1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28665
(51) A61K 39/02 (2006.01)
A61K 39/102 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1212.1
(22) 16.09.2013
(45) 15.07.2014, бюл. №7
(72) Сейсенбаева Мадина Сагадатовна; Кошеметов
Жумагали Каукарбаевич; Матвеева Валентина
Михайловна; Нурабаев Сергазы Шуратбаевич;
Богданова Марина Ивановна; Сансызбай Абылай
Рысбайулы; Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич;
Сугирбаева Гульнур Джолдасбековна
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Научно-
исследовательский институт проблем
биологической безопасности" Комитета науки
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56)
http://www.arriah.ru/sites/default/files/diagnosticums/pa
steurella_multocida_in_the_blood_serum_of_pigs_elisa
.pdf, 16.06.2008
(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА
ВОЗБУДИТЕЛЯ PASTEURELLA MULTOCIDA
МЕТОДОМ ИФА
(57) Предлагаемое изобретение относится к области
ветеринарной микробиологии ибиотехнологии, а
именно к методам диагностики и идентификации
бактериальных инфекций и представляет собой
способ лабораторной диагностики антигена
возбудителя Pasteurella multocida в различных
клинических образцах с помощью
иммуноферментного анализа.
Предложен способ ИФА для обнаружения
антигена возбудителя Pasteurella multocida, где в
качестве первого слоя сэндвича и в качестве
улавливающих антител используются
поликлональные антитела к штамму
Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ возбудителя
Pasteurella multocida.
Изобретение предназначено для лабораторной
диагностики возбудителя Pasteurella multocida.
Проводят сорбцию иммуноглобулина к штамму
Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ возбудителя
Pasteurella multocida на твердую фазу, отмывание
избытка белка раствором, содержащим твин-80.
Затем проводят взаимодействие иммуноглобулина с
испытуемыми антигенами, а затем с
иммунопероксидазным конъюгатом, добавляют
субстрат и после инкубации регистрируют
интенсивность окрашивания смеси.
Разработанный способ постановки ИФА,
основанный на использовании поликлональных
антител к штамму Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ
возбудителя Pasteurella multocida, пригоден для
выявления антигена возбудителя Pasteurella
multocida в любых клинических образцах.
Полученные данные положительно коррелировали с
результатами ПЦР набора Bactotype, Германия.
(19)KZ(13)A4(11)28665

2. 28665
2
Предлагаемое изобретение относится к области
ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а
именно к методам диагностики и идентификации
бактериальных инфекций и представляет собой способ
выявления антигена возбудителя Pasteurella multocida в
различных клинических образцах с помощью
иммуноферментного анализа (ИФА).
Известен ряд способов диагностики возбудителя
пастереллеза, например, микробиологический метод,
реакция непрямой гемагглютинации и др. За последнее
время наука достигла значительных результатов в
области диагностики и эпизоотологического
мониторинга инфекционных болезней животных. К
одним из самых эффективных диагностических
методов относится твердофазный иммуноферментный
анализ (ELISA), который к настоящему времени
является одним из наиболее высокоспецифичных,
чувствительных и достоверных методов
количественной и качественной лабораторной
диагностики болезней сельскохозяйственных и диких
животных, птиц. С его помощью можно проводить
массовое обследование поголовья, оценку иммунного
статуса после профилактических мероприятий,
выявить очаг инфекции и предотвратить ее
распространение, подтвердить или исключить факт
заболевания сложной этиологии, своевременно
принять решение о необходимости вакцинации и
терапии, осуществлять контроль затрат на проведение
комплекса противоэпизоотических мероприятий.
Преимуществами ИФА являются высокая
чувствительность, позволяющая выявлять
концентрации белка в диапазоне нг/мл и
специфичность; воспроизводимость полученных
результатов; стабильность при хранении всех
необходимых реагентов; простота проведения
реакции; возможность инструментального учета
реакции и автоматизации всех ее этапов. Все они
обусловили широкое применение данного метода, как
в органах государственной ветеринарной службы.
Известен набор для определения антител к
Pasteurella multocida в сыворотке крови кур
методом иммуноферментного анализа производства
«ZETECT - ПроФлок-Рм-Ат»
(http://www.zetect.Info/picture/upload/file/ZETECT -prof-
ibk-a.pdf). 16.06.2008.
В состав набора входят иммуноспецифические и
химические компоненты.
