được dùng để trừ sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang hại rau; rầy xanh hại chè; rệp muội , bọ trĩ hại cam chanh. Thuốc hầu như không ảnh hưởng đến cá và động vật thuỷ sinh; ong mật, chim và động vật hoang dã. Không gây độc cho cây. Cnidiadin: Thuốc có phổ tác động rộng, trừ được nhiêu loài sâu hại thuộc bộ cánh phấn và nhện đỏ. Triệu chứng ngộ độc thể hiện nhanh. Thuốc ít độc với người và động vật máu nóng cũng như các loài sinh vật khác. Eucalyptol: Có trong cây bạch đàn. Phổ tác động rất rộng; trừ được nhiêu loài sâu và nhện. Thuốc ít gây độc với người, động vật máu nóng và các loài sinh vật khác. Bị phân huỷ nhanh trong môi trường. 1.3.2. Thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm bệnh Đã có rất nhiều hợp chất nguồn gốc thảo mộc được dùng để trừ bệnh hại cây trồng, an toàn với cây trồng, con người, môi sinh và môi trường [13].
  • 25. 13 Các hợp chất có hiệu lực kìm hãm sợi nấm phát triển, không để lây lan, trừ nhiều loài nấm và vi khuẩn hại lúa, rau và nhiều loại cây trồng khác như Acide acrylic và Acide ginkgoic. Các tổ hợp dầu thực vật có tác dụng trừ nấm tiếp xúc như Eugenol ( có trong dầu đinh hương Syzygium aromaticum; dầu quế Cinnamomum spp. và hương nhu Ocimum spp.) để trừ bệnh khô vằn hại lúa; giả sương mai và phấn trắng hại dưa chuột, sương mai cà chua; đốm nâu, đốm xám hại chè; phấn trắng hại hoa hồng. TP-Zep (dầu màng tang, dầu xả, dầu hồng, dầu hương nhu, dầu chanh) được dùng để trừ mốc sương cà chua; đốm nâu, đốm xám, thối búp chè; phấn trắng, đốm đen hoa hồng; đạo ôn, bạc lá lúa; nấm muội đen Capnodium sp. hại nhãn [13]. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc BVTV thảo mộc ở Việt Nam Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2009, có 344 sản phẩm được đăng ký vào danh mục các loại thuốc BVTVSH lưu hành tại Việt Nam, trong đó có 221 sản phẩm thuốc trừ sâu và 66 sản phẩm thuốc trừ nấm. Số lượng thuốc BVTVSH được đăng ký gia tăng rất nhanh, nếu năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm, nay đã gấp hơn 150 lần. Tuy vậy, dù số lượng các thuốc BVTVSH tăng nhanh nhưng tổng doanh thu hàng năm chỉ chiếm dưới 5% tổng doanh thu các loại thuốc BVTV nói chung. Nghĩa là hiện nay dù thuốc BVTVSH tốt, an toàn môi trường nhưng người nông dân lại ít sử dụng. Tuy vậy, số loại chế phẩm sinh học (CPSH) dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân bón vi sinh, hiện nay rất đa dạng về chủng loại và số lượng ở Việt Nam. Theo số liệu của Cục Trồng trọt, tính đến tháng 8/2012, Việt Nam đã có 1.694 các loại phân hữu cơ. Tuy nhiên chỉ có một số ít sản phẩm có chất lượng và uy tín, còn lại không thể kiểm soát được chất lượng
  • 26. 14 hay chất lượng không đảm bảo. Điều này đã làm giảm lòng tin của nhà nông vào loại sản phẩm này, làm thiệt thòi cho người sản xuất CPSH nghiêm túc, ảnh hưởng đến xu hướng khuyến khích sử dụng CPSH, nhất là việc dùng phân bón hữu cơ cho cây trồng. Tiềm năng sử dụng các CPSH trong nông nghiệp rất lớn, là hướng đi đúng đắn, hướng tới nền nông nghiệp hữu cơ, sinh thái bền vững và thân thiện với môi trường. Có thể kế đến một số loại thuốc BVTVSH hiện có tại Việt Nam như:  Sản phẩm từ cây neem: VINEEM 1500 EC (Chiết xuất từ nhân hạt neem (azadirachta indica A.Juss) chứa azadirachtin), Neemaza, Neemcide 3000 SP, Neem Cake, trừ nấm, côn trùng trong đất và rễ cây trồng rất tốt.  Hoạt chất rotenone được chiết xuất từ hai giống cây họ đậu là derris elliptica benth và derris trifoliate, dùng để diệt rầy.  Chế phẩm Đầu trâu Bihopper (hoạt chất retonone) đóng vai trò diệt tuyến trùng và chế phẩm Olicide (oligo - sacarit) đóng vai trò tăng sức đề kháng bệnh cây trồng. 1.4. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới 1.4.1. Khái niệm nấm nội sinh thực vật Nấm nội sinh thực vật (Endophytes, Endophytic fungi) là những vi sinh vật sống ở mô sâu thực vật nhưng không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [14, 15]. Endophytes cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormone [16], tổng hợp siderophores [17], cố định đạm [18], hay qua hỗ trợ phytoremediation [19]. Endophytes có thể được truyền từ một thế hệ kế tiếp thông qua các mô của vật chủ, hạt giống hoặc mầm thực vật [20]. Nghiên cứu đã cho thấy rằng các sản phẩm tự nhiên thu được từ vi khuẩn endophytic có chống vi khuẩn, chống ung
  • 27. 15 thư, chống oxy hóa, chống tiểu đường, ức chế miễn dịch, chống huyết khối, chống viêm và chống bệnh Alzheimer và một số bệnh khác [21]. Giữa nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tương sinh, nấm nội sinh xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong quá trình tiến hóa của cây. Sự tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện những đột biến gen từ những vi sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng nấm nội sinh hữu ích. Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh [22,23]. Nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ. Ở một số loài cây cỏ có nấm nội sinh sống, người ta nhận thấy chúng có khả năng gia tăng sức chịu đựng khô hạn hoặc chịu được độc tính của nhôm trong nguồn nước, trong môi trường sống… Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi cho kí chủ như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm tự nhiên được sinh ra từ nấm nội sinh cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng: các hoạt chất quí giá này do chính cây sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các nấm nội sinh có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra [21]. 1.4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội sinh thực vật  Trên thế giới: Nếu năm 1955, trên thế giới chỉ tìm ra được 500 chất kháng sinh thì 20 năm sau, năm 1975 đã tìm ra được 5.000 chất kháng sinh. Đến nay đã biết được hơn 13.000 chất kháng sinh được sản xuất từ thiên nhiên [19]. Từ những năm 1990, Taxomyces andreanae lần đầu tiên được phân lập từ cây Taxus brevifolia, nấm này sản xuất paclitaxel - chất ức chế các thoi
  • 28. 16 phân bào trong quá trình phân chia tế bào, có phổ khối tương tự như paclitaxel chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Một số nhà khoa học đã nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh của các cây thuộc chi Thông đỏ và tìm thấy các hoạt chất taxol (một hoạt chất được sử dụng hiệu quả nhất trong điều trị bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú) do nấm nội sinh tổng hợp. Chi thông đỏ (Taxus) luôn là một nguồn giàu nấm nội sinh [24,25, 26]. Năm 1995 – 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với cây chủ. Những nấm đã được biết là có tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis microspora. Ngoài ra, thông qua những bằng chứng miễn dịch học, người ta cũng đã phát hiện được sự tổng hợp taxol ở nhiều nấm nội sinh khác phân lập từ cây thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng của Penicillium sp., Pestalotiopsis sp. và Truncatella sp. [24,25, 26]. Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn nội sinh Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 được phân lập từ cây Kennedia nigriscans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram (+) như Bacillus anthracis, M. tuberculosis đa kháng và một số vi khuẩn kháng thuốc khác. Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 phát triển trong lá cây Grevilea pteridifolia phát triển ở Úc, sản xuất kháng sinh kakadumicin và echinomycin đều cho tác động kháng P. falciparum với LD50=7-10ng/ml [27, 28, 29]. Năm 2001, Tan và Zou chứng minh rằng nấm nội sinh cũng được công nhận là nguồn phong phú của chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học. Một vật chủ có thể phân lập được rất nhiều các chủng nấm nội sinh khác nhau [30]. Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về chủng nấm nội sinh Cryptospriopsis quercina được phân lập từ cây Tripterigeum wilfordii, nấm
  • 29. 17 này có thể sản xuất cryptocandin và cryptocin. Trong đó, cryptocandin kháng một số nấm gây bệnh cho người như Candida albicans, Trichophyton sp. và chống một số nấm gây bệnh thực vật như Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis cinerea. Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae và một số nấm gây bệnh thực vật [93]. Cùng năm 2003, Taechowisan và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia galanga [28, 29]. Năm 2005, Raviraja đã phân lập được mười tám loài nấm nội sinh được phân lập từ vỏ cây, thân và lá phân đoạn của năm loài cây thuốc ở Tây Ghats của Ấn Độ: Curvularia clavata, C. lunata, C. Pallescens, Fusarium oxysporum... Nấm nội sinh đã được tìm thấy nhiều nhất trong các đoạn lá, chứ không phải là phân khúc thân cây và vỏ cây. Phần lớn các loài nấm nội sinh đã được tìm thấy trong cây Callicarpa tomentosa thuộc chi Tử châu, họ Hoa môi (11 loài), trong khi cây Lobelia nicotinifolia thuộc phân họ Lỗ bình, họ Hoa chuông (5 loài) [31]. Năm 2007, Li và cộng sự đã tìm ra nấm Acremonium (2F09P03B) từ Huperzia serrate có khả năng sản xuất huperzine A có tác dụng là chất ức chế enzyme acetylcholinesterase, và được dùng trong điều trị bệnh Alzheimer [32]. Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập được Fusarium solani từ Camptotheca acuminate có khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất (9- methoxycamptothecin và 10-hydroxycamptothecin) có khả năng chống ung thư [33]. Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte trong cây Nghệ (Curcuma longa). Các chất dinh dưỡng trong thân rễ của cây nghệ là môi trường sống đa dạng cho các nhóm vi khuẩn khác nhau. Một số vi khuẩn nội sinh liên quan có thể thúc đẩy tăng trưởng. Trong nghiên cứu này, hai chủng endophyte Paenibacillus sp. được phân lập từ thân
