1. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
В.В. Масленников
ФГБУ «Поликлиника №1 УД
Президента РФ», Москва
Возможности
гидрогелевых биочипов
в онко- и аллергодиагностике
29 января 2013 г. Пушкинские Горы
2. Преимущества
Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
гидрогелевых
биочипов
• В качестве носителя используют гидрогель
на основе производных метакриламида.
Фотоиндуцируемая иммобилизация
молекулярных зондов в объеме гелевого
элемента биочипа
• Увеличение емкости в пересчете на единицу
поверхности в десятки и сотни раз
• Увеличение чувствительности и
воспроизводимости анализа
3. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Распределение флуоресцентного сигнала в
гелевом элементе микрочипа
Изображения гелевого элемента
микрочипа после проведения
иммуноанализа, полученные на
конфокальном микроскопе
4. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Биологический
микрочип (Биочип)
массив элементов, содержащих
биологические зонды –
БЕЛКИ УГЛЕВОДЫ
ДНК,
РНК
инструмент Низкомолекулярные
соединения
многопараметрического анализа
образца
Преимущества
Исследуемые молекулы
гелевых биочипов
- Сохранение нативной
Иммобилизованные структуры биомолекул
молекулы
- Длительный срок хранения
- Высокая эффективность
иммобилизации по сравнению с
поверхностным слоем
- Повышение чувствительности
Иммобилизация на поверхности Иммобилизация в
гелевой ячейке анализа
5. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Технология изготовления гелевых биочипов
ИМБ РАН
Метод полимеризационной иммобилизации
• Каждый гелевый элемент биочипа –
индивидуальная пробирка для проведения
реакции
• Биочип позволяет проводить
параллельно и одновременно различные
типы реакций
6. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Процедура иммуноанализа на
биочипе
Инкубация Инкубация биотинилированных антител
неразведенной (1 ч) + стрептавидин-Су5 (10 мин)
сыворотки (18 ч)
Обработка результатов анализа
с помощью программного
обеспечения
Регистрация сигнала с
помощью анализатора
биочипов
7. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
ОМ-БИОЧИП (ПСА)
регистрационное удостоверение
№ ФСР 2007/01418
Назначение – скрининг и диагностика
рака предстательной железы
- Биочипы
- Набор реагентов
- Флуоресцентный анализатор биочипов
- Специальное программное обеспечение
Программа ImaGelAssay:
Результаты анализа:
[ПСА общ], нг/мл = 7,8
[ПСА своб], нг/мл = 1,8
([ПСА своб]/[ПСА общ]),% =23,1
ПРЕИМУЩЕСТВА:
• Одновременное количественное определение двух форм ПСА и их соотношения
• При проведении анализа не требуется построения калибровочных кривых
8. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
ОМ-БИОЧИП
регистрационное удостоверение
№ ФСР 2008/03415
Назначение - одновременное
количественное определение шести
опухолевых маркеров в сыворотке крови
человека:
-Общей формы простат-специфического антигена
(ПСАобщ);
-Свободной формы простат-специфического антигена
РАЗРАБОТЧИК Институт молекулярной биологии
ИЗГОТОВИТЕЛЬ
(ПСАсвоб);
им. В.А. Энгельгардта РАН ООО “БИОЧИП-ИМБ”
119991, Россия, Москва,
ул. Вавилова , 32,
тел. 8 (499) 135-05-59, факс 8 (499) 135-14-05
119991, Россия, Москва, Ул. Вавилова , 32,
тел. 8 (499) 135-05 -59 , факс 8 (499) 135-14-05
e-mail: Info@biochip.ru
- Альфа-фетопротеина (АФП);
- Ракового эмбрионального антигена (РЭА);
ОМ-Биочип
Набор реагентов - Хорионического гонадотропина человека (ХГЧ);
для о дновременного количественного определения шести маркеров онкологических заболеваний
- Нейрон-специфической енолазы (НСЕ).
(общей и свободной форм простат-специфического антигена, альфа-фетопротеина, ракового
эмбрионального антигена, хорионического гонадотропина, нейрон-специфической енолазы)
в сыворотке крови методом иммунофлуоресцентного анализа на биологическом микрочипе
Для проведения 100 анализов
ТУ 9398-008-02699501-2007
Комплект №1 набор реагентов для Хранение:
постановки иммуноанализа
Комплект №2 биологические микрочипы Комплекты №1, 2 хранить при температуре
от плюс 2 до плюс 8 °C
Серия
Дата изготовления
Годен до Только для in vitro диагностики
ПРЕИМУЩЕСТВА:
•Одновременное количественное определение шести показателей;
• При проведении анализа не требуются разведения образца для
выявления и контроля хук-эффекта, приводящего к ложно
заниженным результатам и искажению диагностической картины.
9. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Универсальная многопараметрическая тест-система
Одновременное количественное
определение панели онкомаркеров: ОМ 9 - БИОЧИП
ПСАобщ, ПСАсвоб, АФП, РЭА, ХГЧ,
НСЕ, СА125, СА 19-9, СА 15-3
Внедрение в клиническую
практику позволит:
Увеличить
эффективность Флуоресцентное изображение
биочипа после проведения анализа
дифференциальной
диагностики широкого
АФП НСЕ
круга онкозаболеваний; ХГЧ ПСАобщ
РЭА ПСАсвоб
СА 125 гель
Уточнить имеющиеся СА15-3
представления о СА19-9
диагностической
значимости и
специфичности данных
маркеров и их
10. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Взаимоотношение онкомаркеров:
принцип пирамиды
АФП,
ПСА
СА15.3, КЭА
СА19.9, КЭА
СА125
13. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Больная Ф. 1921 г/р.
Анамнез: 1971 г.: надвлагалищная ампутация матки с
придатками по поводу рака тела матки. 2007 г.:
гемиколэктомия (рак толстой кишки T4N0M0, умеренно
дифференцированная аденокарцинома)
Контрольное обследование Биочип
• Онколог: явных признаков • СА 19.9 – 64,4 МЕ/мл
обострения не обнаружено • КЭА – 4,5 нг/мл
• ИФА: • СА 125 – 64,1 (норма до 28)
СА 19.9 – 115,2 (норма до 37) МЕ/мл
МЕ/мл
КЭА – 1,2 (норма до 5) нг/мл
ВЫВОД
Вероятно, в данном случае СА 125 – сопутствующий маркер,
высокое значение которого на фоне повышенного СА 19.9,
указывает на рецидив рака толстой кишки
14. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Больной К. 1950 г/р.
ЖКБ, осложненная механической желтухой, хр.
калькулезный холецистит, холедохолитиаз
Данные обследования
• Боли в верхних отделах
живота, потемнение мочи, Биочип
осветление кала • СА 19.9 – 117,1 МЕ/мл
• КТ: картина конкремента • Остальные маркеры - норма
холедоха, желчного пузыря
• ИФА: СА 19.9 – 212,8 (норма
до 37) МЕ/мл
КЭА – 1,3 (норма до 5) нг/мл
ВЫВОД
С высокой степенью вероятности можно заключить, что
повышение концентрации СА 19.9 связано с холестазом, но не
опухолевым процессом в ЖКТ, т.к. все онкомаркеры биочипа,
включая СА 125, в норме
15. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа3В стадии.
Рак желудка по клинической иммунологии, 2013г
Гастроэтомия, спленэктомия, 6
курсов ПХТ. В 2008 г. поставлен д-
з доброкачественной
гиперплазии предстательной
железы
Данные планового Биочип
обследования • ПСА – 6,2 (норма до 4) нг/мл
• ИФА (в т.ч. КЭА) – в норме • ПСАсв/ПСАобщ – 5 (норма
более 15)
• Остальные маркеры - норма
ВЫВОД
С высокой степенью вероятности можно констатировать наличие
злокачественного процесса в простате. Пациент направлен на
дополнительные исследования
16. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Больная М. 1938 г/р.
Пневмония в н. доле правого легкого. ЖКБ, хр.
калькулезный холецистит. Лекарственный гепатит
Данные обследования Биочип
• СА 125 – 119,5 (норма до 35) МЕ/мл • ХГЧ – 11,9 (норма до 10) МЕ/л
• Биохимия: повышение прямого и • СА 125 – 432,9 (норма до 35) МЕ/мл
непрямого билирубина, ЛДГ, АСТ, АЛТ, • СА 15.3 – 48,6 (норма до 28) МЕ/мл
ЩФ • СА 19.9 – 59,7 (норма до 37) МЕ/мл
• УЗИ: жировая инфильтрация печени, хр.
калькулезный холецистит
• Клиника: боли в н. половине грудной
клетки, рвота съеденной пищей,
субфебрилитет
• Онколог и гинеколог: патологии не
выявлено
ВЫВОД
Необходимо проведение детального обследования органов
репродуктивной системы для исключения онкопатологии
17. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Из истории аллергодиагностики
1880 1967 1988-91 1995-99 …21 век
18. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Преимущество In vitro
аллергодиагностики
• Безопасность
• Высокая специфичность
• Больший спектр выявляемых реагинов
(особенно ценно для диагностики
латентной аллергии)
• Объективизация оценки эффективности
лечения (АСИТ)
• Возможность проведения исследований
в сезон палинации
19. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Экстракты или
рекомбинантные белки?
Экстракты Рекомбинантны
• Сложности в е белки
стандартизации состава • Стабильность
• Интервальная оценка состава
результата в тест- • Создание
системах количественн
• Широкий спектр ых систем
скрининга по перекресту• Создание
• «Аналоговый» подход к скрининговых
оценке результатов смесей
• Мультиплексн
ые системы с
«цифровым»
подходом к
21. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Схема анализа на Белковый биочип для
биочипе одновременного
количественного анализа
панели аллерген-
специфических
иммуноглобулинов класса Е
Cy5-меченные антитела против IgE
Специфические IgE
Общий IgE
Антитела аnti-human IgE
Иммобилизованные аллергены
Аллергены могут быть иммобилизованы
внутри гелевого элемента биочипа без
потери иммунологической активности
23. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Индивидуальные профили специфических IgE в
образцах сывороток крови человека на биочипе
#60800
#69770
24. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Одновременный анализ специфических
иммуноглобулинов классов Е и G4
Метод позволяет проводить
параллельный анализ панели
sIgE и sIgG4 на одном биочипе с
проявкой смесью антител
anti-IgE-Cy5 и anti-IgG4-Cy3.
Cy3: λabs=550 nm, λem=570 nm
Cy5: λabs=650 nm, λem=670 nm
anti-IgG4
25. Масленников В.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г
Перспективные области применения
гидрогелевых биочипов в иммунологии
• Онкодиагностика
• Аллергодиагностика
• Диагностика
аутоиммунной
патологии
• Анализ цитокинового
Т.е. в тех областях, где требуется одномоментная оценка множества
профиля
патологических маркеров
• Исследование
протеома
