1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) B (11) 28630
(51) C12Q 1/68 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
(21) 2013/0744.1
(22) 03.06.2013
(45) 16.06.2014, бюл. №6
(72) Искакова Айша Нурбековна; Романова Алия
Аделовна; Мухамедьяров Дамир Адильевич;
Ахметоллаев Ильяс Амирханович; Куламетов
Жалгас Аскарович; Жолдыбаева Елена Витальевна;
Момыналиев Куват Темиргалиевич
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Национальный
центр биотехнологии" Комитета науки
Министерства образования и науки Республики
Казахстан; Товарищество с ограниченной
ответственностью "General genetics"
(56) Белозерцева Л.А. и др. Исследование влияния
полиморфных вариантов генов VKORC1, CYP2C9,
CYP4F2, GGCX, PROC, F VII на дозу варфарина
среди жителей западно-сибирского региона России
// I Всероссийская научная студенческая
конференция с международным участием «Медико-
биологические науки:достижения и перспективы»,
Томск, 10-11 ноября 2011г: сборник материалов
[под ред. проф., д-ра мед. наук С.И. Карася]. Томск:
Сибирский гос. мед. университет, 2011. с.11-14
Искакова А.Н. и др. Частоты встречаемости
полиморфизмов единичного нуклеотида генов
CYP2C9, VKORC1, CYP4F2, GGCX в казахской
популяции// Молекулярно-генетические методы
исследования в медицине и биологии: мат-лы м/н
научно-практической конференции 23-24 февраля
2012г. Караганда. 2012. с.83-86
Голухова Е.З. и др Фармакогенетические
основы, определяющие нежелательные
лекарственные реакции у кардиохирургических
больных, принимающих варфарин // Креативная
кардиология. 2011. №1. с.20-24
Jonatan Lindh. Major determinants of outcome and
dosing in warfarin treatment. Stockholm. 2009. с.5-14
(54) ЭКСПРЕСС-МЕТОД ПОДБОРА ДОЗ
ВАРФАРИНА НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ
ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
(57) Изобретение относится к области
биотехнологии и медицины, а именно к
фармакогеномике, и может быть использовано для
подбора индивидуальных дозировок лекарственных
средств на основе генетических данных пациента с
целью предотвращения риска развития побочных
реакций при приеме лекарственных средств,
повышения эффективности лечения
лекарственными препаратами, снижения
экономических расходов, связанных с
неоправданным использованием универсальных доз
лекарственных препаратов.
Предложен способ подбора дозировки
Варфарина, оптимизированный для большого и
постоянного потока образцов ДНК, удобный для
лечебных учреждений. Способ основан на
генотипировании полиморфизмов единичного
нуклеотида методом полимеразной цепной реакции
в режиме реального времени. Данная схема
позволит проводить, быстро и достаточно точно
генотипирование по 5 наиболее оптимальным и
клинически значимым полиморфизмам единичного
нуклеотида (CYP2C9*2 (С430Т), CYP2C9*3
(А1075С), VKORC1 (1639С>Т), GGCX (G1958C),
CYP4F2 (G1297А)) с учетом особенностей
распространенности аллелей для казахстанской
популяции.
(19)KZ(13)B(11)28630

2. 28630
2
Область техники, к которой относится
изобретение. Изобретение относится к области
биотехнологии и медицины, а именно к
фармакогеномике, и может быть использовано для
решения актуальных задач современной медицины,
в частности, для подбора индивидуальных
дозировок лекарственных средств на основе
генетических данных пациента, тем самым,
уменьшая риск развития побочных реакций при
приеме лекарственных средств, повышая
эффективность лечения лекарственными
препаратами. А это, в свою очередь, приводит к
снижению экономических расходов, связанных с
неоправданным использованием универсальных доз
лекарственных препаратов.
Как известно, эффективность и переносимость
одних и тех же лекарственных средств у различных
больных неодинакова. Это связано с тем, что
ферменты, отвечающие за биотрансформацию
лекарственных препаратов, могут снижать или
повышать свою активность за счет мутаций в генах,
отвечающих за синтез этих ферментов. В
зависимости от характера мутации гена изменяется
скорость синтеза фермента или синтезируется
атипичный фермент. Генетические особенности
пациентов обусловливают около 50%, а по
некоторым данным и до 90%, всех
«неблагоприятных» ответов на лекарственные
средства (неэффективность и/или нежелательные
лекарственные реакции).
Уровень техники. На сегодняшний день
существует множество методов для определения
генотипа человека. Наиболее распространенными
являются: метод полимеразной цепной реакции в
режиме реального времени (RT - PCR), анализ
полиморфизма длины рестрикционных фрагментов
(RFLP), ДНК-микроэррей (DNA - microarray) и
метод прямого секвенирования (sequencing).
Метод полимеразной цепной реакции в режиме
реального времени является наиболее быстрым,
удобным и достаточно точным для применения в
лечебных учреждениях, в которых необходим
быстрый, недорогой, удобный для анализа большого
количества образцов, метод.
Аналоги изобретения. Основанная на методе
полимеразной цепной реакции в режиме реального
времени тест-система Idaho Technologies
LightScanner®
(Idaho Technologies, USA) разработана
для генотипирования полиморфизмов единичного
нуклеотида только 2 генов по 3 позициям (VKORC1
1639, CYP2C9*2, CYP2C9*3)
[http://www.idahotech.com/LightScannеr/Warfarin.html].
В предлагаемом нами способе проводится
генотипирование 4 генов по 5 позициям (CYP2C9*2
(С430Т), CYP2C9*3 (А1075С), VKORC1 (1639С>Т),
GGCX (G1958C), CYP4F2 (G1297A)), т.e.
совпадение с вышеуказанным аналогом только по 2
генам 3 позициям (VKORC1 (1639С>Т), CYP2C9*2
(С430Т), CYP2C9*3 (А1075С)). Данный аналог
является наиболее близким заявляемому нами
способу генотипирования.
Одобренная Управлением по санитарному
надзору за качеством пищевых продуктов и
медикаментов (FDA, USA) тест-система Verigene®
Warfarin Metabolism Nucleic Acid Test (Nanosphere,
Inc., Northbrook, IL) на основе метода гибридизации
является достаточно быстрым, однако требует
специфичного оборудования (Verigene Reader and
Processor vl) [http://www.nanosphere.us/product/warfarin-
metabolism]. Тест разработан для генотипирования
полиморфизмов единичного нуклеотида 2 генов по 3
позициям (VKORC1 1173С>Т, CYP2C9*2,
CYP2C9*3). В предлагаемом нами способе
проводится генотипирование 4 генов по 5 позициям
(CYP2C9*2 (С430Т), CYP2C9*3 (А1075С), VKORC1
(1639С>Т), GGCX (G1958C), CYP4F2 (G1297A)),
т.e. совпадение с вышеуказанным аналогом только
по 1 гену 2 позициям (CYP2C9*2 (С430Т),
CYP2C9*3 (А1075С)). Генотипирование, в
предлагаемом нами способе, проводится методом
полимеразной цепной реакции в режиме реального
времени.
С помощью ДНК-микроэррея INFINITI®
CYP450
2C9-VKORC1 (AutoGenomics, Inc., Vista СА)
возможно генотипировать 13 позиций
полиморфизмов единичного нуклеотида, однако
только по 2 генам (CYP2C9*2, CYP2C9*3,
CYP2C9*4, CYP2C9*5, CYP2C9*6, CYP2C9*11,
VKORC1 -1639G>A, 2255С>Т, 698С>Т, 358С>Т,
1173С>Т, 3730G>A, 1542G>C)
[http://www.autogenomics.com/ pharma_2C9.php]. В
предлагаемом нами способе проводится
генотипирование 4 генов по 5 позициям (CYP2C9*2
(С430T), CYP2C9*3 (А1075С), VKORC1 (1639С>Т),
GGCX (G1958C), CYP4F2 (G1297A)), т.e.
совпадение с вышеуказанным аналогом только по 2
генам 3 позициям (VKORC1 1639С>Т, CYP2C9*2
(С430T), CYP2C9*3 (А1075С)). Генотипирование по
аллельным полиморфизмам CYP2C9*5, CYP2C9*6,
CYP2C9*11 не имеет смысла, т.к., согласно данным
нашего исследования и литературным данным, не
встречаются в казахстанской популяции.
Клинически значимыми SNP по гену VKORC1 на
сегодняшний день считаются 1639G>A, 1173С>Т,
3730G>A, однако типирование одновременно всех
трех вариантов VKORC1 1639G>A, 1173С>Т,
3730G>A не имеет смыла, т.к. данные мутации
сцеплены. Генотипирование, в предлагаемом нами
способе, проводится методом полимеразной цепной
реакции в режиме реального времени.
ДНК-микроэррей eSensor®
XT-8 warfarin
sensitivity test (GenMark Dx, Inc., UK). Тест
разработан для генотипирования полиморфизмов
единичного нуклеотида только 2 генов по 3
позициям (VKORC1 1639С>Т, CYP2C9*2,
CYP2C9*3)
[http://www.genmarkdx.com/products/reagents/
warfarin.php]. В предлагаемом нами способе
проводится генотипирование 4 генов по 5 позициям
(CYP2C9*2 (С430Т), CYP2C9*3 (A1075C), VKORC1
(1639C>T), GGCX (G1958C), CYP4F2 (G1297A)),
т.e. совпадение с вышеуказанным аналогом только
по 2 генам 3 позициям (VKORC1 1639С>Т,
CYP2C9*2 (С430Т), CYP2C9*3 (А1075С)).
Генотипирование, в предлагаемом нами способе,

3. 28630
3
проводится методом полимеразной цепной реакции
в режиме реального времени.
Сущностью изобретения является разработка
протокола генотипирования 4 генов по 5 позициям
(CYP2C9*2 (С430Т), CYP2C9*3 (А1075С), VKORC1
(1639С>Т), GGCX (G1958C), CYP4F2 (G1297А))
методом полимеразной цепной реакции в режиме
реального времени, необходимых для подбора
индивидуальных доз непрямых антикоагулянтов
кумаринового ряда.