  • 30. 18 rễ củ nghệ và cả hai chủng đã được tìm thấy có khả năng để sản xuất Indole 3 acetic acid qua phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - high- performance liquid chromatography) [17]. Năm 2012, Cui và cộng sự đã phát hiện nấm nội sinh Fusarium oxysporum phân lập từ cây Ginkgo biloba có khả năng sản xuất ginkgolid B dùng để điều trị bệnh tim mạch [10]. Năm 2014, Lena Hammerschmidt và cộng sự của Viện Sinh dược và Công nghệ Sinh học, Đại học Heinrich-Heine, Duesseldorf, Cộng hòa Liên bang Đức phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các dịch chiết của nấm nội ký sinh Acremonium strictum Gams, phân lập từ cây Đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) thu hái tại Việt Nam. Trong đó có 5 dẫn xuất polyketide mới 60-hydroxypestalotiopsone C (1), acropyrone (2), bicytosporone D (3), waol acid (4), và pestalotiopene C (5) và 7 hợp chất đã biết (6-12). Các hợp chất 6, 7 và 9 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình đối với hai dòng tế bào ung thư ở người là ung thư biểu mô buồng trứng nhạy cảm với cisplatin (A2780) và dòng kháng cisplatin (A2780 CisR), trong khi chỉ có chất 9 biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus với giá trị MIC 14,3 µM [25]. Có thể liệt kê các hoạt tính sinh dược từ sản phẩm thứ cấp khi lên men nấm nội sinh: Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nấm nội sinh phân lập từ cây ngập mặn ở một số vùng địa lý khác nhau có thể tổng hợp được các chất gây độc và tiêu diệt tế bào ung thư. Cyclic depsipeptides bionectriamides A-C được tách chiết từ chủng Bionectria ochroleuca được phân lập từ cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) ở Hải Nam, Trung Quốc [10]. Tiêu diệt vi sinh vật: Các hợp chất mới có tính diệt khuẩn do nấm nội sinh sản xuất có thể sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, giúp khắc phục hiện
  • 31. 19 tượng nhờn thuốc của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều hợp chất có nguồn gốc từ nấm nội sinh có khả năng tiêu diệt một dải rộng các loài vi khuẩn gây bệnh. Fusarium incarnatum được phân lập từ cây Cúc tần (Pluchea indica) ở đảo Hải Nam, Trung Quốc có khả năng sinh ra equisetin [4]. Chất chống oxi hóa: Chất chống oxi hóa thường được tìm thấy ở các cây dược liệu, rau và hoa quả. Chất chống oxi hóa thường được xem như các tác nhân giúp phòng tránh và chữa trị bệnh như ung thư, bệnh tim, tăng huyết áp, tiểu đường, run chân tay và mất trí nhớ, lão hóa… Thành phần phenol từ nấm nội sinh có tác dụng chống oxi hóa cao. Loài nấm Phomopsis amygdale phân lập từ cây ngập mặn ở Karankadu (Ấn Độ), và Trichoderma được tìm thấy trong lá cây ngập mặn Aegiceras corniculatum có thể sinh ra các chất có hoạt tính chống oxy hóa cao. Nấm nội sinh Alternaria sp. R6 phân lập từ rễ cây ngập mặn loài Myoporum bontioides A có khả năng tiết ra các chất chuyển hóa resverratrodehydes A&C chống các gốc tự do ABTS&DPPH [34]. Ức chế α-glucosidase: Các chất ức chế α-glucosidase có thể làm giảm sự hấp thụ carbohydrate từ bữa ăn và ngăn chặn tăng đường huyết sau khi ăn. Các chất này có thể được sử dụng để điều trị tiểu đường, béo phì. Hai chất mới được tìm thấy từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum phân lập từ loài cây ngập mặn Kandelia candel ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc (6’-O- desmethylterphenyllin, 3-hydroxy-6’-O-desmethylterphenyllin) có hoạt tính ức chế α-glycosidase rất mạnh, và có hiệu quả cao hơn cả chất đối chứng dương genistein. Hợp chất 07H239 từ nấm Xylaria sp. BL321 có hoạt tính ức chế α-glucosidase khi thử ở nồng độ cao. Ngoài ra, các chất chuyển hóa của vermistatin, 6-demethylpenisimplicissin và 2-epihydroxyldihydrovermistatin từ nấm nội sinh Penicillium sp. HN29-3B1 (phân lập từ cây Cerbera manghas) cũng biểu hiện hoạt tính kháng cao [25].
  • 32. 20 Ức chế acetylcholinesterase: Chất ức chế acetylcholinesterase (AChE) hiện sử dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ Alzheimer. Tuy nhiên, hiện vẫn chưa tìm được loại chất AChE có tác dụng mạnh, lâu dài mà ít tác dụng phụ nhất. Sporothrin A từ nấm nội sinh Sporothrix sp. có biểu hiện ức chế AChE rất mạnh. Hai terphenyls từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum (ZH4-E2) cũng có hoạt tính ức chế AchE. Ngoài ra, họ đang nghiên cứu các hợp chất do nấm nội sinh của cây ngập mặn sản sinh ra, chủng Penicillium sp. sk5GW1L và Penicillium sp. sk14JW2P, có tác dụng ức chế AChE như arigsugacin I, arigsugacin F và territrem B [25]. Hoạt tính chống viêm: Hợp chất chống viêm không chứa steroid rất cần thiết trong điều trị các bệnh viêm. Nấm nội sinh Irpex hydnoides, Aspergillus flavus, Schizophyllum commune, Neurospora crassa, Hypocrea lixii, Pestalotiopsis microspora, Aspergillus oryzae và Meyerozyma guilliermondi phân lập từ cây ngặp mặn có thể sản sinh ra các chất chống viêm có hoạt tính tương đương thuốc Indomethacin [25]. Tiêu diệt vi khuẩn lao mycobacteria: vi khuẩn Lao phổi đang trở nên rất nguy hiểm khi xuất hiện các dạng vi khuẩn kháng thuốc, do đó việc tìm ra các chất mới thay thế trở thành vấn đề cấp bách. Nấm nội sinh Fusarium sp. DZ- 27 phân lập từ thân cây Kandelia candel (Hải Nam, TQ) có thể sinh ra axit fusaric. Các thử nghiệm chống vi khuẩn lao cho thấy rằng hỗn hợp axit fusaric với muối cadmium và muối đồng của nó thể hiện hoạt tính tiêu diệt rất cao hai chủng vi khuẩn lao Mycobacterium bovis BCG và M.tuberculosis H37Rv [7]. Nấm nội sinh Nigrospora sp. phân lập từ cây Bruguiera sexangula có thể sản sinh anthraquinones có tác dụng phòng bệnh cao chống lại rhino virus [35]. Nhiều nấm nội sinh trong cây đã được phân lập, chúng có khả năng sản sinh những chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kiềm hãm khối u, chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác.
  • 33. 21 Fusarium sp. là nấm phân lập từ cây Selaginella pallescens, được thu nhập từ vùng Bảo vệ thực vật của Guanacaste của Costa Rica, sản xuất được một pentaketide mới là CR 377 cho tác dụng mạnh trên C. albicans [24]. Pestralotiopisis microspora thường gặp ở rừng mưa nhiệt đới, sản xuất nhiều chất có tác dụng sinh học, một trong những chất này là axit ambuic có tác dụng kháng nấm. Ngoài ra, nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã được phân lập từ các nguồn thực vật khác, các chủng nấm này có thể sản xuất các kháng sinh kháng nấm. Muscodor albus là nấm được phân lập từ cành của cây Quế (Cinnamomum zeylanicum), nấm này sản xuất một số chất bay hơi có thể ức chế vi khuẩn và nấm. Thành phần chính của những hợp chất này đã được xác định cấu trúc hóa học bằng sắc ký khí ghép với khối phổ (GC-MS), từ đó được tổng hợp hóa học. Các chất tổng hợp được có hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm, không độc với người [36]. Nodulisporium sp. được phân lập từ cây Bontia daphnoides sản xuất hợp chất nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng của ruồi xanh, nhặng [30].  Ở Việt Nam: Từ năm 1994, các nhà nghiên cứu trong nước đã phân lập được 6 chủng nấm nội sinh từ vỏ cây thông đỏ. Đây là loài thực vật đặc hữu có ở Việt Nam, từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng như một vị thuốc. Trong đó đáng chú ý là chủng nấm Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai. có mặt ở tất cả các mẫu vỏ của cây thông đỏ được lấy mẫu. Chúng phù hợp nhất với hình thái chủng nấm Pestalotiopsis sp. được tìm thấy trong vỏ cây thông đỏ ở Mỹ và được các nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc kí bản mỏng cùng với chất taxol chuẩn [6]. Năm 2005, Lê Mai Hương cùng các cộng sự của mình đã phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của 45 mẫu cây lấy ở vùng Yên
  • 34. 22 Tử, Hà Nội và vườn thuốc Mê Linh thu được 89 chủng nấm nội sinh trong đó có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn (chiếm 22,5% tổng số), 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tổng số), 27 chủng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tổng số chủng phân lập). Từ 32 chủng có hoạt tính, bằng phương pháp lên men tách chiết sơ bộ đã chọn được 9 chủng có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chủng có kí hiệu N2 có hoạt tính cao nhất, kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) và Fusarium oxyporum [20]. Năm 2009, Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về nấm nội sinh trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep.) và bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu được chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho hoạt tính kháng vi sinh vật, độc tế bào, chống oxy hóa và hoạt tính enzym ngoại bào; sorbicillin cho hoạt tính kháng S.aureus với MIC=25mg/ml. Chất ergosterol peroxid biểu hiện hoạt tính độc tế bào mạnh với cả 3 dòng tế bào thử là ung thư gan, ung thư màng tử cung và ung thư màng tim [37]. Năm 2009, Phạm Quang Thu và cộng sự cũng đã nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở các dòng Keo tai tượng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế. Phân lập được 8 chủng vi khuẩn nội sinh và 13 chủng nấm nội sinh từ 35 dòng Keo tai tuợng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế, trong đó có 15 chủng gồm vi khuẩn và nấm nội sinh trên tổng số 21 chủng có hoạt tính ức chế nấm Ceratocystis sp. ở mức độ mạnh và rất mạnh và chỉ có 8 trên tổng số 21 chủng ức chế nấm Corticium salmonicolor ở mức dộ mạnh và rất mạnh [38]. Năm 2010, Nguyễn Đinh Nga và cộng sự sàng lọc các chủng nấm nội sinh thực vật trên cây ngũ sắc (Lanata camara L.) thu được chủng Pseudeurotium NS-T1 kháng C. albicans, trên cây mã đề (Plantago major L.) thu được chủng Fusarium MĐ-TR1 và MĐ-TR3 cho hoạt tính kháng C.
  • 35. 23 albicans và MRSA; tía tô (Perilla ocymoides L.) thu được chủng Trichoderma TT-L1 kháng C. albicans và MRSA; trầu (Piper betle L.) thu được chủng Fusarium TR-T1 kháng C. Albicans [16]. Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã phân lập được rất nhiều nấm nội sinh, nhiều nhất ở lá (50 chủng), thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1 chủng). Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết 68 chủng nấm nội sinh, kết quả có 17 mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với cả 3 dòng tế bào ung thư như mẫu chiết của các chủng SHT4, SHT6, SHT9…Bằng phương pháp phân loại hình thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101 và Gongroniella butleri SHT106. Hợp chất SHT46.1 thể hiện hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư cơ vân với giá trị IC50 là 4,19 μg/ml. Hợp chất SHT 101.1 biểu hiện khả năng kháng mạnh vi khuẩn S. aureus với MIC là 25 μg/ml. Hợp chất SHT 101.2 có hoạt tính gây độc 2 dòng tế bào ung thư phổi và ung thư cơ vân với giá trị IC50 tương ứng là 4,0 và 3,06 μg/ml. Kết quả thực nghiệm cho thấy các chủng nấm lựa chọn đều có khả năng ức chế sâu bệnh với tỉ lệ tương đối cao, từ 11,4-31,4% so với đối chứng [6]. Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã phát hiện ra môi trường nuôi cấy thích hợp cho nấm nội cộng sinh Fusarium oxyporum được phân lập trên Thông đỏ (Taxus wallichiana) tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng và lượng taxol sinh ra ở môi trường nuôi cấy là 250,98 mg/kg khối lượng khô [26]. 1.5. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa L.) 1.5.1. Thực vật học  Cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre):
  • 36. 24 Hình 1.5.1 Cây Ngâu ta (nguồn internet) Đặc điểm thực vật: Cây nhỡ có thể cao 4-7m. Lá kép lông chim lẻ. Hoa mọc thành chùm ở kẽ lá, nhỏ màu vàng, rất thơm. Quả hạch màu đỏ. Hạt có áo hạt. Phân bố: Cây được trồng khắp nơi làm cảnh và lấy hoa để ướp chè. Công dụng: Ngoài công dụng dùng ướp chè cho thơm, hoa và lá ngâu dùng chữa sốt, vàng da, hen suyễn. Lá tươi dùng nấu tắm ghẻ.  Cây Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.): Hình 1.5.2. Cây Gội ổi (nguồn internet) Đặc điểm thực vật: Cây gỗ lớn, cao 20 - 25m. Lá kép lông chim lẻ. Hoa có đường kính khoảng 2mm. Quả gần hình cầu, màu nâu hay vàng, chia 2 ô; mỗi ô chứa 1 hạt có áo hạt trắng hay nâu. Phân bố: Loài phân bố ở Việt Nam, Thái Lan, Malaixia, Inđônêxia và Philippin. Ở Việt Nam có gặp tại Đồng Nai, An Giang và Kiên Giang.
