1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28793
(51) A61K 36/00 (2006.01)
A61P 3/10 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1323.1
(22) 08.10.2013
(45) 15.08.2014, бюл. №8
(72) Чаудхари Игбал Мухаммед (PK); Абилов
Жарылкасын Абдуахитович (KZ); Орманбаева
Амангуль Мамыржановна; Султанова Нургуль
Адайбаевна (KZ); Умбетова Алмагуль Кендебаевна
(KZ)
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Казахский
национальный университет им. аль-Фараби"
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) Патент РФ №2095075, 10.11.1997
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ
ИЗ РАСТЕНИЙ TAMARIX (T.LAXA),
ОБЛАДАЮЩИХ АНТИДИАБЕТИЧЕСКИМ
ДЕЙСТВИЕМ
(57) Изобретение относится к области получения
биологически активных природных соединений, в
частности к способу получения флавоноидов,
обладающих антидиабетическим действием.
Техническим результатом предлагаемого
способа является переработка растительного сырья
и получение биологически активного вещества,
обладающего антидиабетическим действием.
Технический результат обеспечивается путем
экстракции растительного сырья органическим
растворителем, упаривания и очистки на колонке
сефадекс (LH-20), затем перехроматографированием
на колонке с полиамидным сорбентом.
Антидиабетическая активность (фермент α -
глюкозидаза ) испытана на флавоноид из надземной
массы гребенщика рыхлого Tamarix laxa (TL-8). В
качестве стандартов применялись 1 -
диоксинодиримицин и acarbose.
(19)KZ(13)A4(11)28793
2. 28793
2
Изобретение относится к области получения
биологически активных природных соединений, в
частности к способу получения флавоноидов,
обладающих антидиабетическим действием.
Известен способ получения полифенольных
соединений из надземной части зверобоя
продырявленного (Hypericum perforatum L.) (Патент
РФ №2152794, МПК А61K 35/78, А61Р 39/06, опубл.
20.07.2000 г.). Экстракцию проводят очищенной
водой при соотношении сырья и экстрагента 1:6,6
при нагревании на водяной бане в течении 2 ч, после
чего отвар очищают на хромотографической
колонке с полиамидным сорбентом, а сумму
флавоноидов элюируют 70%-ным этанолом,
который отгоняют, а остаток высушивают при
температуре 100-105°С до постоянной массы.
Недостатком данного способа является
использование высокой температуры, что может
привести к гидролизу флавоноидов.
Известен способ извлечения флавоноидного
экстракта из листьев гинкго двулопастного (Ginkgo
Biloba) (Патент РФ №2163254, МПК С11В 9/02,
А61K 35/78, A23L 1/00, A23L 2/00, A23G 3/30, A23G
3/00, А23С 9/00, А23С 9/123, опубл. 20.02.2001 г.).
Листья гинкго двулопастного экстрагируют 6-12
частями (предпочтительно 8) воды, содержащей
60% ацетона, при 50-60°С, и концентрируют
раствор, уменьшая содержание ацетона до
величины, меньшей чем 3%. Этот раствор
охлаждают, а липиды удаляют декантированием.
Водный раствор экстрагируют 2-5 частями
этилацетата, содержащего 0-20% гептана.
Полученный раствор экстрагируют минимальным
количеством смеси ацетон-бутанол (0-15% ацетона)
в присутствии сульфата аммония. Органическую
фазу концентрируют; после добавления этанола
раствор вновь концентрируют. После повторного
разбавления этанолом раствор охлаждают и
отфильтровывают нерастворимый осадок.
Полученный раствор концентрируют, сушат и,
наконец, измельчают для получения флавоноидного
экстракта в виде однородного порошка.
Недостатком данного способа является
использование в качестве растворителя ацетона,
поскольку он вызывает кумуляцию в организме и
обладает токсическим действием.
Наиболее близким аналогом к предложенному
способу является способ получения полифенольных
соединений из надземной части душицы
обыкновенной (Origanum vulgare) (Патент РФ
№2095075, МПК А61K 35/78, опубл. 10.11.1997 г.).
Сущность способа заключается в экстракции
надземной части душицы обыкновенной
последовательно, дробно 70-95% этиловым
спиртом, упаривании спиртовых экстрактов,
выдерживании на холоду, отделении осадка,
очистке этилацетатом, сгущении, растворении
фенольных соединений в подогретом 95% этаноле,
концентрировании и очистке на полиамидном
сорбенте. Примерно 2 кг надземной части душицы,
измельченной до частиц размером 2 мм, заливают
6 л 70% этилового спирта и нагревают на водяной
бане при температуре 85-90°С в течении 1,5 ч.
Извлечение сливают и повторяют экстракцию 80% и
95% этиловым спиртом по 2 л, нагревая каждый раз
по 1,5 ч. Из объединенных извлечений этиловый
спирт отгоняют, оставшийся водный экстракт
выдерживают 2 сут. в холодильнике при
температуре +4°С. Выпавший в осадок хлорофилл
отфильтровывают. Хлорофилл на фильтре
промывают горячей дистиллированной водой для
растворения адсорбировавшихся на осадке
фенольных соединений. Промывные воды
присоединяют к водному экстракту. Для отделения
фенолкарбоновых кислот водный экстракт
обрабатывают этилацетатом по 0,5 л три раза.
Очищенный водный экстракт концентрируют
отгонкой под вакуумом до объема 300 мл. Для
отделения водорастворимых сахароподобных
веществ, сконцентрированный экстракт тонкой
струей вливают в подогретый до 70-75°С 95%-ный
этанол при непрерывном встряхивании колбы с
этанолом. Экстракт вливают из расчета 50 мл на 1л
95% этанола. Фенольные соединения растворяются
в подогретом этаноле, водорастворимые
сахароподобные вещества выпадают в осадок.
Этанольный раствор фенольных соединений
концентрируют под вакуумом до объема 100 мл,
смешивают с полиамидным сорбентом, высушивают
и переносят в стеклянную колонку диаметром
3,5 см, заполненную на 25-28 см полиамидом.
Колонку промывают 70% этанолом (1 л). Из элюата
после отгонки растворителя под вакуумом и
высушивания получают 16 г. порошка суммы
флавоноидов. Выход целевого продукта по
отношению к исходному сырью составляет 0,8%.
Полученная сумма флавоноидов представляет собой
порошок желто-коричневого цвета.
Недостатком данного способа является то, что он
не обеспечивает полноту экстракции суммы
флавоноидов из растительного сырья.
Задача настоящего изобретения - разработка
способа получения флавоноидов из растений рода
Tamarix (Tamarix laxa Willd.), обладающих
антидиабетическим действием.
Техническим результатом предлагаемого
способа является расширение арсенала
отечественных лекарственных средств, переработка
растительного сырья и получение биологически
активного вещества, обладающего
антидиабетическим действием.
Технический результат обеспечивается путем
экстракции растительного сырья органическим
растворителем, упаривания и очистки на колонке
сефадекс (LH-20), затем перехроматографированием
на колонке с полиамидным сорбентом; в качестве
растительного сырья используют надземную массу
гребенщика рыхлого (Tamarix laxa Willd.), а
экстракцию ведут 70%) водным раствором
этилового спирта в течение 72 часов при комнатной
температуре.
Пример 1. Извлечение биологически активных
веществ из надземной массы (стебли, листья)
гребенщика рыхлого (Tamarix laxa Willd.)
проводится 70% водным раствором этилового
спирта в течение 72 часов при комнатной
3. 28793
3
температуре с последующим фильтрованием и
сгущением экстракта в вакууме водоструйного
насоса до полного удаления спирта. Для
предварительного разделения биологически
активных веществ проводится дробная экстракция
водно-спиртового экстракта Т. laxa хлороформом и
этилацетатом.
Хлороформные и этилацетатные экстракты и
водный раствор исследуемого вида растения
проанализированы методами газожидкостной
(ГЖХ), бумажной (БХ) и тонкослойной
хроматографии (ТСХ). В водном растворе Т.laxa
методом БХ в системах: н-бутиловый спирт -
уксусная кислота - вода (40 : 12,5 : 29) (I), 6%-ная
уксусная кислота (II), бензол -уксусная кислота -
вода (60 : 70 : 30) (III), формиат Na - муравьиная
кислота - вода (10 : 1 : 20) (IV) с применением
специфических проявителей (УФ-свет, NH3,
железоаммониевые квасцы (ЖАК), о-толуидиновый
и нингидриновый проявители) обнаружены
углеводы, аминокислоты и флавоноиды.
Разделение водного раствора Т laxa
осуществляется следующим образом. Экстракт
растворяется в минимальном количестве воды,
отфильтровывается и наносится на колонку с
сефадексом (LH-20). Элюентом служит вода и
водный ацетон с возрастающей концентрацией
ацетона. Во фракциях, элюированных водой и
ацетоном (9 : 1), содержится флавоноид (вещество
1). Перехроматографированием данной фракции на
небольшой колонке с полиамидом выделено
вещество 1 (0.5%) в индивидуальном состоянии.
Вещество 1 - калиевая соль 3-O-сульфат-5,7,3'-
тригидрокси-4'-метоксифлавон - тамариксин
(C16H11O10SK), кристаллический порошок светло-
желтого цвета, с температурой плавления 320-322°С
(Н2O); Rf 0.33 (I), 0.33 (II). Данные ЯМР 1
Н, УФ, ИК
спектров представлены в таблице 1.
Таблица 1
Данные спектральных характеристик флавоноидов из T.laxa
Название соединения Спектральные характеристики
Калиевая соль 3-О-сульфата тамариксетина -
тамариксин (вещество 1) C16H11O10SK из
растения T.laxa
Масс-спектр, м/е, %: 434 (10.0), 395 (20.0), 315 (100.0), 284
(1.7), 267 (2.7),152 (12.4), 136 (4.0), 118 (13.5), 102 (2.6), 99
(3.7), 52 (16.9).
ЯМР 1
Н (500 МГц, CD3OD, δ, м.д., J/Гц): 3.92 (3Н, с,-ОСН3),
6.20 (1Н, д, J=2.0, Н-6), 6.41 (1Н, д, J=2.0, Н-8), 7.04 (1Н, д,
J=8.0, Н-5'), 7.64 (1Н, д, J=2.0, Н-2'), 7.79 (Ш, дд, J-2.0, 8.0, Н-
6').
УФ - спектр (МеОН, λmax, нм): 254, 339; CH3COONa: 268, 353;
CH3COONa + H3BO3: 255, 350; АlСl3: 270, 389; АlСl3 + НСl:
270, 361; NaOMe: 273, 360.
ИК-спектр (KBr, ν, см-1
): 3336, 1650, 1601, 1274 (S=O), 1190
(S=O), 1048 (C-O-S).
Данные элементного анализа приведены в таблице 2.
Таблица 2
Элементный анализ вещества 1
Найдено, % С 43.14 Н2. 85 S 7.25
Вычислено, % для
С16Н11О10SK
С 44.23 Н2.53 S 7.37
Из продуктов кислотного гидролиза выделен
агликон (температура плавления 240-242°С),
совпадающий с тамариксетином. Часть гидролизата
сконцентрирована и исследована методом БХ в
присутствии достоверных образцов углеводов.
Углеводы не обнаружены. Другая часть гидролизата
после нейтрализации Na2CO3 водным раствором
обработана насыщенным раствором хлорида бария,
при этом наблюдалось выпадение белого осадка
сульфата бария, что указывает на присутствие
сульфатной группы. Качественной реакцией с
кобальтитонитритом натрия (желто-зеленое
окрашивание) в гидролизате обнаружены К.
Количественное содержание калия определено
методом пламенной фотометрии - 9.8%. Вычислено
для С16Н11О10SK 9.0% калия.
Определение калия. 0.0071 г вещества
растворялось в 50 мл воды. Затем отбирались
аликвоты (0.5, 1.0, 1.5 мл) в мерные колбы
вместимостью 50 мл. Объемы растворов до метки
доводились водой. По стандартной кривой
определено содержание калия в пробе. Для
построения стандартной кривой использовался
раствор хлорида калия в воде. Данные определения
приведены в таблице 3, стандартная кривая - на
фиг.1.
4. 28793
4
Таблица 3
Определения калия фотометрическим методом
V, Аликвоты (мл) Интенсивность растворов
(I), дел
С, г/мл·10-5
% содержание
0.01 23 1.9 -
0.02 40 3.8 -
0.03 57 5.9 -
0.04 75 7.8 -
0.05 95 9.5 -
Исследуемый раствор
0.25 50 5.0 6/9
0.5 67 7.2 10/0
1.5 83 9.2 12.7
Вещество 1 по качественным реакциям (темное
свечение в УФ-свете), хроматографическому
поведению предварительно отнесено к
гликозидированным формам флавоноидов.
В масс-спектре (метод БУА) определена масса
молекулярных ионов с м/е 434 (вещество 1)
соответственно. В веществе 1 пик молекулярного
иона с м/е 446 позволяет предположить
молекулярную формулу С16Н11О10SK.
Присутствие сульфатной группы и катиона К
доказано присутствием фрагмента с м/е 315
[М-39-66]+
.
По данным УФ спектров с диагностирующими и
комплексообразующими добавками сульфатов
вещество 1 образует хелатные комплексы с А1Сl3,
который под действием НСl разрушает вещество 1,
что свидетельствует о свободной ОН группе в С-5
положении и замещенной ОН группе в С-3
положении.
Таким образом, на основании химических и
физико-химических данных структуры вещество 1
установлено как калиевая соль 3-О-сульфат
тамариксетина (тамариксин). Структурная формула
вещества 1 представлена на фиг.2.
Биологическая активность индивидуального
соединения исследована в специализированном
учреждении: Исследовательский Институт Химии,
Центр Молекулярной Медицины и Исследования
Лекарств им. доктора Пэйнджвани Университета г.
Карачи, Пакистан.
На данный вид активности было испытано
вещество 1 (TL-8). В качестве стандартов
применялись 1-диоксинодиримицин и acarbose.
Данные приведены в таблице 4.
Таблица 4
Антидиабетическая активность соединений из T.laxa
Вещества Концентрация (µМ) Процент ингибирования,
(%)
Значение IС50 Мм IC50 ± sem
0.8 84.59 572 572±11
0.4 23.86
Вещество 1 (TL-8)
0.2 0
Стандарт (425.6 ± 8.14) ) µМ
Acarbose (780 ± 28) µМ
Из данных таблицы 4 следует, что вещество 1
обладает достаточно высокой ингибирующей
активностью фермента α-глюкозидазы.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения флавоноида, обладающего
антидиабетическим действием, включающий
экстракцию растительного сырья 70%-ным
этиловым спиртом в течении 72 часов при
комнатной температуре, фильтрацию и упаривание
спиртового экстракта с последующей обработкой
хлороформом, этилацетатом, выделение целевого
продукта из водного экстракта на колонке сефадекс
(LH-20) смесью вода-ацетон (9:1), повторным
хроматографированием на полиамиде, удаление
растворителя и высушивание, отличающийся тем,
что в качестве растительного сырья используют
надземную массу гребенщика рыхлого (Tamarix laxa
Willd.).