Задачей изобретения является оптимизация
способа подбора доз варфарина на основе
генотипирования полиморфизмов единичного
нуклеотида CYP2C9*2 (С430Т), CYP2C9*3
(А1075С), VKORC1 (1639С>Т), GGCX (G1958C),
CYP4F2 (G1297A) методом полимеразной цепной
реакции в режиме реального времени.
Технический результат. Предложена
оптимальная, для лечебных учреждений, схема
генотипирования полиморфизмов единичного
нуклеотида на основе метода полимеразной цепной
реакции в режиме реального времени. Данная схема
позволит проводить генотипирование по 5 наиболее
оптимальным и клинически значимым
полиморфизмам единичного нуклеотида (CYP2C9*2
(С430Т), CYP2C9*3 (А1075С), VKORC1 (1639С>Т),
GGCX (G1958C), CYP4F2 (G1297A)). Такой подход
позволит быстро и достаточно точно подбирать как
«стартовые» дозы варфарина, так и
«поддерживающие» дозы, тем самым снизив риск
возникновения нежелательных лекарственных
реакций.
Сведения, подтверждающие возможность
осуществления изобретения. Для определения
индивидуальной дозировки Варфарина на основе
геотипирования методом ПЦР в режиме реального
времени необходимо провести ряд манипуляций.
Сущность изобретения поясняется следующим
конкретным примером:
Пример 1:
1) Выделение ДНК из венозной крови пациента,
либо из букальных клеток пациента.
2) Амплификация фрагментов генов,
содержащие области анализируемых
полиморфизмов, с помощью полимеразной цепной
реакции в режиме реального времени с
использованием олигонуклеотидных пар праймеров
и двух зондов, несущих «гаситель» на 3’-конце
(BHQ1, BHQ2) и разные флюоресцентные красители
(FAM, R6G, R110, ROX) на 5’-конце.
Таблица 1
Последовательность праймеров и зондов
Аллель Последовательность праймеров Последовательность зондов
CYP4F2 tgcctcatcagtgttttcgg r6g-caacccagctgtgtggcc-bhq 1
ttgagggaggtgatgttggatac R110-caacccagctatgtggccg-bhql
GGCX tcctgtatgacagtctctag R110-agttaccaagcttgccaa-bhql
ccatgagcgattcttcc rox-agttaccaaggttgccaa-bhq2
CYP2C9*2 tttctcaactcctccacaag rox-cttgaacactgtcctcaatgc-bhq2
ctccctcctagtttcgtttc fam-tgaacacggtcctcaatgc-bhq 1
CYP2C9*3 cctacacagatgctgtggt fam-tccagagatacattgaccttctc-bhq 1
acatggagttgcagtgtagg rox-ccagagataccttgaccttctc-bhq2
VKORC1 gctaggattataggcgtgag fam-cgcacccggccaat-bhq 1
aagggtaggtgcaacagtaag rox-ccgcacctggccaat-bhq2
Приготовление реакционной смеси: 16 мкл
MasterMix (состав: 87,5 мМ Трис-НС1, pH 8.6,
20,75мМ (NH4)2SO4, 3,125 мМ MgCl2, 0,156 дНТФ,
1,3U TaqPol), 3 мкл PrimerMix (10µМ Forward, 10µМ
Reverse, 5 µМ Probe FAM, 5µM Probe ROX, для
GGCX - 10µM Forward, 10µM Reverse, 10µM Probe
R110, 2,5µM Probe ROX) и 1 мкл матрицы ДНК.
Условия реакции амплификации указаны в
таблице 2.
Таблица 2
Программа амплификации
Температурный режим и время Количество повторов
Длительная
денатурация
95°С - 5 минут 1 повтор
ПЦР
циклирование
95°С - 10 секунд 45 повторов
Т°С* - 40 секунд
*Т°С-58°C (CYP2C9*2/3, VKORC1), 56°C (GGCX), 62°C (CYP4F2)
Полученные данные обрабатываются и
анализируются с помощью программы «Bio-Rad
CFX Manager 2.1».
3) После определения генотипа 5 аллельных
полиморфизмов CYP2C9*2 (С430Т), CYP2C9*3
(А1075С), VKORC1 (1639С>Т), GGCX (G1958C),
CYP4F2 (G1297A) производится подсчет дозировки
Варфарина на основании определенных
генетических данных и с учетом таких параметров,
как возраст, расовая принадлежность, пол, значение
целевого МНО, площадь поверхности тела (исходя

4. 28630
4
из роста и веса), взаимодействие Варфарина с
Амиодароном и статинами.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Экспресс-метод подбора доз Варфарина на
основе генотипирования клинически значимых
генов, таких как CYP2C9 (CYP2C9*2, CYP2C9*3),
VKORC1 (1639С>Т), отличающийся тем, что
типирование проводят методом полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени по 4
генам 5 аллельных полиморфизмов CYP2C9
(CYP2C9*2, CYP2C9*3), VKORC1 (1639С>Т),
GGCX (G1958C), CYP4F2 (G1297A).
Верстка А. Сарсекеева
Корректор Р. Шалабаев