Иммуноспецифические компоненты:
полистироловые 96-луночные планшеты, с
адсорбированным в лунках очищенным
инактивированным антигеном Pasteurella multocida;
положительная сыворотка крови кур к Pasteurella
multocida (положительный контроль); нормальная
сыворотка крови кур (отрицательный контроль), не
содержащая антител к Pasteurella multocida;
антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против
IgG кур-химические компоненты: буферный раствор
для разведения контрольных и испытуемых сывороток
и антивидового иммунопероксидазного конъюгата;
буферный раствор (концентрированный) для
межэтапной промывки планшетов; субстрат - раствор
АБТС (2,2'-азино-ди [3-этил]
бензтиазолинсульфоновая кислота), содержащий
перекись водорода; "стоп-раствор" - 5% раствор
(концентрат) додецилсульфата натрия.
Набор рассчитан на исследование 92, 184, 460 или
920 проб сыворотки крови кур в зависимости от
комплектации.
Компоновка набора допускает возможность
дробного использования компонентов для проведения
исследований по мере поступления биологического
материала при соблюдении условий их подготовки и
хранения.
Сущность непрямого варианта ИФА заключается в
выявлении комплекса, образованного антигеном,
сорбированным в лунках полистиролового планшета и
специфическими антителами, содержащимися в
пробах сывороток крови кур. Специфический
комплекс выявляется антивидовыми Ig G,
ковалентносвязанными с ферментом - пероксидазой
хрена, который при взаимодействии с субстратом
(Н2О2) в составе бесцветной хромогенной смеси
(АБТС) вызывает ее окрашивание. Интенсивность
окрашивания пропорциональна концентрации
специфических антител в исследуемой пробе.
Известна тест-система для выявления антител к
Pasturella multocida фирмы IDEXX
(http://cvo.su/diaRnosticheskie-nabory-idexx).
Фирма IDEXX является мировым лидером в
производстве диагностических наборов для ИФА в
ветеринарии. При использовании тест-систем их
производства специалисты имеют возможность
получать, надежные и высокоточные результаты
исследований при минимальной необходимости
повторного тестирования.
Производимые IDЕХХ диагностические тест-
системы предназначены для:
- серологической диагностики заболеваний птиц;
- определения статуса стада (свободы от
инфекции), мониторинга родительских стад;
- определения уровня поствакцинального
иммунитета и эффективности проведенной
вакцинации птиц;
- выявления повышенных титров антител после
воздействия полевых вирулентных штаммов
возбудителей;
- определения уровня пассивного (материнского)
иммунитета у цыплят, в том числе для выбора
оптимального срока проведения вакцинации птиц
против инфекционный болезней;
- для контроля родительских стад,
- мониторинга инфекционных болезней птиц;
- контроля здоровья птиц при перевозке и
поступлении на убой; Отличительные характеристики
ИФА технологии IDEXX:
- тест-системы IDEXX на основе ИФА являются
одними из самых чувствительных и достоверных. Они
сертифицированы по международному стандарту ISO
9001: 2008 и являются признанным эталоном для ИФА
во всем мире;
наряду с отличной чувствительностью тест-
системы IDEXX обладают высочайшей
специфичностью, исключающей перекрестные
иммунные реакции;
отличительной особенностью диагностикумов
IDEXX является воспроизводимость технологии

3. 28665
3
ИФА, позволяющая получать стабильно
сопоставленные результаты при использовании
тест-наборов разных серий на протяжении всего
срока их годности;
- реагенты наборов IDEXX готовы для
использования и нуждаются только в доведении до
комнатной температуры перед исследованием, что
обеспечивает их точность, удобство в работе и
сокращение времени на подготовку к тесту;
- использование компьютерной программы
IDEXX облегчает анализ полученных данных и
графический вывод результатов, а также их
интерпретацию.
Имеется набор РосАгроБиоПром для выявления
антител к бактериям pasteurella multocida в сыворотках
крови свиней иммуноферментным методом
(http://vvrww.arriah.ru/sites/default/flles/diagnosticums/pa
steurella_multocida in the bloodseru m of pigs_elisa.pdf).
В состав набора входят следующие компоненты:
- сыворотка крови свиней, положительная к P.
multocida; нормальная сыворотка крови свиней, не
содержащая антител к бактериям P. multocida;
антиген P. multocida адсорбированный в лунках
планшета для ИФА; антивидовой
иммунопероксидазный конъюгат против IgG
свиней; набор солей для приготовления буферного
раствора; набор солей для приготовления
субстратного буфера; детергент твин-20; - субстрат -
ортофенилендиамин; - перекись водорода,
гидроперит.
Сущность изобретения. Изобретение
предназначено для лабораторной диагностики
антигена возбудителя Pasteurella multocida.
Проводят сорбцию иммуноглобулина к антигенам
штамма Pasteurella/Saigas/2011/ZKО/KZвозбудителя
Pasteurella multocida на твердую фазу, отмывание
избытка белка раствором, содержащим твин-80.
Затем проводят инкубирование иммуноглобулина с
испытуемыми антигенами, а затем с коньюгатом
пероксидазы хрена, добавляют субстрат и после
инкубации регистрируют интенсивность
окрашивания смеси.