  • 37. 25 Công dụng: Gỗ được sử dụng trong xây dựng và đóng đồ đạc thông thường.  Cây Trầu không (Piper betle L.) họ Hồ tiêu (Piperaceae): Hình 1.5.3. Cây Trầu không (nguồn internet) Đặc điểm thực vật: Cây nhỡ leo nhẵn. Lá có cuống có bẹ, phiến hình trái xoan. Hoa khác gốc, mọc thành bông. Quả mọng lồi, tròn, có những lông mềm ở đỉnh. Phân bố: Cây gốc ở Malaixia, được trồng rộng rãi để lấy lá ăn trầu. Lá thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô, có khi tán bột, dùng dần. Công dụng: Vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm; có tác dụng trung hành khí, khư phong tán hàn, tiêu thũng chỉ thống, hoá đàm, chống ngứa. Trầu không được xem như là thuốc làm săn da, làm chất kích thích, làm chất lợi nước bọt và xem như có tác dụng dự phòng chống bệnh lỵ và sốt rét.  Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.): Đặc điểm thực vật: cao khoảng 70 cm. Thân rễ (thường gọi củ Nghệ) hình trụ hay hình bầu dục, phân nhánh, có màu vàng tươi. Lá đơn, mọc từ thân rễ. Bẹ lá hình lòng máng, dài 18- 28 cm, ôm sát vào nhau tạo thành một thân khí sinh giả có màu xanh.
  • 38. 26 Hình 1.5.4. Cây Nghệ vàng (nguồn internet) Phân bố: Gốc ở Ấn Độ, được trồng phổ biến tại Việt Nam, lấy thân rễ làm gia vị và làm thuốc. Công dụng: Nghệ có vị đắng, cay, mùi thơm hắc, tính ấm; có tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống. Người ta cũng biết được là curcumin có tác dụng tiêu mủ, lên da non, tác dụng thông mật, làm tăng sự bài tiết mật của tế bào gan, phá cholesterol trong máu. Tinh dầu Nghệ có tác dụng diệt nấm ngoài da và cũng như curcumin có tác dụng kháng khuẩn. 1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 1.5.2.1. Cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre) Năm 2007, Bo-Jun Xie và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất: agladupol A–E (đánh số từ 1–5 trong hình dưới đây) [39]. Năm 2012, nghiên cứu của Heng Zhang và cộng sự đã cho biết dịch chiết methanol của cành lá Aglaia duperreana có hoạt tính tiêu diệt ốc bươu vàng Pomacea canaliculata với giá trị LC50 33.4 μg/mL. Trong đó, cặn chiết
  • 39. 27 ehyl acetate (LC50 53.6 μg/mL) thể hiện hoạt tính cao hơn các cặn chiết còn lại. Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của cặn chiết này, nhóm tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất, đánh số thứ tự trong hình minh họa dưới đây: (20R)-3β-hydroxy-lup-28,29-dioic acid (số 6), betulinic acid (số 7), 24(R),25-dihydroxydammar-20-en-3-one (số 8), ursolic acid (số 9), obtusilin (số 10), (24R)-cycloartane-3α,24,25-triol (số 11), cabraleone (số 12), ocotillone (số 13), shoreic acid (số 14), 3-hydroxy-4',5,7- trimethoxyflavone (số 15), 2,3-dihydro-5-hydroxy-4',7-dimethoxyflavone (số 16), naringenin trimethyl ether (số 17), (2R,3R)-(+)-4',5,7- trimethoxydihydroflavonol (số 18), (+)-eudesmin (số 19), (+)-odorine (số 20) và (+)-odorinol (số 21). Naringenin trimethyl ether biểu hiện hoạt tính đáng kể với giá trị LC50 là 3.9 μg /mL, cao hơn so với chất đối chứng saponin ở trà xanh (LC50 = 4.5 μg/mL) [40]. 1.5.2.2. Cây Gội ổi (Aglaia oligophylla) Năm 2003, Gerhard Bringmann và cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất: rocaglamide (số 22), 6-demethoxy-6,7-methylendioxyrocaglamide (số 23), 6-demethoxy-10-hydroxy-11-methoxy-6,7-methylendioxyrocaglamide
  • 40. 28 (số 24) và cyclorocaglamide (số 25). Trong đó hợp chất 3 có tác dụng ức chế ấu trùng bướm đêm Spodoptera littoralis với giá trị LC50 bằng 2,5 ppm [41] Năm 2006, Nantiya Joycharat và cộng sự đã phân lập, xác định cấu trúc của 10 hợp chất từ lá Aglaia oligophylla gồm dipterocarpol (số 26), ocotillone (số 27), cabraleone (số 28), ocotillol (số 29), 20(S),24(S)-dihydroxydammar- 25-en-3-one (số 30), rocaglaol (số 31), odorine (số 32), 20-epi-odorine (số 33), 20S,25-epoxy-24R-hydroxy-3-dammaranone (số 34), 20S,25-epoxy-24R- hydroxydammarane-3α-ol (số 35) [42]. Năm 2016 Yunie Y. và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 4 hợp chất từ thân loài Aglaia oligophylla, gồm 2 hợp chất steroid: stigmasterol (số 36) và β-sitosterol (số 37); 2 hợp chất triterpenoid: oligophyllic acid (số 38) và foveolin B (số 39):
  • 41. 29 Bên cạnh đó, ngoài dược lý đặc hiệu làm thuốc trừ sâu, chống viêm và chống ung thư, Trong xét nghiệm CUPRAC (Cupric giảm năng lực chống oxy hóa), dịch chiết ethyl acetate của thân cây thể hiện khả năng giảm mạnh nhất với giá trị 1543 mg đương lượng Trolox/g và dịch chiết methanol cho thấy khả năng chống oxy hóa giảm mạnh nhất với giá trị 1059 mg đương lượng Trolox/g. [43]. 1.5.2.3. Cây Trầu không (Piper betle L.) Năm 2013, trong nghiên cứu của D. Pradhan và cộng sự đã cho biết thành phần hóa học cây Trầu không (Piper betle L.) rất phong phú và đa dạng với nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm. Một số hợp chất Terpenoid gồm: 1, 8-cineole, cadinene, camphene, caryophyllene, limonene, pinene, chavibetol (số 40), ally pyrocatechol (số 41), carvacrol, safrole, chavibetol acetate (số 42), eugenol (số 43) và piperitol (số 44) là các dẫn xuất phenol chính được xác định trong lá Trầu không. Trong đó, eugenol có hoạt tính chống nấm mạnh. Các hợp chất flavonoid: quercetin (số 45), luteolin (số 46), các hợp chất alkaloid: cepharadione A (số 47), aristololactame (Α-II) (số 48) và cepharadione (số 49). Ngoài ra còn có một số hợp chất khác: ursonic acid (số 50), ellagic acid (số 51),…
  • 42. 30 Lá trầu không như chất chống oxy hóa tự nhiên, có tương quan với hoạt tính sinh hoc khác như bảo vệ gan, trị đái tháo đường, chống viêm, chống đột quỵ và chống ung thư. Bên cạnh đó, lá có phổ rộng kháng khuẩn, chống lại nhiều vi khuẩn khác nhau bao gồm Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Enteritidis, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium, Actinomycetes viscosus, Streptococcus sanguis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia. Hơn nữa, lá có tác dụng chống nấm và chống độc, hoạt động chống lại mầm bệnh gây bệnh thương hàn, dịch tả, bệnh lao,... Nhai lá trầu tăng tiết nước bọt làm tăng enzyme peroxidase, lysozyme và kháng thể để chống lại sự phát triển của vi khuẩn trong khoang miệng. Lá trầu có hoạt tính chống ung thư chất gây ung thư thuốc lá do sự hiện diện của hydroxychavicol và axit chlorogen. Hai hợp chất sau này tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường. Nhai lá trầu kết quả hành động tim mạch bằng cách tăng tốc catecholamine từ vỏ thượng thận đóng góp để tăng sức chịu đựng của cơ tim, nhịp tim, huyết áp và thần kinh giao cảm. Nó cũng có tác dụng ức chế tiểu cầu. Do đó, lá trầu có lợi cho rối loạn tim mạch khác nhau như xung huyết suy tim, bệnh mạch vành, cấp tính nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch [44]
  • 43. 31 1.5.2.4. Cây Nghệ vàng (Curcuma longa) Năm 2017, Ting Yuan và cộng sự của mình đã phân lập được 6 hợp chất: turmerone Q (số 52), bisacurone A (số 53), bisacurone (số 54), bisacurone B (số 55), 1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(4-hydroxyphenyl)- penta-(1E,4E)-1,4-dien-3-one (số 56), cyclocurcumin (số 57) và 1,7-bis(4- hydroxy-phenyl)-3-hydroxy-1,3-heptadien-5-one (số 58). Hợp chất số 57 và số 58 cho thấy hoạt tính ức chế đáng kể về sản xuất NO gây ra bởi lipopolysacarit (LPS) trong các đại thực bào. Cùng năm này, Kamran Ashraf và Sadia Sultan đã phân lập và xác định cấu trúc của 3 hợp chất: curcumin (số 59), demethoxycurcumin (số 60), bisdemethoxycurcumin (số 61) Sự ức chế tăng sinh tế bào ung thư gan HepG2 của curcumin (IC50 41,69 µg/mL) hiệu quả hơn nhiều so với chiết xuất methanolic (IC50 196,12 µg/mL). Bột nghệ khi uống với sữa đun sôi rất hữu ích trong việc chữa bệnh ho và các bệnh liên quan đến đường hô hấp, và bột nghệ rang là một thành
  • 44. 32 phần được sử dụng như thuốc chống động kinh cho trẻ em. Củ nghệ cũng được sử dụng trong điều trị các bệnh về răng miệng, rối loạn tiêu hóa như khó tiêu và axit, khó tiêu, đầy hơi, loét, chống oxy hóa, chống đông cũng như làm giảm bớt tác dụng gây ảo giác của hashish và các thuốc hướng tâm thần khác. Trong thực phẩm và sản xuất, curcumin hiện đang được sử dụng trong nước hoa và như một chất tạo màu vàng tự nhiên, cũng như một phụ gia thực phẩm được phê duyệt cho hương vị khác nhau các loại cà ri và mù tạt [45].
  • 45. 33 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thực vật Vỏ cây Ngâu ta thu tại Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Aglaia duperreana Pierre, họ Xoan (Meliaceae) số tiêu bản AD1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Lá cây Gội ổi thu tại Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Aglaia oligophylla Miq., họ Xoan (Meliaceae) số tiêu bản AO1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Lá cây Trầu không thu tại Trạm đa dạng sinh học Mê Linh (Vĩnh Phúc), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Piper betle L., họ Hồ tiêu (Piperaceae) số tiêu bản PB1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Củ rễ cây Nghệ vàng thu tại Trạm đa dạng sinh học Mê Linh (Vĩnh Phúc), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Curcuma longa L., họ Gừng (Zingiberaceae), số tiêu bản CL1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • 46. 34 2.1.2. Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên khoa học lập hồ sơ lưu trữ. Chuẩn bị dụng cụ: Dụng cụ chuẩn bị cần có: túi lưới, báo cũ, dây buộc, túi nilon loại nhỏ, eteket, bút viết kính, khung gỗ ép mẫu, dao cắt chặt mẫu, dao kéo cắt dây và cành mẫu nhỏ, rổ nhửa, máy ảnh,… Tiến hành thu hái thực vật ngoài thực địa: Mẫu thực vật có thể lấy lá, vỏ, rễ, củ. Số lượng mẫu lấy từ 0,5 – 1 kg. Các mẫu thực vật thu được mô tả sơ bộ và ghi chép đầy tình trạng cây (tên cây, mầu sắc, hoa quả). Tại địa điểm lấy mẫu, tiến hành thu hái sơ bộ các bộ phận khác nhau của cây để chung vào 1 túi lưới kèm theo 1 eteket đánh mã số loài. Mẫu thực vật được đánh mã số trên eteket và chụp ảnh mẫu cùng với mã số tương ứng làm tài liệu lưu trữ. Ảnh chụp cần thể hiện được các đặc điểm nhận dạng của loài thực vật: dạng thân cành, cách mọc lá, đặc điểm hoa hoa và quả,... Mẫu thực vật cần tách riêng 1 mẫu tiêu bản dùng để xác định chính xác danh tính của loài thực vật. Mẫu tiêu bản bao gồm 1 lượng nhỏ tất cả các bộ phận loài thực vật đã thu hái. Các mẫu tiêu bản được gắn theo 1 eteket đánh mã số tương ứng của loài thực vật thu hái rồi cho chung trong 1 túi lưới. Xử lý mẫu thực vật, xác định tên khoa học của loài sau khi thu hái: Sau khi thu hái, mẫu thực vật được xử lý từng bộ phận, được tách riêng hay gộp chung thành 1 mẫu tùy thuộc vào khối lượng mẫu được nhiều hay ít, cành và thân được chặt nhỏ (kích thước 5 – 10 mm). Mẫu tiêu bản sau khi được đưa về cơ quan tại nơi thu mẫu cần được ép mẫu bằng khung ép mẫu và giấy báo: các mẫu tiêu bản được ngăn cách nhau bởi các lớp báo. Các lớp báo này có tác dụng ngăn cách và hút hơi nước từ mẫu tiêu bản tránh thối hỏng mẫu. Chuyên gia thực vật dựa vào mẫu tiêu bản và đặc điểm cây được ghi chép ngoài thực địa để xác định tên khoa học của các mẫu thực vật. Mẫu thực vật được băm nhỏ và làm khô sơ bộ tại cơ quan nơi lấy mẫu tránh làm thối hỏng các mẫu thực vật chứa lượng nước nhiều sau đó mang về phòng sấy, mỗi mẫu
  • 47. 35 được cho vào 1 rổ nhựa có ký hiệu mẫu đã phân loại và xếp gọn gàng, sấy khô rồi chuyển vào kho chứa mẫu thực vật. 2.1.3. Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật Các mẫu thực vật đều được xử lý chung như sau: Mẫu được ngâm chiết 3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50 o C thu được cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, diclometan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan, diclometan, etyl axetat và metanol tương ứng. 2.1.4. Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật Các mẫu nấm nội sinh thực vật đều được xử lý chung như sau: Các nấm nội sinh phân lập trong các mẫu thực vật đã định danh sau đó mang đi nuôi cấy với lượng lớn. Sau khi nuôi cấy nấm trong 35 ngày, các sợi nấm đã phát triển kín môi trường gạo sẽ tiến hành diệt nấm bằng tia UV trong box cấy. Nấm được ngâm chiết trong dung môi hữu cơ. Sau khoảng 12h tiến hành chắt lọc dung môi ngâm chiết bằng giấy lọc thu dịch chiết nấm. Quá trình ngâm chiết được làm 3 lần và cô quay thu được cặn chiết. Cặn chiết được chiết phân lớp với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, diclometan, etyl axetat, methanol và nước. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan, etyl axetat và metanol tương ứng 2.1.5. Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự vùng ITS Tách chiết ADN tổng số: phương pháp sử dụng CTAB của J. Doyle và L. Doyle (1987) Phản ứng PCR được thực hiện với dung tích 20 μl: Đệm chứa 2 mM MgCl2, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (Thermo Scientific), 0,2 μM mồi và khoảng 30 ng khuôn mẫu ADN và nước cất dùng cho PCR.
  • 48. 36 Chương trình chạy PCR: Các phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 940 C (5 phút), 35 chu kỳ [940 C (1 phút), 590 C (45s), 720 C (50s)] và kết thúc ở 720 C (5 phút). Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản phẩm PCR được bổ sung 4 μl thuốc nhuộm rồi tiến hành điện di. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen: - Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2 ml. Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3:1. - Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn. - Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút. - Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa. - Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút. - Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1,5 ml sạch. - Để hòa tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH = 7-8,5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút, thu lượng ADN tinh sạch. Phương pháp giải trình tự: Sản phẩm PCR vùng ITS sau khi tinh sạch được đọc trình tự tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Kết quả giải trình tự được so sánh với các trình tự tương đồng trên NCBI. Sau đó các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng chương trình MEGA v6.0 và CLC v8.02 để tạo cây phát sinh loài. Kết quả phân tích các sản phẩm khuếch đại: Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi ITS1/ITS4 và được điện di trên gel agarose 1,5% cho băng đơn hình với kích thước khoảng 750 bp. Sau khi khuếch đại sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành thôi gel bằng việc sử dụng cột QIAquick Spin Columns (USA) nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu.
  • 49. 37 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của mẫu nghiên cứu được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là YMC RP 18 (Merck) và sắc ký ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck). 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (0,25 mm; Merck) và RP-18 F254S (0,25 mm; Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm Các hợp chất được phát hiện trên đèn tử ngoại ở các bước sóng 254nm và 366 nm hoặc được phun thuốc thử anisaldehyde rồi nung nóng ở 110 o C. Công thức: Anisaldehyde/H2SO4 (DAB 10) Anisaldehyde: 5 ml Glacial Acetic Acid: 100 ml Methanol: 85 ml Các thành phần được trộn lẫn rồi sau đó mới thêm 5 ml acid sunfuric đặc, để nguội từ từ sau đó bảo quản vào chai thuỷ tinh có mầu giữ trong tủ lạnh để sử dụng. 2.2.2. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 mesh) của Merck, dung môi rửa giải chủ yếu là loại phân tích, công nghiệp. Sắc ký cột ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20. Sắc ký cột pha đảo sử dụng loại YMC RP-18 có cỡ hạt là 30-50 μm (Fujisilica Chemical Ltd.).
  • 50. 38 Sắc ký lỏng hiệu năng cao-điều chế (HPLC-Preparative): Các cột điều chế (125 x 4 mm, i.d.) đã được nhồi sẵn với eurospher C-18 (Knauer, Berlin, Germany) hoặc Dynmax (250 x 21.4 mm, L.ID). Lượng mẫu được đưa lên cột tuỳ thuộc vào kích thước của cột. Đối với loại cột nhỏ, 3 mg mẫu được hoà tan trong 1ml dung môi hoặc hệ dung môi bắt đầu chạy theo chương trình định trước rồi bơm lên cột. Với loại cột to, lượng mẫu đưa lên cột có thể tích 20 mg. Các hệ dung môi thường được sử dụng là hỗn hợp dung môi methanol hoặc acetonitrile và nước siêu lọc (nanopure) có dùng đệm hoặc không dùng đệm với 0,1 % TFA, và tỉ lệ dòng là 5 ml/phút. Các hợp chất được phát hiện trên UV-VIS diode array detector. Sắc ký lỏng hiệu năng cao - phân tích (HPLC): Đối với kỹ thuật HPLC phân tích, hiệu năng phân tách đạt được dựa trên việc xử dụng bơm áp suất cao để đẩy dung môi pha động qua cột sắc ký. Kỹ thuật phân tích HPLC được sử dụng để nhận dạng các peak từ các dịch chiết hay các phân đoạn. Các thành phần khác nhau trong hỗn hợp được đưa qua cột với các tốc độ dòng tùy theo sự phân bố giữa dung môi pha động và pha tĩnh. Hệ dung môi được dùng dưới dạng gradient là MeOH: Nước (nanopure) có sử dụng đệm pH=2 bằng acid phosphoric với sự tăng dần của MeOH đến 100 % trong thời gian 45 phút. Các hợp chất được phát hiện bằng UV-VIS diode array detector. 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được sử dụng các thiết bị hiện đại. Các thiết bị và phương pháp sử dụng gồm: Điểm nóng chảy (mp): Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ khối lượng (MS): Phổ khối (phun mù điện tử) ESI-MS được đo trên máy Agilent 1200 TRAP. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo
  • 51. 39 trên máy FT-ICR-Mass spectrophotometer tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): Phổ NMR đo trên máy Bruckker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS), tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY. Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d6, CD3OD và CDCl3. Lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo. 2.3. Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm[24] 2.3.1. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm[24]  Chuẩn bị thí nghiệm: Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm: dịch chiết các mẫu cần thử, lá thầu dầu sâu khoang (Spodoptetra litura), đĩa petri, các dụng cụ khác: đũa gỗ, pipetman, bông… Cân 10 mg dịch chiết cho vào lọ penecillin, sau đó cho vào mỗi ống 10 ml cồn hoặc aceton. Chạy siêu âm trong 10 phút để dịch chiết tan hoàn toàn trong dung môi. Kiểm tra bằng mắt thường độ tan của các chất trước khi đưa vào thí nghiệm. Đối với chất sạch, cân 5 mg hòa tan trong 5 ml cồn hoặc axeton. Lá thầu dầu được thu hái về đem rửa sạch, lau khô, bỏ cuống gân. Cắt thành hình tròn đường kính 6 cm. Mỗi đĩa petri cần 2 lá.
  • 52. 40 Sâu khoang: thí nghiệm được thử bằng sâu khoang ở độ tuổi 1,5-2 tuổi, chọn mỗi đĩa 10 con sâu đồng đều lứa tuổi để đưa vào thí nghiệm.  Tiến hành thí nghiệm: Dùng pipetman hút lượng chất được định lượng rồi tia đều lên lá thầu dầu, tán đều lên 2 mặt lá. Hong khô tự nhiên cho cồn (hoặc axeton) bay hơi hết rồi đặt vào đĩa petri có lót giấy thấm, sau đó dùng đũa gỗ gắp thả 10 con sâu vào mỗi đĩa thí nghiệm. Cho 0,5 ml nước cất thấm vào bông và giấy thấm để tạo độ ẩm. Sau 24h kiểm tra số sâu sống. Sau 48h kiểm tra số sâu và thay lá mới không phun thuốc. Sau 72h cân xác định khối lượng sâu sống sót. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu theo công thức Abbott: Tỷ lệ sâu sống được tính theo công thức: Tỷ lệ sâu chết tính theo công thức: Tỷ lệ sâu tăng trưởng tính theo công thức: Hoạt lực trừ sâu tính theo công thức: Trong đó: Ef (%): hiệu lực Ca: Số sâu sống của mẫu đối chứng Ta: Số sâu sống của mẫu thí nghiệm