1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29935
(51) A61K 39/145 (2006.01)
A61P 31/12 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0762.1
(22) 02.06.2014
(45) 15.06.2015, бюл. №6
(72) Асанов Ныгмет Гатауович; Сансызбай Абылай
Рысбаевич; Кошеметов Жумагали Каукарбаевич;
Мусина Галия Шайхисламовна; Мусоев Асылбек
Маилибоиевич
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Казахский
национальный аграрный университет"
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) Дмитриев Д.В. Непрямой метод
иммуноферментного анализа в диагностике
метапневмовирусной инфекции птиц. Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук. Санкт-Петербург,
2010
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МЕТАПНЕВМОВИРУСА
ПТИЦ
(57) Изобретение относится к области ветеринарной
вирусологии и биотехнологии. Способ получения
сыворотки для диагностики метапневмовируса птиц
(МПВИ) предусматривает накопление вирусной
массы, сбор вируссодержащей суспензии, обработку
ультразвуковыми волнами вируссодержащей
суспензии с помощью ультразвукового
диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц,
мощности 50-70 Вт/см2
в течение 5-10 минут,
очистку вируса в градиенте сахарозы,
гипериммунизацию продуцентов, получение
сыворотки.
Предлагаемый способ способствует повышению
сыворотки.
(19)KZ(13)A4(11)29935

2. 29935
2
Изобретение относится к области ветеринарной
вирусологии и биотехнологии.
Известен способ получения сыворотки для
диагностики метапневмовируса птиц, включающий
накопление вирусной массы, сбор вируссодержащей
суспензии, очистку вируса в градиенте сахарозы,
гипериммунизацию продуцентов, получение
сыворотки (Д.В.Дмитриев. Непрямой метод
иммуноферментного анализа в диагностике
метапневмовирусной инфекции птиц. Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук. Санкт-Петербург-
2010).
Недостатком данного способа является низкая
активность сыворотки.
Задача заявляемого изобретения - повышение
активности сыворотки.
Задача решается путем обработки
ультразвуковыми волнами вируссодержащей
суспензии с помощью ультразвукового
диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц,
мощности 50-70 Вт/см2
в течение 5-10 минут.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в повышении активности
целевого продукта.
Способ получения сыворотки для диагностики
метапневмовируса птиц (МПВИ) предусматривает
накопление вирусной массы, сбор вируссодержащей
суспензии, обработку ультразвуковыми волнами
вируссодержащей суспензии с помощью
ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте
20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см2
в течение 5-10
минут, очистку вируса в градиенте сахарозы,
гипериммунизацию продуцентов, получение
сыворотки.
Пример получения сыворотки для диагностики
мегапневмовируса птиц.
А. Работа со штаммом.
Штамм "PL-21" метапневмовируса птиц
свободен от контаминации бактериями,
микоплазмами и другими гемагглютинирующими
вирусами и используется для приготовления вакцин
и диагностических препаратов при
метапневмовирусной инфекции птиц (МПИП).
Для получения антигенного материала из
штамма "PL-21" вируса МПВИ в качестве
чувствительной системы культивирования
используют культуру клеток Vero.
Б. Приготовление и контроль нормального и
специфического антигенов метапневмовируса птиц
Технология получения вируссодержащей
культуральной суспензии для приготовления
нормального и специфического антигенов
Для получения вируссодержащей культуральной
суспензии используют матрасы емкостью 1,0-1,5
дм3
со сплошным монослоем культуры клеток Vero
в стационарных условиях при температуре
(37,5±0,5)°С.
Вакцинный штамм PL-21 метапневмовируса
птиц имел максимальное накопление 6,0±0,1 lg
ТЦД50/см3
.
Перед заражением из матрасов удаляют
питательную ростовую среду. После внесения
заражающей дозы вируса матрасы выдерживают в
течение 1,-1,5 ч при (37±1)°С. осторожно покачивая
каждые 15-20 мин. Затем в матрасы заливают 100-
150 см3
поддерживающей среды (Vero). Матрасы
помещают в термостат и инкубируют при (37±1)°С.
до наступления полного поражения клеток.
Для приготовления нормальных и
специфических комплексных антигенов МПИП
монослой в неинфицированных матрасах и
пораженный вирусом монослой инфицированных
матрасах снимают стерильным резиновым
шпателем, определяя полноту снятия визуально.
Вируссодержащую суспензию и контрольную
суспензию неинфицированных культуры клеток
сливают раздельно в стерильные сосуды емкостью
не менее 10 дм3
каждый.
Полученный производственный вирус проверяют
на цитопатогенную активность путем титрования в
однослойной пробирочной культуре клеток Vero.
Производственный вирус должен иметь
активность не менее 5,0 lg ТЦД50/см3.
В. Приготовление антигена
Полученную культуральную вируссодержащую
суспензию подвергают обработке ультразвуковыми
волнами с помощью ультразвукового диспергатора
УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности
50-70 Вт/см2
в течение 5-10 минут, затем
концентрируют путем центрифугирования в
0,5-1 дм3
стерильных стаканах рефрижераторной
центрифуги. Центрифугирование проводят при 3000
об/мин (4±2)°С в течение 30 мин (BECKMAN
COULTER Allegra 64-R). После остановки
центрифуги надосадочную жидкость из стаканов
сливают в отдельную посуду, а в стаканы с осадком
добавляют новую порцию суспензии. Затем
суспензию центрифугируют при 27000 об/мин в
течение одного часа при температуре (4±2)°С
(BECKMAN COULTER OPTIMATM™L-80P
ULTRACENTRIFUGE).
Осадки ресуспендируют и очищают в градиенте
сахарозы (20, 45, и 60%) и центрифугируют при
3000 об/мин в течение 35 мин при температуре
(4±2)°С. Надосадок используют как антиген в
РНГА, РДП и ИФА.
Г. Гипериммунизация продуцентов
Первой стадией получения сывротки является
иммунизация животных. В качестве продуцентов
специфической сывротки используют клинически
здоровых курицы в возрасте 20 недельных, не
содержащих в крови антител к возбудителям
сходных заболеваний.
Специфическую сывротку для серологических
реакций при МПИП получают по схеме трехкратное
подкожное:
а) иммунизация - введение животным 1 cм3
антигена;
б) гипериммунизация:
- первая инъекция - введение 15 см3
культурального концентрированного антигена в
комплексном с ГОА гидрооксильалюмений (0,2 см3
2%) интервал 30 сут;

3. 29935
3
- вторая инъекция - введение 30 см3
культурального концентрированного антигена и
0,8 см3
адъювант Монтанид ISA71 9 сут;
В процессе гипериммунизации за курами ведут
клиническое наблюдение. Очередную инъекцию
антигена делают только курам с нормальной
температурой тела.
Через каждые 7 сут после последней инъекции у
кур из ярменой вены берут кровь и определяют титр
антител в ИФА и РДП. При установлении в
сыворотках крови необходимого титра проводят
тотальное обескроливание.
Д. Получение сыворотки
Кровь у продуцентов берут в стерильные
цилиндры, содержащие небольшое количество (20-
30 см3
) физиологического раствора для смачивания
стенок цилиндра. Цилиндры с кровью для
формирования сгустка вначале помещают на 3-4 ч в
термостат при (37±1)°С, а затем на 12-15 ч в
холодильник при (4±2)°С. Отстоявшуюся сыворотку
сливают в стерильные флаконы, а сгустки крови
утилизируют. При наличии в сыворотке форменных
элементов крови ее центрифугируют в стерильных
центрифужных стаканах в течение 15-20 мин при
1500-2000 об/мин. Полученную сыворотку проверят
на активность и специфичность в ИФА и РДП.
Проверку сывороток крови на стерильность
проводили ГОСТ 4483:2005.
Таблица 1
Сравнительные данные по активности и специфичности сыворотки в ИФА
Группа Кол-во
проб
Мин
титр
Мах
титр
Средний
титр
Опытная
(новый)
15 30 020 32 063 31 042
Контрольная
(прототип)
15 25 295 27 583 26 439
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения сыворотки для диагностики
метапневмовируса птиц, включающий накопление
вирусной массы, сбор вируссодержащей суспензии,
очистку вируса в градиенте сахарозы,
гипериммунизацию продуцентов, получение
сыворотки, отличающийся тем, что
вируссодержащую суспензию подвергают обработке
ультразвуковыми волнами с помощью
ультразвукового диспергатора при частоте
20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см2
в течение
5-10 минут.
Верстка Н.Киселева
Корректор К.Нгметжанова