Задача изобретения. Разработка эффективного
варианта ИФА на основе
иммуноглобулина к антигенам штамма
Pasteurella/Saigas/2011/ZKО/KZвозбудителя
Pasteurella multocida с целью обнаружения
типоспецифического антигена данной бактерии в
любых клинических образцах.
Техническим результатом изобретения является
разработка чувствительного и специфичного
способа постановки ИФА, основанного на
использовании поликлональных антител против
штамма Pasteurella/Saigas/2011/ZKО/KZвозбудителя
Pasteurella multocida, пригодного для выявления
антигена данного заболевания в любых клинических
образцах.
Способ выполняется следующим образом. В
лунки полистироловых плоскодонных плашек
вносят специфический иммуноглобулин к
антигенам штамма Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ
возбудителя Pasteurella multocida в концентрации
30 мкг/см3
в 0,01 М КББ, с рН 9,6. Планшет
выдерживают в течении 3 ч при (37±0,5)°С или 18 ч
при (4±2)°С.
Затем планшет трижды промывают раствором
для ИФА и вносят в качестве наполнителя 1%
раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в
каждую лунку и инкубируют при (37±0,5)°С в
термостате в течение 1 ч. Затем содержимое лунок
удаляют, плашку однократно промывают раствором
для ИФА (ФБСТ).
Готовят разведения контрольных и испытуемых
проб антигенов (как указано на схеме) в растворе
для ИФА и разливают по 0,13
см в один ряд лунок
плашки (по горизонтали).
Схема постановки ИФА по выявлению антигена возбудителя Pasteurella multocida
Антиген Разведение антигена
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Нормальный А
РаствордляИФА,
контроль
± - - - - - - - - - -
Специфический В + + + + + + + + + + +
Испытуемый 1 С + + + + + + + + + - -
Испытуемый 2 D ± - - - - - - - - - -
Испытуемый 3 Е + + + + + + + + - - -
Испытуемый 4 F ± - - - - - - - - - -
Испытуемый 5 G + + + + + + + - - - -
Испытуемый 6 Н + + + + + + + - - - -
Примечания: 1. «±», «-» - отрицательный результат (слабо-голубое окрашивание или окрашивания нет).
2. «+» - положительный результат (синее окрашивание).
Пластину с нанесенными на нее пробами
инкубируют в течении 3 ч при (37±0,5)°С или 16 ч
при (4±2)°С. Затем пятикратно промывают
раствором ФБСТ. После промывки и просушивания
планшета в каждую лунку вносят по 0,1 см3
рабочего разведения пероксидазного конъюгата в
растворе ФБСТ. Плашку с конъюгатом инкубируют
в термостате при (37±1)°С в течении 1 ч, пятикратно
промывают вышеупомянутым раствором для ТФ-
ИФА и вносят по 0,13
см рабочего раствора
субстрата для пероксидазы (АБТС). Результаты
реакции учитывают через 30-60 мин. Учет
результатов ИФА проводят визуально или на
фотометре марки "Мультискан". При визуальном

4. 28665
4
учете реакции титром антигена считают его
предельное разведение, в котором он связывается со
специфическим иммуноглобулином,
иммобилизированным на твердой фазе (в лунках
пластин) и вызывает окисление субстрата
(развивается синее окрашивание). При этом
интенсивность окрашивания должна уменьшаться с
разведением антигена. В лунках, обработанных
отрицательным антигеном (контроль
специфичности), допускается слабо-голубое
окрашивание, исчезающее до разведения
диагностикума 1:10. При учете результатов реакции
на фотометре марки "Мультискан" при длине волны
405 нм, для АБТС, результаты считают
положительными, если оптическая плотность
специфического антигена в 2 и более, раз
превышает оптическую плотность контрольного
(нормального) антигена.
Разработанный способ постановки ИФА,
основанный на использовании
поликлональных антител против штамма
Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ возбудителя
Pasteurella multocida, пригоден для выявления
антигена данного заболевания в любых клинических
образцах. Полученные данные положительно
коррелировали с результатами ПЦР набора
Bactotype, Германия.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ выявления антигена возбудителя
Pasteurella multocida методом иммуноферментного
анализа, включающий выявление антигена бактерий
Pasteurella multocida в клинических образцах в
течении 5 или 24 часа после поступления
биоматериала, отличающийся тем, что используют
при разработке ИФА поликлонального
иммуноглобулина, к нововыделенному от сайгаков,
штамму Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ возбудителя
Pasteurella multocida, в концентрации 30 мкг/см и
иммунопероксидазного конъюгата приготовленного
на основе того же иммуноглобулина по методу
Wilson и Nakane.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч